T.C.

SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

SUSAM BİTKİSİNDE (Sesamum indicum L.) ANTER KÜLTÜRÜ

İLE KALLUS OLUŞTURMA POTANSİYELİNİN

ARAŞTIRILMASI

Mehmet Tolgahan HAKAN

Danışman

Prof. Dr. Kudret KABAR

YÜKSEK LİSANS TEZİ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ISPARTA - 2013

© 2013 [Mehmet Tolgahan HAKAN]

TAAHHÜTNAME

Bu tezin akademik ve etik kurallara uygun olarak yazıldığını ve kullanılan tüm

literatür bilgilerinin referans gösterilerek tezde yer aldığını beyan ederim.

Mehmet Tolgahan HAKAN

i

İÇİNDEKİLER

Sayfa

İÇİNDEKİLER........................................................................................................ i

ÖZET....................................................................................................................... ii

ABSTRACT............................................................................................................ iii

TEŞEKKÜR............................................................................................................ iv

ŞEKİLLER DİZİNİ................................................................................................. v

ÇİZELGELER DİZİNİ............................................................................................ vi

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ............................................................ vii

1. GİRİŞ ................................................................................................................... 1

1.1. Anter Kültürü ............................................................................................... 3

1.2. Susam Bitkisi ................................................................................................ 11

2. KAYNAK ÖZETİ ................................................................................................ 13

3. MATERYAL VE METOD .................................................................................. 17

3.1. Materyal ........................................................................................................ 17

3.2. Metod ............................................................................................................ 17

3.2.1. Donör bitkilerin yetiştirilmesi ............................................................ 17

3.2.2. Sitolojik çalışmalar ............................................................................. 17

3.2.2.1. Çiçek tomurcuklarının gruplandırılması ................................ 18

3.2.2.2. Uygun tomurcuk safhasının tespiti ........................................ 19

3.2.3. Anterlere yapılan ön işlem ................................................................. 19

3.2.4. Anterlerin kültüre alınması ................................................................. 20

3.2.5. Kültür ortamının hazırlanışı ............................................................... 21

4. ARAŞTIRMA BULGULARI .............................................................................. 24

4.1. Sitolojik Çalışmalar Sonucu Elde Edilen Bulgular ...................................... 24

4.1.1. Uygun tomurcuk safhasına ilişkin bulgular ....................................... 24

4.2. Kültür Ortamından Elde Edilen Bulgular ......................................................... 28

4.2.1. Kültür ortamına cevap veren anterlerin tespiti ............................................... 28

4.2.2. Bitki çeşidine ve uygulanan önişleme göre kültür ortamına cevap veren ve

kallus meydana getiren anter sayıları ve yüzdeleri ......................................... 29

5. TARTIŞMA VE SONUÇ .................................................................................... 34

7. KAYNAKLAR .................................................................................................... 38

ÖZGEÇMİŞ ............................................................................................................. 41

ii

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

SUSAM BİTKİSİNDE (Semamum indicum L.) ANTER KÜLTÜRÜ İLE

KALLUS OLUŞTURMA POTANSİYELİNİN ARAŞTIRILMASI

Mehmet Tolgahan HAKAN

Süleyman Demirel Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü

Biyoloji Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. Kudret KABAR

Bu çalışmada susam bitkisinin (Sesamum indicum L.) 3 farklı genotipi kullanılarak

anter kültür tekniği uygulanmıştır. Bu amaçla Baydar-2001, Muganlı-57 çeşitleri

Süleyman Demirel Üniversitesi Ziraat Fakültesi’nden temin edilmiş, yerel genotip

ise Denizli-Çal bölgesinden temin edilmiştir. Susam tohumları doku kültürü

çalışmaları için Süleyman Demirel Üniversitesi Biyoloji Bölümü Doku Kültürü ve

Biyodozimetri Laboratuvarında yetiştirilmiştir. Bu çalışmalarda her bir genotip için,

morfolojik ve sitolojik çalışmalar yapılarak uygun tomurcuk ve mikrospor safhası

belirlenmiştir. Uygun safhaların belirlenmesinden sonra yetiştirilen donör bitkilerden

alınan anterler, 2 mg/L dicamba ve 1 mg/L kinetin ile modifiye edilmiş MS kültür

ortamına alınmışlardır. Donör bitkiden alınan anterler ikiye ayrılarak bir gruba 24

saat +4oC’de önişlem uygulanmıştır, diğer gruba önişlem uygulanmamıştır.

Böylelikle susam bitkisinde erkek üreme hücrelerinde totipotensi araştırılması

yapılmıştır. Bu araştırma ile totipotensiye genotipin ve önişlem uygulamasının etkisi

ortaya konulmuştur. Kültür ortamına konulan anterlerden kallus meydana getirenler

tespit edilerek kallus oluşum yüzdesi hesaplanmıştır. Böylece soğuk önişlem etkisi

ve genotiplerin anrogenesis yeteneği karşılaştırılmıştır. Buna göre, ön işlem

yapılmayan deneme grubunda totipotensi yeteneği en yüksek olan genotip Denizli-

Çal olarak bulunmuştur. Bunu yaklaşık olarak aynı değerde olan Muganlı-57 ve

Baydar-2001 çeşitleri takip etmiştir. Soğuk önişlem yapılan deneme grubunda ise

Muganlı-57 çeşidi en yüksek totipotensiye sahip çeşit, onun ardından Baydar-2001

ve en düşük totipotensi yeteneği ise yerel genotipte bulunmuştur.

Anahtar Kelimeler: Anter kültürü, Sesamum indicum L., totipotensi, soğuk önişlem.

2013, 41 sayfa

iii

ABSTRACT

M.Sc. Thesis

INVESTIGATION OF THE POTENTIAL OF CALLUS FORMATION ON

SESAME (Sesamum indicum L.)

Mehmet Tolgahan HAKAN

Suleyman Demirel University

Graduate School of Applied and Natural Sciences

Department of Biology

Supervisor: Prof. Dr. Kudret KABAR

In this study, anther culture technique was applied using three different genotypes of

sesame. For this purpose, Baydar-2001, Muganli-57 varieties were supplied from

Suleyman Demirel University, Faculty of Agriculture, local genotype was supplied

from the region of Denizli-Çal. Sesame seeds were grown for tissue culture studies in

Laboratory of Tissue Culture and Biodosimetry at Biology Department, Suleyman

Demirel University. The appropriate bud and microspores stage for each genotype

were determined by performing morphological and cytological studies. After the

determination of the appropriate stages, anthers from donor plants, were transferred

to modified MS culture medium with 2 mg/L dicamba and 1 mg/L kinetin. Anthers

from donor plants were divided into two groups. One of them were applied chilling

pretreatment at +4oC for 24 hours. The other group (control) weren’t applied any

pretreatment. In this manner, on sesame plants, the male reproductive cells’

totipotency was investigated. The eeffects of chilling pretreatment and genotype on

the totipotency were put forward. The percentage of callus formation from the

anthers put into culture medium were calculated. Thus, the effect of chilling

pretreatment and androgenesis ability of genotypes were compared. According to

this, it was found that Denizli-Çal local genotype was the highest totipotency ability

on the trial group without pretreatment. It was followed by Muganlı-57 and Baydar-

2001 which have approximately the similar values. Muganlı-57 type belong to

chilling pretreatment group, was the highest totipotency and Baydar-2001 followed it

and it was found that the local genotype has the lowest totipotency ability.

Keywords: Anther culture, Sesamum indicum L., totipotency, chilling pretreatment.

2013, 41 pages

iv

TEŞEKKÜR

Bu çalışma için beni yönlendiren; düşüncelerini, iyi niyetini, bilgi ve tecrübesini

benden esirgemeyerek karşılaştığım zorluklarda yardımcı olan, tezimin sonuca

ulaşmasını sağlayan danışman hocam Sayın Prof. Dr. Kudret KABAR’a teşekkür

ederim.

Tez çalışmalarımın başlamasında gerekli teorik bilgileri edinmemi sağlayan, çalışma

konumun belirlenmesinde katkıları olan hocam Prof. Dr. Çiğdem SAVAŞKAN’a

teşekkürü borç bilirim.

Tüm çalışmalarım esnasında sonsuz desteklerini yanımda hissettiren, lisans

eğitimimin en başından yüksek lisansımın sonuna kadarki akademik hayatımda

kendilerinden çok şey öğrendiğim ve daha da öğreneceğime inandığım Sayın

hocalarım Dr. Rağbet Ezgi DURAN ve Dr. Yasemin COŞKUN’a teşekkür ederim.

Birlikte olduğumuz uzun zaman diliminde, bana her türlü koşulda sevgisini, bilgisini

ve desteğini sunan, iyi ve zor günlerde her zaman yanımda olan eşim Aliye

KAŞARCI HAKAN’a sonsuz sevgimle teşekkür ederim.

Yüksek lisansım boyunca ihtiyacım olan tüm bilgiyi sabır, ilgi ve tecrübeleriyle bana

aktaran ve her zaman desteklerini gördüğüm Biyoloji Bölümü’ndeki tüm hocalarıma

saygı ve teşekkürlerimi sunarım.

Tezimin süresince maddi manevi desteklerini aldığım aileme de teşekkür ederim.

Mehmet Tolgahan HAKAN

ISPARTA, 2013

v

ŞEKİLLER DİZİNİ

Sayfa

Şekil 1.1. Mikrosporların in vivo ve in vitro koşullarda gösterdikleri alternatif

yollar...................................................................................................... 10

Şekil 1. 2. Susam (Sesamum indicum L.) bitkisinin genel görünümü ..................... 11

Şekil 3. 1. Farklı gelişim evrelerindeki tomurcuk örnekleri .................................... 18 Şekil 3. 2. Soğuk önişlem için hazırlık .................................................................... 19 Şekil 3. 3. Steril kabinde yapılan işlemler ............................................................... 20

Şekil 4. 1. Uygun safhadaki tomurcuk ve mikrosporlar .......................................... 25

Şekil 4. 2. Erken safhadaki tomurcuk ve mikrosporlar. ........................................... 26 Şekil 4. 3. Geç safhadaki tomurcuk ve mikrosporlar. ............................................ 27 Şekil 4. 4. Cevap veren ve vermeyen anter örnekleri .............................................. 28

vi

ÇİZELGELER DİZİNİ

Sayfa

Çizelge 3. 1.Murashige ve Skoog (1962) tarafından geliştirilen MS kültür ortamı

bileşenleri ............................................................................................ 22

Çizelge 4. 1. Denizli-Çal genotipine ait veriler........................................................ 31 Çizelge 4. 2. Muganlı-57 çeşidine ait veriler ........................................................... 31 Çizelge 4. 3. Baydar 2001 çeşidine ait veriler ......................................................... 32

vii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

2,4-D 2,4-dikloro fenoksi asetik asit

ABA Absisik asit

BAP Benzil amino pürin

CaCl2 .7H2O Kalsiyum klorür heptahidrat

CoCI2 . 6H2O Kobalt klorür heksahidrat

CuSO4 . 5 H2O Bakır sülfat pentahidrat

DH Double haploid

FeSO4 . 7H2O Demir II sülfat heptahidrat

H3BO3 Borik asit

HCl Hidroklorik asit

IAA İndol-3-asetik asit

KI Potasyum iyodür

KIN Kinetin

KH2PO4 Potasyum dihidrojen fosfat

KNO3 Potasyum nitrat

L Litre

M Molar derişim

Mg Miligram

MgSO4 . 7H2O Magmesyum sülfat heptahidrat

MnSO4 . H2O Mangan II sülfat monohidrat

MS Murashige ve Skoog kültür ortamı

N6 Nitsch ve Nitsch kültür ortamı

Na2EDTA Disodyum etilendiamintetra asetik asit

Na2MoO4 . 2H2O Sodyum molibdat dihidrat

NAA Naftalen asetik asit

NH4NO3 Anomyum nitrat

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Restriksiyon

enzimleri kullanılarak DNA'nın farklı büyüklükteki parçalara

ayrılması)

ZnSO4 . 7H2O Çinko sülfat heptahidrat

w/v Ağırlık/Hacim

μM Mikromolar derişim

1

1. GİRİŞ

Bitki doku kültürü önemli bir botanik disiplinidir ve biyoteknolojinin gelişmesinde

bir anahtar olarak kabul edilmektedir (Smith, 1997).

