taxus sumatrana (miquel) de laubenfels dan …

Berita Biologi 10(3) - Desember 2010

ENDOFIT Taxus sumatrana (Miquel) de Laubenfels DAN POTENSINYADALAMMEMPRODUKSISENYAWABIOAKTIFSEBAGAISUMBERANTIOKSIDAN1

[Endophytes of Taxus sumatrana (Miquel) de Laubenfels and Its Potential on ProducingBioactive Compound as Antioxidant Agent]

Harmastini SukimanPusat Penelitian Bioteknologi-LIPI

Jin Raya Jakarta-Bogor Km 46 Cibinong 16911email: [email protected]

ABSTRACTTaxus sumatrana (Miquel) de Laubenfels is known as an endanger forest tree species grown at Kerinci National Park in Jambi,Indonesia. This plant was known potential on producing taxol. Taxol is a bioactive compound, could be used as antibacterial agentand recently confirmed to cure cancer cells. For the first time in 1960, Arthur Barclay found the taxol compound from Taxus sp.(pacific yew). However to isolate the bioactive compound, huge amount of tree biomass is needed. Research on endophytesmicrobes which are isolated from inner tissue of Taxus sp. declared that those microbes have potential on producing antioxidantagent for drug discovery. Isolation and conservation of endophytes and selecting its potential is promising the novel of findingnew drug that may be effective for treating the newly developing diseases in human. Fifteen isolates of Taxus endophytes have beensuccessfully studied on their ability on producing antioxidant. The results showed that endophytes fungus isolates TsC-17, isolatedfrom Taxus sumatrana grown in Cibodas Botanical Gardens-LIPI, could produce extracellular bioactive compound which performedactivity of suppressing free radical, is significantly better compared to intracellular bioactive compound eventhough it is not ashigh as in vitamin C. The activity of suppressing free radical resulted from bioactive compound of endophyte fungus isolates TsC-17 was 20% for intracellular bioactive compound, while it was 60% for extracellular bioactive compound and 90% for vitamin C.

Kata kunci/ keywords: Taxus sumatrana, endofit/endophytes, taxol

PENDAHULUAN

Gaya hidup modern dapat meningkatkan resikotimbulnya berbagai penyakit misalnya kebiasaanmerokok, konsumsi minuman beralkohol yangberlebihan dan asupan makanan berlemak. Kondisilingkungan yang semakin buruk karena berbagai polusiudara, juga dapat mengakibatkan terbentuknya radikalbebas yang beresiko bagi kesehatan manusia. Di dalamtubuh, radikal bebas akan menyebabkan timbulnyareaksi berantai yang dapat merusak makromolekulpembentuk sel, sehingga sel menjadi rusak, mati ataubermutasi. Hal ini merupakan salah satu penyebabberbagai penyakit degeneratif, seperti kanker danpenuaan dini sel. Proses reaksi berantai tersebutsebenarnya dapat dihambat oleh zat antioksidan yangbersifat menetralkan radikal bebas. Saat ini,antioksidan dari bahan alam banyak diteliti oleh paraahli kimia dan kesehatan karena perannya yang dapatmenetralkan dan melawan radikal bebas danmenghambat terjadinya oksidasi pada sel tubuh.Dengan demikian antioksidan alami dapat mengurangiterjadinya kerusakan sel (Winarsih, 2007).

Antioksidan adalah senyawa kimia yang dapatmemberikan elektron (electron donors) kepada

senyawa yang bersifat oksidan (radikal bebas)sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisadihambat. Antioksidan adalah zat yang dapatmenetralisir radikal bebas (free radical scavenger),

sehingga atom-atom molekul yang mempunyai elektronyang tidak berpasangan dapat berpasangan danmenjadi stabil (Strobel, 2004).

Sejauh ini pemanfaatan sumber daya hayatiterutama tumbuhan obat dilakukan dengan caraeksplorasi fitokhemis. Kelemahan cara ini,untukmendapatkan senyawa bioaktif yang akan dijadikanobat diperlukan biomasa tumbuhan yang cukupbanyak. Namun dengan ditemukannya mikrobaendofitik penghasil metabolit sekunder yangberpotensi, maka penelitian dengan memanfaatkanmikroba endofit mulai banyak dikembangkan.

Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup didalam jaringan tumbuhan dan dalam siklus hidupnyadapat membentuk koloni tanpa membahayakantumbuhan inangnya (Song, 1998). Mikroba ini bidupbersimbiosis mutualistik dengan tumbuhan inangnya.

Mikroba endofit diisolasi dari jaringantumbuhan dapat ditumbuhkan pada medium tumbuh

xDiterima: 5 Juli 2010 - Disetujui: 04 Agustus 2010

349

Sukiman - Endofit Taxus sumatrana - Potensinya dalam Memproduksi Senyawa Bioaktif

artifisial. Di dalam medium tersebut mikroba endofitakan menghasilkan metabolit yang hampir sama dengansenyawa aktif yang berasal dari tumbuhan inangnya(Strobel ef a/., 1998).

