EE - EP1692182 B1

Suurenenud Fc retseptori sidumisvõime ja efektori funktsiooniga CD20 antikehad

LEIUTISE TAUST

TEHNIKAVALDKOND

Käesolev leiutis seondub antigeeni siduvate molekulidega (ABM). Täpsemates 5

teostustes seondub käesolev leiutis rekombinantsete monoklonaalsete

antikehadega, täpsemalt inimese CD20 spetsiifiliste inimese jaoks kohandatud

antikehadega. Lisaks seondub käesolev leiutis selliseid ABM kodeerivate

nukleiinhappe molekulide ja selliseid nukleiinhappe molekule sisaldavate vektorite

ja peremeesrakkudega. Leiutis seondub täiendavalt leiutise ABM 10

valmistamismeetoditega ja meetoditega nimetatud ABM kasutamiseks haiguste

ravimisel. Lisaks seondub käesolev leiutis modifitseeritud glükosüülimisprofiiliga

ABM, millel on paranenud terapeutilised omadused, k.a suurenenud Fc retseptori

sidumisvõime ja suurenenud efektori funktsiooniga antikehad.

TEHNIKA TASE 15

Immuunsüsteem ja anti-CD20 antikehad

Selgroogsete (k.a inimesed) immuunsüsteem koosneb arvukatest organitest ja

rakutüüpidest, mis on arenenud sissetungivaid kehaväliseid mikroorganisme

(„antigeenid“) täpselt ja spetsiifiliselt tuvastama, siduma ja hävitama.

Immuunsüsteemi korrektsel funktsioneerimisel omavad kriitilist tähtsust 20

lümfotsüüdid. Neid rakke toodetakse harknäärmes, põrnas ja luuüdis

(täiskasvanud) ning need moodustavad umbes 30% täiskasvanud inimeste

vereringes eksisteerivatest valgetest verelibledest. Eksisteerib kaks peamist

lümfotsüütide alampopulatsiooni: T rakud ja B rakud. T rakud põhjustavad raku

poolt vahendatud immuunsust, samas kui B rakud vastutavad antikehade tootmise 25

eest (humoraalne immuunsus). Kuid tüüpilise immuunvastuse korral toimivad T

rakud ja B rakud üksteisest sõltuvalt: T rakud aktiveeritakse, kui T raku retseptor

seondub antigeeni fragmentidega, mis omakorda on seotud antigeeni kujutava

raku pinnal olevate histokompatibiilse peakompleksi („MHC“) glükovalkudega;

EE - EP1692182 B1 2

selline aktiveerumine põhjustab bioloogiliste mediaatorite („interleukiinid“)

vabanemise, mis omakorda stimuleerivad B rakkude diferentseerumist ja antigeeni

vastaste antikehade („immunoglobuliinid“) tootmist.

Iga peremehes olev B rakk avaldab mingi kindla tüübi ja spetsiifilisusega antikeha

ja erinevad B rakud avaldavad erinevate antigeenide spetsiifilisi antikehasid. B 5

rakkude proliferatsioon ja antikehade tootmine suurenevad hüppeliselt

reaktsioonina kehavälisele antigeenile ning mõlemad reaktsioonid vaibuvad (või

vähenevad oluliselt), kui kehaväline antigeen on neutraliseeritud. Kuid tavaliselt

jätkub konkreetse B raku proliferatsioon ilma vähenemiseta; selline proliferatsioon

võib põhjustada kasvaja tekke, mida teatakse kui "B raku lümfoomi". 10

Nii T kui ka B rakud sisaldavad rakupinna valke, mida saab kasutada

diferentseerumise ja tuvastamise „markeritena“. Üheks selliseks inimese B raku

markeriks on inimese B lümfotsüüdi diferentseerumist keelav antigeen Bp35 ehk

„CD20“. „CD20“ avaldatakse varajase eel-B raku arengu käigus ja avaldumine

toimub plasmarakkude diferentseerumiseni. Täpsemalt, CD20 molekul võib 15

reguleerida aktiveerimisprotsessi etappi, mis on vajalik rakutsükli käivitamiseks ja

diferentseerimiseks ja see avaldub tavaliselt väga kõrgetel tasemetel

neoplastilistes („tuumori“) B rakkudes. Kuna CD20 esineb kõrgetel tasemetel

„pahaloomulistes“ B rakkudes (s.t need B rakud, mille lakkamatu proliferatsioon

võib viia B raku lümfoomini), on CD20 pinna antigeen potentsiaalseks B raku 20

lümfoomide „suunatud ravi“ kandidaadiks.

Põhimõtteliselt kujutab selline suunatud ravi endast järgnevat: B rakkude CD20

pinna antigeenide spetsiifilised antikehad sisestatakse (näiteks süstimise abil)

patsienti. Need anti-CD20 antikehad seonduvad spetsiifiliselt (näiliselt) nii tervete

kui ka pahaloomuliste B rakkude CD20 rakupinna antigeeniga; CD20 pinna 25

antigeeniga seotud anti-CD20 antikeha võib seejärel põhjustada neoplastiliste B

rakkude hävitamise ja hulga vähenemiseni. Lisaks võib anti-CD20 antikehaga

konjugeerida keemilised ained või radioaktiivsed märgised, mis on potentsiaalselt

võimelised tuumori hävitama nii, et aine "transporditakse" spetsiifiliselt näiteks

neoplastilistesse B rakkudesse. Hoolimata rakendamisviisist on peamiseks 30

eesmärgiks tuumori hävitamine: konkreetse kasutusviisi võib määrata vastavalt

EE - EP1692182 B1 3

kasutatavale konkreetsele anti-CD20 antikehale ja seega võivad võimalikud CD20

antigeenile suunatud kasutusviisid märgatavalt erineda.

Kasvaja ravimisel võivad kasulikeks ravimiteks osutuda konjugeerimata

monoklonaalsed antikehad (mAb), mida on demonstreerinud asutuse U.S Food

and Drug Administration heakskiit ravimi Rituximab (Rituxan™; IDEC 5

Pharmaceuticals, San Diego, CA ja Genentech Inc., San Francisco, CA)

kasutamisele CD20 positiivsete B rakkude, väikse riskiga või follikulaarse mitte-

Hodgkini lümfoomi ravimisel; ravimi Trastuzumab (Herceptin™; Genentech Inc,)

kasutamisele arenenud rinnavähi ravimisel (Grillo-Lopez, A.-J., et al., Semin.

Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21:309-18 (1999)), ravimi 10

Gemtuzumab (Mylotarg™, Celltech/Wyeth-Ayerst) kasutamisele korduva akuutse

müeloidi leukeemia ravimisel ja ravimi Alemtuzumab (CAMPATH™, Millenium

Pharmaceuticals/Schering AG) kasutamisele B rakkude kroonilise lümfotsüütilise

leukeemia ravimisel. Nimetatud toodete edu ei põhine ainult nende efektiivsusel,

vaid samuti nende sobivatel ohutusprofiilidel (Grillo-Lopez, A.-J., et al., Semin. 15

Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21:309-18 (1999)).

Hoolimata nende ravimite abil saavutatust, pakub hetkel laialdast huvi

konjugeerimata mAb ravist suurema spetsiifilisusega antikeha aktiivsuse

väljatöötamine. Hiire monoklonaalne antikeha B-Ly1 on veel üheks antikehaks,

mis teatakse olevat inimese CD20 spetsiifiline. (Poppema, S. ja Visser, L., Biotest 20

Bulletin 3: 131-139 (1987)).

Patendis WO 03/11878 kirjeldatakse antikehade glükomuutmist, kasutades

näitena C2B8 (rituxan). Nimetatud dokumendis ei mainita B-Ly1.

Polyak et al., Blood (2002), lk 3256-3262 uurivad epitoope, millega mitmed anti-

CD20 antikehad seonduvad. Nad kasutavad katsetes ühe 16 antikehast koosneva 25

paneelina täielikku hiire B-Ly1 antikeha, testides selle reaktiivsust CD20

ekstratsellulaarse aasa konkreetse piirkonnaga, selle võimet rakkude

homotüüpilist agregatsiooni esile kutsuda ja CD20 rakumembraanis ümber

paigutada. Kuid nad ei pakkunud välja järjestust B-Ly1 jaoks ega valmistanud

fusioonvalke, mis sisaldaksid B-Ly1 järjestuse osasid (näiteks kimäärsed, inimese 30

jaoks kohandatud või glükomuundatud antikehad) ja säilitaksid samas võime

CD20 siduda.

EE - EP1692182 B1 4

Cragg et al., Blood (2003), lk 1045 - 1052 korreleerivad läbi CD20 eritumise

lipiidsetesse parvedesse erinevate anti-CD20 antikehadega (k.a rituximab)

tekitatud komplemendi vahendatud lahustust. Cragg et al. isegi ei testinud oma

uuringutes täielikku hiire B-Ly1 antikeha; selle asemel tehti ainult viide Polyak ja

Deans dokumendile, milles demonstreeriti, et B-Ly1 ei transpordi CD20 5

lipiidsetesse parvedesse.

Davies et al., Biotechnology and Bioengineering - Combinatorial Chemistry (2001),

lk 288-294 avaldasid roti GnTIII rituximab avaldavates CHO rakkudes. Kuid nad

isegi ei maininud hiire B-Ly1, rääkimata B-Ly1 järjestusi või glükomuundatud II

tüübi antikehasid sisaldavate fusioonpolüpeptiidide valmistamisest. 10

Patent US 2003/0 007 097 on suunatud GnTIII kaasavaldatavatele

rekombinantsetele antikehadele, kuid ainukene toimiv näide on suunatud GnTIII

ekspressioonile rituximab´ avaldavates rakkudes. B-Ly1 antikeha ei ole avaldatud.

Patent WO 00/67796 on suunatud meetoditele autoimmuunsete haiguste

ravimiseks, kasutades selleks B raku pinna markeritega (näiteks anti-CD20 15

antikehad) seonduvaid antagoniste. Näited on suunatud rituximab´le. B-Ly1

antikeha ei ole avaldatud.

Mitmete uuringute tulemused võimaldavad soovitada, et Fc retseptorist sõltuvad

mehhanismid soodustavad üldiselt tsütotoksiliste antikehade toimet tuumorite

vastu ja demonstreerivad, et optimaalne tuumorite vastane antikeha seonduks 20

eelistatult aktiveerimise Fc retseptoritega ja minimaalselt inhibeerimispartneriga

FcγRIIB. (Clynes, R. A., et al., Nature Medicine 6(4):443-446 (2000); Kalergis,

A.M. ja Ravetch, J. V., J. Exp. Med 19S (12):1653-1659 (juuni, 2002). Näiteks

vähemalt ühe uuringu tulemused võimaldavad soovitada, et FcγRIIIa retseptor on

tugevalt seotud antikeha ravi efektiivsusega. (Cartron, G., et al., Blood 99(3):754-25

757 (veebruar, 2002)). Nimetatud uuringu käigus demonstreeriti, et FcγRIIIa

suhtes homotsügootsete patsientide reageering rituximab´le oli parem kui

heterotsügootsetel patsientidel. Autorid järeldasid, et parem reageering oli tingitud

antikeha paremast in vivo FcγRIIIa seondumisest, mis omakorda põhjustas

parema ADCC aktiivsuse lümfoomi rakkude vastu. (Cartron, G., et al., Blood 30

99(3):754-757 (veebruar, 2002)).

EE - EP1692182 B1 5

Avaldatud on mitmed CD20 pinna antigeenile suunatud katsed. Hiire

monoklonaalne antikeha 1F5 (anti-CD20 antikeha) manustati B raku lümfoomi

põdevatele patsientidele pideva intravenoosse infusiooniga. Vereringes olevate

tuumorirakkude kõrvaldamiseks vajati ülimalt kõrgeid (>2 grammi) 1FS tasemeid ja

tulemusi kirjeldati kui „põgusaid“. Press et al., "Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-5

CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas." Blood 69/2:584-591 (1987).

Nimetatud kasutusviisi potentsiaalseks probleemiks on, et inimestelt

mittepärinevatel monoklonaalsetel antikehadel (näiteks hiire monoklonaalsed

antikehad) puudub tavaliselt inimese efektori funktsionaalsus, s.t, et need ei ole

inter alia võimelised komplemendist sõltuvat lahustust vahendama või inimese 10

märklaud-rakke läbi antikehast sõltuva rakulise toksilisuse või Fc retseptori poolt

vahendatud fagotsütoosi lahustama. Lisaks võidakse inimestelt mittepärinevad

antikehad inimorganismis võõrvalkudena identifitseerida; seega võivad selliste

võõrantikehade korduvad sisestused viia immuunreageeringute esile kutsumiseni,

mis omakorda võivad viia ohtlike ülitundlikkuse reaktsioonideni. Hiire 15

monoklonaalsete antikehade korral viidatakse eelnevalt kirjeldatule sageli kui

inimese reageeringule hiire antikeha vastu või „HAMA“ reageeringule. Lisaks

võidakse neid „võõraid“ antikehasid rünnata peremehe immuunsüsteemi poolt nii,

et need neutraliseeritakse enne sihtkohta jõudmist.

Veel üheks kirjeldatud viisiks hiire monoklonaalsete antikehade B raku häirete 20

ravimiseks sobivamaks muutmiseks on radioaktiivse märgise või toksiini

konjugeerimine antikehaga viisil, et nimetatud märgis või toksiin lokaliseeritakse

tuumori asukohas. Näiteks „märgistati“ eelnevalt mainitud 1F5 antikeha jood-131

("131I“) ja seejärel testiti selle biojaotuvust kahel patsiendil. Vaadake Eary, J. F. et

al., "Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma" J. Nuc. Med. 31/8:1257-1268 25

(1990); vaadake samuti Press, O. W. et al., "Treatment of Refractory Non-

Hodgkin’s Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (Anti-CD37) Antibody" J. Clin. Onc.

7/8:1027-1038 (1989) (ühel 131I-märgistatud IF-5 ravitud patsiendil saavutati

„osaline reageering"); Goldenberg, D. M. et al., "Targeting, Dosimetry and

Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-131-Labeled LL2 30

Monoclonal Antibody" J. Clin. Onc. 9/4:548-564 (1991) (kaheksast mitu doosi

saanud patsiendist kolmel arenes välja HAMA reageering); Appelbaum, F. R.

"Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin’s

EE - EP1692182 B1 6

Lymphoma" Hem. lOnc. Clinics of N. A. 5/5:1013-1025 (1991) (ülevaade); Press,

O. W. et al "Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous

Bone Marrow Support." New England J. Med 329/17: 1219-12223 (1993) (jood-

131 märgistatud anti-CD20 antikehad IF5 ja Bl); ning Kaminski, M. G. et al

"Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with 131I Anti-B1 (Anti-CD20) 5

Antibody". New England J. Med 329/7(1993) (jood-131 märgistatud anti-CD20

antikeha B1; järgnevalt "Kaminski"). Antikehadega on samuti konjugeeritud

toksiine (s.t kemoterapeutilised ained nagu doksorubitsiin või mitomütsiin C).

Vaadake näiteks PCT publitseeritud patendiavaldust WO 92/07466 (publitseeritud

14. mail, 1992). 10

Alternatiivina „konjugeeritud“ antikehadele on samuti välja töötatud kimäärsed

antikehad, mis koosnevad kahe või rohkema erineva liigi (näiteks hiir ja inimene)

antikehade osadest. Vaadake näiteks Liu, A. Y. et al, "Production of a Mouse-

Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic

Activity" J. Immun. 139/10: 3521-3526 (1987), kus kirjeldatakse CD20 antigeeni 15

vastu suunatud hiire/inimese kimäärset antikeha. Vaadake samuti PCT

publikatsiooni nr. WO 88/04936. Näiteks kimäärne anti-CD20 antikeha rituximab

(RITUXAN®) on kiidetud heaks mitte-Hodgkinsi lümfoomi ravimisel.

Arvestades CD20 ekspressiooni B raku lümfoomide poolt, võib see antigeen

toimida kui selliste lümfoomide "ravimise" kandidaat. Põhimõtteliselt kujutab selline 20

suunatud ravi endast järgnevat: patsiendile manustatakse antikehad, mis on

spetsiifilised B rakkude CD20 pinna antigeeni suhtes. Need anti-CD20 antikehad

seonduvad spetsiifiliselt (näiliselt) nii tervete kui ka pahaloomuliste B rakkude

CD20 rakupinna antigeeniga ja raku pinnal seotud CD20 põhjustab tuumorit

sisaldavate B rakkude hävitamise ja hulga vähenemise. Lisaks võib anti-CD20 25

antikeha külge kinnitada otse või kaudselt keemilised ained, tsütotoksiinid või

radioaktiivsed ained nii, et aine „transporditakse“ selektiivselt CD20 avaldavatesse

B rakkudesse. Mõlema kasutusviisi korral on peamiseks eesmärgiks tuumori

hävitamine. Kasutatav rakendusviis sõltub konkreetsest kasutatavast anti-CD20

antikehast. Seega on selge, et erinevad CD20 antigeeni ravivõimalused võivad 30

üksteisest märgatavalt erineda.

EE - EP1692182 B1 7

Rituximab (RITUXAN®) antikeha on geenitehnoloogia abil valmistatud kimäärne

inimese gamma 1 hiire konstantne domeen, mis sisaldab inimese CD20 antigeeni

vastu suunatud monoklonaalset antikeha. See kimäärne antikeha sisaldab inimese

gamma 1 konstantseid domeene ja seda on kirjeldatud USA patendis nr.

5 736 137 (Andersen et al., väljastatud 17. aprillil, 1998 ja omistatud ettevõttele 5

IDEC Pharmaceuticals Corporation) nime all „C2B8“. RITUXAN® on kiidetud

heaks patsientide ravimiseks, kellel esineb korduv või refraktoriga väikse riskiga

või follikulaarne CD20 positiivne B raku mitte-Hodgkinsi lümfoom. Toimeuuringute

in vitro mehhanism on näidanud, et RITUXAN® ilmutab inimese komplemendist

sõltuvat tsütotoksilisust (CDC) (Reff et. al, Blood 83(2): 435-445 (1994)). Lisaks 10

avaldas see märgatavat aktiivsust analüüsides, kus mõõdeti antikehast sõltuvat

rakulist tsütotoksilisust (ADCC). On demonstreeritud, et RITUXAN® omab

antiproliferatiivset aktiivsust tümidiini liitumisanalüüsides ja piiratud võimet

otseseks apoptoosi indutseerimiseks - CD20 antikehadel see puudub (Maloney et.

al, Blood 88 (10): 637a (1996)). 15

Antikeha glükosüülimine

Oligosahhariidkomponent võib mõjutada märgatavalt terapeutilise glükovalgu

efektiivsuse olulisi omadusi, k.a füüsikaline stabiilsus, resistentsus

proteaasrünnakule, vastastiktoime immuunsüsteemiga, farmakokineetika ja

spetsiifiline bioloogiline aktiivsus. Sellised omadused ei pruugi sõltuda ainult 20

oligosahhariidide olemasolust või puudumisest, vaid samuti nende spetsiifilistest

struktuuridest. Oligosahhariidi struktuuri ja glükovalgu funktsiooni vahel võib teha

mõningaid üldistusi. Näiteks teatud oligosahhariidi struktuurid vahendavad läbi

toimete spetsiifiliste süsivesikuid siduvate valkudega glükovalgu kiiret kõrvaldamist

vereringest, samas kui teised võivad seonduda antikehadega ja käivitada 25

soovimatuid immuunreaktsioone. (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81

(1996)).

Terapeutiliste glükovalkude tootmise eelistatud peremeesteks on imetajate rakud,

kuna need on võimelised glükosüülima valke inimestel kasutamiseks kõige

sobivamas vormis. (Cumming et al., Glycobiology 1:115-30 (1991); Jenkins et al., 30

Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Bakterid glükosüülivad valke väga harva ja

sarnaselt muude tavapäraste peremeeste tüüpidega nagu pärmid, kiulised seened

EE - EP1692182 B1 8

ning putukate ja taimede rakud, seonduvad ka pärmi glükosüülimismustrid kiire

eemaldamisega vereringest, soovimatute immuunreaktsioonide ja mõningatel

juhtudel ka vähenenud bioloogilise aktiivsusega. Imetajarakkudest on viimase

kahe aastakümne jooksul olnud enim kasutatuiks hiina hamstri munarakud (CHO).

Lisaks sobivate glükosüülimismustrite tekitamisele võimaldavad need rakud 5

pidevat geneetiliselt stabiilsete suure tootlikkusega klonaalsete rakuliinide loomist.

Neid rakke saab kultuuristada suure tihedusega ka lihtsates bioreaktorites,

kasutades seerumivaba söödet ja saades seeläbi turvalised ja taastatavad

bioprotsessid. Muud tavaliselt kasutatavad loomarakud hõlmavad hamstripoegade

neeru (BHK) rakke, NS0- ja SP2/0 hiire müeloomi rakke. Viimasel ajal on testitud 10

ka transgeensete loomade produktsiooni (Jenkins et al., Nature Biotechnol.

14:975-81 (1996)).

Kõik antikehad sisaldavad raske ahela konstantsete piirkondade konserveerunud

positsioonidel süsivesikute struktuure, kus iga isotüüp omab erinevat N-aheldatud

süsivesiku struktuuride järjestust, mis mõjutab erineval moel valgu pakkimist, 15

eritumist või funktsionaalset aktiivsust (Wright, A. ja Morrison, S. L., Trends

Biotech. 15:26-32 (1997)). Kinnitatud N-aheldatud süsivesiku struktuur erineb

märgatavalt, sõltudes protsessimisastmest ja võib sisaldada nii suure

mannoosisisaldusega hargnenud ahelaga kui ka biantennaarseid kompleksi

vormis oligosahhariide (Wright, A. ja Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 20

(1997)). Tavaliselt toimub konkreetse glükosüülimispiirkonna külge kinnitatud

tuuma oligosahhariidi struktuuride heterogeenne protsessimine viisil, et isegi

monoklonaalsed antikehad esinevad mitmetes glükovormides. Sarnaselt on

demonstreeritud, et peamised erinevused antikeha glükosüülimisel toimuvad

rakuliinide vahel ja erinevatel kultuuritingimustel kasvatatud rakuliinide jaoks on 25

näha isegi väikesed erinevused (Lifely, M. R. et al., Glycobiology 5(8):813-22

(1995)).

Üheks viisiks potentsiaalsuse oluliseks suurendamiseks, säilitades samaaegselt

lihtsad tootmisprotsessid ja vältides potentsiaalseid märgatavaid soovimatuid

kõrvaltoimeid, on monoklonaalsete antikehade looduslike raku poolt vahendatud 30

efektori funktsioonide võimendamine, muundades selleks nende oligosahhariidi

komponenti viisil, mida on kirjeldanud Umańa, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-

EE - EP1692182 B1 9

180 (1999) ja USA. patendis nr. 6 602 684. IgG1 tüübi antikehad (kasvajate

immunoteraapias enim kasutatud antikehad) on glükovalgud, mille iga CH2

domeeni Asn297 positsioonil asub konserveerunud N-aheldatud glükosüülimissait.

Asn297 külge kinnitatud kaks komplekset biantennaarset oligosahhariidi maetakse

CH2 domeenide vahele, kus need saavutavad ulatusliku kontakti polüpeptiidi 5

alustalaga ja nende olemasolu on antikeha jaoks olulise tähtsusega efektori

funktsioonide nagu antikehast sõltuv rakulise tsütotoksilisuse (ADCC),

vahendamisel (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., et

al., Immunol Rev. 163:59-76 (1998); Wright, A. and Morrison, S. L., Trends

Biotechnol. 15:26-32 (1997)). 10

Käesoleva leiutise autorid demonstreerisid eelnevalt, et Hiina hamstri

munarakkudes toimuva β(1,4)-N-atsetüülgükoosaminüültransferaas III („GnTIII“)

liigse ekspressiooni käigus tekib glükosüültransferaas, mis katalüseerib poolitatud

oligosahhariidide moodustumist, suurendades seeläbi märgatavalt muundatud

CHO rakkude poolt toodetud neuroblastoomi vastase monoklonaalse antikeha 15

(chCE7) in vitro ADCC aktiivsust. (Vaadake Umańa, P. et al., Nature Biotechnol.

17:176-180 (1999) ja rahvusvaheline patenditaotlus nr. WO 99/54342). Antikeha

chCE7 kuulub suurde konjugeerimata mAb klassi, millel on tugev tuumori afiinsus

ja spetsiifilisus, kuid madal potentsiaal kliiniliseks kasutamiseks juhul, kui need

antikehad toodetakse standardsetes tööstuslikes rakuliinides, millel puudub GnTIII 20

ensüüm (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). See uuring oli

esimeseks, kus näidati, et suur ADCC aktiivsuse suurenemine võidakse

saavutada, muundades antikeha tootvaid rakke GnTIII avaldamiseks, mis

suurendab samuti konstantse piirkonnaga (Fc) seotud poolitatud oligosahhariidide

(k.a poolitatud fukosüülimata oligosahhariidid) proportsiooni võrreldes looduslikult 25

esinevates antikehades leiduvaga.

Kuid endiselt eksisteerib vajadus täiustatud ravimeetodite järele, mis on suunatud

CD20 antigeeni kasutamisele B raku lümfoomide ravimiseks primaatidel, k.a

(olemata samas nendega piiratud), inimesed.

30

EE - EP1692182 B1 10

LEIUTISE LÜHIKOKKUVÕTE

Arvestades antigeeni siduvate molekulide (ABM), millel on hiire B-Ly1 antikeha

sidumisspetsiifilisus ja mida on glükomuundatud Fc retseptori sidumisafiinsuse ja

efektori funktsiooni täiustamiseks, tohutut terapeutilist potentsiaali, töötasid

käesoleva leiutise autorid välja meetodi selliste ABM valmistamiseks. Inter alia, 5

nimetatud meetod hõlmab rekombinantsete kimäärsete antikehade või nende

kimäärsete fragmentide valmistamist. Nende ABM efektiivsust täiustatakse lisaks,

muundades antikeha Fc piirkonna glükosüülimisprofiili.

Leiutises avaldatakse eraldatud polünukleotiid, mis koosneb: (a) järjestusest, mis

on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ja SEQ ID NO.: 10

7 (CDR VH-1); (b) järjestusest, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO:

21, SEQ ID NO: 22 ja SEQ ID NO: 23. (CDR VH-2); ning SEQ ID NO: 24. Lisaks on

avaldatud eraldatud polünukleotiid, mis koosneb SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ja

SEQ ID NO: 10. (CDR VL). Ühes teostuses kodeerib vähemalt üks nendest

polünukleotiididest fusioonpolüpeptiidi. 15

Lisaks avaldatakse SEQ ID NO: 3 sisaldav eraldatud polünukleotiid, SEQ ID NO: 4

sisaldav eraldatud polünukleotiid ja eraldatud polünukleotiid, mille järjestus on

valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33;

SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO:

43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID 20

NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO :59; SEQ ID NO: 61; SEQ

ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69 ja SEQ ID NO: 71.

Lisaks avaldatakse SEQ ID NO: 75 sisaldav eraldatud polünukleotiid. Ühes

teostuses kodeerivad sellised polünukleotiidid fusioonpolüpeptiide.

Lisaks kirjeldatakse eraldatud polünukleotiidi, milles leiduv järjestus on vähemalt 25

80% ulatuses identne SEQ ID NO: 3; nimetatud eraldatud polünukleotiid kodeerib

fusioonpolüpeptiidi. Täiendava teostusena kirjeldatakse eraldatud polünukleotiidi,

milles leiduv järjestus on vähemalt 80% ulatuses identne SEQ ID NO: 4; nimetatud

eraldatud polünukleotiid kodeerib fusioonpolüpeptiidi. Samuti kirjeldatakse

eraldatud polünukleotiidi, milles leiduv järjestus on vähemalt 80% ulatuses identne 30

EE - EP1692182 B1 11

järjestusega, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO:

31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID

NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49; SEQ

ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59;

SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69 5

ja SEQ ID NO: 71; nimetatud eraldatud polünukleotiid kodeerib

fusioonpolüpeptiidi. Täiendava teostusena mainitakse eraldatud polünukleotiidi,

milles leiduv järjestus on vähemalt 80% ulatuses identne SEQ ID NO: 75;

nimetatud eraldatud polünukleotiid kodeerib fusioonpolüpeptiidi.

Lisaks avaldatakse polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 11 (kogu raske ahel) 10

või polünukleotiide, mis on 80%, 85%, 90%, 95% või 99% ulatuses identsed SEQ

ID NO: 11; samuti kirjeldatakse polünukleotiidi, mis sisaldab SEQ ID NO: 12 (kogu

kerge ahel) või polünukleotiide, mis on 80%, 85%, 90%, 95% või 99% ulatuses

identsed SEQ ID NO: 12.

Ka avaldatakse eraldatud polünukleotiid, mis kodeerib SEQ ID NO: 1 järjestust 15

omavat kimäärset polüpeptiidi. Ühes teostuses sisaldab polünukleotiid SEQ ID

NO: 1 järjestust omavat polüpeptiidi kodeerivat järjestust; samuti avaldatakse

järjestus, mis kodeerib polüpeptiidi, mis omakorda sisaldab antikeha Fc piirkonna

või selle fragmendi järjestust, mis ei pärine hiirtelt. Samuti kirjeldatakse eraldatud

polünukleotiidi, mis kodeerib kimäärset polüpeptiidi, mille järjestus on valitud 20

rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID

NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ

ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54;

SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO:

64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70 ja SEQ ID NO: 72. Üheks 25

teostuseks on polünukleotiid, mis sisaldab polüpeptiidi kodeerivat järjestust ja

nimetatud polüpeptiidi järjestus on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 30;

SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO:

40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID

NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ 30

ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68;

SEQ ID NO: 70 ja SEQ ID NO: 72 ning polüpeptiidi kodeeriv järjestus, kus

EE - EP1692182 B1 12

nimetatud polüpeptiid sisaldab antikeha Fc piirkonna või selle fragmendi järjestust,

mis ei pärine hiirtelt.

Veel üheks leiutise teostuseks on eraldatud polünukleotiid, mis kodeerib SEQ ID

NO: 2 järjestust omavat kimäärset polüpeptiidi. Ühes teostuses koosneb

polünukleotiid järjestusest, mis kodeerib SEQ ID NO: 2 järjestusega polüpeptiidi; ja 5

polüpeptiidi kodeerivast järjestusest, kus nimetatud polüpeptiidil on antikeha Fc

piirkonna või selle fragmendi järjestus, mis ei pärine hiirtelt. Veel ühes teostuses

kirjeldatakse eraldatud polünukleotiidi, mis kodeerib SEQ ID NO: 76 järjestust

omavat kimäärset polüpeptiidi. Ühes teostuses sisaldab polünukleotiid SEQ ID

NO: 76 järjestust omavat polüpeptiidi kodeerivat järjestust; samuti avaldatakse 10

järjestus, mis kodeerib polüpeptiidi, mis omakorda sisaldab antikeha Fc piirkonna

või selle fragmendi järjestust, mis ei pärine hiirtelt.

Lisaks mainitakse eraldatud polünukleotiidi, mis sisaldab järjestust, mis omakorda

kodeerib hiire B-Ly1 antikeha või selle funktsionaalsete variantide VH piirkonda

omavat polüpeptiidi; samuti kirjeldatakse polüpeptiidi kodeerivat järjestust, kus 15

nimetatud polüpeptiidil on antikeha Fc piirkonna või selle fragmendi järjestus, mis

eri pärine hiirtelt. Veel ühes teostuses mainitakse eraldatud polünukleotiidi, mis

sisaldab järjestust, mis omakorda kodeerib hiire B-Ly1 antikeha või selle

funktsionaalsete variantide VL piirkonda omavat polüpeptiidi; samuti kirjeldatakse

polüpeptiidi kodeerivat järjestust, kus nimetatud polüpeptiidil on antikeha Fc 20

piirkonna või selle fragmendi järjestus, mis eri pärine hiirtelt.

Leiutises kirjeldatakse samuti ekspressioonivektorit, mis sisaldab mistahes

eelnevalt kirjeldatud eraldatud polünukleotiidi; samuti kirjeldatakse sellist

ekspressioonivektorit sisaldavat punktidele 12 kuni 17 vastavat peremeerakku.

Täiendava teostusena seondub leiutis mistahes nõudluspunktile 12 kuni 17 25

vastava peremeesrakuga.

Avaldatakse eraldatud polüpeptiid, mis koosneb: (a) järjestusest, mis on valitud

rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 ja SEQ ID NO: 17 (CDR

VH-1); (b) järjestusest, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO: 25,

SEQ ID NO: 26 ja SEQ ID NO: 27 (CDR VH-2); ning SEQ ID NO: 28; nimetatud 30

polüpeptiidiks on fusioonpolüpeptiid. Veel ühes teostuses avaldatakse eraldatud

EE - EP1692182 B1 13

polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ja SEQ ID NO: 20 (CDR

VL), kus nimetatud polüpeptiidiks on fusioonpolüpeptiid.

Samuti avaldatakse kimäärne polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 1 järjestust

või selle varianti ja kimäärne polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 2 järjestust või

selle varianti. Ühes teostuses sisaldab mistahes selline polüpeptiid inimese Fc 5

piirkonda. Lisaks kirjeldatakse kimäärset polüpeptiidi, mis sisaldab järjestust, mis

omakorda on valitud SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID

NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ

ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54;

SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 10

64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70 ja SEQ ID NO: 72 või nende

variantide hulgast; ja kimäärset polüpeptiidi, mis sisaldab SEQ ID NO: 76

järjestust. Ühes teostuses sisaldab mistahes selline polüpeptiid inimese Fc

piirkonda.

Lisaks avaldatakse polüpeptiid, mis sisaldab hiire B-Ly1 antikehast deriveeritud 15

järjestust ja heteroloogsest polüpeptiidist deriveeritud järjestust ja sellist

polüpeptiidi sisaldav antigeeni siduv molekul. Antigeeni siduvaks molekuliks on

antikeha. Ja nimetatud antikeha on inimese jaoks kohandatud.

Kirjeldatakse ka eraldatud polüpeptiidi, mis sisaldab SEQ ID NO: 13 või selle

varianti ja eraldatud polüpeptiidi, mis sisaldab SEQ ID NO: 14. 20

Lisaks avaldatakse kimäärne ABM, mis on võimeline CD20 sidumisel hiire B-Ly1

antikehaga konkureerima. Ühes teostuses on ABM antikeha või selle fragment.

Täiendavas teostuses on ABM rekombinantne antikeha, mis sisaldab VH piirkonna,

mille aminohappejärjestus on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 1; SEQ

ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; 25

SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO:

48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56; SEQ ID

NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 66; SEQ

ID NO: 68; SEQ ID NO: 70 ja SEQ ID NO: 72. Ühes muus teostuses on ABM

rekombinantne antikeha, mis sisaldab VL piirkonda, mille aminohappejärjestus on 30

valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 2 ja SEQ ID NO: 76. ABM on inimese

EE - EP1692182 B1 14

jaoks kohandatud rekombinantne antikeha. Ühes muus teostuses on ABM inimese

Fc piirkonda sisaldav rekombinantne antikeha. Ühes täiendavas teostuses võib

mistahes eelnevalt avaldatud ABM konjugeerida fragmendi nagu toksiini või

radiomärgisega.

