Am-s

FACULDADE DE FARMCIA

UNIVERSIDADE DE LISBOA

Estudos de estabilidade por HPLC de

um composto hbrido para o tratamento

do glioma

Relatrio da Unidade Curricular de Projecto II

Julho, 2014

Ana Sofia Cruz Fernandes Ferreira

Orientador: Professora Doutora Maria Eduarda Mendes

Co-orientador: Professora Doutora Maria de Jesus Perry

ii

RESUMO

A temozolomida (TMZ) o principal agente antitumoral para gliomas. um

triazeno alquilante do cido desoxirribonucleico (DNA) e, devido sua lipofilia, tem duas

caratersticas que o tornam num antitumoral de eleio: pode ser administrado

oralmente e capaz de atravessar a barreira hemato-enceflica. No entanto, a eficcia

teraputica frequentemente dececionante, devido em grande parte, falta de

seletividade para clulas tumorais, baixa concentrao do frmaco no local de ao e

ocorrncia de resistncias do tumor ao tratamento. importante desenvolver

abordagens teraputicas alternativas.

Os inibidores das deacetilases de histonas (iHDAC) tm vindo a emergir como

potenciais componentes teis teraputica antitumoral devido aos seus efeitos de

aumento da sensibilidade s radiaes usadas em radioterapia, influenciado pela

expresso da protena p53 (codificada pelo gene supressor tumoral p53), e de aumento

da especificidade para as clulas malignas. Estes inibidores induzem a acumulao de

histonas hiperacetiladas que leva ao aumento da expresso de um pequeno conjunto

de genes silenciados e, consequentemente, diminui a proliferao celular maligna,

aumenta o grau de maturao celular (diferenciao) e aumenta a apoptose das clulas

malignas.

Dentro deste mbito, a equipa de investigao esteve envolvida no design de

uma nova molcula com duas unidades, um triazeno antitumoral e um iHDAC, o cido

valprico (VPA). Este hbrido denominado HYBCOM.

Neste trabalho foram feitos estudos cinticos de estabilidade em tampo fosfato

(0.01 M, pH 7.4) e no plasma humano e a determinao das suas propriedades

lipoflicas atravs da cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC).

Palavras-chave: glioma; triazeno; inibidor das deacetilases de histonas

(iHDAC); cido valprico

iii

ABSTRACT

Temozolomide (TMZ) is the most widely used antitumor agent for gliomas. It is a

triazene that alkylates deoxyribonucleic acid (DNA) and, due to its lipophilicity, it has two

features that make it an antitumor of choice: it can be administered orally and is capable

of crossing the blood-brain barrier. However, the therapeutic efficiency is often

disappointing largely due to lack of selectivity for tumor cells, the low concentration of

the drug at the site of action and the occurrence of tumor resistance to the treatment. It

is important to develop alternative therapeutic approaches.

Histone deacetylase inhibitors (iHDAC) are emerging as potentially useful

components of the antitumor therapy due to its effects of increased sensitivity to radiation

used in radiotherapy, influenced by protein p53 expression (encoded by the tumor

suppressor gene p53), and increased specificity for malignant cells. These inhibitors

induce the accumulation of hyperacetylated histones that leads to increased expression

of a small subset of silenced genes and thus reduces the malignant cell proliferation,

increases the level of cell maturation (differentiation) and increases apoptosis in

malignant cells.

Within this context, the research team was involved in the design of a new

molecule with two units, an antitumor triazene and an iHDAC, valproic acid (VPA). This

hybrid is called HYBCOM.

In the present study, kinetic stability studies were made in phosphate buffer (0.01

M, pH 7.4) and in human plasma and the determination of its lipophilic properties by high

performance liquid chromatography (HPLC) was also made.

Keywords: glioma; triazene; histone deacetylase inhibitors (iHDAC); valproic

acid

iv

NDICE

RESUMO ...................................................................................................................... ii

ABSTRACT .................................................................................................................. iii

LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... v

LISTA DE TABELAS .................................................................................................... vi

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS .................................................................. vii

1. INTRODUO .......................................................................................................... 1

1.1. Gliomas malignos ............................................................................................... 1

1.2. Tratamento do glioma maligno ........................................................................... 1

1.2.1. Triazenos: agentes alquilantes ..................................................................... 1

1.2.2. Resistncia das clulas tumorais aos triazenos e inespecificidade do

tratamento ............................................................................................................. 3

1.2.3. Inovaes no tratamento do glioma maligno ................................................ 4

1.3. Objetivos ............................................................................................................ 5

2. MATERIAIS E MTODOS ........................................................................................ 6

2.1. Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) ................................................. 6

2.2. Determinao do comprimento de onda mximo de absoro dos compostos... 6

2.3. Curvas de calibrao .......................................................................................... 7

2.4. Estudos cinticos ............................................................................................... 7

2.4.1. Tampo fosfato-salino (PBS) (0.01 M, pH=7.4) ............................................ 8

2.4.2. Plasma humano (80% v/v) ........................................................................... 8

2.5. Determinao do logaritmo do coeficiente de partio ....................................... 8

2.5.1. Fundamento terico ..................................................................................... 8

2.5.2. Procedimento experimental ......................................................................... 9

2.5.3. Mtodo computacional ............................................................................... 10

3. RESULTADOS E DISCUSSO .............................................................................. 11

3.1. Estudo de estabilidade em tampo fosfato salino ............................................. 11

3.2. Estudo de estabilidade em plasma humano ..................................................... 12

3.3. Determinao do logaritmo do coeficiente de partio ..................................... 13

4. CONCLUSO ......................................................................................................... 15

AGRADECIMENTOS .................................................................................................. 16

BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................... 17

ANEXOS ..................................................................................................................... 20

v

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representao qumica do composto triazeno genrico ............................... 1

Figura 2 - Mecanismo de ativao da temozolomida e mecanismo de alquilao do DNA

adaptado de [10] .................................................................................................... 2

Figura 3 - Variao da concentrao de pr-frmaco ao longo do tempo no ensaio em

tampo fosfato pH 7.4.......................................................................................... 12

Figura 4 - Variao da concentrao de pr-frmaco ao longo do tempo no ensaio em

plasma humano 80% (v/v) ................................................................................... 13

vi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Comprimentos de onda mximos de cada composto. .................................. 6

