biotechnologija - molbiomolbio.vdu.lt/medziaga/kanopka/biotechnologija.pdf · bakterijos ląsteles...

A. Kanopka-Biotechnologija

Biotechnologija

Įvadas į biotechnologiją.

Biotechnologija, tai mokslas apie manipuliavimą biologiniais organizmais tikslu užtikrinti ir palengvinti žmogaus gyvenimą. Tradiciniu medicininiu technologijų, žemdirbystes ir tradicinis grūdiniu kultūrų auginimas nepripažįstama kaip biotechnologija.

Biotechnologija apima tokias įvairias sritis kaip maisto pramonė, atliekų perdirbimą, kalnakasybą (metalų gavybą), mediciną ir kt.

Pirmą kartą, jeigu taip galima vadinti, biotechnologija buvo panaudota maisto gaminimui 6000 metų prieš mūsų erą, kai alaus darymui buvo panaudotos mielės. Jau 4000 metų prieš mūsų erą egiptiečiai atrado kaip mielių pagalba gauti raugintą duoną. Taip pat manoma kad Kinijoje tuo metu jau buvo panaudojami ir kiti fermentacijos procesai. Viena iš seniausių šiuo metu auginamų kultūrų yra kukurūzai. Jie ir šiandien, kaip ir prieš 5000 metų p.m.e. Meksikoje, yra auginami maistui. Kadangi pradinio augalo iš kurio išsivystė kukurūzai nerasta tai parodo kad turbūt tai buvo labiausiai pavykęs agrokultūrinis eksperimentas antikoje.

Šiuolaikines biotechnologijos era prasideda 1953 metais kai Amerikos biochemikas James Watson ir anglų biofizikas Francis Crick pasiūlė dvigrandės, komplementarių spiralių, DNR modelį. Tais pačiais metais William Hayes atranda kad galimas plazmidinių DNR perkėlimas iš vienos ląstelės (bakterijos) į kitą.

1960-asiais šveicaru mikrobiologas Werner Arber's bakterijoje atrado specifinius fermentus, vadinamus restrikcijos endonukleazėmis (restriktazėmis). Šie fermentai kerpa (skelia) visu žinomų organizmų DNR grandinę specifinėse vietose.

1973 metais Amerikos genetikas Stanley Cohen ir Amerikos biochemikas Herbert Boyer panaudojant DNR restrikcijos endonukleazes perkėlė specifinį geną iš vienos bakterijos į kitą bakteriją. Šis įvykis pradėjo rekombinantinės DNR technologijos erą, bendrai vadinama genetine inžinerija. 1977 metais genai iš aukštesniųjų organizmų buvo pernešti į bakteriją. Šie pasiekimai pagaliau įgalino pirma žmogaus hormono geno įterpimą į bakteriją Escherichia coli. Gauta transgeninė bakterija negali naudoti žmogaus hormono, ji tik gamina ji kartu su savo, įprastais, cheminiais junginiais.Molekulinė biotechnologija tai patraukli, moksliniu požiūriu revoliucinė disciplina, pagrįsta mokslininkų sugebėjimais pernešti specifinę genetinę informaciją iš vienų organizmų į kitus. Dažniausiai šios rekombinantinės technologijos tikslas yra komercinių produktų sukūrimas.

“Gententech” kompanijoje besispecializuojančioje rekombinantinės DNR technologijoje, genetinėje inžinerijoje, genų transplantacijoje bei genų klonavime, sėkmingai buvo išskirtas insuliną koduojantis genas ir perneštas į genetinį elementą (klonavimo vektorių) kuris gali būti palaikomas bakterijoje Escherichia coli ląstelėje. Šios bakterijos ląsteles veikia kaip biologijos fabrikas gaminant dvi žmogaus insulino polipeptidines grandines, kurios po to išgryninamos ir panaudojamos diabetu sergančių žmonių gydymui.

Ankstyvaisiais 1970-aisiais metais tradicinė biotechnologija nebuvo plačiai žinoma disciplina. Plačiu požiūriu biotechnologija yra susijusi su mikroorganizmų gaminamų metabolitinių produktų komercinių technologijų kūrimu ir jų produktų panaudojimu.

1


Formaliau biotechnologija gali būti apibrėžta kaip mokslinių inžinerinių principų taikymas tikslu išskirti ir panaudoti biologinių organizmų gaminamas medžiagas.

Šiandien biotechnologija taikoma įvairiose srityse, kaip pavyzdžiui atliekų perdirbime, biotechnologija panaudojama sukuriant įvairias biodegradacines medžiagas. Viena iš tokių medžiagų gaminama iš pieno rūgšties gaunamos fermentuojant (išmetamus, likusius po derliaus nuėmimo) kviečių stiebus. Individualios pieno rūgšties molekulės yra chemiškai sujungiamos tuo pačiu susidarant polimerui, pasižyminčiam plastiko savybėmis bet yra tuo pačiu biodegraduojama, kas labai svarbu atliekų perdirbime. Šiuo metu tokio plastiko gamyba yra brangi tačiau tikimasi kad ateityje tokio plastiko gamyba taps rentabili.

Pramoninis biotechnologijos procesas naudojantis mikroorganizmus komercinių produktų gamyboje vyksta pagal tokią schemą:

Žaliava|

Pirminis žaliavos apdorojimas|

Fermentacija ir transformacija|

Antrinis žaliavos apdorojimas|

Švarus produktas

1. Pirminis apdorojimas: žaliavos paruošimas taip kad ją mikroorganizmai galėtų panaudoti kaip pirminį maisto šaltinį.2. Fermentacija ir transformacija: tikslinių mikroorganizmų, gaminančių reikalingas medžiagas, auginimas dideliuose bioreaktoriuse. Tai gali būti antibiotikai, amino rūgštys, įvairūs baltymai. Transformacijos efektyvumo didinimas tai viena iš sunkiausiai optimizuojamų stadijų.3. Antrinis apdirbimas: reikalingų medžiagų, antibiotikų, amino rūgščių, įvairių baltymų, iš ląstelių terpės ar biomasės gryninimas.Biotechnologijos mokslo pastangos pagrinde yra nukreiptos kiekvienos iš šių pakopų efektyvumo didinimą.

Išsivysčius rekombinantinės DNR technologijai, pagrindinė biotechnologijos kryptis buvo stipriai pakeista.

Šiuo metu biotechnologija vystos šiomis kryptimis:- Įvairių ligų diagnostikos pagerinimas bei vaistų įvairioms infekcinėms bei genetinėms ligoms sukūrimas.- Grūdinių kultūrų derliaus padidinimas, sukuriant augalus atsparius augalų kenkėjams, grybams ir virusinėms ligoms, aplinkos stresams tokiems kaip trumpalaikės sausros ar ilgalaikiai karščiai.

2


- Mikroorganizmų gaminančių (produkuojančių) vaistus, antibiotikus, polimerus, amino rūgštis, fermentus ir įvairius maisto priedus sukūrimas.- Įvairių mikroorganizmų, gyvūnų genetinis pakeitimas taip kad jie pasižymėtų reikiamomis savybėmis.- Technologijų sukūrimas teršalų ir atliekų pašalinimui iš aplinkos.

Nepaisant tai kad biotechnologija yra perspektyvi šaka įgalinanti taupyti natūralius gamtos resursus tačiau kadangi biotechnologija kaip instrumentą naudoja mikroorganizmus bei gyvūnus todėl čia kyla nemažai įvairių ginčų: 1.) Ar genetiškai sukurti mikroorganizmai nebus pavojingi natūraliai esantiems įvairiems organizmams ir supančiai aplinkai. 2.) Ar genetiškai sukurtų organizmų vystimasis ir panaudojimas nepakenks natūraliai genetinei įvairovei. 3.) Ar gali buti žmogus kuriamas genetiškai. 4.) Ar naujos diagnostines priemonės nepažeis kiekvieno individo privatumo. 5.) Ar gali genetiniais metodais sukurti gyvūnai gali būti patentuojami. 6.) Ar biotechnologijos vystimasis įgalins ir kitų svarbių technologijų vystimąsi. 7.) Ar komercinis tikslo vaikymasis nereikš tai kad biotechnologijos pasiekimai bus prieinami tik sveikiems žmonėms. 8.) Ar biotechnologijos diegimas bei vystimasis žemes ūkyje netrukdys tradiciniams žemės ūkio metodams bei jų vystimuisi. 9.) Ar molekulinės biotechnologijos metodai taikomi medicininėje terapijoje neišstums vienodai efektyvius tradiciškai naudojamus medicinines terapijos metodus.10.) Ar įvairių darbų biotechnologijoje patentavimo galimybės ieškojimas nesutrukdys mokslininkų tarpe laisvo minčių apsikeitimo.

Biologinės sistemos naudojamos biotechnologijoje. Biotechnologijoje naudojamas labai platus biologinių sistemų spektras: įskaitant mikroorganizmų, vabzdžių, augalų ir žinduolių ląstelių linijas, vabzdžių augalų ir žinduolių virusus, o taip pat daugialąstelinius organizmus tokius kaip augalai, pelės ir kt. Biologinės sistemos yra labai svarbios biotechnologijos proceso biotransformacijos fazėje. Daugeliu atveju genetiškai modifikuotas besidauginantis biologinis vienetas (ar tai butu mikroorganizmas ar virusas ar augalas ar gyvūnas) faktiškai tai yra komercinis produktas (Escherichia coli, mieles, įvairios augalų ar ląstelių linijos).

Prokariotiniai ir eukariotiniai organizmai.Visi organizmai auga atitinkamose temperatūros ribose. Aukštose temperatūrose prasideda ląstelės baltymų denatūracija ir kitų svarbių ląstelės sistemų bei komponentų irimo procesai vedantys į ląstelės žuvimą. Žemose temperatūrose gyvybiškai svarbūs ląstelės procesai dėl ląstelės baltymų struktūrinių pokyčių taip pat sustoja. Pagal optimalią augimo ir temperatūrą ląstelės yra klasifikuojamos į: termofilus (45->90 C), mezofilus (nuo 10 iki 47 C) ir psichrofilus (-5 - -35 C). Mikroorganizmai augantys skirtingose temperatūrose naudojami specifinių biotechnologijos tikslų pasiekimui. Pavyzdžiui: termofilai dažniausiai naudojami kaip genų produktų stabilių aukštose temperatūrose naudojamų pramonėje ir laboratorijose gavimui, tuo tarpu kai psichrofilai paprastai yra genetiškai pakeičiami kai kurių specifinių tikslų pasiekimui, pvz.: toksinių teršalų šaltuose vandenyse biodegradacijai.

3


Gyvieji organizmai yra skirstomi į dvi pagrindines grupes: prokariotus ir eukariotus. Šį skirstimą nusako daugelis šių organizmų struktūrinių savybių.Prokariotiniese ląstelėse tokiose kaip bakterijos, chromosominė DNR ląstelėje randasi tiesioginiame kontakte su citoplazma. Kieta ląstelės sienelė sudaryta iš peptidoglikanų, taip pat jie neturi sublastelinių citoplazminių organelių.Eukariotinėse ląstelėse chromosomine DNR yra apsupta membranos susidarant taip vadinamam branduoliui. Ląstelės sieneles sudarytos iš chitino arba celiuliozės, bet niekada iš peptidoglikanų taip pat jos citoplazmoje turi subląstelines organeles tokias kaip mitohondrijas, Goldžio aparato daleles ar augalai turi chloroplastus.Plačiausiai biotechnologijoje naudojama bakterija aptinkama žmogaus žarnyne tai Escherichia coli.

Escherichia coliTai labiausiai tyrinėjamas bei naudojamas mikroorganizmas pasaulyje. Per pastaruosius 50 metų t.y. nuo tada kai šis mikroorganizmas pradėtas tyrinėti buvo gautas didelis kiekis informacijos apie genetiką, molekulinę biologiją, fiziologiją ir apie bendrąją biologiją. Tai gram-neigiama, nepatogeninė, pailgos formos, mažesnė negu 1 mikrometras ilgio, aptinkamas žmogaus žarnyne, bet natūraliai, dirvoje ar vandenyje, neaptinkamas mikroorganizmas. Jos sugebėjimas daugintis dalijimusi (dvigubėjimas ar skilimas) laboratorinėmis sąlygomis naudojant paprastą (nesudėtingą) auginimo terpę susidedančią iš nedidelių kiekių mineralinių druskų (Na+, K+, Mg2+, Ca2+, NH4, Cl-, HPO4

2-, ir SO42-) ir

gliukozės kaip anglies šaltinio padarė šią bakteriją labai patrauklią tyrinėjimams. Turtingesnėje terpėje, turinčioje nedidelius kiekius amino rūgščių, vitaminų, druskų ir anglies šaltinį šių ląstelių dauginimosi laikas esant 37 oC, logaritminėje augimo fazėje yra apie 22 minutes.E.coli yra visapusiškas mikroorganizmas galintis augti tiek esant deguoniui (aerobiškai) tiek jam nesant (anaerobiškai). Tačiau paprastai siekiant gauti optimalią reikiamų produktų išeigą E.coli yra auginama aerobinėse sąlygose.

Biotechnologijos tikslams be E.coli naudojama visa eilė mikroorganizmų. Visi šie mikroorganizmai gali buti skirstomi į tokias specifines grupes: tie kurie tiekia genus reikalingus specifinių funkcijų atlikimui, ir tie kurie specifinių tikslų efektyviam pasiekimui yra genetiškai keičiami.

Mielės (Saccharomyces cerevisiae).Vienos iš labiausiai biotechnologijoje naudojamų ląstelių tai mielės (S.cerevisiae). Tai beveik E.coli ląstelės eukariotinė versija. Mielių kaip ir E.coli auginimui naudojama paprasta terpė. Mielių sugebėjimas perdirbti cukrus susidarant alkoholiui ir CO2 nuo senovės naudojama alkoholinių gėrimų bei duonos gamybai. Šiandien kasmet pasaulyje sunaudojama daugiau kaip milijonas tonų S.cerevisiae. Mielių svarba yra ne tiek pramonėje bet ir mokslo srityje t.y. jos naudojamos kaip modelinė sistema procesams vykstantiems eukariotinėje ląstelėje tyrinėti. Pvz.: jų genų dauginimosi ciklas yra panašus į žmogaus ląstelės ir tai leido charakterizuoti ir išskirti žmogaus genus atsakingus už vėžinių ląstelių vystimąsi.Dažniausiai, eukariotinėse ląstelėse baltymai po sintezės yra modifikuojami., pridedant mažo molekulinio svorio komponentus kurie reikalingi tiksliam baltymų ląstelėje veikimui.

4


Skirtingai nuo E.coli ar kitu prokariotų kuriose nevyksta baltymų modifikacijos ar jos skirtingos nuo modifikacijų eukariotinėse ląstelėse. Mieles taip pat plačiai naudojamos įvairių rekombinantinių baltymų sintezei (ekspresijai).

DNR ir jos svarba.

Atsakinga už organizmo apibudinimą ir jo biochemines funkcijas nusakanti genetinė informacija koduojama dezoksiribonukleininėje rūgštyje (DNR).Molekulinė biotechnologija naudingų produktų sukūrimui naudoja daugybės organizmų genus.

Atsakinga už organizmo apibudinimą ir jo biochemines funkcijas genetinė informacija koduojama dezoksiribonukleinineje rūgštyje (DNR). Daugelyje organizmų tai dvigrandis, ilgas polimerinis junginys.Pati DNR molekulė yra tyrinėjama jau nuo 1868 metu, ir iki 1940 metų buvo žinoma:- kad ji sudaryta iš atskirų vienetų – nukleotidų;- nukleotidai yra sujungti į ilgą grandinę;- nukleotidai susideda iš organinės bazės, penkiaanglio cukraus (pentozės) ir fosfato grupės.

DNR sudaro 4 bazių rūšys: adeninas (A), guaninas (G), citozinas (C) ir timinas (T).

Cukrus – 2’ dezoksiribozė turi hidroksilo grupe ant 3’ cukraus likučio anglies atomo. Ribozė - turi OH- grupes ant 2’ ir 3’ anglies atomų.

DNR nukleotidai sujungiami fosfodiesterine jungtimi su fosfato grupe susidarančia tarp vienos ribozės 5’ anglies atomo ir kitos ribozės 3’ anglies atomo OH grupių. Polinukleotidinė grandinė viename gale baigiasi 3’ OH grupe (3’ galas), o kitame 5’ fosfato grupe – 5’ galas.

1953 m. J. Watson ir F. Crick iškrisalinę DNR ir naudodami rentgeno spindulių difrakcija nustatė kad DNR grandinės tarpusavyje yra palaikomos vandenilinių jungčių susidarančių tarp skirtingų grandinių bazių. Bazės sudaro specifines poras A su T ir G su C. A-T bazių pora palaikoma 2 vandenilinių jungčių, o G-C pora – trijų. Abi DNR grandinės yra viena kitai komplementarios, reiškia prieš C vienoje grandinėje kitoje bus G ir atvirkščiai, o prieš A bus T ir atvirkščiai.

