LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA

VETERINARIJOS FAKULTETAS

UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDRA

Renata Dargyt÷

Veterinarin÷ maisto sauga II kursas, 1 grup÷

SPORINöS BAKTERIJOS ŽALIAVINIAME PIENE

Veterinarin÷s maisto saugos magistrantūros studijų magistrinis darbas

Kaunas, 2010 m.

2

Magistrinis darbas atliktas 2008 – 2010 metais Lietuvos veterinarijos akademijos

Užkrečiamųjų ligų katedros mikrobiologijos laboratorijoje.

Magistrinį darbą paruoš÷: Renata Dargyt÷

Magistrinio darbo vadov÷: prof. dr. Jūrat÷ Šiugždait÷

(LVA Užkrečiamųjų ligų katedra)

Recenzentas (÷):

3

SUTRUMPINIMAI

BCSA – Bacillus cereus selektyvinis agaras

Ca - kalcis

CytK – cytotoksinas K

DNR - deoksiribonukleorūgštis

g – gramas

H – vandenilis

HBL – hemolitinis BL toksinas

JAV – Jungtin÷s Amerikos Valstijos

K – kalis

kDa – atomin÷s mas÷s vienetas

ksv – kolonijas sudarantys vienetai

Mg – magnis

min – minut÷

MYP – (manitolio, kiaušinių trynio, polimiksino) agaras

ml – mililitras

Mn – manganas

MR – metileno raudonasis

Na – natris

NaCl – natrio chloridas

NHE – ne hemolitinis enterotoksinas

p – tikimyb÷

s – sekund÷

S. aureus – Staphylococcus aureus

s. l. – sensu lato

s. s. – sensu stricto

SASP - mažas rūgščiai-tirpus proteinas

spp. – rūšys

tRNR – transportin÷ ribonukleino rūgštis

UV – ultravioletin÷ spinduliuot÷

val. – valandos

VP – Vougas Proskaueris

4

x2 – Chi kvadrat kriterijus

µg – mikro-gramas

5

TURINYS

ĮVADAS .......................................................................................................................................6

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI.....................................................................................8

2. LITERATŪROS APŽVALGA ................................................................................................9

2.1. Pieno mikroflora ir mikrobiologiniai ypatumai.....................................................................9

2.2. B. cereus ryšys su pienu ir pieno produktais .......................................................................11

2.3. B. cereus charakterizuojantys požymiai ..............................................................................14

2.4. B. cereus sukelti maistiniai apsinuodijimai .........................................................................18

3. MEDŽIAGOS IR METODAI ................................................................................................22

3.1. B. cereus tyrimas žaliaviniame piene ir pakratuose ............................................................22

3.2. B. cereus biocheminių savybių nustatymas.........................................................................23

3.3. Statistin÷ duomenų analiz÷ ..................................................................................................25

4. TYRIMŲ REZULTATAI ......................................................................................................26

4.1. B. cereus nustatymas žaliaviniame karvių piene .................................................................26

4.2. B. cereus biocheminių savybių nustatymas.........................................................................28

4.3. Pieno ir pakratų taršos tikimyb÷ ..........................................................................................30

5. TYRIMŲ REZULTATŲ APIBENDRINIMAS.....................................................................32

6. IŠVADOS...............................................................................................................................34

SUMMARY ...............................................................................................................................35

7. NAUDOTA LITERATŪRA ..................................................................................................36

8. PRIEDAI ................................................................................................................................42

6

ĮVADAS

Pienas ir pieno produktai mūsų šalies gyventojams yra viena svarbiausių kasdien÷s

mitybos dalis. Taip pat tai vienas iš pačių svarbiausių gyvūnin÷s kilm÷s produktų, turintis

specialią maistinę vertę. Jame yra riebalų, baltymų, angliavandenių, mineralinių medžiagų,

taip pat fermentų, vitaminų, organinių rūgščių – visų reikalingų medžiagų organizmui augti ir

vystytis. Pienas gali būti naudojamas ir kaip dietinis produktas, nes turi maistinių, biologinių,

energetinių ir gydomųjų savybių (Šernien÷, Sekmokien÷, 2006).

Nors pieno nauda žmogaus organizmui yra visuotinai pripažinta, nepaisant to pienas

gali būti ir pavojaus šaltiniu gyvybei ar sveikatai, nes pienas yra puiki terp÷

mikroorganizmams daugintis. Tod÷l būtina užtikrinti tinkamą mikrobiologinę pieno higieną.

Kadangi mikroorganizmai lengvai plinta, turi didelę fiziologinę įvairovę, toleruoja

ekstremalias sąlygas, jie yra plačiai paplitę ir gali užteršti bei daugintis daugyb÷je maisto

produktų. Maisto produktuose esančių mikroorganizmų elgesys (augimas, išlikimas ar

žuvimas) priklauso nuo maisto produktų savybių (pvz., vandens aktyvumo, pH) ir saugojimo

būdo (pvz., temperatūros, santykinio dr÷gnio, atmosferos) (Berthold, Molska, 2002).

Bacillus rūšys yra visur paplitę organizmai lengvai išskiriami iš dirvožemio, vandens,

dulkių ir oro. Šiuo metu yra apibūdinta apie 50 rūšių. Kai kurios Bacillus rūšys naudojamos

pramon÷je ir žem÷s ūkyje, o kitos yra patogenin÷s žmogui ir/ar gyvūnui.

Maisto pramon÷je labiausiai reikšminga Bacillus rūšis yra Bacillus cereus. Šių

bakterijų randama įvairiuose maisto produktuose, tarp jų pieno milteliuose, m÷soje,

prieskoniuose ir grūdų produktuose. B. cereus gali išlikti ir maisto produktuose, kuriuos

gaminant taikomas terminis apdorojimas. Šios bakterijos gali sukelti pieno produktų ydas:

kartų ar apkartusį skonį, vaisių ir mielių kvapą.

Keletas B. cereus s.s. padermių yra laikomos naudingomis, nes yra manoma, kad jos

skatina augalų augimą, pasižymi probiotin÷mis savyb÷mis. D÷l šių priežasčių jos yra

naudojamos gaminant maisto papildus gyvuliams, nes sugeba išgyventi jas supančioje

nepalankioje aplinkoje. Tačiau kitos gali dalyvauti gaminant enterotoksinus, kurie gali sukelti

žmonių skrandžio ir plonosios žarnos ligas, o taip pat endokarditą (Lodemann ir kt., 2008).

Taip pat šie mikroorganizmai, gali sukelti maistinius apsinuodijimus, dažniausiai kai maistas

laikomas keletą valandų nepakankamai atšaldytas prieš vartojimą ir kai jame B. cereus yra

daugiau kaip 106 kolonijas sudarančių vienetų (KVS)/g. Taigi, maisto produktų, įskaitant ir

pieno, monitoringas d÷l potencialiai patogeninių Bacillus padermių taršos yra labai svarbus.

7

B. cereus sukelia dviejų tipų maistinius apsinuodijimus – dier÷jinį ir emetinį. Šių

abiejų ligų priežastis – toksinai. Pagrindin÷ dier÷jinio apsinuodijimo priežastis – proteinų

toksinų, enterotoksinų susidarymas žarnyne mikroorganizmams augant. Emetinį

apsinuodijimą sukelia emetinis toksinas (cereulidas), cyklinis peptidas kuris susiformuoja

maiste.

8

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas:

Išskirti sporinius mikroorganizmus iš žaliavinio pieno.

Uždaviniai:

1. Nustatyti sporinius mikroorganizmus iš žaliavinio karvių pieno ir pakratų.

2. Identifikuoti B. cereus, ištirti jų biologines savybes.

3. Palyginti B. cereus paplitimą žaliaviniame piene ir pakratuose.

9

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1 Pieno mikroflora ir mikrobiologiniai ypatumai

Sveikos karv÷s natūraliame piene visada yra mikroorganizmų, kurie vadinami

įprastiniais. Šviežiame, ką tik pamelžtame piene jau būna 7-10 tūkst. bakterijų 1 ml pieno.

Dažniausiai nedidelis skaičius tokių mikroorganizmų pavojaus žmonių sveikatai nesukelia.

Kuo šių bakterijų skaičius piene mažesnis, tuo geresn÷ pieno kokyb÷. Tačiau žaliaviniame

piene gali atsirasti ir žmogaus sveikatai potencialiai pavojingų patogenų. Patogenin÷s

bakterijos sukelia rimtą gr÷smę žmonių sveikatai ir sudaro apie 90% apsinuodijimų pienu ir

pieno produktais, tod÷l natūraliame piene patogeniškų bakterijų (salmonelių, dizenterijos

suk÷l÷jų) neturi būti (McMahon ir kt., 2007).

Pieno kokybę lemia gyvulių sveikata, jų laikymo sąlygos, mitybos r÷žimas, taip pat

melžimo procesų ypatumai, pieno valymo ir šaldymo būdai. Melžimo metu yra didel÷ rizika

pieną užteršti mikroorganizmais, nes pieną pradeda veikti įvairūs aplinkos faktoriai: gyvulio

laikymo sąlygos, tinkamas tešmens paruošimas melžimui, inventoriaus, su kuriuo liečiasi

pienas, būkl÷, aptarnaujančio personalo higienos taisyklių laikymasis.

Svarbu užtikrinti, kad melžimo vieta būtų tinkamai paruošta. Reikia stengtis, kad

tvarte būtų užtikrintas kuo mažesnis dr÷gm÷s kiekis, kadangi dr÷gm÷ įtakoja mikroorganizmų

paplitimą. Vienas iš didesnių pieno užteršimo šaltinių yra karvių (gyvulio) oda, ant kurios

užsilaiko m÷šlas, šiaudai, pakratai, tod÷l ją reik÷tų tinkamai prižiūr÷ti ir valyti. Nemažiau

svarbus geras tvarto v÷dinimas, nes mikrobai į pieną patenka su dulk÷mis, per užterštus

pašarus, tod÷l taip pat svarbu pasirūpinti, kad karvių guolis būtų pakreiktas švariais šiaudais

(Masteikien÷, 2006).

Mikroorganizmai į pieną patenka ir iš karvių tešmens pro spenių kanal÷lius. Čia

mikroorganizmai laikosi, nes tešmenyje yra geros sąlygos: tinkama temperatūra, pakankamai

dr÷gm÷s ir maisto medžiagų. Karv÷s organizmo imuninis barjeras, trukdo mikroorganizmams

patekti į tešmenį ir jame daugintis. Tai pieno fermentai ir proteinai. Bakteriostatiškai

veikiantis lizocimas stabdo mikrobų dauginimąsi piene ir kuo šio fermento koncentracija

piene ir kraujo serume didesn÷, tuo stipresnis bakteriostatinis poveikis mikroorganizmams.

Karv÷ms sergant mastitu, lizocimo kiekis piene maž÷ja (Masteikien÷, 2006).

