SUHTEELLISEN ILMANKOSTEUDEN JA KASVUALUSTAN

TYPPIPITOISUUDEN VAIKUTUKSET RAUDUSKOIVUN

(Betula pendula Roth) LEHTIEN METABOLIITTEIHIN

VIRVE VILKMAN

Pro Gradu -tutkielma

Itä-Suomen yliopisto

Ympäristö- ja biotieteiden laitos

Biologia

2017

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO

Ympäristö- ja biotieteiden laitos, Biologia

VILKMAN, VIRVE: Suhteellisen ilmankosteuden ja kasvualustan typpipitoisuuden

vaikutukset rauduskoivun (Betula pendula Roth) lehtien

metaboliitteihin.

Pro Gradu -tutkielma (40 op), 47 s., 1 liite

Joulukuu 2017

___________________________________________________________________________

TIIVISTELMÄ

Useat ilmastonmuutosmallit ennustavat Pohjois-Euroopan vuotuisen sademäärän kasvavan,

sadepäivien ja pilvisyyden lisääntyvän sekä keskilämpötilan nousevan tämän vuosisadan

aikana, mikä johtaisi suhteellisen ilmankosteuden lisääntymiseen. Korkeassa suhteellisessa

ilmankosteudessa kasvin lehdissä tapahtuva haihdunta sekä veden sisäänotto juuristossa vähe-

nevät, jolloin myös ravinteiden imeytyminen maaperästä ja kuljetus kasvissa heikentyy. Tällöin

kasvin tarvitsee tehdä merkittäviä muutoksia aineenvaihdunnassaan ja kasvustrategioissaan,

jotta se sopeutuisi ja menestyisi muuttuvassa ilmastossa. Primaarimetaboliitit, kuten sokerit,

sokerialkoholit, orgaaniset hapot ja aminohapot, ovat välttämättömiä kasvin kasvulle ja kehi-

tykselle, sillä ne osallistuvat keskeisiin metaboliaprosesseihin, kuten glykolyysiin ja sitruuna-

happokiertoon. Primaarimetaboliitit toimivat myös esiasteina useille sekundaariyhdisteille,

kuten fenoleille ja terpenoideille, joilla on tärkeitä tehtäviä muun muassa kasvin puolustus-

mekanismeissa.

Tämän pro gradu -tutkielman tavoitteena oli selvittää, mitä metaboliitteja kammiokokeessa

kasvatettujen rauduskoivujen (Betula pendula Roth) lehdet ovat tuottaneet, sekä kuinka

suhteellisen ilmankosteuden ja kasvualustan typpipitoisuuden kaksi eri tasoa vaikuttivat näiden

metaboliittien pitoisuuksiin. Lehtinäytteet uutettiin ja derivatisoitiin analysoitaviksi kaasu-

kromatografi-massaspektrometrilla (GC-MS). Analyysituloksia ja kammiokokeen raudus-

koivujen kasvuaineistoa tarkasteltiin tilastollisilla menetelmillä. Metaboliitti- ja kasvuaineiston

välistä lineaarista riippuvuutta tarkasteltiin parametrisella Pearson-korrelaatiolla.

Kohotettu suhteellinen ilmankosteus vaikutti voimakkaasti rauduskoivun lehden metaboli-

aan. Useimpien primaarimetaboliittien tuotanto aleni kohotetussa suhteellisessa ilmankosteu-

dessa kasvatettujen rauduskoivujen lehdissä, ainoastaan raffinoosin pitoisuus nousi. Sekundaa-

rimetaboliiteista kversetiinin ja flavonoliglykosidin pitoisuudet nousivat ja salidrosidin

pitoisuus aleni kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvatettujen rauduskoivujen

lehdissä. Kohotettu suhteellinen ilmankosteus vaikutti koivuntaimen kasvuun lisäämällä

suhteellista pituus- ja paksuuskasvua sekä alentamalla lehden typpipitoisuutta ja klorofylli-

indeksiä. Kasvatus kasvualustan kohotetussa typpipitoisuudessa nosti malaatin ja sukkinihapon

sekä alensi 3-trans-kumaryyli-kiinihapon pitoisuuksia rauduskoivun lehdissä. Kasvualustan

typpipitoisuudella ei havaittu vaikutusta koivuntaimen kasvuun eikä lehtien ominaisuuksiin.

Kammiokokeen lyhyt kesto sekä istutusaineksen typen lähtötaso ovat voineet vaikuttaa siihen,

ettei kasvualustan typpipitoisuuden vaikutusta lehtien metaboliaan tai koivuntaimen kasvuun

juuri havaittu. Suhteellisen ilmankosteuden ja kasvualustan typpipitoisuuden yhdysvaikutusta

ei havaittu metaboliitti- eikä kasvuaineistossa. Tutkimus osoittaa suhteellisen ilmankosteuden

olevan hyvin tärkeä tekijä, joka vaikuttaa hiilen ja typen sitomiseen sekä niiden ohjaamiseen

eri metaboliareiteille kasveissa.

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND

Department of Environmental and Biological Sciences, Biology

VILKMAN, VIRVE: The effects of relative humidity and soil nitrogen level on

metabolites of silver birch (Betula pendula Roth) leaves.

MSc. Thesis (40 ECTS), 47 pp., 1 appendice

December 2017

___________________________________________________________________________

ABSTRACT

Several climate change scenarios predict significant increases in annual precipitation, number

of rainy days, cloudiness and average temperatures in Northern Europe during this century,

which in total would lead to elevated relative humidity. This will cause transpiration rate of

leaves and uptake of water in the roots to decline, thus decreasing absorption of mineral

nutrients from the soil and transportation within the plant. Significant alterations will be needed

in plant metabolism and growth strategies in order to acclimate successfully to changing

climate. Primary metabolites, such as carbohydrates, sugar alcohols, organic acids and amino

acids, are necessary for plant growth and development due to their involvement in pivotal

metabolic processes, such as glycolysis and TCA cycle. Primary metabolites also serve as pre-

cursors to secondary compounds, such as phenolics and terpenoids, which have important roles

in plant defence.

Aim of this MSc Thesis was to study which metabolites are produced in the leaves of silver

birches (Betula pendula Roth) grown in a chamber experiment under two different levels of

relative humidity and soil nitrogen level, and how these treatments affect the concentrations of

the metabolites. Leaf samples were extracted, derivatized and analyzed with a gas chromato-

graph coupled with mass spectrometer (GC-MS). Statistical analysis of the metabolite data and

growth parameter data was performed. Parametric Pearson-correlation tests were conducted to

explore linear correlation between metabolite and growth parameter data.

Elevated relative humidity had remarkable impacts on the metabolism of silver birch leaves.

Concentrations of most primary metabolites decreased, only raffinose content of leaves

increased. The concentrations of secondary metabolites quercetin and flavonol glycoside

increased, and salidroside decreased. Relative height and diameter growth of silver birches

increased, and nitrogen content and chlorophyll index of leaves decreased under elevated rela-

tive humidity. Elevated soil nitrogen level affected leaf metabolism by increasing the

concentrations of malic acid and succinic acid, and by decreasing the concentration of 3-trans-

coumaroyl-quinic acid. Elevated soil nitrogen level had no significant effect on growth para-

meters. It is possible, that the short duration of the chamber experiment and the nitrogen content

of the planting material have diminished the effects of elevated soil nitrogen level on leaf

metabolism and on growth parameters. There was no interaction found between relative

humidity and soil nitrogen level towards metabolites or growth parameters. This study shows

that relative humidity strongly affects accumulation of carbon and nitrogen and their allocation

towards different metabolic routes in plants.

SISÄLLYSLUETTELO

1 JOHDANTO ....................................................................................................................... 2

2 KASVISOLUN AINEENVAIHDUNTA ........................................................................... 3

2.1 Primaarimetabolia ........................................................................................................ 3

2.2 Typen sidonta orgaanisiin molekyyleihin.................................................................... 4

2.3 Sekundaarimetaboliitit ................................................................................................. 5

3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET JA TUTKIMUSKYSYMYKSET ................................ 5

4 AINEISTO JA MENETELMÄT ........................................................................................ 6

4.1 Näytemateriaalin tuottaminen kammiokokeessa ......................................................... 6

4.2 Metaboliatutkimus ....................................................................................................... 8

4.2.1 Homogenisointi .................................................................................................. 8

4.2.2 Uutto ................................................................................................................... 9

4.2.3 Derivatisointi .................................................................................................... 12

4.2.4 Kaasukromatografis-massaspektrometrinen analysointi .................................. 13

4.2.5 Yhdisteiden identifiointi ja kvantifiointi .......................................................... 14

4.2.6 Tilastollinen analyysi ....................................................................................... 15

5 TULOKSET ...................................................................................................................... 18

5.1 Näytteiden sijoittuminen pääkomponenttianalyysissa............................................... 18

5.2 Kohotetun suhteellisen ilmankosteuden vaikutus metaboliitteihin ........................... 19

5.3 Kasvualustan kohotetun typpipitoisuuden vaikutus metaboliitteihin ........................ 20

5.4 Koivun kasvu kammiokokeessa ................................................................................ 30

5.5 Rauduskoivun taimien kasvu- ja lehtien ominaisuuksien sekä lehtinäytteistä

määritettyjen metaboliittipitoisuuksien välinen Pearson-korrelaatio.…………....…… 32

6 TULOSTEN TARKASTELU ........................................................................................... 34

6.1 Kohotetun suhteellisen ilmankosteuden vaikutus metaboliitteihin ........................... 36

6.2 Kasvualustan kohotetun typpipitoisuuden vaikutus metaboliitteihin ........................ 38

6.3 Rauduskoivun kasvu kammiokokeessa ..................................................................... 38

6.4 Korrelaatio ................................................................................................................. 39

6.5 Kammiokoetulosten vertailu kenttäkokeen tuloksiin ................................................ 40

7 JOHTOPÄÄTÖKSET ....................................................................................................... 41

8 KIITOKSET ...................................................................................................................... 43

KIRJALLISUUSLUETTELO .................................................................................................. 43

LIITTEET ................................................................................................................................. 47

2

Ilmastonmuutoksen vaikutusten arviointiin, määrittelyyn ja ennustamiseen käytetään useita eri

skenaariomalleja, jotka perustuvat mitattuihin päästömääriin, vuosikymmenien sääseurantaan

ja tähän mennessä havaittuihin muutoksiin ilmakehässä (Stocker ym. 2013, Jaagus & Mändla

2014). Esimerkiksi tarkasteltuna 1950-luvulta 2010-luvulle on ilmakehän ja meriveden lämpö-

tila kohonnut, lumen ja jään määrä vähentynyt sekä merenpinta noussut (Stocker ym. 2013).

Hiilidioksidin, metaanin ja typen oksidien pitoisuudet ilmakehässä ovat korkeampia kuin

koskaan ennen. Äärisääilmiöt, kuten äärimmäinen kylmyys ja kuumuus sekä paikalliset rankka-

sateet, ovat yleistyneet. Myös paikalliset tuulituhot ovat lisääntyneet.

Ilmastonmuutoksen ennustetut vaikutukset vaihtelevat käytetystä ilmastonmuutosmallista ja

arvioidusta kasvihuonekaasujen tasosta riippuen (Stocker ym. 2013). Vuotuisen keskisade-

määrän on ennustettu kasvavan Pohjois-Euroopassa 5-30 %, sadepäivien ja pilvisyyden lisään-

tyvän sekä vuotuisen keskilämpötilan nousevan 2-4 °C nykytasosta vuoteen 2100 mennessä

(Kont ym. 2003). Talvisateiden määrän on ennustettu samalla aikavälillä kasvavan 20-50 %.

Kesäsateiden määrän muutoksen on ennustettu vaihtelevan -10 % ja + 20 % välillä (Kont ym.

2003, Jaagus & Mändla 2014). Talvikuukausien keskilämpötilojen on ennustettu nousevan 4-7

°C ja kesäkuukausien keskilämpötilojen nousevan 1-2 °C nykytasosta (Jylhä ym. 2004). Lämpi-

mämpi ilma voi lisätä haihduntaa ja pidättää enemmän vesihöyryä, jolloin suhteellisen ilman-

kosteuden (relative humidity, RH) voidaan odottaa kohoavan edellä mainittujen tekijöiden

yhteisvaikutuksesta. Suhteellinen ilmankosteus tarkoittaa prosenttilukua, joka ilmaisee, kuinka

paljon ilmassa on vesihöyryä suhteessa siihen, mitä se voi kyseisessä lämpötilassa enimmillään

sisältää (Ilmatieteenlaitos 2017). Jos ilmastonmuutokseen liittyy lämpenemisen ja ilman hiili-

dioksidipitoisuuden kohoamisen ohella myös suhteellisen ilmankosteuden nousu, voivat

kasvien reaktiot ilmastonmuutokseen erota siitä, mitä olisi odotettavissa pelkästään ilmaston

lämpenemisen ja hiilidioksidipitoisuuden nousun perusteella. Tätä taustaa vasten on tärkeää

selvittää mahdollisimman monipuolisesti, kuinka kasvien aineenvaihdunta reagoi muuttuvaan

ilmastoon.

Suhteellinen ilmankosteus voi vaikuttaa merkittävästi lehtipuiden aineenvaihduntaan ja

kasvuun, sillä korkeassa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvin ylemmissä osissa tapahtuva

haihdunta, nestevirtaus kasvissa ja niiden myötä juuriston veden ja ravinteiden otto vähenevät

(Tullus ym. 2012, Sellin ym. 2013, Rosenvald ym. 2014, Sellin ym. 2015, Lihavainen ym.

2016a,b). Toisaalta korkea suhteellinen ilmankosteus voi lisätä kasvin lehden ilmarakojen auki-

oloa ja sen myötä edistää hiilidioksidin sitomista ilmasta (Gislerød & Nelson 1989, Fordham

1 JOHDANTO

3

ym. 2001, Lihavainen ym. 2016a). Kasvualustan korkea ravinnepitoisuus voi vaikuttaa siihen,

kuinka voimakkaasti korkeammasta suhteellisesta ilmankosteudesta aiheutuva heikentynyt

ravinteiden otto hidastuu (Lihavainen ym. 2016a). Muutokset kasvuolosuhteissa, erityisesti

kasvualustan ravinnepitoisuudessa (Keinänen ym. 1999, Keski-Saari & Julkunen-Tiitto 2003,

Lihavainen ym. 2016a,b), ilmakehän kaasukoostumuksessa ja suhteellisessa ilmankosteudessa

(Lihavainen ym. 2016a,b), vaikuttavat voimakkaasti kasvien primaari- ja sekundaarimetabo-

liaan (Geiger ym. 1999, Scheible ym. 2004, Lihavainen ym. 2016a,b). Primaarimetaboliassa

tuotetaan kasville välttämättömiä hiilihydraatteja muun muassa tukemaan kasvin kasvua ja

kehitystä sekä solurakenteen ylläpitoa. Sekundaarimetaboliassa tuotetut yhdisteet osallistuvat

viestinvälitykseen kasvin ja ympäristön välillä, toimien esimerkiksi kasvin puolustusyhdisteinä

(Kutchan ym. 2015).

Koivut (Betula L.), erityisesti rauduskoivu (Betula pendula Roth), ovat valoisalla paikalla

viihtyviä nopeakasvuisia pioneeripuita (Hynynen ym. 2010), jotka valtaavat avohakkuualueet

ja kesannolle jätetyt pellot ja niityt muutamassa vuodessa (Viherä-Aarnio 2008). Rauduskoivu

ja hieskoivu (Betula pubescens Ehrh.) ovat Pohjois-Euroopan yleisimpiä ja kaupallisesti

merkittävimpiä lehtipuita, kattaen Suomessa noin 15 % metsäalasta (Hynynen ym. 2010).

Nopeakasvuisina puina koivut ovat otollisia tutkimuskohteita ulkoisten stressitekijöiden

muutoksen vaikutusten selvittämiseen, sillä selviytyäkseen mahdollisimman vähin vaurioin

koivujen on sopeuduttava muuttuvaan ympäristöön nopeasti.

Pro gradu -tutkielmani tarkoituksena oli selvittää mitä primaari- ja sekundaarimetaboliitteja

kammiokokeessa kasvatetut rauduskoivun lehdet ovat tuottaneet, sekä kuinka suhteellinen

ilmankosteus (RH) ja kasvualustan typpipitoisuus (N) vaikuttavat näiden metaboliittien

pitoisuuksiin ja rauduskoivujen kasvuun.

2.1 Primaarimetabolia

Kasvien aineenvaihdunnassaan tuottamat yhdisteet eli metaboliitit voidaan jaotella primaari- ja

sekundaarimetaboliitteihin (mm. Taiz & Zeiger 2012, Buchanan ym. 2015). Primaarimetabo-

liitit, kuten hiilipohjaiset sokerit, sokerialkoholit ja orgaaniset hapot sekä typpeä sisältävät

aminohapot, osallistuvat keskeisiin metaboliaprosesseihin ja ovat siten välttämättömiä kasvin

kasvulle ja kehitykselle. Primaarimetaboliittien tuotantoon tarvitaan hapen ja vedyn lisäksi

hiiltä, joka sidotaan ilmakehän hiilidioksidista. Lehden alapinnan ilmarakojen kautta lehden

2 KASVISOLUN AINEENVAIHDUNTA

4

soluvälitilaan otetun ilmakehän hiilidioksidin sitominen hiiliyhdisteisiin käynnistyy viherhiuk-

kasen Calvin-Benson syklissä (Taiz & Zeiger 2012). Fotosynteesin monivaiheisessa

reaktioketjussa tuotetaan hiilirunkoja muun muassa glykolyysiin ja sitruunahappokiertoon

(kuva 1). Näiden reaktioketjujen välituotteet osallistuvat lukuisiin prosesseihin, esimerkiksi

amino- ja rasvahapposynteesiin, pigmentti- ja hormonisynteesiin sekä typen sidontaan. Esimer-

kiksi sikimihaposta syntetisoitavat aromaattiset aminohapot (fenyylialaniini, tryptofaani ja

tyrosiini) (kuva 1, Maeda & Dudareva 2012) toimivat esiasteina lukuisille sekundaarimetabo-

liiteille, kuten flavonoideille.

Kuva 1. Yksinkertaistettu malli primaarimetaboliasta: Glykolyysi, sitruunahappokierto ja aminohappo-

jen tuotanto. (Sweetlove & Fernie 2013, Lihavainen ym. 2016a,b mukaillen).

2.2 Typen sidonta orgaanisiin molekyyleihin

Typpi on kasveille välttämätön alkuaine, jota tarvitaan muiden muassa amino- ja nukleiini-

happojen, proteiinien, klorofyllin, soluseinän komponenttien sekä hormonien ja vitamiinien

5

tuotannossa (Krapp 2015). Kasvit saavat typpeä pääasiallisesti nitraatteina (NO3-) ja ammo-

niumioneina (NH4+) juuriston kautta maaperästä muun muassa orgaanisesta maannoksesta,

symbionttisilta typensitojamikrobeilta ja lannoitteesta, sekä vähäisessä määrin typenoksideina

ilmakehästä lehtien ilmarakojen kautta (Taiz & Zeiger 2012). Maaperän typpi siirretään juuris-

ton kautta nilakuljetuksella lehden fotosynteettisiin mesofyllisoluihin, joissa kasvin tarvitsemat

typpiyhdisteet muodostetaan (Taiz & Zeiger 2012, Krapp 2015).