Leiutis seondub täiendavalt käesoleva leiutise ABM, kus nimetatud ABM sisaldab 5

modifitseeritud oligosahhariide. Ühes teostuses on modifitseeritud

oligosahhariididel võrreldes modifitseerimata oligosahhariididega väiksem

fukosüülimisaste. Muudes teostustes on modifitseeritud oligosahhariidideks

hübriidid või kompleksid. Täiendavas teostuses on ABM nimetatud molekuli Fc

piirkonnas suurenenud fukosüülimata oligosahhariidide või poolitatud 10

fukosüülimata oligosahhariidide proportsioon. Ühes teostuses on poolitatud

fukosüülimata oligosahhariidid hübriidid. Ühes täiendavas teostuses on poolitatud

fukosüülimata oligosahhariidid kompleksid. Ühes teostuses on vähemalt 20%

nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas olevatest oligosahhariididest fukosüülimata

või poolitatud ja fukosüülimata. Eelistatumates teostustes on vähemalt 30%, 35%, 15

40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% või 75% või rohkem oligosahhariididest

fukosüülimata või poolitatud ja fukosüülimata.

Leiutises avaldatakse samuti polünukleotiid, mis kodeerib mistahes eelnevalt

mainitud ABM ja sellist polünukleotiidi sisaldavad ekspressioonivektorid ja rakud.

Avaldatakse meetod ABM, mis on võimeline CD20 sidumisel hiire B-Ly1 20

antikehaga konkureerima, valmistamiseks ning nimetatud ABM on kimäärne;

nimetatud meetod sisaldab: (a) peremeesraku, mis sisaldab käesoleva leiutise

ABM kodeerivat polünukleotiidi, kultuuristamist söötmes tingimustel, mis

võimaldavad nimetatud ABM kodeeriva nimetatud polünukleotiidi ekspressiooni; ja

(b) nimetatud ABM eraldamist saadud kultuurist. 25

Ühes muus teostuses seondub leiutis nõudluspunktile 18 vastava

ravimkoostisega, mis sisaldab leiutise ABM. Mõistetakse, et ravimkoostis võib

lisaks sisaldada ka farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit, abiainet või nende

kombinatsiooni.

EE - EP1692182 B1 15

Täiendavas teostuses võib leiutist kasutada B rakkude hulga vähendamisega

ravitava haiguse ravimiseks. Meetod hõlmab seda vajavale inimpatsiendile

terapeutiliselt efektiivse koguse käesoleva leiutise ABM manustamist. Ühes

eelistatud teostuses ravitakse haigust ABM manustamisega ja nimetatud ABM on

kimäärne antikeha või antikeha kimäärne fragment. 5

Lisaks avaldatakse peremeesrakk, mida on muundatud viisil, et võimaldada

vähemalt ühe GnTIII aktiivsust omava polüpeptiidi kodeeriva nukleiinhappe

avaldamist mahus, mis on piisav sellisel viisil valmistatud peremeesraku Fc

piirkonna oligosahhariidide modifitseerimiseks; ABM on võimeline CD20 sidumisel

hiire B-Ly1 antikehaga konkureerima ja on kimäärne. Ühes teostuses on GnTIII 10

aktiivsust omavaks polüpeptiidiks fusioonpolüpeptiid. Ühes muus teostuses on

peremeesraku poolt toodetud ABM antikeha või antikeha fragment. Täiendavas

teostuses sisaldab ABM piirkonda, mis on samaväärne inimese IgG Fc

piirkonnaga.

Kirjeldatakse ka eraldatud polünukleotiidi, mis sisaldab vähemalt ühte hiire B-Ly1 15

antikeha või selle variandi või lühendatud vormi komplementaarsust määravat

piirkonda, mis sisaldab vähemalt nimetatud komplementaarsust määrava

piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke; nimetatud eraldatud polünukleotiid

kodeerib fusioonpolüpeptiidi. Eelistatult kodeerivad sellised eraldatud

polünukleotiidid fusioonpolüpeptiidi, milleks on antigeeni siduv molekul. Ühes 20

teostuses koosneb polünukleotiid kolmest hiire B-Ly1 antikeha või selle variantide

või lühendatud vormide komplementaarsust määravast piirkonnast, mis sisaldavad

vähemalt iga nimetatud kolme komplementaarsust määrava piirkonna

spetsiifilisust määravaid jääke. Ühes muus teostuses kodeerib polünukleotiid kogu

kimäärse (näiteks inimese jaoks kohandatud) antikeha kerge või raske ahela 25

varieeruvat piirkonda.

Kirjeldatakse ka antigeeni kombineerivat molekuli, mis sisaldab vähemalt ühte

hiire B-Ly1 antikeha või selle variandi või lühendatud vormi komplementaarsust

määravat piirkonda, mis omakorda sisaldab vähemalt nimetatud

komplementaarsust määrava piirkonna spetsiifilisust määravat jääki ja järjestust, 30

mis on deriveeritud heteroloogsest polüpeptiidist. Ühes teostuses koosneb

antigeeni siduv molekul kolmest hiire B-Ly1 antikeha või selle variantide või

EE - EP1692182 B1 16

lühendatud vormide komplementaarsust määravast piirkonnast, mis sisaldavad

vähemalt iga nimetatud kolme komplementaarsust määrava piirkonna

spetsiifilisust määravaid jääke. Ühes muus teostuses koosneb antigeeni siduv

molekul antikeha kerge või raske ahela varieeruvast piirkonnast. Ühes eriti

kasulikus teostuses on antigeeni siduvaks molekuliks kimäärne (näiteks inimese 5

jaoks kohandatud) antikeha. Sellised antigeeni siduvaid molekule saab kasutada

haiguste, k.a B raku lümfoomid, ravimiseks.

Käesolev leiutis on esimeseks teada olevaks juhuks, kus II tüübi anti-CD20

antikeha muundatakse suurenenud efektori funktsioonide nagu ADCC omamiseks,

säilitades samal ajal potentsiaalse apoptoosi võime. Seega on käesolev leiutis 10

suunatud muundatud II tüübi anti-CD20 antikehale, millel on nimetatud

muundamise tulemusel suurenenud ADCC ilma, et kaoks potentsiaalne apoptoosi

indutseerimise võime. Ühes teostuses on II tüübi anti-CD20 antikehasid

muundatud viisil, et neil oleks Fc piirkonnas muudetud glükosüülimismuster. Ühes

konkreetses teostuses koosneb muudetud glükosüülimine suurenenud poolitatud 15

kompleksi jääkide tasemest Fc piirkonnas. Ühes muus konkreetses teostuses

koosneb muudetud glükosüülimine vähenenud fukoosi jääkide tasemest Fc

piirkonnas. Ühes muus teostuses on II tüübi anti-CD20 antikehad läbinud

polüpeptiidi muundamise. Leiutis seondub lisaks meetoditega selliste muundatud

II tüübi antikehade valmistamiseks ja meetoditega selliste antikehade 20

kasutamiseks erinevate B raku häirete, k.a B raku lümfoomid, ravimiseks.

Käesoleva leiutise peremeesraku võib valida rühmast, kuhu kuuluvad, olemata

samas nendega piiratud, CHO rakk, BHK rakk, NSO rakk, SP2/0 rakk, YO

müeloomi rakk, P3X63 hiire müeloomi rakk, PER rakk, PER.C6 rakk või

hübridoomrakk. Ühes teostuses sisaldab leiutise peremeesrakk lisaks 25

transfekteeritud polünukleotiidi, mis sisaldab hiire B-Ly1 antikeha või selle

variantide VL piirkonda kodeerivat polünukleotiidi ja järjestust, mis kodeerib

inimese immunoglobuliini Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda. Ühes muus

teostuses sisaldab leiutise peremeesrakk lisaks transfekteeritud polünukleotiidi,

mis sisaldab hiire B-Ly1 antikeha või selle variantide VH piirkonda kodeerivat 30

polünukleotiidi ja järjestust, mis kodeerib inimese immunoglobuliini Fc piirkonnaga

samaväärset piirkonda.

EE - EP1692182 B1 17

Ühe täiendava teostusena seondub leiutis peremeesrakuga, mis toodab ABM, mis

omakorda avaldab selle oligosahhariidide modifitseerimise tõttu suurenenud Fc

retseptori sidumisafiinsust ja/või suurenenud efektori funktsiooni. Ühes muus

teostuses avaldub suurenenud sidumisafiinsus Fc retseptori ja täpsemalt FcγRIIIA

retseptori suhtes. Siin vaadeldud efektori funktsiooni võib valida rühmast, kuhu 5

kuuluvad, olemata samas nendega piiratud, suurenenud Fc vahendatud rakuline

tsütotoksilisus; suurenenud seondumine NK rakkudega; suurenenud seondumine

makrofaagidega; suurenenud seondumine polümorftuumaste rakkudega;

suurenenud seondumine monotsüütidega; suurenenud apoptoosi indutseeriv

otsene signalisatsioon; suurenenud dendriitrakkude valmimine; ja suurenenud T 10

rakkude praimimine.

Täiendavas teostuses sisaldab käesoleva leiutise peremeerakk vähemalt ühte

nukleiinhapet, mis kodeerib konstitutiivse promootorelemendiga operatiivselt

aheldatud GnTIII aktiivsust omavat polüpeptiidi.

Ühes muus teostuses avaldatakse meetod ABM tootmiseks peremeesrakus, mis 15

hõlmab: (a) peremeesraku, mida on muundatud vähemalt ühe GnTIII aktiivsust

omava fusioonpolüpeptiidi kodeeriva polünukleotiidi avaldamiseks, kultuuristamist

tingimustel, mis võimaldavad nimetatud ABM tootmist ja nimetatud ABM Fc

piirkonnas olevate oligosahhariidide modifikatsiooni; ja (b) nimetatud ABM

eraldamist; nimetatud ABM on võimeline CD20 sidumisel hiire B-Ly1 antikehaga 20

konkureerima ja on kimäärne. Ühes teostuses on GnTIII aktiivsusega

polüpeptiidiks fusioonpolüpeptiid, mis koosneb eelistatult GnTIII katalüütilisest

domeenist ja heteroloogse Golgi-resistentse polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni

domeenist, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad mannosidaas II lokalisatsiooni

domeen, β(1,2)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas I ("GnTI") lokalisatsiooni 25

domeen, mannosidaas I lokalisatsiooni domeen, β(1,2)-N-

atsetüülglükoosaminüültransferaas II ("GnTII") lokalisatsiooni domeen ja α1-6

tuuma fukosüültransferaasi lokalisatsiooni domeen. Eelistatult on Golgi

lokalisatsiooni domeeniks mannosidaas II või GnTI.

Ühes täiendavas teostuses seondub leiutis meetodiga peremeesraku poolt 30

toodetud anti-CD20 ABM glükosüülimisprofiili modifitseerimiseks; meetod hõlmab

vähemalt ühe leiutise nukleiinhappe või ekspressioonivektori sisestamist

EE - EP1692182 B1 18

peremeesrakku. Ühes teostuses on ABM antikeha või selle fragment, mis sisaldab

eelistatult IgG Fc piirkonda. Alternatiivina on polüpeptiidiks fusioonvalk, mis

sisaldab inimese IgG Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda.

Ühes teostuses seondub leiutis rekombinantse kimäärse antikeha või selle

fragmendiga, mis on võimeline konkureerima CD20 sidumisel hiire B-Ly1 5

antikehaga ja millel on vähenenud fukosüülimistase.

Ühes muus teostuses seondub käesolev leiutis meetodiga leiutise rekombinantse

antikeha või selle fragmendi glükosüülimise modifitseerimiseks, kasutades selleks

fusioonpolüpeptiidi, millel on GnTIII aktiivsus ja mis sisaldab heteroloogse Golgi-

resistentse polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni domeeni. Ühes teostuses sisaldavad 10

leiutise fusioonpolüpeptiidid GnTIII katalüütilist domeeni. Ühes muus teostuses on

Golgi lokalisatsiooni domeen valitud rühmast, kuhu kuuluvad: mannosidaas II

lokalisatsiooni domeen, GnTI lokalisatsiooni domeen, mannosidaas I

lokalisatsiooni domeen, GnTII lokalisatsiooni domeen ja α1-6 tuuma

fukosüültransferaasi lokalisatsiooni domeen. Eelistatult on Golgi lokalisatsiooni 15

domeeniks mannosidaas II või GnTI.

Ühes teostuses on leiutise meetod suunatud modifitseeritud oligosahhariide

sisaldava rekombinantse kimäärse antikeha või selle fragmendi tootmisele, kus

nimetatud modifitseeritud oligosahhariididel on võrreldes modifitseerimata

oligosahhariididega vähenenud fukosüülimistase. Vastavalt käesolevale leiutisele 20

võivad need modifitseeritud oligosahhariidid olla hübriidid või kompleksid. Ühes

muus teostuses seondub leiutise meetod rekombinantse kimäärse antikeha või

selle fragmendi tootmisega, millel on nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas

suurenenud poolitatud fukosüülimata oligosahhariidide proportsioon. Ühes

teostuses on poolitatud fukosüülimata oligosahhariidideks hübriidid. Ühes muus 25

teostuses on poolitatud fukosüülimata oligosahhariidideks kompleksid. Ühes

täiendavas teostuses seondub leiutise meetod rekombinantse kimäärse antikeha

või selle fragmendi tootmisega, kus vähemalt 20% nimetatud polüpeptiidi Fc

piirkonna oligosahhariididest on poolitatud ja fukosüülimata. Ühes eelistatud

teostuses on vähemalt 30% nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas olevatest 30

oligosahhariididest poolitatud ja fukosüülimata. Ühes muus eelistatud teostuses on

EE - EP1692182 B1 19

vähemalt 35% nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas olevatest oligosahhariididest

poolitatud ja fukosüülimata.

Ühe täiendava teostusena seondub leiutis rekombinantse kimäärse antikeha või

selle fragmendiga, mis omakorda avaldab selle oligosahhariidide modifitseerimise

tõttu suurenenud Fc retseptori sidumisafiinsust ja/või suurenenud efektori 5

funktsiooni. Ühes muus teostuses avaldub suurenenud sidumisafiinsus Fc

aktiveeriva retseptori suhtes. Ühes täiendavas teostuses on Fc retseptoriks Fcγ

aktiveeriv retseptor ja täpsemalt FcγRIIIA retseptor. Siin vaadeldud efektori

funktsiooni võib valida rühmast, kuhu kuuluvad, olemata samas nendega piiratud,

suurenenud Fc vahendatud rakuline tsütotoksilisus; suurenenud seondumine NK 10

rakkudega; suurenenud seondumine makrofaagidega; suurenenud seondumine

polümorftuumaste rakkudega; suurenenud seondumine monotsüütidega;

suurenenud apoptoosi indutseeriv otsene signalisatsioon; suurenenud

dendriitrakkude valmimine; ja suurenenud T rakkude praimimine.

Ühes muus teostuses seondub leiutis mistahes käesoleva leiutise meetoditega 15

valmistatud rekombinantse kimäärse antikeha fragmendiga, millel on hiire B-Ly1

antikeha sidumisspetsiifilisus ja mis sisaldab Fc piirkonda, mida on muundatud

suurenenud efektori funktsiooni saavutamiseks.

Ühes muus teostuses avaldatakse mistahes käesoleva leiutise meetoditega

valmistatud fusioonvalk, mis sisaldab SEQ ID NO: 1 järjestust ja immunoglobuliini 20

Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda; nimetatud fusioonvalku on muundatud

suurenenud efektori funktsiooni saavutamiseks.

Ühes muus teostuses avaldatakse mistahes käesoleva leiutise meetoditega

valmistatud fusioonvalk, mis sisaldab SEQ ID NO: 2 järjestust ja immunoglobuliini

Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda; nimetatud fusioonvalku on muundatud 25

suurenenud efektori funktsiooni saavutamiseks.

Ühes teostuses seondub käesolev leiutis ravimkoostisega, mis sisaldab mistahes

käesoleva leiutise meetoditega valmistatud rekombinantset kimäärset antikeha ja

farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit. Ühes muus teostuses seondub

käesolev leiutis ravimkoostisega, mis sisaldab mistahes käesoleva leiutise 30

EE - EP1692182 B1 20

meetoditega valmistatud rekombinantse kimäärse antikeha fragmenti ja

farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit. Ühes muus teostuses seondub

käesolev leiutis ravimkoostisega, mis sisaldab mistahes käesoleva leiutise

meetoditega valmistatud fusioonvalku ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.

Käesoleva leiutise ühendeid võib kasutada B rakkude hulga vähendamisega 5

ravitavate haiguste ravimismeetodis ja nimetatud meetod hõlmab seda vajavale

inimpatsiendile terapeutiliselt efektiivse koguse mistahes käesoleva leiutise

meetodiga valmistatud rekombinantse kimäärse antikeha või selle fragmendi

manustamist.

JOONISTE LOETELU 10

Joonis FIG 1. Hiire B-Ly1 VH piirkonna nukleotiid (SEQ ID NO: 2) ja

aminohappejärjestus (SEQ ID NO: 1).

Joonis FIG 2. Hiire B-Ly1 VL piirkonna nukleotiid (SEQ ID NO: 4) ja

aminohappejärjestus (SEQ ID NO: 3).

Joonis FIG 3. Rituximab® (O) ja ch-B-Ly1 (∆) seondumine CD20 Raji B lümfoomi 15

rakkudel.

Joonis FIG 4. Rituximab® (O) ja ch-B-Ly1 (∆) poolt esile kutsutud B rakkude hulga

vähenemine kolme erineva FcγRIIIa-158V/F genotüübi klassi täisveres: (A) F/F

doonori veri, mis on homotsügootne madalama afiinsuse retseptori suhtes; (B) F/V

doonori veri, mis on heterotsügootne afiinsuse retseptori suhtes; ja (C) V/V 20

doonori veri, mis on homotsügootne kõrgema afiinsuse retseptori suhtes.

Joonis FIG 5. Kimäärse anti-CD20 antikeha raske ahela nukleotiid (SEQ ID NO:

11) ja aminohappejärjestus (SEQ ID NO: 13).

Joonis FIG 6. Kimäärse anti-CD20 antikeha kerge ahela nukleotiid (SEQ ID NO:

12) ja aminohappejärjestus (SEQ ID NO: 14). 25

Joonis FIG 7. Hiire B-Ly1 antikeha CDR nukleotiid ja aminohappejärjestus. (A)

Eeldatud CDR VH piirkonna jaoks; (B) eeldatud CDR VL piirkonna jaoks.

EE - EP1692182 B1 21

Joonis FIG 8. Glükomuundatud kimäärse B-Ly1 antikeha MALDI-TOF profiil. (A)

Konkreetse tipu protsente näitav tabel; (B) glükomuundatud kimäärse B-Ly1

spekter; (C) EndoH töödeldud glükomuundatud kimäärse B-Ly1 spekter.

Joonis FIG 9. Erinevate inimese jaoks kohandatud anti-CD20 antikehade

seondumine Raji B rakkudega. Erinevused BHH2 konstruktsiooni ning B-HL8 ja B-5

HL11 konstruktsioonide vahel asuvad raami 1 ja 2 piirkondades ning kõik kolm

CDR on identsed. B-HL8 ja B-HL11 FR1 ja FR2 järjestused on deriveeritud

inimese VH3 klassist, samas kui kogu B-HH2 raam on deriveeritud inimese VH1

klassist. B-HL11 on B-HL8 derivaat, omades ühte mutatsiooni Glu1GIn, kus GIn

on B-HH2 konstruktsioonis olev aminohappejääk. See tähendab, et Glu1GIn 10

vahetus ei muuda sidumisafiinsust või -intensiivsust. Muudeks B-HH2 ja B-HL8

vahelisteks erinevusteks on 14 FR jääki, millest üks või rohkem mõjutavad

nimetatud antikeha antigeeni sidumise olemust.

Joonis FIG 10. Inimese jaoks kohandatud anti-CD20 antikeha BHL4-KV

seondumine Raji märklaudrakkudega. B-HL4 konstruktsioon on deriveeritud B-15

HH2 antikehast, asendades B-HH2 FR1 fragmendiga, mis omakorda on

deriveeritud inimese iduliini järjestusest VH1_45. Hoolimata sellest, et FR1 on

erinevad aminohapped ainult kolmel positsioonil, on konstruktsioonil on oluliselt

vähenenud antigeeni sidumisvõime. Jäägid asuvad vastavalt Kabat´

nummerdusele positsioonidel 2, 14 ja 30. Nimetatud positsioonidest tundub olema 20

kõige olulisem positsioon 30, kuna see moodustab osa Chothia CDR1

definitsioonist.

FIG 11. B-HH1, B-HH2, B-HH3 ja lähte-antikeha B-Ly1 sidumisomaduste võrdlus.

Andmed demonstreerivad, et kõikidel antikehadel on sarnane EC50 väärtus, kuid

B-HH1 konstruktsioon seondub madalama intensiivsuse/stöhhiomeetriaga kui 25

variandid B-HH2 ja B-HH3. B-HH1 võib eristada B-HH2 ja B-HH3 nii selle osaliselt

inimese CDR1 ja CDR2 piirkondadega (Kabat´ definitsioon) kui ka positsioonil 28

esineva Ala/Thr polümorfismiga (Kabat´ nummerdus). See näitab, et

antikeha/antigeeni vastastiktoime jaoks on oluline kas positsioon 28, täielik CDR1

ja/või täielik CDR2. 30

EE - EP1692182 B1 22

Joonis FIG 12. B-HL1, B-HH1 ja B-Ly1 lähte-antikeha võrdlus. Andmed

demonstreerivad sidumisaktiivsuse puudumist B-HL1 konstruktsioonis ja umbes

poolt B-HH1 sidumisintensiivsusest/stöhhiomeetriast võrreldes B-Ly1. Nii B-HL1

kui ka B-HH1 on välja töötatud, tuginedes inimese VH1 klassist deriveeritud

aktseptori raamidele. Muude erinevuste hulgas on silmatorkavaks erinevuseks B-5

HL1 konstruktsiooni positsioon 71 (Kabat´ nummerdus), näidates selle eeldatavat

tähtsust antigeeni sidumise jaoks.

Joonis FIG 13. Anti-CD20 antikeha võimekuse fluorotsütomeetriline analüüs selle

antigeeni suhtes. Andmed demonstreerisid, et B-HL2 ja B-HL3 konstruktsioonid ei

ilmuta CD20 siduvat aktiivsust. 10

Joonis FIG 14. Anti-CD20 antikehade apoptoos Z-138 MCL rakkudel.

Joonis FIG 15. Anti-CD20 antikehade poolt esile kutsutud apoptoos. Analüüsi

detailid: 5 x 105 rakku/reservuaari kohta idustati 24-reservuaariga plaatidel

kultuursöötmes (5 x 105 rakku/ml kohta). Reservuaaridele lisati 10 mg vastavat

antikeha, PBS (negatiivne kontroll) või 5 mM kamptotetsiini ((CPT) positiivne 15

kontroll). Proove inkubeeriti üleöö (16 tundi), värviti AnnV-FITC abil ja analüüsiti

FACS. Analüüs sooritati kolmes korduses (*): lahutati ainult signaal PBS jaoks

(ainult PBS andis 8% ja 2% AnnV+ vastavalt PR1 ja Z-138 rakkude jaoks).

Kasutatud antikehadeks olid: C2B8 (kimäärne, glükomuundamata); BHH2-KV1

(inimese jaoks kohandatud, glükomuundamata). Märkus: see analüüs ei hõlma 20

võimalikke täiendavaid efektori rakke, vaid ainult märklaudrakke pluss antikeha või

kontrollvariandid.

Joonis FIG 16. Märklaud-rakkude hävitamine anti-CD20 antikehadega

immuunseid efektorrakke kasutades. Analüüsi detailid: B rakkude hulga

vähendamine terves täisveres koos üleöö kestva inkubatsiooniga ja CD 19+/CD3+ 25

analüüs FACS abil. ADCC koos PBMC kasutamine efektoritena, 4 tunni pikkune

inkubatsioon, efektori:märklaua suhe 25:1, märklaua hävitamist mõõdetakse

kaltseiini peetumisega, mis on relatiivne pesuvahendiga lahustusega (100%) ja

ilma antikeha lahustuseta (0%). Kasutatud antikehad: C2B8 (kimäärne

glükomuundamata vorm); BHH2-KV1-wt (BHH2-KV1 inimese jaoks kohandatud 30

EE - EP1692182 B1 23

glükomuundatud vorm); BHH2-KV1-GE (BHH2-KV1 inimese jaoks kohandatud

glükomuundatud vorm).

Joonis FIG 17. Modifitseerimata glükomuundamata BHH2-KV1 inimese jaoks

kohandatud IgG1 B-Ly1 inimese vastase CD20 antikeha PNGaasF-vabastatud Fc

oligosahhariidide MALDI/TOF-MS profiil. 5

Joonis FIG 18. Glükomuundatud BHH2-KV1g1 inimese jaoks kohandatud IgG1 B-

Ly1 inimese vastase CD20 antikeha PNGaasF-vabastatud Fc oligosahhariidide

MALDI/TOF-MS profiil. Glükomuundamine sooritati antikeha geenide

peremeesrakkude kaasavaldamise ja geeni kodeeriva ensüümiga, millel oli β-1,4-

N-atsetüülgükoosaminüültransferaas III (GnTIII) katalüütiline aktiivsus. 10

Joonis FIG 19. Glükomuundatud BHH2-KV1g2 inimese jaoks kohandatud IgG1 B-

Ly1 inimese vastase CD20 antikeha PNGaasF-vabastatud Fc oligosahhariidide

MALDI/TOF-MS profiil. Glükomuundamine sooritati antikeha geenide

peremeesrakkude kaasavaldamise ja geene kodeeriva ensüümiga, millel oli β-1,4-

N-atsetüülgükoosaminüültransferaas III (GnTIII) katalüütiline aktiivsus ja kodeeriva 15

ensüümiga, millel oli Golgi α-mannosidaas II katalüütiline aktiivsus.

Joonis FIG 20. Glükomuundamata ja glükomuundatud antikehade seondumine

inimese FcgammaRIIIa retseptoriga, näidatuna rekombinantsete CHO-CD 16

rakkude pinnal.

Joonis FIG 21. Fc muundamata ja Fc muundatud anti-CD20 antikehade apoptoos 20

Z-138 MCL rakkudel. Analüüsi detailid: 5 x 105 rakku/reservuaari kohta idustati

24-reservuaariga plaatidel kultuursöötmes (5 x 105 rakku/ml kohta).

Reservuaaridele lisati 10 mg vastavat antikeha või PBS (negatiivne kontroll).

Proove inkubeeriti üleöö (16 tundi), värviti AnnV-FITC abil ja analüüsiti FACS.

Analüüs sooritati kolmes korduses. Kasutatud antikehadeks olid: C2B8 = rituximab 25

(kimäärne glükomuundamata vorm, sarnane kaubanduslikult saadaval olevale

vormile); BHH2-KV1 (inimese jaoks kohandatud, glükomuundamata -

glükosüülimisprofiil on toodud joonisel Fig 6); BHH2-KV1g1 (inimese jaoks

kohandatud, glükomuundatud – glükosüülimisprofiil on toodud joonisel Fig. 7);

BHH2-KV1g2 (inimese jaoks kohandatud, glükomuundatud – glükosüülimisprofiil 30

EE - EP1692182 B1 24

on toodud joonisel Fig 8). Märkus: see analüüs ei hõlma võimalikke täiendavaid

efektorrakke, vaid ainult märklaudrakke pluss antikeha või kontrollvariandid. (*):

Ainult PBS jaoks mõõdetud signaal lahutatud.

LEIUTISE DETAILNE KIRJELDUS

Siin kasutatud mõisted omavad nende üldiselt kasutatavaid tähendusi v.a juhud, 5

kui allpool on defineeritud teisiti.

Siin kasutatuna hõlmab mõiste „antikeha“ täielikke antikeha molekule, k.a

monoklonaalsed, polüklonaalsed ja multispetsiifilised (näiteks bispetsiifilised)

antikehad, nagu ka Fc piirkonda omavad ja sidumisspetsiifilisust säilitavad

antikeha fragmendid ja fusioonvalgud, mis sisaldavad immunoglobuliini Fc 10

piirkonnaga samaväärset piirkonda ja säilitavad sidumisspetsiifilisuse. Samuti on

hõlmatud inimese jaoks kohandatud, primaatide jaoks kohandatud ja kimäärsed

antikehad.

Siin kasutatuna hõlmab mõiste „Fc piirkond“ IgG raske ahela C-otsa piirkonda.

Kuigi IgG raske ahela Fc piirkonna piirid võivad kergelt erineda, on inimese IgG 15

raske ahela Fc piirkond tavaliselt määratletud ulatuma positsioonil Cys226 olevast

aminohappejäägist karboksüül-otsani.

Siin kasutatuna on fraas „piirkond, mis on samaväärne immunoglobuliini Fc

piirkonnaga“ mõeldud hõlmama nii immunoglobuliini Fc piirkonna looduslikult

esinevaid alleelseid variante kui ka variante, millel esinevad asendusi, liitmisi või 20

deletsioone tootvad muudatused, mis ei vähenda samas põhimõtteliselt

immunoglobuliini võimet efektori funktsioone vahendada (näiteks antikehast sõltuv

rakuline tsütotoksilisus). Näiteks võib immunoglobuliini Fc piirkonna N-otsast või

C-otsast kustutada ühe või rohkema aminohappe ilma, et bioloogiline funktsioon

põhimõtteliselt kaoks. Sellised variandid võib valida vastavalt üldistele praktikas 25

teada olevatele reeglitele nii, et neil oleks minimaalne mõju aktiivsusele. (Vaadake

näiteks Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990).

Siin kasutatuna viitab fraas „antigeeni siduv molekul“ oma laiemais ulatuses

molekulile, mis seob spetsiifiliselt antigeenset determinanti. Täpsemalt, „antigeeni

siduv molekul, mis seob CD20" on molekul, mis seondub spetsiifiliselt rakupinna 30

EE - EP1692182 B1 25

glükosüülimata fosfovalguga (35 000 daltonit), mis on tavaliselt tähistatud kui

inimese B lümfotsüüdi diferentseerumist keelav antigeen Bp35 ehk CD20.

„Spetsiifilise sidumise“ all mõeldakse, et sidumine on antigeeni jaoks selektiivne ja

selle saab soovimatutest või mittespetsiifilistest vastastiktoimetest eristada.

Siin kasutatuna tähistavad mõisted „fusioon“ ja „kimäärne“, kasutatuna viitena 5

polüpeptiididele nagu ABM, polüpeptiide, mis sisaldavad kahest või rohkemast

heteroloogsest polüpeptiidist (näiteks erinevate liikide antikehade osad)

deriveeritud aminohappejärjestusi. Kimäärsete ABM jaoks võivad antigeeni

mittesiduvad komponendid olla deriveeritud suurest hulgast erinevatest liikidest,

k.a primaadid nagu šimpansid ja inimesed. Kimäärse ABM konstantne piirkond on 10

kõige eelistatumalt üldiselt identne looduslikult esineva inimese antikeha

konstantse piirkonnaga; kimäärse antikeha varieeruv piirkond on kõige

eelistatumalt üldiselt identne rekombinantse anti-CD20 antikeha, millel on hiire B-

Ly1 varieeruva piirkonna aminohappejärjestus, vastava piirkonnaga. Fusioon- või

kimäärse antikeha eriti eelistatud vormiks on inimese jaoks kohandatud antikehad. 15

Siin kasutatuna viitab fraas "GnTIII aktiivsust omav polüpeptiid“ polüpeptiididele,

mis on võimelised katalüseerima N-atsetüülglükoosamiini (GlcNAc) jäägi β-1-4

ahelduses lisamist N-aheldatud oligosahhariidide trimannosüültuuma β-aheldatud

mannosiidile. See hõlmab fusioonpolüpeptiide, mille poolt avaldatud ensümaatiline

aktiivsus on sarnane, kuid mitte ilmtingimata identne, β(1,4)-N-20

atsetüülglükoosaminüültransferaasile III, mis on samuti teada kui β-1,4-

mannosüülglükovalgu 4-beeta-N-atsetüülglükoosaminüül-transferaas ((EC

2.4.1.144) vastavalt asutuse Nomenclature Committee of the International Union

of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) nomenklatuurile), mõõdetuna

konkreetses bioloogilises analüüsis koos või ilma doosist sõltuvuseta. Juhul kui 25

eksisteerib doosist sõltuvus, ei pea see olema identne GnTIII, vaid pigem üldiselt

sarnane esitatud aktiivsuse doosist sõltuvusele võrreldes GnTIII (s.t, et

potentsiaalne polüpeptiidi kandidaat avaldab suuremat aktiivsust või mitte rohkem

kui umbes 25 korda väiksemat ja eelistatult mitte rohkem kui umbes 10 korda

väiksemat ja kõige eelistatumalt mitte rohkem kui umbes kolm korda väiksemat 30

aktiivsust kui GnTIII).

EE - EP1692182 B1 26

Siin kasutatuna viitab mõiste „variant (või analoog)“ polüpeptiidile, mis erineb

leiutise konkreetselt sõnastatud polüpeptiidist aminohappe insertsioonide,

deletsioonide ja asenduste tõttu ja nimetatud muutused on loodud, kasutades

näiteks rekombinantse DNA tehnikaid. Käesoleva leiutise ABM variandid

hõlmavad kimäärseid, primaatide jaoks kohandatud või inimese jaoks kohandatud 5

antigeeni siduvaid molekule, kus üks või rohkema aminohappejääkidest on

modifitseeritud läbi asenduse, lisamise ja/või deletsiooni viisil, et see ei mõjuta

oluliselt antigeeni (nagu CD20) sidumisafiinsust. Määramisel, millised

aminohappejäägid võib asendada, lisada või kustutada ilma huvi pakkuvaid

aktiivsusi kõrvaldamata, võib juhinduda andmetest, mis saadakse konkreetse 10

polüpeptiidi järjestuse võrdlemisel homoloogsete peptiidide järjestustega ja

minimeerides suure homoloogiaga piirkondades (konserveeritud piirkonnad)

sooritatud aminohappejärjestuste muutuste arvu või asendades aminohapped

konsensusjärjestusega.

Alternatiivina võib neid samu või sarnaseid polüpeptiide kodeerivad 15

rekombinantsed variandid sünteesida või valida, kasutades ära geneetilise koodi

„liigsust“. Et optimeerida kloonimist plasmiidi või viiruse vektorisse või

ekspressiooni konkreetses prokarüootses või eukarüootses süsteemis, võib

sisestada erinevaid koodoni asendusi, näiteks erinevaid restriktsioonisaite

tekitavad vaiksed muutused. Polünukleotiidi järjestuses toimuvad mutatsioonid 20

võivad peegelduda polüpeptiidis või polüpeptiidile lisatud muude peptiidide

domeenides, mis lisatakse polüpeptiidi mistahes osa omaduste

modifitseerimiseks, muutes seeläbi omadusi nagu ligandiga seondumise afiinsus,

ahelasisesed afiinsused või degradatsiooni/pöördumise tase.