Indonesia adalah negara yang kaya akansumber daya alam yang memiliki biodiversitastumbuhan yang sangat bermanfaat bagi kehidupan dankesehatan manusia. Dari sekian banyak tumbuhanberpotensi obat, tanaman Kayu Taji, Taxus sumatrana

(Miquel) de Laubenfels (Taxaceae) yang terdapat diSumatera telah banyak diteliti dalam kemampuannyamenghasilkan senyawa taxol yang bersifat anti kanker,cepalomanin, 7-ep/-10-deasetiltaksol, dan 7-epi-lO-

deasetil cepalomanin (Kitagawa, 1995) (Gambar 1).

Taxol dan derivatnya merupakan senyawaantikanker pertama yang dihasilkan oleh mikrobaendophytes. Pada awal tahun 1990, penelitian tentangisolasi mikroba endofit dari tanaman yew belumberhasil, namun beberapa tahun kemudian penemuanisolat endofit penghasil taxol yakni Taximyces

andreanae ditemukan di Taxus brevifolia (Strobel et

al., 1993) walaupun spesies jamur endofit yang seringditemukan di dalam tanaman yew adalah Pestalotiopsis

spp. (Strobel, 2002a; Strobel, 2002b; Lie et al., 1996,Strobel et al., 1996). Peneliti lain yang juga mengisolasiendofit penghasil taxol melaporkan bahwa taxol dapatdihasilkan oleh jamur Tubercularia sp., Sporormia

minima dan Trichoterium sp. (Shen et al., 2003) yangdiisolasi dari Taxus mairei (chinese yew). Beberapa

senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh mikrobaendofitik adalah taxol, cryptocin, cryptocandin,jesterone, oocydin pseudomycin dan asam ambuic(Strobel, 2002a).

Penelitian ini bertujuan untuk mempelajaripotensi mikroba endofit asal tanaman Taxus sumatrana

(Miquel) de Laubenfels, dalam menghasilkan senyawabioaktif yang berpotensi sebagai antioksidan.

BAHANDANMETODEMikroorganisme

Penelitian ini menggunakan 15 isolat kapangendofit dari tanaman Taxus sumatrana (Miquel) deLaubenfels, yang merupakan koleksi LaboratoriumMikrobiologi, Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI,Cibinong. Ke-15 isolat kapang tersebut diisolasi daritanaman Taxus sumatrana yang ditanam di daerahCibodas.

Isolasi mikroba endofit dilakukan denganmetode tanam langsung (direct seed), yaitu denganmenempelkan belahan ranting atau cabang tanamanyang telah disterilisasi permukaan di atas mediumselektif. Medium yang telah berisi potongan batangtumbuhan kemudian diinkubasi pada suhu 30°C danmikroba endofit yang muncul dari bagian tengah batangyang kemudian dipisahkan untuk selanjutnyadimurnikan (Tanaka etal., 1999).

Masing-masing isolat kapang endofit koleksiyang sudah murni diremajakan dengan cara

0 ^H,

fclH

P t r VHCf 1

Taksol

Cepalomanin

7-ep/-10-deasetiltaksol

7-ep/-1 Odeastilcepalomanin

H3C

H3C

0

1H

R

Ph

YPh

HJ

1

CH3

CH3

R2

Ac

Ac

H

H

\ /i i " IVOHOBz 1

R3

OH

OH

H

H

OAc

R4

H

H

OH

OH

Gambar 1. Struktur senyawa taxol dan isomer-isomernya

350


menumbuhkan pada media PDA (Potato Dextrose

Agar).

Produksi biomasa sel kapang endofitProduksi biomasa kapang endofit dilakukan

dengan cara menumbuhkan kapang tersebut padamedia PDB (Potato Dextrose Broth). Spora kapangmurni dari agar miring diberi sedikit air steril kemudianlarutan yang sudah mengandung spora kapangdiinokulasikan ke dalam media PDB dan selanjutnya.diinkubasi pada suhu kamar dengan pengocokkan padakecepatan 120 rpm selama 14 hari. Biomasa kapangdipanen dengan penyaringan kertas saring dankemudian filtrat diekstraksi dengan etil asetat.Sementara itu biomasa kapangnya dikeringkan dalamoven pada suhu 60-70°C dan selanjutnya jugadiekstraksi dengan etil asetat. Hasil ekstrak dipekatkanmenggunakan evaporator kemudian ditimbang.