Komplementariškumo principas įgalina tai, kad visada naujai sintetinama DNR grandinė turi ta pačią nukleotidų seką kaip ir pradinė DNR. (Žmogaus 1-a chromosomos viena grandinė sudaryta iš 263 Mb.).Abi DNR grandinės viena kitos atžvilgiu yra išsidėsčiusios priešingomis kryptimis. Viena grandinė yra orientuota 5’-3’ kryptimi, kita 3’-5’ kryptimi. Šis modelis paaiškina kaip genetinė medžiaga su dideliu tikslumu gali reprodukuotis bei kaip nuo geno nukleotidų sekos sintetinamas baltymas.Watson-Crick DNR modelis atitinka bazių komplementariškumo principą tuo būdu kiekviena prieš tai egzistavusi DNR seka tarnauja kaip matrica naujai sintetinamų komplementarių sekų gavimui.

5


RNR ir jos svarba.Specifinė dezoksiribonukleotidų eilė nusako informaciją koduojamą individualiame genetiniame elemente (gene). Genai koduoja arba baltymus arba RNR molekules.Genetinės informacijos dekodavimas vyksta per tarpinę molekulę ribonukleino rūgštį (RNR), kuri gaunama nuskaičius informaciją nuo DNR. RNR sintezės procesas vadinamas transkripcija. Ląstelės energetiniai resursai neleidžia vykdyti visų struktūrinių genų transkripciją ir transliaciją vienu metu. Todėl ląstelėje pastoviai vyksta raiška tik tų genų produktų kurie reikalingi palaikyti ląstelės pagrindines funkcijas. Kitų genų ekspresija ląstelėje yra griežtai reguliuojama. Kai baltymas yra reikalingas ląstelei tada jos signalinė sistema inicijuoja reikiamo geno transkripciją. Atvirkščiai, kai baltymo ląstelei nereikia – baltymą koduojantis genas yra išjungiamas.Eukariotinėse ląstelėse transkripciją vykdo bei kontroliuoja visa eilė baltymų taip vadinamų transkripcijos faktoriais.

RNR molekulė tai linijinė polinukleotidinė grandinė kuri nuo DNR skiriasi dviem svarbiais aspektais:

1. Cukraus likutis yra ribozė turintis hidroksilo grupes 2’ ir 3’ C atomų.2. Vietoje bazės timino (T) bazės turi uracilo (U) bazę.

Daugumas RNR – sudarytos iš vienos polinukleotidinės grandinės. RNR molekulių atskiros sritys gali būti viena kitai komplementarios, tuo būdu susidarant dvigrandėms sritims. Dvigrandžių struktūrų susidarymas gali vykti ir tarp dviejų RNR molekulių turinčių viena kitos atžvilgiu komplemetarių sričių.Ląstelėje aptinkamos RNR molekulės: informacinė RNR (iRNR arba mRNR), ribosominė RNR (rRNR), transportinė RNR (tRNR) ir mažos siRNR.

Prokariotinėse ląstelėse – vienas fermentas (RNR polimerazė) atsakingas už visų tipų RNR transkripcija.

Eukariotinėse ląstelėse iRNR, rRNR ir tRNR vykdo skirtingos RNR polimerazės. Jos, kaip ir DNR replikacijoje, susidarant naujoms fosfodiesterinėmis jungtimis, įjungia naujus ribonukleotidus į ilgėjančią RNR molekulę Tik viena DNR grandinė panaudojama kaip matrica RNR sintezei (transkripcijai).Prokariotuose nėra nekoduojančių sekų – intonų. Eukariotuose genai turi pertrauktą struktūrą t.y. sudarytą iš koduojančių sekų (egzonų) ir nekoduojančių sekų (intronų). Po transkripcijos intronai iš susidariusios pre-iRNR pašalinami, 5' iRNR uždedama kepurė (cap nukleotidas), o jos 3' galas poliadenilinamas.

Metaboliškai aktyvioje ląstelėje apie 3-5% nuo visos ląstelės RNR sudaro iRNR, apie 80% rRNR, apie 4% tRNR.tRNR maža molekulė turinti 75-93 nt. Dėl vidinių komplementarių sričių tRNR molekulė sudaro L pavidalo struktūrą. Kiekviena tRNR turi antikodoninę seką, kurios pagalba ji prisijungia prie iRNR. Ląstelėje yra mažiausiai viena tRNR molekulė vienai iš 20 amino rūgščių. Prisijungusi amino rūgštį tRNR vadinama “įkrauta”.

6


RNR genomaiTiek bakterijos tiek eukariotinės ląstelės genomą sudaro DNR. Tačiau kai kuriuose virusuose (taip vadinamuose retrovirusais) genomą sudaro RNR molekulė (gripo virusas, HIV). Tuo atveju kai virusas infekuoja ląstelę informacija koduojama viruso RNR fermento, vadinamo atvirkštine transkriptaze, verčiama į DNR ir toliau jau vyksta pagal įprastą schemą. Tiesiogine RNR – baltymo sinteze negalima, kadangi virusas naudoja šeimininko ląstelės visus reikalingus viruso iRNR sintezei reikalingus komponentus.

Baltymai

1961 m. Marshal Nirenberg ir Henrichj Mattei atrado kad vieną amino rūgštį iRNR grandinėje koduoja 3 nukleotidai.iRNR koduojančios informacijos nuskaitymas ir jos pavertimas baltymu vadinamas – transliacija. Transliacijos procesas ląstelėse vyksta ribosomose. Ribosomos tai daugiabaltyminis kompleksas, sudarytas iš dviejų subvienetų: mažojo ir didžiojo. Transliacijai reikalinga iRNR, įkrautos tRNR, bei ribosomų sąveika. Ribosomos prie iRNR prisijungia per specifinę nukleotidų seką vadinama Shine-Dalgarno seka.

Baltymas nuskaitytas nuo iRNR yra sudarytas iš amino rūgščių likučių sekos, kuri apibrėžia jo atliekamas funkcijas ląstelėje.Baltymai tai polimeriniai junginiai dalyvaujantys praktiškai visuose ląstelės apykaitos procesuose. Jie katalizuoja chemines reakcijas vykstančias ląstelėje, molekulių transportą ląstelėje, molekulių judėjimą tarp ląstelių, kontroliuoja membranų pralaidumą, palaiko ląstelės struktūrą, saugo ląstelę nuo įvairių toksinų poveikio, atlieka apsauginę funkciją, o taip pat reguliuoja kitų genų raišką.Visos amino rūgštys turi panašią cheminę struktūrą. Bendrai amino rūgščių cheminę formulę galima būtų parašyti:

H+H3N – C – COO-

R

R – viena iš 20 amino rūgščių šoninių grandinių.

Į polipetidinę gandinę amino rūgščių likučiai baltymo molekulėje sujungti peptidine jungtimi. Pirmas baltymo amino rūgšties likutis turi laisvą amino grupę todėl vadinamas baltymo N – galu, o paskutinis polipeptidinės grandinės amino rūgšties likutis turi laisvą karboksilo grupę, C - baltymo galas. Baltymai paprastai sudaryti iš 40 – 1000 amino rūgščių likučių. Priklausomai nuo baltymą sudarančių amino rūgščių likučių sekos baltymas susivynioja, į specifines struktūras:pirminė - amino rūgščių likučių seka;antrinė - α-spiralė arba β – klosčių struktūra;tretinė - baltymo bendra struktūra; ketvirtinė - susijungimas į subvienetus.

7


Daugelis ląstelės funkcinių baltymų yra sudaryti iš dviejų ar daugiau polipeptidinių grandinių. Jeigu baltymą sudaro dvi tokios pačios polipetidinės grandinės toks baltymas vadinamas – homodimeriniu, jei skirtingos – heterodimeriniu, o viena baltymo polipeptidinė grandinė – subvienetu.Dideli baltymų kompleksai kurių kiekvienas sudarytas iš kelių ar keleto subvienetų ląstelėje atlieka svarbias funkcijas.

Baltymai pagal savo atliekamas biologines funkcijas yra skirstomi:1. Fermentai (alkoholdehidrogenazė – fermentas skaldantis alkoholi žmogaus organizme).2. Transportiniai baltymai (hemoglobinas - O2 pernešimui).3. Maistiniai ir atsargų baltymai (daugelio augalų sėklose kaupiami baltymai kurie po to naudojami kaip maisto šaltinis pirmose augalo augimo stadijose (kviečių, kukurūzų, ryžių sėklos)). 4. Susitraukimo ir judėjimo organizme funkcijas atliekantys baltymai (aktinas, miozinas

– raumenų sudėtinė dalis).5. Struktūriniai baltymai (kolagenas – sausgyslėse, elastinas – plaukų, nagų).6. Apsauginiai baltymai (imunoglobulinai arba antikūnai, fibrinogenas ir trombinas –

dalyvauja kraujo krešėjimo procese).7. Reguliatoriniai baltymai (insulinas – reguliuoja gliukozės apykaitą organizme, augimo

hormonas – ląstelės augimą).8. Kiti baltymai (pas kai kurias žuvų rūšis randami antifriziniai baltymai).

Fermentai

Fermentai jų veikimas.Fermentai tai biologiniai katalizatoriai, nulemiantys ląstelėse vykstančių cheminių reakcijų kryptį ir greitį, patys neįeidami į šių reakcijų metu susidarančių galutinių produktų sudėtį. Jie dalyvauja visuose ląstelėje vykstančiuose medžiagų apykaitos procesuose.Apie 1850 metus Lui Pasteras padarė išvadą kad mielių sugebėjimas iš cukraus gaminti alkoholį katalizuojamas “fermentų”. Jis laike kad fermentai (enzimai - kas reiškia mielėse) neatskiriama mielių dalis. 1926 m. pirma karta buvo išskirtas fermentas skaldantis šlapalą – ureazė.Kai kurie fermentai yra sudaryti tik iš baltymų ir neturi jokių kitų grupių. Tačiau katalitiniam daugelio fermentų aktyvumui reikalingi papildomi cheminiai junginiai – kofaktoriai. Tai gali buti neorganines medžiagos (Fe2+, Mg2+, Zn2+) arba sudėtingi organiniai junginiai dar vadinami kofermentais.Daugelio fermentų katalitiniam aktyvumui reikalingi ne tik kofaktoriai bet ir vienas ar keli metalų jonai. Kofermentai arba metalų jonai vienuose fermentuose yra laikinai (nestipriai) susirišę su baltymu, tuo tarpu kai kituose fermentuose šis susirišimas yra stiprus ir stabilus (pastovus). Nebaltyminė fermento dalis vadinama - prostetine grupe.

8


Kofermentai ir metalu jonai yra termostabilūs tuo tarpu fermento baltyminė dalis, vadinama apofermentu, ji šildant denatūruoja. Katalitiškai aktyvus fermentas kartu su kofermentu arba metalų jonais vadinamas – holofermentu.Veikiant fermentams vyksta ne tik medžiagų pasikeitimas, bet ir energijos pernešimas iš vienų junginių į kitus. Energijos pernešėjų vaidmenį atlieka ATP.Fermentų klasifikacija pagrista principais:1. Fermentų pavadinimai baigiasi galūne – azė. 2. Katalizuojama reakcija yra esminis požymis pagal kurį vieną fermentą galima atskirti nuo kito. 3. Į klases fermentai suskirstyti pagal katalizuojamos reakcijos tipą. Jis kartu su substrato pavadinimu yra pagrindas fermento pavadinimui sudaryti.

Fermentų klasifikacijai svarbus yra kodai sudaryti iš 4 taškais atskirtų skaičių. Pirmasis – rodo kuriai iš šešių klasių priskiriamas fermentas;Antrasis – rodo poklasį;Trečiasis – rodo popoklasį;Ketvirtasis – fermento eilės numerį popoklasyje.

Fermentų klasės.1. Oksidoreduktazės.Katalizuoja oksidacines-redukcines reakcijas.Bendrai šios fermentų klasės katalizuojamą reakciją galima užrašyti:_D-H2 + A D + A-H2

Atskeliantys substrato vandenilį – dehidrogenazės. Aldehidoksidazės dalyvauja oksiduojant aldehidus.

2. Transferazės.Katalizuoja grupės atomų pernešimą (-CH3, -PO3H2, -NH2 ir kt.)Bendrai šios fermentų klasės katalizuojamą reakciją galima užrašyti:

D-X + A-Y D-Y + A-X

Aminotransferazės – amino rūgščių ir keto rūgščių CO ir NH2 pasikeitimą vietomis.Fosfotransferazės – atlieka fosforo rūgsties likučio pernešimo vaidmenį.

3. Hidrolazės. Katalizuoja reakcijas kurių metu veikiant vandeniui suardomos C-O, C-N, C-C ir kitos jungtys.Bendrai šios fermentų klasės katalizuojamą reakciją galima užrašyti:

_A-B + H2O A-OH + B-H

Peptidazės – peptidinių jungčių ir baltymų hidrolizę.Esterazės – nutraukia sudėtingas jungtis.

9


Gliukozidazės – skaldo glikozidus. Ureazė – skaldo šlapalą.

4. Liazės.Katalizuoja reakcijas kurių metu medžiagose suardomos C-C, C-O, C-N jungtys atsirandant (susidarant) dviguboms jungtims arba grupės atomų prisijungia prie dvigubos jungties ją suardant.Bendrai šios fermentų klasės katalizuojamą reakciją galima užrašyti:

__ R2 R3 R2 R3

_R1 – C – C –R4 R1 – C = C – R4 + XH

X H

Karboksilazės – atskelia CO2 pvz. nuo pirovyuogių rūgšties.Furamathidratazė – atskelia H2O nuo obuolių rūgšties susidarant fumaro rūgščiai.

5. Izomerazės.Fermentai vienus medžiagų izomerus paverčiantys kitais.Gliukozofosfatizomerazė – gliukozofosfatas virsta fruktozofosfatu.

6. Ligazės.Katalizuoja reakcijas kurių metu susijungia dvi molekulės ir nukleozidtrifosfate (dažnai ATP) vyksta pirofosfato jungties hidrolizė.

_A-H + B-OH + ATP A-B + ADP + H3PO4

Asparaginsintetazė – katalizuoja asparagino sintezę.DNR – ligazė katalizuoja DNR grandinių sujungimą.RNR – ligazė, katalizuoja RNR grandinių sujungimą.

Fermentų veikimo mechanizmas.Daugumos fermentų katalitinis veikimas susijęs su tuo kad fermento veikiama medžiaga (substratas) ir pats fermentas susijungia, į laikiną sudėtinį junginį, kuris tuoj pat skyla susidarant laisvam fermentui ir produktui.

Fermentai – tai natūralūs katalizatoriai. Jie, sumažindami aktyvacijos energiją, (tai energijos kiekis (kalorijomis) kuris reikalingas tam kad visos molekules esančios 1 molyje medžiagos pasiektų pereinamąją būsena atitinkančią energetinio (aktivacinio) barjero viršūnei) žymiai padidina griežtai apibrėžtų reakcijų greitį, kurios be fermento vyksta labai lėtai. Yra du pagrindinai cheminių reakcijų greičio padidinimo budai:1. Temperatūros padidinimas - molekulių temperatūrinio judėjimo pagreitėjimas veda prie molekulių turinčių pakankamą vidinę energiją pasiekti perėjimo būseną. (Padidinus temperatūrą 10oC reakcijos greitis padidėja maždaug dvigubai).

10


2. Katalizatoriaus pridėjimas. Katalizatoriai padidina cheminių reakcijų greitį, randant “aplinkinį kelią” leidžaintį molekulėms pereiti aktivacinę ribą esant žymiai mažesniam jų energetiniam lygiui.

Michaelio-Menten konstanta ir jos reikšmėNagrinėjant fermentines reakcijos priklausomybę nuo substrato koncentracijos, esant labai mažoms substrato koncentracijoms reakcijos greitis yra mažas. Didinant substrato koncentraciją reakcijoje reakcijos greitis išauga, ir pagaliau pasiekia tašką kai didinant substrato koncentraciją reakcijos greitis nebedidėja, t.y. reakcija pasiekia plato kai bet koks substrato koncentracijos padidinimas tik labai nežymiai padidina reakcijos greitį. Toliau kaip nedidinant substrato koncentraciją fermento greitis tik artėja prie maksimalaus (Vmax) bet niekad jo nepasiekia.

Fermentinės reakcijos pradinio greičio priklausomybė nuo substrato koncentracijos.

1903 metais Victoras Henry padarė išvadą kad būtina fermento katalizės stadija yra jo susijungimas su substratu susidarant fermento-substarto kompleksui. Toliau šią idėją išvystė Leonor Michaelis ir Mod Menten. 1913 m. jie postulavo, kad pirmoje fermentinės reakcijos stadijoje fermentas (E) greitai ir grįžtamai susijungia su substratu (S)

_ E + S ES

Antrojoje stadijoje susidaręs fermento-substarto kompleksas, jau žymiai lėčiau skyla susidarant produktui (P) ir laisvam fermentui (E).

_ ES E + P

Kadangi antroji stadija yra žymiai lėtesnė tai ji ir sąlygoja visos fermentinės reakcijos greitį, todėl reakcijos veikimo greitis bus tiesiogiai priklausomas nuo fermento-substarto komplekso koncentracijos.Reakcijos greitis bus maksimalus kai praktiškai visas fermentas bus susirišęs su substratu. Ši sąlyga yra tik esant labai didelėmis substrato koncentracijoms. Padidinus substrato koncentraciją reakcijos pusiausvyra pasistumia į dešinę.