Melžiant, pirmosios čiurkšl÷s turi būti numelžiamos į specialų indelį, atskirai nuo

taros, kur bus melžiamas pienas, nes pirmosiose čiurkšl÷se gali būti kazeino krešulių. Tai

10

mastitu sergančių karvių požymis. Siekiant išvengti pieno bakterinio užteršimo, taip pat

kovojant su slaptais ir klinikiniais mastitais, būtina po melžimo atlikti spenių dezinfekcija. Tai

viena svarbiausių profilaktikos priemonių (Masteikien÷, 2006).

Iš karto pamelžus, būtina pieną kuo greičiau atšaldyti iki 5-10ºC temperatūros, nes

žema temperatūra n÷ra palanki bakterijoms daugintis.

Po melžimo būtina visą inventorių gerai išplauti, dezinfekuoti, iššluostyti ir laikyti

sausai, nes nepašalinus pieno likučių ir toliau naudojant įrangą mikroorganizmai greitai

dauginasi ir patenka į pieną, gadindami žaliavinio pieno kokybę.

Geriamasis pienas vartotojui gali būti tiekiamas įvairiai apdorotas: žalias,

pasterizuotas ar sterilizuotas, supakuotas arba nesupakuotas. Svarbiausia, kad jis būtų saugus

vartoti, išsilaikytų šaldytuve kelias dienas. Pasterizuoto pieno maistin÷ vert÷ ir kitos savyb÷s

neturi skirtis nuo žaliavinio pieno.

Pasterizacija – pieno šiluminis apdorojimas, kurio metu, sunaikinamos vegetatyvin÷s

mikroorganizmų formos ir inaktyvuojami pieno fermentai fosfataz÷ ar peroksidaz÷. Kai

pienas 63–65°C temperatūroje išlaikomas 30 min., arba 15 s. 72°C temperatūroje,

inaktyvuojama šarmin÷ fosfataz÷. Sunaikinami beveik visi patogeniniai mikroorganizmai, taip

pat miel÷s, pel÷siai ir dalis vegetatyvinių bakterijų. Serumo baltymai, bakteriostatin÷s

medžiagos nepažeidžiamos ar mažai pažeidžiamos. Šildant 20 s, 75°C temperatūroje

denatūruoja serumo baltymai. Naudojant 20 s 85°C r÷žimą, denatūruojasi fermentas

peroksidaz÷. Dažnai naudojamos ir aukštesn÷s temperatūros – iki 100°C. Sunaikinami visi

vegetatyviniai mikroorganizmai, bet sporos lieka. Pieno bakteriostatin÷s medžiagos

sunaikinamos, o fermentai lipaz÷ ir proteaz÷ dalinai lieka (Šernien÷, Sekmokien÷, 2006).

Po pasterizacijos piene gali likti bakterijų, tarp jų daug termostabilių psichrotrofų,

gerai besidauginančių atv÷sintame piene. Nustatyta, kad šių bakterijų kiekis žaliame piene yra

didesnis vasaros metu. Pagrindiniai psichrotrofinių bakterijų tipai žaliame piene yra:

• B. cereus;

• B. stearotermophilus;

• B. licheniformis;

• B. circulans.

Ultra aukštoje temperatūroje pienas yra paveikiamas 135°C vienai ar daugiau

sekundžių laiko periodui. Po to pienas yra supakuojamas į aseptinę tarą ir gali būti laikomas

įprastin÷je temperatūroje. Apdirbant pieną ultra aukšta temperatūra B. cereus sporos žūva.

Pieno galiojimo laikas priklauso nuo kaitinimo temperatūros, laiko ir terminio apdirbimo

11

pobūdžio (Janstova, Lukasova, 2001). Tačiau po apdirbimo ultra aukštoje temperatūroje,

pieno produktai netenka kai kurių skonio savybių, kurios lieka pasterizavus įprastiniu būdu.

Tam, kad pašalinti sporas iš pieno gali būti naudojamas baktofugavimo metodas, kuris

pašalina bakterijas, o ypač jų sporas iš pieno naudojant aukštų apsukų centrifugą. Šio proceso

d÷ka iš pieno galima pašalinti iki 94–98 proc. aerobinių sporų. Kitas galimas bakterijų ir jų

sporų šalinimo būdas – mikrofiltravimas. Šis metodas yra efektyvesnis už baktofugavimą,

kadangi naudojant jį yra pašalinama 99,1–99,4 proc. aerobinių sporų (Te Giffel, Van der

Horst, 2003). Panaudojus terminį pieno apdirbimą, papildomas baktofugacijos ar

mikrofiltravimo metodų naudojimas padidina pieno perdirbimo kainą. Dažnai sūrio gamybos

metu, baktofugacija ir mikrofiltravimas yra naudojamas kartu su terminiu pieno apdirbimu

tam, kad būtų pašalintos Clostridium sporos, kad brandinimo metu būtų išvengta butano

rūgšties fermentacijos. Galima manyti, kad sporų šalinimas iš pieno mikrofiltravimą derinant

su pasterizavimu bus dažnai naudojamas ateityje (Barbano ir kt, 2006).

2.2 B. cereus ryšys su pienu ir pieno produktais

D÷l piene esančio didelio kiekio maistingų medžiagų, pienas yra labai palanki terp÷

augti daugeliui bakterijų, įskaitant ir tas, kurios priklauso Enterobacteriaceae,

Streptococcaceae ir Bacillaceae šeimai. Iš tiesų šių mikroorganizmų dauginimosi sparta gali

lemti pieno ir pieno produktų užteršimą maisto paruošimo procesuose, kurie yra naudojami

maisto pramon÷je. Iš esm÷s, pieno produktų užteršimas Bacillus cereus grup÷s

mikroorganizmais yra reikšmingas ne tiek d÷l įtakos pieno produktų gedimui, bet d÷l

keliamos gr÷sm÷s žmonių sveikatai ir gyvybei (Bartoszewicz ir kt., 2008).

B. cereus gali plačiai paplisti aplinkoje ir užteršti pieno produktus per šiuos šaltinius:

žemę, grūdų kultūras ir pieno produktų gamybos priemones (Berthold, Molska, 2002). Jų

sporos į pieną patenka nuo nešvaraus tešmens ir spenių.

Svarbu pamin÷ti, kad šie mikroorganizmai, sugeba greitai atkurti sporų formas, be to

daugelis yra psichrotolerantiški, o tai, esant maisto medžiagoms, yra esminiai faktoriai,

leidžiantys jiems augti žemose temperatūrose (Bartoszewicz ir kt., 2008). Nors yra nemažai

duomenų apie B. cereus s.s. sporų atsiradimą žaliaviniame ir termiškai apdirbtame piene,

tačiau to negalima pasakyti apie kitos B. cereus s.l. rūšies paplitimą šiose terp÷se. Šiuo metu

B. cereus s.s. įtaka pieno kokybei yra plačiai studijuojama Skandinavijos šalyse.

Švedijoje Svensson ir kiti bendraautoriai (1999) nustat÷, kad žaliavinio pieno užteršimas

varijuoja skirtingais sezonais. Yra nustatyta, kad daugiausia B. cereus s.s. yra suskaičiuojama

12

šiltojo (ganymo) sezono metu, o mažiausiai – žiemą (Christiansson ir kt., 1999). Šie

duomenys leidžia teigti, kad užteršimo lygio svyravimui gali tur÷ti įtakos bacilų paplitimas

fermose ir pramonin÷je aplinkoje, o ypač paplitimas ant tešmenų ir melžimo įrangos.

Nyderlanduose ištirtas žalio pieno užterštumas B. cereus atsitiktinai pasirinktose 54

fermose žiemą ir 47 fermose – vasarą. Šių tyrimų tikslas buvo ne tik nustatyti skirtumus tarp

fermų d÷l B. cereus skaičiaus žaliaviniame piene, bet ir nustatyti ryšius tarp bendro bakterijų

skaičiaus, bakterijų sporų ir B. cereus skaičiaus. Žiemą 21-os fermos piene buvo rasta nuo 1

iki 120 B. cereus sporų 10 ml tiriamo pieno. Vasarą 20-yje iš 47 ištirtų fermų piene buvo rasta

nuo 1 iki 100 B. cereus sporų 10 ml pieno. Tarp bendro bakterijų skaičiaus ir sporų skaičiaus

rastas teigiamas koreliacinis ryšys. Nyderlanduose randama apie 10 B. cereus sporų 100 ml

žaliavinio pieno (Te Giffel ir kt., 1997).

Remiantis Nyderlanduose atliktu tyrimu (Te Giffel ir kt., 1997) kurio metu buvo

paimti m÷giniai iš oro, dirvos, žol÷s, pakratų (naudotų ir nenaudotų), maisto (šieno, siloso,

burokų), geriamo vandens, išmatų, tešmens ir pieno. Ištyrus m÷ginius buvo nustatyta, kad

labiausiai užkr÷sta buvo žem÷ ir išmatos, o žiemą kai karv÷s laikomos tvartuose – pakratai.

Šie užterštumo šaltiniai l÷m÷ B. cereus atsiradimą tešmens išor÷je, o tai savo ruožtu l÷m÷

žalio pieno užterštumą min÷tomis bakterijomis. Iš fermoje paimtų ir išskirtų B. cereus

bakterijų 43% buvo psichotropin÷s (Te Giffel ir kt., 1997). Šiuos duomenis patvirtina ir kiti

tyrimai (Griffiths, Phillips, 1999). Tik 6% padermių nustatytų tiriant pieno perdirbimo

gamykloje pasterizuotą pieną, geb÷jo daugintis 7ºC temperatūroje. Šie tyrimų duomenys rodo,

kad padermių geb÷jimą augti lemia pieno laikymo ir tiekimo sąlygos. Šią hipotezę patvirtina

ir kitų tyrimų duomenys teigiantys, kad namų ūkiuose didžiojoje dalyje pasterizuoto pieno

rastų bakterijų buvo psichotropin÷s. Atkreiptinas d÷mesys, kad pieno milteliuose išskirtos

B. cereus paderm÷s neaugo žemose temperatūrose ir tai gal÷jo lemti specifinis pieno miltelių

gamybos procesas, kurio metu n÷ra naudojamos žemos temperatūros (Te Giffel ir kt., 1997).