Eelistatult luuakse aminohappe „asendused“, asendades ühe aminohappe teise 25

aminohappega, millel on sarnased struktuursed ja/või keemilised omadused (s.t

konservatiivsed aminohappe asendused). „Konservatiivsed“ aminohappe

asendused võib sooritada, tuginedes sarnasusele polaarsuses, laengus,

lahustuvuses, hüdrofoobsuses, hüdrofiilsuses ja/või kaasatud jääkide amfipaatsel

loomusel. Näiteks mittepolaarseteks (hüdrofoobseteks) aminohapeteks on alaniin, 30

leutsiin, isoleutsiin, valiin, proliin, fenüülalaniin, trüptofaan ja metioniin;

polaarseteks neutraalseteks aminohapeteks on glütsiin, seriin, treoniin, tsüsteiin,

EE - EP1692182 B1 27

türosiin, asparagiin ja glutamiin; positiivse laenguga (aluselisteks) aminohapeteks

on arginiin, lüsiin ja histidiin; ja negatiivse laenguga (happelisteks) aminohapeteks

on asparagiinhape ja glutaamhape. „Insertsioonid“ või „deletsioonid“ jäävad

eelistatult vahemikku umbes 1 kuni 20 aminohapet ja eelistatumalt 1 kuni 10

aminohapet. Lubatud variatsiooni võib määrata katsete abil, sooritades 5

rekombinantse DNA tehnikate abil süstemaatiliselt polüpeptiidi molekulis

aminohapete insertsioone, deletsioone või asendusi ning analüüsides

moodustunud rekombinantsete variantide aktiivsust.

Siin kasutatuna viitab mõiste „inimese jaoks kohandatud“ antigeeni siduvale

molekulile, mis on deriveeritud inimeselt mittepärinevast antigeeni siduvast 10

molekulist nagu hiire antikeha ja mis säilitab või säilitab üldiselt lähtemolekuli

antigeeni siduvad omadused, kuid ei ole inimestele nii immunogeenne. Selle

kohandamise võib sooritada erinevate meetoditega, k.a (a) kogu inimeselt

mittepärineva domeeni siirdamine inimese konstantsetele piirkondadele, luues

seeläbi kimäärsed antikehad; (b) ainult inimeselt mittepärinevate CDR siirdamine 15

inimese raamile ja konstantsetele piirkondadele koos või ilma kriitiliste raami

jääkide säilitamiseta (näiteks jäägid, mis on olulised hea antigeeni sidumise

afiinsuse või antikeha funktsioonide säilitamiseks); või (c) kogu inimeselt

mittepärineva domeeni siirdamine, kuid „varjates“ selle läbi pinnajääkide

asendamise inimesesarnase sektsiooniga. Sellised meetodid on avaldatud 20

järgnevates allikates - Jones et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-

6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al.,

Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991);

Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994). Antikeha igas raske ja kerge ahela

varieeruvas domeenis on üldiselt 3 komplementaarsust määravat piirkonda ehk 25

CDR (CDR1, CDR2 ja CDR3), mis külgnevad igas antikeha raske ja kerge ahela

varieeruvas domeenis nelja raami alampiirkonnaga (s.t FR1, FR2, FR3 ja FR4).

Näiteks FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Arutelu inimese jaoks

kohandatud antikehade üle on toodud inter alia USA patendis nr. 6 632 927 ja

publitseeritud USA patenditaotluses nr. 2003/0175269. 30

Siin kasutatuna viitab mõiste „primaatide jaoks kohandatud“ antigeeni siduvale

molekulile, mis on deriveeritud primaadilt mittepärinevast antigeeni siduvast

EE - EP1692182 B1 28

molekulist nagu hiire antikeha ja mis säilitab või säilitab üldiselt lähtemolekuli

antigeeni siduvad omadused, kuid ei ole primaatidele nii immunogeenne.

Juhul, kui mõiste jaoks eksisteerib kaks või rohkem praktikas kasutatavat ja/või

aktsepteeritavat definitsiooni, on siin kasutatud mõiste definitsioon mõeldud

hõlmama juhul, kui ei ole väidetud vastupidist, kõiki selliseid tähendusi. 5

Konkreetseks näiteks on mõiste „komplementaarsust määrav piirkond“ („CDR“)

kasutamine nii raske kui ka kerge ahela polüpeptiidi varieeruvas piirkonnas

leiduvate piirnematute antigeeni kombineerivate saitide kirjeldamiseks. Seda

konkreetset piirkonda on kirjeldanud Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human

Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) ja Chothia et 10

al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), kus definitsioonid hõlmavad võrdlemisel

kattumist või aminohappejääkide alamkomplekte. Kuid hoolimata sellest jäävad

mõlemad definitsioonid antikeha või selle variantide CDR defineerimisel siin

defineeritud ja kasutatud mõiste piiridesse. Järgnevas tabelis I on võrdluseks

toodud sobivad aminohappejäägid, mis hõlmavad eelnevalt tsiteeritud viidetes 15

defineeritud CDR. Konkreetset CDR hõlmavate täpsete jääkide numbrid erinevad

sõltuvalt CDR järjestusest ja suurusest. Valdkonnas kogenud isikud on võimelised

antikeha varieeruva piirkonna aminohappejärjestuse abil hõlpsasti määrama,

millised jäägid konkreetset CDR sisaldavad.

TABEL 1. CDR definitsioonid1 20

Kabat Chothia AbM

VH CDR1 31-35 26-32 26-35

VH CDR2 50-65 52-58 50-58

VH CDR3 95-102 95-102 95-102

VL CDR1 24-34 26-32

VL CDR2 50-56 50-52

VL CDR3 89-97 91-96 1Kõikide CDR definitsioonide nummerdus tabelis 1 vastab Kabat et al. poolt

kehtestatud nummerdusreeglitele. (vaadake allpool).

EE - EP1692182 B1 29

Kabat et al. defineerisid samuti nummerdussüsteemi varieeruva domeeni

järjestustele, mis on rakendatav mistahes antikeha jaoks. Valdkonnas kogenud

isik suudab seda „Kabat nummerduse“ süsteemi üheselt mistahes varieeruva

domeeni järjestusega rakendada, tuginemata selleks muudele katseandmetele kui

järjestusele endale. Siin kasutatuna viitab „Kabat nummerdus“ 5

nummerdussüsteemile, mida on kirjeldatud Kabat et al., poolt teoses U.S. Dept. of

Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest"

(1983). Juhul kui ei ole teisiti välja toodud, on konkreetsete aminohappejärjestuste

positsioonide nummerdus ABM toodud vastavalt Kabat nummerdussüsteemile.

Järjestused järjestuste loendis (s.t SEQ ID NO: 1 kuni SEQ ID NO: 78) ei ole 10

nummerdatud vastavalt Kabat nummerdussüsteemile.

Nukleiinhappe või polünukleotiidi, mille nukleotiidjärjestus on vähemalt näiteks

95% ulatuses "identne" käesoleva leiutise viitenukleotiidjärjestusega, all on

mõeldud, et polünukleotiidi nukleotiidjärjestus on identne viitejärjestusega v.a see,

et polünukleotiidi järjestus võib sisaldada iga 100 viitenukleotiidjärjestuse 15

nukleotiidi kohta kuni viis punktmutatsiooni. Teiste sõnadega, polünukleotiidi

valmistamiseks, mille nukleotiidjärjestus on vähemalt 95% ulatuses identne

viitenukleotiidjärjestusega, võib kuni 5% viitejärjestuse nukleotiididest kustutada

või muu nukleotiidiga asendada või võib viitejärjestusse sisestada teatud hulga

nukleotiide, mis moodustab kuni 5% viitejärjestuse kogunukleotiididest. 20

Kõnealuseks järjestuseks võib olla kogu joonisel FIG. 24 või FIG. 25 näidatud

järjestus.

Selle, kas mingi konkreetne nukleiinhappe molekul või polüpeptiid on vähemalt

80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% või 99% ulatuses identne käesoleva

leiutise nukleotiidjärjestuse või polüpeptiidjärjestusega, saab määrata teada 25

olevaid arvutiprogramme kasutades. Eelistatud meetodiks parima üldise sobivuse

määramiseks päringjärjestuse (käesoleva leiutise järjestus) ja märklaudjärjestuse

vahel (nimetatud ka globaalseks järjestuste reastamiseks) on arvutiprogrammi

FASTDB kasutamine, mis põhineb Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245

(1990) algoritmil. Järjestuse reastamisel on päring- ja märklaudjärjestus mõlemad 30

DNA järjestused. RNA järjestust saab võrrelda, muundades U-d T-deks.

Nimetatud globaalse järjestuse reastamise tulemuseks on identsusprotsent.

EE - EP1692182 B1 30

Eelistatud parameetriteks identsusprotsendi arvutamiseks DNA järjestuste

FASTDB reastustes on: maatriks = ühtne, k-tuple = 4, puuduva kokkulangevuse

miinus = 1, ühinemismiinus = 30, randomiseerimisrühma pikkus = 0,

tükeldamisskoor = 1, vahe miinus = 5, vahe suuruse miinus = 0,05, akna suurus =

500 või märklaud-nukleotiidjärjestuse pikkus (kasutatakse lühemat). 5

Kui märklaudjärjestus on päringjärjestusest lühem 5´ või 3´ deletsioonide, mitte

sisemiste deletsioonide tõttu, tuleb tulemusi käsitsi korrigeerida. See on tingitud

asjaolust, et FASTDB programm ei arvesta identsusprotsendi arvutamisel

märklaudjärjestuse 5´ ja 3´ lühendusi. 5´ või 3´ otsas lühendatud (päringjärjestuse

suhtes) märklaudjärjestuste korral parandatakse identsusprotsenti, arvutades 10

päringjärjestuse aluste arvu, mis on märklaudjärjestuse 5´ ja 3´ ning mis ei ole

ühildunud/reastatud, kui kogu aluste protsendi päringjärjestuses. Selle, kas

nukleotiid on ühilduv/reastatud, saab määrata FASTDB järjestuse reastamise

tulemuste alusel. See protsent lahutatakse seejärel eelnevalt mainitud FASTDB

programmiga täpsustatud parameetreid kasutades arvutatud identsusprotsendist, 15

saades seeläbi lõpliku identsusprotsendi. Seda korrigeeritud tulemust kasutatakse

käesoleva leiutise eesmärkidel. Identsusprotsendi käsitsi korrigeerimisel

arvutatakse ainult alused, mis on väljapool märklaudjärjestuse 5´ ja 3´ aluseid,

kuvatuna FASTDB järjestuses kui päringjärjestusega mitte ühilduvad/reastatud.

Näiteks reastatakse identsusprotsendi määramiseks 90 alusega märklaudjärjestus 20

100 alusega päringjärjestuse suhtes. Deletsioon toimub märklaudjärjestuse 5´

otsas ja seega ei näita FASTDB reastus 5´ otsa esimese 10 aluse

sobivust/reastust. 10 paaritut alust kujutavad 10% järjestusest (aluste arv 5´ ja 3´

otstes, mis ei ühildu/päringjärjestuse aluste koguarv), seega lahutatakse 10%

FASTDB programmi poolt arvutatud identsusprotsendist. Kui ülejäänud 90 alust 25

ühtiks ideaalselt, oleks lõplikuks identsusprotsendiks 90%. Ühes muus näites

võrreldakse samuti 90 alusega märklaudjärjestust 100 alusega päringjärjestusega.

Sellel korral on deletsioonideks sisemised deletsioonid, seega alused, mis ei ole

päringjärjestusega ühtivad/reastatud, ei asu 5´ ja 3´ otstes. Käesoleval juhul

FASTDB abil arvutatud identsusprotsendi käsitsi ei korrigeerita. Ka sellel korral 30

korrigeeritakse käsitsi ainult märklaudjärjestuse 5´ ja 3´ aluseid, mis ei ole

EE - EP1692182 B1 31

päringjärjestusega sobivad/reastatud. Käesoleva leiutise eesmärkidel täiendavaid

käsitsi parandamisi ei sooritata.

Polüpeptiidi, mille aminohappejärjestus on vähemalt näiteks 95% ulatuses

„identne“ käesoleva leiutise päring-aminohappejärjestusega, all mõeldakse, et

märklaud-polüpeptiidi aminohappejärjestus on identne päringjärjestusega, v.a see, 5

et märklaud-polüpeptiidjärjestus võib sisaldada kuni viit aminohappe muutust

päring-aminohappejärjestuse iga 100 aminohappe kohta. Teiste sõnadega,

polüpeptiidi, mille aminohappejärjestus on vähemalt 95% ulatuses identne päring-

aminohappejärjestusega, valmistamiseks võib kuni 5% märklaudjärjestuse

aminohappejääkidest sisestada, kustutada või muu aminohappega asendada. 10

Need viitejärjestuse muutused võivad toimuda viiteaminohappejärjestuse amino-

või karboksüotsade positsioonidel või mistahes punktis nende kahe otsa vahel,

vaheldudes kas individuaalselt viitejärjestuse jääkide hulgas või ühes või

rohkemas viitejärjestusega külgnevas rühmas.

Selle, kas mingi konkreetne polüpeptiid on vähemalt 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 15

97%, 98% või 99% ulatuses viitepolüpeptiidiga identne, saab määrata teada

olevaid arvutiprogramme kasutades. Eelistatud meetodiks parima üldise sobivuse

määramiseks päringjärjestuse (käesoleva leiutise järjestus) ja märklaudjärjestuse

vahel (nimetatud ka globaalseks järjestuste reastamiseks), on arvutiprogrammi

FASTDB kasutamine, mis põhineb Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 20

(1990) algoritmil. Järjestuse reastamisel on päring- ja märklaudjärjestus mõlemad

nukleotiidjärjestused või aminohappejärjestused. Nimetatud globaalse järjestuste

reastamise tulemuseks on identsusprotsent. FASTDB aminohappe reastamise

eelistatud parameetriteks on: maatriks = PAM 0, k-tuple = 2, puuduva

kokkulangevuse miinus = 1, ühinemismiinus = 20, randomiseerimisrühma pikkus = 25

0, tükeldamisskoor = 1, akna suurus = järjestuse pikkus, vahe miinus = 5, vahe

suuruse miinus = 0,05, akna suurus = 500 või märklaud-nukleotiidjärjestuse pikkus

(kasutatakse lühemat).

Kui märklaudjärjestus on päringjärjestusest lühem N- või C-otsa deletsioonide,

mitte sisemiste deletsioonide tõttu, tuleb tulemusi käsitsi parandada. See on 30

tingitud asjaolust, et FASTDB programm ei arvesta üldise identsusprotsendi

arvutamisel märklaudjärjestuse N- ja C-otsa lühendusi. N- ja C-otsas lühendatud

EE - EP1692182 B1 32

(päringjärjestuse suhtes) märklaudjärjestuste korral parandatakse

identsusprotsenti, arvutades päringjärjestuse aluste arvu, mis on

märklaudjärjestuse N- ja C-otsas ning mis ei ole vastava märklaudjäägiga

ühildunud/reastatud, kui kogu aluste protsendi kõnealuses järjestuses. Selle, kas

jääk on ühilduv/reastatud, saab määrata FASTDB järjestuste reastamise 5

tulemuste alusel. See protsent lahutatakse seejärel eelnevalt mainitud FASTDB

programmiga täpsustatud parameetreid kasutades arvutatud identsusprotsendist,

saades seeläbi lõpliku identsusprotsendi. Seda lõplikku identsusprotsenti

kasutatakse käesoleva leiutise eesmärkidel. Identsusprotsendi käsitsi

parandamisel arvestatakse ainult jääkidega, mis seonduvad märklaudjärjestuse N- 10

ja C-otsaga ja ei sobi/reastu päringjärjestusega. See tähendab, et kasutatakse

ainult päringjäägi positsioone, mis jäävad väljapoole märklaudjärjestuse

kaugeimaid N- ja C-otsa jääke.

Näiteks reastatakse identsusprotsendi määramiseks 90 aminohappejäägiga

märklaudjärjestus 100 jäägiga päringjärjestusega. Deletsioon toimub 15

märklaudjärjestuse N-otsas ja seega ei näita FASTDB reastamine N-otsa esimese

10 jäägi sobivust/reastust. 10 paaritut jääki kujutavad 10% järjestusest (jääkide arv

N- ja C-otstes, mis ei ühildu/päringjärjestuse jääkide koguarv) nii, et 10%

lahutatakse FASTDB programmi poolt arvutatud identsusprotsendist. Kui

ülejäänud 90 jääki ühtiks ideaalselt, oleks lõplikuks identsusprotsendiks 90%. 20

Ühes muus näites võrreldakse 90 jäägiga märklaudjärjestust 100 jäägiga

päringjärjestusega. Sellel korral on deletsioonideks sisemised deletsioonid nii, et

jäägid, mis ei ole päringjärjestusega ühtiv/reastatud, ei asu N- ja C-otstes.

Käesoleval juhul FASTDB abil arvutatud identsusprotsendi käsitsi ei korrigeerita.

Ka sellel korral parandatakse käsitsi ainult FASTDB reastamise poolt kuvatud 25

märklaudjärjestuse N- ja C-otstest väljapool olevaid jäägipositsioone, mis ei

sobi/reastu päringjärjestusega. Käesoleva leiutise eesmärkidel täiendavat käsitsi

parandamist ei sooritata.

Siin kasutatuna viitab nukleiinhape, mis „hübidiseerub rangetel tingimustel“ leiutise

nukleiinhappejärjestuseks, polünukleotiidile, mis hübridiseerub öö läbi kestval 30

inkubeerimisel temperatuuril 42 oC lahuses, mis sisaldab 50% formamiidi, 5 x SSC

(750 mM NaCl, 75 mM naatriumtsitraati), 50 mM naatriumfosfaati (pH 7,6), 5 x

EE - EP1692182 B1 33

Denhardti lahust, 10% dekstraansulfaati ja 20 mg/ml kohta denatureeritud nihkega

lõhe sperma DNA, ja sellele järgneva filtrite pesemisega 0,1 x SSC temperatuuril

umbes 65 oC.

Siin kasutatuna viitab mõiste „Golgi lokalisatsiooni domeen“ Golgi resistentse

polüpeptiidi aminohappejärjestusele, mis põhjustab polüpeptiidi ankurdamise Golgi 5

kompleksis. Tavaliselt sisaldavad lokalisatsiooni domeenid ensüümi aminootsa

„sabasid“.

Siin kasutatuna viitab mõiste „efektori funktsioon“ neile bioloogilistele aktiivsustele,

mis on omistatavad antikeha Fc piirkonnale (loodusliku järjestuse Fc piirkond või

aminohappejärjestuse variandi Fc piirkond). Antikeha efektori funktsioonide näited 10

hõlmavad, olemata samas nendega piiratud, Fc retseptori sidumisafiinsust,

antikehast sõltuvat rakulist tsütotoksilisust (ADCC), antikehast sõltuvat rakulist

fagotsütoosi (ADCP), tsütokiini eritumist, immuunkompleksi vahendatud

antigeenide omastamist antigeene kujutavate rakkude poolt, rakupinna retseptorite

mahareguleerimist jne. 15

Siin kasutatuna viitavad mõisted „muundama“, “muundatud“, „muundamine“ ja

glükomuundatud“ looduslikult esineva või rekombinantse polüpeptiidi või selle

fragmendi glükosüülimismustri mistahes manipuleerimisele. Glükomuundamine

hõlmab raku glükosüülimissüsteemi metaboolset muundamist, k.a oligosahhariidi

sünteesiradade geneetilised manipulatsioonid, et võimaldada rakkudes avaldatud 20

glükovalkude muudetud glükosüülimisprofiili. Lisaks hõlmab glükomuundamine

mutatsioonide ja rakukeskkonna toimeid glükosüülimisel.

Siin kasutatuna hõlmab mõiste "peremeerakk" mistahes rakusüsteemi, mida saab

käesoleva leiutise polüpeptiidide ja antigeeni siduvate molekulide valmistamiseks

muundada. Ühes teostuses muundatakse peremeesrakku modifitseeritud 25

glükovormidega antigeeni siduva molekuli tootmise võimaldamiseks. Ühes

eelistatud teostuses on antigeeni siduvaks molekuliks antikeha, antikeha fragment

või fusioonvalk. Teatud teostustes on peremeerakke manipuleeritud täiendavalt

ühe või rohkema GnTIII aktiivsusega polüpeptiidi kõrgematel tasemetel

avaldamiseks. Peremeesrakkudeks võivad olla kultuuristatud rakud, näiteks 30

imetaja kultuuristatud rakud, P3X63 hiire müeloomi rakud, PER rakud, PER.C6

EE - EP1692182 B1 34

rakud või hübridoomrakud, pärmirakud, putukarakud ja taimerakud ning samuti

transgeensete loomade, transgeensete taimede või kultuurtaimede või loomade

kudede rakud.

Siin kasutatuna tähistab mõiste „Fc vahendatud rakuline tsütotoksilisus“ antikehast

sõltuvat rakulist tsütotoksilisust ja inimese Fc piirkonda sisaldava lahustuva Fc 5

fusioonvalgu poolt vahendatud rakulist tsütotoksilisust. See on

immuunsusmehhanism, mis viib „antikehade märklaud-rakkude“ lahustumiseni

„inimese immuunefektorrrakkude“ poolt, kus:

„inimese immuunefektorrakkudeks“ on leukotsüütide populatsioon, mis avaldab

oma pinna Fc retseptoreid, läbi mille need antikehade või Fc fusioonvalkude Fc 10

piirkonnaga seonduvad ja efektori funktsioone sooritavad. Selline populatsioon

võib hõlmata, olemata samas nendega piiratud, perifeerse vere mononukleaarseid

rakke (PBMC) ja/või looduslikke tappurrakke (NK).

„Antikehade märklaud-rakkudeks" on rakud, mida seotakse antikehade või Fc

fusioonvalkude poolt. Antikehad või Fc fusioonvalgud seonduvad märklaud-15

rakkude Fc piirkonnaga läbi valgu N-otsa.

Siin kasutatuna viitab mõiste „suurenenud Fc vahendatud rakuline tsütotoksilisus“

kas "antikeha märklaud-rakkude", mis teatud aja jooksul teatud antikeha või Fc

fusioonvalgu kontsentratsioonil märklaud-rakke ümbritsevas keskkonnas eelnevalt

kirjeldatud Fc vahendatud rakulise tsütotoksilisuse mehhanismiga lahustatakse, 20

arvu suurenemisele ja/või antikeha või Fc fusioonvalgu kontsentratsiooni

vähenemisele märklaudrakke ümbritsevas keskkonnas, mis on vajalik teatud arvu

"antikeha märklaud-rakkude" lahustamiseks teatud aja jooksul Fc vahendatud

rakulise tsütotoksilisuse mehhanismi abil. Fc vahendatud rakulise tsütotoksilisuse

suurenemine sõltub sama antikeha või Fc fusioonvalgu poolt vahendatud 25

rakulisest tsütotoksilisusest, mis toodetakse sama tüüpi peremeerakkude poolt

samade standardsete valdkonnas kogenud isikutele teada olevate tootmis-,

puhastamis-, moodustamis- ja hoiustamismeetoditega, kuid mis ei ole tekitatud

peremeesrakkude poolt, mida on muundatud siin kirjeldatud meetoditega

glükosüültransferaas GnTIII avaldamiseks. 30

EE - EP1692182 B1 35

„Antikeha, millel on suurenenud antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus (ADCC)“

all mõeldakse siin defineeritud antikeha, mille ADCC on suurenenud; ADCC

suurenemine määratakse mistahes sobiva valdkonnas tavapäraseid oskusi

omavale isikule teada oleva meetodiga. Üks aktsepteeritud in vitro ADCC analüüs

toimub järgneval viisil: 5

1) analüüsis kasutatakse märklaud-rakke, mis teatakse avaldavat märklaud-

antigeeni, mis omakorda on tuvastatav antikeha antigeeni siduva piirkonna poolt;

2) analüüsis kasutatakse efektorrakkudena inimese perifeerse vere

mononukleaarseid rakke (PBMC), mis on eraldatud suvaliselt valitud terve doonori

verest; 10

3) analüüs sooritatakse vastavalt järgnevale protokollile:

i) PBMC eraldatakse standardtihedusega tsentrifuugimisprotseduuridega ja

suspendeeritakse tasemel 5 x 106 rakku/ml kohta RPMI rakukultuuri söötmes;

ii) märklaud-rakke kasvatatakse standardsete koekultuuri meetoditega, kogutakse

eksponentsiaalses kasvufaasis kus elujõud on suurem kui 90%, pestakse RPMI 15

rakukultuuri söötmega, märgistatakse 100 mikrokürii 51Cr, pestakse kaks korda

rakukultuuri söötmega ja suspendeeritakse uuesti rakukultuuri söötmes

tihedusega 105 rakku/ml kohta;

iii) 96-reservuaariga mikrotiitrimisplaadi igasse reservuaari viiakse 100 mikroliitrit

eelnevalt kirjeldatud lõplikku märklaud-raku suspensiooni; 20

iv) antikeha lahjendatakse rakukultuuri söötmes seeriaviisiliselt 4000 ng/ml juurest

0,04 ng/ml juurde ja saadud antikehalahused lisatakse 96-reservuaariga

mikrotiitrimisplaadis olevatele märklaud-rakkudele, testides erinevaid antikeha

kontsentratsioone, mis katavad kogu eelnevalt toodud kontsentratsiooni-

vahemikku, kolmes korduses; 25

v) maksimaalse vabanemise (MR) kontrollvariantideks lisatakse plaadi, mis

sisaldab märgistatud märklaud-rakke, 3 täiendavasse reservuaari antikeha lahuse

asemel (eelnev punkt iv) 50 mikroliitrit 2% (V/V) mitteioonse pesuaine (Nonidet,

Sigma, St. Louis) vesilahust;

vi) spontaanse vabanemise (SR) kontrollvariantideks lisatakse plaadi, mis sisaldab 30

märgistatud märklaud-rakke, 3 täiendavasse reservuaari antikeha lahuse asemel

(eelnev punkt iv) 50 mikroliitrit RPMI rakukultuuri söödet;

EE - EP1692182 B1 36

vii) 96-reservuaariga mikrotiitrimisplaati tsentrifuugitakse seejärel 1 minut kiirusel

50 x g ja inkubeeritakse 1 tund temperatuuril 4 oC;

viii) igale reservuaarile lisatakse 50 mikroliitrit PBMC suspensiooni (eelnev punkt

i), saades seeläbi efektori:märklaud-raku suhteks 25:1; plaadid viiakse 4 tunniks

temperatuuril 37 oC inkubaatorisse, kus valitseb 5% CO2 atmosfäär; 5

ix) iga reservuaari rakuvaba ülemine vedelikukiht kogutakse ja eksperimentaalne

vabanenud radioaktiivsus (ER) määratakse gammaloenduriga;

x) iga antikeha kontsentratsiooni spetsiifilise lahustuse protsent arvutatakse

valemiga (ERMR)/(MR-SR) x 100, kus ER on keskmine mõõdetud radioaktiivsus

(punkt ix), MR on keskmine mõõdetud radioaktiivsus (punkt ix) MR 10

kontrollvariantidele (punkt v) ja SR on keskmine mõõdetud radioaktiivsus (punkt ix)

SR kontrollvariantidele (punkt vi);

4) „suurenenud ADCC“ on defineeritud kui eelnevalt testitud antikeha

kontsentratsioonivahemikus vaadeldud spetsiifilise lahustuse maksimaalne

protsent ja/või antikeha kontsentratsiooni vähenemine, mis on vajalik poole 15

eelnevalt testitud antikeha kontsentratsioonivahemikus vaadeldud spetsiifilise

lahustuse maksimaalse protsendi saavutamiseks. ADCC suurenemine on seotud

eelnevalt kirjeldatud analüüsiga mõõdetud ADCC, vahendatuna sama antikehaga,

toodetuna sama tüüpi peremeesrakkudega ning kasutades samasid valdkonnas

kogenud isikutele teada olevaid standardseid tootmis-, puhastamis-, 20

moodustamis- ja hoiustamismeetodeid; samas ei ole nimetatud ADCC tekitatud

peremeesrakkude poolt, mida on muundatud GnTIII üleavaldamiseks.

Ühes teostuses seondub käesolev leiutis antigeeni siduvate molekulidega, millel

on hiire B-Ly1 antikeha sidumisspetsiifilisus ja avastusega, et nende efektori

funktsioone saab parandada läbi muudetud glükosüülimise. Ühes teostuses on 25

antigeeni siduvaks molekuliks kimäärne antikeha. Üks eelistatud teostus seondub

kimäärse antikeha või selle fragmendiga, mis sisaldab joonisel Fig 7 näidatud

CDR. Täpsemalt, ühes eelistatud teostuses seondub leiutis eraldatud

polünukleotiidiga, mis sisaldab: (a) järjestust, mis on valitud rühmast, kuhu

kuuluvad: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ja SEQ ID NO. 7 (CDR VH-1); ja (b) 30

järjestust, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22

ja SEQ ID NO: 23 (CDR VH-2); ning SEQ ID NO: 24. Veel üks eelistatud teostus

EE - EP1692182 B1 37

seondub eraldatud polünukleotiidiga, mis sisaldab SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ja

SEQ ID NO: 10 (CDR VL). Ühes teostuses kodeerib vähemalt üks nendest

polünukleotiididest fusioonpolüpeptiidi.

Ühes muus teostuses sisaldab antigeeni siduv molekul joonisel Fig 1 näidatud

hiire B-Ly1 antikeha või selle variandi VH domeeni; ja hiirelt mittepärinevat 5

polüpeptiidi. Ühes muus eelistatud teostuses sisaldab antigeeni siduv molekul

joonisel Fig 2 näidatud hiire B-Ly1 antikeha või selle variandi VL domeeni; ja hiirelt

mittepärinevat polüpeptiidi.

Ühes muus teostuses koosnevad antigeeni siduvad molekulid ühest või rohkemast

B-Ly1 lühendatud CDR. Sellised lühendatud CDR sisaldavad minimaalselt antud 10

CDR spetsiifilisust määravaid aminohappejääke. "Spetsiifilisust määrav jääk“

tähistab neid jääke, mis on otseselt antigeeni vastastikmõjuga seotud. Üldiselt

osalevad ainult umbes 1/5 kuni 1/3 antud CDR olevatest jääkidest antigeeniga

seondumisel. Konkreetse CDR spetsiifilisust määravad jäägid saab näiteks

tuvastada, arvutades kolmemõõtmelise mudeli abil aatomitevahelised kontaktid ja 15

määrates antud jäägi positsioonil järjestuste varieeruvuse, kasutades selleks

meetodeid, mida on kirjeldanud Padlan et al., FASEB J 9(1):133-139 (1995).

Seega avaldatakse eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab vähemalt ühte hiire B-

Ly1 antikeha või selle variandi või lühendatud vormi komplementaarsust määravat

piirkonda, mis omakorda sisaldab vähemalt nimetatud komplementaarsust 20

määrava piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke; nimetatud eraldatud

polünukleotiid kodeerib fusioonpolüpeptiidi. Eelistatult kodeerivad sellised

eraldatud polünukleotiidid fusioonpolüpeptiidi, milleks on antigeeni siduv molekul.

Ühes teostuses koosneb polünukleotiid kolmest hiire B-Ly1 antikeha või selle

variantide või lühendatud vormide komplementaarsust määravast piirkonnast, mis 25

sisaldavad vähemalt iga nimetatud kolme komplementaarsust määrava piirkonna

spetsiifilisust määravaid jääke. Ühes muus teostuses kodeerib polünukleotiid kogu

kimäärse (näiteks inimese jaoks kohandatud) antikeha kerge või raske ahela

varieeruvat piirkonda. Leiutis seondub täiendavalt selliseid polünukleotiide

kodeerivate polüpeptiididega. 30

EE - EP1692182 B1 38

Ühes muus teostuses sisaldab antigeeni siduv molekul vähemalt ühte hiire B-Ly1

antikeha või selle variandi või lühendatud vormi komplementaarsust määravat

piirkonda, mis omakorda sisaldab vähemalt nimetatud komplementaarsust

määrava piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke ja järjestust, mis on deriveeritud

heteroloogsest polüpeptiidist. Ühes teostuses koosneb antigeeni siduv molekul 5

kolmest hiire B-Ly1 antikeha või selle variantide või lühendatud vormide

komplementaarsust määravast piirkonnast, mis sisaldavad vähemalt iga nimetatud

kolme komplementaarsust määrava piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke. Ühes

muus teostuses koosneb antigeeni siduv molekul antikeha kerge või raske ahela

varieeruvast piirkonnast. Ühes eriti kasulikus teostuses on antigeeni siduvaks 10

molekuliks kimäärne (näiteks inimese jaoks kohandatud) antikeha. Samuti

avaldatakse meetodid selliste antigeeni siduvate molekulide valmistamiseks ja

nende kasutamiseks haiguste, k.a B raku lümfoomid, ravimisel.

On teada, et anti-CD20 terapeutilist toimet mõjutavad mitmed mehhanismid, k.a

antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus (ADCC), komplemendist sõltuv 15

tsütotoksilisus (CDC) ja kasvu peatumise või apoptoosi indutseerimine. Näiteks

enamus katseandmetest näitavad, et rituximab avaldab oma toimet läbi

tavapäraste efektormehhanismide (mõõdetuna CDC ja ADCC analüüsidega).

Samuti on demonstreeritud, et erinevate lümfoomirakkude resistentsus

rituximab´le in vivo on nende CDC tundlikkuse funktsioon in vitro. Samas ühe muu 20

terapeutiliseks kasutamiseks heaks kiidetud antikeha in vivo toimerežiim B1 ei

vaja ei komplementi ega loodusliku tappurraku (NK) aktiivsust. B1 efektiivsus in

vivo on pigem tingitud selle võimest potentsiaalset apoptoosi indutseerida.

Üldiselt jagunevad anti-CD20 monoklonaalsed antikehad nende lümfoomirakkude

eemaldamise toimemehhanismi alusel kahte erinevasse kategooriasse. I tüübi 25

anti-CD20 antikehad kasutavad märklaud-rakkude hävitamiseks peamiselt

komplemente, samas kui II tüübi antikehad toimivad erinevate mehhanismidega,

milleks on peamiselt apoptoos. Rituximab ja 1F5 on I tüübi anti-CD20 antikehade

näideteks, samas kui B1 on II tüübi antikeha. Vaadake näiteks Cragg, M.S. ja

Glennie, M.J., Blood 103(7): 2738-2743 (aprill, 2004); Teeling, J.L. et al., Blood 30

104(6):1793-1800 (september, 2004).

EE - EP1692182 B1 39

Käesolev leiutis on esimeseks teada olevaks juhuks, kus II tüübi anti-CD20

antikeha muundatakse suurenenud efektori funktsioonide nagu ADCC omamiseks,

säilitades samal ajal potentsiaalse apoptoosi võime. Seega on käesolev leiutis

suunatud muundatud II tüübi anti-CD20 antikehale, millel on nimetatud

muundamise tulemusel suurenenud ADCC ilma, et kaoks potentsiaalne apoptoosi 5

indutseerimise võime. Ühes teostuses on II tüübi anti-CD20 antikehasid

muundatud viisil, et neil oleks Fc piirkonnas muudetud glükosüülimismuster. Ühes

konkreetses teostuses koosneb muudetud glükosüülimine suurenenud poolitatud

kompleksi jääkide tasemest Fc piirkonnas. Ühes muus konkreetses teostuses

koosneb muudetud glükosüülimine vähenenud fukoosi jääkide tasemest Fc 10

piirkonnas. Vaadake USA patenditaotluse publikatsiooni nr. 2004/0093621,

(Shitara et al.). Ühes muus teostuses on II tüübi anti-CD20 antikehad läbinud

polüpeptiidi muundamise, mida on kirjeldatud USA patendis nr. 6 737 056 (Presta)

või USA patenditaotluse publikatsioonis nr. 2004 0185045 (Macrogenics) või USA

patenditaotluse publikatsioonis nr. 2004 0132101 (Xencor). Avaldatakse ka 15

meetodid selliste muundatud II tüübi antikehade valmistamiseks ja meetodid

selliste antikehade kasutamiseks erinevate B raku häirete, k.a B raku lümfoomid,

ravimiseks.