11

½Pradinis reakcijosgreitis

Substrato konc. [M]

Vmax


_E + S ES

Kadangi fermentinės reakcijos greitis priklausomai nuo substrato koncentracijos tik artėja prie maksimalaus bet praktiškai jo niekad nepasiekia todėl Michaelis ir Menten nustatė konstantą Km patogią išreikšti tikslią fermentinės reakcijos greičio priklausomybę nuo substrato koncentracijos.Matematinė išraiška:

Vo = Vmax * [S] / Km + [S]Km (Michaelio-Menteno konstanta) tai substrato koncentracija kuriai esant fermentinės reakcijos greitis yra lygus pusei maksimalaus greičio, Vo- reakcijos matuojamas greitis, [S] - substrato koncebtracija, Vmax - maksimalus fermento veikimo greitis.

Kiekvienas fermentas turi jam charakteringa Km reikšmę.Daugeliui fermentinių reakcijų su fermentu susiriša ne viena, o dvi skirtingos substrato molekulės.

ATP + Gliukoze ADP + gliukozo-6-fosfatas.

Šioje heksokinazės katalizuojamoje reakcijoje ATP ir gliukozė yra substratai.Todėl heksokinazė charakterizuojama dviem Km reikšmėmis, skirtingomis kiekvienam substratui.Kiekvieno fermento veikimui charakteringa optimali pH reikšmė ir veikimo temperatūra.

Fermentas Fermentoveikimo pH

Pepsinas 1.5Ribonukleazė 7.8Arginazė 9.7

Daugumos fermentų aktyvumą galima slopinti (inhibuoti). Fermentų inhibitoriai skirstomi į dvi pagrindines grupes:Negrįžtami - kurie negrįžtamai susiriša su fermento funkcinėmis grupėmisarba jas suardo.Grįžtami - jie dar skirstomi į dvi grupes:

Konkurentinius - kai inhibitorius dėl prisijungimo fermentoaktyviame centre konkuruoja su substratu, bet skirtingainuo substrato jis yra nepaverčiamas produktu.

Nekonkurentinis - kai inhibitorius prisijungia ne fermentoaktyviame centre bet kitoje vietoje. Fermentas pakeičiasavo konformaciją ir tuo pačiu įvyksta grįžtama fermentokatalitinio centro inaktyvacija.

Fermentas Fermento veikimo temperatūra

Taq DNR polimerazė

72 oC

T4 DNR polimerazė

37 oC

12


Fermentai ląstelėje dalyvauja įvairiuose metabolitiniuose procesuose, kuriuose vienos fermentinės reakcijos produktas tarnauja substratu sekančiai fermentinei reakcijai. Multifermentines sistemos gali jungti 15 ir daugiau fermentų veikiančių atitinkamu eiliškumu. Kiekvienoje fermentinėje sistemoje egzistuoja fermentas užduodantis visų sekančių reakcijų greitį. Tokie fermentai vadinami - regulacinais.Kai kuriose ląstelės multifermentinėse sistemose reguliacinis fermentas gali skirtis savo savybėmis t.y. jis gali buti inhibuojamas galutinio multfermentinės reakcijos produkto. Tokia reguliacija vadinama atvirkštinio ryšio inhibicija arba retroinhibicija. Tokie fermentai turi inhibicines sritis ne aktyviame centre ir vadinami alosteriniais fermentais (graikiškai allo ir stereos reiškia "kitas" ir "vieta"). Alosteriniai fermentai - turi "kitą centrą"1. Kaip ir visi fermentai alosteriniai fermentai be katalitinio centro turi dar vieną

reguliacinį metabolitą surišantį centrą.2. Lyginant su paprastas fermentais alosterinių fermentų molekulės yra žymiai didesnes ir

sudėtingesnės.3. Šių fermentų kinetika neatitinka klasikinės Michaelio-Menteno lygties.

Kai kurie fermentai ląstelėje egzistuoja keliomis molekulinėmis formomis, gali būti sutinkami pas tą patį ląstelių tipą, tuose pačiuose audiniuose, netgi toje pačioje ląstelėje. Tokiu atveju visos fermento formos katalizuoja vieną ir tą pačią reakciją, tačiau skiriasi savo kinetinėmis savybėmis, o taip pat amino rūgščių seka. Tokie fermentai vadinami izofermentais (arba izozimais).

Fermentų aktyvumo vienetai. Fermento kiekiui nustatyti matuojamas katalizuojamos reakcijos greitis. Tarptautinės biochemikų sąjungos fermentų nomenklatūros komisija 1972 m. – susitarė kad reakcijos greitis matuojamas moliais produkto susidariusio per 1 s. ir šis vienetas vadinamas – katalu (kat).

Fermentai naudojami biotechnologijojeBiotechnologijoje panaudojami fermentai paprastai išskiriami iš bakterijų ar virusų, nes jie turi paprastą struktūrą, pasižymi reikiamomis katalitinėmis savybėmis bei juos palyginus su fermentais gryninamais iš eukariotinių ląstelių lengva išgryninti.Trumpai apžvelgsime biotechnologijos darbuose naudojamus fermentus:

DNR restrikcijos endonukleazės. Klonavimui DNR turinti reikalingą seką ir klonavimo vektorius turi buti perskeltas į reikiamus diskretinius ir atsikartojančius fragmentus. Chromosominės DNR išskyrimas ir jos praleidimas esant dideliam spaudimui pro ploną (švirkšto) adatą ar DNR paveikimas ultragarsu suskaldo DNR į 300 – 5000 bazių porų fragmentus. Tačiau šie fragmentai yra gaunami atsitiktinai ir tai reiškia kad kiekvieną kartą bus gaunami skirtingi fragmentai. Su bakterinių fermentų skaldančių DNR molekulę specifinėse vietose atradimu DNR klonavimas tapo įmanomas. Šie fermentai vadinami restrikcijos endonukleazėmis.

Skirtingose bakterijų rūšyse randamos skirtingos restrikcijos endonukleazės, t.y. kerpančios DNR skirtingose vietose, kaip pvz:

13


Hpa I (Haemophilus parainfluenzae)

5’ – GTT AAC – 3’3’ – CAA TTG – 5’

Fermento poveikyje susidaro DNR buki galai.

EcoRI (Escherichia coli)

5’ – G AATTC – 3’3’ – CTTAA G – 5’

Fermento poveikyje susidaro išsikisęs 5’ DNR galai

Pst I (Providencia stuartii)

5’ – CTGCA G – 3’3’ – G ACGTC – 5’

Fermento poveikyje susidaro išsikišęs 3’ DNR galai.

Bakterijose restrikcijos endonukleazės tai kaip eukariotinių ląstelių imuninė sistema.Šiuo metu yra žinoma apie 3600 restrikcijos endonukleazių išskirtų iš įvairių šaltinių.

DNR-priklausomos DNR polimerazės.Visos DNR polimerazės vykdo dezoksiribonukleotidų sintezę, prijungiant juos prie 3’-OH pradmens galo.Sintezė vyksta tik 5’-3’ kryptimi, atžvilgiu sintetinamos grandinės. Kiekvienas įjungtas nukleotidas yra komplementarus prieš jį matricinėje grandinėje esančiam nukleotidui. DNR sintezės inicijacijai reikalingi: pradmuo, dezoksiribonukleotidtrifosfatai (dNTP) ir kofaktoriai, paprastai tai metalų jonai.Dauguma DNR polimerazių pasižymi ne tik polimeraziniu bet ir 3’-5’ egzonukleaziniu aktyvumu kuris neatskiriamai susijusijęs su polimeraziniu aktyvumu.3’-5’ egzonukleazinis aktyvumas, reakcijoje nesant dNTP, kiekvieną kartą pašalina vieną nukleotidą (nukleozid 5’ monofosfata). Šis fermento aktyvumas vykdo DNR degradaciją nuo 3’ laisvo hidroksilo (OH) dvigrandės DNR abiejų grandinių galų.Esant reakcijos mišinyje dNTP egzonukleazinis aktyvumas yra inhibuojamas polimerazinio aktyvumo (t.y. aktyvumų santykis pol/exo >> 1). DNR sintezės metu egzonukleazinis aktyvumas vykdo teisingo nukleotidų įjungimo kontrolę, pašalinant neteisingai įjungtus nukleotidus.Kai kurios DNR polimerazės turi 5’-3’ egzonukleazinį aktyvumą, pašalinantį vieną ar kelis nukleotidus (iki 10). Šis aktyvumas fermentui leidžia vykdyti sintezę esant trumpiems vienos iš DNR grandinių trūkiams. Tokia reakcija žinoma "nik transliacijos" pavadinimu ir yra naudojama žymėtos DNR gavimui.

14


Labai svarbi DNR polimerazių savybė tai jų procesyvumas t.y. polimerazės molekulės sugebėjimas įjungti nukleotidus be disociacijos nuo matricos. Daugumas DNR polimerazių turi žemą procesyvumą, t.y. jos disocijuoja nuo matricos po mažiau negu 10 nuleotidų įjungimo. (Pvz: T7 DNR polimerazė yra labai procesivi ir gali įjungti tūkstančius nukleotidų prieš disocijuodama nuo matricos. Ši savybė labai naudinga sintetinant ilgus DNR fragmentus.Iš DNR polimerazių biotechnologijoje plačiai naudojamos: E.coli DNR polimerazė I, T4 DNR polimerazė, T7 DNR polimerazė bei termostabilios DNR polimerazės išskiriamos iš termofilų tokios kaip Taq DNR polimerazė. Taq DNR polimerazė plačiai naudojama padauginant DNR fragmentus polimerazės ciklinėje reakcijoje (PCR, dar naudojamas sutrumpinimas - PGR).

Polimerazės ciklinė reakcija (PCR)1985 m. Kary Mullis atrado DNR sekų padauginimo būdą mėgintuvėlyje. Tai faktiškai buvo revoliucinis atradimas.PCR tai efektyvi procedūra gaunant didelius kiekius reikiamos DNR sekos in vitro.Amplifikacija (padauginimas), kuri siekia milijonus kartų, vyksta trimis stadijomis.Pagrindiniai reikalavimai PCR:

1. Du sintetiniai oligonukleotidiniai, komplementarūs norimos padauginti DNR sritims - pradmenys;2. DNR seka išsidėsčiusi tarp pasirinktos pradmenų poros;3. Termostabilus fermentas - DNR polimerazė;4. Keturi dezoksiribo trifosfatai - (dATP, dCTP, dTTP, dGTP).

Tipinis DNR padauginimo arba amplifikacijos procesas susideda iš ciklų. Kiekvienas ciklas susideda iš 3 stadijų.1. Denatūracija. Terminė DNR mėginio denatūracija pakeliant temperatūrą reakcijos

mėgintuvėlyje iki 95oC;2. Renatūracija. Temperatūra mėgintuvėlyje pažeminama iki 50 – 60oC. Pradmuo pagal

komplimentariškumo principą prisijungia prie DNR;3. Sintezė. Temperatūra pakeliama iki optimalios termostabiliai DNR polimerazei

veikimo temperatūros (72oC). DNR sintezė inicijuojama kiekvieno pradmens 3’-OH gale.

PCR reakcija reikalauja labai mažų pradinės medžiagos kiekių. Mamutų rastų amžino įšalo zonoje DNR buvo padauginta PCR reakcijos pagalba. Reakcija plačiai naudojama kriminalistikoje.

RNR-priklausomos DNR polimerazės.

Atvirkštinė transkriptazė.Gryninama iš virusų, vykdo DNR sintezę nuo RNR. Fermentas nepasižymi 3'-5' egzonukleaziniu aktyvumu, todėl šio fermento katalizuojama DNR sintezė nėra tiksli, dažnai gaunami pakitimai nukleotidų sekoje - mutacijos.

DNR-priklausomos RNR polimerazes.

15


Naudojamos nuo DNR gauti RNR. Iš DNR polimerazių biotechnologijoje plačiai naudojamos: bakteriofagų SP6, T7, T3 RNR polimerazės, išskiriamos iš bakteriofagais užkrėstų ląstelių.

Fosfatazės ir kinazės.Fosfatazės: katalizuoja 5’-fosfato likučių hidrolizę nuo DNR ir RNR molekulių susidarant 5'-OH galams.Biotechnologijos darbuose plačiai naudojamos: bakterinė šarminė fosfatazė ir veršiuko plonųjų žarnų fosfatazė.Kinazės: Katalizuoja galinio γ fosfato nuo ATP pernešimą ant DNR ar RNR 5’-OH galo. Biotechnologijoje plačiai naudojama bakteriofago T4 polinukleotidkinazė.

Dezoksiribonukleazės.Plačiai biotechnologiniuose darbuose naudojamos dezoksiribonukleazės tai fermentai katalizuojantys DNR degradaciją nuo 5' ar 3' DNR grandinės galų. Fermentai skirstomi į tai kokios, viengrandės ar dvigrandės DNR hidrolizę, bei kuria kryptimi 3'-5' ar 5'-3' jie katalizuoja. Šis skirstymas yra sąlyginis kadangi yra fermentų pvz.: E.coli egzonukleazė VII kuri katalizuoja DNR degradaciją tiek nuo 5' tiek nuo jos 3' galų. Dezoksiribonukleazės išskiriamos iš įvairių mikroorganizmų.Biotechnologijos darbuose plačiai naudojamos λ bakteriofagofago dezoksiriboegzonukleazė, E.coli egzonukleazė III, dezoksiribonukleazė I, S1 nukleazė, nukleazė Bal 31 bei kitos.

Ribonukleazės.Fermentai turintys skirtingus specifiškumus (skirtingomis skelimo vietomis) naudojamos įvairiuose biotechnologiniuose darbuose, įskaitant ir pirminės RNR struktūros nustatymą. Kai kurių ribonukleazių skėlimo vietos:

RNazė Skėlimo vietaRibonukleazė T1 Gp / NRibonukleazė U2 Ap / NRibonukleazė CL3 C(A/G)p / NS.aureus nukleaze Np / (A/U)

DNR ligazėsDNR ligazės katalizuoja fosfodiesterinių jungčių tarp gretimų 5‘ fosfato ir 3’-OH galų dvigrandėje DNR grandinėje susidarymą. Labai plačiai naudojama bakteriofago T4 DNR ligazė.

RNR ligazėsKatalizuoja nuo ATP priklausomą viengrandės DNR ar RNR 5’-fosforyl galo prijungimą prie viengrandės DNR ar RNR 3’-OH galo. Plačiai naudojama bakteriofago T4 RNR ligazė.

Vektoriaus sąvoka biotechnologijoje.

16


Biotechnologijoje vektorius tai DNR segmentas į kurį panaudojus rekombinantinės DNR metodus, įterpiamas (įklonuojamas) reikiamas DNR fragmentas.

Plazmidės tai mažos DNR galinčios egzistuoti viduje ląstelių atskirai nuo ląstelės DNR. Plazmidinė DNR ląstelės viduje turi replikuotis. Kad ląstelės šeimininko fermentai kai ląstelė dalijasi galėtų jas replikuoti tokios DNR turi turėti reikalingus genetinius elementus.

Plazmidinės DNR randamos daugelyje mikroorganizmų. Bakterijose pagrinde randamos žiedinės plazmidinės DNR. Kai kuriose mielėse tai linijine DNR, kaip maža papildoma chromosoma.Natūralios plazmidinės DNR dažniausiai neturi svarbių savybių keliamų klonavimo vektoriams. Tos savybes yra:

Mažas dydis, reikalingas tam kad būtų efektyviai perkeliama egzogeninė (svetima) DNR į ląstelę. Perkėlimo efektyvumas palzmidinių DNR didesnių kaip 15 kb. stipriai mažėja.

Unikalūs restrikcijos endonukleazių taikiniai tam kad jas būtų patogu sukarpyti ir į kirpimo vietas būtų įterpta svetima DNR.

Tam kad atskirti ląsteles į kurias klonavimo vektorius-intarpas įsiterpė plazmidinės DNR turi turėti atrankos genetinius markerius.Todėl plazmidės DNR naudojamos biotechnologiniuose darbuose sukonstruojamos panaudojus genetinę inžineriją.

Fermentacija.

Fermentacijos technologijos yra senos, jų amžius siekia šimtus metu. Fermentacijos procesas rytų šalyse buvo naudojamas pagrinde maistinių medžiagų fermentacijoms, tokių kaip sojos padažų. Vakarų šalyse fermentacijos procesai buvo pagrinde naudojami siloso gamyboje, grybų kultivacijoje, sūrio bei raugintų kopūstų produkcijai, bei augalinių bei gyvulinių atliekų kompostavimui.Pradžioje fermentacija, buvo naudojama pagrinde maisto produktų, tokių kaip sūris, jogurtas, grietinė, daržovių marinavimui, sojos padažo alaus, vyno bei spirito gamyboje. Fermentacija tai pagrindinė tradicinės biotechnologijos disciplina, bei praktiškai visos šiuolaikinės biotechnologijos procesų pradinė stadija.Lygiagrečiai su naudingų produktų žmogaus reikmėms naudingų produktų gavimu, buvo vykdoma mikroorganizmų galinčių pašalinti įvairius teršalus identifikacija.