2.3 Sekundaarimetabolia

Sekundaarimetaboliitit ovat orgaanisia yhdisteitä, jotka osallistuvat kasvin ja sen ympäristön

väliseen kommunikointiin (Kutchan ym. 2015) toimien esimerkiksi kasvin väri-, tuoksu-,

houkutin-, puolustus- ja suoja-aineina. Kasveilla on lajityypillisiä sekundaariyhdisteitä eriä-

vissä määrin usein varsin huomattavinakin pitoisuuksina, ja niiden merkitystä kasveille on

pyritty useissa tutkimuksissa selvittämään (mm. Bi & Felton 1995, Lavola ym. 1998, Keinänen

ym. 1999, Lavola ym. 2000, de la Rosa ym. 2001, Keski-Saari ym. 2005, Akula & Ravishankar

2011, Schreiner ym. 2012). Sekundaariyhdisteitä esiintyy myös stressittömässä tilassa perusva-

rantona (Keski-Saari & Julkunen-Tiitto 2003), mutta erityisesti kasvin puolustukseen liittyvien

sekundaariyhdisteiden tuotanto lisääntyy vasteena ulkoisiin stressitekijöihin, kuten ympäristön

muutokseen tai herbivoriaan (mm. Bi & Felton 1995, Akula & Ravishankar 2011). Sekundaa-

riyhdisteiden on esitetty toimivan kasveissa myös oksidaatio- ja UV-vaurioiden estäjinä (mm.

Bi & Felton 1995, Lavola 1998, Lavola ym. 2000, Mewis ym. 2012, Schreiner ym. 2012,

Kurepa ym. 2016).

Sekundaarimetaboliitit luokitellaan typpipohjaisiin, kuten alkaloidit, ja hiilipohjaisiin, kuten

muun muassa fenoliset yhdisteet ja terpenoidit (Kutchan ym. 2015). Rauduskoivun (Betula

pendula Roth) sekundaariyhdisteet ovat hiilipohjaisia ja niiden pitoisuudet voivat olla merkit-

täviä (Keinänen ym. 1999). Koivunlehtien sekundaariyhdisteiden tiedetään vaikuttavan

esimerkiksi niiden kelpaavuuteen ja soveltuvuuteen herbivorien ravinnoksi (Hartley & Firn

1989, Martemyanov ym. 2015).

Tämän pro gradu -tutkielman tavoitteena on tuottaa uutta tietoa rauduskoivun (Betula pendula

Roth) sopeutumisesta ilmastonmuutokseen liittyvän suhteellisen ilmankosteuden kasvuun. Pro

gradu -tutkimus on osa Kasvien ekofysiologian tutkimusryhmän tutkimusprojektia ”Koivun ja

3 TUTKIELMAN TAVOITTEET JA TUTKIMUSKYSYMYKSET

6

haavan molekulaariset vasteet muuttuvalle ilmankosteudelle”, ja siitä saatuja tuloksia hyödyn-

nettiin osana FT Jenna Lihavaisen väitöstutkimusta (Lihavainen ym. 2016a).

Pro gradu -tutkimuksen tavoitteena oli kaasukromatografis-massaspektrometrisin (GC-MS)

menetelmin selvittää, mitä primaari- ja sekundaarimetaboliitteja kammiokokeen aikana kasva-

neet rauduskoivun lehdet ovat tuottaneet. Lisäksi saatiin tarkasteltavaksi kammiokokeen

rauduskoivuista mitattu kasvuparametriaineisto (Lihavainen ym. 2016a). Pro gradu -tutkiel-

massani tarkastelen vaikuttaako suhteellinen ilmankosteus ja kasvualustan typpipitoisuus

tutkittujen metaboliittien pitoisuuksiin ja kasvuparametreihin. Tilastollisin menetelmin analy-

soidaan käsittelyjen pää- ja yhdysvaikutuksia rauduskoivun lehtien metaboliaan sekä

kasvuparametreihin. Lisäksi tarkastellaan, löytyykö metaboliittien pitoisuuksien ja kasvupara-

metrien välisiä lineaarisia riippuvuuksia.

Tutkimuskysymykset:

Kuinka kohotettu suhteellinen ilmankosteus vaikuttaa rauduskoivun lehtien primaari- ja

sekundaarimetaboliaan?

Kuinka kasvualustan kohotettu typpipitoisuus vaikuttaa rauduskoivun lehtien primaari-

ja sekundaarimetaboliaan?

Onko suhteellisella ilmankosteudella ja kasvualustan typpipitoisuudella yhdysvaiku-

tusta rauduskoivun lehtien primaari- ja sekundaarimetaboliaan?

Kuinka kohotettu suhteellinen ilmankosteus ja kasvualustan kohotettu typpipitoisuus

vaikuttavat koivuntaimien kasvuun kammiokokeen aikana?

Havaitaanko koivuntaimista määritettyjen kasvuparametrien ja koivunlehtien metabo-

liittipitoisuuksien muutosten välillä korrelaatiota?

4.1 Näytemateriaalin tuottaminen kammiokokeessa

Pro gradu -tutkimuksessa käytetty lehtinäytemateriaali oli peräisin heinä-elokuussa 2012 suori-

tetusta kammiokokeesta (Lihavainen ym. 2016a), johon en ole itse osallistunut. Kammiokoetta

varten mikrolisäyksellä tuotettuja Vehmersalmi 14 -genotyyppiä edustavia rauduskoivun

(Betula pendula Roth) taimia oli istutettu lannoitettuun turve-vermikuliitti -seokseen (1:1 v/v)

1,6 litran muoviruukkuihin. Kasvihuoneolosuhteissa kuuden kuukauden ikäisiksi kasvaneet

taimet siirrettiin ruukuissaan kasvihuoneelta kasvukammioon. Kammiokoe kesti 30 päivää,

4 AINEISTO JA MENETELMÄT

7

joista neljä päivää kului akklimaatioon eli kasvien totuttamiseen uusiin olosuhteisiin siirrettä-

essä ne kasvihuoneelta kasvukammioihin, ja 26 päivää varsinaiseen kokeeseen (Lihavainen ym.

2016a). Ennen koekäsittelyjen aloittamista taimista mitattiin rungon alkupituus ja alkupaksuus.

Kammiokokeessa 80 taimea oli jaettu neljään kammioon (20 taimea/kammio), joista kahteen

kammioon asetettiin suhteelliseksi ilmankosteudeksi 60 % ja toiseen kahteen kammioon

suhteellinen ilmankosteus 95 %. Tässä pro gradu -tutkielmassa käytän suhteellisen ilmankos-

teuden prosenttilukuja (lyhenteinä RH60 ja RH95) merkitsemään käsittelyjen eri ilmankos-

teustasoja. Kokeen aikana taimien paikkaa kammion sisällä vaihdettiin viikoittain, sekä yhden

kerran rinnakkaisesta kammiosta toiseen, jotta vältyttäisiin paikka- ja kammiovaikutukselta

(Lihavainen ym. 2016a).

Jokaisessa kammiossa olleista 20 koivuntaimesta kymmenelle taimelle annettiin viikoittain

peruslannoitetta [0,2 % Superex-9 -ravinneliuos (19:5:20 N:P:K sisältäen mikroravinteet,

Kekkilä, Suomi)] (typen saanto 15 mg typpeä/viikko) ja kymmenelle taimelle peruslannoitteen

lisäksi typpilisä (typen saanto 15+15 mg typpeä/viikko) 0,08 % ammoniumnitraattiliuoksena

(NH4NO3, JT Baker) (Lihavainen ym. 2016a). Lannoitustasot vastasivat vuotuista typpisaantoa

35 kg N/ha peruslannoituksella (40 taimea), mikä edustaa typen optimitasoa, ja 70 kg N/ha

typpilisällä (40 taimea), mikä edustaa typen ylimäärää. Tässä pro gradu -tutkielmassa käytän

vuotuisen typpisaannon lukuarvoja (lyhenteinä N35 ja N70) merkitsemään käsittelyjen eri

typpitasoja. Kokeen aikana annettu kokonaistyppimäärä per taimi oli 112 mg peruslannoituk-

sella ja 172 mg kasvualustan kohotetussa typpipitoisuudessa (Lihavainen ym. 2016a).

Kammioiden lämpötila (23 °C valossa/16 °C pimeässä) ja valojakson pituus (22 h valoa/2 h

pimeyttä) asetettiin vastaamaan koivuntaimien esikasvatuksessa käytettyjä kasvihuoneolo-

suhteita sekä vuodenajan mukaisia keskiarvoja (Lihavainen ym. 2016a). Valon maksimi-inten-

siteettinä käytettiin 450 µmol/m2/s, jolloin kaikki lamput olivat päällä. Tunti ennen ja jälkeen

pimeyttä puolet lampuista oli sammutettuina.

Kammiokokeen päätteeksi taimista mitattiin loppupituus ja loppupaksuus (Lihavainen ym.

2016a). Suhteellinen pituus- ja paksuuskasvu saatiin jakamalla loppuarvo ennen koetta mita-

tulla alkuarvolla (suhdeluku = loppuarvo

alkuarvo). Lehden typpipitoisuus (mg/g kuivapainoa kohti)

määritettiin Kjeldahlin menetelmällä (Lihavainen ym. 2016a). Lehden klorofylli-indeksi (CCI)

määritettiin kahden aallonpituuden (653 nm ja 931 nm) funktiona (Richardson ym. 2002): CCI

= transmittanssi 931 nm:ssa

transmittanssi 653 nm:ssa, mitä varten näiden aallonpituuksien optista absorbanssia mitattiin

kammiokokeen aikana kasvaneista lehdistä (jokaisen taimen viides lehti taimen kärjestä lukien)

CCM200 -klorofyllimetrillä (Opti-Sciences, Hudson, Yhdysvallat) (Lihavainen ym. 2016a).

8

Lehden pinta-ala (cm2) määritettiin yhdestä kokeen aikana kasvaneesta lehdestä per taimi

LAMINA -ohjelmistolla (Bylesjö ym. 2008) (Lihavainen ym. 2016a). Lehden vesipitoisuuden

määrittämiseksi taimista kerättiin yksi lehti, lehtien tuorepaino punnittiin ja lehdet kuivattiin 2

vuorokautta 50 °C:ssa, minkä jälkeen punnittiin lehtien kuivapaino (Lihavainen ym. 2016a).

Lehden vesipitoisuus (%-osuus tuorepainosta) laskettiin jakamalla lehtien tuorepainon (FW) ja

kuivapainon (DW) erotus tuorepainolla: FW−DW

FW ja kertomalla saatu lukuarvo 100 %:lla.

Metaboliatutkimusta varten kerättiin latvasta luettuna neljäs, viides ja kuudes lehti, joista

leikattiin halkaisijaltaan yhden senttimetrin (Ø 1 cm) kokoisia kiekkoja á 3 kpl/Eppendorf -

putki (Lihavainen ym. 2016a). Lehtikiekot laitettiin numeroimalla yksilöityihin, tyhjänä punnit-

tuihin putkiin. Kasvimateriaalia sisältävät näyteputket jäädytettiin nopeasti nestetypessä ja

säilytettiin jatkotutkimuksia varten -70 °C pakastimessa.

4.2 Metaboliatutkimus

Pro gradu -tutkimus suoritettiin Itä-Suomen yliopistossa Biologian laitoksella Metabolomiikka-

laboratoriossa kesä-heinäkuussa 2014. Metaboliatutkimuksiin varatut lehtikiekkoja sisältävät

näyteputket punnittiin jäisinä ennen tutkimuksen aloittamista, jolloin saatiin laskettua näyttei-

den tuorepaino. Näytteille tehtyjä työvaiheita olivat homogenisointi, uutto, derivatisointi ja

kaasukromatografis-massaspektrometrinen (GC-MS) analyysi. Uutettuja näytteitä valmistettiin

kaksi rinnakkaista sarjaa sekä erilliset varanäytteet. Näyteputket pidettiin homogenisoinnin ajan

nestetypessä ja uuton ajan jäähauteella kasvimateriaalin sulamisen estämiseksi ja esimerkiksi

entsymaattisten ja muiden ei-toivottujen kemiallisten reaktioiden välttämiseksi.

4.2.1 Homogenisointi

Syväjäädytettynä säilytetty kasvimateriaali homogenisoitiin Qiagen -kuulamyllyssä (Qiagen

TissueLyser, Retsch®) ravistellen (kuva 2a). Jokaiseen näyteputkeen lisättiin Qiagen -kuula-

pyssyllä Ø 5 mm metallikuula helpottamaan kasvimateriaalin murskaantumista (kuva 2b).

Näyteputkia ravisteltiin 3 kertaa 15 s ravistelunopeudella 15 ×/s, jäädyttäen putket ravistelujen

välillä nestetypessä. Viimeisen ravistelukerran jälkeen putkien annettiin olla nestetypessä niin

kauan, kunnes ensimmäinen uuttoliuos lisättiin näyteputkiin, jottei kasvimateriaali pääsisi sula-

maan.

9

Kuva 2. a) Homogenisointi Qiagen -kuulamyllyssä. b) Metallikuula näyteputken kannessa.

4.2.2 Uutto

Homogenisoitu kasvimateriaali uutettiin kahdesti, ensin 100 % metanolissa ja sitten 80 % meta-

nolissa. Uuton tarkoituksena oli saada metanoliin liukenevat sokeriyhdisteet ja veteen liuke-

nevat aminohapot erilleen homogenisoidusta kasvimateriaalista. Uuttovaiheessa näytteisiin

lisättiin myös sisäistä standardia, joka on seos yhdisteitä joita näyte ei luontaisesti sisällä ja

joiden kemialliset ominaisuudet ovat samanlaisia tunnistettavien yhdisteiden kanssa (Hill &

Roessner 2013). Sisäisellä standardilla normalisoidaan uutosta tuleva yhdisteiden pitoisuuksien

lievä vaihtelu (Fiehn ym. 2000), jolloin saadaan keskenään vertailukelpoisia tuloksia eli pysty-

tään havaitsemaan kammiokokeen ilmankosteus- ja typpikäsittelyjen vaikutukset rauduskoivun

lehtien metaboliittipitoisuuksien muutoksiin.

Sisäisenä standardina käytettiin yhdisteseosta, joka sisälsi tilavuussuhteessa 4:2:1:2 reagens-

seja bentsoehappo-d5 (1,2464 mg/ml dimetyylisulfoksidissa) (Benzoic Acid-d5, Campro

Scientific, Saksa ja Hollanti), alaniini-d4 (5,033 mg/ml 50 % metanolissa) (DL-Alanine-2,3,3,3-

d4, Isotec, Miamisburg, Yhdysvallat), glyseroli-d8 (4,900 mg/ml dimetyylisulfoksidissa)

(Glycerol-d8, Campro Scientific, Saksa ja Hollanti) sekä 4-metyyliumbelliferoni (10,32 mg/ml

100 % metanolissa) (4-methylumbelliferone, Sigma-Aldrich, Saksa ja Yhdysvallat). Reagenssit

punnittiin mikroanalyysivaa’alla ja liuotettiin sopivalla liuottimella 10 ml:n mittapulloissa.

Liuottimena käytetty dimetyylisulfoksidi oli hankittu VWR:lta (VWR International, Ranska) ja

metanoli Merck:lta (LiCrhosolv® Methanol for Liquid Chromatography, Merck, Saksa).

Uuttoliuosten valmistamiseen käytettiin suodatettua, ultrapuhdasta milliporevettä (Simplicity®

UV, Millipore, Molsheim, Ranska). Standardiseosta säilytettiin uuttopäivien välillä pakastet-

tuna -20 °C:ssa. Standardiseos sulatettiin vesihauteessa ja vorteksoitiin aina ennen käyttöä.

Homogenisoituihin näytteisiin pipetoitiin ensimmäisessä uutossa 1 ml 100 % metanolia sekä

100 µl sisäistä standardiseosta, minkä jälkeen näyteputkia vorteksoitiin. Lisäksi valmistettiin

jokaisena uuttopäivänä niin kutsuttu näyteblankki (SB), joka sisälsi vain uuttoliuokset sekä

a) b)

10

sisäisen standardin. Näin saataisiin poistettua uuttoliuosten mahdollisesti aiheuttama tausta

massaspektristä. Uuttoliuoksen ja homogenisoidun kasvimateriaalin sekoittumisen varmista-

miseksi ja uuton edistämiseksi suoritettiin Qiagen -kuulamyllyssä ravistelu 1 × 15 s ravistelu-

nopeudella 15 ×/s. Ensimmäinen uutto suoritettiin Eppendorf Thermomixer:lla (Thermomixer

comfort, Eppendorf, Saksa) 15 min 6 °C 1400 rpm (kuva 3a), minkä jälkeen näyteputket sentri-

fugoitiin ultrasentrifugilla (Jouan MR23i, Thermo Electron Corporation, Milford, Yhdysvallat)

3 min 10 °C 13 000 rpm (kuva 3b). Supernatantti (kuva 4a) pipetoitiin sakan päältä ja otettiin

talteen 2 ml:n Eppendorf -putkeen. Supernatanttiputkia säilytettiin uuttovaiheiden välissä jäillä

Eppendorf -telineessä.

Kuva 3. a) Uutto Eppendorf Thermomixer:ssä. b) Uutetut näytteet ultrasentrifugissa.

Toisen uuton tarkoituksena oli maksimoida ja varmistaa haluttavien yhdisteiden, erityisesti

vesiliukoisten aminohappojen uuttuminen homogenaatista. Ensimmäisestä uutosta jääneen

sakan päälle pipetoitiin toista uuttoa varten 1 ml 80 % metanolia. Näytteet vorteksoitiin ja ravis-

teltiin Qiagen -kuulamyllyssä 1 × 15 s ravistelunopeudella 15 ×/s. Toinen uutto suoritettiin

Eppendorf Thermomixer:llä 5 min 6 °C 1400 rpm. Uutokset ultrasentrifugoitiin kuten ensim-

mäisessä uutossa, 3 min 10 °C 13 000 rpm. Erottunut supernatantti (kuva 4b) pipetoitiin talteen

ja yhdistettiin ensimmäisestä uutosta saadun supernatantin kanssa. Yhdistetyt supernatantit

vorteksoitiin tasakoostumuksellisen liuoksen aikaansaamiseksi. Kunkin näytteen yhdistetystä

supernatantista pipetoitiin 2 × 100 µl näytteet vialeissa oleviin insertteihin (kuva 5). Viali on

kaasukromatografiassa käytettävä lasinen 2 ml:n näytepullo. Insertti on vialin sisään laitettava

200 µl:n asetin, jonne tutkittava liuos pipetoidaan. Vialit suljettiin Ø 11 mm kumitulpallisilla

alumiinikorkeilla käyttäen korkinsulkijaa, jolloin vialista tulee ilmatiivis. Varsinainen näyte-

sarja pipetoitiin ruskeisiin vialeihin ja rinnakkainen näytesarja kirkkaisiin vialeihin (kuva 5).

a) b)

11

Kuva 4. Sentrifugoitu näyte a) ensimmäisen uuton jälkeen, b) toisen uuton jälkeen.

Kuva 5. Supernatantin pipetoiminen vialissa olevaan inserttiin.

