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GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

TALLER DE MICROBIOLOGÍA 2017

9-13 enero 2017 Santiago, Chile

Programa de Microbiología y Micología, ICBM Facultad de Medicina Universidad de Chile

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MICROBIOLOGÍA DEL SIGLO XXI

CONCEPTO GENERAL Los microorganismos son seres sociales que viven en comunidad en su ambiente natural y que interactúan con otros seres vivos.

CONCEPTOS ESPECÍFICOS 1. La plasticidad genómica de los microorganismos ha generado su biodiversidad y les ha

permitido colonizar diferentes ambientes.

2. Los procesos que originan la variabilidad genética de los microorganismos son principalmente mutaciones y transferencia horizontal de genes.

3. Los microorganismos se comunican y coordinan la expresión de genes en función de su densidad poblacional.

4. Los microorganismos son actores principales en el campo de la salud y la biotecnología.

COORDINADOR Juan Carlos Salazar: Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, U. de Chile

DOCENTES PARTICIPANTES Felipe Del Canto: Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, U. de Chile María Cristina Díaz: Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, U. de Chile Nicolas Guilliani: Depto. Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile Claudia Lefimil: Área Bioquímica, ICOD, Facultad de Odontología, Universidad de Chile Antonio Said: Depto. de Biología, Facultad de Ciencias Básicas, UMCE Juan Carlos Salazar: Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, U. de Chile Cecilia Toro: Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, U. de Chile María Teresa Ulloa: Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, U. de Chile

METODOLOGÍA: Este curso será impartido mediante clases teóricas y actividades prácticas.

LUGAR: Auditórium Hernán Romero y Laboratorios de Salud Pública, Salas de trabajo práctico 1-4 (Zócalo). Sector K, Facultad de Medicina, Campus Norte, Universidad de Chile. Avda. Independencia N° 1027, Santiago, Chile.

FECHA Y HORARIO: 09 al 13 de Enero de 2017 - 40 hrs totales Lunes a Viernes, de 9:00 a 13:00hrs (Teórico-Práctico) y de

14:30 a 18:00hrs (Teórico-Práctico). EVALUACION: Se evaluará con 1 prueba escrita, modalidad de selección múltiple. REQUISITOS DE CERTIFICACIÓN: Asistencia mínima 80%. Aprobación nota mínima 4,0 (escala de 1,0 a 7,0).

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Taller Microbiología del siglo XXI Calendario de clases teóricas y prácticas

Fecha Hora Actividad Profesor encargado

Sala

La plasticidad genómica de los microorganismos ha generado su biodiversidad y les ha permitido colonizar diferentes ambientes

Lunes 9 9:00-9:30 CT1 El Mundo Microbiano JCSalazar Hernán Romero

9:30-10:30 CT2 Aspectos básicos de las bacterias: morfología, estructura, fisiología y reproducción

JCSalazar Hernán Romero

10:30-11:00 CAFÉ

11:00-12:00 CT3 Generalidades de hongos levaduriformes y hongos filamentosos

MCDíaz Hernán Romero

12:00-13:00 TP1 Observar el mundo microbiano mediante microscopía al fresco y tinciones de bacterias y hongos.

JCSalazar, ASaid, MCDíaz, CeToro

Salas de TP Salud Pública Zócalo

13:00-14:30 Almuerzo

14:30-16:00 TP2 Observar la biodiversidad microbiana ambiental y humana, mediante cultivo en medios nutritivos.

JCSalazar, ASaid, CLefimil, MTUlloa,

Salas de TP Salud Pública Zócalo

16:00-16:30 Descanso

16:30-18:00 Observar la resistencia a antimicrobianos mediante: TP3 Estudio de susceptibilidad in vitro.

TP4 Selección de mutaciones espontáneas que confieren resistencia a antibióticos.

JCSalazar, ASaid, MTUlloa, CeToro

Salas de TP Salud Pública Zócalo

Los procesos que originan la variabilidad genética de los microorganismos son principalmente mutaciones y transferencia horizontal de genes

Martes 10 9:00-10:00 CT4 Genomas microbianos: mutaciones espontáneas y Transferencia Horizontal de Genes

CeToro Hernán Romero

10:00-11:00 CT5 Impacto de la Transferencia Horizontal de Genes en los microorganismos

CeToro Hernán Romero

11:00-11:30 CAFÉ

11:30-13:00 TP5 Evidenciar la transferencia horizontal de genes mediante ensayos de transformación.

JCSalazar, CeToro, ASaid, MTUlloa

Salas de TP Salud Pública Zócalo

13:00-14:30 Almuerzo

14:30-16:00 TP2 Cont. Observar la biodiversidad microbiana ambiental y humana analizando el crecimiento de colonias en medios nutritivos y Tinción de Gram.

TP4 Cont. Observar la resistencia a antimicrobianos mediante la selección de mutantes espontáneas.

JCSalazar, ASaid, CLefimil, MTUlloa,

Salas de TP Salud Pública Zócalo

16:00-16:30 Descanso

16:30-18:00 TP3 Cont. Observar e interpretar la resistencia a antimicrobianos mediante lectura y análisis del estudio de susceptibilidad.

MTUlloa, CeToro, ASaid, JCSalazar

Salas de TP Salud Pública Zócalo

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Los microorganismos se comunican y coordinan la expresión de genes en función de su densidad poblacional

Miércoles 11

9:00-10:00 CT6 Comunicación entre los microorganismos NGuilliani Hernán Romero

10:00-11:30 TP4 Cont. Observar la resistencia a antimicrobianos mediante selección de mutantes espontáneas.

TP5 Cont. Evidenciar la transferencia horizontal de genes mediante la observación de adquisición de un fenotipo nuevo por transformación.

TP6 Observar la comunicación bacteria-bacteria mediante incubación del sobrenadante de la cepa productora de autoinductor con una cepa reportera.

JCSalazar, CeToro, ASaid, CLefimil,

Salas de TP Salud Pública Zócalo

11:30-11:45 CAFÉ

11:45-13:00 CT7 Formación de Biopelículas CLefimil Hernán Romero

13:00-14:30 Almuerzo

14:30-16:00 TP5 Cont. Evidenciar la transferencia horizontal de genes mediante la observación de la adquisición de un nuevo plásmido utilizando geles de agarosa.

JCSalazar, CeToro, ASaid,

Salas de TP Salud Pública Zócalo

16:00-16:30 Descanso

16:30-18:00 TP6 Cont. Observar la comunicación bacteria-bacteria mediante la producción de luz por una cepa reportera.

TP7 Evidenciar la formación de biopelículas en perlas de azufre mediante la tinción con cristal violeta o PCR de cepas de Acidithiobacillus crecidas previamente.

TP8 Evidenciar la formación de biopelículas sobre la dentadura, mediante el uso del colorante caristop dualtone.

JCSalazar, NGuilliani, CLefimil, CeToro

Salas de TP Salud Pública Zócalo

Los microorganismos son actores principales en el campo de la salud y la biotecnología Jueves 12 9:00-10:00 CT8 Interacción de los microorganismos con sus

hospederos FDelCanto Hernán

Romero

10:00-10:30 CT9 Probióticos: ejemplo de microorganismos beneficiosos

FDelCanto Hernán Romero

10:30-11:15 TP9 Observar la presencia o ausencia de genes de virulencia mediante PCR de genes específicos de E. coli diarreogénicos.

JCSalazar, ASaid, CLefimil

Salas de TP Salud Pública Zócalo

11:15-11:45 CAFÉ

11:45-13:00 CT10 Microorganismos patógenos para el hombre MTUlloa Hernán Romero

13:00-14:30 Almuerzo

14:30-16:00 TP9 Cont. Observar la presencia o ausencia de genes de virulencia mediante electroforesis en geles de agarosa de los productos amplificados.

JCSalazar, ASaid, CLefimil

Salas de TP Salud Pública Zócalo

16:00-16:30 Descanso

16:30-18:00 TP10 Comparar in silico genomas de especies bacterianas beneficiosas y patógenas.

FDelCanto Hernán Romero

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Capítulo de cierre del taller Microbiología del siglo XXI Viernes 13 9:00-10:30 Discusión general de los temas tratados en el taller de

Microbiología 2017 Mesa Redonda

Hernán Romero

10:30-11:00 CAFÉ

11:00-13:00 Evaluación del Taller JCSalazar, MCDíaz

Hernán Romero

13:00-14:30 Almuerzo

15:00-17:00 Discusión y revisión de todos los 5 cursos realizados en Santiago.

Todos los participantes

Lorenzo Sazie

Día 1 lun 09

Día 2 mar 10

Día 3 mie 11

Día 4 jue 12

AM PM AM PM AM PM AM PM

TP1 X

TP2 X X

TP3 X X

TP4 X X X

TP5 X X X

TP6 X X

TP7 X

TP8 X

TP9 X X

TP10 X

Flujograma de trabajos prácticos

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Contenido CONCEPTO GENERAL ......................................................................................................... 2 CONCEPTOS ESPECÍFICOS ................................................................................................... 2 Calendario de clases teóricas y prácticas ............................................................................ 3

Flujograma de trabajos prácticos ...................................................................................... 5

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN LOS TRABAJOS PRÁCTICOS DE MICROBIOLOGÍA ............... 7 TRABAJO PRÁCTICO Nº 1 ................................................................................................... 8

Observar el mundo microbiano mediante microscopía al fresco y tinciones de bacterias y hongos ............................................................................................................................. 8

TRABAJO PRÁCTICO Nº 2 ................................................................................................. 10 Observar la biodiversidad microbiana ambiental y humana mediante cultivo en medios nutritivos ....................................................................................................................... 10

A) MICROBIOTA AMBIENTAL ....................................................................................... 11

B) MICROBIOTA NORMAL ............................................................................................ 13

TRABAJO PRÁCTICO Nº 3 ................................................................................................. 16 Observar la resistencia a antimicrobianos mediante lectura y análisis del estudio de susceptibilidad ............................................................................................................... 16

TRABAJO PRÁCTICO Nº 4 ................................................................................................. 18 Seleccionar mutaciones espontáneas que confieren resistencia a antibióticos ................ 18

TRABAJO PRÁCTICO Nº 5 ................................................................................................. 22 Evidenciar la transferencia horizontal de genes mediante ensayos de transformación de cepas resistentes a antimicrobianos ............................................................................... 22

TRABAJO PRÁCTICO Nº 6 ................................................................................................. 25 Observar la comunicación bacteria-bacteria mediante incubación del sobrenadante de una cepa productora de autoinductor con una cepa reportera ........................................ 25

TRABAJO PRÁCTICO Nº 7 ................................................................................................. 27 Evidenciar la formación de biopelículas en perlas de azufre por bacterias extremófilas biomineras mediante la tinción con cristal violeta .......................................................... 27

TRABAJO PRÁCTICO Nº 8 ................................................................................................. 31 Evidenciar la formación de biopelículas sobre la dentadura mediante el uso del colorante caristop dualtone ........................................................................................................... 31

TRABAJO PRÁCTICO Nº 9 ................................................................................................. 32 Observar la presencia o ausencia de genes de virulencia mediante PCR de genes específicos de E. coli diarreogénicos ............................................................................... 32

TRABAJO PRÁCTICO Nº 10 ............................................................................................... 38 Comparar in silico genomas de especies bacterianas beneficiosas y patógenas ............... 38

ANEXOS ........................................................................................................................... 39

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NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN LOS TRABAJOS PRÁCTICOS DE MICROBIOLOGÍA

En el Laboratorio de Microbiología es necesario mantener una serie de normas de bioseguridad, cuyo propósito fundamental es la preservación de la salud del alumno, sus familiares y la comunidad en general. Estas normas son las siguientes:

1. Al ingresar y antes de abandonar el Laboratorio el alumno debe lavarse prolijamente las manos.

2. Cada alumno debe usar delantal blanco con el fin de preservar su vestimenta personal (se recomienda envolverlo en una bolsa plástica).