Identifikasi kandungan senyawa dengan KLTIdentifikasi senyawa dilakukan sebagai tahap

awal untuk mengetahui apakah isolat tersebutmengandung senyawa kimia. Fase etil asetat daribiomasa dan filtrat yang telah diuapkan ditotolkan padafase diam silikagel GF2M. Fase gerakyang digunakanadalah «-heksan : etil asetat (2:1) dan kloroform :metanol (5:1). Bercakyangtimbul pada lempeng KLTdiamati pada sinar UV pada panjang gelombang (X.)254 nm dan 365 nm, kemudian disemprot dengan seriumsulfat 1 % dan dipanaskan dalam oven pada suhu 110°Cselama 5 menit. Bercak yang diperoleh dibandingkandengan bercak blanko, yaitu ekstrak PDB dengan etilasetat tanpa kapang. Bercak isolat yang memiliki Rfyang berbeda dengan blanko dipilih untuk diteliti lebihlanjut.

Produksi biomasa sel kapang endofit untuk pengujianaktivitas antioksidan

Produksi biomasa sel kapang endofit untukkeperluan pengujian aktivitas antioksidan dilakukandengan menginokulasi 1 liter media PDB dengansuspensi biomasa kapang endofit yang berumur 7 haridengan cara membuat suspensi kapang disiapkandengan cara menambahkan sejumlah air steril ke dalamisolat murni dalam agar miring PDA dan selanjutnyasebanyak 4 ml diinokulasikan ke dalam 1 liter PDB.

Media yang telah diinokulasi dengan suspensi kapangkemudian diinkubasi dengan kecepatan 120 rpm di atasshaker selama 14 hari pada suhu 20-25°C.

Hasil fermentasi kapang selanjutnya diekstraksisetelah terlebih dahulu diukur pH-nya dengan etilasetat (1:1) sebanyak 3 kali menggunakan corongpisah, lalu didiamkan hingga terpisah fase etil asetatdan fase air. Fase etil asetat dikumpulkan dan diuapkanhingga diperoleh ekstrak kering.

Uji aktivitas antioksidanUji aktivitas antioksidan dilakukan dengan

metode peredaman radikal bebas dengan reagen DPPH(1,1 -difenil-2-pikrilhidrazil). Pembuatan larutan 1 mMDPPH ditimbang secara seksama lebih kurang 39,5 mgDPPH (BM 394,2), kemudian dilarutkan dalam 100,0 mLmetanol proanalisis, dikocok sampai homogen danditempatkan dalam botol gelap.Lima mg ekstrak sampelditimbang secara seksama dan dilarutkan dalam 5 mLmetanol (1000 bpj), kemudian dipipet 125 ul, 250 ul, 625ul, 1250 ul, 2000 ul ke dalam labu tentukur 5 mL.Tiaplabu tentukur ditambahkan 1 mL larutan DPPH 1 mMdan metanol sampai 5 mL kemudian dihomogenkan.Hasilnya diperoleh larutan dengan konsentrasi masing-masing 5 ppm, 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm. Segerainkubasikan selama 30 menit pada suhu 37°C. Serapanlarutan diukur pada panjang gelombang 515 nm.Sebagai kontrol digunakan vitamin C.

Pembuatan kurva pertumbuhan kapangKurva pertumbuhan kapang dibutuhkan untuk

mengetahui umur kapang yang optimal dalammenghasilkan senyawa bioaktif. Sebanyak 2 mLsuspensi spora isolat kapang terpilih diinokulasikanke dalam 100 mL media PDB dan diinkubasi pada suhu25°C dengan pengocokan pada kecepatan 120 rpmselama 20 hari. Setiap 4 hari sekali dilakukanpengambilan sampel untuk mengetahui pertumbuhanisolat kapang tersebut. Hasil fermentasi kapangkemudian disaring dengan kertas saring dandikeringkan dalam oven pada suhu 60-70°C, kemudianbiomasa kapang ditimbang bobotnya untuk selanjutnyadibuat kurva pertumbuhan antara waktu sampling danbobot biomasanya.

351


HASILKarakterisitik morfologi isolat kapang endofittanaman Taxus sumatrana

Pengamatan isolat kapang endofit meliputidiameter dan permukaan koloni, terbentuknya zonapertumbuhan, terbentuknya spora/konidia, warnamiselium, perubahan yang terjadi pada media danterdapatnya hifa-hifa baik steril maupun fertil.

Karakteristik morfologi kapang endofit yangdiisolasi dari tanaman Taxus sumatrana dapat dilihatpada Tabel 1.

Seleksi kapang endofit yang menghasilkan senyawabioaktif yang bersifat antioksidanFermentasi kapang endofit

Pemanenan biomasa kapang dilakukan pada harike-14 setelah proses fermentasi. Pada hari ke-14senyawa metabolit sekunder yang dieksresikan kemedia tumbuh (ekstraseluler) ataupun yang disimpandi dalam jaringan tubuh (intraselular) diperkirakan telahmemproduksi kedua metabolit sekunder ini dapatdipanen dengan cara penyaringan hasil fermentasi,kemudian filtrat (ekstraseluler) dan biomasa(intraseluler) diekstraksi dengan pelarut etilasetat.Hasil penimbangan ekstrak dari filtrat dan biomassahasil bioproduksi kapang endofit Taxus sumatrana

dapat dilihat pada Tabel 2.