Bitki doku kültürü; steril şartlarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, hücre

(meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri), doku (çeşitli bitki

kısımları=eksplant) veya organ (apikal meristem, kök vb.) gibi bitki kısımlarından

yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesidir. Eksplant

bitkinin çeşitli kısımlarından alınabilen kültür başlatmada kullanılabilecek bitki

parçalarıdır. Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik çeşitlilik oluşturmak

doku kültürünün temel amaçları arasında sayılabilir. Bu nedenle bitki doku kültürleri

genetiksel iyileştirme çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca

kaybolmakta olan türlerin korunmasında ve çoğaltılması zor olan türlerin

üretilmesinde, çeşitli doku kültürü yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır

(Babaoğlu vd., 2001).

Tüm doku kültürlerinin başlangıç noktası eksplant denen bitki dokularıdır. Doku

kültürü bitkilerin kök, gövde, petiyol, yaprak veya çiçek parçalarından olabilmekte

ve başarı oranı türlere ve eksplant tipine göre değişmektedir. Eksplant yüzeyinin tüm

mikrobiyal kontaminasyonlardan arındırılması önemlidir (Çapan, 2006).

Bitki doku kültürü somatik ve gametik çalışmalar olmak üzere iki ana uygulama ile

yapılmaktadır. Bu çalışmalardan somatik uygulamalar, donör bitkinin somatik

dokularından alınan eksplantlarla yürütülmektedir. Bu çalışmaların genel amaçları:

Bitkide mevcut olan genleri koruma amaçlı klonlama

Sentetik tohum üretimi

Sekonder metabolit üretimi

Farklı özellikleri bitkiye eklemek için gen aktarımı olarak sıralanabilir.

Doku kültürü uygulamalarından gametik çalışmalar ise eksplant olarak donör

bitkinin gamet doku ve hücrelerini kullanır. Bu tip çalışmaların genel amaçları ise:

2

Bitkideki mevcut özelliklerin geliştirilmesi

Bitkinin istenilen özelliklerindeki veriminin arttırılmasıdır.

Diğer ifade ile bu uygulama bitki ıslahını temel alan çalışmalarda kullanılabilir.

Günümüzde doku kültürü çalışmalarında, embriyo kültürü, kallus kültürü, anter

kültürü, ovül ve ovaryum kültürleri, meristem kültürü, apikal meristem kültürü,

protoplast kültürü, sürgün kültürü, kök kültürü, süspansiyon kültürler ve çeşitli bitki

organlarına ait kültürler sıklıkla kullanılmaktadır. Bu tez çalışmasında anter kültürü

tekniği kullanılmıştır.

Ülkemizde son yıllarda çeşitli kuruluşlarda, farklı mesleklerden kişiler, doku kültürü

çalışmalar yapmaktadır. Bu kuruluşlar üniversiteler ve üniversitelerin ziraat

fakülteleri ve biyoloji bölümleri, tarımsal amaçlı enstitü ve kuruluşlar ve ticari

amaçlı özel kuruluşlardır. Üzerinde çalışılan bitkiler çoğunlukla tahıl bitkileri,

baklagiller, sebze, meyve türleri, çiçekçilikte kulanılan muhtelif bitkiler, odunsu bitki

ve yağlı tohum türleridir.

Genetik değeri ve verim potansiyeli yüksek genotiplerin üretimde seçilerek

kullanılması tarımda çok önemli bir yer tutmaktadır (Munns ve James, 2003).

Ekonomik önem ve teknik uygunluk çalışılacak bitki türünün seçiminde önemli

kriterlerdir. Buğday, şeker pancarı, pamuk mısır gibi sosyo-ekonomik değeri yüksek

olan türlerin doku kültürünün daha zor olması nedeniyle bu türlerdeki gelişmeler

daha yavaştır. Araştırmalarda daha çok yağ bitkileri, endüstri bitkileri, sebzeler,

meyveler ve tahıllar gibi ekonomik açıdan önemli bitkiere öncelik verilmelidir.

Ayrıca üzerinde hiç doku kültürü çalışması yapılmamış bitkiler de tercih edilen

bitkiler olmuştur. Genetik olarak değiştirilmiş 70’ten fazla bitki türünün hepsin de bir

takım doku kültürü teknikleri uygulanmıştır (Babaoğlu vd., 2001).

Ayrıca günümüzde, doku kültürü çalışmalarını daha ileri düzeye getirmek amacıyla

TÜBİTAK, Tarım ve Köy işleri Bakanlığı, Türkiye Teknoloji Geliştirme Vakfı,

Türkiye Tohum Endüstri Derneği, üniversite ve diğer araştırma kuruluşları tarafından

Türkiye’deki biyoteknolojik çalışmaların durumunu, önceliklerini ve stratejilerini

belirlemek ve bu konuda yasal düzenlemeleri oluşturmak için çalışmalar

yapılmaktadır (Babaoğlu vd., 2001).

3

Gerçekleştirilecek biyoteknolojik çalışmalarda önemli bir yere sahip olan doku

kültürü tekniklerinden anter kültürü, bitkilerdeki totipotensinin araştırılması için

temel bir çalışma oluşturmaktadır.

1.1. Anter Kültürü

Bitkilerdeki doku kültürü çalışmalarının temeli, ilk olarak Schwann ve Schleiden’in

1838 yılında totipotensi teorisini öne sürmeleri ile atılmıştır. Genel olarak bitkiler,

hücresel totipotensi için olağanüstü bir potansiyele sahiptir. Aslında, çekirdeğini

muhafaza ettiği sürece herhangi farklılaşmış bir bitki hücresi, embriyogenik şartlara

dönme ve tam olarak yeni bir bitki oluşturma yeteneğindedir. Hücresel totipotensinin

en çarpıcı örneklerinden birisi androgenesis fenomenidir (Arı, 2006).

İlk kez 1953 yılında Tulecke, Ginkgo biloba L. bitkisine ait olgun polenlerin kültür

koşullarında haploid kallus oluşturmak üzere uyarılabileceğini gözlemlemiştir

(Duran, 2007). In vitro kültüre alınan genç anterlerden haploidlerin başarıyla

oluşturulması ilk kez 1964 yılında Datura stramonium bitkisinde Guha ve

Maheshwari tarafından gerçekleştirilmiştir. 1967 yılında Bourgin ve Nitsch’in tütün

bitkisinde anter kültür yoluyla haploid embriyolar elde etmesinden sonra, özellikle

ekonomik önemi fazla olan tahıllar, sebzeler ve şeker pancarı başta olmak üzere

günümüze değin pek çok bitki türünde anter kültürü yoluyla haploid eldesi üzerinde

çalışmalar yapılmış ve 25 familyaya ait 200 bitki türünde in vitro androgenesis

tekniğinden başarılı sonuçlar elde edilmiştir (Ellialtıoğlu, 2000).

Geleneksel metotlar ile karşılaştırıldığında, gametik embriyogenesis homozigot

hatların üretimini ve böyle hatların üretimi için gerekli zamanı kısaltarak tek adımda

heterozigot ebeveynden tam homozigot hatların oluşumunu sağlar. Geleneksel

metotlar ile homozigot hatlar elde etmek, genetik uniformluğa ulaşmada tarımsal

yöntemleri gerektiren ve oldukça zaman alıcı bir işlemdir (Morrison ve Evans, 1987).

Gametik embriyogenesis bitkiler aleminde bulunan embriyogenesisin farklı bir

yoludur ve erkek (mikrospor veya olgunlaşmamış polen taneleri) ya da dişi

gametofitlerin (yumurta hücresi) gametofitik gelişimden sporofitik gelişim yoluna

doğru yönelmelerini sağlar. Genotipin klonal çoğaltımını somaklonal varyasyon

4

olmaksızın sağlayan somatik embriyogenesisten farklı olarak, gametik

embriyogenesis, kendiliğinden ya da indüklenen kromozom katlanması oluşmaksızın

haploid bitki oluşumu ile sonuçlanır (Duran, 2011).

Antere ait bazı somatik dokuların, polenin sporofitik bölünmesinin oluşumunda

önemli bir rol oynadığını ve anter duvarı aracılığı ile besinlerin difüzyonunun

mikrospor embriyogenesisini etkileyen faktörlerden biri olduğunu kabul edilerek

“Duvar Faktörü” kavramını tanımlanmıştır. Polen embriyogenesisinde anter

duvarının rolü üzerine yapılan çok sayıda çalışma, besin akışında bir bariyer görevi

görmesinin yanı sıra yararlı ve inhibitör maddeleri de sağladığını göstermiştir

(Duran, 2011).

Anter kültürü esas olarak; içerisinde olgunlaşmamış polenleri bulunduran anterlerin,

tomurcuklarından ayrılarak in vitro koşullarda yapay besin ortamlarına

yerleştirilmesi ve burada olgunlaşmamış polenlerden haploid embriyolar elde

edilmesi olayına verilen isimdir (Duran, 2007).

Haploid bitkiler, somatik hücrelerindeki kromozom sayısı, ait olduğu bitki türünün

gamet hücrelerinde bulunan kromozom sayısı (n) kadar olan bitkilerdir. Bu bitkiler,

generatif organ ve hücreleri oluşturma yönüne gitmeden önce konsantrasyonu belli

çözeltilerle muamele edildiklerinde n sayıdaki kromozom sayısı iki katına

çıkartılarak normal gamet ve tohum üretimi sağlamaktadır (Savaşkan vd., 1997).

Anter kültürü yapılarak, normal koşullarda iki çekirdekli yapıya dönüşecek olan

polen tanesinin gametik gelişme yönü henüz tek çekirdekli dönemde iken somatik

gelişme yönüne doğru çevrilmekte ve böylece “mikrospor androgenesisi” veya

sadece “androgenesis” olarak adlandırılan oluşum gerçekleşmektedir (Duran, 2007).

Mikrosporların kültür koşulları ve yapılan uygulamaların etkisiyle normal ve sağlıklı

bir çiçek tozu oluşumuyla sona eren gametofitik doğrultudaki gelişme yerine, haploid

embriyo oluşumuyla sona eren sporofitik yöndeki gelişmeye doğru

yönlendirilebilmesi için mutlaka buna uygun gelişme döneminde bulunması

gerekmektedir. Bu dönem, tek çekirdekli (uninucleate) mikrospor gelişme dönemi

veya birinci polen mitozundan hemen önceki dönemdir. Embriyoların oluşumu için

5

geçen süre türe bağlı olarak değişiklik göstermekle birlikte anterlerin dışına çıkıp

çıplak gözle görülebilecek aşamaya gelinceye kadar yaklaşık 3-5 haftalık bir zaman

geçmektedir (Duran, 2007).

Mikrosporlar soğuk ön işlemden sonra ve kültür esnasında farklı yollar

izleyebilmektedirler. Şöyle ki gelişimlerinin durması, olgun bir polen tanesi halini

almaları, çok hücreli kallus benzeri yapı şeklini almaları ya da mikrospordan oluşan

embriyolara dönüşmeleri mümkün olmaktadır (Hosp vd,. 2007; Seguì-Simarro ve

Nuez, 2008). Mikrosporlara soğuk ön işlem uygulaması ile soğuk stres tarafından

gametofitik gelişimlerinin durdurulması sağlanır ve embriyogenik potansiyel

kazandırılır. Böylelikle mikrosporların sitoplazma ve çekirdek içeren tersine

farklılaşmış hücrelerin oluşumu sağlanarak mikrosparlara totipotent durumu

kazandırılır. Totipotensi özelliği kazanan mikrosporlar hücresel genişleme

gösterirler. Genişleme, büyük merkezi bir vakuolün varlığı ve pH’ın daha alkali hale

gelmesi gibi morfolojik ve biyokimyasal değişikliklerle meydana gelmektedir

(Hoekstra vd., 1992; Huang, 1996; Touraev vd., 2001; Maraschin vd., 2003).

Bir sonraki faz, hücre bölünmesi ile ekzin duvarının içerisinde çok hücreli yapıların

oluşumu ile karakterize edilmektedir. Sitolojik ve ultrastrüktürel gözlemler yıldız-

benzeri mikrosporlardan çok hücreli yapıların oluşumunun, ilk bölünme simetrisi ve

yavru hücrelerin yıkımı ile tanımlanan farklı gelişimsel yolları kapsadığını

göstermektedir (Maraschin vd., 2005).

Daha sonraki aşamada, embriyo benzeri yapılar ekzin duvarının dışına çıkmaktadır.

Polenin ekzin yapısı içinde oluşan çok hücreli yapı generatif bölgede kırılma noktası

ile polen porunun karşı tarafına yerleşmektedir (Seguì-Simarro ve Nuez, 2008).

Embriyo benzeri yapılar etrafındaki hücrelerin periklinal bölünmesi sonradan

meydana gelmekte ve epidermis farklılaşmasına neden olmaktadır (Telmer vd., 1995;

Yeung vd., 1996). Epidermis farklılaşması görülen anterlerde, beyaz- sarı renkte

kalluslar şekillenmeye başlamaktadırlar.