Kirjeldatud on ka kimäärseid hiire/inimese antikehasid. Vaadake näiteks Morrison,

S. L. et al., PNAS I1: 6851-6854 (november, 1984); Euroopa patendipublikatsioon 20

nr. 173494; Boulianna, G. L, at al., Nature 312:642 (detsember, 1984); Neubeiger,

M. S. et al., Nature 314:268 (märts, 1985); Euroopa patendipublikatsioon nr.

125023; Tan et al., J. Immunol. 135:8564 (november, 1985); Sun, L. K et al.,

Hybridoma 5(1):517 (1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986).

Vaadake Muron, Nature 312:597 (detsember, 1984); Dickson, Genetic 25

Engineering News 5(3) (märts, 1985); Marx, Science 229:455 (august, 1985); ja

Morrison, Science 229:1202-1207 (september, 1985). Robinson et al., kirjeldavad

PCT publikatsioonis nr. WO 88104936 kimäärset antikeha, mis koosneb inimese

konstantsest piirkonnast ja hiire varieeruvast piirkonnast ja millel on spetsiifilisus

CD20 epitoobi suhtes; Robinsoni kimäärse antikeha hiire osa on deriveeritud 2H7 30

hiire monoklonaalsest antikehast (gamma 2b, kappa). Kuigi antud patendis

mainitakse, et kirjeldatud kimäärne antikeha on "esmane kandidaat" B raku häirete

ravimiseks, võib seda väidet vaadelda kui pelgalt soovitust valdkonnas kogenud

EE - EP1692182 B1 40

isikutele määramiseks, kas nimetatud soovitus vastab antud konkreetse antikeha

puhul tõele ja seda eriti selle tõttu, et viiteallikas puuduvad andmed terapeutilise

efektiivsuse kinnitamiseks ja samuti kõrgema arengutasemega imetajate nagu

primaatide või inimeste kohta käivad andmed.

Valdkonnas on teada metoodikad kimäärsete antikehade valmistamiseks. Näiteks 5

võib kerged ja rasked ahelad avaldada eraldi, kasutades näiteks immunoglobuliini

kerget ahelat ja immunoglobuliini raskeid ahelaid eraldi plasmiidides või ühel

(näiteks paljutsistronilisel) vektoril. Need saab seejärel puhastada ja in vitro

terviklikeks antikehadeks kokku panna; metoodikaid sellise kokkupaneku

sooritamiseks on kirjeldatud. Vaadake näiteks Scharff, M., Harvey Lectures 69:125 10

(1974). Samuti on kirjeldatud in vitro reaktsiooniparameetreid IgG antikehade

valmistamiseks taandatud eraldatud kergetest ja rasketest ahelatest. Vaadake

näiteks Sears et al., Biochem. 16(9):2016-25 (1977).

Ühes eriti eelistatud teostuses on käesoleva leiutise kimäärseks ABM inimese

jaoks kohandatud antikeha. Meetodid inimeselt mittepärinevate antikehade 15

inimese jaoks kohandamiseks on valdkonnas teada. Näiteks võib käesoleva

leiutise inimese jaoks kohandatud ABM valmistada vastavalt meetoditele, mida on

kirjeldatud USA patendis nr. 5 225 539 (Winter), USA patendis nr. 6 180 370

(Queen et al.) või USA patendis nr. 6 632 927 (Adair et al.). Eelistatult on inimese

jaoks kohandatud antikehal üks või rohkem aminohappejääki, mis on pärinevad 20

allikast, kelleks ei ole inimene. Neid inimeselt mittepärinevaid aminohappejääke

nimetatakse sageli "olulisteks" jääkideks, mis võetakse tavaliselt "olulisest"

varieeruvast domeenist. Inimese jaoks kohandamise võib üldiselt läbi viia,

kasutades meetodeid, mida on kirjeldanud Winter ja tema kaastöötajad (Jones et

al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); 25

Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), asendades hüpervarieeruva

piirkonna järjestused inimese antikeha vastavate järjestustega. Seega on sellised

„inimese jaoks kohandatud antikehad“ kimäärsed antikehad (USA patent nr.

4 816 567), kus väike osa inimese varieeruvast domeenist on asendatud vastava

inimesest erineva liigi järjestusega. Praktikas on inimese jaoks kohandatud 30

antikehadeks tavaliselt inimese antikehad, kus mõned hüpervarieeruva piirkonna

jäägid ja võimalik, et ka mõned FR jäägid on asendatud näriliste antikehade

EE - EP1692182 B1 41

analoogsete saitidega. Kõnealused inimese jaoks kohandatud anti-CD20

antikehad koosnevad inimese immunoglobuliini konstantsetest piirkondadest.

Inimese jaoks kohandatud antikehade valmistamisel on antigeensuse

vähendamisel väga oluline inimese varieeruvate domeenide (nii kerged kui

rasked) valik. Vastavalt nn. „parima sobivuse“ meetodile võrreldakse närilise 5

antikeha varieeruva domeeni järjestust kogu teada olevate inimese varieeruva

domeeni järjestuste teegiga. Närilise järjestusele kõige sarnasemat inimese

järjestust kasutatakse seejärel inimese jaoks kohandatud antikeha inimese raami

piirkonnana (FR) (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol.

Biol., 196:901 (1987)). Veel üheks meetodiks inimese raami järjestuse valimiseks 10

on täieliku närilise raami iga individuaalse alampiirkonna järjestuse (s.t FR1, FR2,

FR3 ja FR4) või mõne individuaalse alamregiooni kombinatsiooni (näiteks FR1 ja

FR2) võrdlemine teada olevate inimese varieeruva piirkonna järjestuste, mis

sellele raami alampiirkonnale vastavad (määratuna näiteks Kabat´

nummerdusega), teegiga ja iga alampiirkonna või kombinatsiooni jaoks inimese 15

järjestuse, mis on närilise järjestusega kõige sarnasem, valimine (Leung, USA

patenditaotluse publikatsioon nr. 2003/0040606A1, publitseeritud 27. veebruaril,

2003). Veel ühes meetodis kasutatakse konkreetset raami piirkonda, mis on

deriveeritud kergete ja raskete ahelate mingi kindla alamrühma kõikide inimese

antikehade konsensusjärjestusest. Sama raami võib kasutada mitme erineva 20

inimese jaoks kohandatud antikeha jaoks (Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA,

89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Lisaks on oluline, et antikehad kohandataks inimese jaoks, säilitades antigeeni

suure afiinsuse ja muud soovitavad bioloogilised omadused. Selle eesmärgi

saavutamiseks valmistatakse inimese jaoks kohandatud antikehad vastavalt 25

eelistatud meetodile protsessiga, mille käigus analüüsitakse eellas-järjestusi ja

erinevaid kontseptuaalseid inimese jaoks kohandatud produkte, kasutades eellas-

ja inimese jaoks kohandatud järjestuste kolmemõõtmelisi mudeleid.

Kolmemõõtmelised immunoglobuliini mudelid on laialdaselt saadaval ja on

valdkonnas kogenud isikutele tuttavad. Saadaval on arvutiprogrammid, mis 30

illustreerivad ja kuvavad valitud võimalike kandidaat-immunoglobuliinjärjestuste

kolmemõõtmelisi kohandatud struktuure. Nende kuvade uurimine võimaldab

EE - EP1692182 B1 42

analüüsida jääkide võimalikku osatähtsust kandidaat-immunoglobuliinjärjestuste

funktsioneerimisel, s.t jääkide analüüsimist, mis mõjutavad kandidaat-

immunoglobuliini võimet selle antigeeni siduda. Sellisel viisil võib FR jäägid

vastuvõtjalt valida, kombineerida ning importida nii, et saavutatakse soovitud

antikeha omadus nagu suurenenud afiinsus märklaud-antigeeni suhtes. Üldiselt on 5

antigeeni sidumise mõjutamisel otse ja kõige olulisemalt kaasatud

hüpervarieeruva piirkonna jäägid.

Ühes muus teostuses muundatakse käesoleva leiutise antigeeni siduvaid

molekule viisil, et neil oleks täiustatud sidumisafiinsus; nimetatud meetod on

avaldatud näiteks USA patendiavalduse publikatsioonis nr. 2004/0132066 (Balint 10

et al.).

Ühes teostuses konjugeeritakse käesoleva leiutise antigeeni siduv molekul

täiendava fragmendiga, näiteks radiomärgis või toksiin. Sellised konjugeeritud

ABM võib toota mitme meetodiga, mis on praktikas hästi teada.

Käesolevas leiutises on rakendatav teatud hulk radionukliide ja valdkonnas 15

kogenud isikud peaksid olema võimelised määrama, milline radionukliid on

erinevatel asjaoludel kõige sobivam. Näiteks 131jood on laialdaselt tuntud

radionukliid, mida mingi kindla märklaua vastu suunatud immunoteraapias

kasutatakse. Kuid 131joodi kliiniline kasutus võib olla piiratud mitme faktoriga, k.a: 8

päeva pikkune füüsikaline poolestusaeg; jooditud antikeha dehalogeenimine nii 20

veres kui ka tuumorite asukohtades; ja kiirgusomadused (näiteks suur

gammakompoment), mis võib osutuda suboptimaalseks lokaliseeritud doosi

kuhjumiseks tuumoris. Kõrgekvaliteediliste kelaativate ainete saabumisel

suurendas võimalus metalli kelaativate rühmade kinnitamiseks valkude külge

võimalusi muude radionukliidide kasutamiseks, näiteks 111indium ja 90ütrium. 25 90ütrium võimaldab mitmeid eeliseid radioimmunoteraapiliste rakenduste

kasutamisel: 90ütriumi 64 tunni pikkune poolestusaeg on piisavalt pikk, et

võimaldada antikeha kuhjumist tuumoris ja samuti on 90ütrium erinevalt näiteks 131joodist puhas suure energia beetakiirgaja ilma kaasneva gammakiirguseta

lagunemisel; kiirgus jääb koes vahemikku 100 kuni 1000 raku diameetrit. Lisaks 30

võimaldab läbistava kiirguse minimaalne kogus 90ütriumiga märgistatud

antikehade manustamist ambulatoorsetele patsientidele. Lisaks ei ole märgistatud

EE - EP1692182 B1 43

antikeha omandamine raku hävitamiseks vajalik ja ioniseeriva kiirguse lokaalne

kiirgamine peaks olema piisav kõrval asetsevate tuumorirakkude, kus märklaud-

antigeen puudub, hävitamiseks.

90ütriumiga märgistatud anti-CD20 antikehade efektiivsed ühe ravikorra doosid (s.t

terapeutiliselt efektiivsed kogused) jäävad vahemikku umbes 5 kuni umbes 75 mCi 5

ja eelistatumalt vahemikku umbes 10 kuni umbes 40 mCi. 131joodiga märgistatud

anti-CD20 antikehade efektiivsed ühe ravikorra luuüdile mitteablatiivsed doosid

jäävad vahemikku umbes 5 kuni umbes 70 mCi ja eelistatumalt vahemikku umbes

5 kuni umbes 40 mCi. 131joodiga märgistatud anti-CD20 antikehade efektiivsed

ühe ravikorra ablatiivsed doosid (s.t, et vajalik võib olla autoloogse luuüdi 10

siirdamine) jäävad vahemikku umbes 30 kuni umbes 600 mCi ja eelistatumalt

vahemikku umbes 50 kuni vähem kui umbes 500 mCi. Seotult kimäärse anti-CD20

antikehaga jäävad 131joodiga, mille pikem poolestusaeg vereringes on tingitud vis-

a-vis hiire antikehadest, märgistatud kimäärsete anti-CD20 antikehade luuüdile

mitteablatiivsed doosid vahemikku umbes 5 kuni umbes 40 mCi ja eelistatumalt 15

vähem kui umbes 30 mCi. Kujutuskriteeriumid näiteks 111indiumi märgise jaoks on

tavaliselt väiksemad kui umbes 5 mCi.

Radiomärgistatud anti-CD20 antikehadega sooritatav ravi võib toimuda ühte või

mitut ravikorda kasutades. Radionukliidist komponendi tõttu on eelistatud, et enne

ravi „kogutakse“ patsientidelt, kellel esineb radiatsiooni tõttu potentsiaalselt 20

surmav luuüdi toksilisus, perifeersed tüvirakud („PSC“) või luuüdi („BM“). BM ja/või

PSC kogutakse standardtehnikatega ning puhastatakse ja külmutatakse seejärel

võimalikuks reinfusiooniks. Lisaks on kõige eelistatumaks lähenemisviisiks, et

enne ravi viiakse patsiendil läbi diagnostiline dosimeetria uuring diagnostilist

märgistatud antikeha (näiteks 111indium) kasutades; nimetatud uuringu eesmärgiks 25

on kindlustada, et terapeutiliselt märgistatud antikeha (näiteks 90ütrium) ei

„kontsentreeruks“ üheski terves organis või koes liigselt.

Eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab allpool tabelis 3 näidatud

aminohappejärjestust omavat polüpeptiidi kodeerivat järjestust. Leiutises

avaldatakse samuti eraldatud nukleiinhape, mille järjestus kodeerib tabelis 3 30

näidatud konstruktsioonide aminohappejärjestust (konservatiivsete

aminohappeasendustega) omavat polüpeptiidi.

EE - EP1692182 B1 44

Tabel 2

EE - EP1692182 B1 45

(järgneb)

EE - EP1692182 B1 46

(järgneb)

EE - EP1692182 B1 47

(järgneb)

EE - EP1692182 B1 48

(järgneb)

EE - EP1692182 B1 49

(järgneb)

EE - EP1692182 B1 50

(järgneb)

Tabel 3

5

EE - EP1692182 B1 51

(järgneb)

EE - EP1692182 B1 52

(järgneb)

Leiutises kirjeldatakse eraldatud polünukleotiidi, mis sisaldab joonisel FIG. 1 või

FIG. 2 näidatud aminohappejärjestust sisaldavat polüpeptiidi kodeerivat järjestust.

EE - EP1692182 B1 53

Leiutisega avaldatakse eraldatud nukleiinhape, mis sisaldab mistahes joonisel

FIG. 1, FIG. 2, FIG. 3, FIG. 4, FIG. 5 või FIG. 6 näidatud konservatiivsete

aminohappeasendustega konstruktsiooni aminohappejärjestust omavat

polüpeptiidi kodeerivat järjestust.

Ühes muus teostuses seondub käesolev leiutis nõudluspunktidele vastava 5

ekspressioonivektori ja/või peremeerakuga, mis sisaldab ühte või rohkemat

eraldatud polünukleotiidi.

Üldiselt võib käesoleva leiutise ABM avaldamiseks kasutada iga kultuuristatud

rakuliini tüüpi. Ühes eelistatud teostuses kasutatakse leiutise muundatud

peremeesrakkude valmistamisel aluseks oleva rakuliinina CHO rakke, BHK rakke, 10

NS0 rakke, SP2/0 rakke, YO müeloomi rakke, P3X63 hiire müeloomi rakke, PER

rakke, PER.C6 rakke või hübridoomrakke, muid imetajate rakke, pärmirakke,

putukarakke või taimerakke.

Käesoleva leiutise ABM terapeutilist efektiivsust saab parandada, tootes need

peremeesrakkudes, mis avaldavad täiendavalt GnTIII aktiivsust omavat 15

polüpeptiidi kodeerivat polünukleotiidi. Ühes eelistatud teostuses on GnTIII

aktiivsusega polüpeptiidiks fusioonpolüpeptiid, mis sisaldab Golgi-resistentse

polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni domeeni. Ühes muus eelistatud teostuses annab

käesoleva leiutise ABM ekspressioon peremeesrakus, mis avaldab GnTIII

aktiivsust omavat polüpeptiidi kodeerivat polünukleotiidi, saagiseks ABM, millel on 20

suurenenud Fc retseptori sidumisafiinsus ja suurenenud efektori funktsioon.

Seega ühes teostuses seondub käesolev leiutis peremeesrakuga, mis omakorda

koosneb (a) eraldatud nukleiinhappest, mis omakorda sisaldab GnTIII aktiivsust

omavat polüpeptiidi kodeerivat järjestust; ja (b) eraldatud polünukleotiidist, mis

kodeerib käesoleva leiutise ABM, näiteks inimese CD20 siduv kimäärne või 25

inimese jaoks kohandatud antikeha. Ühes eelistatud teostuses on GnTIII

aktiivsusega polüpeptiidiks fusioonpolüpeptiid, mis sisaldab GnTIII katalüseerivat

domeeni ja Golgi lokalisatsiooni domeeniks on mannosidaas II lokalisatsiooni

domeen. Meetodid selliste fusioonpolüpeptiidide valmistamiseks ja nende

kasutamiseks suurenenud efektori funktsioonidega antikehade valmistamiseks on 30

avaldatud USA patenditaotluses nr. 60/495 142. Veel ühes eelistatud teostuses on

kimäärseks ABM kimäärne antikeha või selle fragment, millel on hiire B-Ly1

EE - EP1692182 B1 54

antikeha sidumisspetsiifilisus. Ühes eriti eelistatud teostuses sisaldab kimäärne

antikeha inimese Fc. Ühes muus eelistatud teostuses on antikeha primaatide või

inimese jaoks kohandatud.

Ühes teostuses võib ühe või mitu käesoleva leiutise ABM kodeerivat

polünukleotiidi avaldada konstitutiivse promootori või alternatiivina reguleeritud 5

ekspressioonisüsteemi kontrolli all. Sobivad reguleeritud ekspressioonisüsteemid

hõlmavad, kuid ei ole nendega piiratud, tsetratsükliin-reguleeritud

ekspressioonisüsteemi, ekdüsooniga indutseeritavat ekspressioonisüsteemi, lac-

lülitiga ekspressioonisüsteemi, glükokortikoidiga indutseeritavat ekspressiooni-

süsteemi, temperatuuriga indutseeritavat promootorsüsteemi ja metallotioneiini 10

metall-indutseeritavat ekspressioonisüsteemi. Kui peremeesraku süsteemis leidub

mitmeid erinevaid käesoleva leiutise ABM kodeerivaid nukleiinhappeid, võib

mõned nendest avaldada konstitutiivse promootori kontrolli all ja ülejäänud

avaldatakse reguleeritud promootori kontrolli all. Maksimaalseks

ekspressioonitasemeks loetakse stabiilse polüpeptiidi ekspressiooni suurimat 15

võimalikku taset, mis ei avalda märgatavat negatiivset mõju rakkude

kasvukiirusele; maksimaalne ekspressioonitase määratakse rutiinse

katsetamisega. Ekspressioonitasemed määratakse valdkonnas teada olevate

meetodiga, k.a Western blot analüüs ABM spetsiifilist antikeha või ABM külge

sulatatud peptiidmärgise spetsiifilist antikeha kasutades; ja Northern blot analüüs. 20

Täiendava alternatiivina võib polünukleotiidi aheldada operatiivselt

reportergeeniga; kimäärse ABM, mille sidumisspetsiifilisus on üldiselt sama hiire

B-Ly1 antikehaga, ekspressioonitasemed määratakse, mõõtes signaali, mis on

korrelatsioonis reportergeeni ekspressioonitasemega. Reportergeeni võib

transkribeerida koos nimetatud fusioonpolüpeptiidi kodeerivate nukleiinhapetega 25

ühe mRNA molekulina; nende vastavad kodeerimisjärjestused võib aheldada kas

sisemise ribosomaalse sisestuspiirkonna (IRES) või cap-iseseisva translatsiooni

võimendajaga (CITE). Reportergeeni võib transleerida koos vähemalt ühe

kimäärset ABM kodeeriva nukleiinhappega, millel on hiire B-Ly1 antikehaga

üldiselt sama spetsiifilisus nii, et moodustub üks polüpeptiidahel. Käesoleva 30

leiutise AMB kodeerivad nukleiinhapped võib aheldada operatiivselt

reportergeeniga, mis on ühe promootori kontrolli all, näiteks fusioonpolüpeptiidi

kodeeriv nukleiinhape; reportergeen transkribeeritakse RNA molekuli, mis on

EE - EP1692182 B1 55

alternatiivselt kahte eraldi mRNA molekuli splaissitud; üks saadud mRNA

transleeritakse nimetatud reportervalku ja teine transleeritakse nimetatud

fusioonpolüpeptiidi.

Ekspressioonivektorite, mis sisaldavad ABM kodeerimisjärjestust ja millel on

üldiselt sama sidumisspetsiifilisus kui hiire B-Ly1 antikehal koos sobivate 5

transkriptsiooni/translatsiooni kontrollsignaalidega, konstrueerimiseks võib

kasutada meetodeid, mis on valdkonnas kogenud isikutele hästi teada. Need

meetodid hõlmavad in vitro rekombinantse DNA tehnikaid, sünteetilisi tehnikaid ja

in vivo rekombinatsiooni/geneetilist rekombinantsiooni. Vaadake näiteks tehnikaid,

mida on kirjeldanud Maniatis et al., MOLECULAR CLONING A LABORATORY 10

MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) ja Ausubel et al.,

CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing

Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989).

Käesoleva leiutise ABM kodeerimisjärjestuse avaldamiseks võib kasutada

erinevaid peremees-ekspressioonivektori süsteeme. Eelistatult kasutatakse 15

peremeesrakusüsteemidena imetajarakke, mis on transfekteeritud rekombinantse

plasmiidi DNA või kosmiidi DNA ekspressioonivektoritega, mis omakorda

sisaldavad huvi pakkuva valgu kodeerimisjärjestust ja fusioonpolüpeptiidi

kodeerimisjärjestust. Peremeesraku süsteemina kasutatakse kõige eelistatumalt

CHO rakke, BHK rakke, NS0 rakke, SP2/0 rakke, YO müeloomi rakke, P3X63 hiire 20

müeloomi rakke, PER rakke, PER.C6 rakke või hübridoomrakke, muid imetajate

rakke, pärmirakke, putukarakke või taimerakke. Mõningaid

ekspressioonisüsteemide ja selektsioonimeetodite näiteid on kirjeldatud

järgnevates viiteallikates ning nendes mainitud viiteallikates: Borth et al.,

Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73 (2000-2001), Werner et al., 25

Arineimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998), Andersen ja Krummen, Curr.

Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002), Chadd ja Chamow, Curr. Op. Biotechnol.

12:188-194 (2001) ning Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454 (2001).

Alternatiivsetes teostuses vaadeldakse ka muude eukarüootsete

peremeesrakkude süsteemide kasutamist, k.a käesoleva leiutise ABM 30

kodeerimisjärjestust sisaldavate rekombinantse pärmi ekspressioonivektoritega

transformeeritud pärmirakud; putukaraku süsteemid, mis on nakatatud

EE - EP1692182 B1 56

rekombinantse viiruse ekspressioonivektoritega (näiteks bakuloviirus), mis

omakorda sisaldab kimäärset ABM kodeerivat järjestust, millel on üldiselt sama

sidumisspetsiifilisus kui hiire B-Ly1 antikehal; taimeraku süsteeme, mis on

nakatatud rekombinantse viiruse ekspressioonivektoritega (näiteks lillkapsa

mosaiikviirus CaMV; tubaka mosaiikviirus TMV) või transformeeritud 5

rekombinantsete plasmiidi ekspressioonivektoritega (näiteks Ti plasmiid), mis

sisaldavad leiutise ABM kodeerimisjärjestust; või loomaraku süsteemid, mis on

nakatatud rekombinantse viiruse ekspressioonivektoritega (näiteks adenoviirus,

vaktsiinia viirus), k.a rakuliinid, mida on muundatud viisil, et need sisaldavad

mitmeid DNA koopiaid, mis kodeerivad kimäärset ABM, mille sidumisspetsiifilisus 10

on üldiselt sama hiire B-Ly1 antikehaga ja mis on kas stabiilselt võimendatud

(CHO/dhfr) või ebastabiilselt topelt-minuti kromosoomides võimendatud (näiteks

hiire rakuliinid). Ühes teostuses on leiutise ABM kodeerivaid polünukleotiide

sisaldav vektor paljutsistroniline. Ühes teostuses on eelnevalt avaldatud ABM

antikeha või selle fragment. Ühes eelistatud teostuses on ABM inimese jaoks 15

kohandatud antikeha.

Leiutise meetodite juures eelistatakse üldiselt põgusale ekspressioonile stabiilset

ekspressiooni, kuna selle abil saavutatakse tavaliselt kergemini taastatavamad

tulemused ja see on samuti paremini suures mahus tootmiseks kohandatav. Selle

asemel, et kasutada replikatsiooni viiruslikke algeid sisaldavaid 20

ekspressioonivektoreid, võib rakud transformeerida vastavate kodeerivate

nukleiinhapetega, mida kontrollitakse sobivate ekspressioonikontrolli elementide

(näiteks promooter, võimendaja, järjestused, transkriptsiooni terminaatorid,

polüadenülatsioonisaidid jne) ja valitava markeriga. Pärast võõrkehalt pärineva

DNA sisestust võib muundatud rakkudel samuti lasta 1 kuni 2 päeva rikastatud 25

söötmel kasvada ja seejärel selektiivsele söötmele üle viia. Rekombinantses

plasmiidis olev valitav marker avaldab selektsioonile resistentsust ja võimaldab

valida rakke, mis on integreerinud plasmiidi stabiilselt oma kromosoomidesse ja

kasvavad foci moodustumiseks, mille omakorda saab kloonida ja rakuliinidesse

laiendada. 30

Kasutada võib mitmeid selektsioonisüsteeme, k.a (olemata samas nendega

piiratud), herpes simplex viiruse tümidiini kinaasi (Wigler et al., Cell 11:223

EE - EP1692182 B1 57

(1977)), hüpoksantiin-guaniini fosforibosüültransferaasi (Szybalska & Szybalski,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)) ja adeniin-fosforibosüültransferaasi

(Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) geene, mida saab kasutada vastavalt tk-, hgprt-

või aprt- rakkudes. Samuti saab antimetaboliidi resistentsust kasutada selektsiooni

alusena dhfr geene, mis avaldavad resistentsust metotreksaadile (Wigler et al., 5

Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 (1989); O’Hare et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA

78:1527 (1981)); gpt geene, mis avaldavad resistentsust mükofenoolhappele

(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo geene, mis

avaldavad resistentsust aminogükosiid G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol.

Biol. 150:1 (1981)); ja hügro geene, mis avaldavad resistentsust hügromütsiinile 10

(Santerre et al., Gene 30:147 (1984). Hiljuti kirjeldati täiendavaid valitavaid geene,

nimelt trpB, mis võimaldab kasutada rakkudel trüptofaani asemel indooli; hisD, mis

võimaldab kasutada rakkudel histidiini asemel histinooli (Hartman & Mulligan,

Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:8047 (1988)); glutamiini süntaasisüsteemi; ja ODC

(ornitiini dekarboksülaas), mis avaldab resistentsust ornitiini dekarboksülaasi 15

inhibiitori, 2-(difluorometüül)-DL-ornitiin, DFMO suhtes (McConlogue teoses:

Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.

(1987)).

Käesolev leiutis seondub täiendavalt meetodiga peremeesraku poolt toodetud

käesoleva leiutise ABM glükosüülimisprofiili muutmiseks, mis hõlmab leiutise ABM 20

kodeeriva nukleiinhappe ja GnTIII aktiivsusega polüpeptiidi kodeeriva

nukleiinhappe või selliseid nukleiinhappeid sisaldava vektori avaldamist nimetatud

peremeesrakus. Eelistatult on modifitseeritud polüpeptiidiks IgG või selle fragment,

mis sisaldab Fc piirkonda. Ühes eriti eelistatud teostuses on ABM inimese jaoks

kohandatud antikeha või selle fragment. 25

Leiutise peremeerakkude poolt loodud modifitseeritud ABM ilmutavad

modifikatsiooni tulemusel suurenenud Fc retseptori sidumisafiinsust ja/või

suurenenud efektori funktsiooni. Ühes eriti eelistatud teostuses on ABM inimese

jaoks kohandatud antikeha või selle Fc piirkonda sisaldav fragment. Eelistatult on

suurenenud Fc retseptori sidumisafiinsuseks suurenenud seondumine Fcγ 30

aktiveeriva retseptoriga, näiteks FcγRIIIa retseptoriga. Suurenenud efektori

funktsiooniks on eelistatult ühe või rohkema järgneva suurenemine: suurenenud

EE - EP1692182 B1 58

antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus, suurenenud antikehast sõltuv rakuline

fagotsütoos (ADCP), suurenenud tsütokiini eritus, suurenenud immuunkompleksi

vahendatud antigeeni omastamine antigeeni kujutavate rakkude poolt, suurenenud

Fc vahendatud rakuline tsütotoksilisus, suurenenud seondumine NK rakkudega,

suurenenud seondumine makrofaagidega, suurenenud seondumine 5

polümorftuumaste rakkudega (PMN), suurenenud seondumine monotsüütidega,

suurenenud märklauaga seotud antikehade ristsidumine, suurenenud apoptoosi

indutseeriv otsene signalisatsioon, suurenenud dendriitrakkude valmimine ja

suurenenud T rakkude primeerimine.

Käesolev leiutis seondub samuti meetodiga käesoleva leiutise ABM 10

valmistamiseks, millel on peremeesrakus modifitseeritud oligosahhariidid;

nimetatud meetod hõlmab (a) peremeesraku, mida on muundatud avaldama

vähemalt ühte nukleiinhapet, mis omakorda kodeerib GnTIII aktiivsusega

polüpeptiidi, kultuuristamist tingimustel, mis võimaldavad käesolevale leiutisele

vastava ABM valmistamist ja nimetatud GnTIII aktiivsust omav polüpeptiid 15

avaldatakse koguses, mis on piisav nimetatud ABM Fc piirkonnas olevate

oligosahhariidide modifitseerimiseks nimetatud peremeesraku poolt; ja (b)

nimetatud ABM eraldamist. Ühes eelistatud teostuses on GnTIII aktiivsusega

polüpeptiidiks fusioonpolüpeptiid, mis sisaldab GnTIII katalüütilist domeeni. Ühes

eriti eelistatud teostuses sisaldab fusioonpolüpeptiid täiendavalt Golgi-resistentse 20

polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni domeeni.

Eelistatult on Golgi lokalisatsiooni domeeniks mannosidaas II või GnTI

lokalisatsiooni domeen. Alternatiivina on Golgi lokalisatsiooni domeen valitud

rühmast, kuhu kuuluvad: mannosidaas I lokalisatsiooni domeen, GnTII

lokalisatsiooni domeen ja α1-6 tuuma fukosüültransferaasi lokalisatsiooni domeen. 25

Käesoleva leiutise meetoditega valmistatud ABM on suurenenud Fc retseptori

sidumisafiinsus ja/või suurenenud efektori funktsioon. Eelistatult kujutab

suurenenud efektori funktsioon endast ühte või rohkemat järgnevatest:

suurenenud Fc vahendatud rakuline tsütotoksilisus (k.a suurenenud antikehast

sõltuv rakuline tsütotoksilisus), suurenenud antikehast sõltuv rakuline fagotsütoos 30

(ADCP), suurenenud tsütokiini eritus, suurenenud immuunkompleksi vahendatud

antigeeni omastamine antigeeni kujutavate rakkude poolt, suurenenud

EE - EP1692182 B1 59

seondumine NK rakkudega, suurenenud seondumine makrofaagidega,

suurenenud seondumine monotsüütidega, suurenenud seondumine

polümorftuumaste rakkudega, suurenenud apoptoosi indutseeriv otsene

signalisatsioon, suurenenud märklauaga seotud antikehade ristsidumine,

suurenenud dendriitrakkude valmimine ja suurenenud T rakkude primeerimine. 5

Suurenenud Fc retseptori sidumisafiinsuseks on eelistatult suurenenud

seondumine Fc aktiveerivate retseptoritega nagu FcγRIIIa. Ühes eriti eelistatud

teostuses on ABM inimese jaoks kohandatud antikeha või selle fragment.

Ühes muus teostuses seondub käesolev leiutis kimäärse ABM, millel on üldiselt

sama sidumisafiinsus kui hiire B-Ly1 antikehal ja mis on toodetud leiutise 10

meetoditega ja millel esineb nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas suurenenud

poolitatud oligosahhariidide proportsioon. Vaadeldakse, et selline ABM hõlmab

antikehasid ning nende fragmente, mis sisaldavad Fc piirkonda. Ühes eelistatud

teostuses on ABM inimese jaoks kohandatud antikeha. Ühes teostuses on

poolitatud oligosahhariidide protsent ABM Fc piirkonnas vähemalt 50%, 15

eelistatumalt vähemalt 60%, vähemalt 70%, vähemalt 80%, vähemalt 90% ja

kõige eelistatumalt vähemalt 90-95% oligosahhariidide koguhulgast. Veel ühes

teostuses on leiutise meetoditega valmistatud ABM Fc piirkonnas suurenenud

fukosüülimata oligosahhariidide proportsioon – see saavutatakse läbi selle

oligosahhariidide modifikatsiooni käesoleva leiutise meetodeid kasutades. Ühes 20

teostuses on fukosüülimata oligosahhariidide protsent vähemalt 50%, eelistatult

vähemalt 60% kuni 70% ja kõige eelistatumalt vähemalt 75%. Fukosüülimata

oligosahhariidid võivad olla hübriidid või kompleksid. Ühes eriti eelistatud

teostuses on peremeesrakkude poolt leiutise meetodeid kasutades valmistatud

ABM suurenenud poolitatud fukosüülimata oligosahhariidide proportsioon Fc 25

piirkonnas. Poolitatud fukosüülimata oligosahhariidid võivad olla hübriidid või

kompleksid. Täpsemalt, käesoleva leiutise meetodeid võib kasutada ABM

valmistamiseks, kus vähemalt 15%, eelistatumalt vähemalt 20%, eelistatumalt

vähemalt 25%, eelistatumalt vähemalt 30% ja veelgi eelistatumalt vähemalt 35%

ABM Fc piirkonnas olevatest oligosahhariididest on poolitatud ja fukosüülimata. 30

Käesoleva leiutise meetodeid võib samuti kasutada polüpeptiidide valmistamiseks,

kus vähemalt 15%, eelistatumalt vähemalt 20%, eelistatumalt vähemalt 25%,

EE - EP1692182 B1 60

eelistatumalt vähemalt 30% ja veelgi eelistatumalt vähemalt 35% polüpeptiidi Fc

piirkonnas olevatest oligosahhariiddest on poolitatud fukosüülimata hübriidid.

Ühes muus teostuses seondub käesolev leiutis leiutise meetoditega valmistatud

kimäärse ABM, millel on hiire B-Ly1 antikehaga sarnane sidumisspetsiifilisus ja

mida on muundatud suurenenud efektori funktsiooni ja/või suurenenud Fc 5

retseptori sidumisafiinsuse saavutamiseks. Eelistatult kujutab suurenenud efektori

funktsioon endast ühte või rohkemat järgnevatest: suurenenud Fc vahendatud

rakuline tsütotoksilisus (k.a suurenenud antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus),

suurenenud antikehast sõltuv rakuline fagotsütoos (ADCP), suurenenud tsütokiini

eritus, suurenenud immuunkompleksi vahendatud antigeeni omastamine antigeeni 10

kujutavate rakkude poolt, suurenenud seondumine NK rakkudega, suurenenud

seondumine makrofaagidega, suurenenud seondumine monotsüütidega,

suurenenud seondumine polümorftuumaste rakkudega, suurenenud apoptoosi

indutseeriv otsene signalisatsioon, suurenenud märklauaga seotud antikehade

ristsidumine, suurenenud dendriitrakkude valmimine ja suurenenud T rakkude 15

primeerimine. Eelistatud teostuses on suurenenud Fc retseptori

sidumisafiinsuseks suurenenud seondumine Fc aktiveeriva retseptoriga ja kõige

eelistatumalt FcγRIIIa retseptoriga. Ühes teostuses on ABM antikeha või Fc

piirkonda sisaldav antikeha fragment või fusioonvalk, mis sisaldab

immunoglobuliini Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda. Ühes eriti eelistatud 20

teostuses on ABM inimese jaoks kohandatud antikeha.