Christiansson ir kt. (1999) tyr÷ užterštumo kelius fermose. Tyrimo metu buvo

nustatyta, kad karvių ganymo sezono metu B. cereus užterštumas šiene, silose, koncentrate ir

žol÷je yra panašaus lygio. Taip pat tyrimas parod÷, kad lietingu oru melžtų karvių piene B.

cereus sporų yra daugiau negu melžtų sausu laiku. Nustatyta aukšta koreliacija tarp karv÷s

spenelių ir pieno užterštumo. Rezultatai parod÷, kad pieno užterštumo riziką gerokai padidina

dr÷gnas dirvožemis. Daugelyje fermų atlikti tyrimai parod÷, kad pienas labiausiai užterštas

min÷tomis bakterijomis yra rugpjūčio – rugs÷jo m÷nesiais, nors taip pat jų rasta dviejose

fermose žiemos periodu (Christiansson ir kt., 1999). Taip pat tyrimų nustatyta, kad šienas ir

dulk÷s yra vieni pagrindinių taršos šaltinių žiemą, o dirvožemis – vasarą. Ištirtos B. cereus

13

sporos esančios žol÷je, silose, šiene, dirvožemyje, fekalijose, pieno melžimo aparatuose,

žaliaviniame piene ir buvo nustatyta koreliacija tarp pieno užterštumo sporomis lygio ir

maisto bei ÷džių užterštumo (Altayar, Sutherland, 2006).

Magnusson ir bendraautoriai (2007) tyr÷ pieno užterštumą kai karv÷s buvo laikomos

uždarai. Buvo nustatyta, kad tais atvejais kai karv÷s buvo laikomos tvartuose pririštos ar

laisvai, piene užterštumas B. cereus sporomis buvo panašiame lygyje, o maisto, pakratų,

vandens ir oro tarša buvo nežymi. Tačiau tais atvejais kai karv÷s guolis buvo gilus ir

pakreiktas pjuvenomis, tarša buvo gana žymi, panašaus dydžio kaip ir ganymo periodu. Šių

atliktų tyrimų rezultatai parod÷, kad yra ryšys tarp B. cereus kiekio karvių guolyje ir piene.

Tik÷tina, kad tiesiogine pieno taršos priežastis atsirado d÷l spenelių ir užteršto kraiko kontakto

(Magnusson ir kt., 2007). Remiantis šia prielaida, galima teikti, kad pieną gali būti sunku

visiškai izoliuoti nuo bakterijų taršos diegiant geresnes gyvulių auginimo praktikas. Tačiau

patobulinus pasiruošimą melžimui, o ypač atkreipiant d÷mesį į spenių valymą, galima pasiekti

mažesnį pieno taršos B. cereus lygį.

Tiriant B. cereus užteršimo lygį pieno apdirbimo gamykloje, nustatytas panašus

žaliavinio pieno užterštumo lygis fermoje ir pieno apdirbimo įrangoje, atitinkamai 36% ir

35% (Lin ir kt., 1998). Lin ir kitų mokslininkų atliktas tyrimas parod÷, kad dviejuose pieno

apdirbimo gamyklose pieno užterštumas bakterijomis buvo santykinai žemas (7–10%), tačiau

daugiau negu 90% galutinio pieno produkto pagaminto šiose gamyklose buvo užkr÷sti

B. cereus paderm÷mis. Šias pieno užterštumo tendencijas buvo pasteb÷tos Te Giffel ir

bendraautorių (1999). Pirmoje gamykloje, kurioje buvo gaminamas pasterizuotas pienas

B. cereus mikroorganizmais buvo užterštas 71% galutin÷s pieno produkcijos, o antrojoje

gamykloje, kurioje buvo gaminami pieno milteliai, galutinio produkto tarša siek÷ iki 60%.

Nustatytas užterštumo lygis buvo žemas, kadangi mikroorganizmus buvo galima nustatyti tik

juos prieš tai inkubavus 6 val. 30ºC. Šį žemą užterštumo lygį patvirtina ir kiti tyrimai (Lin ir

kt., 1998).

Remiantis moksline medžiaga nustatyta, kad kai kurie B. cereus tipai yra randami viso

pieno ar pieno miltelių apdirbimo proceso metu, o tai savo ruožtu leidžia teigti, kad žaliavinis

pienas pats savaime gali būti taršos šaltinis (Eneroth ir kt. 2001). Kitos B. cereus rūšys buvo

identifikuotos po pieno pasterizacijos etapo, o tai leidžia manyti, kad taip pat gali būti

papildomi taršos šaltiniai, pvz., pieno apdirbimo įranga. Min÷tų bakterijų ląstel÷s gali prikibti

prie paviršių ir formuoti kolonijas (Wirtanen ir kt. 2003). Šiomis sąlygomis ląstel÷s gali augti

ir daugintis, tod÷l sporos gali tapti nuolatiniu pieno perdirbimo įrangos taršos šaltiniu

(Eneroth ir kt. 2001).

14

Magnusson ir bendraautorių (2006) atliktas tyrimas parod÷, kad pagrindine pieno

B. cereus užkr÷timo priežastimi yra sporos rastos žaliaviniame piene. Tam tikras kiekis pieno

užteršto min÷tomis bakterijomis buvo nustatytas ir jį pasterizavus. Tod÷l galima teigti, kad B.

cereus užkr÷timas gali įvykti bet kurioje pieno apdirbimo stadijoje (B. cereus bakterijos buvo

rastos silose, pasterizatoriuje ir pakavimo įrenginiuose). Lin ir kt. (1998) taip pat nustat÷, kad

žaliavinis pienas yra pagrindinis taršos šaltinis, o popasterizacinis pieno apdirbimo etapas,

n÷ra labai reikšmingas kovojant su bakterine pieno tarša.

J. Schlegelova ir kiti autoriai (2003) teigia, kad d÷l B. cereus vegetatyvinių ląstelių ir

sporų hidrofobiškumo, jos yra linkusios prikibti prie pieno riebalų lašelių, tod÷l tikimyb÷ rasti

B. cereus liesame piene ir iš lieso pieno pagamintuose produktuose yra mažesn÷, nei riebiame

piene ar iš riebaus pieno pagamintuose produktuose.

2.3 B. cereus charakterizuojantys požymiai

Bacillus cereus – gramteigiamos, aerobin÷s arba fakultatyvin÷s anaerobin÷s, sporas

sudarančios, judrios arba nejudrios 1,0-1,2 µm pločio ir 3,5-5,0 µm ilgio lezdel÷s. Geriausiai

auga esant pH 4.5-9.3, vandens aktyvumui esant didesniam nei 0.92, o druskos koncentracijai

ne didesnei kaip 7,5%. Trys amino rūgštys L-valinas, L-leucinas ir L-treoninas yra

svarbiausios B. cereus augimui (Agata ir kt. 1999). Jų augimą slopina 1000 µg/ml laktoferino

koncentracija (Sato ir kt., 1999). Augimui palanki temperatūra yra labai įvairi. Optimaliausia

– nuo 28 iki 35ºC, minimali – 4-5ºC, maksimali – 48ºC. Sporos gali sudygti greitai, kai kurių

padermių – per 30 min, tam reikia tam tikro skaičiaus glicino ar alanino ir purino ribozidų.

B. cereus priklauso Bacillaceae šeimai, turinčiai penkias gentis:

• Bacillus,

• Clostridium,

• Sporosarcina,

• Sporolactobacillus,

• Desulfotomaculum.

Plačiausiai išplitusios ir reikšmingiausios yra Bacillus ir Clostridium genčių

bakterijos. Labai svarbios patogenin÷s rūšys priklausančios Bacillus cereus grupei, kuri

susidaro iš:

• B. cereus;

• B. mycoides;

15

• B. thuringiensis;

• B. anthracis;

• B. weihenstephanensi;

• ir B. pseudomycoides.

Daugelis rūšių yra natūraliai paplitusios dirvožemyje. Šios rūšys skiriasi tarpusavyje

biochemin÷mis savyb÷mis, tačiau jas atskirti sud÷tinga.

B. cereus padermių temperatūrinio r÷žimo tolerancijos nustatymas yra svarbus

įvertinant padermes. Mikrobiologinius nustatymo metodus sudaro naujai augančios

inokuliuotos paderm÷s auginamos įvairiose temperatūrose. Nustatytos padermių vystymosi

kritin÷s temperatūrų ribos yra 10 ir 42ºC. Pagal padermių dauginimuisi ir augimui daromą

temperatūrinio r÷žimo įtaką, galima išskirti šias B. cereus padermes:

Mezofilin÷s. Šios paderm÷s auga temperatūrai esant 10–42ºC, optimali augimo

temperatūra – 30 – 37ºC.

Psichrofilin÷s. Šios paderm÷s gali augti ir žemesn÷je nei 10ºC temperatūroje,

maksimali augimo temperatūra 42ºC. Optimali – 37ºC laipsniai.

Psichrotrofin÷s. Skirtingai nei kitos B. cereus paderm÷s šios geba augti žemesn÷je

nei 10ºC, tačiau 42ºC temperatūra n÷ra palanki jų augimui. Optimali augimo temperatūra yra

37ºC laipsniai.

Mokslin÷je literatūroje pateikti faktai liudija apie B. cereus galimybę augti žemose

temperatūrose (psichrotofin÷ savyb÷) ir neigiamą poveikį žemoje temperatūroje laikomo

pasterizuoto pieno ir kitų produktų kokybei. Laikomo pieno kokybę neigiamai gali paveikti

net ir nedidelis sporų skaičius (Lechner ir kt., 1998)

Bakterijų sporos yra gerai prisitaikiusios išgyventi nepalankias sąlygas. Jos formuojasi

bakterijų viduje, tod÷l vadinamos endosporomis. Visos Bacillus rūšys gali formuoti karščiui

patvarias endosporas (Henriques, Moran, 2007). Bakterijų endosporas sudaro kieta, neveikli

struktūra, kuri yra labai atspari (Atrih, Foster. 1999). Bacillus formuojamos endosporos yra

vienos pagrindinių veiksnių, leidžiančių mikroorganizmui išgyventi jam nepalankiose

sąlygose.

Subrendusių sporų struktūrą sudaro:

1. Šerdis, kuri yra vegetatyvin÷s ląstel÷s protoplasto analogas, nes ji turi DNR,

ribosomas, tRNR ir aukštą dipikolino rūgšties ir Ca+2 koncentraciją (Setlow, 2006). Ją

sudaro tik 25 – 50 % vandens, tai reiškia, kad ląstel÷je esančio vandens lygis yra labai

mažas, o tai savo ruožtu apriboja makromolekulinį jud÷jimą (Cowan ir kt., 2003).

16

2. Bakterijos ląstel÷s sienel÷ sudaryta iš peptidogliukano, identiško vegetatyviniai

ląstelei (Setlow, 2006).

3. Žiev÷s pagrindin÷ medžiaga peptidogliukanas skiriasi nuo vegetatyvin÷s ląstel÷s

peptidogliukano. Žiev÷ yra atsakinga už sporos formavimąsi ir vandens lygį joje

(Atrih, Foster, 1999).

4. Sporos apvalkalas, kurį sudaro keli sluoksniai skirtingų proteinų, daugiausia –

specifiniai ir atsakingi už atsparumą chemikalams ir enzimams (Setlow, 2006).