Dari 15 isolat kapang koleksi Pusat PenelitianBioteknologi LIPI yang difermentasikan terlihat bahwaisolat TsC-17, TsC-18 dan TsC-29 merupakan isolat

yang cukup tinggi menghasilkan biomasa kapang yatr0,0112,0,0194 dan 0,0173 gram. Kapang endofit asLtanaman Taxus ini kemudian dianalisis dengan KLTdan uji aktifitas antioksidan dengan metodipenangkapan radikal bebas menggunakan pereaksDPPH (l,l-difenil-2-pikrilhidrazn).

Analisis kromatografi lapis tipis (KLT) untuk semurnetilasetat hasil bioproduksi endofit Taxus sumatraw

Hasil analisis KLT menunjukkan bahwa sister:pelarut w-heksan: etilasetat (2:1) adalah sistem elueiyang lebih baik dibandingkan dengan pelarut klorofonr:metanol(5:1). Hasil pemisahan senyawa aktifdengarn-heksan : etil asetat menunjukkan adanya bercai(spot) yang jelas dan terpisah dari beberapa senyawj.kimia. Hasil KLT dengan menggunakan kedua jeniscampuran eluen tersebut dapat dilihat pada Gambar 2.

Uji aktivitas antioksidan dengan metode

penangkapan radikal bebas menggunakan DPPH

(l,l-difenil-2-pikrilhidrazil)Hasil uji antioksidan terhadap semua ekstrak

(filtrat maupun biomasa) menunjukkan bahwa hampirsemua ekstrak filtrat mempunyai daya aktivitasmeredam radikal bebas lebih besar dari ekstrak biomasa.kecuali untuk ekstrak biomasa dari TsC-10, TsC-12 danTsC-28. Sedangkan secara keseluruhan, hampir semuaekstrak mempunyai daya aktivitas meredam radikalbebas di bawah 50%, kecuali hasil bioproduksi endofitTsC-17 sebesar 61,353%. Sehingga selanjutnyafermentasi skala besar hanya dilakukan untuk isolatmikroba endofit TsC-17 untuk memperoleh IC;o, kurva

Tabel 1. Karakteristik morfologi kapang endofit dari Taxus sumatrana

No

1

Kode Isolat

TsC2

Permukaan Bagian Atas

Diameter: 83Konidia/Spora : tidak adaWama miselium: putih

Permukaan Miselium : menyebar, agakterkonsentrasi di bagian tengah

Permukaan Bagian Bawah

Wama Miselium : bagian tengahkekuningan, bagian pinggir putihPermukaan Miselium : menyebar

Perubahan Media : tidak ada

Keterangan : T: Taxuss : sumatranaC : Cibodas

352


lanjutan Tabel 1. Karakteristik morfologi kapang endofit dari Taxus sumatrana

No Kode Isolat

TsC3

TsC5

TsC6

TsC7


Diameter : 74Konidia/Spora : tidak adaWama miselium : putih

Permukaan Miselium : sedikit menebal,menyebar rata

Diameter: 71Konidia/Spora : tidak ada

Wama miselium : putih tipisPermukaan Miselium : agak kasar

menyebar

Diameter: 80Konidia/Spora : tidak adaWama miselium : putih

Permukaan Miselium : rata menyebar


Permukaan Miselium : menyebar tetapitidak rata, memiliki pola tertentu

Wama Miselium : putih kekuninganPermukaan Miselium : menyebar


Wama Miselium : bagian tengah adawama coklat sedikit, putih

Permukaan Miselium : menyebarPerubahan Media : tidak ada

Wama Miselium : putih kekuninganPermukaan Miselium : rata menyebar


Wama Miselium : bagian tengah sedikitjingga, putih ada bintik hitam

Permukaan Miselium : menyebar denganpola tertentu


pertumbuhannya dan identifikasi senyawa metabolitsekunder yang dihasilkan isolat tersebut.

Data yang menunjukkan hasil uji aktivitasantioksidan pada isolat-isolat kapangendofit Taxus

sumatrana terdapat pada Tabel 3.

Dari hasil skrining tersebut diperoleh bahwa

pada kapang TsC-17 dapat menghasilkan senyawabioaktif yang memiliki daya peredam radikal bebaspaling besar dibanding isolat-isolat kapang lainnya.