Belirlenen aşamadaki anterleri bulunduran çiçek tomurcukları yüzeysel

dezenfeksiyon işlemine tabi tutulduktan sonra steril koşullarda tomurcukların

içerisinden çıkartılan anterler, önceden hazırlanmış ve otoklavlanarak steril hale

6

getirilmiş besin ortamlarının üzerine yerleştirilmektedir. Çoğunlukla petri kutularına,

agarla katılaştırılmış besin ortamlarına yerleştirilen anterlerin yerleştirme işlemi

tamamlandıktan sonra petri kutularının kenarları bir film şeritle kapatılarak herhangi

bir enfeksiyona karşı dış ortamdaki atmosferle olan ilişki kesilmektedir. Petri kutuları

içerisindeki anterler inkübasyon için değişik koşullara alınabilmekte, tütün gibi anter

kültürüne son derece olumlu yanıt veren bitkilerde 24-28oC sıcaklıkta ve

fotoperiyodik olarak aydınlatılan bir iklim dolabında yapılan inkübasyon yeterli

olurken; patlıcan, biber, lahana grubu sebzelerde kültürün ilk günlerinde yüksek

sıcaklık şoklarına gereksinim duyulabilmektedir (Ellialtıoğlu, 2000).

Haploid bitkilerin; genetik, moleküler biyoloji, fizyoloji gibi temel bilimler veya

bitki yetiştirme ve bitki ıslahı gibi uygulamalı bilimlerde sağlamış oldukları

avantajları aşağıdaki gibi sıralamak mümkündür:

a. Haploidleri kullanmanın en başta gelen avantajı tam homozigot bir karakteri çok

kısa bir sürede elde etme olanağını sunmasıdır. Dihaploid (DH) hatların

kullanılmasıyla genetik ve ıslah çalışmalarını yapmak kolaylaşmakta ve sonuca daha

çabuk ulaşılabilmektedir. Yabancı döllenen türlerde heterozigotluk oranı çok yüksek

olduğundan bunlarda homozigot hatların elde edilmesi için 8 – 10 generasyon

boyunca kendilemeler yapmak gerekmekte ve kendidöllek türlerde bile aynı amaçla

5 – 7 generasyon kendileme işlemine gereksinim duyulmaktadır. Dihaploidizasyon

yöntemi devreye girdiğinde homozigot hatlara bir generasyonda ulaşmak olasıdır.

b. Haploidizasyon, resesif mutasyonların açığa çıkartılmasında başvurulan en etkin

yöntemdir. Haploid bitkilerde resesif genler dominant genler tarafından

örtülemeyeceğinden, mutlak homozigot özelliğe sahip olan dihaploid hatlarda

genetik açılımı izlemek mümkün hale gelebilmektedir.

c. Haploidler ve bunların katlanması ile geliştirilen dihaploidler sitolojik, fizyolojik

ve genetik açıdan önemli deneysel materyallerdir.

d. Islah etkinliğinin artırılması haploidizasyonun sağladığı en önemli avantajlar

arasındadır. Bu etkinlik artışı iki şekilde açıklanmaktadır:

7

- Dihaploid bitkilerin döllerinde bir açılım olmadığı için genotipler arasında çok iyi

bir eliminasyonun yapılması,

- Dominansi etkisinin kalkması ve eklemeli gen etkisinin ikiye katlanması

e. Yonca ve patates gibi tetraploidlerin bulunduğu türlerde haploidizasyon, diploid

bitkilerin üretiminde kullanılabilmektedir. Elde edilen diploidler ticari olarak ilginç

olabileceği gibi, bu yolla bazı tetraploid ürünlerde yabani türler ile kültür çeşitleri

arasında diploid seviyede melezleme yaparak kombinasyon yoluna gidilebilmektedir.

f. Dihaploid hatların güncel uygulamalarından biri de gen haritalarının

çıkartılmasında kullanımlarıdır. Doubled haploid genotipler içerisinde barındırdıkları

gerek dominant gerekse resesif genleri homozigot olarak ifade ettiklerinden

restriksiyon enzimleriyle kesilen DNA parçalarında genleri tanımlayan bazların

başlangıç ve bitiş bölgeleri belirgin ve nettir. Bu da güvenli genomik analiz

çalışmaları yapılmasını sağlar. Bu nedenle fenotipik işaretleyicilerin (marker)

tanımlanması çok daha etkin olabilmektedir. Dihaploid hatlarda herhangi bir gen

ister bitki isterse marker seviyesinde olsun genellikle RFLP ile belirlenmektedir. Bu

durum özellikle poligenik olarak kontrol edilen bir karakterin haritasıın

çıkartılmasında önem taşımakta ve kolaylık sağlamaktadır.

g. F1 hibrit çeşitlerin geliştirilmesinde ‘’homozigot hatlar arasında üstün

kombinasyon yeteneği verenlerin belirlenmesi’’ yöntemi kullanıldığından,

haploidinin hibrit çeşit ıslahında özel bir önemi bulunmaktadır. Dihaploid bitkilerden

elde edilen saf hatlar F1 hibrit çeşit ıslahında ebeveyn olarak kullanılabilirler.

h. Melezleme teknikleri ile sonuca çok kısa sürede ulaşmayı sağlayan haploidlik

sayesinde, F1 kademesindeki melez bitkilerden haploidliği çekerek farklı

genotiplerde bulunan ve tek bir genotipte toplanması arzu edilen özelliklere sahip

bitkiler kazanmak mümkündür.

i. Haploid bitkiler farklı patojenler ve patojenlerin fizyolojik ırklarına karşı in vitro

seviyede seçime olanak vermekte, hastalıklara dayanıklılık çalışmalarında zaman,

yer ve maddi kazanç sağlamaktadır.

8

j. Dioik türlerde veya kendileme depresyonu nedeniyle klasik yöntemlerle homozigot

karakterlere ulaşmanın zor olduğu lahana ve çilek gibi türlerde, dihaploidizasyon

yöntemi kullanılarak bu sorun bir generasyonda çözülebilir.

k. Çok yıllık meyve ağaçları ve orman bitkileri gibi tohumdan çiçeklenmeye kadar

oldukça uzun bir gençlik dönemi olan türlerde de haploidizasyon önem

kazanmaktadır. Bu türlerde kendilemeler mümkün olsa bile, homozigot özelliğin elde

edilmesi oldukça uzun bir sürede gerçekleşmektedir.

l. Haploid bitkiler somatik hibridizasyon işleminin diploid protoplastlara göre daha

kolay yapılabilmesine olanak tanımaktadır. Ayrıca iki haploid protoplastın

birleşmesinin sonucu ‘diploid’ olacağından; protoplast kültürü kullanılarak yapılan

somatik hibridizasyon tekniğinin bilinen dezavantajlarının büyük bir kısmı böylece

ortadan kalkacaktır.

m. Kendilemenin olanaksız olduğu bazı dioik türlerde haploid uyartımı ve bunu takip

eden kromozom katlanmasıyla saf erkek bitkiler elde etmek mümkündür.

Kuşkonmaz (Asparagus officinalis) bu uygulama için iyi bir örnektir. Kuşkonmaz

bitkisinde, erkek bireyler dişi bireylerden daha erkenci ve daha yüksek verimlidirler.

Dişi (XX) ve erkek (XY) bitkiler melezlendiğinde %50 dişi, %50 erkek kuşkonmaz

bitkiler elde edilir. Erkek kuşkonmazların anterlerinden çekilen haploidlerde (X ve

Y) kromozom katlanması sonucu süper erkek (YY) bitkiler elde edilir ve bunlar

vegetatif olarak çoğaltılabilir. Dişi bitkiler (XX) süper erkek bitkilerle

melezlendiğinde de sadece erkek bitkiler (XY) oluşur (Coşkun, 2006).

Mikrospor kültür tekniğinde her bir mikrosporu kültür ortamında kullanırken

taşıdıkları genetik varyasyonu birer birer rejenerant bitki olarak alma olasılığı vardır.

Bu rejenerant bitkilerin hücrelerinde kromozom sayısı haploiddir (n). Yani normalde

vücut hücrelerinde taşımaları gereken kromozom sayısının yarısına eşittir. Oysa fertil

bitkilerin hücrelerinde diploid sayıda kromozomları olması gerekir. Bunun için

mikrosporlarla üretilen haploid bitkilere, döl almaşında bitkinin generatif evresine

ulaşmadan örneğin monokotillerde başaklanma evresi öncesi kromozom sayısını iki

katına çıkartıcı işlem yapılmalıdır. Bu işlemin temel özelliği hücre bölünmesinde iğ

ipliklerini etkilemek, böylece kromozom sayısını ikiye katlamaktır. İğ ipliklerini

9

etkileyerek kromozomların kutuplara dağılmasını engelleyen kolhisin gibi kimyasal

maddeler vardır. Bu maddeler belirli bir konsantrasyonda bir süre için kullanılır.

Böylece her mikrospora mayoz sonunda dağılmış olan genetik bilgi, varyasyonu

oluşturan genler ister resesif isterse dominant olsun, tam olarak ikiye katlandığından

homozigot olacak ve fenotipte kendini gösterebilecektir. Buna doubled haploid

sistem denir. Bu sistem sayesinde doubled haploid bitkilerde kromozom sayısı

diploid seviyeye ulaştığından morfolojik karakterlerde değişiklikler fertil olarak

izlenebilecek, kantitatif özellikte olanları sayısal olarak ve ölçümlerle

hesaplanabilecek, kalitatif özelliklerin ise analizleri yapılabilecektir (Savaşkan vd.,

2001; Savaşkan vd., 2003).

Maluszynski vd., (2003) mikrosporların in vivo ve in vitro koşullarda alternatif yollar

gösterebildiklerini bildirmişler ve bu yolları Şekil 1.1.’deki şematize etmişlerdir:

10

Şekil 1. 1. Mikrosporların in vivo ve in vitro koşullarda gösterdikleri alternatif yollar

(Maluszynski vd., 2003).

11

1.2. Susam Bitkisi

Susam (Sesamum indicum L.) (Şekil 1.1), Orta Afrika’dan dünyaya yayılmış olup

yaklaşık 4000 yıldır tarımı yapılan en eski yağ bitkilerinden birisidir (Koca, 2007).

Çok eski bir kültür bitkisi olmasına rağmen orijin merkezi kesin olarak

bilinmemektedir. Değişik araştırıcılar susam türlerinin üçte ikisinin Afrika’da yer

almasına ve ekonomik olarak susamın bu kıtada baskın olmasına dayanarak, bu

bitkinin orijinini Afrika olarak göstermişlerdir.

Şekil 1. 2. Susam (Sesamum indicum L.) bitkisinin genel görünümü a-b) Çiçek, c)

Kapsül, d) Açılmış kapsül içerisindeki tohumlar (Waynes Word, 2011).

Susam bitkisi ortalama bitki boyu 60-120 cm olan tek yıllık bir bitkidir. Kazık köklü

bir bitki olup kazık kök 1,0-1,5 m derinlere kadar inebilmektedir. Yapraklar polimorf

yapıdadır. Alt boğumlarda büyük ve geniş, üst boğumlarda dar ve uzundur. Bitkide

çiçekler çeşidine göre yaprak koltuğunda 1 ya da 3 adet olabilir. İki karpelli

a b

c d

12

susamların çiçek yapısı bellidir (en dışta 5 adet çanak yaprak, iç kısımda taç yaprak

ve biri dumura uğramış 4 adet erkek organ ve 1 adet dişi organ). Dişi organın

stigması iki parçalıdır. Çanak yapraklar dip kısımda birleşmişlerdir. Taç yaprakların

birleşmesi ile çiçek, bir çan şeklini almıştır. Dört karpelli susamlarda, erkek

organların sayısı farklı olup, 10’a kadar çıkabilmektedir. Stigma ise 4 parçalıdır.

Susam kendine döllenen bir bitkidir.

Susam; tropikal savana, kuru tropikal, step alanları, nemli subtropikal ve kuru

subtropikal (Akdeniz Bölgesi vb.) bölgelerde yetişebilen bir bitkidir (Koca, 2007).