5. Egzospora, kuri supa sporą (Yan ir kt., 2007). B. cereus egzosporą sudaro daugiau nei

20 proteinų (Steichen ir kt., 2003; Todd ir kt., 2003), amino ir neutralūs polisacharidai,

lipidai ir anglis. Alanino proteinas yra pagrindinis B. cereus egzosporos komponentas

(Yan ir kt., 2007). Jis verčia L-alanino į D-alanino formą (Steichen ir kt., 2003; Todd

ir kt., 2003).

1 pav. B. cereus paderm÷s kultūros padarytos elektroniniu mikrografu atvaizdas.

Maria A. Andersson ir F. Mayer (1999).

Bacillus sporos egzosporos yra apsuptos į plaukus panašiu proteinų sluoksniu (Todd ir

kt., 2003).

B. cereus sporos yra labai atsparios nepalankioms sąlygoms, tokioms kaip karštis,

dehidratacija, radiacija, taip pat dezinfektantams ir valymo priemon÷ms. Buvo nustatyta, kad

B. cereus sporos išaugintos 37ºC temperatūroje buvo gyvybingesn÷s aukštoje temperatūroje

(90ºC), palyginti su sporomis išaugintomis 15–20ºC (Gounina-Allouane ir kt., 2008).

17

Bakterijos atsparumo savyb÷ms yra svarbūs keletas elementų. Dipikolinin÷ rūgštis

(piridinas-2, 6-dikarboksilin÷ rūgštis) yra atsakinga už vandens lygio sumažinimą sporos

šerdyje sporuliacijos metu ir už UV fotochemiją sporos DNR. Ši molekul÷ sudaro nuo 5 iki

20% išdžiovintos Bacillus sporos svorio. Ji yra sužieduota su dvivalenčiais teigiamais

atomais, daugiausia su Ca+2 (Setlow, 2007). Mažas rūgščiai-tirpus proteinas sporos šerdyje yra

svarbus veiksnys lemiantis sporos atsparumą. SASP taip pat yra svarbus sporos atsparumo

osmosui vystymuisi (Setlow, 2007).

Nors informacija apie sporų savybes tiesiogiai neprisideda prie B. cereus apibūdinimo

ir identifikavimo, ši informacija gali būti naudinga charakterizuojant riziką susijusią su

B. cereus paderm÷mis.

Sporos formuojamos įvairiose, augimą skatinančiose, terp÷se aerobin÷mis sąlygomis.

Mangano buvimas ir mangano jonai stimuliuoja sporuliaciją. Sporuliaciją sudaro asimetrinių

lastelių skaidymasis, kopijuojant genomą padalintą į kiekvieną iš seserinių lastelių Mažesn÷

lastel÷ subrestą į suaugusią endosporą. Motinin÷ ląstel÷ prisideda prie endosporos atskyrimo

proceso autolyz÷s būdu paleisdama subrendusią ląstelę į aplinką (Henriques, Moran, 2007).

Reikia apie 6 val. tam, kad įvyktų sporos formavimosi procesas (Henriques, Moran, 2007).

Sporų augimas n÷ra nuoseklus. Vienos sporos suformuoja vegetatyvinę ląstelę per 2 val.,

kitoms gali prireikti daugiau valandų, ar netgi dienų. Broussolle ir bendraautorių (2008)

atliktas tyrimas parod÷, kad iš 12 tirtų B. cereus padermių, 2 iš viso nesidaugino, o kitų

padermių dauginimosi maksimumas buvo steb÷tas po 100 min. Po nustatyto dauginimosi

maksimumo 160–200 min. intervale dauginimasis nevyko. Dauginimasis vyksta be naujų

makromolekulių sintezavimo poreikio, visa ko reikia dauginimuisi jau yra subrendusioje

sporoje (Moir 2006).

Augimo metu medžiagos prasiskverbia pro išorinį sporos apvalkalo ir žiev÷s

sluoksnius ir sąveikauja su receptoriais esančiais vidin÷je sporos membranoje. Tada tokie

mišiniai kaip monovalentiniai kationai (H+, Na+, K+), divalentiniai kationai (Ca+2, Mg+2,

Mn+2) yra paleidžiami iš sporos šerdies (Moir, 2006). Kai spora auga mikrobo gemalo ląstel÷s

siena tampa bakterine ląstel÷s siena. Peptidogliukano hidroliz÷ yra reikalinga augimui ir sporų

dauginimuisi. Sporos šerdis greitai siurbia vandenį tam, kad vandens lygmuo susilygintu su

augančios ląstel÷s protoplaste esančiu vandens lygmeniu ir būtų atstatytas makromolekulinis

jud÷jimas ir enzimų aktyvumas šerdyje (Setlow, 2001).

B. cereus rūšys turi fenotipus, kurie skiria tos pačios grup÷s vienus narius nuo kitų:

B. cereus s. s. ląstel÷s yra judrios, neturi parasporadinių kristalų, yra atsparios penicilinui ir

bakteriofaginiams (gama) virusams (Granum, 2007).

18

ß – laktamazių gamyba yra vienas potencialių virulentiškumo faktorių, kuris leidžia

bakterijai būti atspariai net ir trečios kartos cefalosporinams. V÷lesni vaistai yra efektyvūs jei

jie naudojami kaip sporuliacijos inhibitoriai jautrioms B. cereus paderm÷ms (Kotiranta ir kt.,

2000). N÷ra nustatyta ryšio tarp plazmidžių ir B. cereus padermių, izoliuotų iš pieno, ir

atsparumo antimikrobiniams vaistams. Yra nustatytas atsparumo tetraciklinui genas, esantis

ant potencialaus judraus elemento – plazmid÷s pBC16. Taip pat nustatyta, kad atsparumas

antimikrobin÷ms medžiagoms, tokioms kaip meticilinas, gentamicinas, kanamycinas ir

tetraciklinas, gali būti įgyjamas tarp gramteigiamų mikroorganizmų, kuriems priklauso ir

B. cereus, apsikeičiant plazmid÷mis (ECDC, 2002).

2.4 B. cereus sukelti maistiniai apsinuodijimai

1950 metais buvo nustatytas ryšys tarp B. cereus ir maistinių apsinuodijimų. Tyrimo

metu B. cereus buvo išskirti ir inokuliuoti 106 mikroorganizmų į sterilų padažą. Eksperimento

metu pra÷jus 16 val. po B. cereus stipriai užkr÷sto vanilinio padažo suvartojimo, pasireišk÷

pilvo skausmai, pykinimas ir vandeninga diar÷ja. Po šio bandymo B. cereus buvo nustatytos

kaip diar÷jinį susirgimą lemiantis agentas (Haug, 1955). Tačiau prireik÷ beveik 20 m., kol

buvo pripažinta, kad B. cereus gali tapti gastrointestinalionio susirgimo priežastimi

(Mortimer, McCann, 1974).

Mokslin÷je literatūroje yra pateikiami duomenys apie B. cereus sukeltus maistinius

apsinuodijimus. Remiantis šiais duomenimis B. cereus l÷m÷ apie 33% visų maistinių

apsinuodijimų Norvegijoje (1988-1993), 47% Islandijoje (1985-1992), 22% Suomijoje

(1992), 8,5% Olandijoje (1991) ir 5% Danijoje (1990-1992). Gerokai mažesni apsinuodijimų

skaičiai buvo nustatyti Jungtin÷je Karalyst÷je – 0,7%, Japonijoje – 0,8%, JAV – 1,3% ir

Kanadoje – 2,2% (Berthold, Molska, 2002).

Bacillus cereus maistinius apsinuodijimus dažniausiai lemia sporų geb÷jimas išlikti

maistą verdant/ pasterizuojant ir daugintis kada maistas yra netinkamai atšaldytas. Minimalus

kiekis reikalingas sukelti abiejų tipų apsinuodijimus kai suvirškintame maiste yra 105 – 108

kvs/g mikroorganizmų. Tačiau yra pranešimų, kad emetinio tipo apsinuodijimą gali sukelti

maistas kuriame yra tik 103 ksv/g mikroorganizmų.

Dier÷jinio apsinuodijimo simptomai pasireiškia pra÷jus 8–16 val. po užkr÷sto maisto

suvartojimo vandeningu viduriavimu, pilvo spazmais, pykinimu. Emetinio apsinuodijimo

simptomai – pykinimas ir v÷mimas – pasireiškia pra÷jus 1–5 val. po užkr÷sto produkto

19

suvartojimo. Abiejų užk÷timų atvejais klinikinių požymių trukm÷ trunka apie 24 val.

(Guinebretiere ir kt., 2002).

Dier÷jinis apsinuodijimas įtakojamas B. cereus rūšies gaminamų enterotoksinų.

Šiuolaikinis mokslas yra apibūdinęs keturis toksinus:

1) hemolitinis BL toksinas, tai hemolitinis enteroksino kompleksas susidedantis iš trijų

proteinų,

2) ne hemolitinis enterotoksinas – ne hemolitinis enterotoksinas kompleksas

susidedantis iš trijų proteinų,

3) enterotoksinas T – proteinas,

4) cytotoksinas K – proteinas. Trys iš šių toksinų yra susiję su maistiniais

apsinuodijimais, o enterotoksinas T – ne.

Yra manoma, kad iš visų B. cereus s. s. išskiriamų enteretoksinų, trikomponentis HBL

ir (NHE) yra tiesioginiai susiję su apsinuodijimu maistu. Nors HBL ir NHE yra skirtinguose

chromosominiuose operonuose, jų genetin÷ struktūra ir proteinų kodavimas turi daug

panašumų, tiek reguliaciniame, tiek struktūriniame lygyje (Michelet ir kt., 2006). Lund ir

bendraautoriai (2000) yra nustatę, kad CytK, 34 kDa proteinas su hemolizine ir nekrotine

veikla taip pat skatina B. cereus intoksikaciją. Taip pat svarbu pažym÷ti, kad B. cereus s.s. ir

B. weithensephanensis paderm÷s, kurios sintetina cereulidą, yra atsakingos už emetinio

sindromo suk÷limą (Dierick ir kt., 2005; Thorsen ir kt. 2006). Lengvų emetinių susirgimų,

trunkančių 6-24 val., sukeltų cereulido dažnai nustatoma vaikams (Dierick ir kt., 2005).

Nepaisant potencialios patogeninių ir nepatogeninių padermių dauginimosi piene,

Hoton ir bendraautoriai (2005) nustat÷, kad cereulido sintezei būtinas genas yra plasmidin÷s

prigimties ir, kad horizontalus geno perdavimas gali įvykti B. cereus s. l., izoliuotų nuo įvairių

sluoksnių, taip pat ir maisto, tarpe (Van der Auswera ir kt., 2007). Taigi negalima atmesti

prielaidos, kad gali įvykti ir toksino geno perdavimas.