Käesolev leiutis seondub täiendavalt ravimkoostistega, mis sisaldavad käesoleva

leiutise ABM ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.

Käesolev leiutis seondub lisaks selliste ravimkoostiste kasutamisega kasvajate

ravimiseks. Täpsemalt, käesolev leiutis seondub meetodiga kasvaja ravimiseks 25

ning nimetatud meetod hõlmab terapeutiliselt efektiivse koguse leiutise

ravimkoostise manustamist.

Käesoleva leiutisega pakutakse lisaks välja meetodid peremeesrakkude

süsteemide loomiseks ja kasutamiseks käesoleva leiutise ABM glükovormide

valmistamiseks, millel on suurenenud Fc retseptori sidumisafiinsus, eelistatult 30

suurenenud seondumine Fc aktiveeritavate retseptoritega ja/või suurenenud

EE - EP1692182 B1 61

efektori funktsioonid, k.a antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus.

Glükomuundatud antikeha, mida käesoleva leiutise ABM kasutada saab, on

kirjeldatud detailsemalt USA patendis nr. 6 602 684 ja esialgses USA

patenditaotluses nr. 60/441 307 ja WO 2004/065540. Käesoleva leiutise ABM võib

alternatiivina glükomuundada patendis EP 1 176 195 A1 kirjeldatud viisil, et need 5

sisaldaksid Fc piirkonnas vähenenud fukoosi jääke.

Rakuliinide valmistamine muudetud glükosüülimismustriga valkude tootmiseks

Käesolevas leiutises pakutakse välja peremeesraku ekspressioonisüsteemid

käesoleva leiutise ABM valmistamiseks, millel on muudetud glükosüülimismustrid.

Täpsemalt, käesolevas leiutises pakutakse välja peremeesraku süsteemid 10

käesoleva leiutise ABM paranenud terapeutilise väärtusega glükovormide

valmistamiseks. Seega pakutakse leiutises välja peremeesraku

ekspressioonisüsteemid, mis on valitud või muundatud GnTIII aktiivsusega

polüpeptiidi avaldamiseks. Ühes teostuses on GnTIII aktiivsusega polüpeptiidiks

fusioonpolüpeptiid, mis sisaldab heteroloogse Golgi-resistentse polüpeptiidi Golgi 15

lokalisatsiooni domeeni. Täpsemalt, need peremeesraku ekspressioonisüsteemid

võib valmistada selliselt, et need sisaldaksid GnTIII aktiivsusega polüpeptiidi

kodeerivat rekombinantset nukleiinhappe molekuli, mis on aheldatud operatiivselt

konstitutiivse või reguleeritud promootorsüsteemiga.

Ühes konkreetses teostuses pakutakse käesoleva leiutisega välja peremeerakk, 20

mida on muundatud vähemalt ühe GnTIII aktiivsust omavat fusioonpolüpeptiidi

kodeeriva nukleiinhappe avaldamiseks, mis omakorda sisaldab heteroloogse

Golgi-resistentse polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni domeeni. Ühes teostuses on

peremeesrakku muundatud nukleiinhappe molekuliga, mis sisaldab vähemalt ühte

GnTIII aktiivsust omavat fusioonpolüpeptiidi kodeerivat geeni ja heteroloogse 25

Golgi-resistentse polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni domeeni.

Üldiselt võib käesoleva leiutise peremeesrakkude liinide valmistamise alusena

kasutada mistahes kultuuristatud rakuliini tüüpi, k.a eelnevalt avaldatud rakuliinid.

Ühes eelistatud teostuses kasutatakse leiutise muundatud peremeesrakkude

valmistamisel aluseks oleva rakuliinina CHO rakke, BHK rakke, NS0 rakke, SP2/0 30

rakke, YO müeloomi rakke, P3X63 hiire müeloomi rakke, PER rakke, PER.C6

EE - EP1692182 B1 62

rakke või hübridoomrakke, muid imetajate rakke, pärmirakke, putukarakke või

taimerakke.

Leiutis on mõeldud hõlmama kõiki GnTIII aktiivsust omavaid polüpeptiide

avaldavaid muundatud peremeesrakke, k.a fusioonpolüpeptiidid, mis sisaldavad

siin defineeritud heteroloogse Golgi-resistentse polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni 5

domeeni.

Konstitutiivse promootori või reguleeritud ekspressioonisüsteemi kontrolli all võib

avaldada ühte või mitut GnTIII aktiivsusega polüpeptiidi kodeerivat nukleiinhapet.

Sellised süsteemid on praktikas hästi teada ja hõlmavad eelnevalt mainitud

süsteeme. Kui peremeesraku süsteemis leidub mitu erinevat fusioonpolüpeptiide, 10

millel on GnTIII aktiivsus ja mis sisaldavad heteroloogse Golgi-resistentse

polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni domeeni, kodeerivat nukleiinhapet, võib mõned

nendest avaldata konstitutiivse promootori kontrolli all, samas kui teised

avaldatakse reguleeritud promootori kontrolli all. GnTIII aktiivsusega

fusioonpolüpeptiidide ekspressioonitasemed määratakse üldiselt valdkonnas 15

teada olevate meetoditega, k.a Western blot analüüs, Northern blot analüüs,

reportergeeni ekspressioonianalüüs või GnTIII aktiivsuse mõõtmine. Alternatiivina

võib kasutada GnTIII biosünteetiliste saadustega seonduvat lektiini, näiteks E4-

PHA lektiin. Alternatiivina võib kasutada ka funktsionaalset analüüsi, millega

mõõdetakse suurenenud Fc retseptori seondumist või suurenenud efektori 20

funktsiooni, mida vahendatakse GnTIII aktiivsusega polüpeptiidi kodeeriva

nukleiinhappega muundatud rakkude poolt toodetud antikehade poolt.

Transfektantide või transformantide tuvastamine, mis avaldavad modifitseeritud

glükosüülimismustriga valku

Peremeesrakud, mis sisaldavad kimäärse ABM, millel on üldiselt hiire B-Ly1 25

antikehaga sama sidumisspetsiifilisus, kodeerimisjärjestust ja mis avaldavad

bioloogiliselt aktiivseid geenisaaduseid, võib tuvastada vähemalt nelja üldise

lähenemisviisiga; (a) DNA-DNA või DNA-RNA hübridisatsioon; (b) „marker“ geeni

funktsioonide olemasolu või puudumine; (c) transkriptsioonitaseme hindamine,

mõõdetuna vastavate mRNA transkriptide ekspressiooniga peremeesrakus; ja (d) 30

EE - EP1692182 B1 63

geenisaaduse tuvastamine immuunsusanalüüsi või selle bioloogilise aktiivsuse

mõõtmisega.

Esimese võimaluse korral võib kimäärse ABM, millel on üldiselt sama

seondumisspetsiifilisus kui hiire B-Ly1 antikehal, kodeerimisjärjestuse ja GnTIII

aktiivsusega polüpeptiidi kodeerimisjärjestuse tuvastada DNA-DNA või DNA-RNA 5

hübridisatsiooniga, kasutades selleks proove, mis koosnevad

nukleotiidjärjestustest mis omakorda on homoloogsed vastavate kodeerimis-

järjestuste või nende osade või derivaatidega.

Teise meetodi korral saab rekombinantse ekspressioonivektori/peremeessüsteemi

tuvastada ja valida, tuginedes teatud „marker“ geeni funktsioonide olemasolule või 10

puudumisele (näiteks tümidiinkinaasi aktiivsus, resistentsus antibiootikumide

suhtes, resistentsus metotreksaadi suhtes, transformatsiooni fenotüüp,

oklusioonkeha moodustumine bakuloviiruses jne). Näiteks juhul, kui leiutise ABM

või selle fragmendi kodeerimisjärjestus ja GnTIII aktiivsusega polüpeptiidi

kodeerimisjärjestus sisestatakse vektori markergeeni järjestusse, saab vastavaid 15

kodeerimisjärjestusi sisaldavad rekombinantsed saadused tuvastada markergeeni

funktsiooni puudumise alusel. Alternatiivina võib markergeeni sisestada tandemina

kodeerimisjärjestustega samade või erinevate promootorite, mida

kodeerimisjärjestuste ekspressioonil kasutati, kontrolli all. Markeri ekspressioon

reageeringuna induktsioonile või selektsioonile näitab leiutise ABM 20

kodeerimisjärjestuse ekspressiooni ja GnTIII aktiivsusega polüpeptiidi

kodeerimisjärjestust.

Kolmandas meetodis võib leiutise ABM või selle fragmendi kodeeriva piirkonna

transkriptsionaalset aktiivsust ja GnTIII aktiivsust omava polüpeptiidi

kodeerimisjärjestuse aktiivsust hinnata hübridisatsiooni analüüsidega. Näiteks 25

RNA võib eraldada ja analüüsida Northern blot meetodiga, kasutades leiutise ABM

või selle fragmendi kodeerimisjärjestustega homoloogset proovi ja GnTIII

aktiivsust omava polüpeptiidi või selle konkreetsete osade kodeerimisjärjestust.

Alternatiivina võib ekstraheerida kõik peremeesraku nukleiinhapped ja analüüsida

nende hübridisatsiooni selliste proovide suhtes. 30

EE - EP1692182 B1 64

Neljandas meetodis võib valgusaaduste ekspressiooni hinnata immunoloogiliselt

(näiteks Western blot analüüsid), immuunsusanalüüside nagu „radioimmuno-

sadestumine“ või ensüümiga aheldatud immuunsusanalüüsidega. Kuid ülim test

ekspressioonisüsteemi edukuse määramiseks hõlmab bioloogiliselt aktiivsete

geenisaaduste tuvastust. 5

ABM, millel on suurenenud efektori funktsioon, k.a antikehast sõltuv rakuline

tsütotoksilisus, valmistamine ja kasutamine

Eelistatud teostuses pakutakse käesoleva leiutisega välja kimäärsete ABM, millel

on üldiselt sama sidumisspetsiifilisus kui hiire B-Ly1 antikehal ja suurenenud

efektori funktsioon, k.a antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus, glükovormid. 10

Antikehade glükomuundamist on kirjeldatud varasemalt. Vaadake näiteks USA

patenti nr. 6 602 684.

Kliinilised katsed konjugeerimata monoklonaalsete antikehade (mAb)

kasutamiseks mõningate kasvajatüüpide ravimisel on andnud viimasel ajal

julgustavaid tulemusi. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997); 15

Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997). Kimäärne konjugeerimata IgG1 on

kiidetud heaks väikse riskiga või follikulaarse B raku mitte-Hodgkinsi lümfoomi

ravimiseks. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997), samas kui

üks teine konjugeerimata mAb, inimese jaoks kohandatud IgG1, mis on suunatud

tahkete rinnakasvajate ravimisele, on III faasi kliinilistes katsetes samuti lubavaid 20

tulemusi demonstreeritud. Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997). Nende

kahe mAb antigeene avaldatakse tugevalt nende vastavates tuumorirakkudes ja

antikehad vahendavad potentsiaalset tuumori hävitamist efektorrakkude poolt in

vitro ja in vivo. Samas paljud konjugeerimata mAb, millel on hea

tuumorispetsiifilisus, ei suuda käivitada piisava potentsiaaliga efektori funktsioone, 25

mis osutuksid kliiniliselt kasulikeks. Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus

et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). Mõningate selliste nõrgemata mAb jaoks

katsetatakse hetkel täiendavat tsütokiini ravi. Tsütokiinide lisamine võib

stimuleerida antikehast sõltuvat rakulist tsütotoksilisust (ADCC), suurendades

vereringes leiduvate lümfotsüütide aktiivsust ja arvu. Frost et al., Cancer 80:317-30

33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). ADCC ehk lüütiline

rünnak antikeha märklaud-rakkude vastu käivitatakse pärast leukotsüüdi

EE - EP1692182 B1 65

retseptorite seondumist antikehade konstantse piirkonnaga (Fc). Deo et al.,

Immunology Today 18:127 (1997).

Erinevaks, kuid samas komplementaarseks meetodiks konjugeerimata IgG1

ADCC aktiivsuse suurendamiseks on antikeha Fc piirkonna muundamine. Valgu

muundamisuuringud on näidanud, et FcγR omab vastastikmõju IgG CH2 domeeni 5

madalama liigendpiirkonnaga. Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996). Kuid

FcγR seondumine nõuab samuti CH oleva konserveeritud Asn 297 külge

kovalentselt kinnitatud oligosahhariidide olemasolu. Lund et al., J. Immunol.

157:4963-69 (1996); Wright ja Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997), mis

võimaldab eeldada, et nii oligosahhariid kui ka polüpeptiid on mõlemad 10

vastastiktoime piirkonnaga seotud või on oligosahhariidi vaja aktiivse CH2

polüpeptiidi konformatsiooni säilitamiseks. Oligosahhariidi struktuuri

modifikatsiooni saab seega uurida kui vahendit vastastiktoime afiinsuse

suurendamiseks.

IgG molekul kannab oma Fc piirkonnas kahte N-aheldatud oligosahhariidi – üks 15

mõlemal raskel ahelal. Nagu iga glükovalk, toodetakse ka antikehad glükovormide

populatsioonina, mis omavad sama polüpeptiidist alustala, kuid

glükosüülimissaitide külge on kinnitatud erinevad oligosahhariidid. Seerumi IgG Fc

piirkonnas tavaliselt leiduvad oligosahhariidid on biantennaarsed kompleksid

(Wormald et al., Biochemistry 36:130-38 (1997)), millel on otsmise siaalhappe ja 20

poolitava N-atsetüülglükoosamiini (GlcNac) madalad tasemed ning erinevad

otsmise galaktosüülimise ja tuuma fukosüülimise tasemed. Mõningad uuringud

võimaldavad soovitada, et FcγR seondumiseks vajalik minimaalne süsivesiku

struktuur peitub oligosahhariidi tuumas. Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69

(1996). 25

Tööstuses ja konjugeerimata terapeutiliste mAb tootmisuuringutes kasutatud

hiirtelt ja hamstritelt deriveeritud rakuliinid kinnitavad tavaliselt vajalikud

oligosahhariidi määrajad Fc saitidele. Kuid nendes rakkudes avaldatud IgG

puudub poolitav GlcNac, mida leidub väikeses koguses seerumi IgG. Lifely et al.,

Glycobiology 318:813-22 (1995). Samas hiljuti täheldati, et roti müeloomiga 30

toodetud inimese jaoks kohandatud IgG1 (CAMPATH-1H) omas mõningates oma

glükovormides poolitavat GlcNAc. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995).

EE - EP1692182 B1 66

Roti rakust deriveeritud antikeha saavutas sarnase maksimaalse in vitro ADCC

aktiivsuse kui standardsete rakuliinide poolt toodetud CAMPATH-1H antikehad,

kuid märgatavalt madalamatel antikeha kontsentratsioonidel.

CAMPATH antigeeni leidub tavaliselt kõrgetel tasemetel lümfoomi rakkudes ja

kimäärsel mAb on poolitava GlcNAc puudumisel suur ADCC aktiivsus. Lifely et al., 5

Glycobiology 318:813-22 (1995). N-aheldatud glükosüülimisrada (poolitav GlcNAc)

lisatakse GnTIII poolt. Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986).

Varasemates uuringutes kasutati ühte antikeha tootvat CHO rakuliini, mida oli

eelnevalt kloonitud GnTIII geeni ensüümi erinevate tasemete avaldamiseks väliselt

reguleeritud viisil muundatud (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 10

(1999)). See meetod lõi esimest korda jäiga korrelatsiooni GnTIII ekspressiooni ja

modifitseeritud antikeha ADCC aktiivsuse vahel. Seega sisaldab leiutise süsteem

rekombinantset kimäärset antikeha või selle fragmenti, millel on hiire B-Ly1

antikeha sidumisspetsiifilisus ja suurenenud GnTIII aktiivsusest tingitud muudetud

glükosüülimisomadused. Suurenenud GnTIII aktiivsus põhjustab ABM Fc 15

piirkonnas nii poolitatud oligosahhariidide protsendi suurenemise kui ka fukoosi

jääkide protsendi vähenemise. Sellel antikehal või selle fragmendil on suurenenud

Fc retseptori sidumisafiinsus ja suurenenud efektori funktsioon. Lisaks seondub

leiutis antikeha fragmendi ja fusioonvalkudega, mis sisaldavad immunoglobuliinide

Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda. 20

Vastavalt käesoleva leiutise meetoditele valmistatud ABM terapeutiline

kasutamine

Käesoleva leiutise ABM võib kasutada iseseisvalt tuumorirakkude leidmiseks ja

hävitamiseks in vivo. ABM võib samuti kasutada koos sobiva terapeutilise ainega

inimese kartsinoomi ravimiseks. Näiteks võib ABM kasutada kombineeritult 25

standardsete või tavapäraste ravimeetoditega nagu kemoteraapia, kiiritusravi või

konjugeerida või aheldada terapeutilise aine transportimiseks kartsinoomi

asukohta nii terapeutilise ravimi või toksiini kui ka lümfokiini või tuumorit

inhibeeriva kasvufaktoriga. Esmase tähtsusega käesoleva leiutise ABM

konjugaatideks on (1) immunotoksiinid (ABM ja tsütotoksilise fragmendi 30

konjugaadid) ja (2) märgistatud (näiteks radiomärgistatud, ensüüm-märgistatud või

EE - EP1692182 B1 67

fluorokroom-märgistatud) ABM, kus märgis loob vahendid märgistatud ABM

sisaldavate immuunsuskomplekside tuvastamiseks. ABM võib samuti kasutada

lahustuse indutseerimiseks läbi loodusliku kromosoomistikprotsessi ja

vastastiktoimeks tavaliselt esinevate antikehast sõltuvate tsütotoksiliste

rakkudega. 5

Immunotoksiini tsütotoksiliseks fragmendiks võib olla tsütotoksiline ravim või

bakteritelt või taimedelt pärinev ensümaatiliselt aktiivne toksiin või sellise toksiini

ensümaatiliselt aktiivne fragment („A ahel“). Kasutatavateks ensümaatiliselt

aktiivseteks toksiinideks või nende fragmentideks on difteeria A ahel,

difteeriatoksiini mittesiduvad aktiivsed fragmendid, eksotoksiini A ahel (pärineb 10

Pseudomonas aeruginosa), ritsiini A ahel, abriini A ahel, modeksiini A ahel, alfa-

sartsiin, Aleurites fordii valgud, diantiini valgud, Phytolacca americana valgud

(PAPI, PAPII ja PAP-S), momordica charantia inhibiitor, kurtsiin, krotiin,

sapaonaria officinalis inhibiitor, geloniin, mitogeliin, restriktotsiin, fenomütsiin ja

enomütsiin. Ühes muus teostuses on ABM konjugeeritud väikese molekuliga 15

kasvajavastaste ravimitega. ABM ja selliste tsütotoksiliste fragmentide

konjugaadid valmistatakse erinevaid bifunktsionaalseid valke siduvaid aineid

kasutades. Selliste reagentide näideteks on SPDP, IT, imidoestrite

bifunktsionaalsed derivaadid nagu dimetüüladipimidaat, HCl, aktiivsed estrid nagu

disukinimidüülsuberaat, aldehüüdid nagu glutaaraldehüüd, bis-asidoühendid nagu 20

bis(p-asidobensoüül)heksaandiamiin, bis-diasooniumi derivaadid nagu bis-(p-

diasooniumbensoüül)-etüleendiamiin, diisotsüanaadid nagu tolüleen 2,6-

diisotsüanaat ja bis-aktiivsed fluori ühendid nagu 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenseen.

Toksiini lahustava osa võib ühendada ABM Fab fragmendiga. Täiendavad sobivad

toksiinid on valdkonnas teada, millele aitab kinnitust leida näiteks publitseeritud 25

USA patenditaotlus nr. 2002/0128448.

Ühes teostuses konjugeeritakse kimäärne glükomuundatud ABM, millel on üldiselt

sama sidumisspetsiifilisus kui hiire B-Ly1 antikehal, ritsiini A ahelaga. Kõige

eelistatumalt on ritsiini A ahel deglükosüülitud ja valmistatud rekombinantsete

vahenditega. Eelistatud meetodit ritsiini immunotoksiini valmistamiseks on 30

kirjeldanud Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987).

EE - EP1692182 B1 68

Kasutatuna inimese kasvajarakkude hävitamiseks in vitro diagnostilistel

eesmärkidel, lisatakse konjugaadid tavaliselt rakukultuuri söötmele

kontsentratsiooniga vähemalt umbes 10 nM. In vitro kasutamisel ei ole koostis ja

manustamisviis kriitilise tähtsusega. Tavaliselt kasutatakse veelisi koostisi, mis

sobivad perfusioonisöötme kultuuriga. Kasvaja olemasolu või leviku astme 5

mõõtmisel võib tsütotoksilisuse mõõta tavapäraste tehnikatega.

Nagu eelnevalt mainitud, võib kasvaja ravimiseks mõeldud tsütotoksilise

radiofarmatseutilise aine valmistada, konjugeerides radioaktiivse isotoobi (näiteks

I, Y, Pr) kimäärse glükomuundatud ABM, millel on üldiselt sama

sidumisspetsiifilisus kui hiire B-Ly1 antikehal. Mõiste „tsütotoksiline fragment“ on 10

siin kasutatuna mõeldud selliseid isotoope hõlmama.

Ühes muus teostuses täidetakse liposoomid tsütotoksilise ravimiga ja kaetakse

seejärel käesoleva leiutise ABM. Kuna pahaloomulise B raku pinnal on palju CD20

molekule, võimaldab see meetod suure koguse ravimi transportimist õigesse

rakutüüpi. 15

Tehnikad selliste terapeutiliste ainete konjugeerimiseks antikehadega on hästi

teada (vaadake näiteks Amon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting

of Drugs in Cancer Therapy", teoses Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,

Reisfeld et al. (eds.), lk 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al.,

"Antibodies For Drug Delivery", teoses Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), 20

Robinson et al. (eds.), lk 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody

Carriers Of Cytotoxic Agents teoses Cancer Therapy: A Review", teoses

Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al.

(eds.), lk 475-506 (1985); ja Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic

Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)). 25

Veel üks leiutise ABM terapeutiline rakendusviis hõlmab konjugatsiooni või

aheldust (näiteks rekombinantse DNA tehnikatega) ensüümiga, mis on võimeline

muundama eelravimi tsütotoksiliseks ravimiks ning nimetatud antikeha-ensüümi

konjugaadi kasutamist kombineeritult eelravimiga, et muuta eelravim tuumori

piirkonnas tsütotoksiliseks ravimiks (vaadake näiteks Senter et al., "Anti-Tumor 30

Effects of Antibody-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4842-46

EE - EP1692182 B1 69

(1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of

Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-

Alkaline Phosphatase Conjugates", Cancer Research 49:5789-5792 (1989); ja

Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates:ANewApproach

to Cancer Therapy, "FASEBJ. 4:188-193 (1990)). 5

Veel üks leiutise ABM terapeutiline kasutus hõlmab tuumorirakkude eemaldamist

kasvajaga patsientide luuüdist kas konjugeerimata kujul (komplemendi

juuresolekul) või antikeha-ravimi või antikeha-toksiini konjugaadi osana. Vastavalt

sellele meetodile võib autoloogse luuüdi puhastada ex vivo läbi ravi antikehaga ja

seejärel infundeeritakse luuüdi patsiendile tagasi [vaadake näiteks Ramsay et al., 10

"Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J. Clin. Immunol., 8(2):81-

88 (1988)].

Lisaks vaadeldakse, et leiutis sisaldab ühe ahelaga immunotoksiini, mis sisaldab

antigeeni siduvaid domeene, mis omakorda võimaldavad üldiselt sama

sidumisspetsiifilisust kui hiire B-Ly1 antikeha (näiteks polüpeptiid, mis sisaldab 15

hiire B-Ly1 antikeha CDR) ja sisaldavad täiendavalt toksiini polüpeptiidi. Leiutise

ühe ahelaga immunotoksiine võib kasutada inimeste kartsinoomide ravimiseks in

vivo.

Sarnaselt võib inimese kartsinoomi in vivo ravimiseks kasutada fusioonvalku, mis

sisaldab vähemalt leiutise ABM antigeeni siduvat piirkonda, mis on liidetud 20

vähemalt tuumorivastase aktiivsusega teise valgu funktsionaalselt aktiivse osaga

(näiteks lümfokiin või onkostatiin).

Käesolevat leiutist saab kasutada CD20 avaldavate tuumorirakkude selektiivseks

hävitamiseks. Nimetatud meetod hõlmab leiutise immunokonjugaadi (näiteks

immunotoksiin) reageerimist nimetatud tuumorirakkudega. Need tuumorirakud 25

võivad pärineda inimese kartsinoomist.

Lisaks võib leiutist kasutada kartsinoomide (näiteks inimese kartsinoomid)

ravimiseks in vivo. See meetod hõlmab patsiendile farmatseutiliselt efektiivse

koguse koostise, mis sisaldab vähemalt ühte leiutise immunokonjugaatidest

(näiteks immunotoksiin), manustamist. 30

EE - EP1692182 B1 70

Täiendava teostusena võib leiutist kasutada täiustatud meetodis B raku

proliferatiivsete häirete (näiteks B raku lümfoom) ja autoimmuunse haiguse, mis

on tekkinud täielikult või osaliselt patogeensete autoantikehade tõttu, ravimiseks

läbi B rakkude eemaldamise; nimetatud meetod hõlmab seda vajavale

inimpatsiendile terapeutiliselt efektiivse koguse käesoleva leiutise ABM 5

manustamist. ABM on glükomuundatud anti-CD20 antikeha, mille

sidumisspetsiifilisus on üldiselt sarnane hiire B-Ly1 antikeha vastavate näitajatega;

nimetatud antikeha on inimese jaoks kohandatud. Autoimmuunhaiguste või -

häirete näited hõlmavad, olemata nendega piiratud, immuun-vahendatud

trombotsütopeeniaid nagu akuutne idiopaatiline trombotsütopeeniline purpur ja 10

krooniline idiopaatiline trombotsütopeeniline purpur, dermatomüosiit, Sydenhami

korea, luupusnefriit, reumaatiline palavik, polüglandulaarsed sündroomid, Henoch-

Schonleini purpur, streptokokk-infektsiooni järgne nefriit, sõlmjas erüteem,

Takayasu arteriit, Addisoni tõbi, multiformne erüteem, nodoosne polüartriit,

anküloseeriv spondüliit, Goodpasture sündroom, oblitereeriv endarteriit, primaarne 15

biliaarne tsirroos, Hashimoto türeoidiit, türeotoksikoos, krooniline aktiivne hepatiit,

polümüosiit/dermatomüosiit, polükondriit, harilik villtõbi, Wegeneri granulomatoos,

membraani nefropaatia, amüotroofiline lateraalskleroos, seljaajukuive,

polümüalgia, kahjulik aneemia, kiiresti süvenev glomerulonefriit ja fibroseeruv

alveoliit, põletikulised reageeringud nagu põletikulised nahahaigused, k.a psoriaas 20

ja dermatiit (näiteks atoopiline dermatiit); süsteemne sklerodermia ja skleroos;

põletikulise soolehaigusega seonduvad reageeringud (nagu Crohni tõbi ja

haavandiline koliit); respiratoorse distressi sündroom (k.a täiskasvanu

respiratoorse distressi sündroom; ARDS); dermatiit; meningiit; entsefaliit;

soonkestapõletik; jämesoolepõletik; glomerulonefriit; allergilised seisundid nagu 25

ekseem ja astma ning muud seisundid, mis hõlmavad T rakkude sissetungi ja

kroonilisi põletikulisi reageeringuid; ateroskleroos; leukotsüüdi kleepumishäire;

reumaatiline artriit; süsteemne erütematoosne luupus (SLE); diabeet (näiteks

esimest tüüpi diabeet või insuliinist sõltuv diabeet); sclerosis multiplex; Reynaud

sündroom; autoimmuunne türoidiit; allergiline entsefalomüeliit; Sjörgeni sündroom; 30

raske suhkrutõbi varajase algusega; ja immuunreageeringud, mis seonduvad

tsütokiinide ning T-lümfotsüütide vahendatud akuutse ja viivitatud ülitundlikkusega

ja mis esinevad tavaliselt koos tuberkuloosi, sarkoidoosi, polümüosiidi,

EE - EP1692182 B1 71

granulomatoosi ja vaskuliidiga; pahaloomuline aneema (Addisoni tõbi); haigused,

mis hõlmavad leukotsüüdi diapedeesi; kesknärvisüsteemi (KNS) põletikuline häire;

mitme organi vigastussündroom; hemolüütiline aneemia (k.a, olemata samas

nendega piiratud krüoglobineemia või Coombsi positiivne aneemia); raskekujuline

müasteenia; antigeen-antikeha kompleksi vahendatud haigused; Goodpasture´i 5

sündroom; antifosfolipiidi sündroom; allergiline neuriit; Gravesi tõbi; Lambert-

Eatoni sündroom; bulloosne pemfigoid; pemfigus; autoimmuunne

polüendokrinopaatia; Reiteri tõbi; kangestunud mehe sündroom; Behceti tõbi;

hiidraku artriit; immuunkompleksi nefriit; IgA nefropaatia; IgM polüneuropaatiad;

immuunne trombotsütopeeniline purpur (ITP) või autoimmuunne 10

trombotsütopeenia jne. Selles leiutise teostuses kasutatakse leiutise ABM B

rakkude hulga vähendamiseks veres pikendatud perioodi jooksul.

Vastavalt käesoleva leiutise tavale võivad patsientideks olla inimesed, hobused,

sead, veised, hiired, koerad, kassid ja linnud. Käesoleva leiutisega on samuti

hõlmatud muud soojaverelised loomad. 15

Käesolevat leiutist saab kasutada meetodites inimese tuumorirakkude kasvu

inhibeerimiseks, tuumori ravimiseks patsiendil ja proliferatiivse haiguse ravimiseks

patsiendil. Need meetodid hõlmavad patsiendile efektiivse koguse leiutise ühendi

manustamist.

Seega on mõistetav, et käesolev leiutis hõlmab ravimkoostisi, kombinatsioone ja 20

meetodeid inimeste kartsinoomide (näiteks B raku lümfoom) ravimiseks. Leiutis

hõlmab näiteks inimese kartsinoomide ravimiseks kasutatavaid ravimkoostisi, mis

koosnevad farmatseutiliselt efektiivsest kogusest käesoleva leiutise antikehast ja

farmatseutiliselt aktsepteeritavast kandurist.

Käesoleva leiutise ABM koostised saab manustada tavapäraseid manustamisviise 25

kasutades, k.a (olemata samas nendega piiratud) intravenoosne,

intraperitoneaalne, suukaudne, intralümfaatiline või otse kasvajasse manustamine.

Eelistatud on intravenoosne manustamine.

Ühes leiutise teostuses valmistatakse leiutise ABM sisaldavad ravimkoostised

hoiustamiseks, segades soovitud puhtusastmega antikeha valikuliste 30

EE - EP1692182 B1 72

farmatseutiliselt aktsepteeritavate kandurite, ekstsipientide või stabilisaatoritega

(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))

lüofiliseeritud koostiste või vesilahuste vormis. Sobivad kandurid, ekstsipiendid või

stabilisaatorid on patsientidele kasutatud dooside ja kontsentratsioonide juures

mittetoksilised ning hõlmavad ühendeid, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad 5

puhvrid nagu fosfaat, tsitraat ja muud orgaaniliste hapete soolad; antioksüdandid

nagu askorbiinhape ja metioniin; säilitusained (näiteks

oktadetsüüldimetüülbensüül-ammooniumkloriid; heksametooniumkloriid;

bensalkooniumkloriid, benetooniumkloriid; fenool-, butüül- või bensüülalkohol);

alküülparabeenid nagu metüül- või propüülparabeen; katehhool; resortsinool; 10

tsükloheksanool; 3-pentanool; ja m-kresool); madala molekulmassiga (vähem kui

umbes 10 jääki) polüpeptiidid; valgud nagu seerumalbumiin, želatiin või

immunoglobuliinid; hüdrofiilsed polümeerid nagu polüvinüülpürrolidoon;

aminohapped nagu glütsiin, glutamiin, asparagiin, histidiin, arginiin või lüsiin;

monosahhariidid, disahhariidid ja muud süsivesikud, k.a glükoos, mannoos või 15

dekstriinid; kelaativad ained nagu EDTA; suhkrud nagu sahharoos, mannitool,

trehaloos või sorbitool; soolasid moodustavad vastasioonid nagu naatrium;

metallkompleksid (näiteks Zn-valgu kompleksid); ja/või mitteioonsed pindaktiivsed

ained nagu TWEEN™, PLURONICS™ või polüetüleenglükool (PEG).

Näitlikke anti-CD20 ABM koostisi on kirjeldatud patendis WO98/56418. Selles 20

publikatsioonis kirjeldatakse vedelat mitut doosi sisaldavat koostist, mis sisaldab

40 mg/ml kohta rituximab, 25 mM atsetaati, 150 mM trehaloosi, 0,9%

bensüülakoholi ja 0,02% polüsorbaat 20; koostise pH tase on 5,0 ja minimaalseks

hoiustusperioodiks temperatuuril 2 - 8 oC on kaks aastat. Veel üks huvi pakkuv

anti-CD20 koostis sisaldab 10 mg/ml rituximab lahust, mis koosneb 9,0 mg/ml 25

kohta naatriumkloriidist, 7,35 mg/ml kohta naatriumtsitraadi dihüdraadist, 0,7

mg/ml kohta polüsorbaat 80 ja süstimiseks mõeldud steriilsest veest; lahuse pH on

6,5. Käesolevas leiutises asendatakse RITUXAN® käesoleva leiutise ABM.

Subkutaanseks manustamiseks kohandatud lüofiliseeritud koostisi on kirjeldatud

patendis WO 97/04801. Sellised lüofiliseeritud koostised võib taastada sobiva 30

lahjendi abil suure valgukontsentratsioonini ja taastatud koostise võib manustada

subkutaanselt selle abil ravitavale imetajale.

