superoxide dismutase -...

http://genewikiplus.org/wiki/superoxide_dismutase

EL MUNDO FASCINANTE DE LAS

METALOENZIMASJAMES F. wESTON, ÓSCAR G. GARCÍA

52 Hipótesis, apuntes científicos uniandinos, núm. 13, noviembre del 2012

Con la creciente disminución de los recursos fósiles, nos acer-camos rápidamente a un dilema global: ¿de dónde vamos a obtener la energía que necesitamos en el futuro? Junto con este dilema, hay otro asociado directamente: los depósitos na-turales de nitratos para fertilizantes también se están acabando rápidamente. ¿Cómo asegurar el sustento diario si la pobla-ción mundial sigue creciendo? afortunadamente, tenemos una solución parcial en el caso de los alimentos, pues somos ca-paces de producir fertilizantes usando el proceso industrial de Haber-Bosch1, que convierte el nitrógeno del aire en amoniaco, el cual, a su vez, se puede convertir fácilmente en fertilizante. no obstante, esta solución es extremadamente ineficiente debi-do al altísimo gasto de energía. Por ejemplo, en el 2008, el 40% de la población mundial se alimentó con base en fertilizantes producidos mediante el proceso Haber-Bosch y este proceso consumió el 2% de la energía mundial total en dicho año [1, 2].

en el aspecto bioquímico, la naturaleza ya ha solucionado ambos problemas de una manera muy elegante. el proceso de la fotosintesís garantiza que se obtenga toda la energía que necesita direc-tamente del sol y que las plantas obtengan el nitrógeno (fertilizante) mediante el proceso de “fijación de nitrógeno”. ambos procesos fundamentales funcionan con la ayuda de una clase especial de catalizadores naturales: las metaloenzimas.

las metaloenzimas catalizan procesos bioquímicos difíciles o aun imposibles de realizar en el labo-ratorio, con velocidades increíbles y bajo condiciones ambientales (25° C y presión atmosférica). los dos procesos anteriores son solamente dos ejemplos naturales (vide infra). el interés de los químicos en las metaloenzimas suele ser evidente pues queremos ser capaces de sintetizar catalizadores simi-lares en nuestros laboratorios.

a primera vista, las metaloenzimas son sistemas simples: la mayoría contienen un sitio activo con un ion metálico, que es el responsable de llevar a cabo la catálisis. las estructuras de estos sitios activos nos recuerdan las de los complejos inorgánicos de metales de transición y “sabemos” cómo sintetizar

1 el proceso de Haber-Bosch fue patentado por el alemán fritz Haber y comercializado en 1910 por Carl Bosch. Haber y Bosch recibieron el Premio nobel de química en 1918 y 1931, respectivamente, por sus trabajos y desarrollos en la aplicación de la tecnología de altas presiones y temperaturas.

El mundo fascinante de las metaloenzimas

James F. WestonDr. rer. nat. Profesor del Departmento de Química de la Universidad de los Andes, [email protected]

Óscar G. GarcíaAsistente graduado del Departamento de Química de la Universidad de los Andes, [email protected]

Universidad de los Andes, facultad de Ciencias 53

pequeños compuestos de este tipo. en este contexto muchos grupos de investigación en todo el mundo se han dedicado a duplicar la estructura enzimática de la vecindad del ion métalico con base en pequeños compuestos artificiales o biomiméticos. Pero el progreso en este campo no ha tenido mucho éxito. grupo tras grupo ha logrado la síntesis de un biomimético potencial que duplica perfectamente la estructura alrededor del ion me-tálico del sitio activo de la enzima, ¡pero que generalmente no realiza la catálisis! una relación simple entre estructura y función no se da para la mayoría de las metaloenzimas.

es evidente que nos falta comprender los mecanismos naturales de la catálisis metaloenzimática. Por suerte, los progresos en este campo han sido enormes y nuevos conocimientos surgen casi a diario; no obstante, estamos ahogados en un mar de de-talles específicos sin una visión general.

la naturaleza no tiene una única estrategia, sino varias estrate-gias sumamente diversas. según el profesor truhlar “[…] each enzyme has its unique characteristics and enzymes use all pos-sible means to achieve the ultimate objective of reducing the free energy of activation…” [3]. si se extrapola esta observa-ción, hay que considerar cada metaloenzima por separado (¡ya existen miles!) y, en consecuencia, no habría la posibilidad de obtener principios generales. en contravía a esta observación, la mayor parte del desarrollo en este campo se basa en un único modelo simplista de catálisis enzimática. la realidad se encuen-tra probablemente en el medio. en nuestra opinión, la naturale-za emplea una serie de estrategias generales para asegurar la capacidad básica de sus metaloenzimas y además, la evolución

ha optimizado cada sistema por sí mismo, introduciendo modifi-caciones individuales.