Kurva pertumbuhan kapang endofit TsC-17Kurva pertumbuhan dilakukan untuk

353



No Kode Isolat

TsC8

TsC 10

TsC 12

TsC 13



Permukaan Miselium : tidak rata, menyebar


Permukaan Miselium : kasar, tidak rata,menyebar

Diameter: 71Konidia/Spora: tidak ada

Warna miselium : putih, ada sedikit hijauPermukaan Miselium : tidak rata, menyebar


Wama miselium : putih hijauPermukaan Miselium : ada penebalan,

menyebar

Permukaan Bagian Bawah

Wama Miselium : bagian sebelum tengahmembentuk garis jingga, putih

Permukaan Miselium : rata, menyebarPerubahan Media : tidak ada

Wama Miselium : bagian yang tua coklatjingga, pinggir putih

Permukaan Miselium : rata, pinggir tidakteratur


Wama Miselium : membentuk garistumbuh coklat, hijau putih bagian pinggir

Permukaan Miselium : rata menyebarPerubahan Media : tidak ada

Wama Miselium : bagian tengah kuningmuda, pinggir putih

Permukaan Miselium : rata menyebarPerubahan Media : tidak ada

mengetahui waktu optimum yang diperlukan untumenghasUkan senyawa bioaktif kapang endofit TsC-17. Hasil pengamatan data kurva pertumbuhan isolatTsC-17 selama 20 hari ditunjukan pada Tabel 4 danGambar5.

Fase pertumbuhan kapang ditentukan olehwaktu pertumbuhannya. Hari ke-0 sampai hari ke-4kapang TsC-17 mengalami fase adaptasi (fase lag),

kapang beradaptasi dengan lingkungan tumbuhnya.Setelah mampu beradaptasi dengan lingkungannya,kapang akan mulai tumbuh. Kapang mengalami fasepertumbuhan (fase log) dari hari ke-4 sampai hari ke-12, pada fase ini terlihat adanya peningkatan jumlahsel. Setelah hari ke-12 sampai hari ke-14 kurvapertumbuhan menunjukkan bahwa kapang mulaimemasuki fase stasioner. Pada fase ini sel tidak

354



No Kode Isolat Permukaan Bagian Atas


Waraa miselium : hijau muda, putihPermukaan Miselium : tidak rata


Warna miselium : putih, coklat-hijauPermukaan Miselium : sedikit

bergelombai

Diameter: 88Konidia/Spora: tidak adaWarna miselium : putih

Permukaan Miselium: rata

Diameter: 82Konidia/Spora: tidak adaWarna miselium : putih

Permukaan Miselium : hamper rata


Warna miseiium : putih hijauPermukaan Miselium : tidak rata

Permukaan Bagian fiawah

Wama Miseiium : hijau hitamPermukaan Miselium : rata, memiliki pola

pertumbuhanPerubahan Media : tidak ada

Warna Miselium : putih-kuningPermukaan Miselium : rata, ada pola

pertumbuhanPerubahan Media: tidak ada

Warna Miselium : putihPermukaan Miselium: rata


Warna Miseiium : putih kekuninganPermukaan Miselium : rata, ada pola

pertumbuhanPerubahan Media : tidak ada

Wama Miselium : hitam hijauPermukaan Miselium: rataPerubahan Media : tidak ada

Permukaan Bagian Atas Permukaan Bagian Bawah

Diameter : 71Konidia/Spora : tidak adaWama miselium : putih

Permukaan Miselium : rata

Waraa Miselium : putih jinggaPermukaan Miselium: rata


355


Tabel 2. Hasil penimbangan ekstrak dari filtrat (ekstraseluler) dan biomasa (intraseluler) hasil bioproduksikapang endofit Taxus sumatrana

No

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Kode Isolat

TsC2

TsC3

TsC5

TsC6

TsC7

TsC8

TsCIO

TsC 12

TsC 13

TsC 15

Filtrat/Biomasssa

FBFBFBFBFBFBFBFBFBFB

Berat (mg)

0,00520,00620,00250,01050,00100,06790,00730,05820,00770,04360,01010,04030,00610,03580,01090,03670,00210,00470,00240,0120

No

11

12

13

14

15

Kode Isolat

TsC 17

TsC 18

TsC 27

TsC 28

TsC 29

Filtrat/Biomasssa

FBFBFBFBFB

Berat (g)

0,00330,01120,00580,01940,00720,00570,00630,00290,00590,0173

Keterangan: T : Taxuss : sumatrana

C : Cibodas

F : FiltratB : Biomassa

HP*IF I B ZF 2B 3F 3B 4F 4B 5F 5B 6F 6B B 0 7F 7B 8F SB 9F 9B 10F 10B 11F IB 12F 12B 13F 13B 14F 14B 15F 15B

Gambar 2. Kromatogram KLT senyawa kimia hasil bioproduksi kapang endofit Taxus sumatrana (kloroform-metanol = 5:1)

Keterangan :Lempeng : silika gel F254

Penyemprot : Serium sulfat 10%Eluen : A. n-heksan : etilasetat = 2 : 1

B. kloroform : metanol = 5 : 1: Filtrat; B = Biomassa

( : spot terlihat pada UV 366 nm) : spot terlihat pada UV 254 nmGambar 3 : Hasil KLT dengan eluen kloroform : metanol = 5 : 1Gambar 4 : Hasil KLT dengan eluen n-heksan : etilasetat = 2 : 1

