tÉcnicas reproductivas en las enfermedades … dpi 2012.pdf · y no susceptibles de tratamiento...
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Dra. Noemí [email protected]
www.ivi.es
3r curso de actualización en habilidades médicas y de enfermería
TÉCNICAS REPRODUCTIVAS EN LAS ENFERMEDADES
HEREDITARIAS
Alcoi, 8 de Marzo 2012
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Introducción
ÓvuloÓvulo
23 cromX 23 cromX
EspermatozoideEspermatozoide
46 XX 46 XY
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Incidencia
Anomalías cromosómicas: 0,4-0,6 %
Alteraciones génicas : 1-2 %
Anomalías cromosómicas: 0,4-0,6 %
Alteraciones génicas : 1-2 %
Herencia recesiva25 %Herencia recesiva25 %
Herencia dominante 50 %Herencia dominante 50 %
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Diagnóstico prenatal – aborto terapéuticoDonación de gametos
Donación de embrionesAdopción
DIAGN ÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL
Opciones
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Procedimientos1. Selección de pacientes
2. Estimulación-ICSI-cultivo
3. Biopsia y fijación
4. Análisis Genético
5. Transferencia
DIAGNÓSTICO PREIMPLANTACIONAL
1.1. SelecciSeleccióón de pacientesn de pacientes
2.2. EstimulaciEstimulacióónn--ICSIICSI--cultivocultivo
3.3. Biopsia y fijaciBiopsia y fijacióónn
4.4. AnAnáálisis Genlisis Genééticotico
5.5. TransferenciaTransferencia
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Ley 14/2006, 26 de mayo, sobre Técnicas de Reproducción Humana Asistida.
Artículo 12. Diagnóstico preimplantacional.
DGP: Selección de pacientes
Los centros debidamente autorizados podrán practicar DPI para:a) Detección de enfermedades hereditarias graves, de aparición precoz,
y no susceptibles de tratamiento curativo posnatal con arreglo a los conocimientos científicos actuales
b) La detección de otras alteraciones que puedan comprometer la viabilidad del preembrión.
Otra finalidad no comprendida o determinación de los Antígenos de histocompatibilidad con fines terapéuticos para terceros requerirán autorización expresa.
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• Alteraciones estructurales:
- Traslocaciones robertsonianas
- Traslocaciones recíprocas
- Inversiones
• Alteraciones numéricas:
- varón: 47, XYY; 47, XXY
- mosaicismos:45,X/46,XX/47,XXX
Enfermedades monogénicas
DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL
Cariotipos anormales (PGD)
DGP: Selección de pacientes
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DGP: Selección de pacientes
Enfermedades Autosómicas Recesivas
• Atrofia Muscular Espinal • Fibrosis Quística • β-Talasemia • Defecto de la Glicosilación (CDG1A) • Sordera congénita neurosensorial no sindrómica• Poliquistosis renal (ARPKD) • Leucodistrofia metacromática• Deficit 21-Hidroxilasa• Enfermedad Gaucher• Tirosinemia tipo 1 • Linfohistiocitosis familiar • Acidemia propiónica A • Acidemia propiónica B • Mucopolisacaridosis IIIA (SanFilippo A) • Displasia hidrótica ectodérmica, Síndrome de Clouston• Déficit L-CHAD • Osteopetrosis, • Inmunodeficiencia combinada severa, alinfocítica
Enfermedades Autosómicas Dominantes
• Distrofia Miotónica, Steinert• Huntington • Poliquistosis Renal, AD. Ligada a PKD1 • Neurofibromatosis tipo 1 • Charcot-Marie-Tooth 1A • Ataxia Espinocerebelar, SCA1, SCA3 • Esclerosis tuberosa tipo 1 • Exostosis múltiple hereditaria • Neoplasia Múltiple Endocrina 2A • Cáncer colon hereditario, no polipósico (S. Lynch) • Poliposis adenomatosa familiar • Esclerosis tuberosa tipo 2 • Síndrome Von Hippel Lindau• Paraparesia espástica familiar • Poliquistosis Renal, AD. Ligada a PKD2 • Retinosis Pigmentaria
Enfermedades con herencia ligada al cromosoma X
•Síndrome de X frágil •Hemofilia A •Distrofia Muscular Duchenne/Becker •S. Alport•Incontinencia Pigmenti•Déficit Ornitin Transcarbamilasa •Enfermedad de Norrie•Mucopolisacaridosis II •Mucopolisacaridosis IIIA
ENFERMEDADES MONOGÉNICAS
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SCREENING GENÉTICO PREIMPLANTACIONALde Aneuploidías (PGS)
Parejas mal pronóstico reproductivo
• Edad materna avanzada ( ≥≥≥≥ 41 a)
• Fallo de implantación
• Abortos recurrentes
• FISH espermatozoides anormal
DGP: Selección de pacientes
Selección de embriones
euploides:
-Mejorar la implantación
-Disminuir la tasa de aborto
-Reducir el riesgo de
cromosomopatías
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¿QUÉ CROMOSOMAS analizamos?????