Cereulidas (2 pav.) yra aukšto lipolipiškumo molekul÷ ir tod÷l žarnyne yra efektyviai

absorbuojama (Paananen ir kt., 2002). Cereulidas nehemolyzuoja triušių ar avių eritrocitus ir

tod÷l neturi fosfolipaz÷s C. Cereulidas yra atsparus karčiui (121ºC 90min.) ir pepsino bei

tripsino proteolitiniui aktyvumui, o taip pat stabilus esant aplinkos pH 2 – 11. B. cereus

kultūros cereulidą pradeda gaminti stacionarioje faz÷je nepriklausomai nuo sporuliacijos

(Haggblom ir kt., 2002).

Celeuridas yra rūgštims atsparus, bei toksiškas net ir mažomis doz÷mis. Cereulidas ir

sukelia emetinio apsinuodijimo požymius iškart suvartojus toksinais užkr÷stą maistą.

Nustatyta, kad cereulidas yra toksiškas mitochondrijai, ir veikia kaip valinomycinas (Hoton ir

20

kt., 2005). Šis cereulidas naikina žmogaus naturalias ląsteles, kurios yra imunin÷s sistemos

dalis. Nekintančioje augimo faz÷je nustatyti didžiausi emetinio toksino kiekiai. Cereulidų

kiekis priklauso tiek nuo inkubavimo temperatūros ir terp÷s, tiek nuo kitų išorinių faktorių,

tokių kaip pH, v÷dinimas, specifinių amino rūgščių buvimas. Psichrotolerantin÷s paderm÷s

gamina enterotoksinus, o mezofilinių padermių emetinio toksino gamyba ribojama žemos 10

– 15ºC temperatūros, tod÷l tai paaiškina, kod÷l n÷ra nustatoma toksinų žemesn÷je nei 10ºC

temperatūroje (Beattie, Williams, 2000).

2 pav. Cereulido chemin÷ struktūra [-D-OVal-D-Val-L-O-Ala-L-Val-]3

(Prieiga per internetą:

http://www.biocenter.helsinki.fi/groups/salkinoja/heat_stable.htm&usg=__kL1fntc2k9LKDT

Opv-9zekkfXAM)

Iš maisto produktų B. cereus gali būti ištirtos taikant tradicinius mikrobiologinius

metodus. B. cereus maisto produktuose aptikti naudojamas atrankusis agaras, pvz., MYP

(manitolio, kiaušinių trynio, polimiksino) agaras. Polimiksinas įjungtas į terp÷s sud÷tį turint

tikslą nuslopinti kitų mikroorganizmų augimą, o B. cereus yra labai atsparios šiam

antibiotikui. MYP agaro sud÷tyje yra kiaušinio trynys, kurį veikia lecitinaz÷ – fermentas,

randamas B. cereus. Aplink kolonijas susidaro nuos÷dų zonos. B. cereus kolonijos dažniausiai

rausvos; spalvos intensyvumas did÷ja ilgiau inkubuojant. B. cereus kolonijoms patvirtinti

atliekami papildomi testai pateikti 2 lentel÷je.

21

1 lentel÷. B.cereus grup÷s bakterijų patvirtinimo testai Patvirtinimo testai B. cereus B. thuringiensis B. mycoides

Dažymas Gramo būdu + + +

Katalaz÷ + + +

Judrumas ± ± -

Nitratų redukavimas + ± +

Tirozino skaidymas + + ±

Atsparumas lizocimui + + +

Kiaušinio trynio

hidroliz÷ + + +

Gliukoz÷s

panaudojimas + + +

Voges-Proskauerio

reakcija + + +

Rūgšties iš manitolio

susidarymas - - -

Hemolizinas + + +

Serologiniai metodai gali būti taikomi toksinams, sukeliantiems diar÷jinius

apsinuodijimus, aptikti, o ląstelių kultūrų metodais aptinkami emetinių apsinuodijimų

toksinai. Toksinų susidarymas priklauso nuo bakterijų augimo sąlygų, pvz., nuo terp÷s pH ir

cukraus koncentracijos. Parengti du komerciniai in vitro imuninių metodų rinkiniai B. cereus

diar÷jiniams enterotoksinams aptikti. Tai – BCET-RPLA (priešingos pasyvios latekso

agliutinacijos metodas), Oxoid firmos metodas ir BDE-VIA – vizualinis imuninis metodas,

Tecra firmos. Hemolitinis enterotoksinas aptinkamas RPLA metodu, nehemolitinis

kompleksas – Tecra VIA (Šalomskien÷, Bartiuk, 2006).

22

3. MEDŽIAGOS IR METODAI

Tyrimai atlikti 2008 – 2010 metais, Lietuvos veterinarijos akademijoje, Užkrečiamųjų

ligų katedroje, mikrobiologijos laboratorijoje.

Iš viso ištirti 369 pieno m÷giniai. 330 pieno m÷ginių imta iš UAB „X“, 39 pieno

m÷giniai imti iš „X“ ūkininko esančio Pasvalio rajone.

M÷giniai buvo paimti steriliai, į sterilius m÷gintuv÷lius. Tam, kad nebūtų pakenkta

tyrimų rezultatams m÷gintuv÷liai su pieno m÷giniais į laboratoriją buvo gabenami

kompaktiškame, transportavimui skirtame šaldytuve.

Buvo ištirti 16 m÷ginių iš pakratų, kurie buvo imti iš UAB „X“, iš kurio buvo imti ir

pieno m÷giniai. M÷giniai paimti steriliai ir atvežti į laboratoriją sterilioje taroje.

3.1 B. cereus tyrimas žaliaviniame piene ir pakratuose

Visi pieno (369) ir pakratų (16) m÷giniai s÷jami 0,01 ml mikropipete ant kraujo agaro

(KA) ir maitinamojo agaro (MA) (Oxoid, Anglija). KA ir MA ruošiami pagal metodiką

nurodytą ant pakuot÷s. Kontrolei 1 – 2 l÷kštel÷s dedamos į termostatą 24 val. Užs÷tos

vienkartin÷s Petri l÷kštel÷s kultivuojamos termostate esant 37ºC temperatūrai 24 – 48 val. Po

kultivavimo vertinama išaugusių kolonijų spalva, dydis, hemoliz÷s pasireiškimas. Atlikus

vertinimą su atrinktomis charakteringomis kolonijomis atliekamas katalaz÷s testas. Ant

objektinio stiklelio užlašinamas 1 lašas vandenilio peroksido tirpalo, kilpele nuo KA paimama

tiriamoji kolonija. Sumaišoma su lašu. Jei susimaišius pradeda skirtis burbuliukai

(mikroorganizmas gamina katalazę, kuri skaido vandenilio peroksidą į vandenį ir dujinį

deguonį). Teigiamą reakciją rodžiusios kolonijos dažomos pagal Gramą („Diagnostica

Merck“, Vokietija). Tepin÷lis mikroskopuojamas. Būdingos Bacillus spp. kolonijos toliau

pers÷jamos į selektyvią terpę – MYP (manitolio, kiaušinio trynio, polimiksino) agarą (Oxoid,

Anglija). Polimiksinas slopina kitų mikroorganizmų augimą, o B. cereus yra labai atsparios

šiam antibiotikui. MYP agaras ruošiamas pagal metodiką nurodytą ant pakuot÷s. Petri

l÷kštel÷s su pas÷liais inkubuojamos 24 val. 30 °C temperatūroje. MYP agaro sud÷tyje yra

kiaušinio trynys, kurį veikia fermentas lecitinaz÷, randamas B. cereus. Aplink kolonijas

susidaro nuos÷dų zonos. B. cereus kolonijos dažniausiai rausvos. Jei užaugusios kolonijos

neryškios, l÷kštel÷s inkubuojamos dar 24 val. Po kultivavimo vertinama išaugusių kolonijų

23

spalva, dydis. Charakteringos kolonijos dažomos pagal Gramą (Merck, Vokietija). Tepin÷lis

mikroskopuojamas.

B. cereus nustatymui taip pat naudojamas Bacillus cereus selektyvinis agaras (BCSA)

(Oxoid, Anglija). Tai yra selektyvin÷ ir diagnostin÷ terp÷ naudojama B. cereus išskyrimui.

Terp÷s sud÷tyje esantis polymiksinas B slopina gramneigiamus mikroorganizmus. Agare B.

cereus formuoja m÷lynas kolonijas, nes neskaido manitolio (indikatorius bromtymolio

m÷lynasis), kurios yra apsuptos kiaušinio trynio precipitacijos zona. Bakterijos, kurios skaido

manitolį gamina geltonas kolonijas. BCSA agaras ruošiamas pagal metodiką nurodytą ant

pakuot÷s. Užs÷tos Petri l÷kštel÷s inkubuojamos 24 – 48 val. 37°C temperatūroje. Po

kultivavimo vertinama išaugusių kolonijų spalva, dydis. Charakteringos kolonijos dažomos

pagal Gramą. Tepin÷lis mikroskopuojamas.

3.2 B. cereus biocheminių savybių nustatymas

Charakteringos B. cereus paderm÷s ats÷jamos ant nuožulnaus agaro. Toliau su jomis

atliekamas biocheminių savybių nustatymas.

Bakterijų judrumui nustatyti naudojamas pusiau skystas maitinamasis agaras (MA)

(Oxoid, Anglija). Dūrio metodu į m÷gintuv÷lį pas÷jama tiriamoji kultūra. M÷gintuv÷liai su

pas÷liais inkubuojami 24 – 48 val. 37°C temperatūroje. Jei bakterijos judrios, užauga „eglut÷s

formos“, jei dūrio vietoje yra tiesi linija – bakterijos nejudrios.

Nustatant ar bakterijos skaido angliavandenius naudojamose gliukoz÷s ir maltoz÷s

terp÷se (Oxoid, Anglija), į m÷gintuv÷lius su terpe dūrio metodu pas÷jama tiriamoji kultūra ir

kultivuojami 37ºC temperatūroje 24 – 48 val. Teigiamai vertinamas terp÷s spalvos

pasikeitimas, nuos÷dų susidarymas. Jei terp÷ nepakito – reakcija neigiama.

B. cereus augimo nustatymas 7% NaCl. Paruošiamas maitinamasis agaras (MA)

(Oxoid, Anglija) su 7% NaCl. Išpilstomas į m÷gintuv÷lius. Dūrio metodu pas÷jama tiriamoji

kultūra. M÷gintuv÷liai su pas÷liais inkubuojami termostate 24 – 48 val. 37°C temperatūroje.

Jei dūrio vietoje matomas augimas – reakcija teigiama.

Nitritų redukavimui iki nitratų nustatymui naudojamas nitritų testas. M÷gintuv÷lis su

nitritų terpe (KNO3) sumaišomas su tiriamąja kultūra ir termostate laikomas 24 val. 37°C

temperatūroje. Po to į m÷gintuv÷lį pilamas 0,5% alfanaftylaminas ir 0,8% sulfanilin÷ rūgštis.

M÷gintuv÷lis sukratomas ir 1 – 2 min. laukiamas spalvos pasikeitimas. Jei spalva pasikeit÷ –

reakcija teigiama.