Tabela 2 - Valores das reas correspondentes ao pr-frmaco detetadas ao longo do

tempo no estudo cintico em tampo fosfato ....................................................... 11

Tabela 3 - Valores das reas correspondentes ao pr-frmaco detetadas ao longo do

tempo no estudo cintico em plasma humano ..................................................... 12

Tabela 4 - Valores das reas correspondentes ao pr-frmaco detetadas no estudo da

determinao do Log P ........................................................................................ 13

vii

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

AAI Amina aromtica inativa

ACN Acetonitrilo

DNA cido desoxirribonucleico

iHDAC Inibidor das deacetilases de histonas

HPLC Cromatografia lquida de alta eficincia (High-performance liquid

chromatography)

Log P Logaritmo do coeficiente de partio octanol-gua

MMT Monometiltriazeno

OGAT O6-alquilguanina-DNA transferase

OMS Organizao Mundial de Sade

PBS Tampo fosfato-salino

PF Pr-frmaco

RP-HPLC Cromatografia lquida de alta eficincia de fase reversa

TMZ Temozolomida

UV Ultravioleta

Comprimento de onda

1

1. INTRODUO

1.1. Gliomas malignos

Os gliomas malignos so tumores das clulas gliais (estas clulas protegem,

nutrem e do suporte aos neurnios). O sistema de classificao da Organizao

Mundial de Sade (OMS) agrupa os gliomas em quatro classes histolgicas definidas

por graus crescentes de indiferenciao, anaplasia e agressividade (Anexo I). Segundo

a OMS, os gliomas malignos incluem os tumores de classe III (variantes anaplsicas de

astrocitoma, oligodendroglioma e oligoastrocitoma) e os tumores de classe IV

(glioblastoma e as suas variantes). um dos tipos de tumor maligno mais comuns a

nvel mundial na espcie humana com uma incidncia anual de 5.26 por 100 000

habitantes ou 17 000 novos diagnsticos por ano. Estes tumores so tipicamente

associados a fatores hereditrios e m qualidade de vida. Tm origem principalmente

no encfalo e possuem a capacidade de se infiltrar no tecido cerebral saudvel e formar

tumores satlite. Esta migrao faz com que o tratamento se torne extremamente

complicado e invariavelmente fatal [1, 2].

1.2. Tratamento do glioma maligno

O tratamento de doentes com gliomas malignos paliativo e inclui

cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Grande parte dos compostos farmacuticos

antitumorais disponveis no mercado caracteriza-se pela interao com o DNA ou com

os seus percursores, de modo a inibir a replicao celular ou provocando leses

irreparveis na cadeia [3].

A maioria dos agentes quimioteraputicos pode ser dividido em agentes

alquilantes, antimetabolitos e agentes intercalantes de DNA [4, 5, 6].

1.2.1. Triazenos: agentes alquilantes

Os triazenos so espcies qumicas constitudas por cadeias abertas contendo

trs tomos de azoto ligados entre si (grupo diazoamina), como observado na Figura 1.

Estas cadeias de azoto podem ser facilmente estabilizadas por substituintes orgnicos

nos azotos terminais, levando formao de diversos anlogos [7].

Figura 1 - Representao qumica do composto triazeno genrico

2

Estes compostos so alvo de muitas pesquisas cientficas, uma vez que,

alterando a sua estrutura qumica, os derivados podem adquirir diferentes propriedades,

entre elas: atividade antimicrobiana, antifngica, mutagnica, anticarcinognica e

teratognica [8]. O grupo diazoamina responsvel pelas propriedades qumicas,

fsicas e antitumorais destas molculas [9].

A quimioterapia em monoterapia com agentes quimioteraputicos a estratgia

mais usada no tratamento de gliomas em estado avanado [5]. Os triazenos, como a

temozolomida (TMZ), so agentes alquilantes que so usados atualmente no tratamento

de gliomas malignos como teraputica de primeira linha [10].

A TMZ um agente de alquilao de 2 gerao da classe das imidotetrazinas

que tem sido amplamente utilizado no tratamento de gliomas de alto grau [11]. Pode ser

administrada oralmente, atravessa a barreira hemato-enceflica e tem efeitos

secundrios mnimos (genotoxicidade, nuseas, obstipao, anorexia e fadiga) em

relao a outros frmacos alquilantes usados [12]. uma molcula de baixo peso

molecular que, aps ingesto oral, totalmente absorvida e, aps 8h da ingesto,

completamente eliminada e, por este motivo, representa um risco reduzido de toxicidade

para a medula ssea. A sua eficcia no tratamento de gliomas envolve um primeiro

evento caracterizado por alteraes na organizao da heterocromatina e o seu

silenciamento, que seguido por apoptose e senescncia [13].

A TMZ utilizada em clnica um pr-frmaco (PF), ou seja, um derivado

qumico farmacologicamente inativo que, s aps a sua transformao, quer por

metabolizao quer por hidrlise qumica espontnea, se torna farmacologicamente

ativo, libertando o metabolito de ao citotxica [14, 15, 16] (Figura 2).

Figura 2 - Mecanismo de ativao da temozolomida e mecanismo de alquilao do DNA adaptado de [10]

3

Aps a ingesto, a TMZ convertida no seu metabolito ativo, sem necessidade

de desmetilao enzimtica por hidrlise no fgado [12, 17]. Depois de absorvida no

intestino, a TMZ sofre um ataque nucleoflico por parte da gua e d-se a abertura do

anel heterocclico formando-se um derivado do monometiltriazeno citotxico (MMT) e

dixido de carbono. Os MMTs, em meio aquoso, sofrem decomposio espontnea,

resultando na formao de uma amina aromtica inativa (AAI) e do io metildiaznio,

num processo de converso irreversvel dependente do pH. Este io, por sua vez,

alquila os cidos nucleicos impossibilitando a diviso celular. A interao final do agente

com o DNA consiste na transformao da base guanina atravs da metilao nas

posies N7-guanina, O6-guanina e O3-adenina do DNA [10].

Os efeitos citotxicos/mutagnicos deste frmaco baseiam-se na presena de

aductos de O6-Metilguanina que geram desemparelhamentos de bases com a citosina

e a timina. Estes aductos conduzem morte celular ou, se a clula sobreviver, provocam

mutaes pontuais somticas representadas por uma transio C:G T:A na hlice do

DNA [15, 16, 18].