Ensimmäisenä uuttopäivänä tehtiin myös laadunvarmistusnäyte (QC), mitä varten kunkin

näytteen yhdistetystä supernatantista pipetoitiin 100 µl erilliseen 2 ml Eppendorf -näyteput-

keen. Tällöin saatiin luotua kaikkia käsittelyjä edustava 16 näytteen (4 näytettä/käsittely) super-

natanttien seos, jolla voidaan varmentaa jokaisena ajopäivänä suoritetun derivatisoinnin ja GC-

MS -analyysin laatua sekä GC-MS -analyysistä saatavien tulosten tarkkuutta ja luotettavuutta

sillä oletuksella, että QC-näytteet edustavat likimain koko näyteaineiston keskiarvoja. QC -

vialeja tehtiin yhteensä kahdeksan, jotta jokaiselle ajopäivälle riittäisi varmasti oma laadun-

varmistusnäyte.

Uutetut näytteet haihdutettiin kuiviin vakuumikonsentraattorilla 30 min 35 °C (vakuu-

misentrifugi SPD121P ja vakuumipumppu OFP400, Thermo Electron Corporation, Milford,

Yhdysvallat). Kuivatuksen jälkeen näytteet altistettiin typpikaasuvirtaukselle 1 min ajan,

jolloin typpikaasu syrjäyttää insertin ilmatilassa olevan hapen. Tällä toimenpiteellä pyrittiin

estämään uutetun näytteen reagoiminen hapen kanssa. Näytevialit korkitettiin mahdollisimman

nopeasti typpialtistuksen jälkeen, aseteltiin pakastusrasioihin ja vietiin -70 °C pakastimeen.

Supernatanteista pipetoitiin lisäksi 500 µl varanäytteet 1,5 ml:n Eppendorf -näyteputkiin.

Varanäytteet haihdutettiin kuiviin vakuumikonsentraattorilla 120 min 35 °C, altistettiin typpi-

kaasuvirtaukselle 1 min ajan ja vietiin korkit suljettuina -70 °C pakastimeen. Jäljelle jäänyt

supernatantti pakastettiin sellaisenaan muita julkaisuja varten tehtäviä tutkimuksia ajatellen.

a) b)

12

4.2.3 Derivatisointi

Uutetuille näytteille suoritettiin kaksivaiheinen derivatisointi, minkä avulla kasvimateriaalista

uuttuneet orgaaniset yhdisteet pyrittiin saamaan kaasuuntuvaan muotoon ja muokkaantumaan

metoksi- ja silyylijohdannaisiksi, jotta yhdisteet voitaisiin havaita massaspektrissä. Derivati-

soinnin tarkoituksena on lisäksi vähentää yhdisteissä esiintyvien hydroksyyli-, amino- ja

karboksyyliryhmien polaarisuutta (Hill & Roessner 2013). Derivatisointia edeltävästi huoneen-

lämmössä vialitelineellä yhden tunnin ajan sulatettuihin näytteisiin pipetoitiin 50 µl dikloori-

metaania (DCM for HPLC, Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa) eVol® XR -automaattipipetillä

(SGE Analytical Science, Australia) sulatuksen aikana insertteihin mahdollisesti kondensoitu-

neen veden poistamiseksi. Lisätty dikloorimetaani ja mahdollinen kondensaatiovesi haihdu-

tettiin kuiviin vakuumikonsentraattorissa 5 min 35 °C.

Ensimmäisessä vaiheessa derivatisointireagenssina käytettiin pyridiiniin (Sigma-Aldrich,

Steinheim, Saksa) liuotettua metoksiamiinihydrokloridia (20 mg/ml) (MAHC, Sigma-Aldrich,

Steinheim, Saksa; valmistettu Sveitsissä), jota valmistettiin tuore liuos jokaisena derivatisointi-

päivänä. MAHC:ta punnittiin analyysivaa’alla 4 ml:n ruskeaan lasipulloon 20 mg ja liuotettiin

se 1000 µl pyridiiniin. Jokaiseen näytteeseen pipetoitiin 40 µl MAHC-pyridiini -liuosta ja vialit

korkitettiin välittömästi pipetoinnin jälkeen liuoksen haihtumisen estämiseksi. Ensimmäisen

vaiheen derivatisointi suoritettiin 180 min 30 °C lämpöblokissa 170 rpm tasaisessa ravistelussa.

Toisessa vaiheessa derivatisointireagenssina käytettiin N-metyyli-N-trimetyylisilyyli-

trifluoroasetamidi + 1 % trimetyyliklorosilaania (MSTFA + 1 % TMCS, ThermoScientific,

Bellefonte, Yhdysvallat), jota pipetoitiin näytteisiin 80 µl. Samanaikaisesti derivatisointi-

reagenssin kanssa näytteisiin pipetoitiin 20 µl retentioaikastandardina käytettyä alkaanisarjaa

[saturoituja alkaaneja C7-C40 (Supelco, Bellefonte, Yhdysvallat) heksaanissa (Merck, Saksa)].

Alkaanisarjan avulla lasketaan kaikkien analysoitavien piikkien retentioindeksit, mikä on

välttämätöntä yhdisteiden tunnistamiselle. Näytteiden derivatisoinnin yhteydessä valmistettiin

samanaikaisesti niin kutsuttu reagenssiblankki (RB), joka sisälsi vain derivatisointireagenssit.

Tämän avulla poistetaan derivatisointireagenssien aiheuttama tausta GC-MS -kromatogram-

mista. Toisen vaiheen derivatisointi suoritettiin 120 min 60 °C lämpöblokissa 170 rpm tasai-

sessa ravistelussa. Derivatisoinnin jälkeen näytevialit poimittiin vialitelineelle ja aseteltiin

satunnaisessa järjestyksessä GC-MS -laitteiston (kuva 6) näyteautomaattiin.

13

4.2.4 Kaasukromatografis-massaspektrometrinen analysointi

Kaasukromatografi yhdistettynä massaspektrometriin (GC-MS) sopii laitteistona hyvin sellais-

ten metaboliittien analysoitiin, joiden molekyylipaino, poolisuus ja kiehumispiste ovat alhaiset,

ja jotka ovat herkästi haihtuvia tai derivatisoitavissa herkästi haihtuviksi (Hill & Roessner 2013,

Xue ym. 2015). Tällaisia yhdisteitä ovat erityisesti primaarimetaboliitit, kuten muun muassa

aminohapot, sokerit ja orgaaniset hapot (Hill & Roessner 2013). GC-MS on yksi eniten käyte-

tyistä analyyttisistä menetelmistä kasvimetabolomiikassa sen avulla saatavan korkean

resoluution, korkean herkkyyden (sensibility), hyvän toistettavuuden (reproducibility), standar-

dispektrikirjastojen laajuuden sekä suhteellisen alhaisten kustannusten vuoksi (Xue ym. 2015).

Derivatisoidut näytteet analysoitiin tietokoneohjatulla GC-MS -laitteistolla [(Agilent 6890N

kaasukromatografi, 5973 massaspektrometri, 7683 injektori ja näyteautomaatti (Agilent

Technologies, Palo Alto, Yhdysvallat), kuva 6]. GC-MS -laitteistoa ohjaa ChemStation -ajo-

ohjelmisto (MSD ChemStation E.02.01.1177, Agilent Technologies, Palo Alto, Yhdysvallat),

joka muun muassa säätelee GC-MS -laitteiston eri osien lämpötiloja ja kontrolloi ajoa. Kroma-

togrammeja ja piikkien massaspektrejä voidaan tarkastella ajo-ohjelmistoon liittyvällä

Enhanced Data Analysis -ohjelmalla.

Ajoparametreinä käytettiin räätälöityä metodia VIRVESplit30.M, jossa näytettä injektoitiin

1 µl split-suhteella 30:1. Tällöin injektoidusta näytteestä yksi kolmaskymmenesosa (1/30)

kulkee kantajakaasun mukana kolonnin läpi detektoitavaksi massaspektillä. Kantajakaasuna

käytettiin heliumia (H2), jonka virtaus kolonnin läpi oli 1.0 ml/min. Kolonnina oli Restek, USA

Rxi®-5Sil MS 30 m, 0.25 mmID, 0.25 µm df, jossa on 10 m Integra-esikolonni. Linerina oli

Restek Split Precision® deaktivoitu liner 4 mm x 6.3 x 78.5. Injektointilämpötilana käytettiin

260 ºC:ta. Lämpötilaohjelma oli seuraava: 1 min isoterminen 70 ºC, 6 ºC/min nosto 330 ºC:een,

jossa pito 5 min. Jäähdytys 70 ºC:een, jossa pito 3 min (postrun). 7 min tasapainotus 70 ºC:ssa

ennen seuraavaa ajoa. MSD interface (AUX) 290 ºC, MS lähde 230 ºC, MS quad 150 ºC.

Massa-alue (scanning range) m/z 55 - 550, joka 35 minuutin jälkeen nostettiin m/z 55 - 650.

Massasignaalin kerääminen aloitettiin 5,5 min viiveellä, jotta liuottimet ehtivät kulkea kolon-

nista massadetektorille ja sen ohi. Ajopäivien välissä injektointiruisku (Agilent 10 µl) pestiin

pyridiini - heksaani - metanoli - asetoni -liuotinsarjalla. Injektorilla (kuva 6c) ruiskun neulaosan

pesussa käytettiin pyridiiniä ja heksaania.

14

Kuva 6. GS-MS -analyysilaitteisto, Agilent: a) 6890N kaasukromatografi, b) 5973 massaspektrometri,

c) 7683 injektori ja d) näyteautomaatti; massaspektrometrin ionilähde (ylhäällä vasemmalla) ja kaasu-

kromatografin kolonniuuni (ylhäällä oikealla).

4.2.5 Yhdisteiden identifiointi ja kvantifiointi

GC-MS -analysoitujen näytteiden sisältämät metaboliitit tunnistettiin ja kvantifioitiin kohden-

netusti kvantifiointi-ionin, retentioindeksin (Liite 1: taulukko L1) ja massaspektrin perusteella

sekä vertaamalla yhdistespektrejä ja retentioindeksejä NIST Mass Spectral Database- (version

2.2, Agilent Technologies, National Institute of Standards and Technology, USA) ja Golm

Metabolome Database (Kopka ym. 2004, Schauer ym. 2005, Hummel ym. 2010) -tietokantoi-

hin. Metaboliittien tunnistamiseen ja piikkien pinta-alojen laskemiseen käytettiin

MetaboliteDetector 2.0 -ohjelmistoa (Hiller ym. 2009) erillisellä koivukammiokirjastolla

(Lib_chamber_birch, J. Lihavainen). Piikkejä etsittiin niiden korkeuden ja dekonvoluutiole-

veyden erilaisilla yhdistelmillä. Dekonvoluutio erottelee yksittäiset piikit tilanteessa, jossa

saman retentioajan sisällä tulee monta yhdistettä päällekkäin (Hiller ym. 2009, Chen & Dai

2015). MetaboliteDetector 2.0 -ohjelmistolla suoritetun kvantifioinnin tulokset koottiin Micro-

soft Office Excel 2013 -taulukkopohjaan (Microsoft, Seattle, Yhdysvallat). Yhdisteen

a)

b)

c)

d)

15

pitoisuuden normalisoitu arvo saatiin jakamalla yhdisteen piikin pinta-ala sisäisen standardin

piikin pinta-alalla (bentsoehappo-d5) ja näytteen tuorepainolla. Tällöin saatiin vertailukelpoisia

tuloksia eli pystyttiin havaitsemaan kammiokokeen ilmankosteus- ja typpikäsittelyjen vaiku-

tukset rauduskoivun lehtien metaboliittipitoisuuksiin. Glutamiinilla, fruktoosilla, glukoosilla ja

sedoheptuloosilla havaittiin kaksi lähekkäisillä retentioajoilla eluoituvaa saman yhdisteen

piikkiä, joten näiden metaboliittien kohdalla pitoisuusarvona käytettiin kahden kvantifioidun

piikin pinta-alojen yhteenlaskettua arvoa (Liite 1: taulukko L1). Kolme näytettä jätettiin tilas-

tollisen analyysin ulkopuolelle arvojen normalisoinnin yhteydessä havaitun sisäisen standardin

vähäisen pitoisuuden (kaksi näytettä) tai alhaisen tuorepainon (yksi näyte) vuoksi.

Tilastollisesti analysoitava aineisto koostui lehtinäytteistä (n = 41), jotka oli kerätty

alemmassa suhteellisessa ilmankosteudessa ja kasvualustan optimaalisessa typpipitoisuudessa

kasvatetuista taimista, joita käytettiin vertailukohtana muihin käsittelyihin näiden olosuhteiden

ollessa samankaltaiset kasvihuoneolosuhteiden kanssa (näytteet C = RH60 N35, n = 10), koho-

tetussa suhteellisessa ilmankosteudessa ja kasvualustan optimaalisessa typpipitoisuudessa

kasvatetuista taimista (näytteet H = RH95 N35, n = 10), alemmassa suhteellisessa ilmankosteu-

dessa ja kasvualustan kohotetussa typpipitoisuudessa kasvatetuista koivuista (näytteet N =

RH60 N70, n = 11) sekä kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa ja kasvualustan kohote-

tussa typpipitoisuudessa kasvatetuista taimista (näytteet HN = RH95 N70, n = 10). Metabo-

liittien havaintoyksiköiden lukumäärä (n) käsittelyittäin on taulukoitu tutkielman liitteeksi

(Liite 1: taulukko L1).

4.2.6 Tilastollinen analyysi

Aineiston tarkkuutta, luotettavuutta ja vertailukelpoisuutta voidaan tarkastella tilastollisin

menetelmin. Pro gradu -tutkimuksessa GC-MS:lla analysoidulle metaboliittiaineistolle suori-

tettiin pääkomponenttianalyysi (PCA) SIMCA-P+ 12.0.1 -ohjelmistolla (Umetrics, Uumaja,

Ruotsi) aineiston sisäisen vaihtelun ja hajonnan tarkastelemiseksi. SPSS 21 -ohjelmistolla (IBM

SPSS Statistics, IBM, Yhdysvallat) laskettiin metaboliitti- ja kasvuparametriaineiston muuttu-

jakohtaiset keskiarvot ja keskivirheet. Kaksisuuntaisella ANOVA -varianssianalyysillä saatiin

selville käsittelyvaikutusten merkitsevyysasteet. Näitä vaikutuksia havainnollistettiin BoxPlot

-kuvaajilla sekä suoritettiin metaboliitti- ja kasvuparametriaineiston välinen parametrinen

Pearson-korrelaatioanalyysi.

PCA on ohjaamaton (unsupervised) monimuuttujamenetelmä, jolla pelkistetään monimut-

kaisen aineiston vaihtelu muutamalle pääkomponentille sekä etsitään suurimman vaihtelun

16

sijoittumista aineistossa (Worley & Powers 2013). PCA:ta varten osalle metaboliiteista tehtiin

SIMCA-P+ -ohjelmistolla pitoisuusarvojen kymmenkantainen logaritmikorjaus (log10) jakau-

mien normalisoimiseksi. SIMCA-P+ -ohjelmisto tekee aineistolle automaattisesti UV -

skaalauksen, jossa kunkin muuttujan arvojen keskiarvo asettuu arvoon 0 (mean centering) ja

keskihajonta asettuu arvoon 1 (unit variance). PCA:n score plot havainnollistaa, kuinka eri

näytteiden välinen kokonaishajonta asettuu PCA-ordinaatioon suhteessa pääkomponentti-

akseleihin (Worley & Powers 2013). Pääkomponentit muodostetaan niin, että aineiston moni-

ulotteisuuden vähentämiseksi ohjelmisto pyrkii sisällyttämään mahdollisimman suuren

osuuden aineiston vaihtelusta ensimmäiseen pääkomponenttiin (Ranta ym. 1994, Zar 1999).

Sitä vastaan kohtisuoraan sijoittuva toinen pääkomponentti sisältää mahdollisimman suuren

osuuden aineiston jäännösvaihtelusta, jota ensimmäinen pääkomponentti ei selitä. Kaukana

origosta sijaitsevat pisteet edustavat aineiston keskiarvosta eniten poikkeavia havaintoja.

Metaboliitti- ja kasvuparametriaineistolle laskettiin SPSS 21 -ohjelmistolla käsittelykoh-

tainen näytelukumäärä (n), tutkittavien metaboliittien pitoisuuksien ja kasvuparametrien

keskiarvo (ka.) kussakin käsittelyryhmässä sekä keskiarvojen keskivirheet (SE). Suhteellisen

ilmankosteuden (RH) ja kasvualustan typpipitoisuuden (N) pää- ja yhdysvaikutuksia (RH×N)

metaboliittipitoisuuksiin ja kasvuparametreihin testattiin kaksisuuntaisella varianssianalyysillä

(ANOVA eli Univariate Analysis of Variance). ANOVA:n kiinteinä tekijöinä (fixed factor)

käytettiin suhteellisen ilmankosteuden ja kasvualustan typpipitoisuuden kahta eri tasoa (RH60

ja RH95 sekä N35 ja N70). ANOVA testaa aineistoa vertaamalla suhteellisen ilmankosteuden

tasoja toisiinsa (näytteet C ja N verrattuna näytteisiin H ja HN) ja etsii näiden kahden tason

väliltä merkitseviä eroavaisuuksia tarkasteltavissa muuttujissa, jolloin havaitaan mahdollinen

suhteellisen ilmankosteuden päävaikutus kussakin muuttujassa. Vastaavasti ANOVA testaa

aineistoa vertaamalla kasvualustan typpitasoja toisiinsa (näytteet C ja H verrattuna näytteisiin

N ja HN) ja etsii näiden kahden tason väliltä merkitseviä eroavaisuuksia tarkasteltavissa

muuttujissa, jolloin havaitaan mahdollinen kasvualustan typpipitoisuuden päävaikutus kussakin

muuttujassa. Lisäksi ANOVA testaa kiinteiden tekijöiden yhdysvaikutusta toisiinsa. Mikäli

kiinteiden tekijöiden yhdysvaikutus on merkitsevä, tällöin kohotetun suhteellisen ilmankosteu-

den vaikutus muuttujiin olisi erisuuntainen eri typpitasoilla sekä kasvualustan kohotetun typpi-

pitoisuuden vaikutus muuttujiin olisi erisuuntainen eri ilmankosteustasoilla. Mikäli kiinteiden

tekijöiden yhdysvaikutus ei ole merkitsevä, tällöin tekijän mahdollinen päävaikutus määrittää

tuloksia eli esimerkiksi kohotettu suhteellinen ilmankosteus vaikuttaa muuttujaan samalla

tavalla kasvualustan molemmilla typpitasoilla.

17

Niille metaboliiteille, joille oli PCA:ta varten tehty kymmenkantainen logaritmimuunnos

(log10) jakauman normalisoimiseksi, käytettiin ANOVA:ssa samoja logaritmimuunnettuja

arvoja. Kasvuparametriaineistosta havaittiin Kolmogorov-Smirnovin sekä Shapiro-Wilkin

testillä, etteivät suhteellisen pituuskasvun arvot täyttäneet normaalijakaumaoletuksia kohotetun

suhteellisen ilmankosteuden ja kasvualustan alhaisemman typpipitoisuuden osalta, joten

suhteellisen pituuskasvun arvoille tehtiin log10 -muunnos ANOVA:a varten. Muunnoksen

jälkeen suhteellisen pituuskasvun arvot poikkesivat edelleen normaalijakaumasta kasvualustan

alemman typpipitoisuuden osalta, mutta enempää muunnoksia ei tehty.