3. Se prohíbe comer, beber, fumar o llevar cualquier tipo de objeto a la boca por existir gran posibilidad de contagio.

4. Las pipetas Pasteur y las asas (de requerirse) se deben esterilizar en la llama del mechero, antes y después de su uso, dejándolas en el soporte correspondiente, por ningún motivo sobre el mesón. En ambos casos, se deben enfriar antes de introducirlas a las placas a fin de evitar salpicaduras, microgotas o aerosoles que pueden contener elementos contagiosos.

5. Las pipetas Pasteur deben depositarse en contenedores para deshecho de material de vidrio y cortopunzantes después de haber sido utilizadas.

6. Las placas de Petri deben abrirse solamente en el momento de la siembra y a una distancia no superior a 30 cm del mechero encendido.

7. Los tubos deben ser flameados en el mechero antes y después de extraer o depositar un inóculo.

8. Frente al derrame de un medio de cultivo o muestra, informe inmediatamente al docente para que éste resuelva el problema según protocolo. Recomendamos igual procedimiento con respecto a cualquier tipo de accidente como quemaduras, cortaduras, aspiración o contacto con el material contaminado.

9. Es de primordial importancia el cuidado del microscopio. Una vez usado el lente de inmersión debe limpiarse con la solución destinada para tal fin. Encienda la ampolleta sólo en el momento de la observación.

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 1 Observar el mundo microbiano mediante microscopía al fresco y

tinciones de bacterias y hongos

INTRODUCCIÓN La observación microscópica directa de los microorganismos, provenientes desde

una muestra permite visualizar características tales como morfología celular, agrupaciones celulares, propiedades tintoriales y evidenciar rasgos fisiológicos, bioquímicos y estructurales, entregando información fundamental a considerar durante la identificación de un agente bacteriano o fúngico.

OBJETIVOS

1. Conocer los fundamentos teóricos de la tinción de Gram y clasificar las bacterias como Gram (+) y Gram (-).

2. Reconocer las diversas morfologías y agrupaciones microbianas que pueden presentar algunas especies bacterianas.

3. Visualizar las estructuras macro y microscópicas de algunos hongos levaduriformes

y algunos hongos filamentosos.

ACTIVIDADES

DÍA 1 1.- Analizar conceptos básicos de bioseguridad y normas del laboratorio. 2.- Discutir los fundamentos de la tinción de Gram y su relación con la clasificación de algunas

bacterias y hongos, tanto ambientales como de importancia médica. 3.- Observar al microscopio la morfología, agrupación y propiedades tintoriales de los

principales grupos de microorganismos. Completar la planilla (microteca). - Cocácea Gram Positivo en cadenas - Bacilo Gram Positivo - Cocácea Gram Positivo en racimos - Bacilo Gram Negativo - Cocácea Gram Negativo en pares - Espiroquetas 4.- Observar movilidad al fresco de una muestra de Proteus o Pseudomonas. 5.- Observar biodiversidad de microorganismos mediante examen al fresco de una muestra

de agua de charco. 6.- Observar crecimiento en medio sólido de levaduras y hongos filamentosos. 7.- Observar características microscópicas de preparaciones fijadas de levaduras (Candida

albicans), hongos filamentosos septados (Penicillium, Aspergillus), filamentosos aseptados (Mucor, Rhizopus) filamentosos pigmentados (Alternaria).

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Tinción: Tinción:

Forma: Forma:

Agrupación: Agrupación:

Tinción: Tinción:

Forma: Forma:

Agrupación: Agrupación:

Para hongos

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 2 Observar la biodiversidad microbiana ambiental y humana

mediante cultivo en medios nutritivos

INTRODUCCIÓN

MICROBIODIVERSIDAD (o DIVERSIDAD MICROBIANA)

En la naturaleza, los microorganismos viven asociados a otros en conjuntos mayores denominados poblaciones. Tales poblaciones se componen de células relacionadas entre sí y generalmente, derivan de una única célula parental. El lugar físico donde vive una población microbiana se denomina hábitat.

Los microorganismos son miembros esenciales de la biosfera. Se encuentran presentes en diversos ambientes, desde aquellos que presentan condiciones ideales para su crecimiento y reproducción, como aquellos que están casi al límite de las condiciones abióticas. Esta propiedad de ubicuidad de los microorganismos es consecuencia tanto del ámbito más amplio de potencialidades fisiológicas y bioquímicas que presentan en su conjunto respecto a los demás organismos vivos, como de su reducido tamaño y capacidad para adaptarse y resistir condiciones ambientales extremas.

Los microorganismos se encuentran por ejemplo en el aire que respiramos, en los alimentos que consumimos, sobre objetos inanimados (paredes, piso, suelos, etc.). Incluso algunos pueden habitar en ambientes tan hostiles como fuentes hidrotermales terrestres o marinas a temperaturas sobre los 100ºC. Algunos microorganismos se encuentran presentes en diversas partes del cuerpo de los animales, constituyendo lo que se denomina la microbiota normal o nativa de ese organismo. Esta colonización microbiana del cuerpo, que se inicia durante el nacimiento y persiste hasta la muerte del organismo, se presenta en diversas partes tales como, boca, garganta, intestino, etc., en general en piel y mucosas. Pero, la gran mayoría de los microorganismos se encuentra presente en ambientes naturales, tales como, el aire, el suelo y el agua.

Considerando, la diversidad microbiana presente en estos ambientes naturales, la microbiología ha desarrollado un conjunto de técnicas y procedimientos de laboratorio que permiten aislar y caracterizar aquellos microorganismos capaces de crecer en estas condiciones, obteniendo cultivos puros. Para ello, se deben obtener muestras representativas de cada ambiente natural y proceder a su aislamiento y caracterización citológica y fisiológica o bioquímica.

La obtención de cultivos puros se realiza empleando soluciones nutritivas que contienen todos los elementos nutricionales adecuados para el desarrollo del microorganismo (medios de cultivo). Mediante observación microscópica del microorganismo teñido adecuadamente, se puede lograr la caracterización morfológica del microorganismo en estudio, y mediante ensayos de medición de actividades enzimáticas se puede caracterizar bioquímicamente.

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OBJETIVOS:

1.- Visualizar la diversidad y ubicuidad de los distintos microorganismos que componen la microbiota ambiental en muestras procedentes de suelo, aire y aguas contaminadas.

2.- Conocer y visualizar la microbiota normal del cuerpo humano.

ACTIVIDADES

A) MICROBIOTA AMBIENTAL

Realizar siembra de muestras ambientales en medios de cultivos enriquecidos. DÍA 1

a. Muestra de aire

- Exponer al ambiente una placa de agar sangre y otra de agar Sabouraud, retirando la tapa superior de ambas y manteniéndolas abiertas durante toda la sesión. Utilizar placas de cada medio de cultivo sin abrir, como control. Cerrar las placas, rotularlas correctamente e incubar por 12-24 horas a 37ºC las placas de agar sangre y a 30ºC las placas de agar Sabouraud. Las placas se incuban en la estufa en posición invertida (contratapa de la placa conteniendo el medio de cultivo hacia arriba).

b. Muestra de suelo - Usted dispondrá de una muestra de suelo de jardín (5 gramos), en un recipiente de vidrio limpio y estéril. Depositar la muestra, de manera aséptica, en un matraz conteniendo 45 ml de suero fisiológico estéril. Agitar el matraz hasta lograr la máxima disolución de la muestra. Ésta será la dilución 10-1. Dejar la suspensión en reposo durante 3-4 min en la superficie del mesón de trabajo. - A partir de esta solución, realizar una dilución seriada de la muestra, en tubos de ensayo conteniendo 9 ml de suero fisiológico estéril (diluciones 10-2 a 10-5). De la fase líquida de la muestra del matraz (parte media) tomar 1 ml, con una pipeta estéril y transferirla al tubo rotulado con la dilución 10-2. Homogenizar completamente el contenido del tubo y repetir el procedimiento, hasta completar la dilución 10-5 (Figura 1). - Observar la turbidez de las diferentes diluciones. Seleccionar una de ellas para ser sembrada en los medios de cultivo. Pipetear 0,1 ml de dicha dilución y depositarla al centro de una placa de agar TSA (agar tripticasa soya). Distribuir la muestra por toda la superficie de la placa (siembra en césped) con la ayuda de un asa en rastrillo, previamente esterilizada a la llama del mechero (el docente del equipo hará una demostración previa). Dejar las placas cerradas sobre el mesón durante unos 5 min para que el exceso de líquido se absorba en el medio de cultivo. Invertir las placas, previamente rotuladas, e incubarlas a 37ºC durante 18 a 24 h.

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c. Muestra de agua contaminada

- Repetir el procedimiento anterior a partir de una muestra de agua contaminada (agua estancada de charco). De acuerdo al grado de turbidez de la muestra, discutir la necesidad de realizar la dilución seriada antes de sembrar el medio de cultivo. Deberá sembrar dos placas de agar TSA e incubarlas en las mismas condiciones de temperatura y tiempo que las placas de las muestras de suelo.

DÍA 2 - Observar los resultados de cada una de las actividades anteriores en la siguiente sesión. Interpretar.

Figura 1. Esquema de trabajo para la dilución de las muestras ambientales.