24

MR – VP terp÷ (Oxoid, Anglija) naudojama mikroorganizmų nustatymui, paremta

rūgščių ar acetylmetyl karbinolio gamyba. MR testas yra naudojamas skirtingas rūgštis

fermentuojančioms bakterijoms, kurių gaminamas galutinis produktas yra stabilios rūgštys,

nustatyti. VP testas naudojamas bakterijų gebančių fermentuoti 2,3 butandiolį nustatymui.

MR – VP terp÷ susideda iš gliukoz÷s, peptono ir fosfato buferio. Dauguma mikroorganizmų,

gaminančių didelį kiekį stabilių rūgščių, sumažina terp÷s pH. Rūgščių aptikimui yra

naudojamas pH indikatorius – MR (raudona pH 6). Tam, kad įsitikintume,

kad rūgštys yra stabilios, testas turi būti atliekamas pra÷jus 48 val. po inokuliacijos.

Metileno raudonojo testas: Į m÷gintuv÷lį su 1ml MR –VP terp÷s užnešama tiriamoji

kultūra ir kultivuojama termostate 37°C temperatūroje 48 val. Po to įlašinami 5 lašai metileno

raudonojo ir stebimas spalvos pasikeitimas. Reakcija teigiama, jei spalva pasikeit÷ į šviesiai

raudoną. Jei geltonai oranžin÷ – reakcija neigiama.

Vougo Proskauerio testas: Į m÷gintuv÷lį su 1ml MR –VP terpe užnešama tiriamoji

kultūra ir kultivuojama termostate 37 °C temperatūroje 48 val. Į m÷gintuv÷lį pridedama

0,6 ml 5% alfanaftolio ir 0,2 ml 40% KOH. Švelniai pamaišoma. Po 15 min. stebimas spalvos

pasikeitimas. Reakcija yra teigiama, jei susidaro raudona spalva. Jei raudonos spalvos n÷ra –

reakcija neigiama.

Antimikrobinis mikroorganizmų jautrumas nustatomas pagal identifikuotų

mikroorganizmų rūšies gryną kultūrą, nustatomas jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms

pagal Kirby - Bauer metodiką (1966). Iš mikroorganizmų kultūros paimamos 4-5 išskirtos

bakterijų kolonijos. Jos suspenduojamos fiziologiniame tirpale iki pasiekia 0,5 McFarland

vieneto optinį tankumą. Mikroorganizmų kiekis McFarland vienetais įvertinamas McFarland

Densitometer 1 („Biosan“, JAV) aparatu. Iš šios 0,25 ml suspensijos su bakterijomis, steriliu

vatos tamponu suvilgomas Mueller Hinton (Oxoid/Anglija) agaro paviršius, atitinkamais

atstumais uždedami antibiotikų diskai. Po to kultivuojama termostate apie 16 – 18 val., 35 –

37oC temperatūroje.

Naudojami šie antibiotikų diskai:

• Beta laktamų grup÷s: synuloksas (amoksacilinas 20 µg / klavulano rūgštis 10 µg) 30

µg (Oxoid, Anglija), penicilinas 10 µg (Oxoid, Anglija);

• Sulfonamidų grup÷s: trimetoprim sulfatas 25 µg (Sensi Disc, Prancūzija);

• Cefalosporinų grupei: cefaleksinas 30 µg (Oxoid, Anglija).

Gauti rezultatai įvertinami pagal firmų pateiktas lenteles atsparumui įvertinti bei

matuojant slopinimo zonas laikantis galiojančių standartų.

25

3.3 Statistinių duomenų analiz÷

Atliekant statistinių duomenų analizę buvo paskaičiuotas Chi-kvadrat kriterijus, kuriuo

buvo siekiama nustatyti ryšius tarp piene ir pakratuose esančių Bacillus cereus.

Tyrimo duomenys patikimi, kai p

26

4. TYRIMŲ REZULTATAI

4.1 B. cereus nustatymas žaliaviniame karvių piene ir pakratuose

Buvo atliktas pirminis Bacillus spp. išskyrimas iš 369 žaliavinio karvių pieno m÷ginių

ir 16 pakratų juos s÷jant ant kraujo agaro (KA) (Oxoid, Anglija). Tolimesniems tyrimams

buvo naudojamos charakteringos B. cereus kolonijos, kurios KA sudar÷ dideles pilkas,

apšerkšnojusio stiklo paviršiaus, vingiuotais karštais kolonijas (3 paveiksl÷lis). Vertinamas

hemoliz÷s pasireiškimas KA (4 paveiksl÷lis).

3 pav. B. cereus kolonijos formuojamos KA

(Prieiga per internetą:

http://www.microbiologyatlas.kvl.dk/biologi/english/showmorf.asp?articleid=2)

4 pav. Stebima plati, kolonijas supanti hemoliz÷s zona

(Prieiga per internetą:

http://www.microbiologyatlas.kvl.dk/biologi/english/showmorf.asp?articleid=2)

27

Atlikus vertinimą su atrinktomis charakteringomis kolonijomis atliktas katalaz÷s

testas, kuriam visos paderm÷s buvo teigiamos. Charakteringos Bacillus cereus kolonijos

toliau pers÷tos į selektyvias terpes – Bacillus cereus selektyvinį (BCSA) (Oxoid, Anglija) ir

MYP (manitolio, kiaušinio trynio, polimiksino) agarą (Oxoid, Anglija). Pagal šiose terp÷se

charakteringą augimą atrinktos 23 kolonijos vertintos kaip Bacillus cereus (5 ir 6

paveiksl÷liai) ir su jomis atlikti biocheminių savybių testai įsitikinti ar šios Bacillus spp.

paderm÷s tikrai priklauso B. cereus rūšiai.

5 pav. MYP terp÷je augančios charakteringos B. cereus kolonijos

(Prieiga per internetą: http://www.oxoid.com/omd/library/fullsize/CM0929.jpg)

6 pav. BCSA terp÷je augančios charakteringos B. cereus kolonijos

(Prieiga per internetą:

http://www.oxoid.com/omd/library/thumbs/th_CM0617.jpg&imgrefurl=http://www.oxoid.co

m/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp)

28

4.2 B. cereus biocheminių savybių nustatymas

Su išskirtomis charakteringomis kolonijomis buvo atliktas jud÷jimo nustatymas, kuris

parod÷, kad visos 23 paderm÷s buvo judrios, gerai augo terp÷je su 7% NaCl. Taip pat skald÷

maltozę ir gliukozę. Buvo atlikti nitratų redukcijos, MR ir VP testai (2 lentel÷), atliktas

išskirtų Bacillus spp. padermių jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms (3 lentel÷).

2 lentel÷. Išaugusių kolonijų identifikavimas pagal biochemines savybes

Eil

Nr.

Nitratų redukcija Metileno raudonojo

reakcija

VP testas

1. + + +

2. + + +

3. + + +

4. + + +

5. + + +

6. - - -

7. + + +

8. + + +

9. + - +

10. + + +

11. + + +

12. + + +

13. + + +

14. + + +

15. + + +

16. + + +

17. + + +

18. + + +

19. + + +

20. + + +

21. + + +

22. + + +

23. + + +

29

3 lentel÷. Iš žaliavinio pieno ir pakratų išskirtų charakteringų B. cereus padermių,

jautrumas antimikrobin÷s medžiagoms

Eil

Nr.

Amoksicilinas

+ klavulanin÷

rūgštis

Penicilinas Trimetoprim

sulfatas

Cefaleksinas

1. A VA J A

2. A VA J A

3. A VA J A

4. A J J A

5. VA VA J J

6. J A J J

7. J J J J

8. A J J A

9. A VA A A

10. VA J J A

11. A VA J A

12. VA VA J A

13. VA VA J A

14. VA A J A

15. VA J J A

16. VA VA J A

17. VA J A A

18. VA J J A

19. VA VA J A

20. VA VA J A

21. VA J J A

22. VA J J A

23. A VA A A

Paaiškinimai: J – jautru; VA – vidutiniškai atsparios; A – atsparu.

Atlikus 23 padermių atsparumą antibiotin÷ms medžiagoms, nustatyta, kad:

• cefaleksinui buvo atsparios 87% padermių, o 13% buvo jautrių;

30

• amoksicilinui ir klavulaninei rūgščiai buvo atsparios 35%, jautrios – 13%, ir

vidutiniškai atsparios – 52% padermių;

• penicilinui buvo atsparios 9% padermių, vidutiniškai atsparios 52% ir 39% padermių

penicilinui buvo jautrios;

• trimetoprim sulfatui 13% padermių buvo atsparios, ir 87% - jautrios.

4.3 Pieno ir pakratų taršos tikimyb÷

Iš 369 pieno m÷ginių, 18 (5%) nustatyta Bacillus cereus (1 grafikas), o ištyrus 16

pakratų m÷ginių Bacillus cereus nustatyta 4 (25%) m÷giniuose (2 grafikas).

Atlikus pieno ir pakratų m÷ginių tyrimus, buvo paskaičiuotas Chi-kvadrat kriterijus,

kuris parodo ryšį tarp piene ir pakratuose esančių Bacillus cereus. B. cereus aptikti pakratuose

tikimyb÷ didesn÷ nei piene (4 lentel÷).

4 lentel÷. Tikimyb÷ aptikti B. cereus piene ir pakratuose

B. cereus

M÷ginių skaičius skaičius procentai

Tikimyb÷s aptikti B. cereus pasikliautinis intervalas (95%)

Pienas 369 18 4,9 0,049±0,011

Pakratai 16 4 25 0,250±0,116

Viso 385 23 6,0 0,060±0,012 (χ2=13,74; p=0,0002) x2 – Chi kriterijus; p – tikimyb÷

1 grafikas. Bacillus cereus paplitimas žaliaviniame karvių piene

5%

95%

B. cereus Bacillus spp.

31

2 grafikas. Bacillus cereus paplitimas tirtuose pakratuose

25%

75%

B. cereus Bacillus spp.

32

5. TYRIMŲ REZULTATŲ APIBENDRINIMAS

Nors pieno nauda žmogaus organizmui yra visuotinai pripažinta, nepaisant to pienas

gali būti ir pavojaus šaltiniu gyvybei ar sveikatai, nes pienas yra puiki terp÷

mikroorganizmams daugintis. B. cereus gali plačiai paplisti aplinkoje ir užteršti pieno

produktus per šiuos šaltinius: žemę, grūdų kultūras ir pieno produktų gamybos priemones

(Berthold, Molska, 2002). Jų sporos į pieną taip pat patenka nuo nešvaraus tešmens ir spenių.

Šiame tyrime buvo įvertintas B. cereus paplitimas žaliaviniame piene ir pakratuose.