EE - EP1692182 B1 73

Siin kirjeldatud koostis võib samuti sisaldada vajaduse korral konkreetse häire

ravimiseks rohkem kui ühte aktiivühendit ja eelistatud on ühendid, mille täiendavad

aktiivsused ei mõjuta üksteist ebasobival viisil. Näiteks võib olla soovitav lisada

täiendav tsütotoksiline aine, kemoterapeutiline aine, tsütokiin või immuunvastust

mahasuruv aine (näiteks aine, mis toimib T rakkudel (tsüklosporiin) või T rakke 5

siduv antikeha nagu LFA-1 siduv antikeha). Selliste muude ainete efektiivne kogus

sõltub koostises oleva antagonisti kogusest, ravitava haiguse või häire tüübist ja

muudest eelnevalt mainitud faktoritest. Täiendavaid ühendeid kasutatakse üldiselt

samade dooside ja samade manustamisviisidega kui siin eelnevalt mainitud või

vahemikus 1 kuni 99% siin eelnevalt rakendatud doosi suurustest. 10

Aktiivained võib samuti sulgeda mikrokapslitesse, mis on valmistatud näiteks

koagulatsioonitehnikate või pindaktiivse polümerisatsiooniga, näiteks

hüdroksümetüültselluloosist või želatiinist mikrokapslid ja polü-

(metüülmetatsülaadi) mikrokapslid vastavalt kolloidsetes ravimi

transportimissüsteemides (näiteks liposoomid, albumiini mikrosfäärid, 15

mikroemulsioonid, nanoosakesed ja nanokapslid) või makroemulsioonides.

Sellised tehnikad on avaldatud teoses Remington’s Pharmaceutical Sciences 16h

edition, Osol, A. Ed. (1980).

Valmistada võib ka pideva vabanemisega preparaadid. Pideva vabanemisega

koostiste sobivad näited hõlmavad antagonisti sisaldavate tahkete hüdrofoobsete 20

polümeeride poolläbitavaid maatrikseid ja nimetatud maatriksid on vormitud kujul,

näiteks kiled või mikrokapslid. Pideva vabanemisega maatriksite näideteks on

polüestrid, hüdrogeelid (näiteks polü(2-hüdroksüetüülmetakrülaat) või

polü(vinüülalkohol)), polülaktiidid (USA patent nr. 4 774 919), L-glutaamhappe ja

γ-etüül-L-glutamaadi kopolümeerid, lagunematu etüleenvinüülatsetaat, lagunevad 25

piimhappe-glükoolhappe kopolümeerid nagu LUPRON DEPOT™ (süstitavad

mikrosfäärid, mis koosnevad piimhappe-glükoolhappe kopolümeerist ja

leuproliidatsetaadist) ja polü-D-(-)-3-hüdroksübutüürhape.

In vivo manustamiseks kasutatavad ravimkoostised peavad olema steriilsed. See

on kergesti saavutatav filtreerimisega läbi steriilsete filtreerimismembraanide. 30

EE - EP1692182 B1 74

Leiutise koostised võivad esineda erinevates doseerimisvormides, mis hõlmavad,

olemata nendega piiratud, vedelaid lahuseid või suspensioone, tablette, pille,

pulbreid, ravimküünlaid, polümeerseid mikrokapsleid või mikropõiekesi, liposoome

ja süstitavaid või sulamatuid lahuseid. Eelistatud vorm sõltub manustamisviisist ja

terapeutilisest rakendamisest. 5

Leiutise koostised sisaldavad samuti eelistatult tavapäraseid praktikas teada

olevaid farmatseutiliselt aktsepteeritavaid kandureid ja abiaineid nagu inimese

seerumalbumiin, ioonivahetajad, alumiinium, letsitiin, puhverained nagu fosfaadid,

glütsiin, sorbhape, kaaliumsorbaat ja soolad või elektrolüüdid nagu

protamiinsulfaat. 10

Käesoleva leiutise ravimkoostiste kõige efektiivsem manustamis- ja

doseerimisrežiim sõltuvad haiguse tõsisusest ja käigust, patsiendi tervislikust

seisundist ja reageeringust ravile ning raviarsti otsusest. Seega tuleks koostiste

doosid iga patsiendi jaoks eraldi tiitrida. Hoolimata sellest jääb leiutise koostiste

efektiivne doos üldiselt vahemikku umbes 0,01 kuni umbes 2000 mg/kg kohta. 15

Siin kirjeldatud molekulid võivad olla erinevates doseerimisvormides, mis

hõlmavad, olemata nendega piiratud, vedelaid lahuseid või suspensioone, tablette,

pille, pulbreid, ravimküünlaid, polümeerseid mikrokapsleid või mikropõiekesi,

liposoome ja süstitavaid või sulamatuid lahuseid. Eelistatud vorm sõltub

manustamisviisist ja terapeutilisest rakendamisest. 20

Käesoleva leiutise ABM sisaldav koostis formuleeritakse, doseeritakse ja

manustatakse viisil, mis vastab heale meditsiinilisele tavale. Selles kontekstis on

kaalumist vajavateks faktoriteks konkreetne ravitav haigus või häire, konkreetne

ravitav patsient, patsiendi kliiniline seisund, haiguse või häire põhjus, aine

transportimispiirkond, manustamismeetod, manustamisgraafik ja muud 25

meditsiinitöötajatele teada olevad faktorid. Manustatava antagonisti terapeutiliselt

efektiivne kogus sõltub sellistest asjaoludest.

Üldise soovitusena jääb parenteraalselt manustatud antikeha terapeutiliselt

efektiivne kogus doseerimisel vahemikku 0,1 kuni 20 mg/kg patsiendi kehamassi

EE - EP1692182 B1 75

kohta päevas ja kasutatava antagonisti algne tase jääb tavaliselt vahemikku

umbes 2 kuni 10 mg/kg kohta.

Ühes eelistatud teostuses on ABM antikeha ja eelistatult inimese jaoks

kohandatud antikeha. Sellise konjugeerimata antikeha sobivad doosid jäävad

näiteks vahemikku umbes 20 mg/m2 kuni umbes 1000 mg/m2. Ühes teostuses 5

erineb antikeha doos doosist, mis on üldiselt soovitatud RITUXAN® jaoks. Näiteks

võib patsiendile manustada ühe või mitu antikeha doosi, mis on väiksemad kui 375

mg/m2 koha, näiteks jäävad doosid vahemikku umbes 20 mg/m2 kuni umbes 250

mg/m2 kohta, näiteks vahemikku umbes 50 mg/m2 kuni umbes 200 mg/m2.

Lisaks võib manustada ühe või mitu algset antikeha doosi ja sellele järgnevalt ühe 10

või rohkem järgnevat doosi, kus mg/m2 antikeha doos järgnevates doosides ületab

algse doosi antikeha mg/m2 näitaja. Näiteks võib algne doos jääda vahemikku

umbes 20 mg/m2 kohta kuni umbes 250 mg/m2 kohta (näiteks umbes 50 mg/m2

kohta kuni umbes 200 mg/m2 kohta) ja järgnev doos võib jääda vahemikku umbes

250 mg/m2 kohta kuni umbes 1000 mg/m2 kohta. 15

Kuid nagu eelnevalt mainitud, on need soovitatud ABM kogused suuresti

terapeutilise valikuvabaduse poolt mõjutatavad. Võtmetähtsusega faktoriks sobiva

doosi ja graafiku valimisel on saadud tulemus (vaadake eelnevalt). Näiteks

süvenevate ja akuutsete haiguste ravimisel võib algselt vaja minna suhteliselt

kõrgemaid doose. Sõltuvalt haigusest või häirest kõige efektiivsemata tulemuste 20

saamiseks manustatakse antagonist võimalikult kiiresti pärast haiguse või häire

esimest märki, diagnoosi, ilmnemist või esinemist või haiguse või häire remissiooni

käigus.

Käesoleva leiutise ABM manustatakse mistahes sobival viisil, k.a parenteraalne,

subkutaanne, intraperitoneaalne, intrapulmonaarne ja intranasaalne manustamine 25

ja kui lokaalse immuunvastust mahasuruva ravi jaoks on vajalik, siis ka

intralesionaalne manustamine. Parenteraalsed infusioonid hõlmavad

intramuskulaarset, intravenoosset, intraarteriaalset, intraperitoneaalset või

subkutaanset manustamist. Lisaks võib antagonisti manustada sobivuse korral

impulss-infusiooniga, kasutades näiteks antagonisti vähenevaid doose. Eelistatult 30

toimub doseerimine süstidega ja kõige eelistatumalt intravenoossete või

EE - EP1692182 B1 76

subkutaansete süstidega sõltuvalt sellest, kas manustamine on lühiajaline või

krooniline.

Koos siin kirjeldatud antagonistidega võib manustada ka muud ühendid nagu

tsütotoksilised ained, kemoterapeutilised ained, immuunvastust mahasuruvad

ained ja/või tsütokiinid. Kombineeritud manustamine hõlmab kaasmanustamist 5

eraldi koostisi või ühte ravimkoostist kasutades ja üksteisele järgnevat

manustamist mistahes järjekorras, kus eelistatult esineb ajavahemik, kus mõlemad

(või kõik) aktiivained avaldavad oma bioloogilisi aktiivsusi samaaegselt.

On selge, et graafiku optimeerimiseks võib leiutise koostise doosi, mis on raviks

vajalik, täiendavalt vähendada. 10

Vastavalt leiutise tavale võib farmatseutiliseks kanduriks olla lipiidist kandur.

Lipiidist kanduriks võib olla fosfolipiid. Lisaks võib lipiidist kanduriks võib olla

rasvahape. Lipiidist kanduriks võib olla ka pesuaine. Siin kasutatuna on

pesuaineks mistahes aine, mis muudab vedeliku pindpinevust, seda tavaliselt

vähendades. 15

Ühes leiutise näites võib pesuaineks olla mitteioonne pesuaine. Mitteioonsete

pesuainete näited hõlmavad, olemata samas nendega piiratud, polüsorbaat 80

(teada ka kui Tween 80 või (polüoksüetüleensorbitanmonooleaat), Brij ja Triton

(näiteks Triton WR-1339 ja Triton A-20).

Alternatiivina võib pesuaineks olla ioonne pesuaine. Ioonse pesuaine näiteks on 20

alküültrimetüülammooniumbromiid, olemata samas sellega piiratud.

Lisaks võib lipiidist kandur olla vastavalt leiutisele liposoom. Käesolevas

dokumendis kasutatuna on „liposoomiks“ mistahes membraaniga seotud põieke,

mis sisaldab leiutise mistahes molekule või nende kombinatsioone.

Järgnevatest teostustes on mainitud spetsiifilisi teostusi, mis on olulised: 25

Punkt 1: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb:

a. järjestusest, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:

6 ja SEQ ID NO: 7; ja

EE - EP1692182 B1 77

b. järjestusest, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 21, SEQ ID

NO: 22 ja SEQ ID NO: 23; ja

c. SEQ ID NO: 24.

Punkt 2: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ja

SEQ ID NO: 10. 5

Punkt 3: punktile 1 või punktile 2 vastav eraldatud polünukleotiid, mis kodeerib

fusioonpolüpeptiidi.

Punkt 4: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 3.

Punkt 5: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 4.

Punkt 6: punktile 4 või punktile 5 vastav eraldatud polünukleotiid, kus nimetatud 10

polünukleotiid kodeerib fusioonpolüpeptiidi.

Punkt 7: eraldatud polünukleotiid, mille järjestus on vähemalt 80% ulatuses

identne SEQ ID NO: 3; nimetatud eraldatud polünukleotiid kodeerib

fusioonpolüpeptiidi.

Punkt 8: eraldatud polünukleotiid, mille järjestus on vähemalt 80% ulatuses 15

identne SEQ ID NO: 4; nimetatud eraldatud polünukleotiid kodeerib

fusioonpolüpeptiidi.

Punkt 9: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb:

a. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi järjestusega SEQ ID NO: 1; ja

b. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus pärineb antikeha Fc 20

piirkonnast või selle fragmendist ja mis ei pärine hiirtelt.

Punkt 10: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb:

a. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi järjestusega SEQ ID NO: 2; ja

b. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus pärineb antikeha Fc

piirkonnast või selle fragmendist ja mis ei pärine hiirtelt. 25

EE - EP1692182 B1 78

Punkt 11: eraldatud polünukleotiid, mis kodeerib SEQ ID NO: 1 järjestust omavat

polüpeptiidi.

Punkt 12: eraldatud polünukleotiid, mis kodeerib SEQ ID NO: 2 järjestust omavat

polüpeptiidi.

Punkt 13: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 11. 5

Punkt 14: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 12.

Punkt 15: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 80%

ulatuses identne SEQ ID NO: 11 või SEQ ID NO: 12.

Punkt 16: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 85%

ulatuses identne SEQ ID NO: 11 või SEQ ID NO: 12. 10

Punkt 17: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 90%

ulatuses identne SEQ ID NO: 11 või SEQ ID NO: 12.

Punkt 18: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 95%

ulatuses identne SEQ ID NO: 11 või SEQ ID NO: 12.

Punkt 19: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 99% 15

ulatuses identne SEQ ID NO: 11 või SEQ ID NO: 12.

Punkt 20: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 13 (raske ahel aa)

polüpeptiidi kodeerivat järjestust.

Punkt 21: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 14 (kerge ahel aa)

polüpeptiidi kodeerivat järjestust. 20

Punkt 22: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb:

a. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille VH piirkond pärineb hiire B-Ly1

antikehalt või selle variantidelt; ja

b. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus pärineb antikeha Fc

piirkonnast või selle fragmendist ja mis ei pärine hiirtelt. 25

Punkt 23: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb:

EE - EP1692182 B1 79

a. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille VL piirkond pärineb hiire B-Ly1

antikehalt või selle variantidelt; ja

b. järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus pärineb antikeha Fc

piirkonnast või selle fragmendist ja mis ei pärine hiirtelt.

Punkt 24: ekspressioonivektor, mis koosneb mistahes punktile 1 kuni 23 vastavast 5

eraldatud polünukleotiidist.

Punkt 25: punkti 24 vektor, kus nimetatud vektor on paljutsistroniline.

Punkt 26: punktile 24 vastavat ekspressioonivektorit sisaldav peremeesrakk.

Punkt 27: peremeesrakk, mis koosneb mistahes punktile 1 kuni 23 vastavast

eraldatud polünukleotiidist. 10

Punkt 28: polüpeptiid, mis sisaldab hiire B-Ly1 antikehast deriveeritud järjestust ja

heteroloogsest polüpeptiidist deriveeritud järjestust.

Punkt 29: punkti 28 polüpeptiidi sisaldav antigeeni siduv molekul.

Punkt 30: punktile 29 vastav antigeeni siduv molekul, mis seob inimese CD20.

Punkt 31: punktile 29 vastav antigeeni siduv molekul, milleks on antikeha. 15

Punkt 32: punktile 31 vastav antigeeni siduv molekul, milleks on kimäärne

antikeha.

Punkt 33: punktile 31 vastav antigeeni siduv molekul, milleks on inimese jaoks

kohandatud antikeha.

Punkt 34: punktile 31 vastav antigeeni siduv molekul, milleks on primaatide jaoks 20

kohandatud antikeha.

Punkt 35: kimäärne antikeha, mis sisaldab SEQ ID NO: 1 järjestust või selle

varianti.

Punkt 36: kimäärne antikeha, mis sisaldab SEQ ID NO: 2 järjestust või selle

varianti. 25

EE - EP1692182 B1 80

Punkt 37: kimäärne polüpeptiid, mis koosneb:

d. polüpeptiidist, mille järjestus on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO:

15, SEQ ID NO: 16 ja SEQ ID NO: 17; ja

e. polüpeptiidist, mille järjestus on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO:

25, SEQ ID NO: 26 ja SEQ ID NO: 27; ja 5

f. SEQ ID NO: 28.

Punkt 38: punktile 37 vastav kimäärne polüpeptiid, mis koosneb täiendavalt raske

ahela varieeruva piirkonna raamist, kus nimetatud raam sisaldab positsioonil 71

(vastavalt Kabat´ nummerdusele) alaniini jääki.

Punkt 39: punktile 37 vastav kimäärne polüpeptiid, mis koosneb täiendavalt raske 10

ahela varieeruva piirkonna raamist, kus nimetatud raam sisaldab positsioonil 94

(vastavalt Kabat´ nummerdusele) arginiini jääki.

Punkt 40: kimäärne polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ja

SEQ ID NO: 20.

Punkt 41: eraldatud polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 13 või selle varianti. 15

Punkt 42: eraldatud polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 14 või selle varianti.

Punkt 43: mistahes punktile 35 kuni 40 vastav eraldatud polüpeptiid, kus

nimetatud polüpeptiidiks on fusioonpolüpeptiid.

Punkt 44: antigeeni siduv molekul, mis sisaldab punkti 43 eraldatud polüpeptiidi.

Punkt 45: punkti 44 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks 20

molekuliks on antikeha.

Punkt 46: punkti 45 antikeha, kus nimetatud antikeha on primaadi jaoks

kohandatud antikeha.

Punkt 47: punkti 45 antikeha, kus nimetatud antikeha on inimese jaoks

kohandatud antikeha. 25

EE - EP1692182 B1 81

Punkt 48: punkti 44 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks

molekuliks on antikeha fragment.

Punkt 49: punkti 48 antikeha fragment, kus nimetatud antikeha fragment on

primaadi jaoks kohandatud.

Punkt 50: punkti 48 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antikeha fragment on 5

inimese jaoks kohandatud.

Punkt 51: antigeeni siduv molekul, mis on võimeline CD20 sidumisel hiire B-Ly1

antikehaga konkureerima ja nimetatud antigeeni siduv molekul on kimäärne.

Punkt 52: punkti 51 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks

molekuliks on antikeha. 10

Punkt 53: punkti 52 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antikeha on primaadi

jaoks kohandatud.

Punkt 54: punkti 51 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud rekombinantne

antikeha on inimese jaoks kohandatud.

Punkt 55: punkti 51 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud rekombinantne 15

antikeha sisaldab inimese Fc piirkonda.

Punkt 56: punkti 55 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud inimese Fc piirkonnaks

on inimese IgG Fc piirkond.

Punkt 57: mistahes punkti 29 kuni 34 või 44 kuni 56 antigeeni siduv molekul, kus

nimetatud antigeeni siduval molekulil on modifitseeritud oligosahhariididega Fc 20

piirkond.

Punkt 58: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud Fc piirkonda

on modifitseeritud väiksemaks fukoosi jääkide sisalduseks võrreldes

modifitseerimata antigeeni siduva molekuliga.

Punkt 59: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud Fc piirkonnal 25

on suurenenud poolitatud oligosahhariidide proportsioon.

EE - EP1692182 B1 82

Punkt 60: punktile 59 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud

modifitseeritud oligosahhariidideks on poolitatud kompleksid.

Punkt 61: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud

modifitseeritud oligosahhariididel on nimetatud antigeeni siduva molekuli Fc

piirkonnas suurenenud poolitatud fukosüülimata oligosahhariidide proportsioon. 5

Punkt 62: punktile 61 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud poolitatud

fukosüülimata oligosahhariidideks on hübriidid.

Punkt 63: punktile 61 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud poolitatud

fukosüülimata oligosahhariidideks on kompleksid.

Punkt 64: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 20% nimetatud 10

polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud ja

fukosüülimata.

Punkt 65: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 30% nimetatud

polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud ja

fukosüülimata. 15

Punkt 66: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 35% nimetatud

polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud ja

fukosüülimata.

Punkt 67: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 70% nimetatud

polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud ja 20

fukosüülimata.

Punkt 68: meetod antigeeni siduva molekuli valmistamiseks, mis on võimeline

inimese CD20 seondumisel hiire B-Ly1 antikehaga konkureerima ja nimetatud

antigeeni siduv molekul on kimäärne; nimetatud meetod hõlmab:

a. punkti 26 või punkti 27 peremeesraku kultuuristamist söötmes tingimustel, mis 25

võimaldavad nimetatud antigeeni siduvat molekuli kodeeriva nimetatud

polünukleotiidi ekspressiooni;

b. nimetatud antigeeni siduva molekuli eraldamist moodustunud kultuurist.

EE - EP1692182 B1 83

Punkt 69: punkti 68 meetod, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks on

antikeha.

Punkt 70: ravimkoostis, mis sisaldab mistahes punktile 29 kuni 34 või 46 kuni 67

vastavat antigeeni siduvat molekuli ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.

Punkt 71: punkti 70 ravimkoostis, kus nimetatud koostis sisaldab täiendavalt 5

farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.

Punkt 72: punkti 70 ravimkoostis, kus nimetatud koostis sisaldab täiendavalt

abiainet.

Punkt 73: meetod häire ravimiseks, mis on ravitav B rakkude hulga

vähendamisega ja kus nimetatud meetod hõlmab seda vajavale inimpatsiendile 10

mistahes punkti 70 kuni 72 ravimkoostise efektiivse koguse manustamist.

Punkt 74: peremeesrakk, mida on muundatud vähemalt ühe β(1,4)-N-

atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega polüpeptiidi kodeeriva

nukleiinhappe avaldamiseks koguses, mis on piisav nimetatud peremeesraku

poolt toodetud polüpeptiidi Fc piirkonnas olevate oligosahhariidide 15

modifitseerimiseks ja nimetatud polüpeptiidiks on mistahes punktile 44 kuni 67

vastav antigeeni siduv molekul.

Punkt 75: punkti 74 peremeesrakk, kus nimetatud β(1,4)-N-

atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega polüpeptiidiks on

fusioonpolüpeptiid. 20

Punkt 76: punkti 74 peremeesrakk, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks

on antikeha.

Punkt 77: punkti 74 peremeesrakk, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks

on antikeha fragment.

Punkt 78: punkti 74 peremeesrakk, kus nimetatud antigeeni siduv molekul sisaldab 25

piirkonda, mis on samaväärne inimese IgG Fc piirkonnaga.

EE - EP1692182 B1 84

Punkt 79: punkti 74 peremeesrakk, kus nimetatud peremeesraku poolt toodetud

nimetatud antigeeni siduv molekul avaldab nimetatud modifikatsiooni tulemusel

suurenenud Fc retseptorit siduvat afiinsust.

Punkt 80: punkti 74 peremeesrakk, kus nimetatud peremeesraku poolt toodetud

nimetatud antigeeni siduv molekul avaldab nimetatud modifikatsiooni tulemusel 5

suurenenud efektori funktsiooni.

Punkt 81: punkti 75 peremeesrakk, kus nimetatud fusioonpolüpeptiid sisaldab

β(1,4)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas III katalüseerivat domeeni.

Punkt 82: punkti 75 peremeesrakk, kus nimetatud fusioonpolüpeptiid sisaldab

täiendavalt heteroloogse Golgi-resistentse polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni 10

domeeni.

Punkt 83: punktile 82 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni

domeeniks on mannosidaas II lokalisatsiooni domeen.

Punkt 84: punktile 82 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni

domeeniks on β(1,2)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas I lokalisatsiooni 15

domeen.

Punkt 85: punktile 82 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni

domeeniks on β(1,2)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas II lokalisatsiooni

domeen.

Punkt 86: punktile 82 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni 20

domeeniks on mannosidaas I lokalisatsiooni domeen.

Punkt 87: punktile 82 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni

domeeniks on α1-6tuuma fukosüültransferaasi lokalisatsiooni domeen.

Punkt 88: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori

funktsiooniks on suurenenud Fc vahendatud rakuline tsütotoksilisus. 25

Punkt 89: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori

funktsiooniks on suurenenud seondumine NK rakkudega.

EE - EP1692182 B1 85

Punkt 90: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori

funktsiooniks on suurenenud seondumine makrofaagidega.

Punkt 91: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori

funktsiooniks on suurenenud seondumine polümorftuumaste rakkudega.

Punkt 92: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori 5

funktsiooniks on suurenenud seondumine monotsüütidega.

Punkt 93: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori

funktsiooniks on suurenenud apoptoosi indutseeriv otsene signalisatsioon.

Punkt 94: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori

funktsiooniks on suurenenud dendriitrakkude valmimine. 10

Punkt 95: peremeesrakk vastavalt punktile 80, kus nimetatud suurenenud efektori

funktsiooniks on suurenenud T rakkude praimimine.

Punkt 96: peremeesrakk vastavalt punktile 79, kus nimetatud Fc retseptoriks on

Fcγ aktiveeriv retseptor.

Punkt 97: peremeesrakk vastavalt punktile 79, kus nimetatud Fc retseptoriks on 15

FcγRIIIA retseptor.

Punkt 98: peremeesrakk vastavalt punktile 74, kus nimetatud peremeesrakuks on

CHO rakk, BHK rakk, NSO rakk, SP2/0 rakk, YO müeloomi rakk, P3X63 hiire

müeloomi rakk, PER rakk, PER.C6 rakk või hübridoomrakk.

Punkt 99: punkti 74 peremeesrakk, mis sisaldab täiendavalt vähemalt ühte 20

transfekteeritud polünukleotiidi, mis kodeerib mistahes punktile 28 ja 35 kuni 41

vastavat polüpeptiidi ja nimetatud nukleiinhape sisaldab järjestust, mis kodeerib

inimese immunoglobuliini Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda.

Punkt 100: peremeesrakk vastavalt punktile 74, kus nimetatud vähemalt üks

nukleiinhape, mis β(1,4)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega 25

polüpeptiidi kodeerib, on aheldatud operatiivselt konstitutiivse

promootorelemendiga.

EE - EP1692182 B1 86

Punkt 101: punkti 100 peremeesrakk, kus nimetatud β(1,4)-N-

atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega polüpeptiidiks on

fusioonpolüpeptiid.

Punkt 102: meetod antigeeni siduva molekuli, mille peremeesrakus on

modifitseeritud oligosahhariidid, tootmiseks ja nimetatud meetod hõlmab: 5

a. peremeesraku, mida on muundatud vähemalt ühte β(1,4)-N-

atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsust omavat polüpeptiidi kodeeriva

nukleiinhappe avaldamiseks, kultuuristamist tingimustel, mis võimaldavad

nimetatud antigeeni siduva molekuli tootmist ja võimaldavad nimetatud antigeeni

siduva molekuli Fc piirkonnas olevate oligosahhariidide modifikatsiooni; ja 10

b. nimetatud antigeeni siduva molekuli eraldamist, kus nimetatud antigeeni siduv

molekul on võimeline CD20 seondumisel hiire B-Ly1 antikehaga konkureerima ja

kus nimetatud antigeeni siduv molekul või selle fragment on kimäärne.

Punkt 103: punkti 102 meetod, kus nimetatud modifitseeritud oligosahhariididel

võrreldes modifitseerimata oligosahhariididega väiksem fukosüülimisaste. 15

Punkt 104: punkti 102 meetod, kus nimetatud modifitseeritud oligosahhariidid on

hübriidid.

Punkt 105: punkti 102 meetod, kus nimetatud modifitseeritud oligosahhariidid on

kompleksid.

Punkt 106: punkti 102 meetod, kus nimetatud peremeesraku poolt valmistatud 20

nimetatud rekombinantsel antikehal või selle fragmendil on nimetatud polüpeptiidi

Fc piirkonnas suurenenud poolitatud fukosüülimata oligosahhariidide proportsioon.

Punkt 107: punkti 106 meetod, kus nimetatud poolitatud ja fukosüülimata

oligosahhariidid on hübriidid.

Punkt 108: punkti 106 meetod, kus nimetatud poolitatud ja fukosüülimata 25

oligosahhariidid on kompleksid.

Punkt 109: punkti 102 meetod, kus vähemalt 20% nimetatud polüpeptiidi Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud ja fukosüülimata.

EE - EP1692182 B1 87

Punkt 110: punkti 102 meetod, kus vähemalt 30% nimetatud polüpeptiidi Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud ja fukosüülimata.

Punkt 111: punkti 102 meetod, kus vähemalt 35% nimetatud polüpeptiidi Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud ja fukosüülimata.

Punkt 112: antigeeni siduv molekul, mida on muundatud suurema efektori 5

funktsiooni saavutamiseks ja mis on valmistatud mistahes punktile 102 kuni 111

vastava meetodiga.

Punkt 113: punkti 112 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks

molekuliks on antikeha.

Punkt 114: antikeha, mida on muundatud suurema Fc retseptori sidumisafiinsuse 10

saavutamiseks ja mis on valmistatud mistahes punkti 102 kuni 111 meetodiga.

Punkt 115: punkti 114 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks

molekuliks on antikeha.

Punkt 116: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud

suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud Fc vahendatud rakuline 15

tsütotoksilisus.

Punkt 117: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud

suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine NK rakkudega.

Punkt 118: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud

suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine makrofaagidega. 20

Punkt 119: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud

suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine monotsüütidega.

Punkt 120: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud

suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine polümorftuumaste

rakkudega. 25

Punkt 121: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud

suurenenud efektori funktsiooniks on apoptoosi indutseeriv otsene signalisatsioon.

EE - EP1692182 B1 88

Punkt 122: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud

suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud dendriitrakkude valmimine.

Punkt 123: antigeeni siduv molekul vastavalt punktile 112, kus nimetatud

suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud T raku praimimine.

Punkt 124: punktile 114 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud Fc 5

retseptoriks on Fc aktiveeriv retseptor.

Punkt 125: punktile 114 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud Fc

retseptoriks on FcγRIIIa retseptor.

Punkt 126: mistahes punkti 102 kuni 111 meetodiga valmistatud antigeeni siduv

molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks on antikeha fragment, mis 10

sisaldab Fc piirkonda ja mida on muundatud suurema efektori funktsiooni

saavutamiseks.

Punkt 127: antigeeni siduv molekul, mis on valmistatud mistahes punkti 102 kuni

111 meetodiga, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks on fusioonvalk, mis

sisaldab SEQ ID NO: 1 järjestusega polüpeptiidi ja piirkonda, mis on samaväärne 15

immunoglobuliini Fc piirkonnaga ja mida on muundatud suurenenud efektori

funktsiooni saavutamiseks.

Punkt 128: antigeeni siduv molekul, mis on valmistatud mistahes punkti 102 kuni

111 meetodiga, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks on fusioonvalk, mis

sisaldab polüpeptiidi, mille järjestus on omakorda valitud rühmast, kuhu kuuluvad 20

SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO:

38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID

NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56; SEQ

ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 66;

SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70; ja SEQ ID NO: 72, ning piirkonda, mis on 25

samaväärne immunoglobuliini Fc piirkonnaga ja mida on muundatud suurenenud

efektori funktsiooni saavutamiseks.

Punkt 129: antigeeni siduv molekul, mis on valmistatud mistahes punkti 102 kuni

111 meetodiga, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks on fusioonvalk, mis

EE - EP1692182 B1 89

sisaldab SEQ ID NO: 3 järjestusega polüpeptiidi ja piirkonda, mis on samaväärne

immunoglobuliini Fc piirkonnaga ja mida on muundatud suurenenud efektori

funktsiooni saavutamiseks.

Punkt 130: antigeeni siduv molekul, mis on valmistatud mistahes punkti 102 kuni

111 meetodiga, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks on fusioonvalk, mis 5

sisaldab SEQ ID NO: 76 järjestusega polüpeptiidi ja piirkonda, mis on samaväärne

immunoglobuliini Fc piirkonnaga ja mida on muundatud suurenenud efektori

funktsiooni saavutamiseks.

Punkt 131: ravimkoostis, mis sisaldab mistahes punktile 112 kuni 130 vastavat

antigeeni siduvat molekuli ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit. 10

Punkt 132: ravimkoostis, mis sisaldab punkti 126 antikeha fragmenti ja

farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.

Punkt 133: ravimkoostis, mis sisaldab mistahes punktile 127 kuni 130 vastavat

fusioonvalku ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.

Punkt 134: meetod haiguse ravimiseks, mis on ravitav B rakkude hulga 15

vähendamisega ja kus nimetatud meetod hõlmab seda vajavale inimpatsiendile

mistahes punkti 112 kuni 130 antigeeni siduva molekuli efektiivse koguse

manustamist.

Punkt 135: punktile 4 või 5 vastav eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab

täiendavalt inimese antikeha kerge või raske ahela konstantset piirkonda 20

kodeerivat järjestust.

Punkt 136: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 80%

ulatuses identne SEQ ID NO: 24; nimetatud eraldatud polünukleotiid kodeerib

fusioonpolüpeptiidi.

Punkt 137: peremeesrakk, mis kaasavaldab punktile 136 vastavat eraldatud 25

polünukleotiidi ja polünukleotiidi, mis sisaldab antikeha kerge ahela varieeruvat

piirkonda kodeerivat järjestust.

EE - EP1692182 B1 90

Punkt 138: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 50% Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.

Punkt 139: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 60% Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.

Punkt 140: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 70% Fc 5

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.

Punkt 141: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 80% Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.

Punkt 142: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 90% Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud. 10

Punkt 143: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 50% Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.

Punkt 144: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 60% Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.

Punkt 145: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 70% Fc 15

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.

Punkt 146: punktile 57 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 75% Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.

Punkt 147: punkti 73 meetod, kus nimetatud häireks on B raku lümfoom.

Punkt 148: eraldatud polünukleotiid, mille järjestus on valitud rühmast, kuhu 20

kuuluvad SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ

ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45;

SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO:

55; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID

NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69 ja SEQ ID NO: 71. 25

Punkt 149: punktile 148 vastav eraldatud polünukleotiid, kus nimetatud eraldatud

polünukleotiid sisaldab SEQ ID NO: 31.

EE - EP1692182 B1 91

Punkt 150: punktile 148 vastav eraldatud polünukleotiid, kus nimetatud eraldatud

polünukleotiid sisaldab SEQ ID NO: 55.

Punkt 151: punktile 148 vastav eraldatud polünukleotiid, kus nimetatud eraldatud

polünukleotiid sisaldab SEQ ID NO: 59.

Punkt 152: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 75. 5

Punkt 153: punktile 148 või punktile 149 vastav eraldatud polünukleotiid, kus

nimetatud polünukleotiid kodeerib fusioonpolüpeptiidi.

Punkt 154: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb:

a) järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus omakorda on valitud

rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 56; ja SEQ ID NO: 60; ning 10

b) järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi järjestusega SEQ ID NO: 76.

Punkt 155: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 80%

ulatuses identne järjestusega, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO:

29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID

NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ 15

ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57;

SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO:

67; SEQ ID NO: 69; ja SEQ ID NO: 71 ja nimetatud eraldatud polünukleotiid

kodeerib fusioonpolüpeptiidi.

Punkt 156: eraldatud polünukleotiid, mille järjestus on vähemalt 80% ulatuses 20

identne SEQ ID NO: 75; nimetatud eraldatud polünukleotiid kodeerib

fusioonpolüpeptiidi.

Punkt 157: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 85%

ulatuses identne järjestusega, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO:

29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID 25

NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ

ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57;

SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO:

67; SEQ ID NO: 69; ja SEQ ID NO: 71.

EE - EP1692182 B1 92

Punkt 158: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 85%

ulatuses identne SEQ ID NO: 75.

Punkt 159: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 90%

ulatuses identne järjestusega, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO:

29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID 5

NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ

ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57;

SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO:

67; SEQ ID NO: 69; ja SEQ ID NO: 71.

Punkt 160: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 90% 10

ulatuses identne SEQ ID NO: 75.

Punkt 161: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 95%

ulatuses identne järjestusega, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO:

29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID

NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ 15

ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57;

SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO:

67; SEQ ID NO: 69; ja SEQ ID NO: 71.

Punkt 162: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 95%

ulatuses identne SEQ ID NO: 75. 20

Punkt 163: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 99%

ulatuses identne järjestusega, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO:

29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID

NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ

ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57; 25

SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO:

67; SEQ ID NO: 69; ja SEQ ID NO: 71.

Punkt 164: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus on vähemalt 99%

ulatuses identne SEQ ID NO: 75.

EE - EP1692182 B1 93

Punkt 165: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb:

a) järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus omakorda on valitud

rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID

NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ

ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; 5

SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO:

64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70 ja SEQ ID NO: 72; ning

b) järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus pärineb antikeha Fc

piirkonnast või selle fragmendist ja mis ei pärine hiirtelt.