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B) MICROBIOTA NORMAL

DÍA 1

1.- Discutir sobre los conceptos de microbiota normal, colonización e infección y su relación con la presencia de microorganismos en el ambiente.

2.- Detectar la presencia de microorganismos (COMUNIDADES) en el ser humano

(microbiota normal): piel, mucosas, saliva. Realizar siembra de muestras en medios

selectivos y diferenciales. Para ello:

a) Tomar una muestra microbiológica desde la mucosa de la fosa nasal anterior con una tórula estéril previamente humedecida con suero fisiológico y sembrar la muestra en una placa de agar manitol- sal. Luego diseminar la muestra sobre la placa con pipeta Pasteur para aislar colonias. Incubar a 37ºC por 24 hrs en atmósfera normal.

b) Tomar otra muestra de microbiota, con tórula estéril, desde cualquiera de los siguientes sitios anatómicos: manos, oído, pelo, dientes, encías etc. Humedecer previamente la tórula en suero fisiológico estéril y luego pasar la tórula por el sitio elegido. Sembrar la muestra en 1 placa de agar sangre. Incubar a 37ºC por 24 hrs en atmósfera normal.

3.- Revisar los resultados al día siguiente, en relación al crecimiento de microorganismos en las placas sembradas. Discutir y comparar los resultados con sus compañeros.

DÍA 2 Tinción de Gram

Escoger una colonia proveniente de alguna de las placas sembradas el día anterior para realizar la tinción de Gram, según el siguiente protocolo:

a) Fijar la muestra bacteriana en un portaobjetos, tomando la colonia y suspendiéndola en una gota de agua sobre el portaobjeto. Seque la muestra mediante flameado suave con mechero, evitando la exposición prolongada al calor.

b) Colocar el portaobjetos sobre una superficie apropiada y aplicar solución cristal violeta.

c) Teñir un minuto y lavar el portaobjeto con agua destilada o agua potable.

d) Aplicar solución yodada (lugol) por un minuto y lavar nuevamente con agua.

e) Descolorar mediante la aplicación de una mezcla alcohol-acetona por 30 segundos y lavar nuevamente con agua.

f) Realizar una contratinción con safranina o similar (fucsina) por un minuto. Lave con agua potable.

g) Secar a temperatura ambiente y luego observar al microscopio con lente de inmersión.

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DÍA 2 Observación y caracterización de colonias microbianas

Observar detenidamente las colonias obtenidas sobre el medio sólido de cada una de las muestras, que fueron incubadas en diferentes medios de cultivo y a distintas temperaturas.

Analizar la morfología de las distintas colonias. Para ello, se recomienda el uso de una lupa. Registre en su cuaderno la siguiente información:

Forma, superficie, borde (margen) y elevación

Figura 2. Caracterización de la morfología de colonias bacterianas

Además, se pueden visualizar otras características, como:

Tamaño (mm): determinar el diámetro de la colonia. Si es inferior a 1 mm se dice que es una colonia puntiforme (en forma de alfiler).

Cromogénesis: determinar color de la colonia.

Consistencia: especificar si es de tipo mucosa, viscosa o granular. Para ello, presionar suavemente la colonia con un asa estéril.

Producción de hemolisinas: en agar sangre se puede detectar la producción de hemolisinas (enzimas bacterianas que provocan la lisis de glóbulos rojos). Existen 3 tipos de hemólisis: Beta (β) (hemólisis total), Alfa (α) (hemólisis parcial) y Gamma (γ) (no hemólisis).

Elabore, en su grupo de trabajo, una ficha estandarizada que le permita caracterizar e identificar las diferentes colonias de microorganismos obtenidas de las diversas muestras ambientales (suelo, aire, etc.). La ficha deberá contener, a lo menos las características señaladas en el punto anterior.

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FICHA ESTANDARIZADA PARA LA CARACTERIZACIÓN DE COLONIAS

Fecha de la observación : Condiciones experimentales 1.- Medio de cultivo : 2.- Tipo de muestra : 3.- Dilución de la muestra : 4.- Temperatura de incubación : 5.- Tiempo de incubación :

COLONIA (número)

FORMA ELEVACION MARGEN COLOR TEXTURA TAMAÑO (mm)

1

2

3

4

5

6

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 3 Observar la resistencia a antimicrobianos

mediante lectura y análisis del estudio de susceptibilidad

INTRODUCCIÓN

La resistencia de las bacterias a los antimicrobianos se puede detectar mediante el estudio de susceptibilidad in vitro, que determina el comportamiento de las bacterias frente a los agentes antimicrobianos, bajo condiciones de laboratorio específicas y estandarizadas.

Uno de los métodos más utilizados corresponde al método de susceptibilidad por difusión, conocido también como método de Kirby-Bauer. Éste permite categorizar las bacterias como sensibles o resistentes a los antimicrobianos de una manera cualitativa, mediante el uso de discos de papel filtro impregnados con una cantidad determinada de antimicrobiano y aplicados sobre la superficie de un agar que ha sido inoculado previamente con la bacteria en estudio.

En microbiología clínica, este estudio se realiza para proveer al clínico orientación sobre la terapia que puede ser más apropiada en pacientes con una infección específica. Permite seguir la evolución de las resistencias bacterianas a los antimicrobianos; revisar regularmente el comportamiento de los antibióticos para adaptar la antibioterapia empírica o usar los datos para adoptar ciertas medidas de intervención de salud pública.

ACTIVIDADES

Cada grupo realizará dos antibiogramas, uno para Staphylococcus aureus y otro para Escherichia coli.

DÍA 1 1. Preparar un inóculo de la bacteria a estudiar, suspendiendo 2-3 colonias en caldo Müller

Hinton, a partir de un cultivo puro. 2. Ajustar la densidad óptica del cultivo a Mac Farland 0,5 (esta densidad equivale a 1,5 X 108

UFC/ml). Nota: Cada alumno recibirá el inóculo preparado previamente. 3. Sembrar esta suspensión (cultivo de S. aureus o de E. coli) en placa de agar MH con una

tórula estéril en tres direcciones rotando la placa en 60° cada vez, para formar un tapiz homogéneo.

4. Luego de 5 min, colocar en forma ordenada y equidistante los sensidiscos correspondientes (filtros de papel conteniendo cada antibiótico) según la cepa en estudio, con una pinza, presionándolos suavemente sobre el agar que ya contiene el tapiz bacteriano.

5. Incubar las placas a 35ºC en estufa de cultivo por 18-24 horas, en aerobiosis.

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DÍA 2

6. Observar los resultados en la próxima sesión. Para ello, medir el diámetro del halo de inhibición que se genera alrededor del disco, utilizando una regla. Se registra el resultado en milímetros.

Lectura e interpretación: Interpretar los resultados catalogados como sensible, medianamente sensible y resistente, de acuerdo a las tablas de referencia. (Las tablas del centro de referencia Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) estarán disponibles en su mesón de trabajo).

RESULTADOS

S. aureus

Antimicrobiano Lectura del halo

(mm) Interpretación

S,I, R

Cefoxitina

Ciprofloxacino

Clindamicina

Eritromicina

Trimetoprim-sulfametoxazol

E. coli

Antimicrobiano Lectura del halo

(mm) Interpretación

S,I, R

Ampicilina

Ciprofloxacino

Gentamicina

Nitrofurantoína

Trimetoprim-sulfametoxazol

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 4 Seleccionar mutaciones espontáneas que confieren resistencia a antibióticos

Aislamiento de mutantes espontáneos de resistencia a rifampicina mediante la técnica de

siembra en césped INTRODUCCIÓN

Mutación es una alteración o cambio en la información genética (genotipo) de un ser vivo, lo cual puede o no expresarse como un cambio en el fenotipo del mismo.

En el caso del ser humano pueden afectar a células que forman parte del cuerpo o “soma” del individuo (mutaciones somáticas) las cuales no son heredables. En cambio, mutaciones que se producen a nivel de las células reproductoras del cuerpo (óvulo o espermatozoide), son de tipo heredable (mutaciones hereditarias).

En el caso de los microorganismos y, de manera particular en bacterias, si no afectan su viabilidad y no son reparadas por los diversos sistemas de reparación genética, pueden transmitirse a las células hijas o descendencia, a través del proceso de división celular.

Las mutaciones pueden alterar el fenotipo de un microorganismo de diversas maneras. Pueden afectar la morfología celular o colonial (mutaciones morfológicas); las vías de biosíntesis (anabolismo) o de degradación de moléculas orgánicas (catabolismo) (mutantes bioquímicas); la resistencia a ciertas drogas que impiden su crecimiento y reproducción (mutantes de resistencia), entre otros tipos de mutantes.

Desde el punto de vista de la extensión de las mutaciones algunas de ellas se originan por la alteración de un simple par de nucleótidos y de la inserción o deleción de uno o dos nucleótidos en la región codogénica del gen. Estos cambios pequeños en el DNA se llaman microlesiones, siendo el más pequeño de estos cambios las mutaciones de punto o puntuales (afectan sólo a un par de bases en el DNA). Existen, además, mutaciones mayores o macrolesiones, tales como grandes inserciones, deleciones, inversiones, duplicaciones y translocaciones de secuencias nucleotídicas.

De acuerdo al origen de las mutaciones, existen dos tipos: mutaciones espontáneas y mutaciones inducidas.

a. Mutaciones espontáneas

Se originan ocasionalmente en cualquier tipo de célula sin que se conozca, de manera específica, el agente causal de la misma. La probabilidad de ocurrencia de este tipo de mutación (tasa de mutación) es del orden de 10−7 en células haploides y 10−14 en células diploides.

Las principales causas de las mutaciones que se producen de forma natural o normal en las poblaciones son tres:

- Errores durante la replicación del DNA

- Lesiones o daños fortuitos en el DNA

- Movilización en el genoma de elementos genéticos transponibles

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b. Mutaciones inducidas Son producto de la acción de un agente mutagénico, de naturaleza física, química o biológica.