Ülkemizde tescilli çeşit olarak Gölmarmara (beyaz susam), Muganlı 57 (sarı susam)

ve Özberk 82 (sarı susam) çeşitleri bulunmaktadır. Bunlara ilaveten, 1999 yılında ana

ve ikinci ürün koşullarına uygun, bol dallanan, uzun boylu, bol kapsüllü ve yüksek

verimli 5 adet beyaz susam çeşidi; Kepsut 99, Cumhuriyet 99, Osmanlı 99, Tan 99 ve

Orhangazi 99 Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü tarafından, sarı susam grubunda

Baydar 2001 çeşidi ise Batı Akdeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü tarafından tescil

ettirilmiştir (Tan, 2007).

Bu tez çalışmada ekonomik öneme sahip susam bitkilerinde çok az literatürün

bulunduğu anter kültürü konusu araştırılarak bilimsel araştırmalara mütevazi bir

katkı amaçlanmıştır. Bu çalışma için 3 susam genotipinin (Baydar-2001, Muganlı-57

ve Denizli-Çal yerel) erkek üreme hücrelerinde totipotensi yeteneği ele alınmıştır.

Çalışma için bu genotiplerden alınan anterler ile doku kültürü çalışmaları yapılmıştır.

Bu teze konu olan bitkide anter kültürü çalışmalarının yürütülebilmesi için öncelikle

donör bitkilerin yetiştirilmesi ile uygun tomurcuk ve mikrospor safhaları belirlenmesi

çalışmaları yapılmıştır. Uygun safha belirlenmesi çalışmalarının ardından yetiştirilen

donör bitkilerden alınan anterlerin totipotensi yetenekleri genotip ve anterlere

uygulanan soğuk önişleme göre değerlendirilmiş ve bu iki etkene göre susam bitkisi

anterlerindeki kallus oluşturma potansiyelinin belirlenmesine çalışılmıştır.

13

2. KAYNAK ÖZETİ

Kim vd. (1987), çalışmalarında susam bitkisinden doku kültürü için alınacak uygun

eksplantın ve büyüme düzenleyicilerinin bulunmasını amaçlamışlardır. Susam

bitkisinden aldıkları hipokotil ve kök eksplantlarını çalışmalarında kullanmışlardır.

Hazırladıkları kültür ortamına iki farklı konsantrasyonda 2,4-D (2,4-

diklorofenoksiasetik asit), ve ayrıca Kinetin eklemişlerdir. 2,4-D ile yürüttükleri

çalışmalarında her iki eksplantın da hazırladıkları kültür ortamında kallus oluşturma

potansiyelleri için fark gözlenmediğini ancak 2,4-D ile birlikte kinetin

uyguladıklarında kallus oluşmadığını belirtmişlerdir.

Lee vd. (1988), dört yerel susam çeşidinde (Sesamum indicum L. var. Kwangsan,

Pungnyeon, Danbaeg ve Hongsam) anter kültür denemeleri üzerine büyüme

düzenleyicilerin, soğuk önişlemin ve genotipin etkisini araştırmışlardır. Kültür

ortamı olarak modifiye MS (Murashige ve Skoog) kültür ortamı kullanmışlardır.

Kültür ortamına 2mg/L 2.4-D, 1mg/L NAA(naftalenasetikasit) ve 2mg/L of kinetin

ekleyerek modifiye ortamı hazırlamışlardır. Çalışmalarında kullandıkları çeşitlere

10oC’de 6 günlük süre ile soğuk önişlem uyguladıklarında ortalama kallus yüzdesini

%80 olarak bulmuşlardır. Gerçekleştirdikleri bu çalışmada Pungnyeon çeşidinin

hazırladıkları kültür ortamına en iyi cevap veren çeşit olduğunu belirtmişlerdir.

Ram vd. (1990), çalışmalarında pamuk, ayçiçeği ve susam gibi yağ bitkilerinin

geliştirilmesinde yeni tekniklerin kullanılmasının öneminden bahsetmişlerdir. Doku

kültürü çalışmalarının bu bitkilerde yapılmasının, özellikle zengin oleik asit,

antioksidan ve uzun zincirli yağ asitleri içeriği ile özel bir kimya marketi olarak

niteledikleri susam bitkisine uygulanmasının değerinden bahsetmişlerdir.

Ranaweera vd. (1992), susam bitkisi anterlerini kullanarak bir doku kültürü çalışması

yapmışlardır. Çalışmalarında MS kültür ortamına ilave ettikleri, farklı

konsantrasyonlarda hazırlanmış 2,4-D, IAA (3-indolasetik asit) ve BAP (6-

benzilaminopürin) büyüme düzenleyicileri kullanmışlardır. Eksplant olarak

kullanacakları anterleri, çiçekler tam olarak açmadan önce alarak haploid bitki

üretimi için oldukça önemli bir aşama olan soğuk ön işleme almışlar ve bu işlemi

anterleri 8oC’de 24 saat karanlık bir ortamda tutarak gerçekleştirmişlerdir.

14

Araştırmacılar farklı kombinasyonda ve konsantrasyonda hazırladıkları 5 farklı

kültür ortamını, meydana gelen kallus yüzdelerini hesaplayarak kallus oluşumu için

en uygun büyüme düzenleyici kombinasyonu ve konsantrasyonunu araştırmışlar ve

bu ortamlardan hangisinin en iyi sonucu verdiğini bulmaya çalışmışlardır. Elde

ettikleri sonuçlara göre 10mg/L 2,4-D, 2mg/L IAA ve 2mg/L BAP düzenleyicileri ile

hazırlanan kültür ortamının en iyi sonuç verdiğini belirtmişlerdir.

Kwon vd. (1993), Sesamum indicum ve Sesamum orientale çeşitlerinde hipokotil ve

kotiledon eksplantları kullanarak kallus üretimini araştırmışlardır. Çalışmalarında

NAA, 2,4-D, BAP ve IAA’nın farklı konsantrasyonları ile modifiye edilmiş MS

kültür ortamı kullanmışlardır. Çalışmalarındaki amaç farklı çeşitlerden alınan

eksplantların üzerine büyüme düzenleyicilerinin etkisini ortaya koymak olmuştur.

Elde ettikileri sonuçlar göre 1-2mg/L NAA ve 0,2-0,6 mg/L BAP’ın

kombinasyonunda hazırlanan kültür ortamındaki hipokotil ve kotiledon

eksplantlarının kallus oluşturma kapasitelerinin en yüksek olduğunu belitmişlerdir.

Takebayashi vd. (1994), 35oC’de kültürünü yaptıkları susam fidelerinin bazı

bölümlerinden aldıkları eksplantları modifiye MS ortamına aktararak susamda

bulunan anti-oksidanlar (sesamol ve α-tokoferol) üzerine bir çalışma

gerçekleştirmişlerdir. Kültür ortamını modifiye ederken sitokinin olarak BAP ya da

kinetin ile oksin olarak ise 2-4D ya da IAA’nın farklı konsantrasyonlarını

kullanmışlardır. Araştırmacılar kallus üretimi için 1x10-5M BAP ve 1x10-5M NAA

ile modifiye edilmiş kültür ortamı kullandıklarını belirtmişlerdir

Tütün (Nicotiana tabacum L.) anter kültüründe genotip ve besi ortamının haploid

bitki oluşumuna etkisini saptamak amacıyla sürdürdüğü çalışmasında Sakin (1994),

Türkiye’nin farklı bölgelerinde toplanan 20 genotipten alınan anterleri iki farklı besin

ortamında (MS ve N6 (Nitsch ve Nitsch)) kültüre almış ve araştırmaları sonucunda

reaksiyon gösteren anter oranı ve rejenerasyon oranının büyük ölçüde genotipik etki

altında olduğunu bulmuştur. Ayrıca çalışmaları sonucunda reaksiyon gösteren anter

oranı açısından MS ortamının N6 ortamına göre daha üstün olduğunu, rejenerasyon

açısından ise ortamlar arasında istatistiksek olarak önemli bir farklılık olmadığını

belirtmiştir.

15

Susamla çalışan Baskaran ve Jayabalan (2006), hipokotil ve kotiledon eksplantları ile

somatik doku kültürü çalışması yapmışlardır. Çalışmalarında kültür ortamı olarak,

MS kültür ortamına çeşitli konsantrasyonlarda eklenmiş büyüme regülatörlerini

kullanmışlardır. Çalışmada 2.4-D, NAA, BAP ve kinetin kombinasyonlarını

eksplantlara uygulayarak, eksplantlardan kallus meydana gelme miktarını

belirlemişlerdir. Ayrıca sürgünlerin NAA içerisinde köklenmesini sağlanmışlardır.

Araştırmacılar bu çalışmalarında susamdan aldıkları eksplantların hangi koşullarda

en iyi bitki rejenerasyonu yapabildiklerini bulmaya çalışmışlardır. Araştırmacılar

çalışmalrı sonucunda hipokotil eksplantlarının kallus üretimi için en iyi eksplant

olduğunu belitmişler ve 2.2–22.6 μM 2,4-D ve 2.6–26.8 μM NAA konsantrasyon

aralıklarında kültür ortamına ilave edilen büyüme düzenleyicilerinin kallus üretimi

için en uygun olduğunu belirtmişlerdir.

Ferrie (2007), endüstriyel olarak birçok alanda kullanımları olan Caryophyllaceae ve

Apiaceae (Umbelliferae) familyaları ile St. John’s wort (Hypericum perforatum L.),

Keten (Linum usitatissimum L.), Zencefil (Zingiber officinale Rosc.) ve Susam

(Sesamum indicum L.) gibi türlerin üzerine yapılmış olan haploid bitki üretimi,

embriyogenezis çalışmaları ve mikrospor kültürü üzerine araştırmaları derlemiştir.

Bu derlemede susam bitkisi ile yapılan mikrospor kültürü çalışmalarında modifiye

MS kültür ortamının kullanıldığına dikkat çekmiştir. Ferrie, kültür ortamının

modofiyesi için kullanılan yüksek konsantrasyondaki kinetinin kallus üretimi için

olumlu etki yaptığını oysa düşük konsantrasyonda kinetine ilaveten yüksek

konsantrasyonda IAA’nın da kullanılmasının kallus üretimini inhibe ettiğini

belirtmiştir.

Ahmed vd. (2008), susam tohumlarını doku kültürü ortamına alarak tohumlardan

(embriyolardan) meydana gelecek bitki rejenerasyonunu gözlemlemişlerdir. Doku

kültür ortamı olarak MS ortamı kullanmışlar ve bu ortama ekledikleri kinetin, BAP

ya da NAA’nın kombinasyonları ile bitki rejenerasyonu için optimum koşulu

bulmaya çalışmışlardır. Ayrıca buldukları bu optimum kültür ortamını farklı

genotiplerdeki susam tohumlarına uygulayarak bitki rejenerasyon yüzdesini

hesaplamışlardır. Araştırmacılar çalışmadan elde ettikleri sayısal verilerin

analizlerini çeşitli istatistik metodlarıyla değerlendirerek en güvenilir sonuca

ulaşmaya çalışmışlardır. Elde ettikleri veriler sonucunda BAP ekledikleri ortamın

16

kinetin ilave edilen artamdan daha iyi olduğunu belitmişler ve en iyi sonuca 1 mg/L

BAP ilave edilmiş kültür ortamında ulaşmışlardır. Çalışmalarında kullandıkları 3

büyüme düzenleyicisi birlikte kullandıklarında ise elde ettikleri sonucun oldukça

yetersiz olduğunu belirtmişlerdir. Ayrıca araştırıcılar çalışmaları sonucunda kültür

ortamına eklenen yüksek konsantrasyondaki sitokininlerin kallus ve sürgün

oluşumunu engelleyici etkisinin önemini de belirtmişlerdir.

Chakraborti ve Ghosh (2010), farklı genotipe sahip susamlarda kök-sürgün

tomurcuklarından kallus üretimi ile tohum kabuğu kalınlığı arasındaki ilişkiyi

incelemişlerdir. Bu araştırmalarında önceden depolanmış olan farklı renklerdeki ve

farklı tohum kabuğu kalınlığına sahip tohumların ekimi ile elde ettikleri taze donör

bitkilerinden eksplant olarak kök-sürgün tomurcuklarını alarak modifiye B5 ortamına

aktarmışlardır. Bu somatik çalışma sonrasında normal şartlar altında depolanmış

tohumlardan elde edilen eksplantların kallus başarısının tohum kabuğu kalınlığı ile

ters orantılı olduğunu bulmuşlardır.

Shashidhara vd. (2011), Sesamum indicum ve Sesamum mulayanum türlerinden

alınan hipokotil eksplantları ile yaptıkları çalışmalarında, MS kültür ortamına

ekledikleri farklı kombinasyon ve konsantrasyonlardaki NAA, 2,4-D, kinetin,

AgNO3 ve BAP için kallus üretim başarısını bulmaya çalışmışlardır. MS kültür

ortamına 0.5 mg/L NAA, 1.5 mg/L kinetin ve 1.5 mg/L BAP konbinasyonu ve

konsantrasyonunda ilave ettikleri büyüme düzenleyicileri ile en etkili kallus üretim

başarısına ulaşmışlardır.