Atlikus pieno ir pakratų m÷ginių tyrimus, nustatyta, kad B. cereus aptikti pakratuose tikimyb÷

didesn÷ nei piene (χ2=13,74; p=0,0002). Ištyrus 16 pakratų m÷ginių, B. cereus nustatyta 25%,

o tai leidžia daryti išvadą, kad pakratai gali tur÷ti įtakos žaliavinio pieno užterštumui.

Magnusson ir bendraautorių (2007) atlikti tyrimai patvirtina, kad yra ryšys tarp B. cereus

kiekio karvių piene ir pakratuose. Tik÷tina, kad tiesioginę pieno taršą lemia spenių ir užteršto

kraiko kontaktas. Remiantis šia prielaida, galima teikti, kad pieną gali būti sunku visiškai

izoliuoti nuo bakterijų taršos. Tačiau patobulinus pasiruošimą melžimui, o ypač atkreipiant

d÷mesį į spenių valymą, galima pasiekti mažesnį pieno taršos B. cereus lygį. Ištyrus 369

pieno m÷ginius buvo nustatyta, kad 4,9% žaliavinio pieno m÷ginių buvo užkr÷sti B. cereus

mikroorganizmų. Panašius duomenis savo tyrime pateik÷ Lin ir bendraautoriai (1998). Jiems

atlikus tyrimą dviejuose pieno apdirbimo gamyklose pieno užterštumas bakterijomis buvo

santykinai žemas (~8%). Magnusson ir bendraautorių (2006) atliktas tyrimas parod÷, kad

pagrindine pieno B. cereus užkr÷timo priežastimi yra sporos rastos žaliaviniame piene.

Remiantis moksline medžiaga nustatyta, kad kai kurie B. cereus tipai yra randami viso pieno

ar pieno miltelių apdirbimo proceso metu, o tai savo ruožtu leidžia teigti, kad žaliavinis pienas

pats savaime gali būti taršos šaltinis (Eneroth ir kt. 2001). Kadangi pasterizacija neužtikrina

sporų sunaikinimo, nes sunaikinamos tik vegetatyvin÷s mikroorganizmų formos, tod÷l tam

tikras kiekis pieno užteršto min÷tomis bakterijomis yra nustatomas ir jį pasterizavus. Taigi

galima teigti, kad B. cereus užkr÷timas gali įvykti bet kurioje pieno apdirbimo stadijoje (B.

cereus bakterijos gali būti randamos silose, pasterizatoriuje ir pakavimo įrenginiuose).

Vienas iš B. cereus patogeniškumo veiksnių - betalaktamaz÷, kuri bakterijai leidžia

būti atspariai net ir trečios kartos cefalosporinams. Mūsų atlikto tyrimo metu iš 23 išskirtų

charakteringų B. cereus padermių 87% padermių buvo jautrios cefaleksinui. B. cereus

jautrumą cefaleksinui taip pat tyr÷ ir Schlegelova bei bendraautoriai (2003). Jų tyrimas

parod÷, kad visai atvejais B. cereus paderm÷s buvo jautrios šiam antibiotikui. Trimetoprimo

33

preparatas dažniausiai naudojamas tada, kuomet suk÷l÷jai yra atsparūs trečios kartos

cefalosporinams.

Taip pat nustatyta, kad 13% padermių buvo jautrios penicilinui, vidutiniškai jautrios -

52%. J. Schlegelovos ir kitų bendraautorių (2003) atliktas tyrimas parod÷, kad beveik visos B.

cereus išskirtos paderm÷s buvo žemo jautrumo beta – laktaminiams antibiotikams.

52% padermių buvo vidutiniškai jautrios amoksicilinui ir klavulaninei rūgščiai.

Matusevičius ir Špakauskas (2005) teigia, kad amoksiciliną slopina choramfenikolis,

makrolidai, tetraciklinai, sulfonamidai, gali susilpninti bakteriocidinį amoksicilino veikimą.

Taip yra d÷l to, kad amoksicilinas yra plataus veikimo spektro beta-laktamų grup÷s

baktericidinis antibiotikas. Mikroorganizmų atsparumas kai kuriems penicilinams pasireiškia

d÷l beta-laktamazių, fermentų, kurie suskaido antibiotiką. Klovulanas negrįžtamai jungiasi su

fermentais beta-laktamaz÷mis, tod÷l nuo hidroliz÷s apsaugo amoksicilino beta-laktamo žiedą.

Klovulanui susijungus su fermentu, susidaro cheminis kompleksas, kuris skaido klovulaną ir

inaktyvuoja beta-laktamazę (Schlegelova ir kt. 2003).

Beta – laktaminiais antibiotikais yra dažnai gydomas karvių spenių uždegimas -

mastitas. Tai gali lemti B. cereus atsparumo padid÷jimą šiam antibiotikui. Tod÷l svarbi

išlauka, kad antibiotikai nepatektų į pieną ir nesivystytų bakterijų atsparumas antibiotikams.

Atlikti biocheminiai tyrimai, kurių metu, su išskirtomis sporin÷mis bakterijomis, buvo

atliekamas katalaz÷s nustatymas, gliukoz÷s ir maltoz÷s fermentavimas, judrumo nustatymas,

augimas terp÷je su 7% NaCl, atliktos MR ir VP reakcijos, taip pat nitratų redukcijos reakcija,

leido patvirtinti išskirtas padermes kaip Bacillus cereus (97%).

Apibendrinus galime teigti, kad svarbiausia mažinti mikrobiologinę taršą žaliaviniame

piene, nes B. cereus sporos yra atsparios pasterizacijai, o tai savo ruožtu lemia produktų

gedimą ir apsinuodijimo maistu pavojaus padid÷jimą.

34

6. IŠVADOS

1. Ištyrus 369 žaliavino karvių pieno m÷ginius, Bacillus cereus nustatyta 4,9%.

2. 25% Bacillus cereus padermių nustatyta ištyrus 16 pakratų m÷ginių.

3. Savais tyrimais nustat÷me, kad aptikti B. cereus pakratuose tikimyb÷ didesn÷ nei piene

(p

35

Sporeforming organisms in raw milk: Veterinary food safety master’s studies master’s paper/

adviser prof. dr. J.Šiugždait÷; Lithuanian Veterinary Academy, Veterinary Faculty,

Department of Contagious Diseases. – Kaunas, 2010. – 33 p. 4 tables, 6 figures, 2 graphics.

SUMMARY

Aim of the study: to extract sporeforming organisms from raw milk.

Tasks: to estimate sporeforming organisms from raw milk and bedding; to identify and

examine B. cereus and it’s biological features; to compare occurrence of B. cereus in raw milk

and bedding; to identify the sensibility of B. cereus to antimicrobial substances.

Subject of the study: 369 raw milk samples which where taken in 2008-2009 and 16 samples

of bedding which were taken in 2009.

There was used MYP & Bacillus cereus selective agar for extraction of sporeforming

organisms. To identify B. cereus by examining their biological properties there were used

these chemical reactions: catalysis, motility, glucose, maltose, reduction of nitrates, growth in

NaCl, methylen red, VP. To examine the sensibility of of B. cereus to antimicrobial

substances there were used antibiotic disks: synulox, penicillin, trimethoprim sulphate,

cephalexin.

There were established that: 4,9% of total raw milk samples were infected by Bacillus

cereus. 25% of total bedding samples were infected by Bacillus cereus. Also it was reavealed

that there is much bigger chance to find B. cereus in bedding, than in raw milk (p

36

7. NAUDOTA LITERATŪRA

1. Agata N., Ohta M., Yokoyama K. Production of Bacillus cereus emetic toxin

(cereulide) in various foods. Int. J. Food Microbiol., 2002. P. 23–27.

2. Altayar M., Sutherland A.D. Bacillus cereus is common in the environment but

emetic toxin producing isolates are rare. Journal of Applied Microbiology, 2006. P

7 – 14.

3. Andersen - Borge G. I., Skeie M., Sorhaug T., Langsrud T., Granum P. E. Growth

and toxin profiles of Bacillus cereus isolated from different food sources. Int. J.

Food Microbiol., 2001. P. 237–246.

4. Atrih A., Foster S. J. The role of peptidoglycan structure and structural dynamics

during endospore dormancy and germination. Antonie van Leeuwenhoek 75, 1999.

P. 299 – 307.

5. Barbano D. M., Ma Y., Santos V. Influence of raw milk quality on fluid milk shelf

life. Journal of Dairy Science 89 (E-Supplement), 2006. P. 15 – 19.

6. Bartoszewicz M., Hansen B. M., Swiecicka I. The members of the Bacillus cereus

group are commonly present contaminants of fresh and heat – treated milk. Food

Microbiology, 2008. P. 588 – 596.

7. Beattie S. H., Williams A. G. Detection of toxigenic strains of B. cereus and other

Bacillus spp. with an improved cytotoxicity assay. Letters in Applied

Microbiology 28, 2000. P. 221 – 225.

8. Berthold A., Molska I. Production of diarreheal enterotoxin and psychotrophic

properties of Bacillus cereus strains isolated from various sources. Polish Journal

of Natural Sciences, 2002. No 11 (2). P. 109 – 114.

9. Billing E., Cuthbert W. A. „Bitty cream“: the occurence and significance of

Bacillus cereus in raw milk supplies. J. Appl. Bacteriol., 1958. P. 65 – 78.

10. Broussolle V., Gauillard F., Nguyen-the C., Carlin F. Diversity of spore

germination in response to inosine and L-alanine and its interaction with NaCl and

pH in the B. cereus group. Journal of Applied Microbiology 105(4), 2008. P. 1081

– 1090.

11. Browne N., Dowds B. C. A. Heat and salt stress in the food pathogen Bacillus

cereus. J. Appl. Microbiol., 2001. P. 1085 – 1094.

37

12. Christiansson A., Bertilsson J. Svensson B. Bacillus cereus spores in raw milk:

factors affecting the contamination of milk during the grazing period. Journal of

dairy science, 1999. Vol. 82, No. 2. P. 305 – 314.

13. Cowan A. E., Koppel D. E., Setlow B., Setlow, P. A soluble protein is immobile in

dormant spores of Bacillus subtilis but is mobile in germinated spores: implication

for spore dormancy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, 2003. P. 4209 – 4214.

14. Dierick K., Van Coillie E., Swiecicka I., Meyfroidt G., Devlieger H., Meulemans

A., Hoedemaekers G., Fourie L., Heyndrickx M., Mahillon J. Fatal family

outbreak of Bacillus cereus – associated food poisoning. J. Clin. Microbiol., 2005.

P. 4277 – 4279.

15. ECDC. Opinion of the Scientific Comminee on Animal Nutrition on the criteria

for assessing the safety of micro-organisms resistant to antibiotics of human

clinical and veterinary importance. European Commission Directorate C –

Scientific Opinions, 2002.

16. Eneroth A., Svensson B., Molin G., Christiansson A. Contamination of pasteurized

milk by Bacillus cereus in the filling machine. J. Dairy Res., 2001. P. 189 – 196.