Tarkasteltuihin metaboliitteihin liittyvillä BoxPlot -kuvaajilla (kuvat 10-17) havainnollis-

tettiin käsittelyjen vaikutuksia metaboliittipitoisuuksiin sekä pitoisuusarvojen hajontaa käsitte-

lyryhmien välillä. Vastaavasti kasvuparametriaineistoon liittyvillä BoxPlot -kuvaajilla (kuvat

18-20) havainnollistettiin käsittelyjen vaikutuksia kyseisiin kasvuparametreihin sekä arvojen

hajontaa käsittelyryhmien välillä. Arvoille ei tehty kymmenkantaista logaritmikorjausta (log10)

BoxPlot -kuvaajia varten, joten nämä kuvat edustavat muuttujien luonnollista jakaumaa.

SPSS-ohjelmisto asettaa havaintojoukon arvot suuruusjärjestykseen, minkä jälkeen BoxPlot -

kuvaajat muodostuvat seuraavin periaattein (Disraeli 1996, kuva 7): Pylvään sisällä oleva

vaakaviiva osoittaa havaintojoukon mediaaniarvon (Q2). Pylväs sisältää keskimmäiset 50 %

havaintojoukon arvoista. Pylvään ylä- ja alapuolella olevat pystyviivat osoittavat havainto-

arvoja, jotka ovat ylimmässä tai alimmassa 25 %:ssa tapauksista niissä havaintojoukoissa joissa

ei ole ääriarvoja. Q4 on tällöin havaintojoukon maksimiarvo ja Q0 havaintojoukon minimiarvo.

Kvartiiliväli (IQR) on yläkvartiilin korkeimman arvon (Q3) ja alakvartiilin alimman arvon (Q1)

erotus [IQR = Q3 - Q1]. Ympyrällä (o) merkitty läheinen ääriarvo on arvoltaan suurempi kuin

[Q1 - 1.5 x IQR] tai [Q3 + 1.5 x IQR]. Tähdellä () merkitty kaukainen ääriarvo on arvoltaan

suurempi kuin [Q1 - 3 x IQR] tai [Q3 + 3 x IQR].

Lineaarisia riippuvuuksia kammiokokeessa kasvetuista rauduskoivuista määritettyjen

kasvuominaisuuksien (suhteellinen pituus- ja paksuuskasvu) ja lehtinäytteiden ominaisuuksien

(näytteen tuorepaino, lehden pinta-ala, vesipitoisuus, typpipitoisuus ja klorofylli-indeksi)

(Lihavainen ym. 2016a) sekä tässä pro gradu -tutkimuksessa määritettyjen metaboliittipitoi-

suuksien välillä tarkasteltiin Pearson-korrelaation avulla. Pearson-korrelaatio kuvaa kahden

muuttujan välisen keskinäisen lineaarisen riippuvuuden voimakkuutta (Ranta ym. 1994, Zar

1999). Korrelaatiokerroin voi saada arvoja välillä -1…0...+1. Positiivinen korrelaatio osoittaa

samansuuntaista lineaarista riippuvuutta, negatiivinen korrelaatio puolestaan osoittaa vastak-

kaissuuntaista lineaarista riippuvuutta. Kahden muuttujan välillä voidaan sanoa olevan

voimakas lineaarinen riippuvuus, kun korrelaatiokertoimen arvo on suurempi kuin ± 0,7.

18

Korrelaatiokertoimen arvoilla ± 0,7…0,3 muuttujien välillä on kohtalainen lineaarinen riippu-

vuus. Korrelaatiokertoimen arvon lähestyessä nollaa, muuttujien välillä oleva lineaarinen

riippuvuus on hyvin vähäistä. Havaintoyksiköiden lukumäärä (n) vaikuttaa sekä korrelaatio-

kertoimen arvoon että korrelaation merkitsevyyteen eli p-arvoon.

Kuva 7. BoxPlot-kuvaajan tulkinta. Havaintojoukon minimiarvo (Q0), alakvartiili (Q1), mediaani (Q2),

yläkvartiili (Q3), maksimiarvo (Q4) sekä ääriarvot (o, ).

5 TULOKSET

Tässä pro gradu -tutkielmassa tarkastellaan suhteellisen ilmankosteuden ja kasvualustan typpi-

pitoisuuden kahden eri tason vaikutuksia rauduskoivun (Betula pendula Roth) taimien lehti-

näytteistä (n = 41) GC-MS:lla analysoitujen ja niistä identifioitujen metaboliittien (n = 36)

pitoisuuksiin (Liite 1: taulukko L1). Näihin metaboliitteihin lukeutui muiden muassa sokereita,

sokerialkoholeja, orgaanisia happoja, aminohappoja ja fenolisia yhdisteitä, joita löytyi suurim-

masta osasta näytteitä, ja ne edustavat keskeisiin metaboliareitteihin (kuva 1) liittyviä yhdiste-

ryhmiä. Tutkielmassa tarkastellaan lisäksi koekäsittelyjen vaikutuksia samoista taimista mitat-

tuihin kasvuparametreihin ja lehtien ominaisuuksiin.

5.1 Näytteiden sijoittuminen pääkomponenttianalyysissa

Pääkomponenttianalyysilla pyrittiin selvittämään metaboliittiaineiston sisäistä vaihtelua sekä

löytämään eroja koekäsittelyjen välillä sen suhteen, määrittääkö tuloksia enemmän kohotettu

suhteellinen ilmankosteus vai kasvualustan kohotettu typpipitoisuus. Ensimmäinen pääkompo-

nentti [t(1)] selitti aineiston kokonaisvaihtelusta 26,9 % ja toinen pääkomponentti [t(2)] 19,1 %

(kuva 8). Kolmannen pääkomponentin selitysaste oli 8,6 % ja neljännen pääkomponentin 6,5

19

%, joten melko vähäisinä ja vaikeasti tulkittavina ne jätettiin pois tarkastelusta. Käsittelyryhmät

eivät selvästi erottuneet toisistaan PCA-ordinaatiossa ensimmäisen ja toisen pääkomponentin

suhteen. Kun ensimmäinen ja toinen pääkomponentti yhdistettiin (kuvien 8 ja 9 diagonaalinen

katkoviiva), saatiin uusi tarkastelutaso, jolloin havaittiin näytteiden erottuvan suhteellisen

ilmankosteuden suhteen (kuva 8). Kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvatetut

näytteet (H ja HN) ryhmittyivät yhteen ja erottuivat suurimmasta osasta alemmassa suhteelli-

sessa ilmankosteudessa kasvatetuista lehtinäytteistä (C ja N) (kuva 8). Kasvualustan

kohotetussa typpipitoisuudessa kasvatetut lehtinäytteet (N ja HN) eivät erottuneet alemmassa

typpipitoisuudessa kasvatetuista näytteistä (C ja H), eli voidaan todeta, ettei kasvualustan

typpipitoisuus määrittänyt tuloksia (kuva 8).

Tulosten ja analyysimenetelmien luotettavuutta osoittaa laadunvarmistusnäytteiden (QC)

toisiinsa nähden läheinen sijoittuminen pääkomponenttianalyysissä sekä keskittyminen PCA-

ordinaatiossa lähelle origoa (kuva 8). Tällöin QC -näytteiden välinen vaihtelu on vähäistä ja

näin ollen voidaan sanoa tulosten olevan tarkkoja ja luotettavia.

5.2 Kohotetun suhteellisen ilmankosteuden vaikutus metaboliitteihin

Metaboliittipitoisuuksien muutosta suhteessa ilmankosteuskäsittelyihin voitiin tarkastella

yhdistämällä analysoidut metaboliitit samaan kuvaan tutkittujen näytteiden kanssa niin kutsu-

tuksi Loadings Bi Plot:iksi (kuva 9). Tästä kuvasta sekä myöhemmistä analyysivaiheista on

poistettu QC -näytteet, joten selitysasteet muuttuivat hieman verrattuna PCA:n tuloskuvaajaan

(kuva 8), ollen ensimmäisellä pääkomponentilla 27,3 % ja toisella pääkomponentilla 19,8 %

(kuva 9). Metaboliitit, joiden pitoisuus aleni kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa

kasvatetuissa lehdissä, ryhmittyivät alemmassa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvatettuja

lehtinäytteitä (C ja N) edustavalle puolelle PCA-ordinaatiota (kuva 9 yläoikea puolisko).

Metaboliitit, joiden pitoisuus nousi kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvatetuissa

lehdissä, ryhmittyivät kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvatettuja lehtinäytteitä

(H ja HN) edustavalle puolelle PCA-ordinaatiota (kuva 9 alavasen puolisko). Metaboliitit,

joiden pitoisuus ei juurikaan muuttunut käsittelyjen vaikutuksesta, sijoittuivat PCA-ordinaa-

tiossa lähelle origoa (kuva 9).

SPSS:n kaksisuuntaisella ANOVA:lla tarkasteltuna 36 tutkitusta metaboliitista yhteensä 14

metaboliitin pitoisuus aleni merkitsevästi rauduskoivun lehdissä kohotetussa suhteellisessa

ilmankosteudessa kasvatettuna verrattuna alemmassa suhteellisessa ilmankosteudessa kasva-

tukseen (taulukko 1). Nämä merkitsevyydet on merkitty vastaavasti myös metaboliittiaineis-

20

tosta laadittuihin BoxPlot -kuvaajiin (kuvat 10-17). Tällaisia metaboliitteja olivat glukoosi

(taulukko 1, kuva 10c), sakkaroosi (taulukko 1, kuva 10f), myo-inositoli (taulukko 1, kuva 11a),

ribitoli (taulukko 1, kuva 11b), sorbitoli (taulukko 1, kuva 11c), malaatti (taulukko 1, kuva 12c),

sikimihappo (taulukko 1, kuva 12d), sitruunahappo (taulukko 1, kuva 12e), sukkinihappo

(taulukko 1, kuva 12f), treonihappo (taulukko 1, kuva 12g), treonihappo-1,4-laktoni (taulukko

1, kuva 12h), treoniini (taulukko 1, kuva 13e), β-sitosteroli (taulukko 1, kuva 14a) ja salidrosidi

(taulukko 1, kuva 16b).

Kolmen metaboliitin pitoisuus nousi merkitsevästi rauduskoivun lehdissä kohotetussa

suhteellisessa ilmankosteudessa kasvatettuna verrattuna alemmassa suhteellisessa ilmankosteu-

dessa kasvatukseen. Tällaisia olivat raffinoosi (taulukko 1, kuva 10e), kversetiini (taulukko 1,

kuva 15a) ja flavonoliglykosidi (taulukko 1, kuva 16a).

5.3 Kasvualustan kohotetun typpipitoisuuden vaikutus metaboliitteihin

SPSS:n kaksisuuntaisella ANOVA:lla (taulukko 1) tarkasteltuna malaatin (taulukko 1, kuva

12c) ja sukkinihapon (taulukko 1, kuva 12f) pitoisuudet nousivat ja 3-trans-kumaryyli-kiini-

hapon (taulukko 1, kuva 17c) pitoisuudet alenivat kasvualustan kohotetussa typpipitoisuudessa

kasvatetuissa rauduskoivun lehdissä verrattuna kasvualustan alemmassa typpipitoisuudessa

kasvatukseen.

Suhteellisella ilmankosteudella ja kasvualustan typpipitoisuudella ei havaittu yhdysvaiku-

tusta metaboliittiaineistossa (taulukko 1). Tällöin kohotetun suhteellisen ilmankosteuden vaiku-

tus tarkasteluihin metaboliitteihin on ollut sama riippumatta kasvualustan typpitasosta, ja

vastaavasti kasvualustan kohotetun typpipitoisuuden vaikutus tarkasteltuihin metaboliitteihin

on ollut sama riippumatta suhteellisen ilmankosteuden tasosta.

21

Kuva 8. Pääkomponenttianalyysin tuloskuvaaja, joka esittää kammiokokeen rauduskoivujen GC-MS:lla

analysoitujen lehtinäytteiden (n = 41) sijoittumista PCA-ordinaatiossa ensimmäisen (t[1]) ja toisen (t[2])

pääkomponentin suhteen. Mukana lisäksi kolme laadunvarmistusnäytettä (QC). Ensimmäisen pääkom-

ponentin selitysaste (R2X[t1]) oli 26,9 % ja toisen pääkomponentin selitysaste (R2X[t2]) oli 19,1 %.

Käsittely kammiokokeessa: C = RH60 N35, N = RH60 N70, H = RH95 N35, HN = RH95 N70. Diago-

naalinen katkoviiva osoittaa tarkastelutasoa, jossa ensimmäinen ja toinen pääkomponentti yhdistetään.

22

Kuva 9. Pääkomponenttianalyysin tuloskuvaaja yhdistettynä metaboliittiaineistoon (Loadings Bi Plot).

Kammiokokeen rauduskoivujen GC-MS:lla analysoidut lehtinäytteet (n = 41) ja niistä identifioidut

metaboliitit (n = 36) yhdistettynä samaan PCA-ordinaatioon. Ensimmäisen pääkomponentin selitysaste

(R2X[t1]) oli 27,3 % ja toisen pääkomponentin selitysaste (R2X[t2]) oli 19,8 %. Diagonaalinen katko-

viiva osoittaa tarkastelutasoa, jossa ensimmäinen ja toinen pääkomponentti yhdistetään. Käsittely

kammiokokeessa: C = RH60 N35, N = RH60 N70, H = RH95 N35, HN = RH95 N70. Metaboliittien

lyhenteiden selitys taulukossa 1.

23

Taulukko 1. Tilastollisessa analyysissä mukana olevat metaboliitit, mahdollinen log10-transformaatio

(log) PCA:ssa, metaboliittien lyhenteet ja ryhmät, kaksisuuntaisella ANOVA:lla lasketut käsittelyjen

pää- ja yhdysvaikutuksen merkitsevyysasteet (p-arvot), sekä merkitsevän muutoksen suunta (↓/↑).

Metaboliitti Lyhenne Ryhmä RH, p ↓/↑ N, p ↓/↑ RH×N, p

fruktoosi (log) Fru S 0,198 0,231 0,342

galaktoosi (log) Gal S 0,083 0,600 0,458

glukoosi (log) Glc S 0,011 ↓ 0,351 0,665

maltoosi Mal S 0,588 0,728 0,586

raffinoosi (log) Raf S 0,032 ↑ 0,558 0,122

sakkaroosi Suc S 0,017 ↓ 0,331 0,103

sedoheptuloosi (log) Sed S 0,063 0,217 0,573

myo-inositoli (log) Ino SA <0,001 ↓↓↓ 0,560 0,579

ribitoli (log) Rib-ol SA 0,005 ↓↓ 0,219 0,375

sorbitoli Sor-ol SA 0,036 ↓ 0,983 0,624

gallushappo GaA OH 0,728 0,807 0,946

kiinihappo QA OH 0,393 0,551 0,693

malaatti MA OH 0,001 ↓↓↓ 0,015 ↑ 0,745

sikimihappo (log) ShiA OH 0,009 ↓↓ 0,414 0,492

sitruunahappo (log) CitA OH 0,013 ↓ 0,094 0,576

sukkinihappo (log) SA OH 0,015 ↓ 0,006 ↑↑ 0,210

treonihappo ThrA OH 0,001 ↓↓↓ 0,284 0,347

treonihappo-1,4-laktoni ThrLac OH <0,001 ↓↓↓ 0,214 0,765

alaniini Ala AH 0,092 0,559 0,374

asparagiinihappo (log) Asp AH 0,429 0,682 0,957

glutamiini Gln AH 0,073 0,258 0,891

glutamiinihappo Glu AH 0,207 0,186 0,164

treoniini (log) Thr AH 0,005 ↓↓ 0,672 0,702

valiini Val AH 0,378 0,110 0,638

β-sitosteroli bSS STE 0,024 ↓ 0,292 0,402

α-tokoferoli TCP TOK 0,206 0,969 0,877

kversetiini QT FLA 0,046 ↑ 0,273 0,969

katekiini Cat FLA 0,107 0,531 0,431

epikatekiini ECG FLA 0,401 0,561 0,457

epigallokatekiini EGCG FLA 0,773 0,730 0,380

flavonoliglykosidi FlaG FenGly 0,043 ↑ 0,153 0,909

salidrosidi (log) Sal FenGly 0,012 ↓ 0,721 0,293

klorogeenihappo (log) CGA QA 0,267 0,271 0,597

3-cis-kumaryyli-kiinihappo 3-cis-CQA QA 0,139 0,253 0,084

3-trans-kumaryyli-kiinihappo 3-trans-CQA QA 0,201 0,022 ↓ 0,405

5-trans-kumaryyli-kiinihappo 5-trans-CQA QA 0,557 0,209 0,673

Ryhmät: S sokeri, SA sokerialkoholi, OH orgaaninen happo, AH aminohappo, STE steroli, TOK toko-

feroli, FLA flavonoidiaglykoni, FenGly fenolinen glykosidi, QA kiinihappojohdannainen. RH: suhteel-

lisen ilmankosteuden päävaikutus, N: kasvualustan typpipitoisuuden päävaikutus, RHxN: suhteellisen

ilmankosteuden ja kasvualustan typpipitoisuuden yhdysvaikutus. Käsittelyvaikutuksen (RH tai N)

merkitsevyys: ↓↓↓ = erittäin merkitsevä (p ≤ 0,001), ↑↑/↓↓ = hyvin merkitsevä (p ≤ 0,01), lihavoitu

lukuarvo ja ↑/↓ = merkitsevä (p ≤ 0,05), kursivoitu lukuarvo = melko merkitsevä (p ≤ 0,10). Merkitsevän

muutoksen suunta: ↑ nouseva , ↓ laskeva .

24

Kuva 10. Sokerit. Havaintoyksiköiden lukumäärä

(n) käsittelyittäin: C, H, HN: n = 10, N: n = 11,

ellei toisin mainita. a) fruktoosi, b) galaktoosi

(C: n = 10, H ja HN: n = 9, N: n = 11), c) glukoosi,

d) maltoosi (C: n = 3, H: n = 6, N: n = 8, HN: n =

5), e) raffinoosi (C, H: n = 10, N: n = 11, HN: n =

9), f) sakkaroosi, g) sedoheptuloosi. Pitoisuusak-

selin suuruusluokka voi poiketa metaboliittien

välillä. Käsittelyvaikutuksen (RH) merkitsevyys

ANOVA:ssa (taulukko 1): = merkitsevä (p ≤

0,05).

RH

a) b)

RH

RH

c) d)

e) f)

g)

25

Kuva 11. Sokerialkoholit. Havaintoyksiköiden

lukumäärä (n) käsittelyittäin: C, H, HN: n = 10,

N: n = 11. a) myo-inositoli, b) ribitoli, c) sorbi-

toli. Pitoisuusakselin suuruusluokka voi poiketa

metaboliittien välillä. Käsittelyvaikutuksen

(RH) merkitsevyys ANOVA:ssa (taulukko 1):

= erittäin merkitsevä (p ≤ 0,001), = hyvin

merkitsevä (p ≤ 0,01), = merkitsevä (p ≤ 0,05).

a) b)

c)

RH RH

RH RH

26

Kuva 12. Orgaaniset hapot. Näytelukumäärä (n) käsittelyittäin: C, H, HN: n = 10, N: n = 11, ellei toisin

mainita. a) gallushappo (C, HN: n = 10, H: n = 9, N: n = 11), b) kiinihappo, c) malaatti, d) sikimihappo

(C, N: n = 10, H: n = 9, HN: n = 7), e) sitruunahappo, f) sukkinihappo, g) treonihappo, h) treonihappo-

1,4-laktoni. Pitoisuusakselin suuruusluokka voi poiketa metaboliittien välillä. Käsittelyvaikutuksen (RH

tai N) merkitsevyys ANOVA:ssa (taulukko 1): = erittäin merkitsevä (p ≤ 0,001), = hyvin merkit-

sevä (p ≤ 0,01), = merkitsevä (p ≤ 0,05).