17

3. MATERYAL VE METOT

3.1. Materyal

Bu tezde çalışılan susam bitkisinin (Sesamum indicum L.) Baydar-2001 ve Muganlı-

57 çeşitlerinin tohumları Süleyman Demirel Üniversitesi Ziraat Fakültesi Öğretim

Üyesi Sayın Prof. Dr. Hasan BAYDAR’dan ve yerel genotip olarak çalışılan diğer

tohumlar ise Denizli’nin Çal ilçesinin Akkent kasabası’nda uzun yıllardır ekimi

yapılan susam bitkilerinden alınmıştır.

3.2. Metot

3.2.1. Donör bitkilerin yetiştirilmesi

Tohumların ekimi yapılacak toprak 2:1 oranında 2 kısım torf toprağı ve 1 kısım kum

olacak şekilde hazırlandı. Susam tohumları, çeşitlerine göre gruplandırılarak her

saksıda 6’şar adet olacak şekilde ekildi, ekilen tohumlardan uygun donör bitkinin

alınabilmesi için saksılar 24oC ± 2oC’de, 16/8 saat gündüz/gece ışık rejimine ayarlı

bitki büyüme odasına yerleştirilmiştir.

Susam bitkisi, gelişme boyunca ardışık olarak çiçek oluşturduğundan dolayı çiçek

tomurcukları her gün takip edilerek uygun zamana gelmiş tomurcuklar, anterleri

kullanılmak üzere donör bitkiden alındı. Susam bitkisi üzerinde anter kültürü metodu

ile yapılan çalışmaların hem sayıda az olması hem de mevcut olan çalışmalarda

uygun zamana gelmiş anterlerin hangi safhadaki tomurcuklarda bulunduğu bilgisi

bulunmadığı için uygun tomurcuk safhası sitolojik çalışmalarla belirlenmiştir.

Uygun duruma gelmiş çiçek tomurcukları donör bitkiden toplandıktan sonra, ön

işleme tabi tutularak ya da ön işlemsiz olarak anterleri alındı ve hazırlanan uygun

kültür ortamına ekimleri yapıldı.

3.2.2. Sitolojik çalışmalar

In vitro androgenesisin başarıyla uyartılmasında etkili olan en önemli faktörlerden

birisi, anterlerin donör bitkiden izole edildiği anda mikrosporların içinde

18

bulundukları gelişme dönemidir. Çoğu bitki türünün mikrospor kültürlerindeki en iyi

sonuçlar, tek çekirdekli mikrospor döneminin orta-geç safhasındaki mikrosporları

içeren anterlerden alınmaktadır (Rudolf vd., 1999; Zheng, 2003).

Mikrosporlar içerisinde nişasta depolanmaya başladıktan sonra, gelişmeyi sporofitik

yöne kaydırmak ve haploid embriyo elde etmek için yapılacak uyarılar etkili

olamamaktadır. Anterlerdeki mikrosporların gelişme dönemini tespit etmek amacıyla

sitolojik gözlemler yapmak gerekmektedir (Reynolds, 1993).

Doğru aşamadaki mikrosporları bulunduran anterlerin ve tomurcukların morfolojik

özellikleri de tanımlandığında, mikrospor kültürü için tomurcuk toplama daha kolay

bir işlem haline gelmektedir (Coşkun, 2011).

3.2.2.1. Çiçek tomurcuklarının gruplandırılması

Çalışmalarda kullanılacak olan susam bitkisinin tomurcukları içerisindeki

mikrosporların gelişim safhalarını belirlemek ve uygun tomurcuk tanımı yapabilmek

için farklı gelişim safhasındaki tomurcuklar gruplandırılarak (Şekil 3.1), her bir

safhadaki mikrospor gelişmesi takip edildi. Tomurcukların safhalara göre

gruplandırılması sepal ve petallerin durumları göz önüne alınarak yapılmıştır.

Şekil 3. 1. Farklı gelişim evrelerindeki tomurcuk örnekleri.

19

3.2.2.2. Uygun tomurcuk safhasının tespiti

Uygun tomurcuk safhasının tespiti çalışmalarında genel kabul gören tek çekirdekli

mikrosporları içeren tomurcuklar belirlenmeye çalışıldı. Bunun işlem için safhalarına

göre önceden gruplandırılan tomurcuklardan anterler alınarak asetokarmin ile tespit

edilmiş ve mikroskop altında incelendi.

Asetokarmin ile Boyama: Tek çekirdekli mikrospor safhasını tespit etmek amacıyla

kullanılan yöntemler arasında en pratik yöntem olarak bilinen bu yöntemde, farklı

büyüklükteki canlı tomurcuklardan alınan anterler lam üzerine yerleştirildi ve bisturi

ucu yardımıyla anterlerin içerisindeki mikrosporlar serbest hale getirildi. Üzerine 1-

2 damla asetokarmin damlatıldıktan sonra üstü lamelle kapatılan ezme preparatlar

ışık mikroskobunda incelendi.

Asetokarmin Hazırlanışı: 55 ml saf su içerisine 45 ml glasiyal asetik asit ilave

edilerek kaynatıldı ve sonra bu karışıma 1 g karmin eklenerek filtre edildi.

3.2.3. Anterlere yapılan soğuk ön işlem uygulaması

Bu çalışmaya materyal olan susam bitkisi tomurcukları üzerinde, ön işlem

optimizasyonu hakkında, uygun bir çalışmaya literatürde rastlanmadığı için,

denemeler; ön işlemsiz (kontrol grubu) tomurcuklar ile +4oC’de 24 saat soğuk

önişlem uygulanmış tomurcuklar (Şekil 3.2 a,b) ile gerçekleştirildi. Böylelikle bu

çalışma ile de susam bitkisi üzerine yapılacak olan anter kültürü çalışmaları için

soğuk ön işlemin etkisi tespit edilmeye çalışıldı.

Şekil 3. 2. Soğuk önişlem için hazırlık. a) tomurcukların petri kabına konulması b)

soğuk ön işlem için hazırlanan petri kabının kapatılıp işaretlenmesi.

a b

20

Donör bitkiden alınan ve yüzey sterilizasyonu yapılmış olan tomurcuklar çeşitlerine

göre, 9 cm’lik steril petri kaplarına alındı. Bu petri kabına, tomurcuklar

yerleştirilmeden önce, içinde saf su bulunan ağzı açık 3cm’lik petri kabı konuldu.

Daha sonra da 9cm’lik petri kabının kapağı kapatılarak etrafı sıkıca parafilm ile

kapatıldı ve kabın üzerine gerekli olan bilgiler yazılarak +4oC’deki buzdolabına

yerleştirildi.

3.2.4. Anterlerin kültüre alınması

Uygun safhada olduğu belirlenen tomurcuklar donör bitkiden toplanıp (Şekil 3.3 c)

çeşitlerine göre ayrı ayrı petri kaplarına alındı. Petrilere alınan tomurcuklar yüzey

sterilizasyonu için %70’lik alkolle muamele edildi (Şekil 3.3 d). Sterilizasyonu

yapılmış tomurcuklardaki anterler, steril kabinde tek tek tomurcuklarından ayrılarak

yine çeşitlerine göre aynı kültür ortamında, farklı petrilere alındı (Şekil 3.3 e,f). Bu

işlemleri tamamı steril odada, çalışma başlamadan önce yüzey ve hava sterilizasyonu

yapılmış steril kabin (Şekil 3.3 a,b) içerisinde yapıldı.

Şekil 3. 3. Steril kabinde yapılan işlemler. a) çalışmaların yapıldığı steril kabin b)

steril kabinin sterilizasyonu c) uygun tomurcukların donör bitkiden

alınması d) tomurcukların sterilizasyonu.

a b

d c

21

Şekil 3.3. (devam) e-f) tomurcuklardan anterin alınarak kültür ortamına

yerleştirilmesi.

3.2.5. Kültür ortamının hazırlanışı

Kültür için Murashige ve Skoog (1962) tarafından geliştirilen MS ortamı (Çizelge

3.1) kullanıldı. Bu kültür ortamı seçilirken literatür taraması sonucunda elde edilen

bilgilerden yararlanıldı (Ranaweera, vd., 1992; Kwon, vd., 1993). MS kültür

ortamında kullanılan bileşenler hassas terazide ölçülerek ağırlık/hacim (w/v) esasına

göre hazırlandı. Standart MS kültür ortamı hazırlanırken, kültür ortamı bileşenleri

kendi gruplarında (makro-mikro elementler vb.) stok çözeltiler şekilde hazırlandı.

Stok çözelti hazırlanması tartım kolaylığı getirmesi sebebiyle, küçük miktarlardaki

tartımların çalışmacıdan kaynaklanan tartım hatasının en aza indirilmesi için gerekli

bir işlemdir. Bu sebeple gerekli hesaplamaların ardından makro elementler 10 kat

yoğunlukta (10x), Na2EDTA, FeSO4.7H2O çözeltileri, mikro elementler ve

vitaminler ayrı ayrı 100 kat yoğunlukta (100x) olacak şekilde stok çözeltiler şeklinde

hazırlandı.

Bu çalışma için gerekli olan 1 L’lik kültür ortamı önceden hazırlanmış olan stok

çözeltilerin uygun miktarları karıştırılarak hazırlandı. Bu işlem sırasında şu yöntem

takip edildi:

Öncelikle makro ve mikro elementler ile vitaminler, karışımlarının yapılacağı bir

erlen içerisine stok çözeltinin derişimine uygun olarak alınarak, aynı çözelti içerisine

agar haricindeki organik bileşenler de eklenerek, toplam hacmin 450 ml olacak

şekilde karışmaları sağlandı. Daha sonra MS kültür ortamı için belirtilen agar miktarı

e f

22

toplam hacim 500 ml olacak şekilde saf suda bir erlen içerisinde çözüldü. Son olarak

da bu iki çözelti birlikte karıştırılarak 121oC’de 20 dakika boyunca otoklavlanmak

suretiyle sterilize edildi.

Çizelge 3. 1. Murashige ve Skoog (1962) tarafından geliştirilen MS kültür ortamı

bileşenleri.

Makro Elementler Konsantrasyon (mg/L)

NH4NO3 1650

KNO3 1900

CaCl2 . 7H2O 440

MgSO4 . 7H2O 370

KH2PO4 170

Demir Kaynağı

Na2EDTA 37.3

FeSO4 . 7H2O 27.8

Mikro Elementler

KI 0.830

MnSO4 . H2O 22.30

Na2MoO4 . 2 H2O 0.250

CoCI2 . 6 H2O 0.025

H3BO3 6.200

ZnSO4 . 7 H2O 8.600

CuSO4 . 5 H2O 0.025

Vitaminler

Pridoksin- HCI 0.5

Nikotinik asit 0.5

Tiamin- HCI 0.1

Organik Bileşenler

Sükroz 30 g/L

Glisin 2

Bakto-agar 7 g/L

myo-Inositol 100

23

Bu çalışmada standart MS kültür ortamına kallus üretimini desteklemek için bazı

bitki büyüme maddeleri (2mg/L dikamba ve 1mg/L kinetin) eklendi. Bu bitki

büyüme maddelerinin çeşidi ve miktarları gerek ön denemelerden gerekse de literatür

taramalarında karşılaşılan çeşit ve miktarlardan yola çıkılarak hesaplandı

(Ranaweera, vd., 1992; Kwon, vd., 1993; Ahmed, vd., 2008). Kültür ortamına

eklenecek olan bu bitki büyüme maddelerinin diğer kültür ortamı bileşenleri gibi stok

çözeltileri hazırlanarak kültür ortamına aktarıldı. Bu stok çözelti için 100 mg

dikamba, 70-80 ml % 96’lık etil alkol içerisinde, 100 mg kinetin ise 70-80 ml HCl

içerisinde çözüldükten sonra hacim distile su ile 100 ml olacak şekilde tamamlandı.

Böylece son hacimde 1,0 mg/ml’lik dikamba ve kinetin stok solüsyonları hazırlandı.

Bu stok solüsyonundan 2ml dikamba ve 1ml kinetin alınarak son hacim 50 ml olacak

şekilde çözelti hazırlandı. Bu bitki büyüme maddelerinin steril kültür ortamına

aktarılmadan önce sterlizasyonuun yapılması gerekmektedir. Bunun için bitki

büyüme maddeleri çözeltisi vakum pompası yardımıyla mikro filtreden geçirilerek

çözeltinin sterlizasyonu sağlandı.