17. Faille C., Fontaine F., Benezech T. Potential occurrence of adhering living

Bacillus spores in milk product processing lines. J. Appl. Microbiol., 2001. P. 892

– 900.

18. Fenselau C., Havey C., Teerakulkittipong N., Swatkoski S., Laine O., Edwards N.

Identificatio of ß-Lactamase in antibiotic – resistant Bacillus cereus spores.

Applied and Environmental Microbiology, 2008. P. 904 – 906.

19. Ghelardi E., Celandroni F., Salvei S., Barsoi C., Baggiani A., Senesi S.

Identification and characterization of toxigenic Bacillus cereus isolates responsible

for two food-poisoning outbreaks. Fems Microbiol. Le., 2002. P. 129 – 134.

20. Gounina-Allouane R., Broussolle V, Carlin F. Influence of the sporulation

temperature on the impact of the nutrients inosine and L- alanine on B. cereus

spore germination. Food Microbiology 25, 2008. P. 202 – 206.

21. Granum P. E. Bacillus cereus. Food Microbiology: Fundamental and Frontiers, 3rd

Ed, 2007. P. 445 – 452.

38

22. Guinebretiere M. H., Broussolle, V., Nguyen-The C. Enterotoxigenic profiles of

food-poisoning and food-borne Bacillus cereus strains. J. Clin. Microbiol. 2002,

40. P. 3053 – 3056.

23. Haggblom M. M., Apetroaie C., Andersson M. A., Salkinoja-Salonen M.

Quantitative analysis of cereulide, the emetic toxin of B. cereus, produced under

various conditions. Applied and Environmental Microbiology 68(5), 2002. P. 2479

- 2483.

24. Haug S. Food poisoning caused by aerobic spore forming bacilli. J. Appl.

Bacteriol. 1955. P. 591 – 595.

25. Henriques, A. O., Moran Jr. C. P. Structure, assembly and function of the spore

surface layers. Annual Review of microbiology, 2007. P. 555 – 588.

26. Hoton F., Andrup L., Swiecicka I., Mahillon J. The cereulide genetic determinants

of emetic Bacillus cereus are plasmid – borne. Microbiology, 151, 2005. P. 2121 –

2124.

27. Yan X., Gai Y., Liang L., Liu G., Tan H. Agene encoding alanine racemase is

involved in spore germination in Bacillus thuringiensis. Archives of Microbiology

187, 2007. P. 371 – 378.

28. Janstova B., Lukasova J. Heat resistance of Bacillus spp. spores isolated from

cow’s milk and farm environment. Acta Vet. Brno, 2001. P. 179 – 184.

29. Kotiranta A., Lounatmaa K., Haapasalo M. Epidemiology and pathogenesis of

Bacillus cereus infections. Microb. Infect., 2, 2000. P. 189 – 198.

30. Lechner, S., Mayer R., Francis K. P, Pruss B. M., Kaplan T., Wiessner-Gunkel E.,

Stewart G. S. A. B., Scherer S. Bacillus weihenstephanensis sp. nov. is a new

psychrotolerant species of the B. cereus group. International Journal of Systematic

Bacteriology 48, 1998. P. 1373 – 1382.

31. Lin S., Schraft H., Odumeru J. A., Griffiths M. W. Identification of contamnation

sources of Bacillus cereus in pasterized milk. Int. J. Food Microbiol., 1998. P. 159

– 171.

32. Lodemann, U., Lorenz, B.M., Weyrauch, K.D., Martens, H. 2008. Effects of B.

cereus var. toyoi as probiotic feed supplements on intestinal transport and barrier

function in piglets. Archives of Animal Nutrition 62(2), 87 – 106.

33. Lund T., De Buyser M. L., Granum P. E. A new Cytotoxin from Bacillus cereus

that may cause necrotic enteritis. Mol. Microliol. 38, 2000. P. 254 – 261.

39

34. Magnusson M., Christiansson A., Svensson B. Bacillus cereus spores during

housing of dairy cows: factors affecting contamination of raw milk. American

Dairy Science Association, 2007. P. 2745 – 2754.

35. Magnusson M., Christiansson A., Svensson B., Kolstrup C. Effect of different

premilking manual teat-cleaning methods on bacterial spores in milk. Journal of

Dairy Science, 2006. P. 3866 – 3875.

36. Majiduddin F. K., Mateson I. C., Palzkill T. G. Molecular analysis of beta –

lactamase structure and function. Int. J. Med. Microbiol, 2002. P. 127.

37. Makarasen A., Yoza K., Isobe M. Higher structure of cereulide, an emetic toxin

from B. cereus, and special comparison with valinomycin, an antibiotic from

Streptomyces fulvissimus. Chemistry an Asian Journal 4(5), 2009. P. 688 – 698.

38. Masteikien÷ R. R. Maisto produktų mikrobiologija. KTU, 2006. P. 38 – 56.

39. Matusevičiuss A., Špakauskas V. Antikokrobin÷s ir antiparazitin÷s vaistin÷s

medžiagos ir vaistai veterinarijoje, Tera Publica., Kaunas, 2005. P. 39

40. McMahon S., Ann M., Jiru Xu, Moore J. E. Environmental Stress and Antibiotic

Resistance in Food – Related Pathogens. Applied and Environmental

Microbiology, 2007. P. 211 – 217.

41. Michelet N, Granum P. E., Mahillon J. Bacillus cereus enteretoxins, bi- and tri-

component cytolysins and other haemolysins. The Comprehensive Sourcebook of

Bacterial Toxins, 2006. P. 779 – 790.

42. Moir A. How do spores germinate? Journal of Applied Microbiology 101, 2006. P.

526530.

43. Mortimer P. R., McCann G. Food-poisoning episodes associated with Bacillus

cereus in fried rice. The Lancet 1974. P. 1043 – 1045.

44. Nothermans S., Te Giffel M. C. Bacillus cereus: its toxins and their significance.

Bull. IDF, 2000. P. 43 – 46.

45. Paananen A., Mikkola R., Sareneva T., Matikainen S., Hes M., Andersson M.,

Julkunen I., Salkinoja-Salonen M. S., Timonen T. Inhibition of human natural

killer cell activity by cereulide, an emetic toxin from B. cereus. Clinical and

Experimental Immunology 129(3), 2002. P. 420 – 428.

46. Schlegelova J., Babak V., Klimova E., Lukašova J., Navratilova P., Šustačkova A.,

Šediva I., Ryšanek D. Prevalence of and Resistance to Anti-Microbial Drugs in

Selected Microbial Species Isolated from Bulk Milk Samples. Journal of

Veterinary Medicine Series B, 2002. Vol. 49, 5. P. 216 – 225 .

40

47. Schlegelova J., Brychta J., Klimova E., Napravnikova E., Babak V. The

prevalence of and resistance to antimicrobial agents of Bacillus cereus isolates

from foodstuffs. Vet. Med. – Czech, 48, 2003 (11). P. 331 – 338.

48. Setlow P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation,

heat and chemicals. Journal of Applied Microbiology 101, 2006. P. 514 – 525.

49. Steichen C., Chen P., Kearney J. F., Turnbough C. L. Identification of the

immunodominant protein and other proteins of the Bacillus anthracis exosporium.

Journal of Bacteriology 185, 2003. P. 1310 – 1903.

50. Swiecicka I., Mahillon J. Diversity of commencal Bacillus cereus sensu lato

isolated from the common sow bug (Porcello scaber, Isopoda). FEMS Microbiol.

Ecol., 56, 2006. P. 34 – 39.

51. Šalomskien÷ J., Bartiuk T. Bacillus cereus maisto produktuose ir jų nustatymo

metodai (apžvalga). Maisto chemija ir technologija, 2006. T. 40, Nr. 1. P. 98 –

103.

52. Šernien÷ L., Sekmokien÷ D. Kokyb÷s ir saugos kontrol÷ pieno perdirbimo metu.

Kaunas, 2006. P. 9

53. Šernien÷ L., Sekmokien÷ D. Pieno higiena. Sanitariniai reikalavimai žalio pieno

apdorojimui. Kaunas, 2006. P. 10 – 18.

54. Te Giffel M. C, Beumer R. R., Granum P. E., Rombouts F. M. Isolation and

characterization of Bacillus cereus from pasteurized milk in household

refrigerators in the Netherlands. Int J Food Microbiol. 1997. P. 307 – 318.

55. Te Giffel M. C. T, Beumer R. R. Isolation, identification and characterization of

Bacillus cereus from the dairy environment. Tijdschr Diergeneeskd 1998. P. 628 –

632.

56. Te Giffel M. C., Beumer R. R., Bonestroo M. H., Rombouts F. M. Incidence and

characterization of Bacillus cereus in two dairy processing plants. Neth Milk Dairy

J. 1996. P. 479 – 492.

57. Te Giffel M. C., Van der Horst C. Microfiltration under the microscope. Dairy

industries international, 2003. P. 39 – 41.

58. Thorsen L., Hansen B. M., Nielsen K. F., Hendriksen N. B., Phipps R. K., Budde

B. B. Characterization of emetic Bacillus weihenstephanensis, a new cereulide –

producing bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2006. P. 5118 – 5121.

41

59. Todd S. J., Moir A. J., Johnson M. J., Moir A. Genes of B. cereus and Bacillus

anthracis encoding proteins of the exosporium. Journal of Bacteriology 185, 2003.

P. 3373 – 3378.

60. Ultee A., Kets E. P., Alberda M., Hoekstra F. A., Smid E. J. Adaptation of the

food-borne pathogen Bacillus cereus to carvacrol. Arch. Microbiol., 2000. P. 233

– 238.

61. Van der Auswera G. A., Timmery S., Hoton F., Mahillon J. Plasmid exchanges

among members of the Bacillus cereus group in foodstuffs. Int. J. Food Microbiol,

25, 2007. P. 164 – 172.

42

8. PRIEDAI

1 Priedas

Metileno raudonojo testo reakcija naudojama B. cereus bakterijų patvirtinimui

(Prieiga per internetą:

http://1.bp.blogspot.com/_dCprCUgHL8c/SmbaRCzgdpI/AAAAAAAAABs/t_B-

61M6gGM/s320/s_mr.gif)

43

2 Priedas

VP testas naudojamas B. cereus bakterijų patvirtinimui

(Prieiga per internetą: www.mc.maricopa.edu/.../labtools/Dbiochem/vp.jpg)

44

3 Priedas

Testas naudojamas judrumo nustatymui: A – neigiama reakcija, B – teigiama reakcija

(Prieiga per internetą: www.textbookofbacteriology.net/.../Motility.jpg)

45

4 Priedas

Testas naudojamas nitratų nustatymui:

kair÷je – neigiama reakcija, dešin÷je – teigiama reakcija

(Prieiga per internetą:

http://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios312/LabProcedures/Nitrate%20reduction%20resu

lts.html)