No entanto, as clulas humanas conseguem desenvolver mecanismos de defesa

e de reparao dos danos causados pelos triazenos, o que leva resistncia aos

frmacos [10].

1.2.2. Resistncia das clulas tumorais aos triazenos e

inespecificidade do tratamento

A resistncia inata ou adquirida das clulas de glioma terapia com triazenos

um problema que tem surgido devido diminuio da ao alquilante destes agentes.

O mecanismo de resistncia destas clulas est relacionado com a capacidade de

reparao das clulas humanas face aos danos induzidos pelos triazenos. Como foi

referido anteriormente, a O6-Metilguanina a principal leso citotxica e mutagnica.

Aps estas alteraes no DNA d-se a reparao celular mediada pela protena O6-

alquilguanina-DNA transferase (OGAT), codificada pelo gene O6-metilguanina-DNA-

metiltransferase. Esta protena remove os aductos de DNA atravs de um mecanismo

de reao SN2. No considerada uma verdadeira enzima, uma vez que remove o

grupo alquilo da leso por uma reao estequiomtrica e a enzima ativa no

regenerada depois de alquilada, sendo assim referida como uma enzima suicida [19,

20]. Os nveis elevados de atividade de OGAT so o principal elemento responsvel

pela resistncia a estes frmacos. Apesar disto, os triazenos tm a capacidade de

inativar esta protena por mecanismos diretos e indiretos [16, 20, 21].

Os frmacos usados atualmente na prtica clnica com ao antitumoral afetam

clulas em proliferao de modo sistmico, principalmente as clulas em diviso ativa,

4

independentemente da fase em que se encontram. Deste modo, tm capacidade para

eliminar um grande nmero de clulas malignas (que se encontram em diviso

descontrolada) [22]. O maior obstculo destes frmacos a falta de especificidade para

as clulas tumorais, pois a concentrao do frmaco que atinge o tecido-alvo reduzida.

Alm disso, como h uma fraca seletividade, pode provocar uma toxicidade sistmica

pois no existe distino entre as clulas saudveis e as clulas malignas, provocando

grandes alteraes na proliferao das clulas saudveis [23, 24].

1.2.3. Inovaes no tratamento do glioma maligno

Como referido anteriormente, a eficcia teraputica dos triazenos

frequentemente dececionante, devido em grande parte, falta de seletividade para

clulas tumorais, baixa concentrao do frmaco no local de ao e ocorrncia de

resistncias do tumor ao tratamento. Deste modo, importante desenvolver abordagens

teraputicas alternativas, como a sntese de pr-frmacos com melhor atividade

teraputica [25]. A sntese de um pr-frmaco um importante meio de aumentar a

eficincia do frmaco, podendo ser constitudo por vrias molculas que, combinadas,

tenham uma maior eficcia teraputica que o frmaco j existente e usado na prtica

clnica. Um requisito importante do pr-frmaco que este deve ser convertido

rapidamente, ou a uma taxa controlada, no agente teraputico ativo in vivo e, ao mesmo

tempo, ser suficientemente estvel in vitro de modo a que possa ser desenvolvido um

produto farmacutico estvel [26].

Neste mbito, os iHDAC tm vindo a emergir como potenciais componentes teis

teraputica antitumoral. Estes compostos tm um efeito radiossensibilizador, mas a

sua contribuio neste aspeto no clara. Pensa-se que a radiossensibilizao pelos

iHDAC , em alguns casos, influenciada pela expresso da protena p53 [16]. A protena

p53 codificada pelo gene supressor de tumor p53, tendo uma importante funo no

ciclo celular que consiste em reparar o DNA quando ocorre uma mutao nas bases da

molcula. Quando no consegue completar a reparao, a protena induz a apoptose

da clula mutada. Esta protena demonstrou sensibilizar as clulas de glioma TMZ por

supra-regulao da via apopttica extrnseca [27].

Outra caracterstica importante destes inibidores a sua seletividade em termos

de alterao da expresso gnica em clulas transformadas. Os iHDAC induzem a

acumulao de histonas hiperacetiladas. Este aumento da acetilao das histonas leva

ao aumento da expresso de um pequeno conjunto de genes silenciados e,

consequentemente, diminui a proliferao celular maligna, aumenta o grau de

diferenciao celular e aumenta a apoptose das clulas malignas [28, 29]. As

modificaes nas histonas podem criar, estabilizar, romper ou ocluir domnios de

5

interao na cromatina para protenas reguladoras, como fatores de transcrio,

protenas envolvidas na condensao da cromatina e reparao do DNA [30, 31].

O cido valprico (VPA) um antiepiltico da classe dos iHDAC e usado em

combinao com a TMZ por ter um efeito sinergtico, aumentando a eficincia da

apoptose induzida por danos no DNA [32]. Como iHDAC, este aumenta a sensibilidade

aos tratamentos de radiao nas linhas celulares do glioma mediada por alteraes na

expresso gentica [16, 33]. O VPA tem efeitos indutivos em certos genes, suprimindo

fatores relacionados com o fator nuclear eritride 2 (Nrf2), fatores de transcrio redox-

sensveis, que participam na resposta antioxidante. Deste modo, induz a produo de

espcies reativas de oxignio, que tm um papel importante na induo da apoptose

[34]. O VPA provoca tambm a depleo de glutationa e a perda do potencial de

membrana mitocondrial, que so efeitos pr-apoptticos, e um potente inibidor da

enzima citocromo P450 do fgado, que possui interaes metablicas importantes com

frmacos utilizados na terapia do glioma. No entanto, a TMZ no necessita de

metabolismo heptico que envolva o sistema P450 e demonstra uma fraca interao

com o VPA [32].

Neste projeto avalia-se a estabilidade de um hbrido em que se combina um

monometiltriazeno e o cido valprico numa s molcula.

1.3. Objetivos

A resistncia dos tumores aos frmacos triazenos um grande obstculo no

tratamento de gliomas. Uma maneira de contornar este problema associar o triazeno

a um composto que diminua a resistncia e aumente sinergeticamente o efeito do

frmaco [32]. Para tal, fez-se uma associao de um triazeno com o cido valprico,

dando origem ao pr-frmaco HYBCOM.