Bu çalışmada kullanılacak büyüme maddeleri ile modifiye edilmiş MS kültür

ortamını hazırlamak için, otoklavdan çıkarılan makro ve mikro elementleri,

vitaminleri ve organik maddeleri içeren 950 ml’lik çözelti ile son hazırlanan 50ml’lik

steril bitki büyüme maddesi çözeltisi iyice karıştırılarak 1L’lik modifiye MS kültür

ortamı hazırlandı. Hazırlanan bu çözelti katılaşmadan önce kültür ortamı olarak

kullanılacak önceden sterilize edilmiş petri kaplarına steril kabinde yeterli miktarda

konularak yine steril kabinde katılaşmaya bırakıldı.

24

4. ARAŞTIRMA BULGULARI

4.1. Sitolojik Çalışmalar Sonucu Elde Edilen Bulgular

4.1.1. Uygun tomurcuk safhasına ilişkin bulgular

Bu çalışma sonucunda en uygun tomurcuk safhası, tomurcuk gruplandırılması

yapılmış olan tomurcuklardan Şekil 4.1 deki a ve b görüntülerindeki safha olduğu

bulunmuştur. Bu safha belirlenirken daha önce de değinildiği üzere tomurcuğu

oluşturan sepal ve petallerin durumları göz önüne alınmıştır. Uygun tomurcuk safhası

olarak belirlenen tomurcukların sepal ve petal durumları şöyle açıklanabilir:

Sepaller tomurcuk üzerine bitişik, uç kısımları ayrılmamış, petal oluşumu sepallerin

arasından gözle görülebilir ve tomurcuktaki sepal ve petaller yaklaşık olarak aynı

boydadır (Şekil 4.1).

Doku kültürü çalışmaları için uygun safha olarak tanımlanan bu tomurcuklardaki

anterlerin mikrosporları tek çekirdekli safhadadırlar (Şekil 4.1 f,g) ve ekzin yapıları

tam olgunlaşmamıştır (Şekil 4.1 c,d,e,f,g). Mikrosporlar erkek gametofitin başlangıç

aşamasıdır. Diğer bir deyişle olgunlaşmamış polen taneleridir ve bir bitkiyi

oluşturmak için yeterli tüm genetik bilgiyi taşımaktadırlar.

25

Şekil 4. 1. Uygun safhadaki tomurcuk ve mikrosporlar. a-b) uygun safhada anter

içeren tomurcuk örnekleric-d-e) uygun safhada bulunan mikrospor

örnekleri f-g) tek çekirdekli mikrospor safhasının görüntüsü.

a b

c d

f

e

g

26

Donör bitkiden alınan tomurcuklardaki petallerin boyu, uygun safhada olarak

tanımlanmış tomurcukların aksine, sepallerin boyuna ulaşmamış ise bu tomurcuklar

erken safhadaki tomurcuklar olarak tanımlanabilir (Şekil 4.2 a,b). Bu tomurcuklarda

bulunan anterlerin mikrosporları tek çekirdekli safhaya henüz geçmemiş ve tetrat

durumundadırlar (Şekil 4.2 c,d). Eğer donör bitkiden alınan tomurcuklardaki

petallerin boyu, sepallerin boyunu geçmiş ise (Şekil 4.3 a,b), bu tomurcuklardaki

anterlerin mikrosporları geç safhadadırlar yani tek çekirdekli safhaya aşmış ve ekzin

yapıları olgunlaşmıştır (Şekil 4.3. c,d). Bu iki tipteki mikrosporlar da doku kültürü

çalışmaları için uygun değillerdir.

Şekil 4. 2. Erken safhadaki tomurcuk ve mikrosporlar. a-b) Erken safhadaki

tomurcuklar c-d) Erken safhadaki tetrat durumunda mikrosporlar.

a

d c

b

27

Şekil 4. 3. Geç safhadaki tomurcuk ve mikrosporlar. a-b) Geç safhadaki

tomurcuklar c-d) Geç safhadaki mikrosporlar.

a b

c d

28

4.2. Kültür Ortamından Elde Edilen Bulgular

4.2.1. Kültür ortamına cevap veren anterlerin tespiti

Uygun safhada oldukları belirlenen anterlerin steril ortamda hazırlanan kültür

ortamlarına alınmalarından sonra anterlerin konuldukları ortamdaki durumları takip

edilmiştir. Şekil 4.4’de görülen ortama konulmamış, donör bitkiden henüz alınmış

anterler (Şekil 4.4 a) ve kültür ortamında bir süre inkübe edilmiş anterler (Şekil 4.4

b,c,d) karşılaştırılarak, kültür ortamına cevap vererek kallus oluşumuna yönelen

anterler (Şekil 4.4 c,d) tespit edilmiştir.

Kültür ortamına aktarılan anterlerin cevap verip vermeme durumları donör bitkinin

genotipine ve anterlere ön işlem uygalanması ya da uygulanmamasına göre farklılık

görtermektedir. Bu farklılığı ortaya çıkarmak için tespit çalışmalarında anterler stero

mikroskop altında incelenmiş ve daha önce verilen kallus tanımına uygun anterler

cevap veren anterler olarak sayılmıştır.

Şekil 4. 4. Cevap veren ve vermeyen anter örnekleri a) yeni alınan anter görüntüsü

b) kültür ortamında inkübe edilmiş ancak cevap vermeyen anter örneği c-

d) kallus meydana getiren anter örnekleri.

d c

b a

29

4.2.2. Bitki çeşidine ve soğuk önişlem uygulaması göre kültür ortamına cevap

veren ve kallus meydana getiren anter sayıları ve yüzdeleri

İnkübasyon sonucunda, hazırlanan kültür ortamına cevap veren anter sayısı

bulunarak totipotensi yeteneğindeki anter yüzdeleri tespit edilmiştir.

Çizelge 4.1., 4.2. ve 4.3.’de verilen bilgilere bakılacak olursa genotiplerin aynı kültür

ortamına verdiği tepkilerin farklı olduğu açıkça görülebilmektedir. Kallus meydana

getiren anter yüzdelerine baktığımızda, Denizli-Çal yerel genotipi ile soğuk önişlem

uygulamadan yapılan anter kültürü çalışması sonunda, bu çeşidin toplam 82

anterden, %50,642 gibi bir değerde kallus oluşturma yüzdesine sahip olduğu ve

Muganlı-57 ve Baydar-2001 çeşitlerinin kallus meydana getirme yüzdeleri ise

sırasıyla toplam 129 ve 251 anterden, %18,694 ve %18.388 olduğu hesaplanmıştır.

Bu duruma göre soğuk önişlem uygulaması yapılmadan gerçekleştirilecek bir anter

kültürü için Denizli-Çal yerel genotipinin diğer genotiplere göre anter kültürü

çalışmalarına daha uygun olduğu söylenebilir. Ancak bu çeşidin soğuk önişlem

olmadan yapılan çalışmalarda kallus veriminin yüksek olmasına rağmen, her bir

yaprak koltuğundan çıkan tomurcuk sayısının 1 olması ve dolayısıyla anter sayısı

verimliliğinin de diğer çeşitlere göre düşük olması sebebiyle anter kültürü

çalışmalarını olumsuz etkilemektedir. Yerel genotip ile yapılacak olan 24 saat soğuk

önişlem uygulamalı anter kültürü çalışmalarında, soğuk önişlemin, toplam 51

anterden, kallus yüzdesini %60,880 değerine yükselttiği hesaplanmıştır. Ancak soğuk

önişlemin kallus yüzdesine olan etkisi diğer çeşitlerde daha fazla gözlemlendiği için

soğuk önişlemle yapılacak olan anter kültürü çalışmalarında diğer genotipler daha

değerlidir. Ayrıca yerel genotip tohumlarından elde edilen donör bitkilerin, diğer

çeşitlerle aynı şartlarda yetiştirilmelerine rağmen, bitkilerin genel durumları diğer iki

çeşide göre cılız kalmakta dolayısıyla sağlıklı çiçek tomurcuklarının sayısının da

düşük olmasına sebep olmaktadır. Bu da Denizli-Çal yerel genotipinin diğer çeşitlere

göre anter kültürü çalışmalarını olumsuz etkilemektedir.

Muganlı-57 ve Baydar-2001 çeşitlerine baktığımızda, soğuk önişlem olmadan

yapılacak anter kültürü çalışmalarında, bu çeşitlerin yerel genotipe göre düşük kallus

verimliliklerinin olduğu bulunmuştur. Ancak 24 saat soğuk önişlem uygulamalı anter

kültürü çalışmalarının bu iki çeşidin kallus verimliliğini oldukça yüksek değerlere

30

çıkardığı bulunmuştur. Bu değerler sırasıyla toplam 90 ve 181 anterden, %77,661 ve

%63,161 olarak hesaplanmıştır. Bu hesaplamalar ışığında kallus verimliliğinin soğuk

önişlem uygulaması ile önemli derecede arttırıldığı söylenebilir. Buna göre soğuk

önişlem uygulaması ile gerçekleştirilecek olan bir anter kültürü çalışması için, ele

alınan bu üç genotip yeterli verimliliğe sahiptir. Ancak soğuk önişlem uygulanan

anter kültürü çalışmalarında da genotipin kallus verimliliği üzerine olan etkisi net bir

şekilde görülmektedir. Bu durumda Muganlı-57 çeşidinin 24 saat soğuk önişlem

uygulamalı anter kültürü çalışmaları için daha değerli olduğu söylenebilir. Ayrıca

Muganlı-57 ve Baydar-2001 çeşitlerinin her bir yaprak koltuğundan 2 hatta bazen 3

adet tomurcuk çıkışının olması ve bu çeşitlerin aynı şartlar altında yetiştirilmelerine

rağmen, yerel genotipe göre, daha sağlıklı tomurcuklar meydana getirmesiyle anter

kültürü çalışmaları daha rahat yürütülmektedir.

31

Çizelge 4. 1. Denizli-Çal (Yerel Çeşit) genotipine ait veriler.

Çizelge 4. 3. Muganlı-57 çeşidine ait veriler

Çiz

elg

e 4

. 2

. D

eniz

li-Ç

al g

eno

tip

ine

ait

ver

iler

GE

NO

TİP

Ön

İşl

em

(saat)

An

terl

erin

Kon

uld

uğu

Pet

ri

nu

mara

sı

Ort

am

a

Kon

an

An

ter

Sayıs

ı

(n)

Cev

ap

Ver

en

An

ter

Sayıs

ı

(n)

Cev

ap

Ver

en

An

ter

Yü

zdes

i

(%)

Kall

us

Mey

dan

a

Get

iren

An

ter

Sayıs

ı

(n)

Kall

us

Mey

dan

a

Get

iren

An

ter

Yü

zdes

i

(%)

Den

izli

– Ç

al

0

1

11

1

9,0

91

2

18,1

82

2

29

2

6,8

97

16

55,1

73

3

42

4

9,5

24

33

78,5

72

24

1

27

4

14,8

15

16

59,2

59

2

24

2

8,3

33

15

62,5

00

32

Çizelge 4. 5. Baydar 2001 çeşidine ait veriler.

Çiz

elg

e 4

. 4

.Mugan

lı-5

7 ç

eşid

ine

ait

ver

iler

ÇE

ŞİT

Ön

İşl

em

(saat)

An

terl

erin

Kon

uld

uğu

Pet

ri

nu

mara

sı

Ort

am

a

Kon

an

An

ter

Sayıs

ı

(n)

Cev

ap

Ver

en

An

ter

Sayıs

ı

(n)

Cev

ap

Ver

en

An

ter

Yü

zdes

i

(%)

Kall

us

Mey

dan

a

Get

iren

An

ter

Sayıs

ı

(n)

Kall

us

Mey

dan

a

Get

iren

An

ter

Yü

zdes

i

(%)

Mu

gan

lı-5

7

0

1

28

2

7,1

43

11

39,2

86

2

28

3

10

,714

6

21,4

29

3

35

3

8,5

71

4

11,4

29

4

38

5

13

,158

1

2,6

32

24

1

28

4

14

,286

20

71,4

29

2

28

1

3,5

71

23

82,1

43

3

34

1

2,9

41

27

79,4

12

33

Çiz

elg

e 4

. 6

. B

ayd

ar 2

00

1 ç

eşid

ine

ait

ver

iler

ÇE

ŞİT

Ön

İşl

em

(saat)

An

terl

erin

Kon

uld

uğu

Pet

ri

nu

mara

sı

Ort

am

a

Kon

an

An

ter

Sayıs

ı

(n)

Cev

ap

Ver

en

An

ter

Sayıs

ı

(n)

Cev

ap

Ver

en

An

ter

Yü

zdes

i

(%)

Kall

us

Mey

dan

a

Get

iren

An

ter

Sayıs

ı

(n)

Kall

us

Mey

dan

a

Get

iren

An

ter

Yü

zdes

i

(%)

Bayd

ar

- 2001

0

1

32

1

3,1

25

12

37,5

00

2

25

2

8,0

00

4

16,0

00

3

27

3

11,1

11

12

44,4

44

4

33

0

0

0

0

5

34

0

0

7

20,5

88

6

35

1

2,8

57

10

28,5

71

7

31

0

0

0

0

8

34

0

0

0

0

24

1

31

2

6,4

52

24

77,4

19

2

25

5

20,0

00

16

64,0

00

3

37

4

10,8

11

25

67,5

68

4

44

2

4,5

45

27

61,3

64

5

44

1

2,2

73

20

45,4

55

34

5. TARTIŞMA VE SONUÇ

Anter kültür tekniği yeni genotip oluşturmada ve haploid bitki üretiminde, ıslah

programlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada susam bitkisinin 3

farklı genotipinin anter kültürüne kabiliyeti soğuk önişlem koşullarının uygulaması

ya da hiçbir önişlem uygulanmaması ile araştırılmıştır.