Punkt 166: eraldatud polünukleotiid, mis koosneb: 10

a) järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi järjestusega SEQ ID NO: 76; ja

b) järjestusest, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus pärineb antikeha Fc

piirkonnast või selle fragmendist ja mis ei pärine hiirtelt.

Punkt 167: eraldatud polünukleotiid, mis kodeerib polüpeptiidi, mille järjestus

omakorda on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; 15

SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO:

42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID

NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ

ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70 ja

SEQ ID NO: 72. 20

Punkt 168: eraldatud polünukleotiid, mis kodeerib SEQ ID NO: 76 järjestust

omavat polüpeptiidi.

Punkt 169: eraldatud polünukleotiid, milles sisalduv järjestus kodeerib polüpeptiidi,

milles sisalduv järjestus omakorda on valitud rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO:

30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID 25

NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ

ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58;

SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO:

68; SEQ ID NO: 70; ja SEQ ID NO: 72.

EE - EP1692182 B1 94

Punkt 170: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 76 omavat

polüpeptiidi kodeerivat järjestust.

Punkt 171: ekspressioonivektor, mis koosneb mistahes punktile 148 kuni 170

vastavast eraldatud polünukleotiidist.

Punkt 172: punkti 171 vektor, kus nimetatud vektor on paljutsistroniline. 5

Punkt 173: punktile 171 vastavat ekspressioonivektorit sisaldav peremeesrakk.

Punkt 174: peremeesrakk, mis koosneb mistahes punktile 148 kuni 170 vastavast

eraldatud polünukleotiidist.

Punkt 175: inimese jaoks kohandatud polüpeptiid, mille järjestus on valitud

rühmast, kuhu kuuluvad SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID 10

NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ

ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54;

SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO:

64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70 ja SEQ ID NO: 72 või nende

variandid. 15

Punkt 176: inimese jaoks kohandatud polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 76

järjestust või selle varianti.

Punkt 177: eraldatud polüpeptiid, milles sisalduv järjestus on valitud rühmast, kuhu

kuuluvad SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ

ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; 20

SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO:

56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID

NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70; ja SEQ ID NO: 72 või nende variandid.

Punkt 178: eraldatud polüpeptiid, mis sisaldab SEQ ID NO: 76 või selle varianti.

Punkt 179: mistahes punktile 177 kuni 178 vastav eraldatud polüpeptiid, kus 25

nimetatud polüpeptiidiks on fusioonpolüpeptiid.

Punkt 180: antigeeni siduv molekul, mis sisaldab punkti 179 eraldatud polüpeptiidi.

EE - EP1692182 B1 95

Punkt 181: punkti 180 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks

molekuliks on antikeha.

Punkt 182: punkti 181 antikeha, kus nimetatud antikeha on inimese jaoks

kohandatud antikeha.

Punkt 183: punkti 180 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks 5

molekuliks on antikeha fragment.

Punkt 184: punkti 183 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antikeha fragment

on inimese jaoks kohandatud.

Punkt 185: punkti 180 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks

molekuliks on rekombinantne antikeha. 10

Punkt 186: punkti 185 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud rekombinantne

antikeha on inimese jaoks kohandatud.

Punkt 187: punkti 180 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud rekombinantne

antikeha sisaldab inimese Fc piirkonda.

Punkt 188: punkti 187 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud inimese Fc 15

piirkonnaks on inimese IgG Fc piirkond.

Punkt 189: mistahes punkti 180 kuni 188 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud

antigeeni siduval molekulil on modifitseeritud oligosahhariididega Fc piirkond.

Punkt 190: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud Fc

piirkonda on modifitseeritud väiksemaks fukoosi jääkide sisalduseks võrreldes 20

modifitseerimata antigeeni siduva molekuliga.

Punkt 191: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud Fc

piirkonnal on suurenenud poolitatud oligosahhariidide proportsioon.

Punkt 192: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud

modifitseeritud oligosahhariidideks on poolitatud kompleksid. 25

EE - EP1692182 B1 96

Punkt 193: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud

modifitseeritud oligosahhariididel on nimetatud antigeeni siduva molekuli Fc

piirkonnas suurenenud poolitatud fukosüülimata oligosahhariidide proportsioon.

Punkt 194: punktile 193 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud poolitatud

fukosüülimata oligosahhariidideks on hübriidid. 5

Punkt 195: punktile 193 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud poolitatud

fukosüülimata oligosahhariidideks on kompleksid.

Punkt 196: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 20%

nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud

ja fukosüülimata. 10

Punkt 197: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 30%

nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud

ja fukosüülimata.

Punkt 198: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 35%

nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud 15

ja fukosüülimata.

Punkt 199: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 70%

nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud

ja fukosüülimata.

Punkt 200: meetod antigeeni siduva molekuli valmistamiseks, mis on võimeline 20

inimese CD20 seondumisel hiire B-Ly1 antikehaga konkureerima ja nimetatud

antigeeni siduv molekul on kimäärne; nimetatud meetod hõlmab:

a) punkti 173 või punkti 174 peremeesraku kultuuristamist söötmes tingimustel,

mis võimaldavad nimetatud antigeeni siduvat molekuli kodeeriva nimetatud

polünukleotiidi ekspressiooni; 25

b) nimetatud antigeeni siduva molekuli eraldamist.

Punkt 201: punkti 200 meetod, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks on

antikeha.

EE - EP1692182 B1 97

Punkt 202: punkti 200 meetod, kus nimetatud kimäärset antigeeni siduv molekul

on inimese jaoks kohandatud.

Punkt 203: ravimkoostis, mis sisaldab mistahes punktile 189 kuni 199 vastavat

antigeeni siduvat molekuli ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.

Punkt 204: punkti 203 ravimkoostis, kus nimetatud koostis sisaldab täiendavalt 5

farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit.

Punkt 205: punkti 203 ravimkoostis, kus nimetatud koostis sisaldab täiendavalt

abiainet.

Punkt 206: meetod häire ravimiseks, mis on ravitav B rakkude hulga

vähendamisega ja kus nimetatud meetod hõlmab seda vajavale inimpatsiendile 10

mistahes punkti 203 kuni 205 ravimkoostise efektiivse koguse manustamist.

Punkt 207: peremeesrakk, mida on muundatud vähemalt ühe β(1,4)-N-

atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega polüpeptiidi kodeeriva

nukleiinhappe avaldamiseks koguses, mis on piisav nimetatud peremeesraku

poolt toodetud polüpeptiidi Fc piirkonnas olevate oligosahhariidide 15

modifitseerimiseks ja nimetatud polüpeptiidiks on mistahes punktile 180 kuni 197

vastav antigeeni siduv molekul.

Punkt 208: punkti 207 peremeesrakk, kus nimetatud β(1,4)-N-

atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega polüpeptiidiks on

fusioonpolüpeptiid. 20

Punkt 209: punkti 207 peremeesrakk, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks

on antikeha.

Punkt 210: punkti 207 peremeesrakk, kus nimetatud antigeeni siduvaks molekuliks

on antikeha fragment.

Punkt 211: punkti 207 peremeesrakk, kus nimetatud antigeeni siduv molekul 25

sisaldab piirkonda, mis on samaväärne inimese IgG Fc piirkonnaga.

EE - EP1692182 B1 98

Punkt 212: punkti 207 peremeesrakk, kus nimetatud peremeesraku poolt toodetud

nimetatud antigeeni siduv molekul avaldab nimetatud modifikatsiooni tulemusel

suurenenud Fc retseptorit siduvat afiinsust.

Punkt 213: punkti 207 peremeesrakk, kus nimetatud peremeesraku poolt toodetud

nimetatud antigeeni siduv molekul avaldab nimetatud modifikatsiooni tulemusel 5

suurenenud efektori funktsiooni.

Punkt 214: punkti 208 peremeesrakk, kus nimetatud fusioonpolüpeptiid sisaldab

β(1,4)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas III katalüseerivat domeeni.

Punkt 215: punkti 208 peremeesrakk, kus nimetatud fusioonpolüpeptiid sisaldab

täiendavalt heteroloogse Golgi resistentse polüpeptiidi Golgi lokalisatsiooni 10

domeeni.

Punkt 216: punktile 215 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni

domeeniks on mannosidaas II lokalisatsiooni domeen.

Punkt 217: punktile 215 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni

domeeniks on β(1,2)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas I lokalisatsiooni 15

domeen.

Punkt 218: punktile 215 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni

domeeniks on β(1,2)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas II lokalisatsiooni

domeen.

Punkt 219: punktile 215 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni 20

domeeniks on mannosidaas I lokalisatsiooni domeen.

Punkt 220: punktile 215 vastav peremeerakk, kus nimetatud Golgi lokalisatsiooni

domeeniks on α1-6tuuma fukosüültransferaasi lokalisatsiooni domeen.

Punkt 221: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud

efektori funktsiooniks on suurenenud Fc vahendatud rakuline tsütotoksilisus. 25

Punkt 222: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud

efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine NK rakkudega.

EE - EP1692182 B1 99

Punkt 223: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud

efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine makrofaagidega.

Punkt 224: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud

efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine polümorftuumaste rakkudega.

Punkt 225: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud 5

efektori funktsiooniks on suurenenud seondumine monotsüütidega.

Punkt 226: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud

efektori funktsiooniks on suurenenud apoptoosi indutseeriv otsene signalisatsioon.

Punkt 227: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud

efektori funktsiooniks on suurenenud dendriitrakkude valmimine. 10

Punkt 228: peremeesrakk vastavalt punktile 213, kus nimetatud suurenenud

efektori funktsiooniks on suurenenud T rakkude praimimine.

Punkt 229: peremeesrakk vastavalt punktile 212, kus nimetatud Fc retseptoriks on

Fcγ aktiveeriv retseptor.

Punkt 230: peremeesrakk vastavalt punktile 212, kus nimetatud Fc retseptoriks on 15

FcγRIIIA retseptor.

Punkt 231: peremeesrakk vastavalt punktile 207, kus nimetatud peremeesrakuks

on CHO rakk, BHK rakk, NSO rakk, SP2/0 rakk, YO müeloomi rakk, P3X63 hiire

müeloomi rakk, PER rakk, PER.C6 rakk või hübridoomrakk.

Punkt 232: punkti 207 peremeesrakk, mis sisaldab täiendavalt vähemalt ühte 20

transfekteeritud polünukleotiidi, mis kodeerib mistahes punktile 28 ja 35 kuni 41

vastavat polüpeptiidi ja nimetatud nukleiinhape sisaldab järjestust, mis kodeerib

inimese immunoglobuliini Fc piirkonnaga samaväärset piirkonda.

Punkt 233: peremeesrakk vastavalt punktile 207, kus nimetatud vähemalt üks

nukleiinhape, mis β(1,4)-N-atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega 25

polüpeptiidi kodeerib, on aheldatud operatiivselt konstitutiivse

promootorelemendiga.

EE - EP1692182 B1 100

Punkt 234: punkti 233 peremeesrakk, kus nimetatud β(1,4)-N-

atsetüülglükoosaminüültransferaas III aktiivsusega polüpeptiidiks on

fusioonpolüpeptiid.

Punkt 235: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 50% Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud. 5

Punkt 236: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 60% Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.

Punkt 237: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 70% Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.

Punkt 238: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 80% Fc 10

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.

Punkt 239: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 90% Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud.

Punkt 240: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 50% Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata. 15

Punkt 241: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 60% Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.

Punkt 242: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 70% Fc

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.

Punkt 243: punktile 189 vastav antigeeni siduv molekul, kus vähemalt 75% Fc 20

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.

Punkt 244: punkti 206 meetod, kus nimetatud häireks on B raku lümfoom.

Punkt 245: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab vähemalt ühte hiire B-Ly1

antikeha või selle variandi või lühendatud vormi komplementaarsust määravat

piirkonda, mis omakorda sisaldab vähemalt nimetatud komplementaarsust 25

määrava piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke; nimetatud eraldatud

polünukleotiid kodeerib fusioonpolüpeptiidi.

EE - EP1692182 B1 101

Punkt 246: punktile 245 vastav eraldatud polünukleotiid, kus nimetatud

komplementaarsust määrav piirkond on valitud rühmast, kuhu kuuluvad:

[NIMEKIRI KÕIKIDEST B-Ly1 CDR JÄRJESTUSTEST].

Punkt 247: punktile 245 vastav eraldatud polünukleotiid, kus nimetatud

polünukleotiid kodeerib antigeeni siduvat molekuli. 5

Punkt 248: eraldatud polünukleotiid, mis sisaldab vähemalt kolme hiire B-Ly1

antikeha või nende variantide või lühendatud vormide komplementaarsust

määravat piirkonda, mis omakorda sisaldavad vähemalt iga kolme nimetatud

komplementaarsust määrava piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke; nimetatud

eraldatud polünukleotiid kodeerib fusioonpolüpeptiidi. 10

Punkt 249: punktile 248 vastav eraldatud polünukleotiid, kus nimetatud

komplementaarsust määravad piirkonnad sisaldavad vähemalt ühte järjestust, mis

on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ja SEQ ID NO:

7; ning vähemalt ühte järjestust, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: SEQ ID

NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 ning SEQ ID NO: 24 või nimetatud 15

järjestuste variandid või lühendatud vormid, mis sisaldavad vähemalt iga

nimetatud komplementaarsust määrava piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke.

Punkt 250: eraldatud polüpeptiid, mida kodeeritakse mistahes punkti 245 kuni 249

eraldatud polünukleotiidi poolt.

Punkt 251: antigeeni siduv molekul, mis sisaldab vähemalt ühte hiire B-Ly1 20

antikeha või selle variandi või lühendatud vormi komplementaarsust määravat

piirkonda, mis omakorda sisaldab vähemalt nimetatud komplementaarsust

määrava piirkonna spetsiifilisust määravaid jääke ja järjestust, mis on deriveeritud

heteroloogsest polüpeptiidist.

Punkt 252: punkti 251 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduv 25

molekul sisaldab vähemalt kolme hiire B-Ly1 antikeha või selle variantide või

lühendatud vormide komplementaarsust määravat piirkonda ja nimetatud antikeha

või selle variandid või lühendatud vormid sisaldavad iga nimetatud

komplementaarsust määrava piirkonna jaoks vähemalt spetsiifilisust määravaid

jääke. 30

EE - EP1692182 B1 102

Punkt 253: punktile 252 vastav antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni

siduv molekul sisaldab antikeha kerge või raske ahela varieeruvat piirkonda.

Punkt 254: punkti 252 antigeeni siduv molekul, kus nimetatud antigeeni siduvaks

molekuliks on kimäärne või inimese jaoks kohandatud antikeha.

Punkt 255: muundatud II tüüpi anti-CD20 antikeha, mille ADCC on nimetatud 5

muundamise tagajärjel suurenenud ilma, et võime märklaud-rakkudes apoptoosi

indutseerida oluliselt väheneks.

Punkt 256: punkti 255 muundatud II tüüpi anti-CD20 antikeha, kus nimetatud

antikeha on muundatud muudetud glükosüülimismustri tekitamiseks Fc piirkonnas.

Punkt 257: punkti 256 muundatud II tüüpi anti-CD20 antikeha, kus nimetatud 10

antikeha muutunud glükosüülimine avaldub suurenenud poolitatud komplekside

vormis oligosahhariidide kogusena.

Punkt 258: punkti 256 muundatud II tüüpi anti-CD20 antikeha, kus nimetatud

antikeha muutunud glükosüülimine avaldub vähenenud fukoosi jääkide kogusena.

Punkt 259: punkti 255 muundatud II tüüpi anti-CD20 antikeha, kus nimetatud 15

antikeha on muundatud muudetud aminohappejärjestuse tekitamiseks Fc

piirkonnas.

Järgnevalt esitatud näidetes kirjeldatakse leiutist detailsemalt. Järgnevad näited ja

valmistamisviisid on toodud, et võimaldada valdkonnas kogenud isikutel

käesolevat leiutist paremini mõista ja praktiseerida. Lugedes eelnevalt toodud 20

kirjeldust ja uurides lisatud jooniseid, mõistab valdkonnas kogenud isik

tõenäoliselt, et lisaks kirjeldatutele on võimalikud ka leiutise täiendavad erinevad

variatsioonid.

NÄITED

[MÄRKUS: Juhul, kui ei ole teisiti välja toodud, on konkreetsete 25

aminohappejärjestuste positsioonide nummerdus järgnevates näidetes esitatud

vastavalt Kabat´ nummerdussüsteemile.]

EE - EP1692182 B1 103

NÄIDE 1

Materjal ja metoodika

Rekombinantse antikeha B-Ly1 kloonimine ja ekspressioon

B-Ly1 avaldavaid hübridoomrakke kasvatati RPMI, mis sisaldas 10% FBS ja 4 mM

L-glutamiini. Koguti 6 x 106 rakku, mille elujõud oli > 90% ning kogu RNA eraldati 5

Qiagen RNA easy minikomplekti kasutades. B-Ly1 erinevaid kergeid ja raskeid

ahelaid kodeerivad cDNA võimendati RT-PCR abil. RT-PCR reaktsioon sooritati

järgmistel tingimustel: 30 minutit temperatuuril 50 oC esimese tüve cDNA sünteesi

jaoks; 15 minutit kestev algne denatureerimine temperatuuril 95 oC; 30 tsüklit

temperatuuril 94 oC 1 minuti jooksul, temperatuuril 45 oC 1 minuti jooksul ja 10

temperatuuril 72 oC 1,5 minuti jooksul; ning viimase pikendusetapi jooksul 10

minutit temperatuuril 72 oC. PCR saaduste eeldatud suurus kinnitati geel-

elektroforeesiga. PCR saadused klooniti sobivatesse E. coli vektoritesse ja DNA

järjestamine kinnitas, et erinevad kerget ja rasket ahelat kodeerivad geenid olid

eraldatud. 15

Kimäärsete B-Ly1 ekspressioonivektorite valmistamiseks sulatati sünteetilised

signaaljärjestused ja sobivad restriktsioonisaidid täiendavate PCR reaktsioonide

abil varieeruvate ahelate külge. Pärast varieeruvate ahelate õige DNA järjestuse

lõplikku kinnitamist liideti need vastavate inimese IgG1 konstantsete

piirkondadega. Pärast geenide valmistamist klooniti need MPSV promootori 20

kontrolli all ja sünteetilisest polüA saidist vastassuunas, kasutades kahte eraldi

vektorit (üks mõlema ahela jaoks) ja saades seeläbi plasmiidid pETR1808 (raske

ahela ekspressioonivektor) ja pETR1813 (kerge ahela ekspressioonivektor).

Mõlemad vektorid kandsid EBV OriP järjestust.

Kimäärne B-Ly1 toodeti, kotransfekteerides HEK293-EBNA rakke vektorite 25

pETR1808 ja pETR1813, kasutades selleks kaltsiumfosfaadi-transfektsiooni

meetodit. Eksponentsiaalselt kasvatatud HEK293-EBNA rakke transfekteeriti

kaltsiumfosfaadi meetodiga. Rakke kasvatati T kolvides kui kõrvuti asetsevaid

monokihi kultuure, kasutades 10% FCS täiendatud DMEM kultuursöödet ning

transfekteeriti, kui nende kokkuvalguvus jäi vahemikku 50 kuni 80%. T75 kolvi 30

EE - EP1692182 B1 104

transfektsiooniks idustati 8 miljonit rakku 24 tundi enne transfektsiooni 14 ml

DMEM kultuursöötmes, mida oli täiendatud FCS (lõpp-kontsentratsioon 10% V/V)

ja 250 µg/ml kohta neomütsiiniga ning rakud viidi ööks temperatuuril 37 oC

inkubaatorisse, kus valitses 5% CO2 atmosfäär. Iga transfekteeritava T75 kolvi

jaoks valmistati DNA, CaCl2 ja vee lahus, segades selleks 47 µg kogu 5

plasmiidivektori DNA, mis oli jagatud võrdselt kerge ja raske ahela

ekspressioonivektorite vahel, 235 µl 1M CaCl2 lahust ja lisades vett, kuni lõplikuks

mahuks oli 469 µl. Sellele lahusele lisati 469 µl pH tasemel 7,05 lahust, mis

koosnes 50 mM HEPES, 280 mM NaCl ja 1,5 mM Na2HPO4 ning saadud segu

segati koheselt 10 sekundit ja lasti seejärel 20 sekundit toatemperatuuril seista. 10

Suspensioon lahjendati 12 ml DMEM, mis oli asendatud 2% FCS ning viidi T75

olemasoleva söötme asemele. Rakke inkubeeriti temperatuuril 37 oC 5% CO2

atmosfääris umbes 17 kuni 20 tundi ning seejärel asendati sööde 12 ml DMEM,

mida oli täiendatud 10% FCS. Modifitseerimata antikeha „chB-Ly1“ tootmiseks

transfekteeriti rakud ainult suhtes 1:1 antikeha ekspressioonivektoritega 15

pETR1808 ja pETR1813. Glükomuundatud antikeha „chBLy-1-ge" tootmiseks

kotransfekteeriti rakke nelja plasmiidiga, millest kaks olid vastavalt antikeha

ekspressiooniks (pETR1808 ja pETR1813), üks oli vastavalt fusioon GnTIII

polüpeptiidi ekspressiooniks (pETR1519) ja üks oli mannosidaas II

ekspressiooniks (pCLF9); omavaheline suhe oli 4:4:1:1. 5 päeva pärast 20

transfektsiooni koguti ülemine vedelikukiht, tsentrifuugiti 5 minutit kiirusel 1200

pööret minutis, sellele järgnevalt 10 minutit kiirusel 4000 pööret minutis ja hoiti

temperatuuril 4 oC.

chB-Ly1 ja chB-Ly1-ge puhastati kultuuri pindmisest vedelikukihist, kasutades

kolme üksteisele järgnevat kromatograafilist etappi: valk A kromatograafia, 25

katioonvahetuse kromatograafia ja suuruseralduskromatograafia Superdex 200

kolonnil (Amersham Pharmacia), vahetades puhvri fosfaat-puhverdatud

soolalahuse vastu ja kogudes monomeerse antikeha tipu sellest viimasest etapist.

Antikeha kontsentratsiooni hinnati spektrofotomeetrit kasutades neelduvusest

tasemel 280 nm. 30

EE - EP1692182 B1 105

Oligosahhariidi analüüs

Oligosahhariidid vabastati antikehadest ensümaatiliselt PNGaasF

digereerimisega, kus antikehad oli immobiliseeritud PVDF membraanil või

lahuses.

Saadud vabanenud oligosahhariide sisaldavat digereerimislahust kasutati otse 5

MALDI/TOF-MS analüüsis või digereeriti enne MALDI/TOF-MS analüüsi

täiendavalt EndoH glükosidaasiga.

Oligosahhariidide vabastusmeetod PVDF membraanile immobiliseeritud

antikehade jaoks

96-reservuaariga plaadi, mis oli valmistatud koos PVDF (Immobilon P, Millipore, 10

Bedford, Massachusetts) membraaniga, reservuaarid niisutati 100 ml metanooliga

ja vedelik imeti läbi PVDF membraani vaakumiga, mis oli tekitatud mitme avaga

vaakumitekitajaga (Millipore, Bedford, Massachusetts). PVDF membraane pesti

kolm korda 300 µl veega. Reservuaare pesti seejärel 50 µl RCM puhvriga (8M

uurea, 360 mM Tris, 3,2 mM EDTA, pH 8,6). 10 µl RCM puhvrit sisaldavasse 15

reservuaari viidi 30 - 40 mg antikeha. Reservuaaris olev vedelik imeti vaakumi abil

läbi membraani ja membraani pesti seejärel kaks korda 50 µl RCM puhvriga.

Disulfiidsildade taandamine sooritati 50 µl lahuse, mis koosnes RCM olevast 0,1M

ditiotreitoolist, ja 1 tunni pikkuse inkubeerimisega temperatuuril 37 oC.

Pärast taandamist rakendati ditiotreitoollahuse reservuaarist eemaldamiseks 20

vaakumi. Reservuaare pesti kolm korda 300 µl veega ja seejärel rakendati

tsüsteiini jääkidel karboksümetüülimist, lisades selleks RCM puhvris oleva 50 µl

0,1M jodoäädikhapet ja inkubeerides 30 minutit toatemperatuuril pimedas.

Pärast karboksümetüülimist tühjendati reservuaarid vaakumiga ja pesti järgnevalt

kolm korda 300 µl veega. PVDF membraan blokeeriti seejärel endoglükosidaasi 25

adsorptsiooni vältimiseks, inkubeerides 100 µl 1% polüvinüülpürrolidoon 360

vesilahust 1 tund toatemperatuuril. Blokeeriv reagent eemaldati seejärel nõrga

vaakumiga ja sellele järgnes 3 pesu 300 µl veega.

EE - EP1692182 B1 106

N-aheldatud oligosahhariidid vabastati 2,5 mU peptiid-N-glükosüdaas F

(rekombinantne N-glükanaas, GLYKO, Novato CA) ja 0,1 mU sialidaasi (GLYKO,

Novato, CA) lisamisega, eemaldades seeläbi võimalikud potentsiaalsed laenguga

monosahhariidi jäägid – lõppmaht oli 25 µl 20 mM NaHCO3 (pH 7,0).

Digereerimine toimus 3 tundi temperatuuril 37 oC. 5

Oligosahhariidi vabastamismeetod lahuses olevate antikehade jaoks

40 kuni 50 µg antikeha segati lahusega, mis koosnes 2 mM Tris olevast 2,5 mU

PNGaasF (Glyko, USA) (pH 7,0), lõpliku mahuni 25 mikroliitrit ning saadud segu

inkubeeriti 3 tundi temperatuuril 37 oC.

PNGaasF-vabastatud oligosahhariidide endoglükosidaas H digereerimise 10

kasutamine hübriidsete poolitatud oligosahhariidide struktuuride hindamiseks

MALDI/TOF-MS neutraalsete oligosahhariidtippude jaoks

PNGaasF vabastatud oligosahhariidid digereeriti järgnevalt endoglükosidaas H

(EC 3.2.1.96) abil. EndoH digereerimise jaoks lisati PNGaasF

digereerimissaadusele (eelnevalt kirjeldatud lahuses oleva antikeha meetod) 15 15

mU EndoH (Roche, Šveits), saades lõplikuks mahuks 30 mikroliitrit ning segu

inkubeeriti 3 tundi temperatuuril 37 oC. EndoH lõhestub N-aheldatud

oligosahhariidide tsitobioostuuma N-atsetüülglükoosamiinjääkide vahel. Ensüüm

saab digereerida ainult oligomannoosi ja enamusi hübriidseid glükaane, samas kui

kompleksi tüüpi oligosahhariide ei hüdrosüülita. 20

Proovi valmistamine MALDI/TOF-MS jaoks

Vabanenud oligosahhariide sisaldavaid ensümaatilisi digereerimissaaduseid

inkubeeriti pärast äädikhappe lisamist lõpliku kontsentratsioonini 150 mM 3 tundi

toatemperatuuril ning juhiti seejärel katioonide ja valkude eemaldamiseks läbi 0,6

ml katioonvahetuse vaigu (AG50W-X8 vaik, hüdrogeeni vormis, 100 - 200 sõela 25

suurus, BioRad, Šveits), mis oli paigutatud mikro-bio-pöörlevasse kromatograafia

kolonni (BioRad, Šveits). Üks mikroliiter saadud proovi viidi roostevabast terasest

plaadile ja segati plaadil 1 µl sDHB maatriksiga. sDHB maatriks valmistati,

lahustades 2 mg 2,5-dihüdroksübensoehapet ja 0,1 mg 5-metoksüsalitsüülhapet 1

ml etanoolis/10 mM naatriumkloriidi vesilahuse segus (suhtes 1:1). Proovid 30

EE - EP1692182 B1 107

kuivatati õhu käes, neil rakendati 0,2 µl etanooli ja proovidel lasti lõpuks õhu käes

rekristalliseeruda.

MALDI/TOF-MS

Massispektri saamiseks kasutatud MALDI-TOF massispektromeetriks oli Voyager

Elite (Perspective Biosystems). Instrumenti kasutati lineaarses konfiguratsioonis, 5

20 kV suuruse kiirenduse ja 80 ns viivitusega. Ioonide massi määramisel kasutati

oligosahhariidide standardeid kasutavat välist kalibreerimist. Lõpliku spektri

saamiseks summeeriti 200 laseri rakendamise tulemused.

Täisvere B rakkude hulga vähendamine

Tervelt patsiendilt saadud 495 µl hepariniseeritud verd alikvooditi 5 ml 10

polüstüreentuubidesse, seejärel lisati 5 µl 100-kordseid kontsentreeritud antikeha

proove (1-1000 ng/ml kohta lõppkontsentratsioon) või ainult PBS ja tuube

inkubeeriti temperatuuril 37 oC. 24 tunni pärast viidi uude tuubi 50 µl verd ja värviti

anti-CD3-FITC, anti-CD19-PE ja anti-CD45-CyChrome (Becton-Dickinson) abil 15

minutit toatemperatuuril pimedas. Enne analüüsi lisati tuubidesse 500 µl FACS 15

puhvrit (PBS, mis sisaldas 2% FCS ja 5 mM EDTA). Vereproovide CD3-FITC ja

CD 19-PE fluorestsentsi analüüsiti voolutsütomeetriliselt, seades lävendi CD45-

CyChrome´l. B rakkude hulga vähenemine määrati, arvutades CD19+ B rakkude

suhte CD3+ T rakkude suhtes.

Anti-CD20 antikehade seondumine Raji rakkudega 20

180 µl FACS puhvris (PBS, mis sisaldab 2% FCS ja 5 mM EDTA) olevad 500 000

rakku viidi 5 ml polüstüreentuubidesse, lisades 20 ul 10 kordse

kontsentratsiooniga anti-CD20 antikeha proove (lõppkontsentratsioon 1 – 5000

ng/ml kohta) või ainult PBS ja inkubeerides tuube 30 minutit temperatuuril 4 oC.

Järgnevalt pesti proove kaks korda FACS puhvriga ja granuleeriti 3 minuti jooksul 25

kiirusel 300 x g. Ülemine vedelikukiht aspireeriti välja ja rakud võeti 100 Φ1 FACS

puhvrisse, lisades 1 µl anti-Fc-spetsiifilise F(ab´)2-FITC fragmente (Jackson

Immuno Research Laboratories, USA) ja seejärel inkubeeriti tuube 30 minutit

temperatuuril 4 oC. Järgnevalt pesti proove kaks korda FACS puhvriga ja viidi

seejärel voolutsütomeetriaga analüüsimiseks 500 µl FACS puhvrisse, mis sisaldas 30

EE - EP1692182 B1 108

0,5 µg/ml kohta Pl. Seondumine määrati, arvutades graafikul geomeetrilise

keskmise fluorestsentsi antikeha kontsentratsioonide vastu.

NÄIDE 2

Suure homoloogiaga aktseptori meetod

Suure homoloogiaga antikeha aktseptori raami otsing viidi läbi, reastades hiire B-5

Ly1 valgu järjestuse inimese idutee rakkude järjestustega ja valides selle inimese

järjestuse, millel ilmnes suurim järjestuse identsus. Käesolevas katses valiti raske

ahela raami aktseptori järjestuseks VBase andmebaasist järjestus VH1_10 ja

kerge ahela raami aktseptori järjestuseks valiti VK_2_40 järjestus. Neile kahele

aktseptori raamile siirdati kolm hiire raskete ja kergete varieeruvate domeenide 10

komplementaarsust määravat piirkonda (CDR). Kuna raami 4 piirkonda ei olnud

idutee V geeni varieeruva piirkonna osaks, sooritati selle positsiooni reastamine

individuaalselt. Raske ahela jaoks valiti JH4 piirkond ja kerge ahela jaoks valiti JK4

piirkond. Välja töötatud immunoglobuliini domeeni molekulaarne modelleerimine

paljastas ühe punkti, mis vajas väljapool CDR potentsiaalselt inimese 15

aminohappejääkide asemel hiire aminohappejääke. Hiire aminohappejääkide

taassisestus inimese raami tekitakse nn. tagasimutatsioonid. Näiteks Kabat´

positsioonil 27 olev inimese aktseptori aminohappejääk muteerus tagasi türosiini

jäägiks. Seega töötati välja inimese jaoks kohandatud antikeha fragmendid, mis ei

sisaldanud ega jätnud vahele tagasimutatsioone. Inimese jaoks kohandatud 20

antikeha kerge ahel ei vajanud mingisuguseid tagasimutatsioone. Pärast

valgujärjestuste väljatöötamist sünteesiti need valke kodeerivad DNA järjestused

viisil, mis on välja toodud järgnevalt.

Segatud raami meetod

Et vältida tagasimutatsioonide sisestamist inimese aktseptoriraami kriitilise 25

tähtsusega aminohappejäägi positsioonidele (kriitilised hea antigeeni siduva

afiinsuse või antikeha funktsiooni säilitamiseks) uuriti, kas kogu raami piirkond 1

(FR1) või raami piirkonnad 1 (FR1) ja 2 (FR2) koos suudaksid asendada juba

doonorjääke omavad inimese antikeha järjestused või funktsionaalselt

samaväärsed järjestused nendel olulistel looduslikel inimese idutee järjestuste 30

EE - EP1692182 B1 109

positsioonidel. Sellel eesmärgil reastati hiire B-Ly1 järjestuse VH raamid 1 ja 2

individuaalselt inimese idutee järjestustega. Siin ei olnud suurim järjestuse

identsus oluline ja seda ei kasutatud aktseptori raamide valimiseks; olulisemaks

loeti mitme kriitilise tähtsusega jäägi ühtivust. Need kriitilised jäägid hõlmasid

jääke 24, 71 ja 94 (Kabat´ nummerdus) ja samuti neid jääke positsioonidel 27, 28 5

ja 30 (Kabat´ nummerdus), mis jäid väljapoole Kabat´ CDR1 definitsiooni, kuid

osalesid sageli antigeeni sidumisel. Sobivaks järjestuseks valiti IMGT järjestus

VH3_3_15. Pärast valgujärjestuste väljatöötamist sünteesiti need valke kodeerivad

DNA järjestused viisil, mis on välja toodud järgnevalt. Seda meetodit kasutades ei

vajatud heade antigeeni sidumistasemete säilitamiseks ei kergel ega raskel ahelal 10

tagasimutatsioone.

Antikeha geenide süntees

Pärast inimese jaoks kohandatud antikeha V piirkonna aminohappejärjestuse

väljatöötamist tuli luua DNA järjestus. Individuaalsete raami piirkondade DNA

järjestuste andmed olid toodud inimese idutee järjestuste andmebaasides. CDR 15

piirkondade DNA andmed võeti vastavatest hiire cDNA andmetest. Nende

järjestuste abil pandi virtuaalselt kokku kogu DNA järjestus. Omades neid DNA

järjestuse andmeid, sisestati virtuaalsesse järjestusse diagnostilised

restriktsioonisaidid, sisestades selleks vaiksed mutatsioonid ja luues seeläbi

restriktsiooni endonukleaaside tuvastussaidid. Füüsikalise DNA ahela hankimiseks 20

viidi läbi geenisüntees (näiteks Wheeler et al. 1995). Selles meetodis loodi

oligonukleotiidid huvi pakkuvatest geenidest viisil, kus üks seeria oligonukleotiide

deriveeriti kodeerivast tüvest ning muud seeriad deriveeriti mittekodeerivast tüvest.