Para un químico que está tratando de sintetizar un biomimético debe ser suficiente saber con cuál estrategia general está tra-bajando el sistema natural. Pero en este aspecto, falta literatura. no existen modelos generales para catalogar y comparar los distintos mecanismos de las metaloenzimas.

EL MODELO BÁSICO

emil fischer propuso en 1894 un modelo muy simple para la ac-ción de una enzima: el modelo “llave-cerradura”2. este modelo, que fue modificado por la teoría de la estructura de transición de michael Polanyi en 19213 y las contribuciones de linus Pauling en 19464, resultó un modelo básico que aún se usa para explicar la capacidad catalítica de enzimas.

2 Hermann emil fischer (1852-1919), alemán, fue uno de los pioneros en el campo de la bioquímica molecular. encontró que las proteínas están compuestas por aminoácidos, deter-minó las primeras estructuras moleculares de azucares simples y descubrió que la acción de las enzimas es específica. Por sus trabajos recibió el Premio nobel de química en 1902.

3 michael Polanyi (1891-1976), fisicoquímico húngaro, desarrolló la teoría de estructuras de transición. Cuando una reacción química transforma un compuesto a en otro B, esta ocurre a través de una especie transitoria (t) que tiene una estructura intermedia entre la de a y la de B.

4 linus Pauling (1901-1994), químico estadounidense, fue uno de los primeros químicos cuánticos y recibió el Premio nobel de química en 1954 por su trabajo sobre la naturaleza de los enlaces químicos. es una de las pocas personas que ha recibido el Premio nobel en más de una ocasión: también recibió el Premio nobel de la Paz en 1962 por su campaña contra las pruebas nucleares terrestres. fue un científico muy prólifico y contribuyó significantemen-te al desarrollo de varios campos, entre estos la biología molecular, en la cual hizo importan-tes descubrimientos sobre el funcionamiento de los catalizadores naturales: las enzimas.

Proceso industrial de Haber Bosch

Fijación enzimática del nitrógeno

Fertilizante

nitrogenasa

n2, H2

n2, H2

nH3 (i)

8H+ + 8e- + N2 2NH3 + H2N2 + 3H2 2NH3

Fe

400 °C300 bar

25 °CPresión normal

imagen de los autores.


Sustrato Producto

Sitio activo

Complejo enzima-sustrato

Complejo enzima-producto

este modelo considera que una enzima –una macromólecula– tiene un pequeño sitio localizado en su superficie llamado “sitio activo” y propone que toda la actividad catalítica proviene de este sitio. si la topología de este sitio –la cerradura– permite el paso del sustrato –la llave–, la enzima lo acepta. se asume que la alta selectividad de las enzimas proviene de esta preselección topológica. Cuando el sustrato entra en el sitio activo se genera un intermediario enzima-sustrato [es]. en este, la topología y ca-racterísticas electrónicas del sitio activo ejercen una fuerza so-bre el sustrato que lo polariza, desestabiliza y lo prepara para la reacción química. De este intermediario [es] la reacción química alcanza el estado de transición [et†]. el sitio activo interactúa directamente con el estado de transición disminuyendo, de esta forma, la energía de activación, ∆g†

cat.

[ET†]†

[EP]

[ES]

Reacción

E (+ S)

E (+ P)

∆G†cat

∆G

∆G†enz

∆Gbind∆Ggrad

∆Gdebind

la estabilización del estado de transición y la destabilización del sustrato que provienen de interacciones específicas entre el sustrato y el sitio activo se consideran los dos factores más importantes que contribuyen a disminuir la energía de activa-ción, ∆g†

cat. la reacción química termina con la formación de un

complejo enzima-producto [eP]. la evolución ha optimizado el sitio activo para tener poca afinidad con el producto, que puede fácilmente disociarse y salir del sitio activo. este modelo básico sigue la cinética de michaelis-menten5 y describe una visión ex-tremadamente simplificada de la actividad enzimática:

E + S [ES] [EP] E + Pkcat

k1 [ET†]† k2

Hoy en día, sabemos que la mayoría de las metaloenzimas muestran desviaciones considerables a este comportamiento.

5 el alemán leonor michaelis (1875-1949) y la canadiense maude menten (1879-1960) son conocidos por su trabajo en la cinética enzimática y concretamente por la formulación del modelo cinético de michaelis-menten.

De hecho, se han identificado por lo menos cuatro estrate-gias generales y muy heterogénas bajo las cuales trabajan las metaloenzimas.