O presente projeto consiste na avaliao deste composto hbrido quanto sua

estabilidade em tampo fosfato salino (pH=7.4) e no plasma humano, assim como a

determinao das suas propriedades lipoflicas para determinar a facilidade de absoro

do pr-frmaco.

Para o efeito, procedeu-se anlise do hbrido HYBCOM por HPLC.

6

2. MATERIAIS E MTODOS

2.1. Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC)

HPLC com detetor ultravioleta (UV) um tipo de cromatografia utilizada em

anlise de compostos no volteis ou instveis termicamente, sendo o seu campo de

aplicao muito vasto [35].

Para realizar os estudos de estabilidade por HPLC foi necessrio escolher o

melhor eluente (fase mvel), para que os tempos de reteno de cada um dos

compostos (pr-frmaco e seus produtos de degradao) no ficassem sobrepostos

permitindo calcular as integraes das reas dos mesmos nos cromatogramas. O

eluente (fase mvel) escolhido foi uma mistura de acetonitrilo (ACN) J. T Baker de grau

HPLC, um solvente orgnico polar que dissolve os compostos sem os decompor, e gua

desionizada no aparelho desionizador Millipore Direct-Q UV 3.

Neste estudo, todas as anlises foram realizadas por cromatografia lquida de

alta eficincia de fase reversa (RP-HPLC), em que a fase estacionria escolhida foi uma

coluna RP-18.

Usou-se o detetor Merck Hitachi LaChrom UV Detector L-7400, a bomba Merck

Hitachi LaChrom Pump L-7110 e o integrador Merck Hitachi Integrator D-7500.

2.2. Determinao do comprimento de onda mximo de

absoro dos compostos

Para determinar o comprimento de onda () no qual ocorre o mximo de

absoro do composto hbrido e dos seus produtos de reao recorreu-se

espetroscopia UV/visvel no espetrofotmetro Shimadzu UV-160 no intervalo de 200 a

400 nm de comprimento de onda. Na Tabela 1 encontram-se os valores mximos de

para a amina, MMT e pr-frmaco.

Composto Comprimento de onda

mximo (nm)

Amina 273.4

MMT 286.0

PF 295.4

Tabela 1 - Comprimentos de onda mximos de cada composto.

7

Os compostos apresentaram mximos de absoro entre 273.4 e 295.4 nm.

Optou-se por selecionar o comprimento de onda de 300 nm para os estudos em HPLC

pois um valor prximo dos obtidos no espetrofotmetro e todos os compostos

absorvem a esse comprimento de onda.

2.3. Curvas de calibrao

Com o objetivo de identificar e quantificar a amina, o monometiltriazeno e o pr-

frmaco por comparao com os respetivos padres foram feitas curvas de calibrao.

Recorreu-se a vrias solues-padro com diferentes concentraes de cada composto

em ACN que foram analisadas por HPLC por ordem crescente de concentraes.

Para a amina e o MMT foram preparadas solues-me de concentrao 10-4

mol L-1 pesando rigorosamente a quantidade apropriada de composto, na balana

analtica Mettler Toledo AB204, e dissolvendo em acetonitrilo. A soluo-me do pr-

frmaco tinha uma concentrao de 1 mol L-1, a partir da qual se fez uma soluo de

concentrao 10-4 mol L-1 para se proceder s diluies nas mesmas condies que as

solues-me preparadas. As solues usadas para a realizao das curvas de

calibrao foram preparadas por diluio a partir das solues previamente referidas

usando como solvente o acetonitrilo.

A tabela com os dados da preparao das solues-padro encontra-se no

Anexo III. As tabelas e representaes grficas das curvas de calibrao podem ser

observadas nos Anexos IV e V.

2.4. Estudos cinticos

A hidrlise do pr-frmaco foi monitorizada por HPLC atravs da quantificao

do desaparecimento do substrato e aparecimento dos produtos da reao. Para

identificar os produtos fez-se a comparao dos seus tempos de reteno com os

tempos de reteno dos padres da amina, MMT e pr-frmaco. Os cromatogramas

efetuados podem ser observados no Anexo II.

Foi realizada uma eluio isocrtica em todos os ensaios e a mistura usada foi

acetonitrilo:gua (65:35) v/v. Antes da anlise, fez-se a desgaseificao da fase mvel

por ultra-sons no aparelho de banho ultrassnico Bandelin Sonorex TK 52 durante 20

minutos para evitar a existncia de bolhas de ar que interferem na anlise.

8

2.4.1. Tampo fosfato-salino (PBS) (0.01 M, pH=7.4)

Uma alquota de 10 L de uma soluo do PF em ACN com concentrao de 10-

2 M foi adicionada a 10 mL de PBS (0.01 M, pH=7.4) a 37C. A diferentes tempos foram

retiradas vrias alquotas da mistura durante 48 horas e analisadas por HPLC a =300

nm e fluxo de 1.0 mL/min. O ensaio foi feito em duplicado.

2.4.2. Plasma humano (80% v/v)

2.4.2.1. Procedimento geral para a obteno de plasma humano

Foi recolhido sangue de vrios doadores saudveis em heparinato de sdio.

Depois de centrifugado, o sobrenadante foi separado e distribudo por vrios frascos de

vidro contendo cada um 2 mL de plasma. Estes frascos foram conservados a -70C.

Antes da sua utilizao teve o cuidado de se fazer uma descongelao gradual para

evitar uma possvel desnaturao das protenas plasmticas.

2.4.2.2. Estudos cinticos em plasma humano

Uma mistura de 2 mL de plasma humano e 0.5 mL de PBS foi termostatizada a

37C. A esta mistura foi adicionada uma alquota de 10 L de uma soluo do PF de

concentrao 10-2 M em ACN. Vrias alquotas (200 L) da mistura reacional foram

retiradas a diferentes tempos durante 48 horas e colocadas em eppendorfs com 400 L

de ACN em gelo. Os eppendorfs foram centrifugados a 14000 rotaes por minuto por

5 minutos e o sobrenadante foi analisado por HPLC com um fluxo de 1.0 mL/min. O

ensaio foi feito em duplicado.

2.5. Determinao do logaritmo do coeficiente de partio

2.5.1. Fundamento terico

A determinao do logaritmo do coeficiente de partio importante para

entender a solubilidade dos pr-frmacos em meio aquoso, em ambiente fisiolgico e a

sua permeabilidade s membranas celulares (lipdicas). Atravs desta determinao

possvel aferir sobre a capacidade dos pr-frmacos atravessarem as membranas

biolgicas das clulas do glioma [14].