13,15,16,17,18, 21,22,X,Y13,15,16,17,18, 21,22,X,Y
Monosomía X 8,6Trisomía autosómicas 26,1Trisomía 13 1,1Trisomía 15 1,7Trisomía 16 7,5Trisomía 18 1,1Trisomía 21 2,3Trisomía 22 2,7Trisomías sexuales 0,3Poliploidía 9,8Anomalías estructurales 2,0
Datos de Hassold et al, 1996 (n=4088)
DGP: Selección de pacientes
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Criterios de inclusiCriterios de inclusiCriterios de inclusiCriterios de inclusióóóón:n:n:n: ananananáááálisis retrospectivo para seleccionar rango edad lisis retrospectivo para seleccionar rango edad lisis retrospectivo para seleccionar rango edad lisis retrospectivo para seleccionar rango edad
41- 44 años
Estudio Estudio randomizadorandomizado IVI: EDAD MATERNA AVANZADAIVI: EDAD MATERNA AVANZADA
Edad
ONGOING
DGP: Selección de pacientes
SGP: Selección de pacientes
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≥≥≥≥ 3 fallos FIV/ICSI, <40 años, ≥≥≥≥6 MII
Fallo repetido de implantaciFallo repetido de implantacióónn
Estudio previo de infertilidad:
• Ecografia vaginal (histeroscopia si es
necesario)
• Cariotipos de la pareja
• Estudio de trombofilias: anticuerposanticardiolipina y lupus anticoagulante;
Antitrombina III; APCR (si positiva, mutación
del factor V de Leiden); niveles de proteina C y
S; Homocisteina sérica y screening de
mutaciones MTHFR y factor II.
SGP: Selección de pacientes
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ABORTO DE REPETICIABORTO DE REPETICIABORTO DE REPETICIABORTO DE REPETICIABORTO DE REPETICIABORTO DE REPETICIABORTO DE REPETICIABORTO DE REPETICIÓÓÓÓÓÓÓÓN N N N N N N N Aborto de repeticiAborto de repeticiAborto de repeticiAborto de repeticiAborto de repeticiAborto de repeticiAborto de repeticiAborto de repeticióóóóóóóón: estudio retrospectivon: estudio retrospectivon: estudio retrospectivon: estudio retrospectivon: estudio retrospectivon: estudio retrospectivon: estudio retrospectivon: estudio retrospectivo
Improved results in RM patients:
- < 5 abortos previos
- Gestación previa anormal
- Aumento de anomalías cromosómicas masculinas
Resultados en AR < 38 años:
- 57% embriones anormales
- 53,1% gestación evolutiva/transfer
- 13,0% aborto
- 44,1 gestación evolutiva/ciclo
Gestación/transfer
Tasa de implantaciónTasa de aborto
2 abortosn=105
3 abortosn=76
4 abortosn=56
> 5 abortosn=16
SGP: Selección de pacientes
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PARPARPARPARÁMETROS SEMINALES ALTERADOSMETROS SEMINALES ALTERADOSMETROS SEMINALES ALTERADOSMETROS SEMINALES ALTERADOS
Oligozoospermia severa< 5 mill espermatozoides/ml
Teratozoospermia severa
Oligozoospermia severa< 5 mill espermatozoides/ml
Teratozoospermia severa
� disomía para cromosomas sexuales
� disomía 21
� diploidía y poliploidía
� disomía para cromosomas sexuales
� disomía 21
� diploidía y poliploidía
(Moosani, 1995; In’t Veld, 1997; Rubio, 2001; Bernardini, 1998; Pang, 1999; Pfeffer, 1999; Bernardini, 2000; Vegetti, 2000; Ushijima, 2000; Nishikawa, 2000; Calogero, 2001; Devillard, 2002 ; Martin, 2003; Mateu, 2006)
SGP: Selección de pacientes
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FACTOR MASCULINOFACTOR MASCULINO
•Azoospermia no obstructiva
•Teratozoospermia severa
•Oligozoospermia severa (<5 mill/ML)
0
10
20
30
40
50
60
≤4 >4-<10 ≤10-<20 ≥20
% FISH anormal
Rodrigo et al., 2009
SGP: Selección de pacientes
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Conlleva un tratamiento de Fecundación “in vitro”,
en el que se obtienen varios embriones para su análisis.