Mutágenos químicos: - Análogos de bases del DNA (2-aminopurina). - Agentes alquilantes (nitrosoguanidina). - Agentes intercalantes (acridinas). Mutágenos biológicos: Se puede considerar la presencia de transposones y de virus (o bacteriófagos) capaces de integrarse en el genoma. Mutágenos físicos: - Radiaciones ionizantes (rayos X, rayos cósmicos y rayos gamma): Estas radiaciones originan radicales libres que reaccionan con el DNA, inactivándolo. - Radiaciones no ionizantes (radiación ultravioleta): Provocan la formación de dímeros de pirimidina en el DNA (unión covalente de dos bases pirimídicas adyacentes), que tiene como consecuencia la aparición de mutaciones

Para aislar mutantes espontáneos en bacterias se debe definir el tipo de mutante que se desea aislar y, en lo posible, la tasa de mutación específica. Lo anterior, permitirá definir el tipo de medio de cultivo y las condiciones físico-químicas que permitirán su crecimiento. En esta actividad se utilizará un medio de cultivo que contiene el antibiótico Rifampicina, que permitirá aislar mutantes espontáneos de Escherichia coli rifampicina-resistente (RifR). Este antibiótico interfiere con el proceso de transcripción génica, al unirse a la subunidad β de la enzima RNA polimerasa. OBJETIVO Seleccionar mutantes espontáneas de Escherichia coli resistentes a Rifampicina. Materiales a. Material biológico: Cultivo de Escherichia coli DH5α. b. Antibióticos: - Rifampicina: Solución stock 1,5% en metanol puro; solución de trabajo: 75 µg/ml de medio c. Medios de cultivo: Agar y caldo LB (Luria-Bertani), LB suplementado con ácido nalidíxico 15 µg/ml (LBNal)

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Condiciones de incubación: Activación de cepa: 37°C / con agitación constante/ 14-16 hrs.

ACTIVIDADES

DÍA 0:

- Activar cultivo de E. coli DH5α: Hacer siembra en pentágono de la cepa en agar LBNal. Incubar a 37°C/24 hrs.

DÍA 1:

- Cultivo en masa: Inocular una colonia de la cepa en matraz conteniendo 20 ml de caldo LBNal. Incubar a 37°C/14-16 hrs, con agitación constante.

NOTA: Las actividades de los Días 0 y 1 serán realizadas por el equipo académico y usted recibirá un matraz conteniendo el cultivo en masa de la bacteria para su trabajo experimental, el Día 2.

DÍA 2:

- Siembra en césped: Colocar 250 µl del cultivo en masa, en la superficie de una placa conteniendo Agar LBNal-Rif.. Sembrar en césped con ayuda de un rastrillo de vidrio. Dejar sobre el mesón algunos minutos (absorber líquido). Invertir e incubar a 37°C/24 hrs.

DÍA 3:

- Seleccionar colonias que crecen en el medio conteniendo agar LBNal-Rif. Incubar a 37°C. En el caso de haber sembrado una colonia resistente a rifampicina, se observará crecimiento al cabo de unas 8 hrs.

Resultados obtenidos

21

Conclusiones.

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 5 Evidenciar la transferencia horizontal de genes mediante ensayos de transformación

de cepas resistentes a antimicrobianos

INTRODUCCIÓN El material genético bacteriano puede ser transferido desde una bacteria a otra por 3 mecanismos: conjugación, transducción o transformación. Así, la transferencia horizontal de genes contribuye a la adaptación y diversificación de organismos, teniendo un impacto significativo en la plasticidad y evolución genómica, la diseminación de factores de virulencia, la formación de nuevas vías catabólicas y la resistencia a antibióticos. Los genes de resistencia a antibióticos se han encontrado asociados a algunos elementos genéticos como plasmidios, transposones e integrones, los cuales permiten la diseminación del fenotipo de resistencia. Estos elementos otorgan una gran variabilidad a las bacterias, permitiéndoles sobrevivir en un medio donde el uso intensivo de antibióticos es habitual. En este trabajo práctico se estudiará la movilidad de genes de resistencia a antibióticos por transformación. Éste es un mecanismo de transferencia de información genética basado en la captura de plasmidios desde el ambiente por una cepa receptora OBJETIVO Determinar la capacidad de algunas bacterias de transferir genes de resistencia a antibióticos a otras que son sensibles a ese marcador.

ACTIVIDADES

ENSAYO DE TRANSFORMACIÓN

DÍA 2 Preparación de células químicamente competentes para uso en transformación por choque térmico (adaptación del método de Inoue: Inoue et al., 1990 Gene 96:23)

1. A partir de un inóculo previo, cultivar en matraz células de Escherichia coli en medio LB a 37º C con agitación (180-250 rpm), hasta una OD600 ~ 0,3 (u óptimamente, cultivar a 23 º C hasta una OD600 de 0,4 – 0,6). El volumen del inóculo no debe superar el 1% del volumen total del cultivo.

2. Al alcanzar la OD deseada, dejar el matraz en hielo por al menos 10 min. Colectar las células por centrifugación (a 4ºC, por 10 min a 3000 RPM). El freno de la centrífuga debe ser lo más bajo (o sea, la disminución de velocidad debe ser la más lenta), para disminuir la posibilidad de estrés en las células.

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3. Eliminar el sobrenadante y lavar el pellet, resuspendiéndolo suavemente en 40 ml de solución de Inoue (preenfriada) por cada 40 ml de cultivo. Después de dejar 10 minutos en hielo, se centrifuga igual que en el paso anterior.

4. Eliminar el sobrenadante y resuspender por cada pellet de 40 ml de cultivo en 4 ml de solución de Inoue.

5. Mantener los tubos por 30 minutos (mínimo) en hielo.

6. Agregar 70 µl de DMSO/ ml de suspensión de células y mezclar suavemente. Dejar en hielo por al menos 10 min.

7. Repartir en alícuotas de 200 a 300 µl en tupos Eppendorf estériles, previamente enfriados (esto se puede hacer encerrando el recipiente de tubos cerrado en el freezer por al menos 2 horas).

8. Opcional: utilizar un baño de etanol + hielo seco para congelar rápidamente las alícuotas de cada tubo. Si no se tiene hielo seco, una papilla de agua y etanol guardadas en el refrigerador a -80º C puede servir bien.

9. Guardar las alícuotas a -80º C. En almacenamiento pueden permanecer por meses sin perder significativamente la competencia.

NOTAS

Si las células se descongelan y vuelven a congelarse a -80ºC, la eficiencia de transformación disminuye notablemente.

Asegúrese que los materiales que se usarán para preparar las células estén libres de detergente.

Todos los pasos deben hacerse en estricta esterilidad.

Es importante que el tratamiento de las células sea suave (por ejemplo, evitar el pipeteo al resuspenderlas en la solución de Inoue)

Solución de Inoue: 10mM HEPES; 75mM CaCl2; 250mM KCl. Se ajusta pH hasta 6,7 con KOH o HCl y luego agregar una solución MnCl2 (lo suficiente hasta una concentración 55mM) con jeringa y filtro de 0,45 µm, y ajustar con agua (lo más pura posible) hasta el volumen final planificado. La solución se guarda a 4º C.

Para transformar

1. Se descongela una alícuota de 100-200 µl de células en hielo. 2. Se agrega un volumen máximo de 5 µl de DNA, se mezcla suavemente y se deja 30 min

en hielo. 3. Luego, se incuba 45 segundos sin agitación en baño de agua a 42º C, para iniciar el

choque térmico. 4. Se transfiere el tubo a un recipiente con hielo por 2 minutos sin agitación.

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5. Luego, se agrega 900 µl de caldo SOC (LB) y se deja 1 hora a 37ºC con agitación y aeración, para permitir que las bacterias se recuperen del choque.

6. Se siembra 100 µl en placa de LB más el antibiótico de selección, previamente incubada por 1 hora a 37º C. Del remanente del cultivo, se toman 500 µl, se centrifugan, se elimina el sobrenadante y con el líquido restante se resuspenden las bacterias y se siembran en otra placa de LB+ antibiótico. Si se usa ampicilina, el tiempo de incubación de las placas no debe superar las 18 horas, a fin de evitar el crecimiento de colonias satélite.

DÍA 3

1. Analizar los resultados. Estimar la eficiencia de la transformación. 2. Tomar colonias aisladas de la cepa previa a la transformación y cepas

transformantes para detección del plasmidio transformante, mediante lisis por calor y electroforesis en gel de agarosa.

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 6 Observar la comunicación bacteria-bacteria mediante incubación del sobrenadante de una

cepa productora de autoinductor con una cepa reportera

INTRODUCCIÓN Comunicación bacteria-bacteria mediante quorum sensing Los microorganismos son capaces de comunicarse entre sí a través de una variedad de moléculas químicas. Esta comunicación intercelular les permite coordinar la expresión de genes y actuar como una comunidad, y puede darse entre bacterias de una misma especie o de especies y géneros diferentes.

Una de las formas en que las bacterias se comunican entre ellas es a través del fenómeno conocido como quorum sensing, que involucra la producción y secreción de una molécula señal conocida como autoinductor por parte de algunos microorganismos y la detección de esta molécula por parte de otros. El quorum sensing puede regular un amplio rango de actividades bacterianas, entre las que se cuentan la virulencia, competencia, conjugación, producción de antibióticos, movilidad, esporulación y formación de biopelículas. A la fecha se han descrito 3 sistemas de quorum sensing, mediados por diferentes tipos de moléculas autoinductoras. En este trabajo práctico analizaremos la comunicación mediada por autoinductor-2.

Para este ensayo utilizaremos una cepa de la bacteria Vibrio harveyi BB170, que es capaz de producir luz cuando se encuentra en presencia de autoinductor-2. Esta bacteria, que llamaremos de ahora en adelante cepa reportera, será crecida durante 16 hrs a 30°C en medio de cultivo AB (toda la noche). Al otro día, las células serán lavadas centrifugando a 6000 rpm y resuspendiendo en medio AB fresco, hasta obtener una DO600=0,5.

Por otra parte, otro microorganismo, en este caso Lactobacillus casei, será crecido en un cultivo independiente, a 37°C por 16 hrs en medio de cultivo MRS. Este microorganismo se caracteriza por producir autoinductor-2 para comunicarse con sus células vecinas.

OBJETIVO

Visualizar el fenómeno de comunicación celular mediada por quorum sensing entre dos bacterias de diferentes especies.

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ACTIVIDADES

DÍA 3 1. Tomar 5 ml del cultivo de la cepa reportera y colocar en un tubo cónico de 15 ml. Repetir

el procedimiento una vez más. 2. Agregar 1 ml del medio de cultivo MRS, donde creció la bacteria Lactobacillus casei a uno

de los tubos cónicos con cepa reportera. Este medio debe estar libre de bacterias por ello se debe filtrar, usando filtros de 0,22µm de diámetro de poro. Al otro tubo, agregar 1 ml de medio de cultivo MRS sin la bacteria Lactobacillus casei.

3. Incubar ambas mezclas (de 6 ml en total cada una) por aproximadamente 4 horas a 30°C. Éste es el tiempo requerido para que la cepa reportera pueda detectar la molécula de autoinductor-2 y desencadene las señales necesarias para producir luz.