Em estudos prvios verificou-se a existncia de uma correlao entre a

solubilidade de alguns frmacos em lpidos e a sua atividade biolgica. Sendo assim,

surgiu um modelo que simula o transporte dos frmacos at ao seu local de ao: a

capacidade de um composto se distribuir entre o 1-octanol (que simula a membrana

lipoflica) e a gua (que simula a fase aquosa). O 1-octanol constitudo por uma cadeia

alqulica saturada longa e tem um grupo hidroxilo polar que forma ligaes de hidrognio

9

com a gua, o que faz com que se dissolva nesta numa concentrao de 1.7 M, levando

saturao. A combinao das cadeias lipoflicas, grupos hidroflicos e molculas de

gua confere ao 1-octanol propriedades bastante semelhantes s das membranas

naturais [36].

De modo a determinar a lipofilia de um frmaco, foi proposto o logaritmo do

coeficiente de partio (Log P) entre a gua e o 1-octanol:

Log P = log [(composto)octanol

(composto)tampo] (Equao 1)

Este coeficiente indica a tendncia preferencial do frmaco para se dissolver

numa fase ou noutra. Com base nesta equao, possvel verificar que se um composto

for mais solvel na fase aquosa (tampo), P1, logo o valor de Log P

positivo [37].

At um certo limite, os compostos mais lipoflicos interagem mais com a fase

lipdica, ou seja, penetram nas membranas lipoflicas facilmente. Contudo, a relao

entre o Log P e a penetrao no linear, sendo que, para valores extremos, esta

interao torna-se demasiado forte e impede o frmaco de atravessar a fase aquosa ou

de se dissolver nesta pois fica retido na camada lipdica. Inversamente, se o Log P tiver

um valor prximo de zero, o frmaco fica retido na fase aquosa e no atravessa a fase

lipdica. De acordo com estudos de correlao dos fenmenos de dissoluo e

transporte, pode afirmar-se que os frmacos com um coeficiente de partio octanol-

gua igual ou superior a 100 (Log P>2) so bem absorvidos. O valor de lipofilia ideal,

que corresponde mxima absoro dos frmacos, Log P2 e poder ir at 3 [37,

38]. Segundo a Regra dos 5 de Lipinski, um frmaco ter provavelmente uma m

absoro oral se Log P>5 [39].

A avaliao da lipofilia atravs do valor do logaritmo do coeficiente de partio

pode ser realizada experimentalmente por HPLC. Paralelamente pode ser feita a sua

determinao por um mtodo computacional [40].

2.5.2. Procedimento experimental

A determinao experimental do Log P do pr-frmaco foi realizada no sistema

octanol-tampo fosfato. A saturao deste sistema foi conseguida colocando-se uma

mistura de 1:1 de octanol e tampo fosfato isotnico (pH 7.4) numa ampola de

decantao que ficou em repouso durante a noite.

10

Para determinar o Log Pexp, num eppendorf adicionou-se aproximadamente 2 mg

de pr-frmaco a um sistema bifsico constitudo por 0.5 mL de octanol (previamente

saturado de tampo fosfato isotnico) e 0.5 mL de tampo fosfato isotnico

(previamente saturado de octanol). A mistura foi agitada no vortex durante 4 minutos,

centrifugada durante 5 minutos e deixada em repouso durante 15 minutos. A alquota

da fase orgnica foi previamente diluda numa proporo de 1:10 em acetonitrilo e s

depois analisada por HPLC. O eluente usado foi a mistura ACN:gua (65:35) e o fluxo

foi de 1 mL/min. A alquota da fase aquosa foi injetada sem qualquer diluio. O Log

Pexp foi obtido pela razo das reas dos picos a 300 nm, correspondentes aos compostos

em questo. O ensaio foi feito em duplicado.

2.5.3. Mtodo computacional

De modo a fazer uma previso terica do valor de Log P, usou-se o programa

ALOGPS 2.1. Atravs da introduo da frmula SMILES (simplified molecular-input line-

entry system), que uma especificao para descrever a estrutura de molculas em

forma de notao que usa caracteres ASCII (American Standard Code for Information

Interchange), determinou-se o Log Pterico [41]. O valor dado pelo programa foi 4.53.

11

3. RESULTADOS E DISCUSSO

3.1. Estudo de estabilidade em tampo fosfato salino

Realizou-se o estudo da hidrlise do pr-frmaco com tampo fosfato (0.01 M,

pH=7.4) a 37C, como descrito anteriormente. As reaes foram monitorizadas por

HPLC. Os produtos da reao foram identificados por comparao com os respetivos

padres (Anexo II). No foi possvel visualizar a amina e o MMT pois no foram

detetados no cromatograma picos com os tempos de reteno correspondentes a estes

compostos, portanto no foi feita a quantificao destes produtos da reao. O nico

pico visvel e identificvel foi o pico correspondente ao pr-frmaco. No Anexo VI

possvel observar cromatogramas deste ensaio a diferentes tempos. Na Tabela 2

encontram-se os valores mdios de rea detetados ao longo do tempo, relativos ao pr-

frmaco.

Tempo / h

rea / mAU

0.00 36570.5

2.50 37657.5

4.75 38802.5

22.50 38967.5

30.50 41008.0

46.50 39552.5

71.75 37795.5

77.00 34463.0

Tabela 2 - Valores das reas correspondentes ao pr-frmaco detetadas ao longo do tempo no

estudo cintico em tampo fosfato

Recorrendo curva de calibrao correspondente ao pr-frmaco (Anexo V),

calculou-se a concentrao do hbrido ao longo do tempo e pode afirmar-se que

estvel em condies semelhantes s fisiolgicas. Na Figura 3 esto representadas as

concentraes do pr-frmaco ao longo de 77 horas.

12

Figura 3 - Variao da concentrao de pr-frmaco ao longo do tempo no ensaio em tampo

fosfato pH 7.4

Pela anlise da representao grfica observa-se que a concentrao do hbrido

se manteve constante ao longo do tempo. Deste modo, os resultados deste estudo

cintico mostraram que o pr-frmaco suficientemente estvel em condies

fisiolgicas, sendo tambm interessante a avaliao da sua estabilidade em plasma

humano.