Ventaja:
se trata de parejas infértilesse trata de parejas infértiles
Diagnóstico preimplantatorio
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2.- Estimulación ovárica-ICSI-cultivo3.- Micromanipulación embrionaria4.- Análisis genético5.- Transferencia embrionaria
Consejo genético
Cronología
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Protocolos con análogos de la GnRH
Estimulación ovárica
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Obtención de ovocitos: punción
Laboratorio de FIV
Quirófano
Punción folicular transvaginal
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D5: Transferencia embriones sanosD3: Diagnóstico genético
Tasa fecundaciónICSI
Ovocitos MIIOvocitos punción
Estimulación ovárica
+/- vitrificación de ovocitos
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Es la fecundación del ovocito mediante laintroducción de un espermatozoide con la
ayuda de una micropipeta”
Inyección intracitoplasmática de espermatozoides
PÁG.22 FISH de espermatozoides
Desarrollo embrionario NO selecciona anomalías cromosómicas
Magli MC et al (2000), Sandalinas M et al (2001), Ziebe S et al (2003),Munné S (2004), Rubio C (2007)
DGP: implicación clínica
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Información genética de la célula embrionaria
DayDay--00 DayDay--11
Polar BodyPolar Bodybiopsybiopsy
DayDay--33
CleavageCleavage stagestagebiopsybiopsy
DayDay--55
BlastocystBlastocystbiopsybiopsy
Información genética
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DGP: biopsia de blastómera y fijación
Rotura de la zona pelúcida
Aspiración de las blastómeras
Fijación de las blastómeras
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FISH: hibridación “in situ” fluorescente: 9 cromosomas.
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
DGP: análisis genético
jcmr2
Diapositiva 25
jcmr2 Independientemente de las muestras con las que estemos trabajando, ¿qué nivel de análisis abarcamos?Julio Martín ; 05/05/2002
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PCR: Mutaciones génicasFibrosis quFibrosis quíísticasticaDistrofia muscular de Distrofia muscular de DuchenneDuchenneSSííndrome de ndrome de MarfanMarfanDistrofia Distrofia miotmiotóónicanicaRetinitis Retinitis pigmentosapigmentosaSSííndrome del Xndrome del X--frfráágilgilCorea de HuntingtonCorea de Huntingtonßß -- TalasemiaTalasemia
......
DGP: análisis genético: PCR
Test informatividad previo:• mutaciones•marcadores genéticos
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+secuencia de ADN
a amplificar
Primers
TERMOCICLADOR
94ºC- 1’40-60º C
Descondensación y adhesión de primersSíntesis de ADN
Elongación de cadenas
(72ºC-1’)PCR FLUORESCENTE
ELECTROFORESIS
Lisis celular de membrana plasmática y nuclear� liberación ADN�amplificación por PCR y detección por fluorescencia
DGP: análisis genético: PCR
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SSííndrome de ndrome de DownDown, , KlinefelterKlinefelter XXYXXYssííndrome XYY, sndrome XYY, sííndrome de ndrome de Turner (XO), edad avanzada,Turner (XO), edad avanzada,
aborto de repeticiaborto de repeticióónn
DGP: análisis genético: FISH
FISH: hibridación “in situ” por fluorescencia
Alteraciones cromosómicas-Estructurales: translocacionestranslocaciones
-- Sondas especSondas especííficasficas
-Numéricas.- 9 cromosomas
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Sondas marcadas con fluorescencia con afinidad por los cromosomas que queramos estudiar
¿Qué CROMOSOMAS?
13,15,16,17,18, 21,22,X,Y
13,15,16,17,18, 21,22,X,Y
DGP: análisis genético: FISH
Jobanputra et al, 2002: el FISH para los cromosomas 13, 15, 16,
18, 21, 22, X, Y permitiría detectar el 83% de anomalías
citogenéticas en abortos
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FISH. Hibridación “in situ” confluorescencia
DGP: análisis genético: FISH
sonda ADN
secuencia cromosómica
DescondensaciónDesnaturalización
Renaturalización
sonda ADN
secuencia cromosómica
DescondensaciónDesnaturalización
Renaturalización
sonda ADN
secuencia cromosómica
DescondensaciónDesnaturalización
Renaturalización
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XXXXXY XXY
DGP: análisis genético: FISH
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Arrays de CGH(Hibridación Gen ómica Comparada)
DGP: análisis genético: Arrays
AnomalAnomalíías numas numééricas de ricas de todostodos los cromosomaslos cromosomas
Normal (XY)
24 cromosomas
¡¡Aumento nivel de detección!!
Aumento tasa de embarazo e implantación
15 % en >40 años>20-25% en AR y FI
En ≤40 años, si existe factor masculino severo adicional a FI o AR:44,4% embriones NO detectables con FISH
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Amplificación genómicacompleta
Marcaje
Purificación y combinación
Hibridación sobre el array
Lectura e interpretación de resultados: software
ADN controlADN controlMuestraMuestra
BlueGnome Ltd., Cambridge, UK
Cy3 Cy5
24 cromosomas
CGH arrays
Cy3 + Cy5
DGP: análisis genético: Arrays
Hibridación sobre plataformas con
secuencias de ADN específicas de
regiones concretas de cr. humanos
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DGP: análisis genético: Arrays
Aneuploide: -19, -21 (XY)
Normal (XY)
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EmbriEmbri óón can ca óóticotico
DGP: análisis genético: Arrays
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¿1 ó 2? ���� SET• Selección embriones:
– Genética
– Viabilidad
• Vitrificación sobrantes
ASPECTOS MÉDICOS DE LA ESTERILIDAD FEMENINA
FIV/ICSI: Transferencia embrionaria
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Gracias por su atención
Centro IVI Dirección – Código Postal poblaciónTel. 000 11 22 33 – Fax. 000 11 22 [email protected]