Anter kültüründe başarı, çok büyük bir oranda anterlerin alındığı bitkilerin

genotipine bağlıdır (Duran, 2007). Yapılan bu çalışmada genotipler arasındaki, kültür

ortamına cevap veren anter sayısı ve yüzdesindeki farklılık soğuk önişlemin

uygulamasında ya da ön işlem uygulanmamasında açıkça görünmektedir. Elde edilen

bu sonuç daha önce yapılan anter kültürü çalışmaları ile paralellik göstermektedir.

Donör bitkinin genotipi kültür tekniğine oldukça uygun olsa da, mikrosporlardan in

vitro koşullarda haploid embriyo uyarımını başarabilmek için bu bitkilerin

yetiştirildiği ortam koşulları da oldukça önemlidir. Bitkilerin yetiştirildiği dönemdeki

ışık yoğunluğu ve kalitesi, günlük ışıklanma süresi, sıcaklık, havadaki CO2

konsantrasyonu ve bitkinin beslenme koşulları başta olmak üzere tüm çevresel

faktörler, o bitkilerden alınan mikrosporlardan elde edilecek başarı üzerinde etkili

olabilmektedir (Zheng, 2003).

Tekniği etkileyen diğer bir faktör mikrosporların konulduğu kültür ortamıdır. Bitki

türlerinin çoğuna cevap verebilecek bir mikrospor kültür ortamı geliştirmek kolay

değildir. Çünkü mikrospor cevabının aynı türdeki farklı genotipler arasında bile

farklılık gösterdiği bir olayda, ortak bir besin ortamı kullanmak çok zordur. Bu

yüzden, kültüre alınacak çeşidin mikrosporlarını embriyogenesise teşvik eden kültür

ortamındaki karbohidratlar, bitki büyüme düzenleyicileri, mineraller ve vitaminler

gibi besin maddeleri, ozmolarite ve ortamın yoğunluğu oldukça önemli olmaktadır

(Zheng vd., 2001).

Ferrie, (2007)’deki çalışmasında yüksek kinetin ilavesi ile hazırlanmış MS kültür

ortamının susam bitkisindeki kültür çalışmalarında başarının oldukça iyi olduğunu

kaydetmiştir. Ancak hazırlanacak kültür ortamına ilave edilen büyüme

düzenleyicilerinin yüksek konsantrasyonlarının kallus oluşumunda olumsuz etkisi

35

bilinmektedir (Kim vd.,1987; Baskaran ve Jayabalan, 2006 ve Ahmed vd., 2008). Bu

sebeple yapılacak olan kültür çalışmalarında en yüksek etkiye sahip en düşük

büyüme düzenleyicisi konsantrasyonu bulunmaya çalışılmalıdır.

Literatürde yer alan çalışmalara bakıldığında doku kültürü çalışmaları için hazırlanan

kültür ortamlarında farklı büyüme düzenleyicilerinin çok farklı kombinasyonlarının

ve konsantrasyonlarının kullanıldığı görülmektedir. Bu da yapılacak olan çalışmalar

için en iyi ortamın geliştirilmesine yönelik çalışmaların halen devam ettiğini

göstermektedir.

Şüphesiz ki, doku kültürü çalışmalarında genotipin kallus üretim başarısında kültür

ortamının etkisi de oldukça fazladır. Ancak her genotipe uygun kültür ortamının ayrı

ayrı çalışmaya dahil edilmesi sonuçların karşılaştırılması için uygun

olmayacağından, genotipler için uygun olacak en iyi kültür ortamı belirlenmiştir.

Bunun için bazı ön denemelerin yanı sıra literatürde önceki çalışmalarda belirtilen

MS kültür ortamı kullanılmıştır.

İn vitro androgenesisin başarıyla uyartılmasında etkili olan en önemli faktörlerden

birisi, anterlerin donör bitkiden izole edildiği anda mikrosporların içinde

bulundukları gelişme dönemidir. Çoğu bitki türünün anter kültürlerinde en iyi

sonuçlar, tek çekirdekli mikrospor döneminin erken veya geç aşamasındaki

mikrosporları içeren anterlerden alınmaktadır (Duran, 2007). Bu tek çekirdekli

mikrosporların bulunduğu dönem sitolojik çalışmalarda belirtilen yöntem ile

belirlenerek çalışmanın başarısının arttırılması sağlanmıştır.

Soğuk ön işlem uygulamaları, mikrosporların metabolizmasını yavaşlatmakta,

böylece mikrosporların normal sıcaklıklarda (25-28°C) kültüre alınıncaya kadar

tekrar mitoz bölünmeye devam etmesi için hücre döngüsünü durdurmaktadır. Ayrıca

önişlem sırasında zayıf ve yaşama gücü olmayan mikrosporlar hemen

kahverengileşip ölmekte, böylece güçlü mikrosporlar kültüre alınmakta ve in vitro

koşullarda yüksek oranda rejenere olabilmektedir (Zheng, 2003).

Anter kültüründe kallus ve bitkiye dönüşüm üzerine soğuk uygulamalarının olumlu

etki yapmasına neden olan mekanizma henüz açıklığa kavuşmamış olmakla birlikte;

36

bu uygulamaların etkisini açıklamaya yönelik bazı görüşler bulunmaktadır. Nişasta

birikiminin bloke edilmesi, tek çekirdekli mikrospor döneminde tutuklanan

mikrospor sayısının artırılması, anter duvarının yaşlanmasının geciktirilmesi ve

absisik asit (ABA) gibi bazı engelleyici büyüme maddelerinin etkisinin azaltılması

bunlardan bazılarını oluşturmaktadır (Ellialtıoğlu, 2000).

Birinci polen mitozunu geçirdikten sonra mikrosporlarda nişasta birikimi artmakta ve

artık bu aşamaya gelmiş olan mikrosporları embriyo oluşturmak üzere sporofitik

gelişmeye yönlendirme şansı kalmamaktadır. Düşük sıcaklıklarda birinci polen

mitozu aşamasında tutulan mikrospor sayısında artış olmakta ve nişasta üretimi bloke

edilmektedir. Nişasta içeriği düşük tek çekirdekli mikrosporlar, kültür koşullarında

embriyo oluşturmak üzere sporofitik gelişmeye doğru daha kolay

yönlendirilebilmektedir (Foroughi-Wehr ve Wenzel, 1993).

Çiçek tomurcuklarına yapılan bazı ön uygulamalar mikrosporların kültür sırasındaki

gelişmesi üzerinde olumlu etki yapmaktadır. Anter kültüründe en etkili ön uygulama,

tomurcuklara yapılan soğuk şoklarıdır. 4-10oC’ler arasında, 72 saat ile 4 hafta

arasında uygun bir süre tutulan tomurcuklar arpa, patates, mısır, buğday ve biber gibi

bazı türlerde polen rejenerasyonu bakımından olumlu yanıtlar vermiştir (Ellialtıoğlu,

2000).

Soğun ön işlemin anter kültür çalışmalarında çiçek tomurcuklarına uygulanmasıyla

da anter kültüründeki başarıyı arttırdığı bilinmektedir. Özellikle anterlere

uygulanacak soğuk stres, birinci polen mitozu aşamasında tutulan mikrospor sayısını

arttırmakta ve nişasta üretimi bloke edilmektedir. Bilindiği gibi nişasta içeriği düşük

tek çekirdekli mikrosporlar, kültür koşullarında embriyo oluşturmak üzere sporofitik

gelişmeye doğru daha kolay yönlendirilebilmektedir (Foroughi-Wehr ve Wenzel,

1993). Öte yandan soğuk uygulama, tohum dormansisinin kırılmasındakine benzer

şekilde anterlerde de hücre bölünmesini teşvik eden sitokinin gibi hormonların

sentezini ve içsel miktarını artırırken ABA gibi engelleyici hormonların içsel

miktarını azaltabilir (Khan, 1977). Soğuk ön işlemi, anterlerin gametofitik yerine

sporofitik yönde gelişimini sağlamaktadır (Touraev vd., 1997; Reynolds, 1997; Hu

ve Kahsa, 1999). Baskaran ve Jayabalan (2006) ile Ranaweera ve Pathirana, R.,

(1992), çalışmalarında susam bitkisi tomurcuklarına soğuk ön işlem uygulayarak,

37

soğuk önişlemin anter kültür çalışmalarındaki olumlu etkisini susam anterlerinde de

gösterdiğini kanıtlamışlardır.

Sonuç olarak; susam bitkisinin (Sesamum indicum L.) Muganlı-57, Baydar-2001 ve

Denizli-Çal yerel genotipleri, uygun şartlardaki bitki büyüme odasında kontrollü

koşullar altında ekimleri yapılarak yetiştirilmiştir. Yetiştirilen bitkilerden, uygun

mikrospor safhasına sahip olan tomurcuklar ve anterler morfolojik ve sitolojik

çalışmalar ile belirlenmiştir. Donör olarak yetiştirilen bitkilerden toplanan anterler

yüzey sterilizasyonları yapılarak bir kısmı +4oC 24 saat soğuk önişlem uygulandıktan

sonra kültür ortamına aktarılmış diğer kısmı ise önişlem uygulanmadan kültür

ortamına aktarılmıştır. Bu çalışmalar ışığında Susam bitkisinin üç genotipinde de

erkek üreme hücrelerinin totipotensi verimliliği, uygulanan soğuk önişlemin ve

genotipin etkisi altında olduğu açıkça görülmektedir. Her genotip için kallus

meydana getiren anter yüzdesi, önişlem uygulananlarla uygulanmayanlara göre

belirgin bir artış göstermiştir. Ayrıca genotiplerin anter kültürü çalışmalarına olan

yatkınlıkları kallus meydana getiren anter yüzdesinde faklılaşmaları ortaya

çıkarmıştır. Bu iki etkenin, susam bitkisinin (Sesamum indicum L.) erkek üreme

hücrelerindeki totipotensi yeteneğini önemli ölçüde değiştirdiği sonucuna varılmıştır.

38

7. KAYNAKLAR

Ahmed, M. M. M., Abdellatef, E., Khalafalla, M. M., 2008. In vitro Multiple Shoot

Induction and Plant Regeneration in Elite Sudanese Sesame Cultivars

(Seasmum indicum L). American-Eurasian Journal of Sustainable

Agriculture, 2 (3), 308-314.

Arı, E., 2006. Türkiye’de Doğal Olarak Yetişen Anemone coronaria var.

coccinea’da Anter Kültürü Çalışmaları. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri

Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Doktora Tezi, 180, Adana.

Babaoğlu M., Gürel E., Özcan S., 2001. “Bitki Biyoteknolojisi Doku Kültürü ve

Uygulamaları” Selçuk Üniversitesi Vakfı Yayınları, Konya, 374 sayfa.

Baskaran, P. ve Jayabalan, N., 2006. In Vitro Mass Propagation and Diverse Callus

Orientation on Sesamum indicum L.-an Important Oil Plant. Journal of

Agricultural Technology, 2(2), 259-269.

Chakraborti, P. ve Ghosh, A., 2010. Variation In Callus Induction and Root-Shoot

Bud Formation Depend On Seed Coat Of Sesame Genptypes. Research

Journal Of Botany 5(1): 14-19.