3.2. Estudo de estabilidade em plasma humano

O estudo cintico em plasma humano (80% v/v) foi, igualmente, seguido por

HPLC. Tal como no estudo anterior, o nico pico identificvel detetado foi o

correspondente ao pr-frmaco. No Anexo VI possvel observar cromatogramas deste

ensaio a diferentes tempos. Na Tabela 3 encontram-se os valores mdios de rea

detetados ao longo do tempo, relativos ao pr-frmaco.

Tempo / h rea / mAU

0 1204886.0

2.50 1296815.0

6.50 1281402.0

21.50 1391722.5

26.00 1402908.0

28.00 1382506.0

48.00 1252533.5

Tabela 3 - Valores das reas correspondentes ao pr-frmaco detetadas ao longo do tempo no

estudo cintico em plasma humano

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 20 40 60 80 100

[PF

] /

mo

l L

-1

Tempo / h

13

Do mesmo modo, recorreu-se curva de calibrao do pr-frmaco (Anexo V)

para calcular a sua concentrao ao longo do tempo com o objetivo de avaliar a sua

degradao. Na Figura 4 esto representadas as concentraes do pr-frmaco ao

longo de 48 horas.

Figura 4 - Variao da concentrao de pr-frmaco ao longo do tempo no ensaio em plasma

humano 80% (v/v)

Analisando os resultados obtidos possvel observar-se que o pr-frmaco

apresenta boa estabilidade em plasma humano durante 48 horas pois no houve

grandes variaes da concentrao detetada do hbrido.

3.3. Determinao do logaritmo do coeficiente de partio

Para se conseguir determinar o valor de Log Pexp fez-se a anlise de alquotas

das fases aquosa e orgnica por HPLC.

As anlises foram feitas em triplicado.

Os valores de rea da fase orgnica foram multiplicados por 10 (fator de diluio)

aps a anlise. Na Tabela 4 pode observar-se os valores de rea correspondentes s

duas fases. Os cromatogramas correspondentes podem ser observados no Anexo VIII.

rea / mAU

Fase aquosa 3103.167

Fase orgnica

27628355

Tabela 4 - Valores das reas correspondentes ao pr-frmaco detetadas no estudo da

determinao do Log P

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 10 20 30 40 50 60

[PF

] /

m

ol

L-1

Tempo / h

14

De acordo com a Equao 1, efetuou-se o clculo do valor de Log Pexp.

Log P = log [276283553103.167

]= 3.95

Comparando os valores dos logaritmos dos coeficientes de partio terico

(4.53) e experimental, verificou-se que o valor experimental se encontra prximo do que

se espera obter teoricamente. Sendo este um valor positivo e superior a 1, indicativo

de que a molcula mais solvel em octanol, ou seja, apresenta um comportamento

lipoflico. Isto tambm permite explicar o fato dos picos do cromatograma da fase aquosa

serem to pequenos, pois o pr-frmaco pouco solvel em gua.

15

4. CONCLUSO

Analisando os resultados obtidos, possvel concluir que o hbrido em estudo

tem uma grande probabilidade de sucesso como pr-frmaco no tratamento do glioma

maligno.

No que respeita aos estudos cinticos de estabilidade em tampo fosfato 0.01 M

pH 7.4 a 37C, o pr-frmaco mostrou ser estvel durante um longo perodo de tempo

(77 horas). Por este motivo, ter uma semi-vida bastante longa pois no se verificou

degradao durante o perodo do estudo.

Relativamente aos ensaios em plasma humano 80% (v/v), estes possibilitam

determinar o comportamento do composto hbrido no plasma, que contm diversas

enzimas que podem ou no interferir no mecanismo do pr-frmaco. Atravs deste

estudo verificou-se que o composto se manteve estvel durante 48 horas estando na

presena de enzimas plasmticas. Isto significa que no foi degradado antes de

alcanar o local alvo, as clulas gliais malignas.

Na determinao do logaritmo do coeficiente de partio, o valor obtido foi

semelhante ao teoricamente previsto, portanto considera-se que os valores so

concordantes. O pr-frmaco apresenta um valor de Log P prximo de 4, o que

demonstra a sua afinidade para com a membrana lipdica. de referir que, como o valor

de Log P desta molcula inferior a 5, o hbrido obedece a um dos parmetros da Regra

dos 5 de Lipinski, tendo uma maior probabilidade de ter uma boa absoro oral.

Um prximo passo neste estudo pode passar por realizar ensaios com culturas

de clulas com o objetivo de averiguar se o hbrido tem uma maior seletividade para as

clulas gliais malignas. Outros estudos podiam ser feitos no sentido de esclarecer a

influncia da ao do cido valprico no pr-frmaco em relao a outros iHDAC.

16

AGRADECIMENTOS

Desejo expressar os meus sinceros agradecimentos a todos aqueles que, direta

ou indiretamente, contriburam para a realizao deste projeto:

Professora Maria Eduarda Mendes pela oportunidade que me deu, pela sua

orientao e disponibilidade prestadas no decorrer do trabalho, assim como

pelas crticas, correes e sugestes apontadas a este documento;

Professora Maria de Jesus Perry pela disponibilidade, auxlio e conhecimentos

transmitidos no decorrer do projeto;

Susana Lucas por todos os conhecimentos transmitidos relativamente aos

aparelhos a utilizar, pela sua pacincia e boa disposio;

A todos os amigos que me ajudaram a concretizar este objetivo, em especial

Sara Reis e Ins Ferreira pela pacincia e prontido na ajuda na reviso do

presente manuscrito. Ao Rodrigo Murteira, Joana Camilo e Bruno Segurado pela

amizade, palavras de encorajamento e fora.

minha famlia por toda a motivao e compreenso durante o decorrer do

projeto.

17

BIBLIOGRAFIA

[1] A. J. Sawyer, J. M. Piepmeier, and W. M. Saltzman, New methods for direct delivery

of chemotherapy for treating brain tumors, Yale J. Biol. Med, 79 (3-4), 141152,

2006.

[2] D. N. Louis, H. Ohgaki, O. D. Wiestler, W. K. Cavenee, P. C. Burger, A. Jouvet, B. W.

Scheithauer, and P. Kleihues, The 2007 WHO classification of tumours of the central

nervous system, Acta Neuropathol., 114 (2), 97109, 2007.