Fermentacijos procesas.Ląstelių augimas priklauso nuo auginimo terpėje esamų maistinių medžiagų sudėties, jų transporto į ląstelę efektyvumo bei jų įsisavinimo, o taip pat nuo aplinkos parametrų tokių kaip temperatūra, auginimo terpės pH ir aeracija (aprūpinimas deguonimi).Vidutinis laiko tarpas reikalingas ląstelių kiekio padvigubėjimui didėjant ląstelių dydžiui ir sudėtingumui didėja: bakterijoms 0.25 – 1 h; mielėms 1 – 2 h; pelėsiniams grybams 2 – 6.5 h; augalų ląstelėms 20 – 70 h; gyvūnų ląstelėms 15 – 48 h.

17


Praktikoje organizmai retai kada turi sąlygas neribotam augimui, paprastai augimas būna priklausomas nuo limituojančių faktorių t.y. nuo pagrindinių terpės komponentų sudėties. Kai šių faktorių koncentracija sumažėja sulėtėja ir ląstelių augimas.

Biotechnologijos procesuose mikroorganizmų auginimui bioreaktoriuose naudojami trys pagrindiniai budai:

1. Serijinis (kai auginama partijomis, t.y. užauginama viena, po to kita ir t.t.);2. Pusiau-nenutrūkstamas (pamaitinamasis);3. Nenutrūkstamas.Bioreaktoriuje procesai gali vykti statinėmis ar agituojamomis sąlygomis, esant ar

nesant deguoniui, skystose ar mažai drėgmės turinčiose terpėse.Mažas mikroorganizmų kiekis (paprastai 1 – 10% nuo to organizmų kiekio kurio

tikimasi fermentacijos pabaigoje) vadinamas - inokuliatu.Serijinėje fermentacijoje mikroorganizmai yra inokuliuojami į fiksuotą terpės tūrį

ir vykstant augimui, auginimo terpėje ar auginamose ląstelėse kaupiasi galutinis (reikiamas) produktas.

Maitinamoji terpė bioreaktoriuje (fermentatoriuje) pastoviai kinta, tuo pačiu verčia kisti auginamų ląstelių metabolizmą. Mažėjant maistinių medžiagų kiekiui bei kaupiantis kenksmingoms ląstelių išskyroms, ląstelių augimas sustoja.

Ląstelių augimo priklausomybė nuo laiko fermentatoriuje (pertraukiamame, arba partijinėje gamyboje) galima pavaizduoti taip:

Daugelis svarbių produktų, tokių kaip antibiotikai, susidaro stacionarinėje, pertraukiamojo auginimo, kultivuojamų ląstelių augimo fazėje.

Tam kad prailginti pertraukiamąją fermentaciją, tuo pačiu padidinant išeigą naudojamas taip vadinamas ląstelių pamaitinimas:1. Laipsniškas koncentruotų terpės komponentų (karbohidratu) pridėjimas, tačiau padidėja kultivuojamos terpės tūris – naudojama kepimo mielių gamyboje.

18

Biomasėslogaritmas

Laikas

Pradinėfazė

Logaritminė fazė Stacionarinėfazė

Ląstelių žūtis


2. Terpės pridėjimas į auginamą` kultūra, bei tokio paties tūrio senos (panaudotos) terpės pašalinimas (nepertraukiama fermentacija) – naudojama gyvūnų ląstelių kultivacijoje.

Skirtingai negu pertraukiamajame auginimo fermentatoriuje procesas, nepertraukiama kultivacija geriau subalansuota, auginama su nedideliais maistingų medžiagų, ląstelių skaičiaus ar biomasės kiekio svyravimais.Nepertraukiamoje fermentacijoje sterili terpe pastoviu greičiu yra tiekiama i fermentatorių, ir tokiu pat greičiu terpė pašalinama iš fermentatoraius, tuo būdu pastoviu palaikant bendra terpės tūrį. Tokio tipo fermentacija, skirtingai nuo pertaraukiamo tipo, fermentacijos leidžia ilgą laiką fermentatoriuje palaikyti pastovų pH, maistinių ir metabolitinių medžiagų koncentracijas. Tačiau pertraukiamo tipo fermentatorai vis dar plačiai naudojami pramoninėje.

Bioreaktoriai/fermentatoriai.Kiekvienas biotechnologinis procesas turi būti vykdomas įrengime kuriame galima sukurti aplinka labiausiai tinkama organizmų augimui.Bioreaktoriai gali buti nuo paprasčiausiai maišomų ar nemaišomų nesterilių atvirų konteineriu, iki kompiuteriais valdomų prietaisų.Daugeliui šiuolaikinių fermentacijos procesų reikalinga išvengti fermentacijos proceso užkrėtimo pašaliniais mikroorganizmais, bei išvengti aplinkos užteršimo mikroorganizmais. Dirbant su genetiškai pakeistais organizmais būtina palaikyti juos fermentatoriuje tam kad išvengti gamtos užteršimo.Pagal auginimo sąlygas fermentacijos dar yra skirstomos:- nesterilios fermentacijos - kada visiškai nebūtinas kultūros švarumas (naudojama nuotekų valymo sistemose).- suderinamos fermenacijos – kai keletas mikroorganizmų kartu auginami auga geriau negu auginant juos atskirai. Šiuo atveju organizmai turi buti vieni nuo kitų priklausomi, nes kitu atveju vienas mikroorganizmas augs intensyviau ir peraugs kita mikroorganizmą tuo būdu pradės dominuoti terpėje.- sterilios fermentacijos - kai sėkmingam produkto formavimuisi (antibiotikų, vitaminų, polisacharidų gamyboje) būtina sąlyga yra sterilumas.

Biologines reakcijos vyksta efektyviai tik esant optimaliems aplinkos parametrams ir tokiu būdu kad kiekviena ląstelė būtų vienodose sąlygose. Fermentacijos reakcijos yra multifazinės, įskaitant dujų fazę (N2, O2, ir CO2), viena ar daugiau skystų fazių (vandeninė terpė ir vandeninį substratą), ir vientisą mikrofazę. Kad gauti greitą masės ir šilumos perdavimą, visos šios fazės turi buti betarpiškame kontakte.

Bioreaktoraus sistemų optimizavimas paremtas sekančiais principais:- Kad išvengti užteršimo pašaliniais mikroorganizmais bioreaktriai turi buti hermetiški bei skirti auginti reikalingam organizmui;- Auginimo terpės tūris turi buti pastovus t.y. fermentatorius turi buti sandarus kad terpė nenugaruotų;- Aplinkos parametrai tokie kaip temperatūra, pH, ir kiti, turi buti kontroliuojami, o kultūra gerai išmaišoma.

19


Medžiagos iš kurių padarytas pats fermentatorius taip pat vaidina svarbų vaidmenį:- Visos medžiagos turinčios sąlytį su pakliūvančiu į bioreaktorių tirpalu ar mikroorganizmų kultūra, tikslu išvengti terpės užteršimo metalais, turi būti korozijai atsparios.- Medžiagos iš kurių padarytas fermentatorius turi buti netoksinės, nes net maža tokių medžiagų koncentracija gali inhibuoti kultūros augimą.- Bioreaktoriaus medžiagos turi išlaikyti daugkartinį didelių temperatūrų ir slėgio pasikeitimą (bioreaktoriai sterilinami didelio slėgio garais).

Tam kad pasiekti optimalią auginamo mikroorganizmo ar galutinio produkto išeigą, dar ir šiuo metu labai trūksta žinių, apie tai kokias sąlygas reikia sudaryti fermentatoriuje.

Fermentacijos procesas paprastai vykdomas trimis stadijomis (arba dydžiais).Pradinėje stadijoje pagrindine naudojant Petri lėkšteles vykdoma mikroorganizmų

atranka bei nedidelių (100 ml – 1 l) tūrių fermentacijos.Nustačius optimalias sąlygas fermentacija vykdoma jau didesniuose tūriuose

naudojant nedidelius ( 5 – 200 l) fermentatorius.Optimizavus sąlygas fermentacija vykdoma fermentatoriuose kuriuose terpės tūris

siekia 5 – 20 m3.Visose fermentacijos stadijose biotechnologų tikslas yra optimalios galutinio produkto formavimuisi reikalingų aplinkos sąlygų palaikymas.

Fermentacijos proceso terpės.Visų biotechnologinių procesų pagrindas yra vanduo. Tai dominuojantis mikroorganizmų auginimo terpių komponentas. Fermentacijos procesui pasiekus optimumą, vandens atskyrimas nuo užaugintų mikroorganizmų vienas iš pagrindinių ir daug sąnaudų reikalaujantis (brangus) procesas.Vandens kokybė – svarbus faktorius turintis įtaką mikroorganizmų augimui, o tuo pačiu ir galutinio (reikiamo) produkto formavimuisi. Anksčiau tradiciškai pagrindinės fermentacijos proceso naudotojos, alaus daryklos, steigėsi tokiose vietovėse kur aukštos kokybes vanduo buvo gaunamas iš natūralių šaltinių tuo pačiu nereikalaujant papildomų išlaidų.

Mikroorganizmų augimo terpė turi tenkinti pagrindinį maistinių medžiagų poreikį t.y. turėti prieinamą anglies šaltinį, azoto šaltinį, neorganinius elementus ir kai kuriems organizmų tipams specifinius augimo faktorius.Terpės sterilizacija turi buti vykdoma taip, kad kuo mažiausiai pažeisti terpės komponentus (jie gali buti dalinai termiškai neatsparūs aukštoms temperatūroms).Žemo (mažo) maistingumo terpėje organizmai augs labai neefektyviai.Nuo mitybinės terpės sudėties ir auginimo sąlygų labai priklauso mikroorganizmų medžiagų apykaitos procesai ir baltymų kiekis. Į terpę pridėjus metabolizmo produktų, galima nutraukti (represuoti) vienų baltymų biosintezę ir indukuoti kitų baltymų biosintezę. Keičiant mikroorganizmų kultivavimo sąlygas, galima pasiekti kad susidarančioje biomasėje būtų daug tikslinio produkto.

20


Kietų substratų fermentacijos.Daugelyje biotechnologinių procesų reikalingas mikroorganizmų auginimas praktiškai nesant, ar esant labai mažiems laisvo vandens kiekiams. Dažniausiai augimas naudojant kietus substratus vykdomas panaudojant javų grūdus, kukurūzų sėklas, medžiagas iš lignoceliuliozės tokias kaip šiaudai, pjuvenos, o taip pat ir plačią augalinių bei gyvulinių medžiagų sferą. Šios medžiagos pagrinde yra netirpios ar labai mažai tirpios vandenyje, tačiau pigios, lengvai gaunamos, polimerinės medžiagos, kurios panaudojamos kaip koncentruota mikroorganizmų auginimo terpė.

Daugeliui kietų substratų fermentacijų, tikslu sumažinti komponentų dydį bei padidinti surištu maistinių medžiagų kiekį reikalingas pirminis substrato apdorojimas (šiaudai susmulkinami, daržovės susmulkinamos).

Kietų substratų fermentacijos panaudojant tokias žaliavas kaip šiaudai, medžio bei kitų pramonės šakų atliekas, gaminamas etanolis, metanas bei pašarinės biomases.

Žinduolių ir augalų ląstelių kultūros.Pagrinde biotechnologinėms reikmėms auginamos bakterijų, mielių, grybų kultūros, ir tik neseniai pradėta auginti augalų bei žinduolių kultūros dideliais kiekiais.Šiuo metu yra kultivuojamos kaulų ląstelės, kremzlės, kepenų, plaučių, krūtinės, odos, inkstų, nervų (neuronu), užkrūčio liaukos ląstelės ir daug įvairių tipų vežinių ląstelių. Gyvūnų ląstelių kultivacija pramoniniu būdu naudojama gaminant vakcinas (poliomelito, kiaulytes, tymai, pasiutlige ir kt.), interferonus, hormonus, insuliną ir įvairius antikūnius. Pagrindinės problemos su kuriomis susiduriama kultivuojant žinduolių ląsteles tai jų didelis jautrumas vandens švarumui, terpės kokybei bei fermentacijų užteršimas greitai augančiais mikroorganizmais.Naujai išskirtos iš žinduolių sistemų kultūros vadinamos pirminėmis kultūromis. Šioje stadijoje ląstelės paprastai yra heterogeniskos. Po keleto kutivacijų naujoje terpėje šios ląstelės arba žūna arba transformuoasi susiformuojant vientisa ląstelių linija.Gyvūnų ląstelės gali augti arba suspensijoje, arba prisitvirtinusios prie kieto paviršiaus. Tokios ląstelės kaip HeLa (ląstelių tipas išvestas iš žmogaus piktybiniu ląstelių) gali augti dviejose būsenose arba kaip limfoblastoidines ląstelės kultūros suspensijoje, arba tuo tarpu kaip pirminės arba normalios diploidinės ląstelės augs tik prisitvirtinusios prie kieto paviršiaus. Manoma kad ateities biotechnologijoje pagrinde bus naudojamos prisivirtinančios ląstelės.Monosluoksninių gyvulinių ląstelių kultivacija susijusi su paviršiumi prie kurio gali ląstelės prisitvirtinti, ir šio metodo išvystymas susijęs su auginimo paviršiaus ploto didinimu.

Po fermentacijos sekantys procesai.Ląstelių auginimas bioreaktoriuse duoda tik grubų produktą. Sekančios stadijos reikalauja reikiamo produkto iš ląstelių išskyrimo ir jo išgryninimo.Po fermentacijos sekantys procesai sudaro pagrindinius daugelio biotechnologinių procesų kaštus.Metodai naudojami po fermentacijos apima: centrifugavimą, filtraciją, ultrafiltraciją, ekstrakciją panaudojant tirpiklius, elektroforezę bei chromatografines stadijas.

21


Galutinis produktas, komerciniam jo platinimui, turi buti stabilus. Daugumai produktų stabilumas pasiekiamas juos išdžiovinant. Naudojant džiovinimo metodus yra gaunamos organinės rūgštys, amino rūgštys, antibiotikai, polisacharidai, fermentai, ir daugelis kitų produktų. Tačiau kai kurie produktai, dėl savo nestabilumo ar aktyvumo praradimo, negali buti džiovinami, todėl jie būna tirpalo pavidale.

Įvadas į baltymų gryninimą.

Baltymai tai jautrios molekulės todėl joms būdinga termolabilumas, tendencija denatūruoti terpėse, kuriu pH reikšmės yra ekstremalios, ar kuriose yra sunkiųjų metalų bei kitų nepalankių faktorių. Dažnai gryninami baltymai pasidaro nestabilūs, todėl jiems reikia empyriškai parinkti tinkamus stabilizatorius. Kol kas nėra bendrųjų kriterijų leidžiančių tam tikriems baltymams parinkti tinkamus stabilizatorius.Gryninant baltymą, iš daugelio baltymų mišinio išskiriamas vienas, turintis reikiamą katalitinį aktyvumą. Kuo daugiau pašalinama neaktyvių baltymų, tuo didesnis darosi santykis tarp katalitinio aktyvumo vienetų ir baltymo kiekio. Šis dydis vadinamas specifiniu fermento aktyvumu ir yra vienas iš baltymų gryninimo matų.Baltymų gryninimas kinta (varijuoja) nuo paprasto vienos pakopos išsodinimo procedūrų iki daugiapakopių procesų. Dažnai tam kad pasiekti reikiamą produkto švarumą reikalinga daugiau negu viena baltymo gryninimo pakopa (stadija).

Biologines žaliavos suardymas.Didelė dalis baltymų ir fermentų, ankstyvojoje baltymų tyrinėjimų stadijoje, buvo išskiriami iš neląstelinio tirpalo. Tai buvo daroma todėl kad iš tarpląstelinio tirpalo yra pakankamai nesunku išsiskirti šiuos baltymus, o taip pat baltymai esantys tarpląsteliniame tirpale dėl disulfidinių tiltelių yra pakankamai stabilūs ir nedidelio dydžio (lizocimas, ribonukleazė, chimotripsinas). Tačiau daugumas baltymų randasi pačioje ląstelėje. Dažnai šie baltymai yra nestabilūs, nes paprastai ląstelių vidinė aplinka pasižymi redukuojančiomis savybėmis, todėl baltymų struktūra neturi disulfidinių tiltelių.