4. Luego de transcurridas las 4 horas de incubación, observar ambos tubos en oscuridad.

Nota: se les entregará el cultivo de la cepa reportera y el sobrenadante de la cepa productora de autoinductor ya filtrado

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 7 Evidenciar la formación de biopelículas en perlas de azufre por bacterias extremófilas

biomineras mediante la tinción con cristal violeta

OBJETIVO El objetivo de este trabajo práctico es evidenciar la capacidad que tienen las células bacterianas de adherirse a sustrato sólido formando así una biopelícula (“Biofilm”). Se utilizará como modelo bacteriano especies bacterianas pertenecientes al género Acidithiobacillus las cuales son capaces de formar biopelículas sobre minerales.

Este modelo bacteriano concita un gran interés biotecnológico en el mundo y en Chile en particular, ya que estas especies son actores fundamentales de la biolixiviación, proceso industrial minero utilizado para la extracción de cobre y de otros valores metálicos de interés comerciales como el oro y el uranio entre otros.

En el marco de este trabajo práctico estudiaremos la cinética de formación de biopelículas de Acidithiobacillus caldus, At. ferrooxidans y At. thiooxidans.

Materiales

a- Cultivos bacterianos * Matraces de cultivo de 500 ml (1 por cultivo + 1 control sin bacterias). * Mechero para generar zona de esterilidad microbiana en el mesón de trabajo. * Botellones de 500 ml para preparar medio (400 ml por botellón). * Olla de presión para esterilizar solución “stock” de medio. * Incubador orbital con agitación 30ºC o Baño María con agitación y temperatura

controladas. * Medio (sales minerales1; azufre elemental; agua destilada; pH 3,5). * Balón de vidrio con “hoyito”. * Calentador eléctrico para solubilizar azufre elemental en polvo. * Agitador magnético. * Ácido Sulfúrico (H2SO4). * Phmetro. * Unidad de Filtración (jeringa + filtro; sistema con vacío y filtro)

b- Pre-cultivos bacterianos Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus thioooxidans y Acidithiobacillus caldus.

c- Tinción2 * Cristal Violeta al 0,05 %. * Agua ácida pH 2 (acidificada con H2SO4).

1 Ver composición del medio en hoja adjunta. 2 Espejo R.T., Romero P. (1987). Growth of Thiobacillus ferrooxidans on Elemental Sulfur. Applied and

Environmental Microbiology. p. 1907-1912.

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* Agua destilada. * Ácido Sulfúrico (H2SO4). * Recipiente para teñir perlas (Placas de Petri 5 ml)

ACTIVIDADES

1. Inocular el medio fresco al 10 % (10 ml de precultivo + 90 ml de medio fresco). Para el control utilizar 100 ml de medio fresco.

2. Incubar 7, 4 o 2 días a 30ºC (At. ferrooxidans; At. thiooxidans) o 42ºC (At. caldus).

3. Eliminar sobrenadante (si se quiere usar sobrenadante para re-inocular realizar este paso en condiciones estériles).

4. Recolectar perlas de azufre con precauciones (evitar golpes, roces y contaminaciones cruzadas) y lavar 2 veces con agua ácida pH 2.

5. Lavar una vez con agua destilada para eliminar exceso de ácido.

6. Incubar con 10-15 ml de una solución al 0,05 % de Cristal Violeta durante 15 min.

7. Lavar varias veces con agua destilada para eliminar el exceso de Cristal Violeta.

8. Dejar secar.

9. Observar presencia de tinción violeta comparando las perlas de azufre que provienen de los cultivos con bacterias y aquéllas que provienen del medio abiótico (Figura 3).

Figura 3. Perlas de azufre incubadas con bacterias capaces de utilizar el sustrato y adherirse a él. La tinción con cristal violeta evidencia la adherencia bacteriana.

Al inicio de la actividad se proyectará una película explicativa sobre formación de perlas de azufre y preparación de los cultivos. 1 Se entregarán cultivos inoculados en distintos momentos [día 1; el día 3 (en duplicado); el día 5].

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Medio de cultivo en azufre para Acidithiobacillus

Na2SO4 x 10 H2O 0,150 g/l 0,5 mM

(NH4)2SO4 0,450 g/l 3,4 mM

KCl 0,050 g/l 0,7 mM

MgSO4 x 7 H2O 0,500 g/l 2,0 mM

KH2PO4 0,050 g/l 0,4 mM

Ca(NO3)2 x 4 H2O 0,014 g/l 59,3 µM

FeSO4 x 7 H2O 0,028 g/l 0,1 mM

ZnSO4 x 7 H2O 0,010 g/l 34,8 µM

CuSO4 x 5 H2O 0,001 g/l 4,0 µM

MnSO4 x 4 H2O 0,001 g/l 4,5 µM

CoCl2 x 6 H2O 0,85 mg/l 3,6 µM

KCr(SO4)2 x 12 H2O 0,75 mg/l 1,5 µM

H3BO3 0,60 mg/l 9,7 µM

Na2MoO4 x 2 H2O 0,50 mg/l 2,1 µM

NiCl2 x 6 H2O 0,90 mg/l 3,8 µM

Na2SeO3 x 5 H2O 0,71 mg/l 2,7 µM

Na2WO4 x 2 H2O 0,10 mg/l 0,3 µM

KBr 0,10 mg/l 0,8 µM

KI 0,10 mg/l 0,6 µM

NaVO3 0,10 mg/l 0,8 µM

S (perlas) 50 g/l 5 % p/V

1- Combine los ingredientes con excepción del sulfato ferroso y el azufre en agua

destilada, ajuste el pH a 3,5 con H2SO4 y esterilice por autoclave (121 °C, 15-20 min).

2- Esterilice las perlas de azufre separadamente adicionándolas al matraz de cultivo e hirviéndolas en medio de cultivo por 10-15 minutos. Alternativamente, las perlas pueden ser esterilizadas en el matraz de cultivo con el medio sin sulfato ferroso por autoclave a 110 °C por 30 min.

3- Una vez que el medio está frío añadir el sulfato ferroso a partir de una solución stock 1 M ajustada a pH 1,8 con H2SO4 y esterilizada por filtración.

4- Referencia. Johnson, D. B. (1995) Selective solid media for isolating and enumerating acidophilic bacteria. Journal of Microbiological Methods 23:205-218.

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Producción de las Perlas de Azufre elemental (sustrato energético sólido)

Poner el azufre dentro de un balón de aforo que posee un agujero en el fondo.

1. Derretir el azufre dentro del balón utilizando una placa calefactora que pueda llegar a unos 180-200 °C (precaución: si se calienta demasiado, el azufre puede inflamarse). Para mejorar la conducción de calor, utilizar papel aluminio para la creación de un soporte para el balón.

2. En un vaso precipitado de 2 litros, colocar unos 800 ml de agua destilada y un agitador magnético. Colocar sobre una placa agitadora.

3. Una vez que el azufre está completamente derretido, verter lentamente a través del agujero inferior en el agua agitada. Para favorecer la formación de perlas pequeñas, el balón debe estar a unos 10-15 cm sobre el vaso con agua.

4. Recuperar las perlas y dejar secar antes de utilizarlas (50 g /l).

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 8 Evidenciar la formación de biopelículas sobre la dentadura

mediante el uso del colorante caristop dualtone

Según describe la biblioteca nacional de medicina de los Estados Unidos (MedLine Plus) las caries dentales pueden afectar a personas de todas las edades. Una de las causas de la aparición de éstas es por el efecto de bacterias que colonizan nuestra boca. Estas bacterias por su metabolismo, convierten los alimentos, especialmente los azúcares y almidones, en ácidos. Las bacterias, el ácido, los pedazos de comida y la saliva se combinan en la boca para formar una sustancia pegajosa llamada placa. La placa se pega a los dientes, justo encima de la línea de la encía en todos los dientes y en los bordes de las obturaciones. La placa que no se elimina de los dientes se convierte en una sustancia llamada sarro o cálculo. La placa y el sarro irritan las encías, produciendo gingivitis y periodontitis. Esta placa bacteriana comienza a acumularse en los dientes al cabo de 20 minutos después de comer. Si ésta no se quita, comenzará a presentar caries que corresponden a perforaciones en los dientes. Las caries se producen por desmineralización de la dentadura producto de los ácidos producidos por las bacterias presentes en la placa dañando el esmalte que cubre los dientes y crean orificios en los dientes llamados caries. Las caries generalmente no duelen, a menos que se comprometan y afecten los nervios o causen una fractura del diente. La caries dental que no se trata también destruye el interior del diente (pulpa), lo cual requiere un tratamiento más extenso o, en el peor de los casos, la extracción del diente.

Los carbohidratos (azúcares y almidones) aumentan el riesgo de caries dentales, los refrigerios azucarados aumentan el tiempo en que los ácidos están en contacto con la superficie del diente, por ello un buen aseo dental disminuirá la posibilidad de obtención de caries. OBJETIVO El objetivo de este trabajo práctico es evidenciar la capacidad que tienen las células bacterianas de nuestra dentadura, en adherirse a sustrato sólido como es el diente formando así una biopelícula (“Biofilm”) o placa bacteriana, siendo un elemento importante para la generación de caries en nuestra dentadura.

Actividad.

La actividad consiste en aplicar en la boca una pastilla del colorante caristop dual tone (también existe un producto que es líquido), juagar la boca y luego observar la presencia de la placa como una superficie de color rosado o azul, dependiendo de los colorantes utilizados en el producto. Posteriormente se procede a lavar con su cepillo de dientes para remover el colorante junto con la placa bacteriana y se enjuaga. Se ser necesario se repite el procedimiento de cepillado.

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 9 Observar la presencia o ausencia de genes de virulencia mediante PCR

de genes específicos de E. coli diarreogénicos INTRODUCCIÓN A LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR (https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr)

Una técnica utilizada para amplificar, o hacer muchas copias de, una región de DNA blanco en específico.

Puntos más importantes:

La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica in vitro de Biología Molecular utilizada para generar en un tubo de ensayo muchas copias de una determinada región de DNA de interés.

La PCR se realiza utilizando una DNA polimerasa termoestable, la Taq DNA polimerasa, y requiere de partidores de DNA diseñados específicamente para la región de DNA de interés.

En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de temperatura que permiten la producción de muchas copias de la región blanco.

La PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la práctica. Se utiliza de forma rutinaria en la clonación de DNA, el diagnóstico médico y el análisis forense de DNA.

¿Qué es la PCR?