IF

IB

2F

2B

3F

3B

4F

4B

5F

5B

TsC-2 filtratTsC-2

biomassaTsC-3 filtrat

TsC-3biomassa

TsC-5 filtratTsC-5


TsC-6biomassa

TsC-7 filtratTsC-7

biomassa

6F

6B

7F

7B

8F

SB

9F

9B

10F

10B

TsC-8 filtratTsC-8


TsC-10biomassa

TsC-12 filtratTsC-12


TsC-13biomassa


biomassa

11F

11B

12F

12B

13F

13B

14F

14B

15F

15B



TsC-18biomassa



TsC-28biomassa


biomassa

356


IF IB 2F 2B 3F 3B 4F 4B 5F 5B 6F 6B BO 7F 7B 8F 8B 9F 9B 10F 10D 11F 11B Bp 12F 12B 13F 13B 14F 14B 15F 1SB

Gambar 3. Kromatogram KLT senyawa kimia hasil bioproduksi kapang endofit Taxus sumatrana («-heksan-etilasetat = 2:1)

Keterangan :

Lempeng : silika gel F254

Penyemprot : Ser ium sulfat 10%

Eluen : A. n-heksan : etilasetat = 2 : 1

B . kloroform : metanol = 5 : 1

: F i l t r a t ; B = Biomassa

£ : spot terlihat pada UV 366 nm

) : spot tertihat pada UV 254 nm

Gambar 3 : Hasi l KLT dengan eluen kloroform : metanol = 5 : 1

Gambar 4 : Hasi l KLT dengan eluen n-heksan : etilasetat = 2 : 1

IF

IB

2F

2B

3F

3B

4F

4B

5F

5B

TsC-2 filtratTsC-2


TsC-3biomassa

TsC-5 filtratTsC-5


TsC-6biomassa

TsC-7 filtratTsC-7

biomassa

6F

6B

7F

7B

8F

8B

9F

9B

10F

10B

TsC-8 filtratTsC-8


TsC-10biomassa



TsC-13biomassa


biomassa

11F

11B

12F

12B

13F

13B

14F

14B

15F

15B



TsC-18biomassa



TsC-28biomassa


biomassa

memperbanyak diri lagi, laju pembiakan berkurang danakan terbentuk spora karena menyusutnya nutriendalam media. Fase ini diasumsikan akan terjadi sekresisenyawa bioaktif keluar sel (ekstraselular) sementarasenyawa aktif yang intraselular akan tetap beradadidalam sel tersebut.

Uji antioksidan dengan metode peredaman radikalbebas menggunakan DPPH hasil bioproduksiTsC-17

Ekstrak dari filtrat dan biomasa isolat kapangendofit TsC-17 diuji aktivitas antioksidannya dandibandingkan dengan vitamin C. Adapun metode yangdipakai adalah metode peredaman radikal bebasmenggunakan reagen DPPH. Hasil uji aktivitasantioksidan dari vitamin C dan tiap fraksi dari isolatkapang TsC-17 dapat dilihat pada Gambar 6.

Pada uji aktivitas antioksi dan isolat kapang TsC-17 terlihat bahwa senyawa bioaktif yang diekskresikan

(ekstraselular) oleh kapang isolat menunjukkanaktivitas peredaman radikal bebas yang lebih baikdibandingkan dengan senyawa bioaktif yang tidakdiekskresikan (intraselular), walaupun demikian hasilsenyawa bioaktif tersebut tidak memiliki aktivitas lebihbaik dari vitamin C.

PEMBAHASANKapang endofit yang diisolasi dari tanaman

Taxus sumatrana menunjukkan jenis koloni yangberbeda-beda. Pertumbuhan dalam media PDAmemberikan karakter-karakter khusus sehingga bisamerupakan karakter spesifik bagi j enis kapang tersebut.Isolat TsC-17 mempunyai karakter koloni denganpinggiran yang bergelombang, spora berwarna putihkuning dan setelah agak tua akan berwarna hijaukecoklatan. Produksi senyawa aktif ekstraselular tidakmenyebabkan perubahan warna media.

357


Tabel 3. Hasil uji aktivitas peredaman radikal bebas untuk semua ekstrak hasil bioproduksi kapang endofitTaxus sumatrana

No

1.

2.