Ląstelėse baltymai dažnai sudaro kompleksines polibaltymines sistemas, veikiančias ne vieną o daugelį viena po kitos vykstančių medžiagų apykaitos reakcijų. Norint iš tokios struktūriškai organizuotos sistemos išgryninti vieną ar keletą baltymų, reikia tą struktūrą suardyti taip, kad nutruktų jungtys tarp baltymų ir kitų membraninių struktūrinių komponentų, bet nesuirtų baltymų struktūra, nes priešingu atveju gali išnykti baltymų katalitinis aktyvumas. Ląstelių suardymo procesas vadinamas ląstelių dezintegracija. Gyvūnų audiniai savo atsparumu suardymui plačiai varijuoja: greta lengviausiai suardomų eritrocitų reikalingas ir audinių turinčių kolageno (tokių kaip kraujo indai ir kiti audiniai sudarantys lygiuosius raumenis) suardymas. Lyginant su gyvulinėmis, augalinės ląstelės, dėl jų celiuliozinio apvalkalo, yra sunkiau suardomos. Bakterijų tarpe greta palyginti trapių ląstelių kurios yra suardomos virškinimo trakto fermentų ar tik osmotinio šoko egzistuoja ir labiau suardymui atsparios, turinčios storą ląstelių sienelę, bakterijos, kurių suardymui jau reikalingas mechaninis poveikis. Tačiau šis poveikis neturi buti per daug didelis, nes esant per dideliam poveikiui galima labilių baltymų inaktivacija.Ląstelių suardymo būdai skirstomi į 3 grupes:

22


- fizinė-mechaninė ląstelių dezintegracija;- cheminė ląstelių dezintegracija;- fermentinė ląstelių dezintegracija.

Pagal ląstelių suardymo pobūdį ląstelių suardymas skirstomas:1. Švelnus suardymas:

Osmotinis ląstelės membranos suardymas;Fermentinis suardymas;Cheminis tirpinimas ir autolizė;Homgenizacija;Susmulkinimas.

2. Suardymas veikiant vidutinei jegai:Mechaninis stambių ląstelių suardymas;Suardymas abrazyvu.

3. Stiprus suardymas:Ekstruzinis metodas;Ultragarsas;Balistiniai metodai.

Ne visi baltymai egzistuoja tirpiuose pavidaluose, todėl tokių baltymų gryninimo sėkmė priklauso nuo to kaip galima su gera išeiga atskirti tokius baltymus nuo likusios netirpios medžiagos.

Neląstelinio ekstrakto gavimas.Suardžius ląstelių biomasę gaunama suspensija sudaryta iš ištirpusių baltymų, nukleino rūgščių, polisacharidų bei suspenduotu ląstelių nuolaužų, ląstelių vidaus struktūrinių komponentų bei jų nuolaužų. Taigi norint iš tokio mišinio išskirti vieną iš daugelio ištirpusių baltymų, pirmiausiai reikia pašalinti suspenduotas daleles ir iš ląstelių gauti ekstraktą, turintį tik ištirpusių medžiagų.

Centrifugavimas - tai vienas iš dažniausiai naudojamų metodų netirpioms dalelėms atskirti nuo tirpalo. Suspenduotų dalelių tankis yra šiek tiek didesnis už tirpalo tankį. Ląstelių homogenato suspenduotos dalelės yra labai mažos, jų tankis labai nedaug skiriasi nuo tirpiklio tankio, todėl sedimentacija dėl žemes traukos jėgos vyksta labai lėtai. Šio proceso pagreitinimas pasiekiamas centrifugose. Kad būtų galima suvienodinti visose centrifugose išsodinimo sąlygas todėl yra įvestas taip vadinamas santykinis centrifugavimo laukas (RCF) kuris rodo kiek kartu daugiau už žemes traukos jėgą vyksta išsodinimas.

RCF išreiškiamas formule:

RPM = RCF / 1.12r * 1000

RCF = (RPM/1000)2 * 1,12 rRCF- santykinis centrifugavimo laukas (relative centrifugation field (RCF)RPM - rotoriaus apsisukimai per minutęr - atstumas nuo ašies (mm)

23


Turimose centrifugose, atsižvelgiant į rotoriaus didį (atstumą nuo centrifugos ašies) ir apsisukimų skaičių, pasiekiama išcentrinė jėga gali buti 1000 – 500 000 kartų didesnė už žemės traukos jėgą.Ląstelėms ar jų homogenatams frakcionuoti paprastai tinka centrifugos, kurių rotoriai sukasi 15 000 – 40 000 aps./min greičiu.

Filtravimas –tai vienas iš paprasčiausių neištirpusių dalelių atskyrimo nuo tirpalo būdų. Juo dažnai nuo skysčio atskiriamos kristalinės bei stambiagranulinės daleles. Šis būdas rečiau taikomas biologinės kilmės suspensijoms. Dezintegruotų ląstelių suspensijos yra labai dispersiškos ir sudaro gelių pobūdžio struktūras. Filtruojamos jos susispaudžia ir užkemša filtrus. Ląstelių homogenatus filtruoti galima tik parinkus pagalbines stambiai akytas pagalbines medžiagas. Pagalbinės medžiagos sudaro vientisus, dispersiškus sluoksnius, kuriuose sulaikomos labai susmulkintos suspensijos daleles. (Kaip pagalbines filtruojančios medžiagos, vartojami susmulkintas asbestas, stambiai porėtas perlitas gaunamas iš degintų uolienų).

Baltymų gryninimas jų išsodinimu.Žaliava paprastai kuo greičiau panaudojama tuo geriau, nes laikant kai kuriais atvejais žaliavoje prasideda natūralūs degradacijos procesai.Ankstyvojoje baltymų chemijoje vieninteliu naudojamu baltymų atskyrimo metodu buvo baltymų išsodinimas keičiant tirpiklio savybes. Toliau nuosėdos nuo tirpalo buvo atskiriamos filtracija ir tirpinamos pradiniame tirpale. Šis baltymų atskyrimo vienų nuo kitų metodas yra naudojamas dar ir dabar.Baltymų nuosėdos tai stambūs baltymų molekulių agregatai, ir nuo tirpalo juos galima atskirti centrifugavimu esant sąlyginai nedidelei išcentrinei jėgai.Didžioji dalis fermentų tai tirpūs baltymai kurie randasi ląsteliniame tirpale. Tai gerai, esant fiziologinėms sąlygoms (0.15-0.2 M joninei jėgai) ir neutraliam pH. Kai kurie baltymai iškrenta į nuosėdas esant joninei jėgai tarp nulio ir fiziologinės reikšmės, tai vysta todėl kad tarpmolekulinė atostūmio jėgos yra nepakankamos.

pH artėjant link izoelektrinio taško, molekulių krūviai mažėja iki nulio elektrostatines atostūmio jėgos taip pat sumažėja ir molekules pritraukiamos vena prie kitos t.y. jos agreguoja. Šis procesas vadinamas izoelektriniu išsodinimu.Baltymų išsodinimui labai svarbus faktorius - druskos prigimtis (t.y. jos tirpumas). Efektyviausiai veikia druskos kurių anijonai turi dideli krūvį (sulfatas, fosfatas, citratas). Katijonai šiuo atveju vaidina mažesnį vaidmenį. Pagal baltymų išsodinimo efektyvumą anijonai sudedami į taip vadinama Hofmeisterio eilę, kuri atrodo taip: SCN-, J-, ClO4

-, NO3-,

Br -, Cl-, CH3COO-, SO4-, PO3

-. Nors fosfato jonai ir efektyviausiai išsodina baltymus, tačiau esant neutraliam pH fosfatas sudarytas iš jonų HPO4

2- ir H2PO4- kurie yra mažiau efektyvus

lyginant su PO4-.

Katijonus pagal efektyvumą baltymų išsodinimui galima sudedami į tokią eilę: NH4+ > K+ >

Na+.Svarbų vaidmenį į tirpalą pridėjus druskos vaidina tirpalo tankis, nes kuo didesnis tirpalo tankis tuo reika didesnes jėgos atskiriant nuosėdas nuo vandeninio tirpalo (t.y. reikia didesnio centrifugavimo greičio).

24


Pagrinde tik viena druska atitinka keliamus reikalavimus ir praktiškai neturi didelių trūkumų - tai amonio sulfatas [(NH4)2SO4]. Jos tirpumas temperatūriniame intervale 0 - 30 oC labai mažai keičiasi. Sotaus tirpalo tankis 1.235 g/cm3, o baltyminių agregatų tankis 1.29 g/cm3. (Esant pH 7.4, 3 M kalio fosfato tirpalo tankis yra 1.33 g/cm3 ir todėl jo praktiškai neįmanoma atskirti centrifugavimu).Amonio sulfatas švariame pavidale lengvai prieinama, pakankamai pigi netgi panaudojant ja dideliais kiekiais, druska.Amonio sulfatas pasižymi parūgštinančiomis savybėmis, tam kad buferinio tirpalo pH išsodinimo metu nesikeistų, jis turi turėti atitinkamą buferinį pajėgumą.Taip pat druskų koncentracija išsodinanti baltymą priklauso ne tik nuo baltymo savybių, bet ir nuo kitų baltymų esančių tirpale savybių, o taip pat ir nuo baltymų koncentracijos tirpale. Jeigu baltymo koncentracija mažesnė kaip 1 mg/ml norint baltymą išsodinti reikia koncentruoti panaudojant kitus metodus (pvz.: ultrafiltraciją).

Baltymų išsodinimas organiniais tirpikliais.Į baltymų vandeninį ekstraktą pridedant tokius tirpiklius kaip etanolis, acetonas sukeliami įvairūs efektai ko pasekmėje baltymai yra išsodinami iš tirpalo t.y. jie agreguoja. Tai įvyksta dėl vandens aktyvumo sumažėjimo.Paprastai baltymams išsodinti iš tirpalo naudojami su vandeniu gerai besimaišantys organiniai tirpikliai - etilo alkoholis, acetonas, rečiau - metilo ir izopropilo alkoholiai, polietilenglikolis. Kadangi aukštesnėje temperatūroje (aukštesnėje negu +4oC) baltymai vandens ir organinių tirpiklių mišiniuose linkę denatūruoti, tai frakcionuoti organiniais tirpikliais reikia žemesnėje kaip 0 oC temperatūroje.Frakcionavimo organiniais tirpikliais efektyvumas priklauso nuo daugelio sąlygų:

- ištirpusių druskų koncentracijos;- baltymų koncentracijos;- baltymų sudėties;- tirpalo pH.

Druskos, didindamos daugelio baltymų tirpumą, mažina baltymų išsodinimo organiniais tirpikliais efektyvumą.

Chromatografiniai baltymų frakcionavimo metodai.

Chromatografija tai fizikinis atskyrimo metodas kuriame atskiriami komponentai paskirstyti tarp dviejų fazių, viena iš kurių yra stacionari (stacionari fazė), kita judanti nustatyta kryptimi (judri arba mobili fazė).Chromatografija – labai efektyvus medžiagų mišinių frakcionavimo metodas – atsirado ir susiformavo praėjusiame amžiuje. Jo pradininkas rusų mokslininkas Michail Cvetov, 1903 m. paskelbęs duomenis apie augalinių pigmentų mišinio, praleisto per Ca3(PO4)2

užpildytą kolonėlę, suskirstymą į atskiras spalvotas zonas. Nuo to kilo metodo pavadinimas – chromatografija (rašymas spalvomis). Plačiai šis metodas paplito šio šimtmečio 40-aisiais metais ir padarė daug permainų chemijoje, biologijoje, medicinoje bei įvairiose technikos šakose.

25


Profilis kuriuo medžiagos nuo plokštelės ar iš sorbentu (derva) užpildyto vamzdelio yra išplaunamos (eliuojamos) vadinamas eliucijos profiliu.

Chromatografija yra skirstoma:

I. Priklausomai nuo frakcionavimo principo:- Chromatografija geliuose / gelių ekskluzinė chromatografija / dydžių ekskluzinė chromatografija / gel-filtracija;- Pasiskirstomoji chromatografija;- Adsorbcinė chromatografija;- Jonų mainų chromatografija; - Afininė chromatografija;- Hidrofobinė chromatografija;- Gradientinė chromatografija.

II. Priklausomai nuo eliucijos būdo:- Frontalinė analizė;- Išstumiamoji chromatografija;- Chromatografinė eliucija.

III. Priklausomai nuo stacionarios fazės:- Chromatografija kolonėlėse;- Chromatografija storuose sluoksniuose (gel-filtracija);- Chromatografija plonuose sluoksniuose (plonasluoksnė chromatografija);- Popieriaus chromatografija;- Chromatografija ant plėvelių;

IV. Priklausomai nuo judančios fazės:- Skysčių chromatografija;- Dujinė chromatografija.

I. Priklausomai nuo frakcionavimo principo:

Chromatografija geliuose / gelių ekskliuzinė chromatografija / dydžių ekskliuzinė chromatografija / gel-filtracija.Tai medžiagų skirstymas pagal jų molekulinį dydį. Chromatografinė medžiaga turi savyje mažas poras, į kurias gali patekti mažos molekulės, o didelės negali patekti (skirtingos medžiagos turi skirtingus porų dydžius, taigi apibrėžimas "mažas" ar "didelis" porų dydis priklauso nuo to kokias medžiagas norima atskirti). Kai molekulių mišinys juda per koloną, mažos molekulės difunduoja į poras, kur tirpiklis yra stacionarioje fazėje, taigi mažos molekules kažkurį tai laiką praleidžia nejudant. Didelės molekulės negali patekti į poras, tuo pačiu jos visa laiką būna judančioje fazėje. Todėl didelės molekulės juda kolona greičiau, palyginus su mažomis t.y. didžiosios molekulės nepatenkančios į granulių vidų) juda, o mažosios atsilieka, nes nuolat pasiskirsto tarp granulių vidaus ir išorės.

Pasiskirstomoji chromatografija.Šioje chromatografijoje nejudri ir judri (mobili) fazės sudarytos iš dviejų nesimaišančių ar sunkiai besimaišančių tirpalų (skysčiu). Tokioje sistemoje ištirpinus kažkokią tai

26


medžiagą jos koncentracija abiejuose tirpikliuose bus vienoda tuo atveju jeigu medžiaga bus tirpi abiejuose tirpikliuose. Kitu atveju medžiagos molekulės pereis iš vienos skystos fazės į kitą, tol kol nusistovės pusiausvyrinė būsena, kai aukštesnė medžiagos koncentracija bus tame tirpiklyje kuriame medžiaga pasižymi didesniu tirpumu. Kai tokie tirpalai sudaro judrią ir nejudamą chromatografijos fazes tai medžiagų pasiskirstymas tarp fazių vyksta pagal medžiagos tirpumą juose. Kuo medžiaga giminingesnė (t.y. jos tirpumas didesnis) nejudriai fazei tuo ji lėčiau juda išilgai kolonėles ar plokštelės.Dažniausiai viena iš fazių yra organinis tirpiklis, tuo tarpu kitą fazę sudaro vandeninis tirpalas. Šiuo atveju medžiagų frakcionavimas vyks priklausomai nuo jų hidrofobiškumo. Istoriškai taip jau susiklostė kad "normalių" fazių išsidėstymu vadinamas fazių išsidėstymas kada nejudri yra vandeninė fazė. Dėl savo drėkinamųjų savybių vandeninė fazė lengvai yra fiksuojama ant hidrofilinių matricų (celiuliozės, poliakrilamidinių arba dekstraninių gelių, silikagelių ir kt.). Judrią fazę, šiuo atveju, sudaro organiniai tirpikliai. Kai fazės yra atvirkščios, t.y. kai prie kietos matricos yra fiksuojama organinio tirpiklio plėvelė, o judrią fazę sudaro vandeninis tirpalas pasiskirstymo chromatografija vadinama atvirkštinių fazių chromatografija (RPC - reversed phase chromatography).

Adsorbcinė chromatografija.Adsorbcinėje chromatografijoje nejudrią fazę sudaro kietas sorbentas. Sorbcijos ir desorbcijos procesų pusiausvyra, kuri yra gana toli nuo sorbento prisotinimo ribos, nusistato nepriklausomai kiekvienam mišinio komponentui. Atitinkamai, kuo didesniu giminingumu sorbentui pasižymi mišinio komponentai tuo lėčiau jie migruos per kolonėlę ar plokštelę. Kai sorbcija vyksta granulių paviršiuje, tai turima tikra (švari) adsorbcinė chromatografija. Kai sorbentas turi poringą struktūrą ir didelė dalis sorbuojamo paviršiaus yra granulių viduje, tai medžiagos molekulių sulaikymui (skirstymui) turi įtakos ir jų difuzijos procesas, nejudriame skystyje esančiame porų viduje, panašiai į tą kuris sutinkamas gelių ekskluzinėje chromatografijoje (gel-filtracijoje).

Jonų mainų chromatografija.Jonų mainai tarp netirpaus, jonogeninių grupių turinčio polimero ir tirpalo buvo nustatyti mažiems jonams ir panaudoti druskoms iš vandens pašalinti (vandeniui minkštinti).Įvairūs jonai nevienodai stipriai susijungs su polimero jonogeninėmis grupėmis, todėl jie atsiskirs nuo polimero ne vienu metu. Dėl skirtingo afiniškumo keletas vienodai jonizuotų medžiagų (pvz: skirtingos amino rūgštys, nukleotidai, monosacharidai, neorganiniai katijonai arba anijonai) per kolonėlę pripildyta jonitų, juda nevienodu greičiu.Baltymai - tai sudėtingi polimerai, turintys daug jonogeninių grupių. Vienos iš jų gali buti įkrautos teigiamai, kitos - neigiamai. Šių krūvių suma yra bendras (suminis) baltymo molekules krūvis.Desorbuoti (atplauti nuo sorbento) prie sorbento prijungta baltymo molekulę galima keičiant joninę jėgą, pH, temperatūrą.Visi jonitai skirstomi į anijonitus ir katijonitus pagal tai, koki joną anijonitą ar katijonitą - jie gali sorbuoti iš tirpalo.