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común utilizada para hacer muchas copias (¡millones o miles de millones!) de una región particular de DNA. Esta región de DNA puede codificar a una proteína le interese al investigador o puede ser una región del genoma de interés. Por ejemplo, podría ser un gen cuya función quiere entender un investigador o un marcador genético usado por científicos forenses para relacionar el DNA de la escena del crimen con los sospechosos. Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente DNA de la región blanco para que pueda analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo, el DNA amplificado por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis en gel o clonar en un plásmido para otros experimentos. La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina, como la investigación en biología molecular, el diagnóstico médico e incluso algunas ramas de la ecología.

La Taq polimerasa

Al igual que la replicación de DNA en un organismo, la PCR requiere de una enzima DNA polimerasa que produzca nuevas cadenas de DNA mediante el uso de las cadenas existentes como molde. La DNA polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq DNA polimerasa, sintetizada por la bacteria tolerante al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus). T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su DNA polimerasa es muy termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los 70°C (temperatura a la que la DNA polimerasa de ser humano o de E. coli no funcionaría). La Taq polimerasa es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad térmica. Como veremos, la PCR utiliza altas temperaturas repetidamente para desnaturalizar el molde de DNA o separar sus cadenas.

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Partidores para PCR

Al igual que otras DNA polimerasas, la Taq polimerasa solo puede hacer DNA si hay un partidor, una secuencia corta de unos 20-30 nucleótidos que proporciona un punto de partida para la síntesis de DNA. En una reacción de PCR, la región de DNA que será copiada, o amplificada, se determina por los partidores que el(la) investigador(a) elija. Por lo tanto estos partidores deben ser complementarios a la zona a amplificar y por ello se deben utilizar dos partidores para una determinada región, y dado que la síntesis de DNA es siempre 5' a 3', los partidores deben permitir la polimerización dejando un extremo 3’ OH disponible para que la Taq DNA polimerasa pueda sintetizar DNA en esa dirección (5' a 3').

Los pasos de la PCR

Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq polimerasa, partidores, DNA molde y nucleótidos (los bloques básicos del DNA). Los ingredientes se colocan en un tubo, junto a la solución amortiguadora con algunos cofactores que necesite la enzima, y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento que permiten la síntesis del DNA. Los pasos básicos son:

1. Desnaturalización (96°C): la reacción se calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las cadenas de DNA. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso.

2. Alineamiento (55 - 65°C): la reacción se enfría para que los partidores puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de DNA de cadena sencilla.

3. Extensión (72°C): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los partidores y sintetice así nuevas cadenas de DNA.

Este ciclo se repite 25 - 35 veces en una reacción de PCR típica, que generalmente tarda 2 - 4 horas, según la longitud de la región de DNA que se copia. Si la reacción es eficiente, puede producir miles de millones de copias a partir de una o unas cuantas moléculas de la región blanco. Como se observa en la figura se realiza amplificación del gen blanco, dado que no solo el DNA inicial se utiliza como molde sino que el producto de cada ciclo de amplificación. El siguiente es un link es una explicación de la técnica: http://www.dnatube.com/video/1397/The-polymerase-chain-reaction-PCR Figura Amplificación de una región de interés mediante PCR. La región de interés está flanqueada por los partidores rojo y verde.

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INTRODUCCIÓN Considerando los postulados moleculares de Koch, se han diseñado estrategias que permiten la

identificación del agente causal de la enfermedad utilizando técnicas moleculares. Ello se basa en que

los agentes patógenos deben poseer uno o más genes específicos y propios del agente, que están ausentes en los agentes no patógenos. En esta actividad se pretende realizar la detección de genes de virulencia presente en diferentes bacterias de la especie Escherichia coli.

Escherichia coli diarreogénicos

La bacteria Escherichia coli fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escheric, de quien recibió su nombre. Hoy sabemos que esta bacteria forma parte de nuestra microbiota normal intestinal y también está presente en otros hospederos. Como parte de la microbiota normal, su presencia es beneficiosa para el hombre, sin embargo, algunas cepas pueden producir infecciones debido a la adquisición de genes de virulencia, permitiendo que la bacteria se convierta en un patógeno. Así en el ser humano pueden provocar infecciones a nivel del sistema urinario, sepsis/meningitis y enfermedades gastrointestinales. La diarrea aguda en el ser humano es una enfermedad intestinal infecciosa y autolimitada, que consiste en más de tres evacuaciones líquidas por día (24 horas). Dentro de los agentes causales de esta enfermedad se encuentran las E. coli diarreogénicas, un conjunto de bacterias que se pueden clasificar en 6 grupos o patotipos:

1) Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH)

2) Escherichia coli enteropatogénica (ECEP)

3) Escherichia coli enterotoxigénica (ECET)

4) Escherichia coli enteroagregativa (ECEAgg)

5) Escherichia coli difusamente adherente (ECDA)

6) Escherichia coli enteroinvasiva (ECEI)

OBJETIVO

Identificar diferentes E. coli diarreogénicas mediante amplificación de los genes de virulencia propios de cada patotipo.

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ACTIVIDADES

Extracción de DNA: (este paso ya estará listo, se le entregará DNA)

1. Homogenizar 5 colonias medianas lactosa positivo en 200 µl de Triton X100 al 1% en un tubo eppendorf de 0,5 ml.

2. Hervir las bacterias por 10 min a 100 °C, someter a vortex.

3. Hervir nuevamente 10 min a 100 °C.

4. Centrifugar a 8000 rpm por 5 min

5. Tomar el sobrenadante y guardar (el DNA que se liberó por la lisis bacteriana está en el sobrenadante).

6. Realizar la reacción de PCR inmediatamente o congelar -20 °C (si se congela, repetir el paso 4).

Amplificación de genes de virulencia presentes en cepas de E. coli diarreogénicas:

1. Preparar una solución que contenga el DNA templado, los partidores específicos, y la enzima DNA polimerasa termorresistente, de acuerdo al siguiente protocolo

Solución 1X (µl) 10X

LP30 (stx1) 0,2 2

LP31 (stx1) 0,2 2

LP43 (stx2) 0,2 2

LP44 (stx2) 0,2 2

eaeF 0,2 2

eaeR 0,2 2

stiF 0,2 2

stiR 0,2 2

LTF 0,2 2

LTRE 0,2 2

Aaf1F 0,2 2

Aaf1R 0,2 2

Aaf2F 0,2 2

Aaf2R 0,2 2

virFF 0,2 2

virFR 0,2 2

ipaHF 0,2 2

ipaHR 0,2 2

daaAF 0,2 2

daaAR 0,2 2

dNTPs 0,5 5

H2O 13,875 138,75

Buffer Taq 5x 5 50

Taq DNA pol 0,125 1,25

DNA* 2

Vol final 25 250

* DNA que se debe agregar a cada tubo de PCR

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2. Una vez preparados los tubos con 25 µl de la reacción, incubar los tubos en un termociclador, de acuerdo al siguiente protocolo de Multiplex PCR utilizando el programa específico:

1.- 94°C 1min 30 seg

2.- 58°C 1 min 15 seg

3.- 72°C 1 min

4.- Repetir 35 veces los pasos 1 al 3

5.- 72°C 7 min

6.- 4°C infinito

3. Para visualizar la amplificación se debe realizar un gel a agarosa al 2 % cargando 10 µl de

cada reacción en el pocillo del amplificado. Para estimar el tamaño de los fragmentos amplificados, se incluye en el gel un marcador de tamaño molecular. La electroforesis se corre a 70 volts por 60 min. Se aplicará el colorante Safer view para visualizar la presencia del DNA.

Tamaños esperados de los amplificados:

Cepa de E. coli

Gen amplificado

Tamaño esperado (pb)

Secuencia partidores

5’----3’ dirección

ECEH o STEC

stx1 348 CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG Directo (F) CACCAGACAATGTAACCGCTG Reverso (R)

stx2 584 ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG Directo (F) GCGTCATCGTATACACAGGAGC Reverso (R)

ECEP eae 482 TCAATGCAGTTCCGTTATCAGTT Directo (F) GTAAAGTCCGTTACCCCAACCTG Reverso (R)

ECET lt 218 GCACACGGAGCTCCTCAGTC Directo (F) TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT Reverso (R)

stII 129 AAAGGAGAGCTTCGTCACATTTT Directo (F) AATGTCCGTCTTGCGTTAGGAC Reverso (R)

ECEAgg aafII 378 CACAGGCAACTGAAATAAGTCTGG Directo (F) ATTCCCATGATGTCAAGCACTTC Reverso (R)

ECDA daaA(E) 542 GAACGTTGGTTAATGTGGGGTAA Directo (F) TATTCACCGGTCGGTTATCAGT Reverso (R)

ECEI virF 618 AGCTCAGGCAATGAAACTTTGAC Directo (F) TGGGCTTGATATTCCGATAAGTC Reverso (R)

ipaH 933 CTCGGCACGTTTTAATAGTCTGG Directo (F) GTGGAGAGCTGAAGTTTCTCTGC Reverso (R)

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Soluciones: Triton X100 1%: 1 ml de Tritón en 100 ml de solvente (agua destilada o solución amortiguadora TE pH 8.0 estéril), almacenar a temperatura ambiente. dNTPs: para 200 µl de volumen final, tomar 20 µl de cada uno y agregar 120 µl de agua estéril para PCR. Partidores: desde los stock preparados 0,5 mM, diluirlos a una concentración de 5 µM (2 µl de partidor en 200 µl de agua PCR), excepto para partidores ST (R y F) que deben diluirse a 10 µM (4µl de partidor en 200 µl de agua PCR). TAE 1X: 40 ml de TAE 50X en 2000 ml de agua destilada Marcador de tamaño molecular: 10 µl desde stock (gene ruler fermentas 100pb DNA ladder), 10 µl de solución amortiguadora de carga y 40 µl de agua.

Figura 4. Movilidad electroforética de los fragmentos de DNA amplificados. L: DNA Ladder 1Kb, 1: ECEH (stx2, eae, stx1), 2: ECEP, 3: ECET, 4:ECEAgg, 5: ECDA, 6: ECEI

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 10 Comparar in silico genomas de especies bacterianas

beneficiosas y patógenas

En los últimos años se han desarrollado tecnologías que han permitido obtener de forma rápida la secuencia de todo el contenido genético (genoma) de organismos vivientes. Por lo tanto, la cantidad de información disponible, en términos de números de genomas, ha crecido exponencialmente, abriendo múltiples posibilidades en el estudio de las características biológicas de estos organismos. A su vez, este desarrollo ha generado el desafío de implementar plataformas y metodologías que permitan analizar de forma adecuada esta gran cantidad de información. En este escenario, el uso de la informática cobra una vital importancia.