No

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

Kode Isolat

TsC 2 F

B

TsC 3 F

B

KodeIsolat

TsC 5 F

B

TsC 6 F

B

TsC 7 F

B

TsC 8 F

B

TsC 10 F

B

TsC 12 F

B

TsC 13 F

B

TsC 15 F

B

Absorban

1,9563,9478,9756,9425,9899,9875,7895,8059,7962,8509,8496,8624

Rerata

1,9599

1,9733

1,7972

1,8543

AbsorbanBlangko

2,0238

2,1205

Inhibisi

(%)

3,1567

2,4761

15,2464

12,5536

Absorban

1,98291,98521,98552,06392,06352,06371,86601,86901,87141,99372,00491,99702,06832,07842,07642,08112,08922,09222,05372,06142,06472,06272,06592,08612,10442,11402,11412,07492,09352,09292,13012,12952,11891,58251,58921,58771,36811,37291,37401,59381,63381,59371,74001,74901,75161,98642,04522,0621

Rerata

1,9845

2,0637

1,8688

1,9985

2,072

2,087

2,0599

2,0716

2,1108

2,0871

2,1262

1,5865

1,3717

1,6071

1,7469

2,0312

AbsorbanBlangko

2,1813

2,1813

2,1813

2,1813

2,1813

2,1813

2,1205

2,1205

Inhibisi

(%)

9,0221

5,3913

14,3263

8,3803

3,985

3,290

5,5654

5,0291

2,2320

4,3185

2,5260

27,2681

35,3124

24,2113

17,6185

4,2113

No

11.

12.

13.

14.

15.

Kode Isolat

TsC 17 F

B

TsC 18 F

B

TsC 27 F

B

TsC 28 F

B

TsC 29 F

B

Absorban

0,84650,84120,81531,58991,69871,75021,9899,9017,8831,9573,9461,9382,3486,3530,3547,7267,7372,7425,9756,9955,9914,9358,9869,9917,9246,9096,9096,9617,9753

1,9799

Rerata

0,8347

1,6796

1,9249

1,9472

1,3521

1,7355

1,9875

1,9715

1,9146

1,9723

AbsorbanBlangko

2,1205

2,0238

2,0238

2,0238

2,0238

Inhibisi( " • • I

Ml.d.Vifi

20,7923

4,8915

3,7832

34,7268

14,2455

1,7937

2,5842

5,3958

2,5447

Tabel 4. Hasil penimbangan bobot massa isolatkapang TsC-17 selama 20 hari

No.12.3.4.5.6.

Hari ke-048121620

pH4,664,614,514,424,405,53

Bobot Biomassa (g)0,00000,11030,20190,25870,25800,2483

Gambar 4. Kurva pertumbuhan isolat kapang TsC-17

358


Tabel 5. Hasil uji aktivitas peredaman radikal bebasdariVitaminC

Tabel 6. Hasil uji aktivitas peredaman radikal bebasdari Filtrat kapang TsC-17

No

1

2

3

4

5

Konscntrasi(ppm)

3

6

9

12

15

Blangko

Absorban

1,83621,86441,89081,41491,42211,42410,97290,97410,97500,40130,40270,40420,08290,08300,08312,11392,12012,1138

Rerata

1,8638

1,4204

0,9740

0,4027

0,0830

2,1159

Persen hambatan(%)

11,9146

32,8702

53,9676

80,9679

96,0773

IC»(ppm)

8,2848

No

1

2

3

4

5

Konsentrasi(ppm)

5

10

25

50

100

Blangko

Absorban

2,10112,10192,10572,00312,00751,99931,87121,89011,99121,34211,34551.33650,81240,81290,83012,11392,12012,1138

Rerata

2,1029

2,0033

1,9175

1,3414

0,8184

2,1159

PersenHambatan

(%)

0,6144%

5,3216%

9,3766 %

36,6038 %

61,3214%

ICs,(ppm)

79,7506

Tabel 7. Hasil uji aktivitas peredaman radikal bebasdari biomassa kapang TsC-17

No

1

2

3

4

5

Konscntrasi(ppm)

5

10

25

50

100

Blangko

Absorban

2,10872,10832,10492,08042,07982,07892,01872,01982,02131,89351,88931,89151,65781,66081,65932,11392,12012,1138

Rerata

2,1073

2,0797

2,0199

1,8914

1,6593

2,1159

Ptrstnhambatan

0,4065 %

1,7109%

4,5371 %

10,6101 %

21,5794%

227,3848

Untuk melihat adanya produksi senyawabioaktif, metoda khromatografi lapis tipis (KLT)merupakan metoda yang cukup efisien untukditerapkan. Selain itu pemilihan pelarut yang cocok jugasangat menentukan hasil yang optimal. Walaupunmetode KLT ini mempunyai tingkat pemisahan yangrendah, tetapi dapat digunakan sebagai ujipendahuluan dalam mengidentifikasi senyawa kimiadan pemilihan sistem pelarut untuk analisakromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi(KCKT).

c

am b

ats

XC

Per

se

120

100

80-

60

40 -

y

20 }0-h-»-

5

Uji Antioksidan

/

10 25 50

Konsentrasi (ppmj

TsC-17

/ -

i

100

-•-Fi l t rat

-*— Biomassa

* Vitamin C

Gambar 5. Kurva hasil uji aktivitas peredamanradikal bebas dari isolat kapang TsC-17

Uji aktifitas meredam radikal bebasmenunjukkan bahwa kapang TsC-17 mampumenghasilkan senyawa antioksidan hingga lebih dari61.35 %. Sementara kapang-kapang yang lain masihdibawah50%.