[3] K. L. P. Laurence L. Brunton, John S. Lazo, As Bases Farmacolgicas da

Teraputica - Goodman & Gilman, Mcgraw-Hill, 2010.

[4] R. Stupp, J.-C. Tonn, M. Brada, and G. Pentheroudakis, High-grade malignant

glioma: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow- up,

Ann. Oncol., 21 (5), 190193, 2010.

[5] M. C. Chamberlain and P. A. Kormanik, Practical guidelines for the treatment of

malignant gliomas, West. J. Med., 168 (2), 114120, 1998.

[6] E. C. C. H. Takimoto, Principles of oncologic pharmacotherapy, Oncol. J., Chapter

3, 2005.

[7] A. Mcnaught and A. Wilkinson, IUPAC. Compendium of Chemical Terminology: The

Gold Book, Blackwell Scientific Publications, 1997.

[8] V. I. Nifontov, N. P. Belskaya, and E. A. Shtokareva, The reactivity and mechanism

of action of triazenes (review), Pharm. Chem. J., 28 (10), 687706, 1994.

[9] M. Hrner, V. F. Giglio, A. J. R. W. A. d Santos, A. B. Westphalen, B. A. Iglesias, P.

R. Martins, C. H. do Amaral, T. M. Michelot, L. G. B. Reetz, C. de M. Bertoncheli, G.

L. Paraginski, and R. Horner, Triazenos e atividade antibacteriana, Rev. Bras.

Cincias Farm., 44 (3), 441449, 2008.

[10] F. Marchesi, M. Turriziani, G. Tortorelli, G. Avvisati, F. Torino, and L. De Vecchis,

Triazene compounds: mechanism of action and related DNA repair systems,

Pharmacol. Res., 56 (4), 275287, 2007.

[11] M. F. Stevens, J. A. Hickman, R. Stone, N. W. Gibson, G. U. Baig, E. Lunt, and C. G.

Newton, Antitumor imidazotetrazines. 1. Synthesis and chemistry of 8- carbamoyl-3-

(2-chloroethyl)imidazo[5,1-d]-1,2,3,5-tetrazin-4(3H)-one , a novel broad-spectrum

antitumor agent, J. Med. Chem., 27 (2), 196201, 1984.

[12] L. L. Tsang, C. P. Quarterman, A. Gescher, and J. A. Slack, Comparison of the

cytotoxicity in vitro of temozolomide and dacarbazine, prodrugs of 3-methyl- (triazen-

1-yl)imidazole-4-carboxamide, Cancer Chemoth. Pharm., 27 (5), 342346, 1991.

18

[13] R. Papait, L. Magrassi, D. Rigamonti, and E. Cattaneo, Temozolomide and

carmustine cause large-scale heterochromatin reorganization in glioma cells,

Biochem. Biophys. Res. Commun., 379 (2), 434439, 2009.

[14] G. L. Patrick, An Introdution to Medical Chemistry, Oxford University Press, 2009.

[15] J. M. M. B. Testa, Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism: Chemistry,

Biochemistry, and Enzymolog, Verlag Helvetica Chimica Acta, 2003.

[16] I. A. Kim, J. H. Shin, I. H. Kim, J. H. Kim, J. S. Kim, H. G. Wu, E. K. Chie, S. W. Ha,

C. Il Park, and G. D. Kao, Histone deacetylase inhibitor-mediated radiosensitization

of human cancer cells: class differences and the potential influence of p53., Clin.

Cancer Res., 12 (3), 940949, 2006.

[17] R. Stupp, M. Gander, S. Leyvraz, and E. Newlands, Current and future developments

in the use of temozolomide for the treatment of brain tumours, Lancet Oncol., 2 (9),

552560, 2001.

[18] W. P. Roos, L. F. Z. Batista, S. C. Naumann, W. Wick, M. Weller, C. F. M. Menck,

and B. Kaina, Apoptosis in malignant glioma cells triggered by the temozolomide-

induced DNA lesion O6-methylguanine, Oncogene, 26 (2), 186197, 2007.

[19] B. Kaina, M. Christmann, S. Naumann, and W. P. Roos, MGMT: key node in the

battle against genotoxicity, carcinogenicity and apoptosis induced by alkylating

agents, DNA Repair (Amst), 6 (8), 10791099, 2007.

[20] P. M. Lacal, S. DAtri, L. Orlando, E. Bonmassar, and G. Graziani, In vitro inactivation

of human O6-alkylguanine DNA alkyltransferase by antitumor triazene compounds,

J. Pharmacol. Exp. Ther., 279 (1), 416422, 1996.

[21] G. P. Margison and M. F. Santibez-Koref, O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase:

role in carcinogenesis and chemotherapy, Bioessays, 24 (3), 255266, 2002.

[22] W. A. Denny, Prodrug strategies in cancer therapy, Eur. J. Med. Chem., 36 (7-8),

577595, 2001.

[23] M. Tsalic, G. Bar-Sela, A. Beny, B. Visel, and N. Haim, Severe toxicity related to the

5-fluorouracil/leucovorin combination (the Mayo Clinic regimen): a prospective study

in colorectal cancer patients, Am. J. Clin. Oncol., 26 (1), 103106, 2003.

[24] B. L., M. R.F., and C. M.C., Pr-frmaco ativado por enzima uma estratgia

promissora na quimioterapia, Qumica Nova, 29 (6), 2006.

[25] D. Allhenn, M. A. Shetab Boushehri, and A. Lamprecht, Drug delivery strategies for

the treatment of malignant gliomas, Int. J. Pharm., 436 (1-2), 299310, 2012.

[26] M. D. J. Perry, E. Carvalho, E. Rosa, and J. Iley, Towards an efficient prodrug of the

alkylating metabolite monomethyltriazene: synthesis and stability of N- acylamino acid

derivatives of triazenes, Eur. J. Med. Chem., 44 (3), 10491056, 2009.

19

[27] L. F. Z. Batista, W. P. Roos, B. Kaina, and C. F. M. Menck, p53 mutant human glioma

cells are sensitive to UV-C-induced apoptosis due to impaired cyclobutane pyrimidine

dimer removal, Mol. Cancer Res., 7 (2), 237246, 2009.

[28] C. Van Lint, S. Emiliani, and E. Verdin, The expression of a small fraction of cellular

genes is changed in response to histone hyperacetylation, Gene Expr., 5 (4-5), 245

253, 1996.