RH

N

RH

RH

RH

RH

N

a)

c) d)

e)

b)

f)

g) RH h)

27

Kuva 13. Aminohapot. Havaintoyksiköiden lukumäärä (n) käsittelyittäin: C, H, HN: n = 10, N: n = 11,

ellei toisin mainita. a) alaniini (C, H, N: n = 10, HN: n = 9), b) asparagiinihappo (C, N: n = 9, H, HN: n

= 7), c) glutamiini (C: n = 9, H: n = 6, N: n = 11, HN: n = 8), d) glutamiinihappo, e) treoniini, f) valiini

(C, N, HN: n = 10, H: n = 5). Pitoisuusakselin suuruusluokka voi poiketa metaboliittien välillä. Käsitte-

lyvaikutuksen (RH) merkitsevyys ANOVA:ssa (taulukko 1): = hyvin merkitsevä (p ≤ 0,01).

a) b)

c) d)

e) f) RH

28

Kuva 14. Primaariset terpenoidit. Havaintoyksiköiden lukumäärä (n) käsittelyittäin: C, H, HN: n = 10,

N: n = 11. a) β-sitosteroli, b) α-tokoferoli. Pitoisuusakselin suuruusluokka voi poiketa metaboliittien

välillä. Käsittelyvaikutuksen (RH) merkitsevyys ANOVA:ssa (taulukko 1): = merkitsevä (p ≤ 0,05).

Kuva 15. Sekundaariyhdisteet: Flavonoidiaglykonit. Havaintoyksiköiden lukumäärä (n) käsittelyittäin:

C, H, HN: n = 10, N: n = 11, ellei toisin mainita. a) kversetiini, b) katekiini, c) epikatekiini (C: n = 8, H:

n = 10, N: n = 11, HN: n = 9), d) epigallokatekiini. Pitoisuusakselin suuruusluokka voi poiketa meta-

boliittien välillä. Käsittelyvaikutuksen (RH) merkitsevyys ANOVA:ssa (taulukko 1): = merkitsevä

(p ≤ 0,05).

a) b)

a) b)

c) d)

RH

RH

29

Kuva 16. Sekundaariyhdisteet: Fenoliset glykosidit. a) flavonoliglykosidi (C: n = 10, H ja HN: n = 7, N:

n = 6), b) salidrosidi (C, H, HN: n = 10, N: n = 11). Pitoisuusakselin suuruusluokka voi poiketa meta-

boliittien välillä. Käsittelyvaikutuksen (RH) merkitsevyys ANOVA:ssa (taulukko 1): = merkitsevä

(p ≤ 0,05).

Kuva 17. Sekundaariyhdisteet: Kiinihappojohdannaiset. Näytelukumäärä (n) käsittelyittäin: C, H, HN:

n = 10, N: n = 11, ellei toisin mainita. a) klorogeenihappo, b) 3-cis-kumaryyli-kiinihappo, c) 3-trans-

kumaryyli-kiinihappo (C, H, HN: n = 10, N: n = 9), d) 5-trans-kumaryyli-kiinihappo (C, H: n = 10, N:

n = 11, HN: n = 9). Pitoisuusakselin suuruusluokka voi poiketa metaboliittien välillä. Käsittelyvaiku-

tuksen (N) merkitsevyys ANOVA:ssa (taulukko 1): = merkitsevä (p ≤ 0,05).

a) b)

c) d)

b) a) RH

N

RH

30

5.4 Rauduskoivun kasvu kammiokokeessa

Kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvatettuna rauduskoivun lehden typpipitoisuus

ja klorofylli-indeksi alenivat (taulukot 2 ja 3, kuva 18) sekä rauduskoivun taimien suhteellinen

pituus- ja paksuuskasvu nousivat verrattuna alemmassa suhteellisessa ilmankosteudessa kasva-

tukseen (taulukot 2 ja 3, kuva 19). Näytteen tuorepaino, lehden pinta-ala ja vesipitoisuus eivät

muuttuneet merkitsevästi ilmankosteuskäsittelyn vaikutuksesta (taulukot 2 ja 3, kuva 20).

Kasvualustan typpipitoisuudella ei havaittu merkitsevää vaikutusta tarkasteluihin kasvu- ja

lehtien ominaisuuksiin (taulukko 3). Suhteellisen ilmankosteuden ja kasvualustan typpipitoi-

suuden yhdysvaikutusta ei havaittu taimien kasvu- ja lehtien ominaisuuksissa (taulukko 3).

Taulukko 2. Kammiokokeen rauduskoivuista määritetyt taimien kasvu- ja lehtien ominaisuudet, käsit-

tely (C = RH60 N35, N = RH60 N70, H = RH95 N35, HN = RH95 N70), näytelukumäärä (n), ominai-

suuden keskiarvo (ka.) ja keskiarvon keskivirhe (SE). Ominaisuus Käsittely n ka. SE

Lehtinäytteen tuorepaino (mg) C 10 37,42 0,69

N 11 36,79 0,96

H 10 36,42 0,57

HN 10 37,26 0,63

Lehden pinta-ala (cm2) C 8 11,03 0,87

N 11 11,20 0,81

H 10 12,15 1,06

HN 10 12,30 0,80

Lehden vesipitoisuus

(%-osuus tuorepainosta)

C 8 60,6 1,12

N 11 64,0 1,04

H 10 59,9 1,41

HN 10 60,5 1,05

Lehden typpipitoisuus

(mg/g kuivapainoa kohti)

C 3 1,97 0,15

N 4 1,98 0,11

H 4 1,57 0,08

HN 2 1,46 0,10

Lehden klorofylli-indeksi

(CCI)

C 10 12,15 1,02

N 11 13,28 1,07

H 10 8,84 0,57

HN 10 10,08 0,63

Suhteellinen pituuskasvu

(log10-muunnettu)

C 10 0,09 0,02

N 11 0,11 0,02

H 10 0,13 0,04

HN 10 0,12 0,02

Suhteellinen paksuuskasvu C 10 1,23 0,03

N 11 1,17 0,03

H 10 1,30 0,04

HN 10 1,32 0,03

31

Taulukko 3. Kammiokokeen rauduskoivuista määritetyt taimien kasvu- ja lehtien ominaisuudet, kaksi-

suuntaisella ANOVA:lla lasketut käsittelyvaikutuksen merkitsevyysasteet (p-arvot), sekä merkitsevän

muutoksen suunta (↓/↑). Ominaisuus RH, p ↓/↑ N, p RH×N, p

Lehtinäytteen tuorepaino 0,723 0,888 0,333

Lehden pinta-ala 0,227 0,862 0,994

Lehden vesipitoisuus 0,085 0,101 0,231

Lehden typpipitoisuus 0,004 ↓↓ 0,650 0,640

Lehden klorofylli-indeksi 0,001 ↓↓↓ 0,179 0,950

Suhteellinen pituuskasvu (log) 0,009 ↑↑ 0,387 0,132

Suhteellinen paksuuskasvu 0,002 ↑↑ 0,570 0,256

RH: suhteellisen ilmankosteuden päävaikutus, N: kasvualustan typpipitoisuuden päävaikutus, RH×N:

suhteellisen ilmankosteuden ja kasvualustan typpipitoisuuden yhdysvaikutus. Käsittelyvaikutuksen

(RH) merkitsevyys: ↓↓↓ = erittäin merkitsevä (p ≤ 0,001), ↑↑/↓↓ = hyvin merkitsevä (p ≤ 0,01), lihavoitu

lukuarvo = merkitsevä (p ≤ 0,05), kursivoitu lukuarvo = melko merkitsevä (p ≤ 0,10). Merkitsevän muu-

toksen suunta: ↑ nouseva , ↓ laskeva .

Kuva 18. Lehden typpipitoisuus ja klorofylli-indeksi alenivat kohotetussa suhteellisessa ilmankosteu-

dessa kasvatettuna. Käsittelyvaikutuksen (RH) merkitsevyys ANOVA:ssa (taulukko 3): = erittäin

merkitsevä (p ≤ 0,001), = hyvin merkitsevä (p ≤ 0,01).

Kuva 19. Suhteellinen pituus- ja paksuuskasvu nousivat kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa

kasvatetuissa taimissa. Käsittelyvaikutuksen (RH) merkitsevyys ANOVA:ssa (taulukko 3): = hyvin

merkitsevä (p ≤ 0,01).

RH RH

RH RH

32

Kuva 20. Lehtinäytteen tuorepaino, lehden pinta-ala ja vesipitoisuus eivät muuttuneet merkitsevästi

käsittelyjen vaikutuksesta.

5.5 Rauduskoivun taimien kasvu- ja lehtien ominaisuuksien sekä lehtinäytteistä määritettyjen

metaboliittipitoisuuksien välinen Pearson-korrelaatio

Tarkasteltaessa kammiokokeessa kasvatettujen rauduskoivujen kasvu- ja lehtien ominaisuuk-

sien sekä lehtinäytteistä määritettyjen metaboliittipitoisuuksien välistä lineaarista riippuvuutta

eli korrelaatioita, havaittiin lehtinäytteen tuorepainon korreloivan positiivisesti treonihapon

kanssa ja negatiivisesti galaktoosin, kiinihapon, alaniinin, epigallokatekiinin ja flavonoliglyko-

sidin kanssa (taulukko 4). Lehden pinta-alan kanssa positiivinen korrelaatio havaittiin

kiinihapolla, negatiivinen korrelaatio sorbitolilla (taulukko 4). Lehden vesipitoisuuden kanssa

positiivisesti korreloivat sorbitoli, malaatti, sitruuna-, sukkini- ja treonihappo, treonihappo-1,4-

laktoni ja treoniini, ja negatiivisesti korreloivat raffinoosi ja flavonoliglykosidi (taulukko 4).

Lehden typpipitoisuuden kanssa positiivisesti korreloivat galaktoosi, glukoosi, myo-inositoli,

ribitoli sorbitoli ja salidrosidi, negatiivista korrelaatiota lehden typpipitoisuuteen ei havaittu

(taulukko 4). Lehden klorofylli-indeksin kanssa positiivisesti korreloivat fruktoosi, sakkaroosi,

myo-inositoli, ribitoli, sorbitoli, malaatti, sitruuna-, sukkini- ja treonihappo, treonihappo-1-4-

laktoni, glutamiini, treoniini ja α-tokoferoli, ja negatiivisesti korreloivat raffinoosi, kiinihappo,

glutamiinihappo, kversetiini, epigallokatekiini, flavonoliglykosidi ja 3-trans-kumaryyli-kiini-

happo (taulukko 4). Suhteellisen pituuskasvun kanssa positiivinen korrelaatio havaittiin 3-cis-

kumaryyli-kiinihapolla ja negatiivinen korrelaatio galaktoosilla, glukoosilla, sedoheptuloosilla,

myo-inositolilla, kiinihapolla, sikimihapolla, β-sitosterolilla, epigallokatekiinilla ja salidrosi-

dilla (taulukko 4). Suhteellisen paksuuskasvun kanssa positiivinen korrelaatio havaittiin

glutamiinihapolla ja negatiivinen korrelaatio sakkaroosilla, myo-inositolilla, ribitolilla, malaa-

tilla, sitruuna-, sukkini- ja treonihapolla, glutamiinilla ja β-sitosterolilla (taulukko 4).

33

Taulukko 4. Pearson-korrelaatiot taimen kasvu- ja lehtien ominaisuuksien sekä lehtinäytteistä määri-

tettyjen metaboliittipitoisuuksien välillä. Metaboliitti Lehti-

näytteen

tuore-

paino

Lehden

pinta-ala

Lehden

vesipi-

toisuus

Lehden

typpi-

pitoisuus

Lehden

kloro-

fylli-

indeksi

Suht.

pituus-

kasvu

Suht.

paksuus-

kasvu

Fruktoosi 0,165 -0,032 0,196 0,447 0,416** -0,240 -0,210

Galaktoosi -0,329* 0,214 -0,195 0,714** 0,007 -0,503** -0,238

Glukoosi -0,224 0,137 -0,198 0,750** 0,016 -0,519** -0,231

Maltoosi -0,027 0,103 0,177 0,631 0,063 -0,362 -0,323

Raffinoosi -0,296 0,259 -0,456** 0,552 -0,386* -0,231 0,237

Sakkaroosi 0,026 -0,163 0,241 0,447 0,413** -0,018 -0,435**

Sedoheptuloosi -0,241 0,157 -0,193 0,515 -0,009 -0,558** -0,206

myo-inositoli 0,025 -0,087 0,309 0,593* 0,511** -0,422** -0,471**

Ribitoli 0,265 0,006 0,020 0,672* 0,394* -0,245 -0,344*

Sorbitoli 0,231 -0,334* 0,440** 0,584* 0,457** -0,208 -0,132

Gallushappo -0,144 0,255 0,043 0,206 -0,017 -0,051 -0,105

Kiinihappo -0,458** 0,407* -0,113 0,134 -0,378* -0,367* 0,301

Malaatti 0,152 -0,175 0,547** 0,386 0,706** -0,182 -0,532**

Sikimihappo -0,230 0,242 0,101 0,561 0,175 -0,630** -0,321

Sitruunahappo 0,237 -0,214 0,514** 0,284 0,593** -0,089 -0,361*

Sukkinihappo 0,225 -0,288 0,532** 0,305 0,525** 0,085 -0,561**

Treonihappo 0,376* -0,260 0,633** 0,420 0,824** -0,046 -0,500**

Treonihappo-1,4-laktoni 0,148 -0,233 0,405* 0,179 0,509** -0,101 -0,298

Alaniini -0,461** 0,192 0,091 0,332 -0,039 -0,288 -0,032

Asparagiinihappo -0,037 0,070 0,072 -0,193 -0,013 -0,008 0,182

Glutamiini 0,092 -0,014 0,273 -0,094 0,533** 0,037 -0,367*

Glutamiinihappo -0,259 0,049 -0,145 -0,024 -0,394* 0,147 0,405**

Treoniini 0,180 -0,194 0,485** 0,504 0,441** -0,100 -0,279

Valiini 0,101 -0,132 0,002 0,481 0,196 0,023 -0,088

β-sitosteroli -0,080 0,124 0,138 0,467 0,249 -0,339* -0,312*

α-tokoferoli 0,225 -0,087 0,139 0,148 0,352* -0,169 -0,265

Kversetiini -0,222 0,200 -0,282 -0,119 -0,382* 0,111 0,200

Katekiini -0,186 0,016 -0,209 0,184 -0,062 -0,125 -0,089

Epikatekiini -0,073 -0,232 0,083 0,211 0,027 0,237 -0,099

Epigallokatekiini -0,348* 0,255 -0,340 0,167 -0,434** -0,368* 0,263

Flavonoliglykosidi -0,455* 0,165 -0,377* 0,108 -0,609** -0,192 0,274

Salidrosidi -0,221 0,202 0,005 0,554* 0,273 -0,509** -0,244

3-cis-kumaryyli-kiinihappo -0,144 -0,193 0,050 -0,008 -0,291 0,406** 0,147

3-trans-kumaryyli-kiini-

happo -0,190 0,085 -0,324 0,561 -0,485** -0,036 0,183

5-trans-kumaryyli-kiini-

happo -0,190 0,129 -0,178 0,211 -0,265 -0,157 -0,062

Merkitsevyys: ** p ≤ 0,01; * p ≤ 0,05; positiivinen / negatiivinen korrelaatio

34

6 TULOSTEN TARKASTELU

Tämän pro gradu -tutkielman tulokset osoittavat, että kammiokokeen kohotettu suhteellinen

ilmankosteus vaikutti voimakkaasti rauduskoivun (Betula pendula Roth) lehtien metaboliaan.

Rauduskoivun lehtinäytteistä löytyi yhteensä 169 erilaista metaboliittia (Lihavainen ym.

2016a), joista tässä pro gradu -tutkielmassa tarkasteltaviksi valikoitui 36 metaboliittia. Useim-

pien primaarimetaboliittien tuotanto aleni kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa kasva-

tetuissa rauduskoivun taimien lehdissä, ainoastaan raffinoosin pitoisuus nousi. Suhteellisen

ilmankosteuden kohottamisen vaikutus lehtien sekundaarimetaboliitteihin oli yhdisteestä

riippuvainen, nostaen tässä tutkielmassa tarkastelluista sekundaariyhdisteistä kversetiinin ja

flavonoliglykosidin pitoisuuksia ja alentaen salidrosidin pitoisuuksia. Kammiokokeessa

suhteellista ilmankosteutta on pystytty kontrolloidusti kasvattamaan hyvin suureksi, ollen tutki-

musasetelmassa 95 %. Ero alempana ilmankosteustasona käytettyyn luonnontasoiseen suhteel-

liseen ilmankosteuteen (RH 60 %) on suuri. Tällöin kammiokokeen kohotetussa suhteellisessa

ilmankosteudessa kasvattaminen on aiheuttanut rauduskoivun taimille voimakasta ympäristö-

stressiä, mikä näkyy lehtien metaboliavasteissa.

Kasvualustan kohotetussa typpipitoisuudessa kasvattaminen vaikutti rauduskoivun taimien

lehtien metaboliitteihin nostaen malaatin ja sukkinihapon sekä alentaen 3-trans-kumaryyli-

kiinihapon pitoisuuksia. Tällöin voidaan todeta, ettei kasvualustan typpipitoisuuden kohottami-

sella ole määrällisesti ollut yhtä merkittäviä vaikutuksia lehtien metaboliaan kuin mitä kohote-

tussa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvatettujen taimien lehdissä havaittiin. Kasvualustan

alemmassa eli optimaalisessa typpitasossa kasvatetut taimet eivät luonnontasoisessa ilmankos-

teudessa osoittaneet metabolian osalta typpirajoitettua kasvua, jolloin peruslannoitus on ollut

riittävää metabolian normaaliin toimintaan ja taimien kasvuun. Kohotettu suhteellinen ilman-

kosteus on puolestaan rajoittanut kasvualustaan lisätyn typen hyödyntämistä kasvin meta-

boliassa sekä rajoittanut typen käyttöä myös optimaalisella typpitasolla kasvatetuilla kasveilla.

Suhteellisen ilmankosteuden ja kasvualustan typpipitoisuuden yhdysvaikutusta ei havaittu

metaboliittiaineistossa. Tällöin esimerkiksi kohotetun suhteellisen ilmankosteuden vaikutukset

lehtien metaboliaan ovat olleet samansuuntaisia riippumatta kasvualustan typpitasosta, sekä

kasvualustan kohotetun typpipitoisuuden vaikutukset lehtien metaboliaan ovat olleet saman-

suuntaisia riippumatta suhteellisen ilmankosteuden tasosta.

35

Kasvatus kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa vaikutti rauduskoivun taimien

kasvuun lisäämällä suhteellista pituus- ja paksuuskasvua sekä lehtien ominaisuuksiin alenta-

malla lehden typpipitoisuutta ja klorofylli-indeksiä. Kasvualustan typpipitoisuuden kohotta-

misella ei havaittu vaikutusta kasvuparametreihin.