Kapang endofit TsC-17 mampu menghasilkansenyawa antioksidan cukup signifikan yakni padakonsentrasi 100 ppm, persen hambatan 21.5794 %dengan nilai IC50 227.3848 ppm sementara vitamin Cpada 100 ppm persen hambatannya adalah 61.3214 %dengan nilai IC^ 79.7506. . ... -

359


KESMPTJLAN

Kapang endofitik yang diisolasi dari tanaman

Taxus sumatrana mempunyai potensi dalam

menghasilkan berbagai senyawa bioaktif yang bersifat

antioksidan dan antimikroba. Sehingga dapat

disimpulkan bahwa endofit yang diisolasi dari tanaman

Taxus dapat dikembangkan sebagai sumber obat baru.

Senyawa bioaktif yang dieksresikan

ekstraselular dari kapang endofitik TsC-17 memiliki

aktivitas sedang dalam uji aktivitas antioksidan metode

peredaman radikal bebas dengan menggunakan reagen

DPPH walaupun masih lebih rendah dibandingkan

dengan kemampuan vitamin C.

UCAPANTERIMAKASIH

Ucapan terima kasih khususnya kami sampaikan

kepada Dr Partomuan Simanjuntak atas bantuannya

dalam memberikan bimbingan dan konsultasi dalam

Bidang Analisis Biokimia. Terimakasih juga kami

sampaikan kepada Vito S Simanjuntak atas

asistensinya. Akhirnya ucapan terima kasih kami

tujukan kepada rekan-rekan di Laboratorium

Mikrobiologi Tanah, Sylvia Lekatompessy, Tiwit

Widowati, Lisye Nurjanah, Nuriyanah dan

Bustanusalam yang telah membantu selama kegiatan

penelitian ini berlangsung.

DAFTARPUSTAKAKitagawa I, Mahmud, T Kobayashi, M Roemantyo and H

Shibuya.1995. Taxol and its related taxoids fromthe needles of Taxus sumatrana. Chemical PharmacyBullettin 43(2), 365-367.

Lampe JW. 1999. Health effects of vegetables and fruit:Assessing mechanism of action in human experimentalstudies. American Journal of Clinical Nutrition,

70(Suppl), 475S-490S.Phongpaichit S, J Nikom, Rungjindamai, J Sakayaroj,

TN Hutadilok, V Rukachaisirikul and KKirtikara. 2007. Biological activities of extracts fromendophytic fungi isolated from Garcinia plants.Immunology and Medical Microbiology 51(3), 517-525.

Shen Y, YL Pan, KL Lo, SS Wang, YT Chang, LT Wangand YC Lin. 2003. New taxane diterpenoids fromTaiwanese Taxus sumatrana. Chemical PharmacyBullettin 7, 867-869.

Song Y. 1998. Isolation and cultivation of endophytic fungi.Asian Network on Microbial Researcher, 255- 258.

Strobel G, and D Long. 1998. Endophytic microbes embodypharmaceutical potential. Asni News 63(5), 263.

Strobel GA, A Stierle, D Stierle and WM Hess. 1993.Taxol formation in yew - Taxus. Plant Science 92, 1-2.

Strobel GA. 2002a. Microbial Gift from Rain forest.Canadian Journal of Plant Pathology 24, 14-20.

Strobel GA. 2002b. Rain Forest Endophytes and BioactiveProduct. Critical Review in Biotechnology 22(4), 315-333.

Strobel GA and B Daisy. 2003. Bioprospecting for microbialendophytes and their natural products. Microbiologyand Molecular Biology Review 67(4), 491-502.

Srobel GA, X Yang, J Sears, R Kramer, RS Sidhu, WMHess.1996. Taxol from Pestalotiopsis micropore, anendophytic fungus of Taxus wallachiana . Microbiology;142, 435-440.

Strobel GA, B Daisy, U Castillo, J Harper. 2004. NaturalProduct from endophytic microorganisms. Journal of.Natural .Product., 67,257-268.

Tanaka M, H Sukiman, M Takebayashi, K Saito, MSPrana, TK Prana, and F Tomita. 1999. Isolation ofEndophytes from plants in Southeast Asia and Japan,and their identification by 18SrRNA gene. In: Annnualreport of ICBiotech 1999, in press.

Winarsi H. 2007. Antioksidan alami dan radikal bebas.Yogyakarta: Penerbit Kanisius; Hal 11-7, 49, 77-81.

360

taxus sumatrana (miquel) de laubenfels dan …

Documents