Afininė chromatografija.

27


Afininėje chromatografijoje specifinė molekulė yra prikabinta prie chromatografinės medžiagos (sorbento) o frakcionuojamos medžiagos yra išskirstomos pagal jų sugebėjimą prisirišti prie specifinės molekulės. Jeigu prijungta molekulė yra didelė, o molekulės kurios turi buti atskirtos yra mažos, tai šis procesas paprastai vadinamas afinine chromatografija. Jeigu prijungta molekulė yra maža, o molekulės kurios turi buti atskirtos yra didelės, tai metodas paprastai vadinamas kovalentine chromatografija, tačiau tai taip pat dažnai taip pat vadinama afinine chromatografija.

Šiuo atveju biospecifinė atranka vyksta sorbcijos (prisijungimo prie sorbento) stadijoje, nes gryninamas baltymas pasižymi specifiniu giminingumu sorbentui dėl ko įvyksta gryninamo baltymo susijungimas su ligandu. Norint eliuoti specifiškai sorbuotą baltymą, tenka vartoti labai gerai su sorbentu saveikaujančius efektorius.

Hidrofobinė chromatografija.Šioje chromatografijoje, kaip stacionari fazė, paprastai naudojamos hidrofobinės medžiagos, tokios kaip nepaveiktas (neapdorotas) silicis. Atskiriamų medžiagų molekulės, priklausomai nuo jų hidrofobiškumo, stipriau ar silpniau sąveikauja su stacionare faze, tuo būdu atsiskiria viena nuo kitos.Baltymų mišinių frakcionavimas hidrofobiniais sorbentais panašus į afininės chromatografijos procesą, jis susideda iš vienas po kito einančių sorbcijos, nesorbuotų baltymų išplovimo ir eliucijos procesų.

Gradientinė chromatografija.Šiuo atveju visos mėginio molekulės yra susirišamos su netirpia medžiaga, toliau jas išplaunant (eliuojant) joninės jėgos didinimu tirpale, arba keičiant eliucinio tirpalo pH.

II. Priklausomai nuo eliucijos budo:

Frontalinė analizė.Taip vadinamas chromatografijos proceso variantas, kada komponentų mišinys pastoviai yra tiekiamas į chromatografinę kolonėlę. Šiuo atveju išėjime (eliucijoje) pasirodo vienas po kito sekančių keletas eliucijos "frontų". Po pirmojo komponento eliucijos, kuris pasižymi mažiausiu giminingumu nejudriai (pastoviai) fazei, toliau seka antrojo pagal judrumą (giminingumą) komponento eliucija ir .t.t. Šiuo metu frontalinė analize terminas naudojama labai retai, tik išimtinais atvejais.

Išstumiamoji chromatografija.Šiuo atveju, pradžioje, į kolonėlę arba ant chromatografinės plokštelės starto linijos užnešamas atitinkamas kiekis medžiagos, o eliucija vykdoma medžiagos, pasižyminčios žymiai didesniu giminingumu nejudriai fazei, negu bet kuris frakcionuojamo mišinio komponentas. Įvyksta komponentų susirišusių su nejudria faze išstūmimas ir pirmiausiai yra išstumiami junginiai pasižymintys mažiausiu giminingumu sorbentui, po to jau išstumiami didesniu giminingumu sorbentui pasižymintys junginiai.Analitiniam frakcionavimui šis metodas yra praktiškai nenaudojamas (netinkamas), tačiau preparatyviam medžiagų atskyrimui šis metodas iki šiol naudojamas.

Chromatografinė eliucija.

28


Šiame metode eliucinis tirpalas pasižymi mažesniu giminingumu sorbentui negu bet kuris frakcionuojamo mišinio komponentas užneštas į kolonėlę ar ant plokštelės. Tokie komponentai pastoviai iš judančios fazės yra "išplaunami" ir dėl nepertraukiamo medžiagos pasiskirstymo tarp nejudrios fazės ir eliuento, juda išilgai kolonėlės. Kiekvienas jų migruoja nepriklausomai nuo kitų atitinkamai jo giminingumui pastoviai ir judrai fazėms. Migracija vyksta tuo lėčiau kuo didesnis yra medžiagos giminingumas nejudriai (pastoviai) fazei.

III. Priklausomai nuo stacionarines fazes chromatografija yra skirstoma:

Chromatografija kolonėlėse.Tai plačiausiai naudojama chromatografija. Netirpios fazės dalelės yra patalpinamos į vamzdelį ir per ji yra praleidžiamas tirpalas. Naudojant kolonėlių chromatografija galima išgryninti didelius kiekius medžiagos. Viena iš chromatografijos atmainų yra didelio efektyvumo skystine chromatografija (HPLC; high performance liquid chromatography, dar kartais vadinama aukšto slėgio skysčių chromatografija ). Šiuo atveju skystis lėtai yra pumpuojamas per sąlyginai mažą koloną esant dideliam slėgiui (30 - 400 atm.). Tokiu atveju labai padidėja medžiagų, pasižyminčių panašiomis savybėmis, atskyrimo efektyvumas.

Chromatografija storuose sluoksniuose.Kai chromatografijos procesas vyksta nuožulniai gulinčiame, lygiame ir sąlyginai storame (keletas mm.) atvirame nuo paviršiaus granulių sluoksnyje, tarp kuriame judrios fazės tirpalas teka veikiamas tik traukos jėgos, tai galima vadinti chromatografija storame sluoksnyje. Praktiškai šis metodas rado pritaikymą tik ekskluzinėje chromatografijoje (gel-filtracijoje).

Chromatografija plonuose sluoksniuose (Plonasluoksnė chromatografija (TLC- thin layer chromatography)).Plonas (0.1 - 0.5 mm.) granulių sluoksnis pritvirtintas prie stiklo plokštelės paviršiaus, leidžia vykdyti chromatografiją ploname sluoksnyje. Skystos fazės judėjimas vyksta dėl kapiliarinių jėgų.Šiuo atveju stacionari fazė yra plonas apdoroto silicio sluoksnis, kuriuo padengta stiklo plokštelė.Chromatografija plokštelėse gali vykti horizontaliai arba vertikaliai, pastaruoju atveju judrios fazes judėjimas gali vykti plokštele aukštyn arba žemyn - tai nevaidina principinės rolės, nes skysčio judėjimas pagrinde sąlygojamas kapiliarinėmis jėgomis.

Popieriaus chromatografija.Šioje chromatografijoje kaip netirpi fazė, yra naudojamas filtrinio popieriaus lapas. Kai kada popierius gali turėti įvestas papildomas įvairias jonogenines grupes.

Chromatografija ant plėvelių.Vietoje popieriaus naudojamos plėvelės iš modifikuotos celiuliozės, poliamidines plėvelės, ir kt.

29


IV. Priklausomai nuo judancios fazes:

Skysčių chromatografija.Šiuo atveju mobili fazė tai skystis, o stacionari fazė kieta medžiaga arba kitas tirpalas, nesimaišantis arba tik dalinai besimaišantis su pirmuoju tirpalu. Dar yra išskiriamos skystinės chromatografijos variacijos:

1) Skysčių-kietos fazes chromatografija;2) Skysčių-skysčių chromatografija, kai stacionari skystinė fazė

pritvirtinta prie kieto nešėjo.

Dujinė chromatografija (GC). Dujinė chromatografija dar skirstoma:

1). Dujų-kietos fazės chromatografija;2). Dujų – skysčių chromatografija.

Naudojama lakių (ar jų lakumui padidinti, chemiškai modifikuotų) molekulių atskyrimui. Dujų chromatografijoje karštų dujų srovė praleidžiama per ploną, termostatuojamą, vamzdelį. Lakios dalelės pasiskirsto tarp dujinės ir skystos (susidarančios ant vamzdelio sienelių) arba kietos, esančios vamzdelyje, fazių. Laikas reikalingas dujų praėjimui per vamzdelį priklauso nuo šio pasiskirstymo.Dalelių išeinančių iš vamzdelio aptikimui, dujų chromatografai paprastai, turi jonizacijos detektorius. Dujoms pereinant per liepsną, susidarę tikslinių molekulių jonai aptinkami kaip elektrinis signalas. Tai jautrus ir plačiai naudojamas metodas, bet netinkamas tam kad po jo molekulės butų surinktos ir toliau panaudotos.

Baltymų gryninime mobili fazė pagrinde yra vanduo ar vandeniniai tirpalai: todėl kad pagrinde beveik visos molekulės dominančios biotechnologiją yra daugiau ar mažiau tirpios vandenyje, o tokios molekulės kaip baltymai kituose tirpikliuose yra nestabilūs.

Biotechnologijos pasiekimų pritaikymas praktikoje.

Biopolimerai.Tai didelės daugiavienetinės makromolekulės gaunamos iš gyvųjų organizmų. Kai kurie iš šių polimerų pasižymi fizinėmis ir cheminėmis savybėmis naudingomis maisto perdirbimo, farmacinėje bei apdirbimo pramonės šakose. Biopolimerai gali būti gauti iš mikroorganizmų, augalų ir gyvūnų.Galimybė genetiškai keisti organizmus skatino naujų biopolimerų paieška, tikslu pakeisti dabar egzistuojančius sintetinius polimerus ekvivalentiniais biopolimerais, pagerinant jų fizines ir struktūrines charakteristikas, o taip pat surandant kelius išeigos padidinimo bei pramoninio proceso kainų sumažinimą.

Mikrobiologinis pavojingų atliekų perdirbimas.

30


Ilgą laiką buvo tikima kad žemės ir vandens sistemos pilnai neutralizuoja pramonės bei žemės ūkio išskiriamas kenksmingas medžiagas. Šiandien egzistuoja dvi pagrindinės problemos:Kaip pašalinti atliekas kurios pastoviai kaupiasi.Kaip pašalinti toksiškus junginius kurie per pastaruosius keletą dešimtmečių stipriai kaupiasi šiukšlynuose, dirvožemyje, bei vandenyje.1960 m. su mikroorganizmų degraduojančių sintetines medžiagas (herbicidai, pesticidai, tirpiklius ir kitus organinius junginius) atradimu suprasta kad šie mikroorganizmai gali būti naudingi degraduojant šiuos pavojingus cheminius junginius iki nepavojingų junginių.

Nepaisant tai kad natūralūs mikroorganizmai gali degraduoti visą eilę sintetinių kenksmingų junginių tačiau galimas tik ribotas mikroorganizmų panaudojimas, todėl kad:1. Vienas mikroorganizmas negali degraduoti visų cheminių junginių;2. Didelės organinių junginių koncentracijos gali slopinti degraduojančių mikroorganizmų veikimą;3. Daugumas užterštų vietų užterštos įvairių cheminių junginių mišiniu, ir mikroorganizmai negali degraduoti visų komponentų, be to organizmas degraduojantis vieną junginį gali būti nuslopintas kitų junginių;4. Taip pat junginiai dirvožemyje ar nuosėdose gali būti neprieinami ar menkai prieinami biodegraduojantiems mikroorganizmams;5. Mikrobiologinė organinių junginių degradacija yra lėta.

Todėl stengiamasi pakeisti esamus mikroorganizmus taip kad jie kuo efektyviau ir greičiau neutralizuotų šiuos organinius sintetinius junginius.

Biologinis kuro gavimas.Etanolio gamyba iš biomasėsAlkoholio produkcija fermentuojant cukrų ir krakmolą, tai nuo seno nusistovėjęs būdas, kuris dažnai laikomas kad tai pirmasis žmogaus naudotas mikrobiologinis procesas.C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2

Pramoninė alkoholio gamyba, fermentacija, labai priklauso nuo sukauptų žinių apie alaus gamybą. Šiuo metu, pramoninė alkoholio gamyba daugumoje atveju tai yra grynai sintetinis (t.y. nemikrobiologinis) procesas, kai etanolis gaunamas hidratuojant etileną.Kadangi etanolio kaip kuro nauda aiški, kadangi jo degimo metu neišsiskiria toksinių produktų tokių kaip angles monoksidas, o taip pat lyginant su įprastu kuru mažiau teršiama aplinka.Etanolį gaminti cheminiu būdu yra vis dar yra pigiau negu naudojant fermentaciją.Tačiau besivystant biotechnologijai manoma kad alkoholis ateityje gali tapti viena iš pagrindinių kuro rūšių.

Neseniai buvo susidomėta modifikuoto rapsų aliejaus panaudojimu kaip dyzelinio kuro pakaitalu: biodyzeliu. Šis produktas gaunamas reakcijos tarp aliejaus ir metanolio dalyvaujant katalizatoriams (tokiems kaip natrio hidroksidas), 50oC temperatūroje, gaunamas esteris ir glicerolis.

31


Rapsu aliejus + Metanolis Diesteris + Glicerolis(1 tona) (0.1 tonos) (1 tona) (0.1 tonos)

Glicerolis atskiriamas, o biodyzelis gryninamas ir naudojamas kaip kuras.Išgrynintas biodyzelis turi praktiškai tokias pačias fizines ir chemines savybes kokias turi dyzelinis ir krosninis kuras. Pagrindiniai biodyzelio privalumai lyginant su dyzeliniu kuru yra:- energetiniai resursai yra panaudojami žymiai efektyviau, ir jų efektyvumas, gerinant

rapsų kultūras, dar didės;- biodizelinis kuras yra netoksiškas, daugiau kaip 98 % biodegraduojamas, todėl aplinka

teršiama 3 - 5 kartus mažiau;- tai atsinaujinanti kuro rūšis (nafta - neatsinaujinanti kuro rūšis).

Metano gamyba iš biomases.Metanas tai dujos naudojamos mechaninei, elektros bei šilumos energijai gauti. Dabartiniu metu, vietiniams bei pramoniniams tikslams, metanas plačiai naudojamas kaip kuro šaltinis. Taip pat iš metano gali būti gaunamas metanolis, kuris gali būti naudojamas vidaus degimo varikliuose.Mikrobiologinis metano gamybos metodas yra pakankamai sudėtingas, kuriam reikalingi anaerobinių mikroorganizmų mišiniai.Iš principo, anaerobinė kompleksinių organinių junginių mišinių fermentacija vyksta trimis biocheminėmis fazėmis, iš kurių kiekviena reikalauja specifinių mikrobiologinių parametrų. Pradinėje stadijoje reikalingas kompleksinių molekulių (celiuliozės, riebalų bei baltymų) sudarančių žaliavinę terpę ištirpinimas. Gauti ištirpę mažos molekulinės masės junginiai kitoje stadijoje yra paverčiami organinėmis rūgštimis. Galutinėje mikrobiologinėje stadijoje šios rūgštys (pagrinde acto) specifiškai, metanogeninių bakterijų, suskaldomos susidarant metanui ir CO2.Efektyviausia ir sudėtingiausia natūrali metaną produkuojanti sistema tai didysis atrajojančių galvijų skrandis.Tačiau šiuo metu yra daug problemų, kurias prieš norint metano gamybos technologiją panaudoti praktiškai reikia išspręsti. Šiuo metu organinių atliekų surinkimas, tik metanogenezės procesui, yra brangus, o tokiu būdu išgaunamos metano produkcijos išeigos yra mažos, todėl visą šį procesą reikia dar optimizuoti.Metanas taip pat yra gaunamas fermentuojant gyvulių mėšlą susidarant dujiniams produktams, vadinamiems biodujomis. Biodujos tai degus dujų mišinys sudarytas iš 50 - 80% metano, 15 - 45% CO2, 5% vandens bei labai nedidelių kiekių kitokių dujų mišinio. Didžiausias biodujų gamintojas pasaulyje šiuo metu yra Kinija (7 mln. biodujų vienetų, tai ekvivalentiška 22 mln. t. anglies).

Vandenilis. Manoma kad ateityje kaip kurą, bus galima panaudoti vandenilį. Vandenilis gali būti gaminamas fotosintezuojančių bakterijų pagalba, vykdant vandens biofotolizę arba fermentacijoje. Taip pat įmanoma gauti vandenilį iš gliukozės, panaudojus atitinkamas bakterijas, tačiau šiuo atveju vandenilio produkcija labai jau menka.

32


Fermentų gamybos technologija.Fermentųgamybos technologija apima jų, išskyrimą, gryninimą, panaudojimą tirpioje formoje, ar juos imobilizuojant ant netirpių paviršių bei panaudojant juos visoje eilėje sistemų. Fermentų technologija, yra tampriai susijusi su genų inžinerija.Mikroorganizmų, kaip fermentų šaltinio, panaudojimas vystėsi dėl kelių priežasčių:

1). Paprastai produktas turi aukštą specifinį aktyvumą/sausos medžiagos svoriui;2). Nėra žaliavų sezoniškumo;3). Mikroorganizmuose aptinkamas platus fermentų turinčių praktinę vertę

spektras.

Fermentų pritaikymasŠiuo metu fermentų kiekis gaminamas pramoniniu būdu greitai didėja.Rekombinantinės DNR technologijos leido pernešti naudingų fermentų genus iš vieno organizmo į kitą. Kai naudingas pramoniniam poreikiui fermentas identifikuojamas, jo genas paprastai perklonuojamas į patogesnį (geriau augantį, galintį produkuoti daugiau fermento ir t.t.) mikroorganizmą toliau jau vykdant šio mikroorganizmo pramoninę kultivaciją. Naudojant šį būdą gaunami aukštos kokybės ir švarumo fermentai.