[29] V. G. Allfrey, R. Faulkner, and A. E. Mirsky, Acetylation and methylation of histones

and their possible role in the regulation of rna synthesis, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.

A., 51, 786794, 1964.

[30] S. B. Hake, A. Xiao, and C. D. Allis, Linking the epigenetic language of covalent

histone modifications to cancer, Br. J. Cancer, 90 (4), 761 769, 2004.

[31] H. Santos-Rosa and C. Caldas, Chromatin modifier enzymes, the histone code and

cancer, Eur. J. Cancer, 41 (16), 23812402, 2005.

[32] C.-H. Chen, Y.-J. Chang, M. S. B. Ku, K.-T. Chung, and J.-T. Yang, Enhancement of

temozolomide-induced apoptosis by valproic acid in human glioma cell lines through

redox regulation, J. Mol. Med., 89 (3), 303315, 2011.

[33] K. Camphausen, T. Scott, M. Sproull, and P. J. Tofilon, Enhancement of xenograft

tumor radiosensitivity by the histone deacetylase inhibitor MS-275 and correlation with

histone hyperacetylation, Clin. Cancer Res., 10 (18), 60666071, 2004.

[34] Y. Kawai and I. J. Arinze, Valproic acid-induced gene expression through production

of reactive oxygen species, Cancer Res., 66 (13), 6563 6569, 2006.

[35] T. A. Bellar and W. L. Budde, Determination of nonvolatile organic compounds in

aqueous environmental samples using liquid chromatography/mass spectrometry,

Anal. Chem., 60 (19), 20762083, 1988.

[36] C. Hansch and T. Fujita, p -- Analysis. A Method for the Correlation of Biological

Activity and Chemical Structure, J. Am. Chem. Soc., 86 (8), 16161626, 1964.

[37] T. Fujita, J. Iwasa, and C. Hansch, A New Substituent Constant, , Derived from

Partition Coefficients, J. Am. Chem. Soc., 86 (23), 51755180, 1964.

[38] J. C. Dearden, Partitioning and lipophilicity in quantitative structure-activity

relationships, Environ. Health Perspect., 61, 203228, 1985.

[39] C. A. Lipinski, Lead- and drug-like compounds: the rule-of-five revolution, Drug

Discov. Today. Technol., 1 (4), 337341, 2004.

[40] OECD, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: Partition Coefficients by

Reversed Phase Chromatography, OECD, 117, 1983.

[41] VCCLAB, Virtual Computational Chemistry Laboratory, 2005. [Online]. Available:

http://www.vcclab.org.

20

ANEXOS

Anexo I

Figura A.1 - Classificao da OMS dos tumores do Sistema Nervoso Central [2]

21

Anexo II

Figura A.2 - Cromatograma correspondente ao padro de amina aromtica

Figura A.3 - Cromatograma correspondente ao padro de monometiltriazeno

22

Figura A.4 - Cromatograma correspondente ao padro de pr-frmaco

23

Anexo III

[composto] / mol L-1 Vsoluo-me / mL Vacetonitrilo

0.50 0.05 9.95

1.00 0.10 9.90

2.50 0.25 9.75

5.00 0.50 9.50

7.50 0.75 9.25

10.00 1.00 9.00

Tabela A.1 - Preparao das solues de amina, MMT e pr-frmaco para as curvas de calibrao

24

Anexo IV

[amina] / mol L-1 rea / mAU Mdia das reas / mAU

0.50 47966

47213.0 46460

1.00 105051

105912.5 106774

2.50 185289

194200.0 203111

5.00 406015

395668.5 385322

7.50 610696

568865.5 527035

10.00 883725

843361.5 802998

Tabela A.2 - Curva de calibrao para a amina aromtica em ACN

[MMT] / mol L-1 rea / mAU Mdia das reas / mAU

0.50 Sinal no

detectado

1.00 Sinal no

detectado

2.50

66881

56435.7 49908

52518

5.00 86146

91376.5 96607

7.50

114996

113477.3 77246

148190

10.00 204057

190949.5 177842

Tabela A.3 - Curva de calibrao para o monometiltriazeno em ACN

25

[PF] / mol L-1 rea / mAU Mdia das reas / mAU

0.50 Sinal no

detectado

1.00 Sinal no

detectado

2.50 20071

21809.0 23547

5.00 42351

43634.0 44917

7.50 63921

63625.5 63330

10.00 87939

85459.0 82979

Tabela A.4 - Curva de calibrao para o pr-frmaco em ACN

26

Anexo V

Figura A.5 Representao grfica da curva de calibrao para a amina aromtica em ACN

Figura A.6 - Representao grfica da curva de calibrao para o monometiltriazeno em ACN

Figura A.7 - Representao grfica da curva de calibrao para o pr-frmaco em ACN

y = 80529x + 3535,3R = 0,9927

0

200000

400000

600000

800000

1000000

0 2 4 6 8 10 12

re

a /

mA

U

[amina] / mol L-1

y = 17026x + 6649,2R = 0,9297

0

50000

100000

150000

200000

250000

0 2 4 6 8 10 12

re

a /

mA

U

[MMT] / mol L-1

y = 8437,7x + 896,5R = 0,9997

0

20000

40000

60000

80000

100000

0 2 4 6 8 10 12

re

a /

mA

U

[PF] / mol L-1

27

Anexo VI

Figura A.8 - Cromatograma correspondente ao pr-frmaco no estudo em tampo fosfato (tempo 0 h)

Figura A.9 - Cromatograma correspondente ao pr-frmaco no estudo em tampo fosfato (tempo 30.5 h)

28

Figura A.10 - Cromatograma correspondente ao pr-frmaco no estudo em tampo fosfato (tempo 77 h)

29

Anexo VII

Figura A.11 - Cromatograma correspondente ao pr-frmaco no estudo em plasma humano (tempo 0 h)

30

Figura A.12 - Cromatograma correspondente ao pr-frmaco no estudo em plasma humano (tempo 21.5 h)

31

Figura A.13 - Cromatograma correspondente ao pr-frmaco no estudo em plasma humano (tempo 48 h)

32

Anexo VIII

Figura A.14 - Cromatograma correspondente fase aquosa para a determinao de Log P

33

Figura A.15 - Cromatograma correspondente fase orgnica para a determinao de Log P