Suhteellisen ilmankosteuden ja kasvualustan typpipitoisuuden yhdysvaikutusta ei havaittu

kasvuparametriaineistossa. Tällöin esimerkiksi kohotetun suhteellisen ilmankosteuden vaiku-

tukset kasvuparametreihin ovat olleet samansuuntaisia riippumatta kasvualustan typpitasosta,

sekä kasvualustan kohotetun typpipitoisuuden vaikutukset kasvuparametreihin ovat olleet

samansuuntaisia riippumatta suhteellisen ilmankosteuden tasosta.

Korkea suhteellinen ilmankosteus voi häiritä ilmarakojen toiminnan säätelyä ja kaasujen

vaihtoa (Gislerød & Nelson 1989, Fordham ym. 2001, Lihavainen ym. 2016a,b). Vaikka

korkeassa suhteellisessa ilmankosteudessa suurin osa lehden alapinnalla olevista ilmaraoista on

auki, veden haihtuminen vähenee ympäröivän ilman vesihöyrypitoisuuden ollessa suuri.

Haihtumisen vähentyessä veden ja mineraalien imeytyminen maaperästä oletettavasti vähenee

johtojänteiden turgoripaineen alentuessa. Suhteellisen ilmankosteuden kohoamisen on havaittu

vähentävän rauduskoivujen ja hybridihaapojen (Populus tremula L.×Populus tremuloides

Michx.) kykyä ottaa typpeä maasta (Tullus ym. 2012, Sellin ym. 2013). Korkeassa suhteelli-

sessa ilmankosteudessa lehtipuut eivät välttämättä kykene hyödyntämään kasvualustan

suurempaa typpimäärää alentuneen haihdunnan ja rajoittuneen virtauksen vuoksi (Lihavainen

ym. 2016b, Sellin ym. 2016). Täten kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvin

voidaan odottaa allokoivan vähemmän typpeä kasvuun ja aineenvaihduntaan kuin alemmassa

suhteellisessa ilmankosteudessa.

Kammiokokeen aikana annettu typpilisä oli optimitasolla 112 mg ja kohotetulla typpitasolla

172 mg per taimi. Tämän pro gradu -tutkielman tuloksia voidaan tulkita käytettävissä olleen

typen hyödynnettävyyden suhteen niin, että vähiten typpeä oli hyödynnettävissä koivuilla, jotka

kasvoivat kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa ja kasvualustan optimaalisessa typpi-

pitoisuudessa (näytteet H: RH95 N35). Nämä yksilöt edustivat voimakkaimmin typpirajoitettua

kasvua. Toiseksi vähiten typpeä oli hyödynnettävissä koivuilla, jotka kasvoivat kohotetussa

suhteellisessa ilmankosteudessa ja kasvualustan kohotetussa typpipitoisuudessa (näytteet HN:

RH95 N70). Toiseksi eniten typpeä oli hyödynnettävissä koivuilla, jotka kasvoivat alemmassa

suhteellisessa ilmankosteudessa ja kasvualustan optimaalisessa typpipitoisuudessa (näytteet C:

RH60 N35). Nämä yksilöt miellettiin kontrollinäytteiksi. Eniten typpeä oli hyödynnettävissä

koivuilla, jotka kasvoivat alemmassa suhteellisessa ilmankosteudessa ja kasvualustan kohote-

tussa typpipitoisuudessa (näytteet N: RH60 N70). Näiden yksilöiden tulisi teoriassa edustaa

36

typpirikasta kasvua, mutta tässä tutkielmassa tarkasteltuna kasvualustan kohotetulla typpipitoi-

suudella havaitut vaikutukset lehden metaboliaan olivat vähäisiä eikä vaikutusta rauduskoivun

taimien kasvuun ja lehden ominaisuuksiin havaittu.

6.1 Kohotetun suhteellisen ilmankosteuden vaikutus metaboliitteihin

Kasvatus kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa vaikutti pitoisuutta alentavasti useilla

primaarimetaboliiteilla, jotka osallistuvat muiden muassa glykolyysiin, sitruunahappokiertoon

ja aminohappojen tuotantoon. Korkeassa suhteellisessa ilmankosteudessa veden ja ravinteiden

nilakuljetus vähenee lehtien ilmarakojen lisääntyneen aukiolon seurauksena (Gislerød &

Nelson 1989, Fordham ym. 2001, Lihavainen ym. 2016a), mikä aiheuttaa typen puutosta ja

edelleen hiilen sidonnassa keskeisen Rubisco-entsyymin määrän ja aktiivisuuden vähenemistä

kasvin lehdissä (Paul & Driscoll 1997). Tämä johtaa fotosynteesin inhibitioon (Lemoine ym.

2013), jolloin fotosynteesissä tuotettujen hiilirunkojen pitoisuudet alenevat kasvin lehdissä,

mikä puolestaan alentaa näistä hiilirungoista syntetisoitavien jatkotuotteiden, kuten hiilihyd-

raattien ja orgaanisten happojen, pitoisuuksia.

Tässä pro gradu -tutkielmassa tarkastelluista sokereista havaittiin glukoosin ja sakkaroosin

pitoisuuksien alenevan rauduskoivun lehdissä kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa

kasvatettuna. Hiilihydraattien pitoisuuksien on useimmiten havaittu typen puutteessa kasvatet-

tujen kasvien lehdissä tämän tutkielman tuloksista poiketen nousevan, esimerkiksi tupakalla

(Nicotiana tabacum L.) (Paul & Driscoll 1997, Scheible ym. 1997) ja maissilla (Zea mays L.)

(Schlüter ym. 2012, 2013).

Raffinoosia käytetään kasvin lehdissä tärkkelyksen ohella hiilirunkojen varastoimismuotona

(Sprenger & Keller 2001). Raffinoosipitoisuuden nouseminen rauduskoivun lehdissä kohote-

tussa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvatettuna osoittaisi hiilirunkojen varastoinnin

raffinoosiin lisääntyvän (Lihavainen ym. 2016a) samalla, kun muiden hiilihydraattien pitoisuus

alenee. Lehtien korkeampi raffinoosipitoisuus kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa voi

lisäksi vaikuttaa ravinteiden kuljetukseen kasvisolukoiden välillä (Lihavainen ym. 2016a).

Pääasiallisesti kasvissa kuljetetaan sakkaroosia, mutta jotkin lajit kuljettavat myös raffinoosia

ja sokerialkoholeja (Lalonde ym. 2004). Kuljetettavien ravinteiden virtaaman vähentyessä

sakkaroosin nilaan lataaminen voi alentua, mikä johtaisi korkeampiin raffinoosipitoisuuksiin

lehdissä (Lemoine ym. 2013). Korkea raffinoosipitoisuus typen puutoksessa kasvatettujen

kasvien lehdissä on havaittu esimerkiksi maissilla (Schlüter ym. 2012, 2013). Raffinoosipitoi-

37

suuden nouseminen voi myös osaltaan kompensoida muiden osmolyyttien pitoisuuksien alene-

misesta mahdollisesti aiheutuvaa lehden osmoottisen säätelykyvyn heikentymistä (Barchet ym.

2013).

Tässä pro gradu -tutkielmassa havaittiin kaikkien tarkasteltujen sokerialkoholien, myo-inosi-

tolin, ribitolin ja sorbitolin, pitoisuuksien alenevan kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa

kasvatetuissa rauduskoivun lehdissä. Sokerialkoholien on esitetty toimivan hiilivarantona sekä

osallistuvan muun muassa kasvin stressioireiden lieventämiseen ja lehden osmoottiseen sääte-

lyyn (Merchant & Richter 2011, Dumschott ym. 2017). Yleisenä stressivasteena sokerialko-

holien pitoisuuksien on havaittu nousevan, mutta tässä tutkielmassa tarkasteltuna suhteellisen

ilmankosteuden kohottaminen vaikutti sokerialkoholien pitoisuutta alentavasti.

Useiden sitruunahappokierron välituotteina toimivien orgaanisten happojen pitoisuuden

havaittiin tässä tutkielmassa alenevan koivunlehdissä, kun taimia kasvatettiin kohotetussa

suhteellisessa ilmankosteudessa. Tämä osoittaa typpirajoitettua kasvua, sillä sitruunahappo-

kierron välituotteiden pitoisuuksien on havaittu alenevan typen puutoksessa (Scheible ym.

1997). Esimerkiksi malaatti toimii kasvisolussa muun muassa osmoottisena säätelijänä ja on

keskeinen välituote useissa metaboliaprosesseissa, kuten fotosynteesissä ja sitruunahappokier-

rossa (Barchet ym. 2013). Tästä syystä malaatin pitoisuusvaihtelun vaikutusta kasvisolukossa

ei voida tarkoin kohdentaa yksittäiseen metaboliaprosessiin, koska sillä on moninaisia vaiku-

tuksia kasvin aineenvaihdunnassa.

Fenyylipropanoidien esiasteen sikimihapon pitoisuuden havaittiin alenevan rauduskoivun

lehdissä kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa, mikä voi osoittaa sikimihapon jatkotuot-

teiden lisääntyneen biosynteesin (Lihavainen ym. 2016a). Sekundaarimetaboliittien tuotantoa

pidetään stressitilassa yllä kierrättämällä primaarisia lähtöaineita tehokkaammin kuin stressit-

tömässä tilassa, jolloin primaaristen lähtöaineiden alhaisetkin pitoisuudet riittävät sekundaari-

yhdisteiden tehokkaaseen tuotantoon (Kutchan ym. 2015).

Tässä pro gradu -tutkielmassa tarkastelluista aminohapoista vain treoniinin pitoisuuden

havaittiin alenevan merkitsevästi. Yleisenä vasteena suhteellisen ilmankosteuden kohoamiseen

ja erityisesti typen puutoksessa kasvattamiseen on useiden aminohappojen pitoisuuksien

havaittu alenevan kasvin lehdissä (Geiger ym. 1999, Scheible ym. 2004, Fritz ym. 2006).

Flavonoideista kversetiinin ja flavonoliglykosidin pitoisuus oli korkeampi kohotetussa kuin

alemmassa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvatetuissa rauduskoivun taimien lehdissä.

Flavonoidien ja fenolisten glykosidien tuotannon lisääntyminen kasveissa on yleinen vaste

ravinteiden puutokseen (Koricheva ym. 1998, Scheible ym. 2004, Amtmann & Armengaud

38

2009, Schlüter ym. 2013). Myös rauduskoivulla on osoitettu flavonoliglykosidien pitoisuuksien

nousevan typen puutteessa kasvatettuna (de la Rosa ym. 2001, Keski-Saari ym. 2005).

6.2 Kasvualustan kohotetun typpipitoisuuden vaikutus metaboliitteihin

Verrattuna suhteellisen ilmankosteuden vaikutuksiin, kasvualustan typpipitoisuuden kohotta-

misen vaikutukset rauduskoivujen lehtimetaboliaan olivat tässä pro gradu -tutkielmassa

tarkasteltuna suhteellisen vähäisiä, rajoittuen merkitseviin muutoksiin vain kolmen yhdisteen

pitoisuudessa. Kasvualustan kohotetussa typpipitoisuudessa kasvaneiden rauduskoivujen

lehdissä malaatin ja sukkinihapon pitoisuudet nousivat ja 3-trans-kumaryyli-kiinihapon pitoi-

suudet alenivat. Kasvualustan typpipitoisuuden on osoitettu vaikuttavan koivujen lehtien

metaboliaan ja metaboliittipitoisuuksiin (Keinänen ym. 1999, Keski-Saari & Julkunen-Tiitto

2003, Keski-Saari ym. 2005). Typpilannoituskokeissa on havaittu merkittäviä eroavaisuuksia

hiilen allokoinnissa eri metaboliareiteille ja kohdistamiseen esimerkiksi yksittäisiin fenolisiin

yhdisteisiin (Haukioja ym. 1998, Koricheva ym. 1998, Keinänen ym. 1999). Keski-Saari &

Julkunen-Tiitto (2003) havaitsivat typpilannoituksen alentavan hieskoivun (B. pubescens)

alalajin tunturikoivun (B. pubescens Erhr. ssp. czerepanovii (Orlova) Hämetahti) lehtien

fenolien, kuten flavonoidien ja tanniinien, pitoisuuksia. Myös rauduskoivulla typpilannoituksen

on todettu vaikuttavan lehtien fenolipitoisuuksiin muun muassa alentamalla eräiden flavonoi-

dien pitoisuuksia (Keinänen ym. 1999, Keski-Saari ym. 2005). Keinänen ym. (1999)

havaitsivat, että muun muassa 3-kumaryyli-kiinihappojen pitoisuudet alenivat rauduskoivun

lehdissä genotyypistä riippumatta vasteena kasvualustan kohotettuun lannoitukseen, mikä on

yhtenevä tulos tässä pro gradu -tutkielmassa tehtyjen havaintojen kanssa.

6.3 Rauduskoivun kasvu kammiokokeessa

Kohotettu suhteellinen ilmankosteus vaikutti tässä pro gradu -tutkielmassa tarkasteltuihin

rauduskoivujen kasvu- ja lehtien ominaisuuksiin lisäämällä taimien suhteellista pituus- ja

paksuuskasvua, sekä alentamalla lehden typpipitoisuutta ja klorofylli-indeksiä. Havaittu

rauduskoivun taimien suhteellisen pituus- ja paksuuskasvun lisääntyminen kohotetussa suhteel-

lisessa ilmankosteudessa on samansuuntainen vaste, mitä kasvihuoneessa kasvatettujen

kukkakasvien kasvua eri ilmankosteustasoilla selvittäneissä tutkimuksissa on havaittu

(Mortensen 1986, Gislerød & Nelson 1989, Gislerød & Mortensen 1990). Gislerød & Nelson

39

(1989) esittivät, että kasvin suhteellisen kasvun lisääntyminen korkeassa suhteellisessa ilman-

kosteudessa olisi seurausta ilmarakojen lisääntyneen aukiolon hiilidioksidin sitomista

edistävästä vaikutuksesta. Sidottu lisähiili voidaan käyttää biomassan tuotantoon eli kasvin

kasvuun. Suhteellisen ilmankosteuden kohoamisen on osoitettu hidastavan nestevirtausta

kasvin versossa (Tullus ym. 2012, Sellin ym. 2013), jolloin ravinteiden otto maaperästä vähe-

nee ja siten myös typpeä kuljetetaan lehtiin vähemmän, mikä johtaa lehtien typpipitoisuuden

alenemiseen. Myös Gislerød & Mortensen (1990) havaitsivat lehtien typpipitoisuuden alenevan

kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa. Keski-Saari & Julkunen-Tiitto (2003) havaitsivat,

että typpirajoitetulla kasvualustalla kasvatettuna koivunlehtien typpipitoisuus oli alhaisempi

kuin optimaalisella typpitasolla kasvatettuna. Lehtien klorofylli-indeksin aleneminen on yhtey-

dessä lehtien typpipitoisuuden alenemiseen (Geiger ym. 1999, Lu & Zhang 2000). Fotosyn-

teesin inhiboituminen typenpuutoksessa (Geiger ym. 1999, Lu & Zhang 2000, Lemoine ym.

2013) vähentää klorofyllisynteesiä, jolloin typpirajoitettua kasvua edustavissa kohotetussa

suhteellisessa ilmankosteudessa kasvatetuissa lehdissä klorofyllipitoisuus alenee.

Kun aiemmissa tutkimuksissa typenpuutetta on verrattu typen optimitasoon, on kasvualustan

korkeamman typpipitoisuuden havaittu lisäävän koivujen kasvua (Keski-Saari & Julkunen-

Tiitto 2003, Keski-Saari ym. 2005). Tässä tutkielmassa kasvualustan kohotetulla typpipitoisuu-

della ei havaittu merkitsevää vaikutusta tarkasteltuihin kasvuominaisuuksiin. Tämä toden-

näköisesti johtuu siitä, että nykyisessä koeasetelmassa kasvualustan typen optimitasoa verrat-

tiin typen ylimäärään (Lihavainen ym. 2016a). Myös kammiokokeen lyhyt kesto ja istutus-

aineksessa olleen typen lähtötaso ovat voineet vaikuttaa siihen, ettei kasvualustan typpi-

lisäyksen vaikutusta kasvuominaisuuksiin nähty.

6.4 Korrelaatio

Sokerialkoholeilla havaittiin positiivinen korrelaatio sekä lehden typpipitoisuuteen että kloro-

fylli-indeksiin, jolloin niillä koivuyksilöillä joilla sokerialkoholeja oli vähän, myös lehden

typpipitoisuus ja klorofylli-indeksi olivat alhaiset. Sitruunahappokierron välituotteiden positii-

vinen korrelaatio lehden klorofylli-indeksiin osoittaa, että niissä lehdissä joiden klorofylli-

indeksi oli alhainen, myös sitruunahappokierron välituotteita oli vähän. Negatiivinen korre-

laatio klorofylli-indeksin ja kversetiinin sekä flavonoliglykosidin välillä kertoo, että ne lehdet

joilla oli alhainen klorofylli-indeksi, sisälsivät paljon kyseisiä fenolisia yhdisteitä.

40

6.5 Kammiokoetulosten vertailu FAHM -kenttäkokeen tuloksiin

Kammiokokeen tulokset kertovat lyhyen ajan muutoksista nuoren rauduskoivun lehden meta-

boliassa ja taimen kasvussa vasteena käsittelyihin. FAHM (Free Air Humidity Manipulation) -

kenttäkokeessa rauduskoivuja ja hybridihaapoja oli istutettu sumutettuihin kenttiin, missä

suhteellista ilmankosteutta nostettiin keinotekoisesti sumuttamalla ilmaan vesihöyryä, sekä

sumuttamattomiin kenttiin jotka toimivat kontrollikenttinä (Kupper ym. 2011). Kammio- ja

kenttäkokeiden tulosten vertailussa tulee huomioida erot koeasetelmissa. Kenttäkokeesta on

kerätty kasvutilastoa useamman vuoden ajalta, ja rauduskoivut olivat jo kentälle istutettaessa

vanhempia (yhden vuoden, Kupper ym. 2011) kuin kammiokokeen rauduskoivut (kuusi

kuukautta, Lihavainen ym. 2016a). Kammiokokeessa rauduskoivut kasvoivat muun muassa

suhteellisen ilmankosteuden osalta hyvin vakioidussa ympäristössä, mutta kentällä herbivorian,

sääolojen ja muiden ympäristötekijöiden vaikutus lisää aineiston vaihtelua. Kammiokokeessa

on lisäksi mahdollista toteuttaa suurempi suhteellisen ilmankosteuden ero kuin kenttäkokeessa.

Koska suuri osa sumutetusta vedestä haihtuu avonaisella kentällä ympäristöön, ei suhteellista

ilmankosteutta voida kasvattaa kenttäolosuhteissa kuin rajallisesti. FAHM -kenttäkokeessa

suhteellinen ilmankosteus oli noin 7 prosenttiyksikköä suurempi sumutetuilla kuin sumuttamat-

tomilla kentillä (Kupper ym. 2011). Suljetussa kammiossa veden haihtuminen ympäristöön

voidaan puolestaan minimoida, ja kammiokokeessa käsittelyjen välinen suhteellisen ilmankos-

teuden ero oli 35 prosenttiyksikköä (Lihavainen ym. 2016a).