La aplicación de informática al estudio y resolución de problemáticas biológicas es lo que se conoce como bioinformática. En términos más específicos, la bioinformática se puede definir como la investigación, desarrollo o aplicación de herramientas y estrategias computacionales para expandir el uso de datos biológicos, médicos, de comportamiento, o de salud pública. Incluye las herramientas y estrategias necesarias para adquirir, almacenar, organizar, archivar, analizar o visualizar tales datos.

El estudio de los microorganismos no es la excepción y la aplicación de bioinformática ha permitido dilucidar información valiosa acerca de su metabolismo, ciclos de vida o determinantes de patogenicidad, por mencionar solo algunos ejemplos. Incluso, actualmente se aplican metodologías de bioinformática para conocer la composición y estructura de comunidades microbianas complejas, como la microbiota humana.

Muchas de las herramientas bioinformáticas actuales permiten hacer predicciones acerca del comportamiento biológico de los microorganismos, en base su contenido genético, las que luego pueden ser comprobadas experimentalmente en el laboratorio o en pruebas de campo. En este escenario, una de las ramas de la bioinformática que ha sido más utilizada en el último tiempo es la genómica comparativa, que, como su nombre lo indica, permite comparar el contenido genético completo de distintos organismos.

En este trabajo práctico demostrativo se realizará un análisis bioinformático, en base a genómica comparativa, de predicción de proteínas que puedan ser utilizadas en el desarrollo de vacunas. Específicamente, se utilizará la herramienta Vaxign, que está disponible de manera gratuita en la web (http://www.violinet.org/vaxign/). Vaxign permite analizar comparativamente genomas microbianos para la identificación de proteínas que comparten similitud de secuencia entre distintos organismos (ortólogos). En base a una serie de predicciones de propiedades biológicas de estas proteínas, el software permite seleccionar candidatos a ser incluidos en una vacuna. Este tipo de estrategia se conoce como “Vacunología reversa” y ha permitido el desarrollo de la vacuna contra el meningococo (Neisseria meningitidis) del serogrupo B, que hasta hace algunos años no estaba cubierto por las vacunas disponibles.

En ANEXOS se muestra en etapas, paso a paso, el procedimiento que se seguirá en la demostración práctica.

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ANEXOS

A. MORFOLOGIA BACTERIANA Las células bacterianas presentan una morfología típica que facilita su identificación. Se reconocen al microscopio óptico tres formas básicas: cocos, bacilos y espirilos. Además, algunas bacterias poseen una agrupación característica. 1. Cocos: Presentan forma esférica o aproximadamente esféricas (arriñonadas, lanceoladas,

levemente ovoides) y según su agrupación se pueden clasificar como:

Agrupación Característica Ejemplo

Diplococos

Se dividen solamente en un plano y permanecen unidos formando pares de células

Neisseria gonorrhoeae

Cadenas

Se dividen en planos paralelos y quedan unidos formando cadenas cortas o largas

Streptococcus pyogenes

Racimos

Se dividen en tres planos irregulares formando racimos

Staphylococcus aureus

Tétradas

Se dividen formando grupos de cuatro células (un cuadrado)

Cocos del género Gaffkys comunes en el suelo

Paquetes

Se dividen en tres planos perpendiculares generando agrupamientos cuboidales (sarcinas)

Sarcina Microrganismos del suelo, bacterias metanogénicas

2. Bacilos: Presentan una forma alargada. La mayoría de los bacilos no

forma agrupaciones y se presentan aislados.

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Sin embargo, existen excepciones:

Agrupación Ejemplo

Letras Chinas

Corynebacterium spp.

Empalizada

Corynebacterium spp.

Cadenas

Bacillus cereus

3. Espirilos: Bacterias que presentan una forma alargada en forma de espiral o tirabuzón. Por ejemplo: Treponema pallidum Existen bacilos que pueden presentar una morfología específica, como por ejemplo:

Cocobacilos : Acinetobacter baumannii Bacilos fusiformes : Fusobacterium spp. Bacilos filamentosos : Actinomyces spp. Bacilos curvos : Vibrio cholerae Bacilos helicoidales : Campylobacter, Helicobacter Rectangulares : Bacillus anthracis

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B. TÉCNICAS DE VISUALIZACIÓN MICROSCÓPICA DE BACTERIAS Y HONGOS . La observación microscópica permite conocer algunas características de las bacterias tales como forma, agrupación, presencia o ausencia de cápsula, flagelos y movilidad entre otras. El examen microscópico de las bacterias se puede hacer de dos maneras:

1) Examen al fresco Se emplea para el estudio de algunas características de los microorganismos, movilidad, aglutinación, yemación, etc. Es un examen de gran utilidad en la observación de muestra de aguas obtenidas del ambiente, o sedimentos urinarios y secreciones vaginales en muestras clínicas para ver la presencia de leucocitos, glóbulos de pus, bacterias, células epiteliales, entre otros. Tiene la limitante que por el pequeño tamaño de los microorganismos y por su índice de refracción similar al del medio, se dificulta la observación de su forma. Otra utilidad de la observación al fresco es que permite observar el movimiento celular. En este sentido, es posible observar tres tipos de movimientos: Movimiento Browniano: No existe desplazamiento de la célula, sino que ésta vibra en el sitio en que se encuentra girando sobre sí misma. Movimiento de Corrientes: Existe un desplazamiento uniforme de todas las bacterias en un solo sentido, producto de las corrientes de líquido generadas en la preparación. Movimiento de Traslación: Desplazamiento al azar de las células bacterianas dentro de la preparación. Si se observa este movimiento se puede decir que se trata de un microorganismo móvil. 2) Examen de frotis fijado y tinciones Con el objeto de obtener un mayor contraste entre las células bacterianas y su entorno, que facilite su visualización al microscopio, se ha hecho necesario el empleo de tinciones. Para ello, se fija una suspensión de bacterias al vidrio. El frotis que se obtiene es la base para la realización de cualquier proceso de tinción, permitiendo el estudio en detalle de la morfología de las bacterias y su agrupación. El frotis se puede preparar a partir de una muestra clínica directa, o a partir de un cultivo bacteriano puro.

Los métodos de tinción más empleados en Bacteriología son:

Tinción Simple: se denomina simple ya que no establece diferencias tintoriales entre los grupos bacterianos observados y sólo permite definir forma y agrupación. Esta tinción permite observar muy bien la presencia de microorganismos intracelulares como Neisseria.

Coloración doble por el método de Gram: Esta tinción diferencial fue descrita y desarrollada por el bacteriólogo danés Christian Gram en el año 1884. Permite agrupar las bacterias en bacterias Gram positivo y Gram negativo, de acuerdo a su diferente afinidad por los colorantes usados. Este proceso significa someter secuencialmente un frotis fijado, a las siguientes etapas (Figura 5).

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1) Tinción con cristal violeta

2) Fijación de la tinción con lugol (formación de un complejo)

3) Descoloración con alcohol-acetona (etapa clave del proceso que evidencia la presencia o ausencia de membrana externa) y

4) Tinción con el colorante de contraste (safranina o fucsina).

La tinción de Gram es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificación bacteriana. Permite clasificar las bacterias en dos grupos: Bacterias Gram positivo: se observan de color azul violeta oscuro y

Bacterias Gram negativo: se observan de color rosado (Figura 4, Tabla 1).

Figura 5. Diagrama de flujo mostrando las etapas de la tinción de Gram.

Fundamento: El cristal violeta es un colorante que penetra la pared celular de bacterias Gram positivo y Gram negativo. Posteriormente se agrega el lugol, que es un mordiente o fijador y que forma un complejo con el cristal violeta. Durante el proceso de descoloración con alcohol-acetona, la gruesa pared de los Gram positivo impide la salida del colorante, manteniendo la coloración violeta. En cambio, por el alto contenido lipídico de la pared de los Gram negativo, el alcohol-acetona genera poros, por los cuales escapa el cristal violeta, la bacteria se descolora y para visualizarla al microscopio es necesario teñirla con un colorante de contraste, de color rojo (safranina o fucsina).

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Tabla 4: Morfología y propiedad tintorial de algunas bacterias de importancia clínica*

Morfología Gram Aerobios y anaerobios facultativos Anaerobios estrictos

Cocos

Gram

(+)

Gram (-)

Staphylococcus, Streptococcus,

Micrococcus, Enterococcus

Neisseria

Peptococcus,

Peptoestreptococcus

Veillonella

Bacilos

Gram

(+)

Gram (-)

Esporulados: Bacillus

No Esporulados: Corynebacterium,

Listeria, Lactobacillus

Clostridium

Propionibacterium,

Eubacterium,

Bifidobacterium, etc.

Enterobacterias: Escherichia,

Klebsiella, Salmonella, Shigella.

No Fermentadores: Pseudomonas,

Acinetobacter, Stenotrophomonas,

Burkholderia.

Fastidiosos: Haemophilus,

Bordetella,

Brucella. Pasteurella.

Bacteroides, Prevotella,

Porphyromonas,

Fusobacterium

* Esta Tabla no incluye a otras bacterias de importancia clínica para las cuales la Tinción de Gram no es aplicable (micobacterias, micoplasmas, clamidias, espiroquetas, etc.).

Coloración doble por el método de Ziehl–Neelsen: Tinción diferencial que se emplea

preferentemente para bacilos de la Tuberculosis (Mycobacterium) y otros similares, que por el alto contenido de material lipídico de sus paredes, difícilmente se pueden teñir con Gram. Estos microorganismos resisten la descoloración con alcohol-ácido y se observan teñidos de color rojo (fucsina de Ziehl), por ello se denominan bacilos alcohol-ácido resistentes (BAAR). El colorante de contraste utilizado es azul de metileno.

Figura 6. Diagrama de flujo mostrando las etapas de la tinción de Ziehl–Neelsen.

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Observación microscópica de los hongos: 1.- Tinción de Gram: útil en la observación microscópica de levaduras. Permite observar: forma y tamaño de las levaduras, tipo de reproducción: fisión, gemación unipolar, bipolar o multipolar, ausencia o presencia de artroconidios, blastoconidios, pseudohifas e hifas verdaderas. 2.- Observación de hongos filamentosos: Se prepara una emulsión tomando una porción de la colonia con una gota de agua destilada o lactofenol con o sin colorante y se prepara el frotis. De esta manera se pueden observar hifas hialinas, pigmentadas, septadas , aseptadas, forma y tipo de conidio, etc. 3.- Microcultivos en lámina: se obtienen preparaciones permanentes al cultivar el hongo en una lámina de vidrio.