METALOENZIMAS DE PLANTILLA

el comportamiento metaloenzimático más simple que se en-cuentra en la naturaleza, y que corresponde mejor a nuestro módelo básico, es el conocido como “metaloenzima de plantilla”. su característica intrínseca es que el ion metálico está enlazado de manera permanente e irreversible a un pequeño sitio activo definido y localizado en la superficie de la enzima. la reacción química tiene lugar en este sitio. la tarea del ion metálico es la de reconocer al sustrato, interactuar con él para efectuar la reacción química y, finalmente, liberar el producto. en esta ca-tegoría, el ion metálico funciona como un verdadero catalizador y su acción es modificada solamente por la estructura del sitio activo en la vecindad inmediata. el resto de la enzima se puede considerar como balastro desde el punto de vista de la reacción química.

las características de las metaloenzimas de plantilla las hacen más accesibles para la síntesis de biomiméticos pequeños. Pa-rece simple diseñar un compuesto pequeño artificial donde se duplica el ion metálico y sus alrededores inmediatos con base en un complejo de coordinación. más del 90% de los trabajos publicados en este campo han sintetizado biomiméticas poten-ciales de acuerdo con este principio. el problema nuevamente es que: ¡la mayoría de estos compuestos no muestra ninguna actividad catalítica! las razones para esto pueden ser varias. una de ellas es que la enzima en la que se basa la biomiméti-ca no tiene una actividad “de plantilla”, sino un tipo de activi-dad mucho más compleja. en este caso, no se puede esperar una relación simple entre estructura y función. Por otra parte, enzimas del tipo plantilla suelen ser relativamente raras: muy pocas metaloenzimas funcionan de esta manera. Por ejemplo, se puede mencionar la niquel superóxido dismutasa6. una corta sequencia artifical de 6 a 9 aminoácidos replica exactamente el sitio activo de la niquel superóxido dismutasa y muestra una alta actividad catalítica [4].

otro problema grande con las biomiméticas a base de comple-jos de coordinación es que hay una diferencia esencial entre la estrategia plantilla de la naturaleza y la estrategia plantilla de la síntesis de complejos de coordinación, y esta diferencia es tan grande como la diferencia entre el modelo de Platón y el modelo de Copérnico y galileo del sistema solar.

la naturaleza emplea la estructura peptídica de la enzima como un molde que acepta el ion metálico. el ion metálico es

6 las superóxido dismutasas son una familia de enzimas capaces de destoxificar el anion radical superóxido (o

2-.). una concentración celular elevada de esté radical anión en seres

humanos es relacionada con muchas enfermedades patólogicas y parece ser uno de los factores significativos en el proceso del envejecimiento.


solamente una pequeña parte de un sistema completo, la ma-cromolécula. si se quita el ion metálico, la enzima pierde su actividad, pero no se destruye el sistema. normalmente, se pue-de reintroducir el ion metálico y la metaloenzima recupera su actividad catalítica.

Cuando sintetizamos un complejo de coordinación, usamos el ion metálico como molde para organizar su alrededor que cons-ta de ligandos orgánicos. el punto central del sistema, el ion metálico, fija estos ligandos a su alrededor mediante interac-ciones directas. si se quita este centro metálico, se destruye completamente el compuesto artificial. quizas es este uno de los factores determinantes para el no-funcionamiento de muchas biomiméticas artificiales.

SISTEMAS SECUENCIALES

otras metaloenzimas, particularmente las que están involucra-das en metabolismos complejos como el ciclo de Krebs7, mues-tran una actividad catalítica totalmente diferente a la de una en-zima de plantilla y se emplea el concepto de “secuencial” para describir el comportamiento de estos sistemas.

Como las metaloenzimas de plantilla, las metaloenzimas se-cuenciales tienen un sitio activo localizado. sin embargo, las ca-racterísticas comunes terminan ahí, pues el ion metálico ahora forma parte intrínseca del círculo catalítico, interactuando con el sitio activo de manera reversible, entrando y saliendo como el

7 el ciclo de Krebs, descubierto por el alemán Hans adolf Krebs (1900-1981) en 1937 (Premio nobel de medicina en 1953), es la ruta metabólica central de todos seres vivos aeróbicos (inclusive seres humanos) en la cual se degrada acetato (en forma de acetyl-Coa), que proviene de los carbohidratos, proteínas y grasas del alimento, para producir energía y precursores bioquímicos importantes para el funcionamiento y mantenimiento del organismo.

sustrato y el producto. los sistemas secuenciales tienen varios estados distintos: al menos un estado inactivo y un estado ac-tivo. en el estado de inactividad e, el sitio activo está vacío, no contiene el ion metálico y la enzima en esta forma no reconoce el sustrato s.