Iga oligonukleotiidi 3´ ja 5´ otsad (v.a reas esimene ja viimane) demonstreerisid

kahe vastastüvest deriveeritud praimeri suhtes alati komplementaarseid järjestusi. 25

Viies need oligonukleotiidid mistahes stabiilse polümeraasi jaoks sobivasse

reaktsioonipuhvrisse ja lisades Mg2+, dNTPs ja DNA polümeraasi, laiendati iga

oligonukleotiidi selle 3´ otsast. Ühe praimeri värskelt moodustunud 3´ ots seondus

seejärel kaksikahelaks vastastüve järgmise praimeriga ja laiendas selle järjestust

edasi tingimustel, mis sobisid matriitsist sõltuvaks DNA ahela pikendamiseks. 30

Lõppsaadus klooniti E. coli tüves paljundamiseks tavapärasesse vektorisse.

EE - EP1692182 B1 110

Antikeha tootmine

Inimese raske ja kerge ahela liiderjärjestused (eritamiseks) lisati eelnevalt

mainitud varieeruva piirkonna järjestustest vastassuunas ning ühendati seejärel

vastavalt inimese IgG1 kappa konstantsetest raske ja kerge ahela järjestustest

vastassuunas, kasutades selleks standardseid molekulaarbioloogia tehnikaid. 5

Saadud täieliku antikeha raske ja kerge ahela DNA järjestused alamklooniti MPSV

promootori kontrolli all ja sünteetilisest polüA piirkonnast vastassuunas imetajate

ekspressioonivektoritesse (üks kerge ahela jaoks ja üks raske ahela jaoks); iga

vektor kandis EBV OriP järjestust, nagu on kirjeldatud eelnevas näites 1.

Antikehad loodi eelnevalt toodud näites 1 kirjeldatud viisil, kotransfekteerides 10

nimelt HEK293-EBNA imetaja antikeha raske ja kerge ahela

ekspressioonivektoriga, kogudes tingimustele vastava kultuursöötme 5 kuni 7

päeva pärast transfektsiooni ja puhastades eritatud antikehad valk A afiinsusega

kromatograafiaga, millele järgnes katioonvahetuse kromatograafia ja viimasena

suuruseralduskromatograafia etapp puhaste monomeersete IgG1 antikehade 15

eraldamiseks. Antikehad moodustati lahuses, mis koosnes 25 mM

kaaliumfosfaadist, 125 mM naatriumkloriidist ja 100 mM glütsiinlahusest (pH 6,7).

Inimese jaoks kohandatud antikeha variandid valmistati, kotransfekteerides

antikeha ekspressioonivektoreid koos GnTIII glükosüültransferaasi

ekspressioonivektoritega või koos GnTIII ekspressioonivektori pluss Golgi 20

mannosidaas II ekspressioonivektoriga viisil, mida on kirjeldatud eelnevas näites 1

kimäärse antikeha jaoks. Glükomuundatud antikehad puhastati ja moodustati viisil,

mida on eelnevalt glükomuundamata antikehade jaoks kirjeldatud. Antikehade Fc

piirkondade külge kinnitatud oligosahhariide analüüsiti MALDI/TOF-MS analüüsiga

eelnevalt kirjeldatud viisil. 25

Oligosahhariidi analüüs

Oligosahhariidi vabastamismeetod lahuses olevate antikehade jaoks

40 kuni 50 µg antikeha segati lahusega, mis koosnes 2 mM Tris olevast 2,5 mU

PNGaasF (Glyko, USA) (pH 7,0), lõpliku mahuni 25 mikroliitrit ning saadud segu

inkubeeriti seejärel 3 tundi temperatuuril 37 oC. 30

EE - EP1692182 B1 111

Proovi valmistamine MALDI/TOF-MS jaoks

Vabanenud oligosahhariide sisaldavaid ensümaatilisi digereerimissaaduseid

inkubeeriti pärast äädikhappe lisamist lõpliku kontsentratsioonini 150 mM

täiendavad 3 tundi toatemperatuuril ning juhiti seejärel katioonide ja valkude

eemaldamiseks läbi 0,6 ml katioonvahetuse vaigu (AG50W-X8 vaik, hüdrogeeni 5

vormis, 100 - 200 sõela suurus, BioRad, Šveits), mis oli paigutatud mikro-bio-

pöörlevasse kromatograafia kolonni (BioRad, Šveits). Üks mikroliiter saadud

proovi viidi roostevabast terasest plaadile ja segati plaadil 1 µl sDHB maatriksiga.

sDHB maatriks valmistati, lahustades 2 mg 2,5-dihüdroksübensoehapet ja 0,1 mg

5-metoksüsalitsüülhapet segus, mis koosnes 1 ml etanoolist/10 mM 10

naatriumkloriidi vesilahusest (suhtes 1:1). Proovid kuivatati õhu käes, neil

rakendati 0,2 µl etanooli ja proovidel lasti lõpuks õhu käes rekristalliseeruda.

MALDI/TOF-MS

Massispektri saamiseks kasutatud MALDI-TOF massispektromeetriks oli Voyager

Elite (Perspective Biosystems). Instrumenti kasutati lineaarses konfiguratsioonis, 15

20 kV suuruse kiirenduse ja 80 ns viivitusega. Ioonide massi määramisel kasutati

oligosahhariidide standardeid kasutavat välist kalibreerimist. Lõpliku spektri

saamiseks summeeriti 200 laseri rakendamise tulemused.

Antigeeni seondumistest

Puhastatud monomeerse inimese jaoks kohandatud antikeha variantide 20

seondumist inimese CD20 testiti Raji B raku lümfoomi märklaud-rakkudel,

kasutades voolutsütomeetrial põhinevat analüüsi, mida on kirjeldatud eelnevas

näites 1 kimäärse B-Ly1 antikeha jaoks.

Monomeersete IgG1 glükovariantide seondumine NK rakkude ja Fc□RIIIA-

avaldava CHO rakuliiniga 25

Inimese NK rakud eraldati värskelt eraldatud perifeerse vere mononukleaarsetest

rakkudest (PBMC), rakendades negatiivset selektsiooni, mis oli CD16- ja CD56-

positiivsete rakkude (MACS system, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch

Gladbach/Saksamaa) jaoks rikastav. CD56 ekspressiooniga määratud puhtus jäi

EE - EP1692182 B1 112

vahemikku 88 - 95%. Värskelt eraldatud NK rakke inkubeeriti PBS ilma kaltsiumi ja

magneesiumi ioonideta (3 x 105 rakku/ml kohta) 20 minutit temperatuuril 37 oC, et

eemaldada NK rakkudega seonduv IgG. Rakke inkubeeriti kontsentratsioonil 106

rakku/ml kohta erinevate anti-CD20 antikeha kontsentratsioonidena (0, 0,1, 0,3, 1,

3, 10 mg/ml kohta) PBS, 0,1% BSA. Pärast mitut pesu määrati antikeha sidumine, 5

inkubeerides suhtes 1:200 FITC konjugeeritud F(ab´)2 kitse inimesevastase,

F(ab´)2 spetsiifilise IgG (Jackson ImmunoReasearch, West Grove, PA/USA) ja

inimesevastase CD56-PE (BD Biosciences, Allschwil/Šveits). Antikeha

glükovariantide (3 µg/ml kohta) seondumisega konkureerimiseks lisati

kontsentratsiooniga 10 µg/ml kohta Anti-FcgammaRIIIa 3G8 F(ab´)2 fragmendid 10

(Ancell, Bayport, MN/USA). Seotud antikeha variantidele viitav fluorestsentsi

intensiivsus määrati CD56-positiivsete rakkude jaoks seadmega FACSCalibur (BD

Biosciences, Allschwil /Šveits). CHO rakud transfekteeriti elektroporatsiooniga

(280 V, 950 mF, 0,4 cm), kasutades ekspressioonivektorit, mis kodeerib

FcgammaRIIIA-Va1158 α-ahelat ja µ-ahelat. Transfektandid valiti, lisades 6 µg/ml 15

kohta puromütsiini ja stabiilseid kloone analüüsiti FACS, kasutades 10 µl FITC-

konjugeeritud anti-FCgammaRIII 3G8 monoklonaalset antikeha (BD Biosciences,

Allschwil/Šveits) 106 raku jaoks. IgG1 seondumine FcgammaRIIIAVal158-

avaldavate CHO rakkudega sooritati analoogselt eelnevalt kirjeldatud NK rakuga

seondumisega. 20

ADCC analüüs

Efektorrakkudena kasutati inimese perifeerse vere mononukleaarseid rakke

(PBMC) ning need valmistati, kasutades Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics

Inc., St. Louis, MO63178 USA) ja järgides üldiselt tootja juhiseid. Lühidalt,

vabatahtlikelt võeti hepariniseeritud süstaldega veeniverd. Veri lahjendati suhtes 25

1:0,75-1,3 PBS (ei sisalda Ca++ või Mg++) ja kanti kihiliselt Histopaque-1077.

Gradienti tsentrifuugiti ilma pausideta 30 minutit kiirusel 400 x g toatemperatuuril

(TT). PBMC sisaldav interfaas koguti, pesti PBS (50 ml rakkude kohta kahest

gradiendist) ning koguti tsentrifuugimisega 10 minuti jooksul TT kiirusel 300 x g.

Pärast kobara resuspensiooni PBS loendati PBMC ja pesti teist korda 30

tsentriguurimisega 10 minuti jooksul TT kiirusel 200 x g. Rakud resuspendeeriti

seejärel järgnevateks protseduurideks sobivas söötmes.

EE - EP1692182 B1 113

ADCC analüüsides kasutatud efektori-märklaua suhe PBMC ja NK rakkude jaoks

oli vastavalt 25:1 ja 10:1. Efektorrakud valmistati AIM-V söötmel piisava

kontsentratsiooniga, et ümara põhjaga 96-reservuaariga plaadi igasse reservuaari

sai lisada 50 µl materjali. Märklaud-rakkudeks olid inimese B lümfoomi rakud

(näiteks Raji rakud), mis olid kasvatatud 10% FCS sisaldavas DMEM. Märklaud-5

rakud pesti PBS, loendati ja resuspendeeriti AIM-V kontsentratsioonil 0,3 miljonit

rakku/ml kohta nii, et igasse mikroreservuaari saaks lisada 30 000 rakku 100 µl

kohta. Antikehad lahjendati AIM-V, lisati 50 µl suuruse kogusena eelnevalt plaadile

kantud märklaud-rakkudele ja lasti 10 minutit TT märklaud-rakkudega seonduda.

Seejärel lisati efektorrakud ja plaati inkubeeriti 4 tundi temperatuuril 37 oC 5% CO2 10

sisaldavas niisutatud atmosfääris. Märklaud-rakkude hävitamist hinnati, mõõtes

laktaatdehüdrogenaasi (LHD) vabanemise kahjustatud rakkudest tsütotoksilisuse

tuvastuskomplekti kasutades (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Šveits). Pärast 4

tunni pikkust inkubeerimist tsentrifuugiti plaate kiirusel 800 x g. Igast reservuaarist

viidi 100 µl ülemist vedelikukihti uuele läbipaistvale lameda põhjaga 96-15

reservuaariga plaadile. Seejärel lisati igale reservuaarile 100 µl komplekti

värvisubstraadi puhvrit. Värvireaktsiooni Vmaks väärtused määrati ELISA lugejaga

tasemel 490 nm vähemalt 10 minuti jooksul SOFTmax PRO tarkvara kasutades

(Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA). Spontaanne LDH vabanemine

mõõdeti reservuaaridest, mis sisaldasid ainult märklauda ja efektorrakke, kuid 20

mitte antikehasid. Maksimaalne vabanemine määrati reservuaaridest, mis

sisaldasid ainult märklaud-rakke ja 1% Triton X-100. Spetsiifilise antikeha-

vahendatud hävitamise protsent arvutati järgneval viisil: ((x-SR)/(MR - SR)*100,

kus x oli Vmaks keskmine spetsiifilisel antikeha kontsentratsioonil, SR oli

spontaanse vabanemise Vmaks keskmine ja MR oli maksimaalse vabanemise 25

Vmaks keskmine.

Komplemendist sõltuv tsütotoksilisuse analüüs

Märklaud-rakud loendati, pesti PBS ning resuspendeeriti AIM-V (Invitrogen)

kontsentratsiooniga 1 miljonit rakku/ml kohta. Lameda põhjaga 96-reservuaariga

plaadi igasse reservuaari viidi 50 µl rakke. Antikeha lahjendused valmistati AIM-V 30

ja lisati rakkudele 50 µl kogusena. Antikehadel lasti rakkudega 10 minutit

toatemperatuuril seonduda. Inimese seerumi komplement (Quidel) sulatati,

EE - EP1692182 B1 114

lahjendati 3-kordselt AIM-V ja lisati reservuaaridele koguses 50 µl. Küüliku

komplement (Cedarlane Laboratories) valmistati vastavalt tootja juhistele,

lahjendati 3-kordselt AIM-V ja lisati reservuaaridele koguses 50 µl.

Kontrollvariandina kuumutati komplemendi allikaid enne analüüsile lisamist 30

minutit temperatuuril 56 oC. Analüüsiplaate inkubeeriti 2 tundi temperatuuril 37 oC. 5

Rakkude hävitamine määrati LDH vabanemise mõõtmisega. Lühidalt, plaate

tsentrifuugiti 3 minutit kiirusel 300 x g. 50 µl ülemist vedelikukihti reservuaari kohta

viidi uuele 96-reservuaariga plaadile ja seejärel lisati 50 µl tsütotoksilisuse

komplekti (Roche) analüüsireagenti. ELISA lugejaga sooritatud kineetiline

mõõtmine näitas, et Vmaks vastab ülemises vedelikukihis valitsevale LDH 10

kontsentratsioonile. Maksimaalne vabanemine määrati, inkubeerides rakke 1%

Trition X-100 juuresolekul.

Täisvere B rakkude hulga vähendamise analüüs

Tervete B rakkude hulga vähendamine anti-CD20 antikehade poolt täisveres viidi

läbi vastavalt eelnevas näites 1 kirjeldatud meetodile. 15

Apoptoosi analüüs

Antikehade apoptootilist potentsiaali analüüsiti, inkubeerides antikeha

kontsentratsioonil 10 µg/ml kohta (küllastavad tingimused antigeeni sidumise

suhtes) üleöö (16 - 24 tundi) märklaud-rakkudega (märklaudrakkude

kontsentratsioon 5 x 105 rakku/ml kohta). Proovid värviti AnnV-FITC ja analüüsiti 20

FACS abil. Analüüs sooritati kolmes korduses.

Tuvastus sooritati voolutsütomeetriaga, järgides apoptootiliste markerite nagu

anneksiin V ja fosfatidüülseriini välimust. Negatiivne kontrollvariant (ei indutseeri

apoptoosi) ei sisaldanud antikeha, vaid ainult fosfaat-puhverdatud soolalahust.

Positiivne kontrollvariant (maksimaalne apoptoos) sisaldas 5 mikromooli tugevat 25

apoptoosi indutseerijat kamptotetsiini (CPT).

Tulemused ja arutelu

Võrreldes antikeha variantide B-HH1, B-HH2 ja B-HH3, mis oli liidetud kimäärse B-

Ly1 kerge ahelaga (mVL, kirjeldatud eelnevas näiteks 1) või inimese jaoks

EE - EP1692182 B1 115

kohandatud B-Ly1 kerge ahelaga (KV1) ja eellaseks oleva kimäärse antikehaga

chB-Ly1 (kirjeldatud eelnevas näites 1), seondumist inimese CD20 antigeeniga

selgus, et kõikidel antikehadel oli sarnane EC50 väärtus, kuid B-HH1

konstruktsioon seondus madalama intentsiivsuse/stöhhiomeetriaga kui variandid

B-HH2 ja B-HH3 (joonis Fig 11). B-HH1 võis eristada B-HH2 ja B-HH3 nii selle 5

osaliselt inimese CDR1 ja CDR2 piirkondade (Kabat´ definitsioon) kui ka

positsioonil 28 esineva Ala/Thr polümorfismi poolest (Kabat´ nummerdus). See

näitas, et antikeha/antigeeni vastastikkuse toime jaoks oli oluline kas positsioon

28, täielik CDR1 ja/või täielik CDR2.

B-HL1, B-HH1 ja kimäärse chB-Ly1 lähteantikeha võrdlus näitas, et B-HL1 10

konstruktsioonis puudus mistahes sidumisaktiivsus ja B-HH1 omas võrreldes B-

Ly1 umbes poolt sidumisintentsiivsusest/stöhhiomeetriast (joonis Fig 12). Nii B-

HL1 kui ka B-HH1 olid välja töötatud, põhinedes inimese VH1 klassist deriveeritud

aktseptori raamidele. Muude erinevuste hulgas oli B-HL1 konstruktsiooni

positsioon 71 (Kabat´ nummerdus; Kabat´ positsioon 71 vastab SEQ ID NO: 48 15

positsioonile 72) silmatorkav erinevus, näidates selle eeldatavat tähtsust antigeeni

sidumise jaoks.

Võrreldes joonistel Fig 9 kuni 13 kujutatud antigeeni sidumisandmeid,

demonstreerisid BHH2-KV1, BHLB-KV1 ja BHL11-KV1 variandid kõikide erinevate

testitud inimese jaoks kohandatud antikeha variantide hulgast parimat 20

sidumisafiinsust inimese CD20 inimese rakkude pinnal. B-HH2 ja B-HL8 ning B-

HL11 vaheline erinevus peitus ainult FR1 ja FR2 piirkondades - kõik kolm CDR

olid identsed (võrreldes näiteks SEQ ID NO: 32, 56 ja 60, mis ei olnud

nummerdatud vastavalt Kabat´, kuid mille Kabat´ nummerduse on valdkonnas

kogenud isik võimeline hõlpsasti määrama). B-HL8 ja B-HL11 FR1 ja FR2 25

järjestused olid deriveeritud inimese VH3 klassist, samas kui kogu B-HH2 raam on

deriveeritud inimese VH1 klassist. B-HL11 oli ühe Glu1Gln mutatsiooniga

(positsioon 1 on sama nii Kabat´ nummerduses kui ka järjestuste loetlemisel

kasutatud tavapärases nummerdussüsteemis) B-HL8 derivaat, kus Gln oli B-HH2

konstruktsioonis olev aminohappejääk. See tähendas, et Glu1Gln vahetus ei 30

muutnud sidumisafiinsust või -intensiivsust. Muudeks B-HH2 ja B-HL8 vahelisteks

EE - EP1692182 B1 116

erinevusteks olid 14 raami jääki, millest üks või rohkem mõjutasid nimetatud

antikeha antigeeni sidumise olemust.

B-HL4 konstruktsioon oli deriveeritud B-HH2 antikehast, asendades B-HH2 FR1

fragmendiga, mis oli deriveeritud inimese iduliini järjestusest VH1_45. Hoolimata

sellest, et FR1 olid erinevad aminohapped ainult kolmel positsioonil, oli 5

konstruktsioonil on suuresti vähenenud antigeeni sidumisvõime. Jäägid asusid

positsioonidel 2, 14 ja 30 (Kabat´ nummerdus). Nimetatud positsioonidest võis

osutuda oluliseks positsioon 30, kuna see moodustas osa Chothia CDR1

definitsioonist. Joonistel Fig 9 kuni 13 näidatud sidumiskõverate üldine analüüs

demonstreeris, et CD20 seondumisel olid olulised järgnevad inimese jaoks 10

kohandatud B-Ly1 raske ahela jäägid (Kabat´ nummerdus): N35 (Kabat´ CDR1

lõpp), täielik Kabat´ CDR1, täielik Kabat´ CDR2 ja täielik Kabat´ CDR3, jäägid A71

ning R94 (käesoleval juhul ei saa R94 treoniiniga asendada) ja Y27. Madalamal

tasemel olid samuti kaasatud A28 ja S30. Lisaks olid antigeeni sidumise jaoks

olulised Kabat´ CDR3 ja kõik kanoonilised jäägid. Inimese jaoks kohandatud 15

kergesse ahelasse, kuhu olid siirdatud täielikud Kabat´ CDR1, CDR2 ja CDR3, ei

sisestatud tagasimutatsioone. Apoptoosi indutseerimisel (joonised Fig 14, 15 ja

21) osutus kõige potentsiaalsemaks variandiks inimese jaoks kohandatud B-Ly1

variant BHHK2-KV1 (isegi potentsiaalsem kui algne chB-ly1 ja palju

potentsiaalsem kui rituximab järjestusega identset järjestust omav antikeha C2B8). 20

Muud inimese jaoks kohandatud variandid (BHL8 derivaadid), mis suurenenud

apoptoosi taastada suutsid, olid: BHL12 kuni B-HL17 (vaadake tabelit), BHH8

(segatud raamid) ning BHH9 ("segatud raamid" ühe tagasimutatsiooniga, S30T).

Positsioonid 9 ja 48 (Kabat´ nummerdus) võivad olla antigeeniga kontaktis.

Variandid BHH4 kuni BHH7 olid muudeks inimese jaoks kohandatud B-Ly1 25

variantideks, mis ei sisestanud täiendavaid inimeselt mittepärinevaid järjestusi.

Inimese jaoks kohandatud B-Ly1 antikeha olulisteks omadusteks oli, et see oleks

II tüübi anti-CD20 antikeha, mis on defineeritud Cragg, M.S. ja Glennie, M.J.,

Blood 103(7):2738-2743 (aprill, 2004). Seega ei indutseerinud see CD20

seondumisel mistahes märkimisväärset resistentsust CD20 mitteioonse 30

pesuvahendi ekstraheerimisele CD20+ inimese rakkude pinnalt – selle

määramiseks kasutati analüüsi, mida on kirjeldanud Polyak, M.J. ja Deans, J.P.,

EE - EP1692182 B1 117

Blood 99(9):3256-3262 (2002). See avaldas kindlasti märgatavalt väiksemat

resistentsust CD20 mitteioonse pesuvahendi ekstraheerimisele kui C2B8 antikeha

(muu anti-CD20 antikeha, millel oli rituximab identne järjestus (vaadake USA

patendipublikatsiooni nr. 2003/0003097 (Reff))). Nagu oli II tüübi anti-CD20

antikehalt oodata, puudus inimese jaoks kohandatud B-Ly1 märgatav 5

komplemendi poolt vahendatud lahustusaktiivsus ja kindlasti oli komplemendi

vahendatud lahustusaktiivsus palju väiksem kui anti-CD20 antikehal C2B8

(kimäärne IgG1, mille järjestus on identne rituximab´ga). Veel üheks inimese jaoks

kohandatud B-Ly1 antikeha oluliseks omaduseks oli, et see oli väga potentsiaalne

homotüüpilise agregatsioonianalüüsi käigus. Selles analüüsis inkubeeriti CD-20 10

positiivseid inimese rakke (Daudi rakud) rakukultuuri söötmes kuni 24 tundi

temperatuuril 37 oC 5% CO2 atmosfääris imetaja rakuinkubaatoris, mida oli

kirjeldatud detailsemalt Dean´i viiteallikas; antikeha kontsentratsiooniks oli 1

mikrogramm/ml kohta ja paralleelselt 5 mikrogrammi/ml kohta. Võrdluseks või

kontrollvariandina sooritati identsetel tingimustel paralleelne rakkude 15

inkubeerimine, kuid kasutades anti-CD20 antikeha C2B8. Erinevatel ajahetkedel,

k.a 8 tundi ja 24 tundi pärast inkubeerimise algust, uuriti rakke visuaalselt

mikroskoobi abil. Leiti, et inimese jaoks kohandatud B-Ly1 antikeha kasutamine

viis tugeva homotüüpilise agregatsioonini, mille agregaadid olid oluliselt suuremad

kui C2B8 kontrollantikeha lisamisel indutseeritud. Lisaks indutseeris see sarnaselt 20

anti-CD20 tüüpi antikehaga juhul, kui CD20-positiivseid inimese rakke inkubeeriti

inimese jaoks kohandatud B-Ly1 antikehas, suuremaid apoptoosi tasemeid

võrreldes kontrollvariandiga; tingimused oli samad ja kasutati C2B8 kimäärset

IgG1 antikeha koos rituximab´ga identse järjestusega.

Inimese jaoks kohandatud antikehade glükomuundatud variandid toodeti GnTIII 25

glükosüültransferaasi koekspressioonil koos antikeha geenidega imetajate

rakkudes. See viis antikehade Fc piirkonna külge kinnitatud fukosüülimata

oligosahhariidide fraktsiooni suurenemiseni, k.a poolitatud fukosüülimata

oligosahhariidid – vaadake patenti WO 2004/065540 (joonised Fig 17-19).

Glükomuundatud antikehadel oli oluliselt suurem seondumistase inimese 30

FcgammaRIII retseptoritega (joonis Fig 20) ja ADCC aktiivsus (joonis Fig 16) kui

glükomuundamata antikehal ja C2B8 antikehal. Inimese jaoks kohandatud B-Ly1

antikeha oli võrreldes kontrollantikehaga C2B8 samuti potentsiaalsem inimese B

EE - EP1692182 B1 118

rakkude hulga vähenemise indutseerimisel täisvere analüüsis (joonis Fig 16). See

kehtis nii glükomuundamata B-Ly1 antikeha kui ka selle glükomuundatud versiooni

kohta. Glükomuundatud antikeha oli B rakkude hulga vähendamisel täisvere

analüüsis umbes 1000 korda potentsiaalsem kui C2B8 kontroll anti-CD20

antikeha. See võrdlus oli oluline nii glükomuundamata kui ka glükomuundatud 5

inimese jaoks kohandatud B-Ly1 antikeha vormide jaoks, kuna see demonstreeris,

et analüüsides, mis kombineerisid Fc retseptorist sõltuvas aktiivsused nagu ADCC

pluss komplemendi vahendatud lahustus pluss apoptoosi indutseerimine, olid

mõlemad B-Ly1 vormid oluliselt potentsiaalsemad kui C2B8, kuigi mõlemal B-Ly1

vormil oli oluliselt madalam komplemendi vahendatud lahustusaktiivsus. ADCC, Fc 10

retseptorist sõltuvad rakkude hävitamise aktiivsused ja apoptoosi indutseerimine

esinesid kõik inimese jaoks kohandatud B-Ly1 antikeha variantides üliheas

aktiivsuses. Lisaks olid apoptoosi analüüsi käigus potentsiaalsed nii selle II tüübi

anti-CD20 antikeha glükomuundatud kui ka glükomuundamata vormid; apoptoosi

indutseerimisel olid Fc muundatud variandid, millel oli suurenenud sidumisafiinsus 15

Fcgamma retseptorite suhtes, isegi potentsiaalsemad kui Fc muundamata

variandid ning kõik variandid olid oluliselt potentsiaalsemad kui kontrollantikeha.

Täiustunud homotüüpilise agregatsiooni ja II tüübi anti-CD20 antikehade

vahendatud apoptoosi indutseerimise täpne mehhanism ei ole teada ning seda

olulist omadust võivad mõjutada kaasnev CD20-positiivsete rakkude pinnal toimuv 20

muude molekulide, näiteks Fc gamma retseptorid, sidumine. Seega oli oluline

demonstreerida, et II tüübi anti-CD20 antikehad, mida oli muundatud Fc piirkonnas

suurenenud sidumisafiinsuse saavutamiseks Fc gamma retseptoritega, k.a

FcgammaRIII, ja ADCC aktiivsuse suurendamiseks, olid endiselt võimelised

tugeva apoptoosi indutseerimiseks, mis oli isegi suurem kui Fc muundamata ja 25

homotüüpilise agregatsiooni korral tekitatu. Apoptoosi indutseerimine on oluline in

vivo, kuna kehas esineb piirkondasid, kus leidub märklauaks olevaid CD20-

positiivseid rakke, kuid milles leiduvatele FcgammaRIII-positiivsetele rakkudele

juurdepääs on keerulisem kui veres; sellisteks piirkondadeks on näiteks

lümfisõlmed. Sellistes piirkondades võib apoptoosi indutseerimine anti-CD20 30

antikeha enda poolt olla kriitilise tähtsusega anti-CD20 antikeha ravi paremaks

efektiivsuseks inimestel, ravides B rakkude arvukuse vähendamise meetodiga nii

hematoloogilisi pahaloomulisi kasvajaid nagu mitte-Hodgkinsi lümfoomid ja B raku

EE - EP1692182 B1 119

krooniline lümfotsüütiline leukeemia kui ka autoimmuunhaiguseid nagu

reumaatiline artriit ja luupus. Selliste teraapiate olulisteks atribuutideks võivad

samuti olla suurenenud sidumisafiinsus FcgammaRIII suhtes ja inimese jaoks

kohandatud Fc muundatud II tüübi anti-CD20 antikeha kõrgem ADCC. Viimasena,

selliste II tüübi anti-CD20 antikehade, k.a selle inimese jaoks kohandatud ning Fc 5

muundatud variandid, vähenenud või väheoluline komplemendi vahendatud

lahustusaktiivsus võib osutuda samuti oluliseks, kuna anti-CD20 antikehade

poolset kõrgemat komplemendi aktiveerimist on seostatud suurenenud

soovimatute kõrvaltoimete esinemisega.

10

EE - EP1692182 B1 120

Patendinõudlus

1. Inimese jaoks kohandatud glükomuundatud II tüübi anti-CD20 antikeha, millel

on pärast nimetatud inimese jaoks kohandamist nimetatud glükomuundamise

tulemusel suurenenud ADCC ja suurenenud apoptoosi indutseerimise võime

märklaud-rakkudes ja kus nimetatud antikeha koosneb raske ahela varieeruvast 5

piirkonnast, mis sisaldab hiire B-Ly1 antikeha komplementaarsust määravaid

piirkondi (CDR), kus:

a. raske ahela CDR1 on SEQ ID NO: 16;

b. raske ahela CDR2 on SEQ ID NO: 26; ja

c. raske ahela CDR3 on SEQ ID NO: 28; 10

kus nimetatud antikeha raske ahela varieeruva piirkonna raami piirkonnad (FR)

FR1, FR2 ja FR3 on VH1_10 inimese idutee järjestuse poolt kodeeritavad inimese

FR järjestused ja nimetatud antikeha raske ahela varieeruv piirkond FR4 on

inimese JH4 idutee järjestuse poolt kodeeritud inimese FR järjestus; nimetatud

antikeha sisaldab täiendavalt kerge ahela varieeruvat piirkonda, mis omakorda 15

sisaldab hiire B-Ly1 antikeha CDR, kus:

d. kerge ahela CDR1 on SEQ ID NO: 18;

e. kerge ahela CDR2 on SEQ ID NO: 19; ja

f. kerge ahela CDR3 on SEQ ID NO: 20,

nimetatud antikeha kerge ahela varieeruva piirkonna FR FR1, FR2 ja FR3 on 20

VK_2_40 inimese idutee järjestuse poolt kodeeritud inimese FR järjestused ja

nimetatud antikeha kerge ahela varieeruva piirkonna FR4 on JK4 inimese idutee

järjestuse poolt kodeeritud inimese FR järjestus.

2. Antikeha vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et antikeha sisaldab

eraldatud polüpeptiidi, mis omakorda koosneb SEQ ID NO: 32 või SEQ ID NO: 40 25

raske ahela varieeruva piirkonna järjestusest.

3. Antikeha vastavalt punktile 1 või 2, mis erineb selle poolest, et antikeha

sisaldab eraldatud polüpeptiidi, mis omakorda koosneb SEQ ID NO: 40 raske

ahela varieeruva piirkonna järjestusest.

EE - EP1692182 B1 121

4. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 3, mis erineb selle poolest,

et antikeha sisaldab eraldatud polüpeptiidi, mis omakorda koosneb SEQ ID NO:

76 kerge ahela varieeruva piirkonna järjestusest.

5. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 4, mis erineb selle poolest,

et antikeha sisaldab esimest eraldatud polüpeptiidi, mis omakorda koosneb SEQ 5

ID NO: 32 või SEQ ID NO: 40 raske ahela varieeruva piirkonna järjestusest; ja

teist eraldatud polüpeptiidi, mis sisaldab SEQ ID NO: 76 kerge ahela varieeruva

piirkonna järjestust.

6. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 5, mis erineb selle poolest,

et antikeha sisaldab esimest eraldatud polüpeptiidi, mis omakorda koosneb SEQ 10

ID NO: 40 raske ahela varieeruva piirkonna järjestusest; ja teist eraldatud

polüpeptiidi, mis sisaldab SEQ ID NO: 76 kerge ahela varieeruva piirkonna

järjestust.

7. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 6, mis erineb selle poolest,

et nimetatud antikeha on suurenenud poolitatud komplekside vormis 15

oligosahhariidide hulga saavutamiseks glükomuundatud.

8. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 7, mis erineb selle poolest,

et nimetatud antikeha on vähenenud fukoosi jääkide koguse saavutamiseks

glükomuundatud.

9. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 8, mis erineb selle poolest, 20

et nimetatud antikehal on modifitseeritud oligosahhariididega Fc piirkond.

10. Antikeha vastavalt punktile 9, mis erineb selle poolest, et vähemalt 20%

nimetatud polüpeptiidi Fc piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on poolitatud

ja fukosüülimata.

11. Antikeha vastavalt punktile 9, mis erineb selle poolest, et vähemalt 50% Fc 25

piirkonnas leiduvatest oligosahhariididest on fukosüülimata.

12. Peremeesrakk, mis avaldab vähemalt ühte β(1,4)-N-atsetüül-

glükoosaminüültransferaas III aktiivsusega polüpeptiidi kodeerivat nukleiinhapet

koguses, mis on piisav nimetatud peremeesraku poolt toodetud polüpeptiidi Fc

EE - EP1692182 B1 122

piirkonna modifitseerimiseks ja nimetatud polüpeptiidiks on ükskõik millisele

punktile 1 kuni 11 vastav antikeha.

13. Peremeesrakk vastavalt punktile 12, mis erineb selle poolest, et nimetatud

peremeesraku poolt toodetud nimetatud antikeha avaldab nimetatud

glükomuundamise tulemusel suurenenud Fc retseptorit siduvat afiinsust. 5

14. Peremeesrakk vastavalt punktile 13, mis erineb selle poolest, et nimetatud Fc

retseptoriks on FcγRIIIA retseptor.

15. Peremeesrakk vastavalt punktile 12, mis erineb selle poolest, et nimetatud

peremeesraku poolt toodetud nimetatud antikeha avaldab nimetatud

glükomuundamise tulemusel suurenenud efektori funktsiooni. 10

16. Peremeesrakk vastavalt punktile 15, mis erineb selle poolest, et nimetatud

suurenenud efektori funktsiooniks on suurenenud apoptoosi indutseeriv otsene

signalisatsioon.

17. Peremeesrakk vastavalt punktile 12, mis erineb selle poolest, et sisaldab

täiendavalt vähemalt ühte transfekteeritud polünukleotiidi, mis kodeerib ükskõik 15

millisele punktile 2, 3, 5 või 6 vastavat polüpeptiidi ja nimetatud nukleiinhape

sisaldab järjestust, mis kodeerib inimese immunoglobuliini Fc piirkonnaga

samaväärset piirkonda.

18. Ravimkoostis, mis sisaldab antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni

11 ja farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandurit. 20

19. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 11 kasutamiseks ravimina

B raku lümfoomi ravimiseks.

20. Antikeha vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 11 kasutamine ravimi

valmistamiseks B raku lümfoomi ravimiseks.