Imobilizuoti fermentai.Fermentų panaudojimas tirpioje formoje gali būti traktuojamas kaip fermento švaistymas, todėl kad po reakcijos fermentas negali būti išgautas iš įvykusios reakcijos ir panaudotas sekančioje reakcijoje. Nauja svarbi fermentų technologijos sritis susijusi su fermentų imobilizavimu ant netirpių polimerų, tokių kaip membranos ir dalelės veikiančios kaip fermentinio aktyvumo palaikytojai ar nešėjai. Pritvirtinti prie kietų paviršių (ar imobilizuoti juose) fermentai gali būti panaudoti katalitiniame procese ir vėl išgauti iš reakcijos mišinio ir panaudojami vėl ir vėl, tai stipriai padidina proceso ekonomiškumą; Šios sąlygos lyg ir sugrįžimas į natūralią fermentų būseną gyvame organizme. Kai kurie fermentai, neląstelinėje sistemoje temperatūros poveikyje yra nestabilūs, tačiau juos pritvirtinus prie inertinio polimerinio paviršiaus tampa stabiliais.Bakterijų ląstelės gali būti imobilizuotos poliakrilamidinių dalelių (rutuliuku, ląstelių) viduje, ir panaudotos plačiam katalitinių funkcijų atlikimui.Dabartiniu metu imobilizuoti fermentai pramoniniu būdu panaudojami L-amino rūgščių, organinių rūgščių ir fruktozės sirupo gamyboje.Nauja imobilizuotų fermentų panaudojimo kryptis yra fermentiniai elektrodai. Tai naujo tipo detektoriai ar biosensoriai sukurti naudoti tokius substratus kaip urea (šlapalas), amino rūgštys, gliukozė, alkoholis bei pieno rūgštis. Elektrodas sudarytas iš elektrocheminių sensorių išdėstytų betarpiškai arti plonos pralaidžios membranos, galinčios specifiškai reaguoti su substratais. Membranoje įtaisyti fermentai, priklausomai nuo įvykstančios fermentinės reakcijos, gaminasi O2, vandenilio jonai, amonio jonai, CO2, ar kitos mažos molekules, kurių kiekis priklauso nuo substrato koncentracijos. Biologinis komponentas biosensoriuje, dažniausiai yra fermentinė ar daugiafermentinė sistema, tačiau gali būti ir antikūnis, organelė, mikrobinė ląstelė, ar audinio gabalėlis.

33


Vienos ląstelės baltymai.Pagrindinė problema su kuria susidurs pasaulis tai spartus žmonių kiekio didėjimas, ypač besivystančiose šalyse. Dabar žemėje gyvena 5.7 mlr. žmonių. Kasmet šis skaičius padidėja apytikriai 97 mln. ir kaip manoma 2050 metais, jeigu šis augimas nebus kontroliuojamas, žemėje gyvens virš 10 mlr. žmonių. Žemės ūkis, toks koks jis yra šiuo metu, nebus pajėgus aprūpinti tokį kiekį žmonių maistu - t.y. nepatenkins maistinių baltymų poreikio.Tačiau visose žemės ūkio šakose produktyvumas didėja. Biotechnologijos atradimai dar labiau spartina šią tendenciją.Mikroorganizmų biomasė gali pasižymėti gana aukštomis maistinėmis savybėmis. Šią maistinę reikšmę apsprendžia baltymai sudarantys žymią dalį ląstelių sausos medžiagos. Jau dešimtmečiais aktyviai diskutuojama ir tyrinėjamos galimybės padidinant mikroorganizmų panaudojimą bendrame pasaulio baltymų gamybos balanse. Toks baltymų panaudojimas galimas tiek netiesiogine prasme (įvedant baltyminius priedus į gyvulių pašarus, tuo pačiu sumažinant tokių produktų kaip sojos ir žuvų miltai sunaudojimą), tiek tiesiogine prasme (gaunant maisto produktus žmonėms).

Kad atskirti tokių produktų tipą nuo aukštesnių daugialąsčių gyvūnų ar augalinių baltymų, mikrobiniams baltymams naudojamas specialus pavadinimas vienos ląstelės baltymas (arba SCP single cell protein; VLB). Tokia gamyba yra paremta mikroorganizmų auginimu dideliais kiekiais, kurie po to perdirbami į maisto produktus. Vienos ląstelės baltymų gamyboje paprastai panaudojamas fermentacijos, skystose terpėse, procesas.

Farmaciniai ir biofarmaciniai preparatai.

Pagrindinai farmaciniai preparatai šiuo metu tai sintetiniai junginiai gaunami cheminės sintezės būdu arba chemiškai modifikuojant molekules gautas iš biologinių šaltinių. Biofarmaciniai preparatai tai rekombinantiniai baltymai, vakcinos ir monokloniniai antikūniai (terapiniams tikslams).

Antibiotikai.1928 m. Alexander Fleming padarytas atradimas kad, grybas vadinamas Penicillium notatum gamina junginį kuris gali inaktyvuoti platų spektrą bakterijų, tuo pačiu neveikiant (šeimininko) organizmo ląstelių.Naudojant antibiotikus tapo įmanoma išgydyti tokias ligas kaip cholera, pneumoniją, tuberkuliozę ir kt.Iš šiuo metu 4000 atrastų antibiotikų tik apie 50 rado praktinį pritaikymą. Antibiotikai veikiantys platų spektrą bakterijų vadinami plataus spektro, (chloramfenikolis ir tetraciklinas). Tuo tarpu streptomicinas ir penicilinas yra siauro spektro antibiotikai, veikiantys tik kelias bakterijų rūšis.Šiuo metu nerimą kelia faktas kad daugelis bakterijų palaipsniui evoliucionuodamos tampa atsparios antibiotikams ir įgytas atsparumas perduodamas kitoms bakterijų rūšims (Pvz.: atspari penicilinui baterijų sukeliančių venerinę ligą - gonorėją jau rasta 19-oje

34


šalių). Atsparumą antibiotikams bakterijose lemia bakterijose lokalizuota plazmidinė DNR, kuri taip pat gali būti perduodama tarp organizmų.

Vakcinos.Seniai jau žinomas vakcinų sugebėjimas stimuliuoti antikūnų susidarymą organizme. Vakcinos tai negyvų arba susilpnintų mikroorganizmų preparatai, galintys stimuliuoti žmogaus ar gyvūnų imuninę sistemą nesukeliant infekcijos. Tuo būdu organizmui suteikiama apsauga.Įšvirkščiant ar išgeriant vakciną indukuojama (sukeliama) antikūnų prieš ligos sukėlėją gamyba, todėl sekančių infekcijų metu infekcinis agentas yra inaktyvuojamas, jo dauginimasis sustabdomas ir liga nepasireiškia.Vakcinacija žmonija sėkmingai įveikė tokias ligas kaip tuberkuliozė (nors atskiri jos protrūkiai pasireiškia ir šiomis dienomis), raupai, cholera, tymai, poliomielitas. Tačiau ir šiandien vakcinų prieš daugelį žmonių ligų dar nėra.

Monokloniniai antikūniai.Kai svetima medžiaga (mikroorganizmas) patenka į gyvūno organizmą, sukeliama visa eilė reakcijų kurių, laimingoje pabaigoje, svetimkūnis inaktyvuojamas (nukenksminamas) ir pašalinamas iš organizmo. Gyvūnuose atmintis apie molekulinį atsaką svetimkūniams, gali išlikti ilgam laikui, ir tai suteikia dalinį imunitetą prieš šį mikroorganizmų rūšį.Pašalinė molekulė, sukelianti neutralizuojantį gyvūno organizmo atsaką - antikūnių sintezę, vadinama antigenu.Antigenai pagrinde tai baltymai, ar baltyminiai kompleksai su kitais junginiais. Antikūnai yra sintetinami specialių ląstelių. Įvairios gyvūnų rūšys, tame tarpe ir žmones, gali gaminti neįtikėtiną skaičių įvairių antikūnų. Žinduoliai gamina antikūnus prieš viską, kas organizmo pripažįstama kaip svetimkūnis. Imuninei gyvūno sistemai atpažinus svetimkūnį, prasideda atitinkamų antikūnų sintezė. Kraujas turi daugybę antikūnių kurie buvo sintetinti prieš pašalines molekules praeityje. Antikūniai išskirti iš tokio kraujo vadinami polikloniniais, todėl kad jie gauti iš ne vienos, o iš daugelio ląstelių tipų. Išskyrus antikūnius sintetinamus vieno (griežtai apibrėžto ląstelių tipo) ląstelių tipo jie vadinami monoklonininiais.Monokloniniai antikūniai panaudojami diagnostinėse sistemose, histologijoje, klinikinėje chemijoje, mikrobiologijoje ir kt. srityse. Diagnozė naudojant monokloninius antikūnius nustatoma daugeliui ligų, įskaitant žmonių venerines ligas, hepatitą B, kai kurias bakterines ligas, taip pat jie naudojami nėštumo testuose.

Insulinas. Pradžioje buvo naudojamas insulinas išskirtas iš kiaulių bei raguočių. Vartojant tokį insuliną pasireikšdavo pašaliniai efektai. Šiuo metu žinoma, kad pašalinius efektus, kurie pasireikšdavo ilgai vartojant iš tokių žaliavų išskirtą insuliną, sukeldavo priemaišinės medžiagos kurių turėjo išskirti iš gyvūnų insulino preparatai.Rekombinantinis žmogaus insulinas (išgrynintas iš bakterijų turinčių įklonuotą (įterptą) žmogaus insulino geną) neturi šių priemaišų.

Interferonai.

35


1957 m. anglų mokslininkai, gyvūnuose, aptiko medžiagą veikiančią prieš virusus, t.y. padarančią ląsteles atsparias virusams. Daugumas stuburinių gyvūnų gamina šią medžiagą, kuri žinoma kaip interferonai.Žmogaus interferonai tai glikoproteinai. Jie vaidina svarbią rolę kontroliuojant įvairių tipų virusų infekcijas, įskaitant ir peršalima, taip pat įtakoja vežinių ląstelių vystimąsi.Įvairiose gyvūnų rūšyse interferonai yra specifiški: pelės interferonas veiks tik pelės ląsteles ir neveiks žmogaus ląstelių ir atvirkščiai. Skirtingi audiniai gamina skirtingus interferonus.Interferonai taip pat naudojami priešvėžinėje terapijoje, nes jie veikia slopinant vėžinių ląstelių augimą, bei stimuliuojant natūralų kūno imunitetą prieš vėžines ląsteles.

Genų terapija.Genų terapija pagrinde susijusi su naujų biotechnologijos technikų atsiradimu.

Terapijoje atsiranda galimybė išjungti defektyvius (pažeistus) genus pakeičiant juos sveiko geno kopijomis.Tai ligos gydymas pernešant ir ekspresuojant genetinę medžiagą paciento ląstelėse, tikslu atstatyti normalia ląstelių funkciją.Skiriama: gemalinių (kiaušialąstes ar tos ląsteles kurios gamina spermą) ląstelių genų terapiją ir somatinių (kitos kūno ląsteles, raumenų, kaulų, nervų ir t.t.) ląstelių genų terapija.

Gemalinių ląstelių genų terapijoje daromi pakeitimai tiesiogiai veika individo genetinę medžiagą ir gali turėti įtakos palikuonims.Griežtai kontroliuojama kad genų terapijos efektai nepasireikštų palikuonims. Šiuo metu pagrindinis genų terapijos dėmesys skiriamas vieno geno defektų (mutacijų) atitaisymams (cistinė fibrozė, heamofilijos atvejais). Daugelis genetinių ligų yra negydomos, taigi genų terapijos išvystymas gali suteikti žmonėms sergantiems šiomis ligomis viltį pasveikti.

Transgeniniai gyvūnai.Iki šių dienų selekcinis veislių išvedimas buvo vienintelis būdas pagerinant vietines gyvūnų savybes. Sėkmingas genų pernešimas į žinduolių ląsteles pernešant ląstelės branduolį į ląstelę su pašalintu branduoliu, leido sukurti genetiškai identiškus gyvūnus. Šių darbų pasekmėje atsirado galimybė pernešti genus ar visa genų grupę įterpiant juos į aukštesniųjų organizmų chromosominę DNR.Transgeninė technologija išvystyta ir ištobulinta kaip modelines sistemas panaudojant peles.Nuo 1980-uju šimtai įvairių genų įterpta į įvairias pelių rūšis. Rezultatai iš tokių bandymų pagilino žinias apie genų raiškos reguliaciją, auglių (vėžio) vystimąsi, imunologiją, ir kitus pagrindinius biologinius procesus.Transgeninės pelės naudojamos tikrinant pramoniniu būdu gaminamus vaistinius preparatus, naudojamus žmonių ligų gydymui, o taip pat konstruojant transgenines gyvūnų rūšis (veisles) kurios naudojamos kaip modelinės sistemos tyrinėjant įvairias žmogaus ligas. Šių gyvūnų, kaip modelinių sistemų, panaudojimas žmogaus ligoms tyrinėti įgalina greitą ligų diagnozavimo sistemų vystimąsi. Tačiau, pelė - tai ne žmogus, netgi įvertinant tai kad yra žinduolis, informacija gauta iš tokių tyrinėjimų nevisada galima pritaikyti praktikoje t.y. panaudoti žmonių reikmėms.

36


Panaudojant peles buvo gauta vertingos informacijos apie Alzheimer (Alzhaimerio) ligą (sukelia smegenų veiklos sutrikimą, sutrinka atmintis, abstraktus mastymas ir t.t.), artritą, raumenų distrofija, auglių vystimąsi, ligas susijusias su nervų ląstelių irimu, endokrinologinius sutrikimus, koronarines ligas ir daugelį kitų.

37


LABORATORINIAI DARBAI

Laboratorinis darbas Nr. 1Baltymų ir nukleino rūgščių koncentracijos nustatymas tirpaluose.

Darbuose susijusiuose su baltymais dažnai reikia atlikti darbus apsprendžiančius tolesnę darbų seką, o tam dažniausiai reikia žinoti baltymų gautų ankstesnėse stadijose koncentraciją.

1. Spektrofotometrinis baltymo koncentracijos nustatymo metodas.Baltymo koncentracijos nustatymas matuojant absorbcija 280 nm (A280) paremtas aromatinių (triptofano, tirozino ir mažesne dalimi fenilalanino) amino rūgščių likučių sugebėjimu absorbuoti šviesą UV spektro dalyje. Šis metodas yra greitas, paprastas, tačiau turi nemažai trukumų:

Metodas nėra pakankamai jautrus (0,05 – 5 mg baltymo), todėl matuojant šiuo metodu reikalingi didesni medžiagos kiekiai.

Baltymas savo sudėtyje turi turėti aromatinių amino rūgščių likučių.Dėl nevienodo aromatinių rūgščių likučių baltymuose kiekio, metodas nėra

pakankamai tikslus.Daugelis buferinių medžiagų ir kitų reagentų gali trukdyti tiksliems A280

matavimams.Absorbcijos reikšmės > 2 neturi būti naudojamos, o vietoj to mėginys turi būti

praskiedžiamas iki reikšmių < 2.Baltymų koncentracijos nustatymo spektras persidengia su nukleino rūgščių

koncentracijos nustatymo spektru, todėl matuojant baltymų koncentracijas tirpaluose turinčiuose nukleino rūgščių priemaišų galimos gana dideles paklaidos.

Darbo eiga:1. Kalibracinės kreivės gavimas:

Paimama: 0, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 μg baltymo.Su H2O praskiedžiama iki 1 ml (galutinio tūrio), ir matuojama absorbcija esant bangos ilgiui 280 nm (A280).Iš gautų duomenų nusibraižoma kalibracinė kreivė: A280 priklausomybė nuo baltymo kiekio.

2. Lygiai taip pat nustatoma baltymo koncentracija nežinomame mėginyje, ir pagal kalibracinę kreivę nustatoma baltymo koncentracija pateiktame mėginyje.

2. Kalorimetrinis baltymų koncentracijos nustatymo metodas.Vienas iš tokių metodų yra taip vadinamas Bradfordo metodas. Tai spalvinė reakcija, paremta baltymų sugebėjimu susirišti su Kumasi mėlio dažu (Coomassie brilliant blue R250). Metodas lyginant su spektrofotometriniu metodu yra žymiai jautresnis (0,005 – 0,05 mg baltymo).Tačiau ir šis metodas turi trūkumų:

Daugelis medžiagų (glicerinas, detergentai, 2-merkaptoetanolis, acto rūgštis, amonio sulfatas (NH4)2SO4, Tris, bei kai kurie šarminiai buferiai trukdo tiksliam

38


koncentracijos nustatymui. Šių problemų galima išvengti naudojant tinkamas kontrolines reakcijas.