Coşkun, Y., 2006. Farklı Kültür Ortamlarının ve Oksinlerin Tetraploid Buğdayda

(Triticum durum Desf.) Haploid Embriyo Üretimine ve Bitki

Regenerasyonuna Etkisi. T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri

Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi, 62, Isparta.

Coşkun, Y., 2011. Mikrospor Kültürü ile Makarnalık Buğday Bitkisinde (Triticum

durum Desf.) Ebritki Rejenerasyonu. T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Doktora Tezi, 127, Isparta.

Çapan, S., 2006. Cucurbita pepo L. (Kabak) Bitkisi Embriyo Kültürlerinde

Kromozom Sayısı ve Mitoz Aktivitesinin İncelenmesi. T.C. Trakya

Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans

Tezi, 74, Edirne.

Duran, R.E., 2007. Tuzlu Koşullar İçin Geliştirilebilecek Buğday Genotiplerinin

Anter Kültür Tekniğine Uyumu. T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Fen

Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi, 60, Isparta.

Duran, R.E., 2011. Tuzlu (NaCl) Koşullarda Kalsiyum ve Prolinin Makarnalık

Buğday (Triticum durum Desf.) Genotiplerinde Haploid Bitki Üretimi

Üzerine Etkileri. T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü

Biyoloji Anabilim Dalı Doktora Tezi, 133, Isparta.

Ellialtıoğlu, Ş., Sarı, N., Abak, K. 2000. Haploid Bitki Üretimi. (Bitki

Biyoteknolojisi Cilt:I, Ed: Babaoğlu, M., Özcan, S., Gürel, E.) 40 s.

Ferrie, A. M. R., 2007. Doubled Haploid Production in Nutraceutical Species: A

Review. Euphytica 158:347–357.

Foroughi-Wehr, B., Wezel, G., 1993. Andro and Parthenogenesis. Plant Breeding:

Principles and Prospects. Chapman&Hall, 261-277.

Hoekstra, S., van Zijderveld, M.H., Louwerse, J.D., Heidekamp, F., van der Mark,

F., 1992. Anther and microspore culture of Hordeum vulgare L. cv Igri. Plant

Science, 86, 89-96.

Hosp, J., Maraschin, S.F., Touraev, A., Boutilier, K., 2007. Functional Genomics of

Microspore Embryogenesis. Euphytica, 158, 275-285.

Hu, T. ve Kahsa, K., 1999. A Cytological Study of Pretreatments Used to Improve

Isolated Microspore Cultures of Wheat (Triticum aestivum L.) cv. Chris.

Genome, 42, 432-441.

39

Huang, B., 1996. Gametoclonal Variation in Crop Improvement. In Vitro Haploid

Production in Higher Plants. (Jain, S.M., Sopory, S.K., Veilleux, R.E., -eds.)

Kluwer, pp. 73-91, Dordrecht.

Khan, A.A., 1977. Physiology and Biochemistry of Seed Dormancy and

Germination. North-Holland Publishing Co, 447, Amsterdam.

Kim, M. K., Park, S. K., Chae, Y. A., 1987. Selection In Vitro For Herbicide

Tolerant Cell Lines of Sesamum indicum, L; Effect of Explant and Hormonal

Combination on Callus Indiction. Korean Journal of Breeading. V. 19(1) p.

70-74

Koca, H., 2007. Tuz Stresinin Farklı Susam lerinin Fizyolojik ve Biyokimyasal

Özellikleri Üzerine Etkisi. Ege Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Doktora

Tezi, 148, Bornova-İzmir.

Kwon, T. H., Abe, T., Sasahara, T., 1993. Efficient Callus Incuction and Plant

Regeneration In Sesamum Species. Plant Tissue Culture Letters, 10(3), 260-

266.

Lee, S. Y., Kim, H. S., Lee, Y. T., Park, C. H., (1988), Research Reports Of The

Rural Development Administration Biotechnology, 30-45.

Maluszynski, M., Kahsa, K.J., Szarejko, I., 2003. Published Double Haploid

Protocols in Plant Species. In: Wheat Anther Culture: A Manual. (Tuvesson,

S., von Post, R., Ljungberg, A.,-eds.) Kluwer, pp. 71-77, Dordrecht.

Maraschin, S.D., Lamers, G.E.M., de Pater, B.S., Spaink, H.P., Wang, M., 2003. 14-

3-3 Isoforms and Pattern Formation During Barley Microspore

Embryogenesis. Journal of Experimental Botany, 54, 1033-1104.

Maraschin, S.F., de Priester, W., Spaink, H.P., Wang, M., 2005. Androgenics Witch:

an Example of Plant Embryogenesis from The Male Gametophyte

Perspective. Journal of Experimental Botany, 56 (417), 1711-1726.

Morrison, R.A., Evans, D.A., 1987. Gametoclonal Variation. Plant Breeding

Reviews, 5, 359-391.

Munns, R., James, R.A., 2003. Screening Methods for Salt Tolerance: A Case Study

With Tetraploid Wheat. Plant Soil, 253, 239-250.

Ram, R., Catlin, D., Romero, J., and Cowley, C., 1990. Sesame: New Approaches for

Crop Improvement. In: J. Janick and JE Simon (eds.), Advances in New

Crops. Kereste basın, Portland, OR. Timber Press, Portland, OR. p. 225-228.

225-228.

Ranaweera, K. K., D. S. ve Pathirana, R., 1992. Optimization of Media and

Conditions for Callus Induction from Anthers of Sesame Cultivar MI3.

Journal of the National Science Council of Sri Lanka, 20(2), 309-316.

Reynolds, T.L., 1993. A Cytological Analysis of Microspores of Triticum aestivum

(Poaceae) During Normal Ontogeny and Induced Embryogenic Development.

American Journal of Botany, 80 (5), 569-576.

Reynolds, T. L., 1997. Polen Embriyogenesis. Plant Mol. Biol, 33(1), 1-10.

Rudolf, K., Bohanec, B., Hansen, M., 1999. Microspore Culture of White Cabbabe,

Brassica oleracea var. capitata L.: Genetic Improvement of Non-responsive

Cultivars and Effect of Genome Doubling Agents. Plant Breeding, 118, 237-

241.

Sakin, M. A., 1994. Tütün (Nicotiana Tabacum L.) Anter Kültüründe Genotip ve

Besi Ortamının Haploid Bitki Oluşumuna Etkileri Üzerine Araştırmalar.

Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Tarla Bitkileri Anabilim Dalı

Yüksek Lisans Tezi, 56, Adana.

40

Savaşkan, Ç., Ellerbrook, C., Fish, L.J., Snape, J.W., 1997. Doubled Haploid

Production in Turkish Durum Wheats Using Crosses With Maize. Plant

Breeding, 116, 299-301.

Savaşkan, Ç., Şenay, A., Denli, E., 2001. Yerli Makarnalık Buğday Çeşitlerimizden

Üretilen Katlanmış Diploid Hatların Kışlık Ekimle Kalitatif ve Kantitatif

Özelliklerinin Araştırılması. IV. Tarla Bitkileri Kongresi, 17-21 Eylül,

Tekirdağ, 13-16.

Savaşkan, Ç., Akinci, C., Donmez, E., Keser, M., Yalvac, K., 2003. The

Relationships Between The Grain Characters of Anatolian Durum Wheat

Genotypes. Tenth International Wheat Genetics Symposium, 1-6 September,

Italy, 81-84.

Seguı`-Simarro, J.M., Nuez, F., 2008. How Microspores Transform into Haploid

Embryos: Changes Associated With Embryogenesis Induction and

Microspore Derived Embryogenesis. Physiologia Plantarum, 134, 1-12.

Shashidhara, N., Ravikumar, H., Ashoka, N., Santosh D.T., Pawar, P., Lokesha, R.

and Janagoudar, B.S., 2011. Callus Induction and Sub-culturing In Sesame

(Sesamum indicum L.) : A Basic Strategy. Int. Jr. of Agril., Env. and Biotech.

Vol. 4, No. 2 : June 2011 : 153-156.

Smith, Roberta A., 1997. “Plant Tissue Culture Studies, Plant Tissue Culture (BS

332). Virginia, 164 sayfa.

Takebayashi, K., Mimura, A., Ichikawa, A., Niwano, M., Takahara, Y. ve Osawa, T.,

1994. Cultivation Of Sesamum indicum L. Callus Cells At 35oC. Plant Tissue

Culture Letters, 11(2), 129-133.

Tan, Ş., 2007. Susam Tarımı. T.C. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Tarımsal

Araştırmalar Genel Müdürlüğü Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü Çiftçi

Broşürü No: 135.

Telmer, C.A., Newcomb, W., Simmonds, D.H., 1995. Cellular Changes During Heat

Shock Induction and Embryo Development of Cultured Microspores of

Brassica napus cv. Topas. Protoplasma, 185, 106-112.

Touraev, A., Indrianto, I., Vicente, Herberle-Bors, E., 1997. Initation of Microspore

Embryogenesis by Stres. Trends Plant Sci. Rev, 2(8), 297-302.

Touraev, A., Pfosser, M., Heberle-Bors, E., 2001. The Microspore: A Haploid

Multipurpose Cell. Advances in Botonical Research, 35, 53-109.

Wayne’s word, 2011. On-line textbook. Erişim Tarihi: 09.05.2011.

http://waynesword.palomar.edu/ecoph44.htm.

Yeung, E.C., Rahman, M.H., Thorpe, T.A., 1996. Comparative Development of

Zygotic and Microspore-derived Embryos in Brassica napus L. cv.Topas. I.

Histodifferentiation. International Journal of Plant Sciences, 157, 27-39.

Zheng, M.Y., Liu, W., Weng, Y., Polle, E., Konzak, C.F., 2001. Culture of Freshly

Isolated Wheat (Triticum aestivum L.) Microspores Treated With Inducer

Chemicals. Plant Cell Reports, 20, 685-690.

Zheng, M.Y., 2003. Microspore Culture in Wheat (Triticum aestivum L.) – Doubled

Haploid Production via Induced Embryogenesis. Plant Cell, Tissue and Organ

Culture, 3, 213-230.

41

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Mehmet Tolgahan HAKAN

Doğum Yeri ve Yılı : Uşak, 1986

Medeni Hali : Evli

Yabancı Dili : İngilizce

E-posta : mthakan@gmail.com

Eğitim Durumu

Lise : Uşak Orhan Dengiz Anadolu Lisesi, 2004

Lisans : SDÜ, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü

Yüksek Lisans: SDÜ, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji A.B.D. (Devam

Ediyor)

Mesleki Deneyim

Arş. Gör. Hitit Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi 2011-………(halen)

Yayınları

Coskun, Y.,Duran, RE., Savaskan, C., Demirci, T., Hakan, MT., 2012. Efficient

Plant Regeneration with Arabinogalactan-proteins on Various Ploidy Levels

of Cereal.Journal of Integrative Agriculture.

Duran, R.E., Coşkun, Y., Savaşkan, Ç., Hakan, M.T., Demirci, T. 2010. "Tuzlu

Koşulların Makarnalık Buğday Bitkisinde Bazı Kantitatif ve Kalitatif

Karakterlere Etkisi". 20. Ulusal Biyoloji Kongresi (Uluslararası Katılımlı),

21-25 Haziran, Denizli, 376.

Coşkun, Y., Duran, R.E., Savaşkan, Ç., Demirci, T., Hakan, M.T., 2010. "Farklı

Miktarlardaki Arabinogalaktan-Proteinlerinin Buğday (Triticum sp. L.) ve

Arpa (Hordeum sp. L.) Bitki Rejenerasyonuna Etkisi". 20. Ulusal Biyoloji

Kongresi (Uluslararası Katılımlı), 21-25 Haziran, Denizli, 510.

Kaşarcı, A., Köse, D.A., Alp Avcı, G., Hakan, M.T., 2012. Cu(II), Ni(II), Co(II) ve

Zn(II) Metal İyonlarının Glisin ve Lösin Aminoasitleriyle Yaptığı

Komplekslerin Sentezi, Yapısal Karakterizasyonu ve Biyolojik Aktiviteleri,

26. Ulusal Kimya Kongresi, 1-6 Ekim, Muğla, 283.

Kaşarcı, A., Köse, D.A., Avcı, E., Hakan, M.T., 2012. Cu(II), Ni(II), Co(II) ve Zn(II)

Metal İyonlarının Triptofan, Arjinin ve Fenilalanin Aminoasitleriyle Yaptığı

Komplekslerin Sentezi, Yapısal Karakterizasyonu ve Biyolojik Aktiviteleri,

26. Ulusal Kimya Kongresi, 1-6 Ekim, Muğla, 66-67.