[EM]

[EMP][EMT]†

S

SP

E

M M

[EMS]

[EM]

el círculo catalítico inicia cuando el estado inactivo e acepta un ion metálico m para generar un intermediario enzima-ion metá-lico [em]. este activa la capacidad de la enzima de reconocer y fijar el sustrato, de lo que resulta un intermedario enzima-ion-metálico-sustrato [ems]. en un sistema secuencial que depende de un ion metálico solamente, este representa el estado “activo”. a partir del [ems] intermediario, la reacción química progresa hasta una estructura de transición [emt†] y continúa a un inter-mediario enzima-ion metálico-producto [emP]. el sitio activo no tiene una buena afinidad para el producto P, el cual se disocia fácilmente y deja un [em]-intermediario que puede aceptar otro sustrato o perder su ion metálico, regresando de esta manera al estado inactivo e.

aunque existen enzimas secuenciales que dependen de un único ion metálico, son más comúnes las que involucran dos. en esta situación, el intermediario [em

1s] representa un estado adicional

de preactivación. ahora se requiere un ion metálico adicional m2,


Sitio activo de la níquel superóxido dismutasa


Hemoglobina

Mecanismo alostérico de

adsorción de oxigeno

para llegar al estado activo [em1sm

2]. solamente en la presencia

de este segundo ion metálico se puede convertir el sustrato en el producto mediante la generación de un [em

1Pm

2] intermediario.

[EM1]

[EM1 P]

[EM1PM2][EM1TM2]†

S1+S

+M2

−P

−M2

E

M1 M1

[EM1SM2]

[EM1]

[EM1 S]

el orden cinético de entrada y salida de los iones metálicos, el sustrato y el producto, es muy importante y da origen a la asignación “secuencial” de este tipo de actividad enzimática. el tamaño del sitio activo normalmente es un poco más grande respecto a una enzima de plantilla. además, frecuemente se encuentran cambios dinámicos locales en la estructura del sitio activo.

la actividad catalítica de esta categoría depende naturalmente de la biodisponibilidad del ion metálico. los organismos pueden reporcionar una regulación a los procesos metábolicos que de-penden de enzimas secuenciales en que simplemente se regu-la la concentración local de los iones metálicos. seguramente, esta es una de las ventajas evolutivas que condujeron a la alta frecuencia de encontrar sistemas secuenciales en procesos me-tabólicos y redes de transducción de señales.

en la actualidad no existe una estrategia sintética para llegar a compuestos artificiales capaces de duplicar una acción enzi-mática secuencial. apenas estamos llegando a la capacidad de investigar esos sistemas de manera teórica con la ayuda de la química computacional. los pocos sistemas secuenciales artifi-ciales que tenemos fueron descubiertos más o menos por ca-sualidad, sin que los químicos reconocieran sus características mecanísticas especiales. Pero, bajo éstos se encuentran algu-nos de los catalizadores artificiales más poderosos de la química que normalmente no se asocian con sistemas biomiméticos o con la bioquímica. el ejemplo más importante, tal vez, es la re-ducción de noyori, un método excelente para obtener un alcohol asimétrico usando un catalizador quiral8. esta reacción depende de la presencia de dos iones de zinc y se desarrolla sobre un mecanismo secuencial.

8 los catalizadores quirales son tan importantes en la química sintética que las contri-buciones del japones royji novori y los estadounidenses william s. Knowles y K. Barry sharpless al campo de la catálisis asimétrica les mereció el Premio nobel de química en 2001.

ENZIMAS ALOSTÉRICAS

si aumentamos la complejidad, tenemos que mencionar los sis-temas alostéricos descritos por Jefferies wyman en 1965 [5]. en este caso, es imposible considerar la catálisis confinada a una región localizada de la enzima y no se puede hablar de un sitio activo aislado. es cierto que la enzima fija el sustrato en un lugar definido llamado sitio activo o sitio alostérico, pero la fijación del sustrato induce un cambio de conformación espacial de la enzima por completo, de lo que resultan modificaciones críticas en otras ubicaciones que pueden ser muy lejanas del sitio alostérico.

la hemoglobina, en los glóbulos rojos de la sangre, constituye un ejemplo importante de un sistema alostérico, aunque no sea una enzima en el sentido estricto, sino más bien una molécula de transporte encargada de transportar oxígeno de los pulmones hasta las células individuales que lo requieren.