Darbo eiga:1. Kalibracinės kreivės gavimas:

a) Paimama: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 μg baltymo.b) Su 0,15 M NaCl tirpalu praskiedžiama iki galutinio 100 µl tūrio.c) Pridedama 1 ml Bradfordo reagento (Kumasi mėlis etanolyje, + fosforo

rūgštis).d) Palaukiama 2 min. kambario temperatūroje.e) Matuojama A595.

Iš gautų duomenų nusibraižoma kalibracinė kreivė: A595 priklausomybė nuo baltymo kiekio.

2. Lygiai taip pat nustatoma baltymo koncentracija nežinomame mėginyje, ir pagalkalibracinę kreivę nustatoma baltymo koncentracija pateiktame mėginyje.

3. Spektrofotometrinis DNR ar RNR koncentracijos nustatymas.DNR ar RNR koncentracijos nustatymui matuojama absorbcija 260 ir 280 nm bangos ilgiuose. Matavimas esant bangos ilgiui 260 nm leidžia apskaičiuoti nukleino rūgšties koncentraciją mėginyje. 1 optinis vienetas apytiksliai yra lygus 50 µg/ml dvigrandės DNR, 40 µg/ml viengrandės DNR ar RNR, 20 µg/ml oligonukleotidų. Santykis tarp matavimo dydžių esant bangos 260 ir 280 nm (A260/A280) leidžia spręsti apie nukleino rūgšties turimos mėginyje švarumą.Nustatoma pateikto mėginio absorbcija esant bangos ilgiui 260 ir 280 nm. Paskaičiuojama DNR koncentracija pateiktame mėginyje.

Laboratorinis darbas Nr. 2 DNR skaldymas restrikcijos endonukleazėmis.

DNR skaldymas restrikcijos endonukleazėmis.DNR fragmentų klonavimui reikalingas klonavimo vektorius, ir reikiamas DNR fragmentas turi buti perskeltas į diskretinius ir atsikartojančius fragmentus. Išskirtos chromosominės DNR praleidimas dideliu spaudimu pro plona (švirkšto) adatą ar DNR paveikimas ultragarsu suskaldo DNR į 0.3 – 5 kb. porų fragmentus. Tačiau šie fragmentai yra suardyti atsitiktinai tai reiškia kad kiekvieną kartą bus gaunami skirtingi fragmentai. Su bakterinių fermentų skaldančių DNR molekulę specifinėse vietose atradimu DNR klonavimas tapo įmanomas. Šie fermentai vadinami II tipo restrikcijos endonukleazėmis.Iki 1970 m. vieno geno išskyrimas atrodė neįmanomas dalykas, todėl kad kiekvienas baltymas ląstelės DNR išraiškoje yra tik kaip nedidelė DNR sekos dalis.Problemos sprendimas išsisprendė su fermentų vadinamų restrikcijos endonukleazėmis atradimu. Šie fermentai skelia dvigrandę DNR seką griežtai apibrėžtose vietose.Skirtingose bakterijų rūšyse randamos skirtingos restrikcijos nukleazės, t.y. kerpančios DNR skirtingose vietose.

39


Elektroforezė agaroziniuose geliuose.Agarozė medžiaga išskiriama iš jūros dumblių. Tai linijinis polisacharidas. DNR elektroforezė agarozės gelyje - standartinis metodas naudojamas DNR fragmentų valymui ir identifikacijai. Naudojant šį metodą galima greitai ir efektyviai atskirti norimus DNR fragmentus iš mišinio, kurie neatsiskiria naudojant kitus metodus. Naudojant fluorescuojantį ir interkaliuojantį dažą – etidium bromidą, DNR galima aptikti (stebėti) tiesiog gelyje. Stebint gelį ultravioletinėje spektro dalyje galima aptikti net 1 ng. DNR.DNR migracijos agarozės geliuose greitis elektroforezėje nusakomas 5 pagrindiniais parametrais:1. DNR molekulių dydžiu. Dvigrandės DNR molekulės gelyje juda greičiu, atvirkščiai

proporcingu jų molekulinės masės dešimtainiam logaritmui.2. Agarozės koncentracija. Duoto ilgio DNR fragmentai skirtingos koncentracijos

agarozės gelyje juda skirtingais greičiais.3. DNR konformacija. DNR turinti vienodą molekulinį svorį bet skirtingą konformaciją,

agarozės gelyje juda skirtingu greičiu. (linijinė, žiedinė ir superspiralė).4. Elektros lauko įtampa. Esant mažai įtampai, linijinės DNR fragmentų judėjimas

agarozės gelyje yra proporcingas įtampai. Elektrinio lauko įtampai didėjant,didelio molekulinio svorio DNR fragmentų judėjimas diferenciškai kinta.

5. Bazių sudėtis ir temperatūra. Skirtingai nuo elektroforezės poliakrilamidiniuosegeliuose DNR mobilumas agarozės geliuose mažai priklauso nuo ją sudarančių bazių sudėties. Agaroziniuose geliuose DNR fragmentų judrumas 4– 30oC ribose praktiškai nekinta.

Darbo eiga:Darbe naudojama lambda fago DNR. Tai linijinė 48502 b.p. ilgio DNR molekulė. Pasiskaičiavus reakcijos komponentų reikiamus į reakciją įdėti tūrius ir juos sudėjus į mėgintuvėlį vykdoma inkubacija 2 valandas 37oC.

Pasibaigus inkubacijai, paimamas mėginys 5µl į kurį įdedama 2 µl dažo ir vykdoma elektroforezė agarozės gelyje, TAE (tris-acetatiniame) buferyje, esant 100 V įtampai. Po elektroforezės gelis dažomas etidium bromido tirpale ir analizuojamas ultravioletinėje spektro dalyje. Į atskirą takelį įdedama fermentais neveikta DNR.

Laboratorinis darbas Nr. 3Polimerazės grandininė reakcija.

PCR (polimerazės ciklinė reakcija - PCR, arba dar vadinama polimerazės grandininė reakcija - PGR,) tai efektyvi procedūra gaunant didelius kiekius specifines DNR sekos in vitro. PCR metodu DNR kiekis padauginamas milijonus kartų.Pagrindiniai reikalavimai PCR:1. 2 sintetiniai oligonukleotidai (pradmenys), komplementarūs norimos

padauginti DNR sritims.2. DNR seka išsidėsčiusi tarp pasirinktų pradmenų poros.3. Termostabilus fermentas DNR polimerazė.

40


4. 4 dNTP (dezoksiribonukleotid trifosfatai [dATP; dCTP; dTTP; dGTP]).Tipinis amplifikacijos procesas apima eilę DNR amplifikacijos ciklų.Kiekvienas ciklas susideda iš 3 stadijų:1. Denatūracija. Terminė DNR mėginio denatūracija pakeliant reakcijos temperatūrą iki

95oC.2. Renatūracija. Temperatūra mėgintuvėlyje pažeminama iki 50 – 60oC. Pradmuo,

pagal komplimentariškumo principą, prisijungia prie DNR.3. Sintezė. Temperatūra pakeliama iki optimalios termostabiliai DNR polimerazei

veikimo temperatūros (72oC). DNR sintezė inicijuojama kiekvieno pradmens 3’-OH gale.

PCR reakcija reikalauja labai mažų pradinės medžiagos kiekių.

Darbo eiga:Darbui naudojama išskirta iš λ fago DNR (48.502 b.p.) ir du pradmenys:Į mėgintuvėlį įdedama:

Pasiskaičiavus PCR reakcijos komponentų reikiamus į reakciją įdėti tūrius ir juos sudėjus į mėgintuvėlį, tam kad tirpalas negaruotų, ant mėginio viršaus užsluoksniuojama mineralinė alyva. Įdedama į PCR aparatą ir vykdomi 25 ciklai, sekančiomis sąlygomis:1. 95oC – 2 min.2. 95oC – 1 min.3. XoC – 2 min.4. 72oC – 2 min.2; 3; 4; stadijos pakartojamos 25 kartus.(XoC - reakcijoje naudojamų pradmenų hibridizacijos temperatūta)Po PCR reakcijos vykdoma DNR elektroforezė 1.2 % (w/v) agarozės gelyje, TAE (tris-acetatiniame) buferyje, esant 100V įtampai.Į 7 µl iš bendro PCR reakcijos mišinio paimto mėginio įdedama 1 µl dažo ir užnešamas į agarozinio gelio šulinėlį. Elektroforezė vykdoma esant 150 V įtampai, apie 45 min.Po elektroforezės gelis dažomas etidium bromido tirpale ir analizuojamas ultravioletinėje spektro dalyje.

Laboratorinis darbas Nr. 4Plazmidinės DNR įterpimas į E.coli ląstelę.

Kompetentinės ląstelės (ląstelės turinčios padidinto pralaidumo sienelę). E.coli ląstelės auginamos iki reikiamo optinio tankio. Ląstelės paveikiamos CaCl2 tirpalu. CaCl2

poveikyje ląstelių išorinė membrana(sienelė) tampa labai poringa ir lengvai praleidžia didesnes molekules iš išorės. DNR patekimo į ląstelę efektyvumui padidinti kartu naudojamas taip vadinamas “ląstelių temperatūrinis šokas” kai ląstelės trumpam patalpinamos į aukštesnės temperatūros aplinką po to jas grąžinant į joms įprastą aplinką.

Darbo eiga: 1. Paruoštos kompetentinės ląstelės atšildomos (mėgintuvėlį su ląstelėmis laikant

ledo vonioje).

41


2. Prie 50 µl kompetentinių ląstelių pridedama 5 µl DNR tirpalo. 3. Mėgintuvėlis su DNR - ląstelių mišiniu 30 min. inkubuojamas leduose. 4. Mėgintuvėlis pernešamas į 42oC vandens vonią ir inkubuojamas 2 min. 5. Po to mėgintuvėlis grąžinamas į ledo vonią. 6. Į mėgintuvėlį įdedama 1 ml terpės ir ląstelės inkubuojamos vandens vonioje 37oC

vieną valandą. 7. Mėgintuvėlis centrifuguojamas, didžioji dalis terpės nupilama. 8. Ląstelės suspenduojamos likusiame terpės tūryje (~ 200 µl). 9. Suspenduotos ląstelės užnešamos ant Petri lėkštelės su terpe turinčia antibiotikų ir

gerai paskirstomos.10. Lėkštelės apverčiamos, patalpinamos į 37oC termostatą ir laikomos 16 valandų.

Išaugusios ant Petri lėkštlės E.coli kolonijos analizuojamos PCR reakcijos pagalba.

Laboratorinis darbas Nr. 4Baltymų elektroforezė denatūruojančiomis sąlygomis.

Elektroforezė naudojama baltymų kompleksų atskyrimui, tikslu įvertinti jų sudėtį bei baltymo homogeniškumą. Ji taip pat gali būti panaudojama kaip viena iš baltymų valymo stadijų.Poliakrilamidiniame gelyje, elektros lauke, baltymai priklausomai nuo gelio porų dydžio, migruoja per gelio matricos poras. Porų dydis, kintant akrilamido koncentracijai, kinta (didėjant poliakrilamido koncentracijai – mažėja). Gelio porų dydis bei baltymo krūvis apsprendžia baltymo migracijos greitį.Poliakrilamidinis gelis susidaro iš akrilamido monomerų, susiuvus jo grandines N',N'-metilenbisakrilamidu. Polimerizacijos reakcija inicijuojama amonio persulfatu ir reakcijos greitintoju TEMED (N,N,N',N'-tetrametiletilenediaminas), katalizuojančiu laisvųjų radikalų iš amonio persulfato susidarymą. Kadangi deguonis inhibuoja polimerizacijos procesą, gelio tirpalo deaeracija pagreitina polimerizacijos procesą.Plačiausiai yra naudojama elektroforezė netolyginiuose geliuose. Kadangi elektroforezės netolyginiuose geliuose metu vyksta ne tik baltymų išskirstymas (frakcionavimas), bet ir koncentravimas, todėl tiriami mėginiai gali būti labiau praskiesti.Netolyginiuose geliuose mėginys, visų pirma, praeina per koncentruojantį gelį, turintį dideles poras. Koncentruojančio gelio buferis turi chlorido jonus (vadinamus pirmaujančiais jonais), kurių elektroforetinis judrumas yra didesnis už baltymų judrumą. Elektroforezės buferis turi glicino jonus (vadinamus nešamaisiais jonais), kurių elektroforetinis judrumas yra mažesnis už baltymų judrumą. Tai duoda, kad greičiau migruojantys jonai po savęs palieka žemesnio laidumo zoną, susidarančią tarp greitai migruojančių chlorido jonų ir lėčiau migruojančių baltymų. Rezultate, susidaręs didesnis įtampos gradientas leidžia baltymams judėti greičiau ir susikoncentruoti šioje zonoje.Po koncentruojančio gelio baltymai patenka į frakcionuojantį gelį- tai gelis, kuriame baltymai pradeda išsiskirstyti pagal savo nešamą krūvį. Frakcionuojantis gelis lyginant su koncentruojančiu geliu turi mažesnius porų dydžius, didesnę druskų koncentraciją ir aukštesnį pH. Frakcionuojančiame gelyje glicino jonai migruoja paskui baltymą ir

42


baltymai išskirstomi pagal savo molekulinį dydį (denatūruojančiuose geliuose), arba pagal savo molekulių pavidalą, dydį ir krūvį nedenatūruojančiuose geliuose.Baltymai denatūruojami juos kaitinant, esant tirpale mažo molekulinio svorio tiolui (2- merkaptoetanolui [2-ME], ar ditiotreitolui [DTT]) ir natrio dodecil sulfatui (SDS). Elektroforezė SDS-poliakrilamidiniuose geliuose- tai anijoninė sistema, todėl kad SDS neša neigiamą krūvį. Daugumas baltymų rišasi su SDS, o susirišęs su baltymu SDS kiekis yra tiesiogiai priklausomas nuo baltymo dydžio, tuo būdu denatūruotuose baltymuose krūvis pasiskirsto praktiškai tolygiai. Todėl SDS-baltymo kompleksas poliakrilamidiniuose geliuose migruoja pagal dydį, o ne pagal krūvį.Nežinomo baltymo molekulinis svoris nustatomas lyginant jo migraciją poliakrilamidiname gelyje su žinomų baltymų (standartų) migracija. Tiksliau baltymo molekulinė masė gali būti skaičiuojama pagal tiesinę kalibracinę kreivę, kurioje x ašyje atidedamas santykis atstumų: dažo fronto migravimo su baltymo migravimu (Rf), o y ašyje molekulinės masės logaritmas.Jeigu du baltymai turi identišką molekulinę masę, jie vienos dimensijos gelyje neatsiskirs. Šiam tikslui naudojami dviejų dimensijų geliai, kur pirmoje dimensijoje vykdomas elektrofokusavimas, t.y. frakcionavimas pagal baltymo krūvį, o kitoje dimensijoje- elektroforezė denatūruojančiomis sąlygomis.

Darbo eiga:Poliakrilamidinio gelio sudėtis:Koncentruojantis gelis: 3.9 % akrilamidas, 0.1 % bisakrilamidas, 0.125 M Tris-Cl pH

6.8, 0.1 % SDS, 0.05 % amonio persulfato, 0.1 % TEMED.Frakcionuojantis gelis: 9.9 % akrilamidas, 0.2 % bisakrilamidas, 0.375 M Tris-Cl pH

8.8, 0.1 % SDS, 0.03 % amonio persulfato, 0.07 % TEMED.

Paruoštas frakcionuojančio gelio tirpalas supilamas tarp dviejų stiklų, ant viršaus užsluoksniuojamas nedideliu kiekiu izopropilo alkoholio. Palaukiama kol įvyks polimerizacijos reakcija. Izopropilo alkoholis nupilamas, ant susipolimerinusio frakcionuojančio gelio užpilamas koncentruojančio gelio tirpalas. Šulinėlių susiformavimui įstatomos taip vadinamos šukos, ir palaukiama kol įvyks polimerizacija. Šukos ištraukiamos, gelis esantis tarp stiklų įdedamas į aparatą ir į susidariusius šulinėlius įnešami baltymų mėginiai.Pavyzdžiai prieš užnešant juos į šulinėlius denatūruojami. Mėginiai lygiais tūriais

sumaišomi su pavyzdžių tirpalu (2xSDS/sample buffer): 0.125 M Tris-Cl pH 6.8, 0.5% SDS, 20 % glicerolas, 2% 2-merkaptoetanolas, 1% bromfenoliomėlis, ir denatūruojami juos virinant 5 min. vandens vonioje.

Elektroforezės buferis: 0.125 M Tris, 0.96 M glicinas, 0.5% SDS.Elektroforezė vykdoma esant 100 V įtampai.Dažant Kumasi briliantiniu mėliu galima aptikti nuo 50 ng baltymo, o dažant sidabru nuo 1 ng baltymo.Elektroforezei pasibaigus, gelis yra fiksuojamas ir dažomas tirpalu: 50 % metanolis (v/v), 0.05 % Kumasi briliantinis mėlis R-250, 10% acto rūgštis (v/v), 40 % vanduo.Dažo perteklius atplaunamas tirpalu: 5 % metanolis, 7 % acto rūgštis, 88 % vanduo.

43

biotechnologija - molbiomolbio.vdu.lt/medziaga/kanopka/biotechnologija.pdf · bakterijos ląsteles...

Documents