FAHM -kentällä kasvaneista neljännen kasvukauden rauduskoivuista ja hybridihaavoista on

tehty myös lehtinäytteiden metabolomiikka-analyysejä (Lihavainen ym. 2016b). Kenttä-

kokeessa sumutetuilla koekentillä eli kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvaneiden

rauduskoivujen lehdissä sikimihapon pitoisuudet olivat alhaisempia, ja sorbitolin, treonihapon

ja treonihappo-1,4-laktonin pitoisuudet olivat korkeampia kuin sumuttamattomilla koekentillä

eli luonnontasoisessa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvaneiden rauduskoivujen lehdissä

(Lihavainen ym. 2016b). Tässä pro gradu -tutkielmassa tarkasteltuna kammiokokeen kohote-

tussa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvaneiden rauduskoivujen lehdissä sikimihapon

pitoisuus aleni vastaavasti kuten kenttäkokeessa havaittiin, mutta sorbitolin, treonihapon ja

treonihappo-1,4-laktonin pitoisuudet alenivat. Lisäksi kammiokokeen kohotetussa suhteelli-

sessa ilmankosteudessa kasvattujen rauduskoivujen lehdissä havaittiin korkeampi

raffinoosipitoisuus ja matalammat glukoosin, myo-inositolin, sitruunahapon ja sukkinihapon

pitoisuudet verrattuna alhaisemmassa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvettujen rauduskoi-

vujen lehtien metaboliittipitoisuuksiin. Puolestaan FAHM -kenttäkokeesta kerätyissä

41

lehtinäytteissä edellä mainittujen metaboliittien pitoisuudet eivät eronneet rauduskoivun

lehdissä ilmankosteuskäsittelyjen välillä (Lihavainen ym. 2016b). Koeasetelmien toisistaan

poikkeava tulos voi selittyä kammiokokeen suuremmalla suhteellisen ilmankosteuden taso-

erolla sekä kammiokokeen lyhyellä kestolla. FAHM -kentällä kasvaneista rauduskoivuista oli

otettu metaboliatutkimuksissa analysoitavat lehtinäytteet neljäntenä käsittelykautena, jolloin

rauduskoivut ovat jo ehtineet monin tavoin sopeutua ympäristön stressitekijöihin eli korkeam-

paan suhteelliseen ilmankosteuteen sumutetuilla kentillä. Poikkeavuutta kammiokokeeseen

tuovat kentällä myös muiden muassa erilainen maannos, sääolojen luontaiset vaihtelut ja

herbivoria.

FAHM -kenttäkokeessa lyhyen ajan vasteena maanpäällinen kasvu hidastui sekä rauduskoi-

vulla että hybridihaavalla (Tullus ym. 2012, Sellin ym. 2013). Kasvuvasteen osalta

kenttäkokeen tulokset eroavat tässä pro gradu -tutkielmassa tarkastelluista kammiokokeen

tuloksista, jossa rauduskoivujen taimien kasvu kiihtyi korkeammassa suhteellisessa ilmankos-

teudessa kasvatettuna. Kohotetusta suhteellisesta ilmankosteudesta johtuva vähentynyt

haihdunta lehdissä (Fordham ym. 2001) vaikutti typen ottoon maaperästä niin, että kenttä-

kokeen ensimmäisinä vuosina rauduskoivun lehtien typpipitoisuus oli alhaisempi sumutetuilla

kuin sumuttamattomilla kentillä (Sellin ym. 2013). Tältä osin tulos on samansuuntainen, mitä

tässä pro gradu -tutkielmassa kammiokokeen rauduskoivuilla havaittiin. Kenttäkokeen neljän-

tenä käsittelyvuotena rauduskoivujen lehtien typpipitoisuus ei kuitenkaan enää eronnut sumu-

tettujen ja sumuttamattomien kenttien välillä (Lihavainen ym. 2016b), toisin sanoen sumute-

tuilla kentillä lehtien typpipitoisuus oli palautunut lähtötasolle, eli sen osalta rauduskoivuilla

havaittiin sopeutumista korkeampaan suhteelliseen ilmankosteuteen.

7 JOHTOPÄÄTÖKSET

Lyhytkestoisessa kammiokokeessa Vehmersalmi 14 -genotyyppiä edustavien rauduskoivujen

(Betula pendula Roth) mikrolisäyksellä tuotetut kuuden kuukauden ikäiset taimet altistettiin

suhteellisen ilmankosteuden ja kasvualustan typpipitoisuuden kahdelle eri tasolle. Tässä pro

gradu -tutkielmassa tarkasteltiin, kuinka edellä mainitut muuttujat vaikuttivat kammiokokeen

aikana kasvaneiden rauduskoivun lehtien metaboliaan sekä koivuntaimien kasvuun ja lehtien

ominaisuuksiin. Suhteellisen ilmankosteuden kohottamisella havaittiin olevan voimakas

vaikutus lehtien metaboliaan. Rauduskoivulla esiintyvien primaari- ja sekundaarimetaboliittien

pitoisuusmuutosten vasteet suhteellisen ilmankosteuden muutokseen vaihtelivat yhdiste-

ryhmien sisällä yhdisteestä riippuen, eivätkä vasteet olleet aina samalla metaboliareitilläkään

42

yhdenmukaisia. Useiden sokereiden, sokerialkoholien ja orgaanisten happojen sekä β-sitoste-

rolin ja salidrosidin pitoisuuden alenivat, ja raffinoosin, kversetiinin ja flavonoliglykosidin

pitoisuudet nousivat kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvatettujen rauduskoivujen

lehdissä. Metaboliamuutokset kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa osoittivat, ettei

typensidonta toiminut yhtä tehokkaasti kuin hiilensidonta. Useissa tutkimuksissa on osoitettu,

että korkean suhteellisen ilmankosteuden vaikutuksesta ravinteiden kuljetus kasvissa vähenee.

Myös tässä tutkimuksessa havaittiin, että kasvatus korkeassa suhteellisessa ilmankosteudessa

ilmensi kasveissa typpirajoitettua kasvua ja typen puutosta metaboliamuutosten suhteen.

Kasvualustan kohotetussa typpipitoisuudessa kasvatettujen rauduskoivujen lehdissä

malaatin ja sukkinihapon pitoisuudet nousivat ja 3-trans-kumaryyli-kiinihapon pitoisuus aleni

verrattuna alemmassa typpipitoisuudessa kasvatettujen rauduskoivujen lehtien metaboliitti-

pitoisuuksiin. Kasvualustan typpilisän vaikutukset lehtien metaboliaan olivat siten määrällisesti

vähäisempiä kuin mitä kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa kasvaneiden raudus-

koivujen lehdissä havaittiin. On mahdollista, että kokeen lyhyt kesto ja istutusaineksen typen

lähtötaso ovat heikentäneet kasvualustan kohotetun typpilisän vaikutusta metaboliamuutoksiin.

Suhteellisen ilmankosteuden kohottamisella oli voimakas vaikutus myös tutkielmassa

tarkasteltuihin koivuntaimen kasvu- ja lehtien ominaisuuksiin. Koivuntaimien kasvu kiihtyi

korkeammassa suhteellisessa ilmankosteudessa, mikä voi johtua hiiliylimäärän lisääntyneestä

allokoinnista biomassan tuotantoon typpirajoitetuissa olosuhteissa. Lehden typpipitoisuuden ja

klorofylli-indeksin aleneminen kohotetussa suhteellisessa ilmankosteudessa osoitti kasvien

rajoittunutta typen ottoa. Tämä pro gradu -tutkimus osoittaa suhteellisen ilmankosteuden

olevan hyvin tärkeä tekijä, joka vaikuttaa hiilen ja typen allokaatioon sekä metaboliaan

kasveissa.

Tässä pro gradu -tutkimuksessa analysoitujen näytteiden ja tutkielmassa tarkasteltavien

metaboliittien lukumäärä oli rajattu vastaamaan tutkielman laajuutta. Tarkastelujoukkoa

kasvattamalla saataisiin kattavampia tuloksia ja voitaisiin keskustella laajemmin tutkimus-

asetelmassa käytettyjen muuttujien (suhteellinen ilmankosteus ja kasvualustan typpipitoisuus)

vaikutuksesta Vehmersalmi 14 -genotyyppiä edustavien rauduskoivujen metaboliaan. Laajen-

tamalla metabolian tutkimista esimerkiksi entsyymi- ja transkriptiotasolle saataisiin moni-

puolisempia, mutta myös monimutkaisempia, tuloksia sekä havaittaisiin selkeämpiä yhteyksiä

reaktioreittien välillä. Käyttämällä tutkimuksessa useampaa genotyyppiä, voitaisiin tässä tutki-

muksessa saatuja tuloksia paremmin yleistää koskemaan laajempaa koivupopulaatiota.

Kasveissa on lisäksi muitakin syntetisoivia osia kuin lehdet. Juuriston ja rungon sisältämien

yhdisteiden sekä fenologisten rakenteiden muutosten tutkimus vasteena ilmastonmuutoksen

43

stressitekijöihin on yhtä lailla tärkeää kuin lehtien metabolian tutkiminen, jotta voisimme

laajemmin ymmärtää ilmastonmuutoksen stressitekijöiden kokonaisvaikutuksia kasvien sopeu-

tumiseen muuttuvassa ympäristössä.

8 KIITOKSET

Suuret kiitokset ohjaajilleni Jenna Lihavaiselle GC-MS -laitteiston käytön opastuksesta, tove-

ruudesta laboratoriossa sekä monipuolisesta ohjauksesta tilastomenetelmien parissa kamp-

paillessani, Sarita Keski-Saarelle täsmällisistä vinkeistä ja kommenteista, joiden avulla tutkiel-

man sisältöä on useaan otteeseen paranneltu sekä Sari Kontunen-Soppelalle kärsivällisyydestä

ja tuesta henkilökohtaisten vaikeuksieni tiellä. Tutkimuksen rahoitus oli saatu Suomen Akate-

mialta ja se oli myönnetty Elina Oksasen tutkimusprojektiin (projekti nro 250636). Kiitos

Hannele Hakuliselle, joka toteutti kammiokoivujen mikrolisäyksen. Kiitos myös Metsätieteen

laitokselle, jossa kammiokokeessa käytetyt kasvukammiot sijaitsivat. Lisäksi haluan kiittää

opiskelutovereitani ja läheisiä ystäviäni vertaistuesta ja kanssakulkemisesta opintovuosieni

aikana.

KIRJALLISUUSLUETTELO

Akula, R., Ravishankar, G.A. 2011: Influence of abiotic stress signals on secondary

metabolites in plants. – Plant Signaling & Behavior 6: 1720-1731.

Amtmann, A., Armengaud, P. 2009: Effects of N, P, K and S on metabolism: new knowledge

gained from multi-level analysis. – Current Opinion in Plant Biology 12: 275-283.

Barchet, G.L.H., Dauwe, R., Guy, R.D., Schroeder, W.R., Soolanayakanahally, R.Y.,

Campbell, M.M., Mansfield, G.S. 2013: Investigating the drought stress response of hybrid

poplar genotypes by metabolite profiling. – Tree Physiology 34: 1203-1219.

Bi, J.L., Felton, G.W. 1995: Foliar oxidative stress and insect herbivory: Primary compounds,

secondary metabolites, and reactive oxygen species as components of induced resistance.

– Journal of Chemical Ecology 21: 1511-1530.

Buchanan, B.B., Gruissem, W. & Jones, R. 2015: Biochemistry and Molecular Biology of

Plants. – 1264 s. John Wiley & Sons, Singapore.

Bylesjö, M., Segura, V., Soolanayakanahally, R.Y., Rae, A.M., Trygg, J., Gustafsson, P.,

Jansson, S., Street, N.R. 2008: LAMINA: a tool for rapid quantification of leaf size and

shape parameters. – BMC Plant Biology 8: 82.

Chen, T.-I., Dai, R. 2015: Chapter 6: Metabolomics data processing based on mass

spectrometry platforms. – Teoksessa: Qi, X., Chen, X. & Wang, Y. (toim.): Plant

Metabolomics: Methods and Applications: 123-169. Springer Netherlands, Dortrecht.

de la Rosa, T.M., Julkunen-Tiitto, R., Lehto, T., Aphalo, P.J. 2001: Secondary metabolites

and nutrient concentrations in silver birch seedlings under five levels of daily UV-B

exposure and two relative nutrient addition rates. – New Phytologist 150: 121-131.

Disraeli, B. 1996: General summary statistics: Lies, damned lies and statistics. – Teoksessa:

Upton, G. & Cook, I. (toim.): Understanding Statistics: 36-83. Oxford University Press,

Lontoo.

Duan, L.-X., Qi, X. 2015: Chapter 7: Metabolite qualitative methods and the introduction of

metabolomics database. – Teoksessa: Qi, X., Chen, X. & Wang, Y. (toim.): Plant

Metabolomics: Methods and Applications: 171-193. Springer Netherlands, Dortrecht.

44

Dumschott, K., Richter, A., Loescher, W., Merchant, A. 2017: Post photosynthetic carbon

partitioning to sugar alcohols and consequences for plant growth. – Phytochemistry 144:

243-252.

Fiehn, O., Kopka, J., Dörmann, P., Altmann, T., Trethewey, R.N., Willmitzer, L. 2000:

Metabolite profiling for plant functional genomics. – Nature Biotechnology 18: 1157-1161.

Fordham, M.C., Harrison-Murray, R.S., Knight, L., Evered, C.E. 2001: Effects of leaf wetting

and high humidity on stomatal function in leafy cuttings and intact plants of Corylus

maxima. – Physiologia Plantarum 113: 233-240.

Fritz, C., Mueller, C., Matt, P., Feil, R., Stitt, M. 2006: Impact of the C-N status on the amino

acid profile in tobacco source leaves. – Plant, Cell and Environment 29: 2055-2076.

Geiger, M., Haake, V., Ludewig, F., Sonnewald, U., Stitt, M. 1999: The nitrate and

ammonium nitrate supply have a major influence on the response of photosynthesis,

carbon metabolism, nitrogen metabolism and growth to elevated carbon dioxide in

tobacco. – Plant, Cell and Environment 22: 1177-1199.

Gislerød, H.R., Nelson, P.V. 1989: The interaction of relative air humidity and carbon dioxide

enrichment in the growth of Chrysanthemum × morifolium Ramat. – Scientia Horticulturae

38: 305-313.

Gislerød, H.R., Mortensen, L.M. 1990: Relative Humidity and Nutrient Concentration Affect

Nutrient Uptake and Growth of Begonia × hiemalis. – HortScience 25: 524-526.

Godbold, D., Tullus, A., Kupper, P., Sõber, J., Ostonen, I., Godbold, J. A., Lukac, M.,

Ahmed, I.U., Smith, A.R. 2014: Elevated atmospheric CO2 and humidity delay leaf fall in

Betula pendula, but not in Alnus glutinosa or Populus tremula×tremuloides. – Annals of

Forest Science 71: 831-842.

Hartley, S.E., Firn, R.D. 1989: Phenolic biosynthesis, leaf damage, and insect herbivory in

birch (Betula pendula). – Journal of Chemical Ecology 15: 275-283. Haukioja, E., Ossipov, V., Koricheva, J., Honkanen, T., Larsson, S., Lempa, K. 1998:

Biosynthetic origin of carbon-based secondary compounds: cause of variable responses of

woody plants to fertilization? – Chemoecology 8: 133-139.

Hill, C. B., Roessner, U. 2013: Metabolic Profiling of Plants by GC-MS. – Teoksessa:

Weckwerth, W. & Kahl, G. (toim.): The Handbook of Plant Metabolomics: 3-23. Wiley-

VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Singapore.

Hiller, K., Hangebrauk, J., Jäger, C., Spura, J., Schreiber, K., Schomburg, D. 2009:

MetaboliteDetector: Comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS

based metabolome analysis. – Analytical Chemistry 81: 3429-3439.

Hummel. J., Strehmel, N., Selbig, J., Walther, D., Kopka, J. 2010: Decision tree supported

substructure prediction of metabolites from GC-MS profiles. – Metabolomics 6: 322-333.

Hynynen, J. Niemistö, P., Viherä-Aarnio, A., Brunner, A., Hein. S., Velling, P. 2010:

Silviculture of birch (Betula pendula Roth and Betula pubescens Ehrh.) in northern

Europe. – Forestry 83: 103-119.

Ilmatieteenlaitos 2017: Teematietoa: Sääennuste: Tunne termit - ymmärrä säätiedotus: Ilman

kosteus: http://ilmatieteenlaitos.fi/ilman-kosteus 12.10.2017.

Jaagus, J., Mändla, K. 2014: Climate change scenarios for Estonia based on climate models

from the IPCC Fourth Assessment Report. – Estonian Journal of Earth Sciences 63: 166-

180.

Jylhä, K., Tuomenvirta, H., Ruosteenoja, K. 2004: Climate change projections for Finland

during the 21st century. – Boreal Environment Research 9: 127-152.

Keinänen, M., Julkunen-Tiitto, R., Mutikainen, P., Walls, M., Ovaska, J., Vapaavuori, E.

1999: Trade-offs in phenolic metabolism of silver birch: Effects of fertilization, defoliation

and genotype. – Ecology 80: 1970-1986.

45

Keski-Saari, S., Julkunen-Tiitto, R. 2003: Resource allocation in different parts of juvenile

mountain birch plants: effect of nitrogen supply on seedling phenolics and growth.

– Physiologia Plantarum 118: 114-126.

Keski-Saari, S., Pusenius, J., Julkunen-Tiitto, R. 2005: Phenolic compounds in seedlings of

Betula pubescens and B. pendula are affected by enhanced UVB radiation and different

nitrogen regimens during early ontogeny. – Global Change Biology 11: 1180-1194.

Kont, A., Jaagus, J., Aunap, R. 2003: Climate change scenarios and the effect of sea-level rise

for Estonia. – Global and Planetary Change 36: 1-15.

Kopka, J., Schauer, N., Krueger, S., Birkemeyer, C., Usadel, B., Bergmüller, E., Dörmann, P.,

Weckwerth, W., Gibon, Y., Stitt, M., Willmitzer, L., Fernie, A.R., Steinhauser, D. 2004: GMD@CSB.DB: the Golm Metabolome Database. – Bioinformatics 21: 1635-1638.

Koricheva, J., Larsson, S., Haukioja, E., Keinänen, M. 1998: Regulation of woody plant

secondary metabolism by resource availability: hypothesis testing by means of meta-

analysis. – Oikos 83: 212-226.

Krapp, A. 2015: Plant nitrogen assimilation and its regulation: a complex puzzle with missing

pieces. – Current Opinion in Plant Biology 25: 115-122.

Kupper, P., Sõber, J., Sellin, A., Lõhmus, K., Tullus, A., Räim, O., Lubenets, K., Tulva, I.,

Uri, V., Zobel, M., Kull, O., Sõber, A. 2011: An experimental facility for free air humidity

manipulation (FAHM) can alter water flux through deciduous tree canopy.

– Environmental and Experimental Botany 72: 432-438.

Kurepa, J., Shull, T.E., Smalle, J.A 2016: Quercetin feeding protects plants against oxidative

stress. – F1000Research 5: 2430. DOI: 10.12688/f1000research.9659.1

Kutchan, T.M., Gershenzon, J., Møller, B.L, Gang, D.R. 2015: Chapter 24: Natural products.

– Teoksessa: Buchanan, B.B., Gruissem, W. & Jones, R. (toim): Biochemistry and

Molecular Biology of Plants: 1132-1206. John Wiley & Sons, Singapore.