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C. MICROBIOTA NORMAL HUMANA

Muchos microorganismos viven gran parte de sus vidas en relación estrecha con otras especies de seres vivos. Este tipo de relación se denomina simbiosis (derivado del griego sym: junto con, y bios: vida) y los seres vivos que la realizan simbiontes.

Existen tres tipos principales de relaciones simbióticas: comensalismo, mutualismo y parasitismo.

Comensalismo: El comensalismo (derivado del latín com: junto y mensa: mesa) es una relación simbiótica en la cual un organismo, el denominado comensal, se beneficia de la relación mientras el hospedero no es afectado ni positiva ni negativamente.

Mutualismo: Designa la relación en la cual ambos participantes reciben un beneficio. Si ambos organismos conservan la facultad de poder vivir en forma independiente, la relación se denomina protocooperación (subtipo de mutualismo). En el caso que la relación sea esencial para ambos participantes, la denominamos mutualismo propiamente tal (algunos autores utilizan para este subtipo de relación el término simbiosis, sin embargo, si recordamos la etimología de esta palabra, su significado corresponde más bien a una relación biológica estrecha, sin considerar el tipo de relación que se establece). En estos casos el mutualista y el hospedero son metabólicamente interdependientes. Existen varios ejemplos de este tipo de relación: protozoo flagelado que vive en intestino de termitas y produce celulasas que degradan la madera; líquenes (relación entre hongos ascomicetos y algas verdes o cianobacterias); microorganismos del rumen de animales herbívoros; etc.

Parasitismo: Describe la situación en la cual uno de los participantes recibe un daño en la interacción. Los patógenos clásicos del ser humano se comportan de esta forma.

Una gran diversidad de microorganismos está asociada a la piel y membranas mucosas del ser humano, desde su nacimiento hasta su muerte. Esta población de microorganismos constituye la microbiota normal del individuo.

La microbiota normal en humanos es relativamente estable, con géneros específicos colonizando varias regiones del cuerpo humano, durante períodos particulares de la vida de un individuo. Usualmente se desarrolla en una secuencia ordenada, o sucesión, después del nacimiento, terminando en el establecimiento de poblaciones bacterianas relativamente constantes en el individuo adulto. El principal factor que determina la composición de la microbiota normal en una región del cuerpo es la naturaleza del ambiente local, el cual es determinado por el pH, temperatura, potencial redox, oxígeno, agua, y niveles de nutrientes. Otros factores, tales como, peristaltismo, saliva, secreción de lisozima, y secreción de inmunoglobulinas también juegan un rol en el control de la microbiota normal. Es importante destacar que la terapia antimicrobiana contra un patógeno bacteriano también afecta negativamente a la microbiota normal, cada vez que ésta se enfrente a un antibiótico.

Existe una inmensa diversidad en las especies bacterianas que conforman la microbiota normal, estimándose que existirían más de 1000 especies diferentes sólo en la microbiota del sistema digestivo.

La microbiota normal humana, incorrectamente denominada flora normal (las bacterias no pertenecen al reino vegetal), comprende todos los microorganismos simbióticos que se

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encuentran normalmente asociados a sistemas anatómicos como la piel, tracto gastrointestinal, sistema respiratorio superior, sistema urogenital y conjuntiva. La mayoría de los microorganismos que pertenecen a la microbiota normal están en una relación comensal con el hospedero, sin embargo, algunos pueden estar en una relación mutualista (los productores de sustancias beneficiosas para el hospedero, por ejemplo).

El estudio de animales libres de microorganismos (axénicos) ha permitido entender el rol fundamental que desempeña la microbiota normal en relación al hospedero. Por ejemplo, se ha establecido que animales experimentales axénicos tienen un promedio de vida cercano al doble del valor encontrado en animales normales, sólo si se mantienen en condiciones de esterilidad. Sin embargo, en presencia de microorganismos patógenos la sobrevida de éstos animales es menor que los animales con microbiota normal. Además, se ha descubierto que los animales libres de microorganismos presentan características anatómicas, fisiológicas e inmunológicas, diferentes a las de los animales normales (fundamentalmente a nivel de la mucosa intestinal).

Los principales beneficios que la microbiota normal entrega al ser humano son:

1. Interferencia bacteriana: Se conoce con este nombre a la capacidad de las bacterias de la microbiota normal de interferir o desplazar el crecimiento de patógenos, porque ocupan un espacio físico (mediante su unión a receptores celulares), lo que disminuye los receptores específicos disponibles para la interacción entre bacterias patógenas y el hospedero. Además, las bacterias de la microbiota normal inhiben el crecimiento de algunos patógenos, evitando por esta vía la infección del hospedero, debido a la producción de compuestos tóxicos, como bacteriocinas (ver Figura 7). También la competencia por nutrientes y algunos minerales limitantes en el hospedero, como el hierro, explican la interferencia bacteriana.

Figura 7. Mecanismos por los cuales la microbiota normal compite con patógenos invasores.

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2. Activación basal y desarrollo del sistema inmune: Los estudios más importantes se refieren al sistema digestivo. La microbiota normal intestinal mantiene en un estado basal de activación al sistema inmune del hospedero (por ejemplo: en seres humanos se encuentran normalmente anticuerpos séricos e inmunoglobulinas tipo A en la mucosa intestinal que reaccionan contra componentes de la microbiota normal; por otra parte, los niveles y tipos linfocitarios en la mucosa intestinal aumentan en forma importante debido a la colonización de la microbiota). La microbiota normal podría participar además en la estructuración espacial del sistema inmune intestinal (diferentes tipos de subpoblaciones linfocitarias en diferentes sitios anatómicos) e indirectamente en la microanatomía del tubo digestivo. Todos estos factores ayudarán finalmente al hospedero a mantener una adecuada defensa contra microorganismos potencialmente patógenos.

3. Producción de nutrientes: Vitaminas del complejo B y vitamina K.

4. Participación en ciclos metabólicos: Reciclaje de la urea y sales biliares.

Aunque la microbiota normal que habita la piel humana, ojos, orofaringe, genitales y tracto gastrointestinal son inocuos en individuos sanos, éstos pueden transformarse en patógenos para hospederos inmunocomprometidos.

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D. CONTROL DE MICROORGANISMOS

ANTIMICROBIANOS El término antimicrobiano se refiere a una sustancia química capaz de interferir sobre el crecimiento microbiano, inhibiendo la proliferación de cualquier microorganismo. Dentro de los antimicrobianos, se encuentran los antibióticos, los cuales comprenden productos químicos elaborados naturalmente por microorganismos, u otra sustancia similar elaborada de forma total o parcial por síntesis química, los cuales en bajas concentraciones inhiben el desarrollo específicamente de bacterias.

CLASIFICACIÓN DE LOS ANTIBIÓTICOS

Los antibióticos se pueden clasificar de acuerdo a diversos criterios.

De acuerdo a su mecanismo de acción, se pueden clasificar en:

a.- Inhibidores de la síntesis de la pared bacteriana. b.- Inhibidores de la función de la membrana citoplasmática. c.- Inhibidores de la síntesis proteica (actúan sobre ribosomas bacterianos). d.- Inhibidores que actúan a nivel de la síntesis de ácidos nucleicos. e.- Antimetabolitos que actúan sobre vías metabólicas esenciales para la bacteria.

Figura 8. Esquema de los sitios blancos para diferentes antibióticos.

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De acuerdo al tipo o grado de acción antimicrobiana se clasifican en:

Bacteriostáticos: Son aquéllos que producen inhibición del crecimiento microbiano, efecto que desaparece cuando dejan de actuar sobre el microorganismo. Por lo tanto, su acción es reversible.

Bactericidas: Causan una acción letal irreversible sobre los microorganismos.

MÉTODOS DE ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO

1. Método de susceptibilidad por difusión Este método, conocido también como método de Kirby-Bauer, permite categorizar las bacterias como sensibles o resistentes a los antimicrobianos, de una manera cualitativa, mediante el uso de discos de papel filtro impregnados con una cantidad determinada de antimicrobiano y aplicados sobre la superficie de un agar que ha sido inoculado previamente con la bacteria en estudio.

.

Figura 9. Esquema representando un antibiograma

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2. Métodos de susceptibilidad por dilución Se usan para determinar la concentración mínima exacta del antimicrobiano que inhibe el crecimiento (CIM) para un determinado microorganismo. Es por lo tanto un método cuantitativo. Para ello, se realizan diluciones seriadas del antimicrobiano, se inoculan con microorganismos y se incuban. La CIM es la concentración más baja del antimicrobiano en la cual no hay crecimiento microbiano aparente. Esta técnica se puede hacer en medio líquido (tubos) o en medio sólido (placas). También, mediante este procedimiento se puede determinar la CBM (Concentración Bactericida Mínima), que es la concentración mínima de antibiótico necesaria para matar el 99.9% de las bacterias en un cultivo. Además, se puede confirmar sensibilidad o resistencia en cepas que presentan sensibilidad intermedia por el método de difusión en agar, o resultados variables por otros métodos.

Test de macrodilución en caldo. En los tubos donde hay menor concentración del antibiótico aparece turbidez indicadora de crecimiento bacteriano. La concentración de 8 µg/ml corresponde a la CIM.

Test de microdilución en caldo. Corresponde a un método cuantitativo, que al utilizar estas microplacas de 96 pocillos, permite analizar una cepa frente a 10 antibióticos distintos en 8 diluciones, o 10 cepas distintas frente al mismo antibiótico.

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3. E-TEST Ésta es una técnica cuantitativa (CIM), que combina los principios básicos de los métodos de estudio de susceptibilidad por difusión y dilución en agar, antes mencionados. En el E-test, el inóculo estandarizado se disemina en una placa de agar para formar un césped homogéneo. Sobre este inóculo, se deposita una tira impregnada con el antimicrobiano a estudiar dispuesto como una gradiente de concentración. El agente antimicrobiano difunde sobre el agar generando un halo elíptico y la CIM corresponde al punto de intersección entre la inhibición del crecimiento bacteriano y la concentración del antimicrobiano.

Utilidad y rendimiento de las pruebas de susceptibilidad in vitro El laboratorio proporciona información a través de métodos estandarizados in vitro de la actividad de los antimicrobianos frente al microorganismo patógeno aislado. Sin embargo, el clínico debe seleccionar el antimicrobiano a usar considerando esta información más todos los otros factores que inciden en el comportamiento del fármaco in vivo (Ej: insuficiencia renal, alergias, etc.).

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Comparar in silico genomas de especies bacterianas beneficiosas y patógenas

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¿Qué sigue luego de la predicción y selección con Vaxign?