la hemoglobina se compone de cuatro subunidades, más o menos esféricas, que se unen en forma tetraédrica, una esfera encima de otras tres. Cada subunidad es un transportador por sí mismo y contiene un grupo hemo como sitio alostérico capaz de fijar reversiblemente una molécula de oxígeno. es bastante particular que la fijación de una molécula tan pequeña como el oxígeno (peso molecular 32 gmol-1) en uno de los cuatro sitios alostéricos induzca un cambio estructural en la proteína (peso molecular 64.000 gmol-1).



la fijación del primer oxígeno aumenta la afinidad de la segunda subunidad por o2; la fijación del segundo o2 aumenta la afini-dad para el tercero, etc. este fenómeno llamado “cooperación positiva” asegura que la hemoglobina esté plenamente cargada al salir de los pulmones. Cuando la hemoglobina llega a una célula que necesita o2, este mecanismo cooperativo se revierte y la liberación del primer o2 facilita la sucesiva liberación de o2 de las otras subunidades. el comportamiento cooperativo de la hemoglobina es indispensable para el transporte eficiente del oxígeno dentro del cuerpo.

MOTORES MOLECULARES

el comportamiento más complejo de una enzima individual es el de un motor molecular. esta es una enzima o proteína capaz de transformar la energía química en movimiento físico –por ejem-plo, las proteínas de los músculos– o de usar movimiento físico para generar energía química.

esta última estrategia emplea células para la síntesis del com-bustible celular esencial, el atP (adenosín trifosfato), y ocurre en las membranas de la mitocondria con la ayuda de un motor mo-lecular, la enzima atP-sintasa, la cual está encargada de reciclar aDP, y un grupo fosfato:

energía + ADP + Pi → ATP

esta enzima se compone de un motor molecular llamado f0 que

está anclado a la membrana mitocondrial y una cabeza móvil llamada f

1.

ADP + P

F1

Fo

H+

H+

Rotor

ATP

fuente: http://www.depts.ttu.edu/chemistry/faculty/weber/.

el motor f0 está impulsado por un gradiente de protones (H+) y

rota la cabeza móvil f1 en sentido horario. esta cabeza es una

proteína hexámerica compuesta de tres unidades α construc-toras y tres unidades β catalíticas. las tres subunidades β pre-sentan una conformación diferente. una adopta la conformación l (loose o semiabierta), otra la conformación t (tight o tensa) y la tercera la conformación o (open o abierta).

la cabeza exhibe un mecanismo alostérico: las conformaciones de las tres subunidades cambian con una rotación de 120° del rotor f0. una rotación completa de 360° de la cabeza provoca que cada subunidad β se cicle a través de sus tres conforma-ciones posibles:

L → T → O

la síntesis de atP se inicia en el estado l con la unión de aDP y P

i. una rotación de 120°C cambia la conformación a t, que

tapa el sitio activo y cataliza la formación del atP. la siguiente rotación de 120° cambia la conformación a o, la cual abre nue-vamente el sitio activo y deja libre el atP. la siguiente rotación vuelve nuevamente al estado l, iniciando la siguiente ronda de síntesis. Por lo tanto, una rotación completa de la cabeza pro-voca la sintesís y liberación de tres moléculas de atP. Conocido como binding change mechanism9, este mecanismo impulsado por un rotor mecánico permite una producción continua de atP.

naturalmente existen sistemas celulares aun más complejos que los motores moleculares, pero en estos la naturaleza em-pieza a juntar sistemas individuales en la construcción de una “biofábrica”. •

REFERENCIAS

[1] erisman Jw, sutton ma, galloway J, Klimont z, winiwarter w.

How a century of ammonia synthesis changed the world. na-

ture geoscience 2008; 1: 636-639.

[2] ritter, s. K. Calling all chemists. Chemical & engineering news

2008; 86(33): 59-68.

[3] gao J, ma s, major Dt, nam K, Pu J, truhlar Dg. mechanism

and free energies of enzymatic reactions. Chemical reviews

2006; 106: 3188-3209.

[4] schmidt m, zahn s, Carella m, schmidt a, Öhlenschläger o,

görlach m, Kothe e, weston J. solution structure of a functio-

nal biomimetic and mechanistic implications for nickel supe-

roxide dismutases. ChemBioChem 2008; 9(13): 2135-2146.

[5] monod J, wyman J, Changeux JP. on the nature of allosteric

transitions: a plausible model. Journal of molecular Biology

1965; 12(1): 88-118.

9 el estadounidense Paul D. Boyer y el inglese John e. walker fueron galardonados en 1997 con el Premio nobel de química por “el descubrimiento de la síntesis de la molécula de al adenosina trifosfato”.

superoxide dismutase -...

Documents