Lalonde, S., Wipf, D., Frommer, W.B. 2004: Transport mechanisms for organic forms of

carbon and nitrogen between source and sink. – Annual Review of Plant Biology 55: 341-

372.

Lavola, A. 1998: Accumulation of flavonoids and related compounds in birch induced by

UV-B irradiance. – Tree Physiology 18: 53-58.

Lavola, A., Julkunen-Tiitto, R., de la Rosa, T.M., Lehto, T., Aphalo, P.J. 2000: Allocation of

carbon to growth and secondary metabolites in birch seedlings under UV-B radiation and

CO2 exposure. – Physiologia Plantarum 109: 260-267.

Lemoine, R., La Camera, S., Atanassova, R., Dédaldéchamp, F., Allario, T., Pourtau, N.,

Bonnemain, J.-L., Laloi, M., Coutos-Thévenot, P., Maurousset, L., Faucher, M., Girousse,

C., Lemonnier, P., Parrilla, J., Durand, M. 2013: Source-to-sink transport of sugar and

regulation by environmental factors. – Frontiers in Plant Science 4: 272.

DOI: 10.3389/fpls.2013.00272.

Lihavainen, J., Ahonen, V., Keski-Saari, S., Kontunen-Soppela, S., Oksanen, E., Keinänen,

M. 2016a: Low vapour pressure deficit affects nitrogen nutrition and foliar metabolites in

silver birch. – Journal of Experimental Botany 67: 4353-4365.

Lihavainen, J., Keinänen, M., Keski-Saari, S., Kontunen-Soppela, S., Sõber, A., Oksanen, E.

2016b: Artificially decreased vapour pressure deficit in field conditions modifies foliar

metabolite profiles of birch and aspen. – Journal of Experimental Botany 67: 4367-4378.

Lu, C., Zhang, J. 2000: Photosynthetic CO2 assimilation, chlorophyll fluorescence and

photoinhibition as affected by nitrogen deficiency in maize plants. – Plant Science 151:

135-143.

Maeda, H., Dudareva, N. 2012: The shikimate pathway and aromatic amino acid biosynthesis

in plants. – Annual Review of Plant Biology 63: 73-105.

46

Martemyanov, V.V., Pavlushin, S.V., Dubovskiy, I.M., Belousova, I.A., Yushkova, Y.V.,

Morosov, S.V., Glupov, V.V. 2015: Leaf surface lipophilic compounds as one of the

factors of silver birch chemical defense against larvae of gypsy Moth. – PloS one 10(3):

e0121917. DOI: 10.1371/journal.pone.0121917.

Merchant, A., Richter, A.A. 2011: Polyols as biomarkers and bioindicators for 21st century

plant breeding. – Functional Plant Biology 38: 934-940.

Mewis, I., Schreiner, M., Nguyen, C.N., Krumbein, A., Ulrichs, C., Lohse, M., Zrenner, R.

2012: UV-B Irradiation Changes Specifically the Secondary Metabolite Profile in Broccoli

Sprouts: Induced Signaling Overlaps with Defense Response to Biotic Stressors. – Plant

and Cell Physiology 53: 1546-1560.

Mortensen, L.M. 1986: Effect of relative humidity on growth and flowering of some

greenhouse plants. – Scientia Horticulturae 29: 301-307.

Paul, M.J., Driscoll, S.P. 1997: Sugar repression of photosynthesis: the role of carbohydrates

in signaling nitrogen deficiency through source:sink imbalance. – Plant, Cell and

Environment 20: 110-116.

Ranta, E., Rita, H. & Kouki, J. 1994: Biometria – tilastotiedettä ekologeille. – 569 s.

Yliopistopaino, Helsinki.

Richardson, A.D., Duigan, S.P., Berlyn, G.P. 2002: An evaluation of noninvasive methods to

estimate foliar chlorophyll content. – New Phytologist 153: 185-194.

Rosenvald, K., Tullus, A., Ostonen, I., Uri, V., Kupper, P., Aosaar, J., Varik, M., Sõber, J.,

Niglas, A., Hansen, R., Rohula, G., Kukk, M., Sõber, A., Lõhmus, K. 2014: The effect of

elevated air humidity on young silver birch and hybrid aspen biomass allocation and

accumulation – Acclimation mechanisms and capacity. – Forest Ecology and Management

330: 252-260.

Schauer, N., Steinhauser, D., Strelkov, S., Schomburg, D., Allison, G., Moritz, T., Lundgren,

K., Roessner-Tunali, U., Forbes, M.G., Willmitzer, L., Fernie, A.R., Kopka, J. 2005: GC-

MS libraries for the rapid identification of metabolites in complex biological samples.

– FEBS Letters 579: 1332-1337.

Scheible, W-R, Gonzalez-Fontes, A., Lauerer, M., Müller-Röber, B., Caboche, M., Stitt, M.

1997: Nitrate acts as a signal to induce organic acid metabolism and repress starch

metabolism in tobacco. – The Plant Cell 9: 783-798.

Scheible, W-R., Morcuende, R., Czechowski, T., Fritz, C., Osuna, D., Palacios-Rojas, N.,

Schindelasch, D., Thimm, O., Udvardi, M.K., Stitt, M. 2004: Genome-Wide

Reprogramming of Primary and Secondary Metabolism, Protein Synthesis, Cellular

Growth Processes, and the Regulatory Infrastructure of Arabidopsis in Response to

Nitrogen. – Plant Physiology 136: 2483-2499.

Schlüter, U., Mascher, M., Colmsee, C., Scholz, U., Bräutigam, A., Fahnenstich, H.,

Sonnewald, U. 2012: Maize source leaf adaptation to nitrogen deficiency affects not only

nitrogen and carbon metabolism but also control of phosphate homeostasis. – Plant

Physiology 160: 1384-1406.

Schlüter, U., Colmsee, C., Scholz, U., Bräutigam, A., Weber, A.P.M., Zellerhoff, N., Bucher,

M., Fahnenstich, H., Sonnewald, U. 2013: Adaptation of maize source leaf metabolism to

stress related disturbances in carbon, nitrogen and phosphorus balance. – BMC Genomics

14: 442. DOI: 10.1186/1471-2164-14-442.

Schreiner, M., Mewis, I., Huyskens-Keil, S., Jansen, M.A.K., Zrenner, R., Winkler, J.B.,

O’Brien, N., Krumbein, A. 2012: UV-B-Induced Secondary Plant Metabolites - Potential

Benefits for Plant and Human Health. – Critical Reviews in Plant Sciences 31: 229-240.

Sellin, A., Tullus, A., Niglas, A., Õunapuu, E., Karusion, A., Lõhmus, K. 2013: Humidity-

driven changes in growth rate, photosynthetic capacity, hydraulic properties and other

functional traits in silver birch (Betula pendula). – Ecological Research 28: 523-535.

47

Sellin, A., Rosenvald, K., Õunapuu-Pikas, E., Tullus, A., Ostonen, I., Lõhmus, K. 2015:

Elevated air humidity affects hydraulic traits and tree size but not biomass allocation in

young silver birches (Betula pendula). – Frontiers in Plant Science 6: 860-871.

Sellin, A., Alber, M., Keinänen, M., Kupper, P., Lihavainen, J., Lõhmus, K., Oksanen, E.,

Sõber, A., Sõber, J., Tullus, A. 2017: Growth of northern deciduous trees under increasing

atmospheric humidity: possible mechanisms behind the growth retardation. – Regional

Environment Change 17: 2135-2148.

Sprenger, N., Keller, F. 2001: Allocation of raffinose family oligosaccharides to transport and

storage pools in Ajuga reptans: The roles of two distinct galactinol synthases. – Plant

Journal 21: 249-258.

Stocker, T.F., Qin, D., Plattner, G-K., Tignor, M., Allen, S.K., Boschung, J., Nauels, A., Xia,

Y., Bex, V. & Midgley, P.M.: IPCC 2013: Climate Change 2013: The Physical Science

Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the

Intergovernmental Panel on Climate Change. – 1535 s. Cambridge University Press,

Cambridge. DOI: 10.1017/CBO9781107415324.

Sweetlove, L.J., Fernie, A.R. 2013: The Spatial Organization of Metabolism within the Plant

Cell. – Annual Review of Plant Biology 64: 723-746.

Taiz, L. & Zeiger, E. 2012: Plant Physiology and Development. – 778 s. Sinauer Associates

Inc., Yhdysvallat.

Tullus, A., Kupper, P., Sellin, A., Parts, L., Sõber, J, Tullus, T., Lõhmus, K., Sõber, A.,

Tullus, H. 2012: Climate change at northern latitudes: Rising atmospheric humidity

decreases transpiration, N-uptake and growth rate of hybrid aspen. – PLoS One 7(8):

e42648. DOI: 10.1371/journal.pone.0042648.

Tullus, A., Sellin, A., Kupper, P., Lutter, R., Pärn, L., Jasińska, A.K., Alber, M., Kukk, M.,

Tullus, T., Tullus, H., Lõhmus, K., Sõber, A. 2014: Increasing air humidity – a climate

trend predicted for northern latitudes – alters the chemical composition of stemwood in

silver birch and hybrid aspen. – Silva Fennica 48: 1-16.

Viherä-Aarnio, A. 2008: Koivun biologiset ja metsänhoidolliset ominaisuudet. – Teoksessa:

Niemistö, P., Viherä-Aarnio, A., Velling, P., Heräjärvi, H. & Verkasalo, E. (toim): Koivun

kasvatus ja käyttö: 20-30. Metsäntutkimuslaitos, Metsäkustannus. Karisto Oy,

Hämeenlinna.

Worley, B., Powers, R. 2013: Multivariate analysis in metabolomics. – Current Metabolomics

1: 92-107.

Xue, Z., Duan, L.-X., Qi, X. 2015: Gas Chromatography Mass Spectrometry coupling

techniques. – Teoksessa: Qi, X., Chen, X. & Wang, Y. (toim.): Plant Metabolomics:

Methods and Applications: 25-44. Springer Netherlands, Dortrecht.

Zar, J.H. 1999: Biostatistical analysis. – 663 s. Prentice Hall, Upper Saddle River.

LIITTEET

LIITE 1, 3 sivua

Taulukko L1. Analysoidut ja identifioidut metaboliitit, kvantifiointi-ioni, retentioindeksi, retentioaika

(min), käsittely (C = RH60 N35, N = RH60 N70, H = RH95 N35, HN = RH95 N70), havaintoyksiköiden

lukumäärä (n) käsittelyittäin (C, H, HN: n ≤ 10, N: n ≤ 11), metaboliitin pitoisuuksien normalisoitujen

arvojen keskiarvo (ka.) ja keskiarvon keskivirhe (SE).

1

LIITE 1

Taulukko L1. Analysoidut ja identifioidut metaboliitit, kvantifiointi-ioni, retentioindeksi, retentioaika

(min), käsittely (C = RH60 N35, N = RH60 N70, H = RH95 N35, HN = RH95 N70), havaintoyksiköiden

lukumäärä (n) käsittelyittäin (C, H, HN: n ≤ 10, N: n ≤ 11), metaboliitin pitoisuuksien normalisoitujen

arvojen keskiarvo (ka.) ja keskiarvon keskivirhe (SE).

Metaboliitti Kvantifi-

ointi-ioni

Retentio-

indeksi

Retentio-

aika (min)

Käsittely n ka. SE

Fruktoosi*

[Fructose (1MEOX)

(5TMS)] MP + BP

307

1874,48

1881,20

23,03

23,15

C

N

H

HN

10

11

10

10

6,28

7,63

5,94

5,95

0,75

0,86

0,58

0,40

Galaktoosi

Galactose (1MEOX)

(5TMS) MP

319

1892,53

23,35

C

N

H

HN

10

11

9

9

0,94

0,66

0,49

0,50

0,19

0,17

0,13

0,12

Glukoosi*

[Glucose (1MEOX)

(5TMS)] MP + BP

160

1898,14

1917,82

23,44

23,76

C

N

H

HN

10

11

10

10

12,51

5,55

3,51

3,09

4,32

1,68

1,37

1,34

Maltoosi

Maltose (1MEOX)

(8TMS) MP

361

2738,36

35,19

C

N

H

HN

3

8

6

5

0,38

0,40

0,38

0,29

0,21

0,09

0,04

0,06

Raffinoosi

Raffinose (11TMS)

361

3388,05

42,13

C

N

H

HN

10

11

10

9

0,63

0,30

0,77

0,94

0,21

0,09

0,18

0,19

Sakkaroosi

Sucrose (8TMS)

361

2640,36

34,03

C

N

H

HN

10

11

10

10

615,24

638,91

586,26

494,72

34,25

39,49

23,93

36,73

Sedoheptuloosi*

Sedoheptulose 1 + 2

319

2135,56

2141,24

27,18

27,26

C

N

H

HN

10

11

10

10

8,59

5,10

3,83

3,44

1,76

1,54

1,20

1,08

myo-inositoli

Inositol, myo- (6TMS)

305

2092,34

26,53

C

N

H

HN

10

11

10

10

114,84

116,40

71,54

66,99

6,80

9,10

2,70

2,11

Ribitoli

Ribitol (5TMS)

217

1728,75

20,49

C

N

H

HN

10

11

10

10

0,40

0,42

0,27

0,33

0,04

0,05

0,04

0,04

Sorbitoli

Sorbitol (6TMS)

319

1940,08

24,12

C

N

H

HN

10

11

10

10

1,02

1,06

0,88

0,84

0,09

0,09

0,08

0,07

Gallushappo

Gallic acid (4TMS)

458

1953,10

24,33

C

N

H

HN

10

11

9

10

0,46

0,44

0,47

0,46

0,05

0,06

0,06

0,08

2

Kiinihappo

Quinic acid (4TMS)

345

1860,61

22,80

C

N

H

HN

10

11

10

10

746,59

710,60

762,40

753,37

29,76

38,44

36,29

28,67

Malaatti

Malic acid (3TMS)

223

1488,65

15,90

C

N

H

HN

10

11

10

10

7,90

10,09

5,30

6,99

1,03

0,65

0,59

0,72

Sikimihappo

Shikimic acid (4TMS)

204

1812,14

21,97

C

N

H

HN

10

10

9

7

1,37

1,39

0,81

1,05

0,20

0,17

0,11

0,12

Sitruunahappo

Citric acid (4TMS)

273

1819,47

22,10

C

N

H

HN

10

11

10

10

27,98

30,16

17,88

22,34

4,67

3,34

5,24

2,75

Sukkinihappo

Succinic acid (2TMS)

247

1312,36

12,20

C

N

H

HN

10

11

10

10

0,41

0,61

0,35

0,44

0,04

0,05

0,03

0,05

Treonihappo

Threonic acid (4TMS)

292

1562,80

17,37

C

N

H

HN

10

11

10

10

2,05

2,47

1,48

1,50

0,30

0,18

0,17

0,16

Treonihappo-1,4-laktoni

Threonic acid 1,4-lactone

247

1370,43

13,44

C

N

H

HN

10

11

10

10

0,82

0,93

0,55

0,61

0,10

0,06

0,03

0,06

Alaniini

Alanine (2TMS)

116

1100,00

7,63

C

N

H

HN

10

10

10

9

0,36

0,35

0,24

0,31

0,05

0,04

0,04

0,04

Asparagiinihappo

Aspartic acid (3TMS)

232

1519,19

16,56

C

N

H

HN

9

9

7

7

0,14

0,15

0,16

0,17

0,03

0,02

0,03

0,03

Glutamiini*

[Glutamine (–H2O) 2TMS]

MP + BP

155

1418,93

1471,83

14,46

15,56

C

N

H

HN

9

11

6

8

1,84

2,27

0,98

1,53

0,37

0,38

0,32

0,54

Glutamiinihappo

Glutamic acid (3TMS)

246

1620,66

18,49

C

N

H

HN

10

11

10

10

0,49

0,50

0,78

0,48

0,10

0,10

0,12

0,11

Treoniini

Threonine (2TMS)

117

1285,58

11,76

C

N

H

HN

10

11

10

10

1,36

1,40

0,78

0,85

0,25

0,29

0,23

0,15

Valiini

Valine (2TMS)

144

1213,65

10,05

C

N

H

HN

10

10

5

10

0,15

0,17

0,13

0,17

0,02

0,01

0,01

0,02

3

β-sitosteroli

Sitosterol, beta (1TMS)

396

3340,67

41,71

C

N

H

HN

10

11

10

10

0,50

0,57

0,45

0,46

0,05

0,04

0,03

0,03

α-tokoferoli

Tocopherol, alpha-

(1TMS)

502

3135,90

39,62

C

N

H

HN

10

11

10

10

1,01

0,99

0,88

0,89

0,12

0,09

0,07

0,05

Kversetiini

Quercetin (5TMS)

647

3180,98

40,11

C

N

H

HN

10

11

10

10

1,08

0,86

1,47

1,27

0,17

0,14

0,16

0,28

Katekiini

Catechin (5TMS)

368

2880,38

36,85

C

N

H

HN

10

11

10

10

15,93

16,14

14,86

13,08

1,33

1,37

1,15

1,08

Epikatekiini

Epicatechin (6TMS)

368

2855,01

36,56

C

N

H

HN

8

11

10

9

0,37

0,42

0,37

0,36

0,06

0,03

0,03

0,03

Epigallokatekiini

Epigallocatechin (6TMS)

456

2920,51

37,30

C

N

H

HN

10

11

10

10

14,04

12,51

13,36

14,03

0,92

1,43

1,09

1,38

Flavonoliglykosidi

Flavonol glycoside

647

3685,60

45,15

C

N

H

HN

10

6

7

7

2,52

1,29

4,08

3,03

0,71

0,44

0,71

0,98

Salidrosidi

Salidroside (5TMS)

193

2764,74

35,52

C

N

H

HN

10

11

10

10

3,35

3,21

2,48

2,75

0,29

0,32

0,13

0,13

Klorogeenihappo

Quinic acid, 3-caffoyl-,

trans- (6TMS)

345

3117,38

39,44

C

N

H

HN

10

11

10

10

1,80

1,54

1,57

1,19

0,36

0,22

0,25

0,19

3-cis-kumaryyli-kiini-

happo

Quinic acid, 3-coumaroyl-,

cis- (5TMS)

345

2852,20

36,53

C

N

H

HN

10

11

10

10

0,75

0,80

1,00

0,78

0,05

0,09

0,08

0,08

3-trans-kumaryyli-

kiinihappo

Quinic acid, 3-coumaroyl-,

trans- (5TMS)

345

2952,54

37,62

C

N

H

HN

10

9

10

10

2,21

1,76

2,84

1,89

0,33

0,20

0,28

0,33

5-trans-kumaryyli-

kiinihappo

Quinic acid, 5-coumaroyl-,

trans- (5TMS)

345

3069,40

38,93

C

N

H

HN

10

11

10

9

0,61

0,50

0,54

0,49

0,06

0,07

0,06

0,05

* Glutamiinin, fruktoosin, glukoosin ja sedoheptuloosin pitoisuudet ovat yhdistelmä kahdesta piikistä,

joilla on läheinen retentioindeksi ja jotka eluoituvat läheisillä retentioajoilla. Molemman piikin retentio-

indeksi ja -aika on ilmoitettu. Pitoisuuden tarkastelua varten näiden yhdisteiden piikkien pinta-alat

laskettiin yhteen ja niitä käsiteltiin tuloksissa yksittäisenä yhdisteenä.