Spektrometria masSpektrometria mas

ZNACZĄCE POSTACIE SPEKTROMETRII MASZNACZĄCE POSTACIE SPEKTROMETRII MAS

1st MSJoseph John Thomson (1856 - 1940) Cambridge University, Great Britain; Nobel Prize in Physics 1906

Ion ChemistryFrancis William Aston(1877 - 1945)Cambridge University, Great Britain; Nobel Prize in Chemistry 1922

Ion Trap Technique Wolfgang Paul(1913 - 1993) University of Bonn, Germany; Nobel Prize in Physics 1989

ESI of Biomolecules John B. Fenn (1917)Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia

Fragmentation MechanismsFred W. McLafferty(1923)Cornell UniversityIthaca, New York

Peptide Sequencing using MSKlaus Biemann (1926)MIT, Cambridge, Massachusetts

MALDIFranz Hillenkamp (1936)University of Münster, Germany

Mechanisms and ApplicationsR. Graham Cooks (1941)Department of Chemistry, Purdue UniversityWest Lafayette, Indiana

Mechanism of MALDI & ESIMichael Karas (1952)University of Frankfurt, Germany

Joseph Thompson: IZOTOPY HELUJoseph Thompson: IZOTOPY HELU

1911

ZASADA POWSTAWANIA WIDMA MASZASADA POWSTAWANIA WIDMA MAS

Droga jonów w polu elektrycznym i magnetycznym: rezultatDroga jonów w polu elektrycznym i magnetycznym: rezultatdziałających sił:działających sił:

• Siła pola magnetycznegoSiła pola magnetycznego (F (Fmm))• Siła odśrodkowaSiła odśrodkowa (F (Fcc))• Energia kinetyczna w polu elektrycznymEnergia kinetyczna w polu elektrycznym (E) (E)

Fmm = Bev B = natężenie pola magnetycznego

Fcc = mv2/r v = prędkość cząstkiEk = eU = ½ mv2 e = ładunek jonu

m = masa cząstki r = promień toru U = natężenie pola elektrycznegoEk = energia kinetyczna cząstki

2

222

2m

reBmeU

FFmm = F = Fcc

BBev = mvev = mv22//rr

v = v = BBer/mer/m

2U

rB

e

m 22

ZASADA POWSTAWANIA WIDMA MASZASADA POWSTAWANIA WIDMA MAS

WIDMO MASOWEWIDMO MASOWE

Stosunek masy jonu do jego ładunku w funkcjiintensywności sygnału

m/z

Inte

nsy

wn

ość

1 Th = 1 1 Th = 1 Dalton/liczbę ładunków/liczbę ładunków

MASY ATOMOWE - IZOTOPYMASY ATOMOWE - IZOTOPY

Węgiel 12C 12.0000* 98.89

13C 13.0033 1.11

Chlor 35Cl 34.9689 75.77

37Cl 36.9659 24.23

* Masa uznana jako dokładnie 12 przez UPAC

Symbol Masa atomowa Zawartość izotopu, %

M(C) = 0.9889(12.0000) + 0.0111(13.0033) = 12.011

M(Cl) = 0.7577(34.9689) + 0.2423(36.9659) = 35.453

SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCHSKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH PIERWIASTKÓWPIERWIASTKÓW

11HH 1.0081.008 1.007831.00783 99.9999.9922HH 2.014102.01410 0.0160.016

1212CC 12.01112.011 12.0000 (std)12.0000 (std) 98.8998.891313CC 13.0033613.00336 1.11 1.11

1414NN 14.006714.0067 14.0031 14.0031 99.6499.641515NN 15.000115.0001 0.36 0.36

1616OO 15.999415.9994 15.9949 15.9949 99.7699.761717OO 16.999116.9991 0.04 0.041818OO 17.999217.9992 0.20 0.20

1919FF 18.99818.998 18.998418.9984 100.0100.0

2828SiSi 28.085528.0855 27.9769 27.9769 92.1792.172929SiSi 28.976528.9765 4.71 4.713030SiSi 29.973829.9738 3.12 3.12

3232SS 32.06632.066 31.9721 31.9721 9955..00443333SS 32.971532.9715 0.76 0.763434SS 33.967933.9679 4.20 4.20

3535ClCl 35.452735.4527 34.9689 34.9689 75.7775.773737ClCl 36.965936.9659 24.2324.23

SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCHSKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH PIERWIASTKÓWPIERWIASTKÓW

SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCHSKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH PIERWIASTKÓWPIERWIASTKÓW

3131PP 30.973830.9738 30.9738 30.9738 100.0100.0

7979BrBr 79.909479.9094 78.9183 78.9183 50.5250.528181BrBr 80.916380.9163 49.4849.48

126126II 126.9045126.9045 126.9045 126.9045 100.00100.00

M(Br):M(Br): [% [% 7979Br x 78.9183] + [% Br x 78.9183] + [% 8181Br x 80.9163] Br x 80.9163]

[50.52 x 78.9183] + [49.48 x 80.9163] = 79.9094[50.52 x 78.9183] + [49.48 x 80.9163] = 79.9094

SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCHSKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH PIERWIASTKÓWPIERWIASTKÓW

C1 C10 C100

m/z R.I.

X 100

X+1 1.1

m/z R.I.

X 100

X+1 11.0

m/z R.I.

X 100

X+1 110

X+2 60

X+3 22

m/z

SKŁAD IZOTOPOWY – OBWIEDNIA IZOTOPOWASKŁAD IZOTOPOWY – OBWIEDNIA IZOTOPOWA

Masa cząsteczkowa respiryny C33H40N2O9

Masy atomowe: Masy izotopów:

C: 33 x 12.011 = 396.363 C: 33 x 12.0000 = 396.000

H: 40 x 1.0079 = 40.316 H: 40 x 1.0078 = 40.312

N: 2 x 14.0067 = 28.013 N: 2 x 14.0031 = 28.006

O: 9 x 15.9994 = 143.995 O: 9 x 15.9949 = 143.954

608.687608.687 608.272608.272

MASA CZĄSTECZKOWA MASA CZĄSTECZKOWA

MASA MONOIZOTOPOWAMASA MONOIZOTOPOWA

PORÓWNANIE PROFILU IZOTOPOWEGO PORÓWNANIE PROFILU IZOTOPOWEGO WIDMA ZMIERZONEGO I OBLICZONEGOWIDMA ZMIERZONEGO I OBLICZONEGO

WIDMO MAS A STRUKTURA MOLEKUŁYWIDMO MAS A STRUKTURA MOLEKUŁY

Jonizacja cząsteczek wiązką elektronów

RODZAJE JONIZACJIRODZAJE JONIZACJI

Miękka

Twarda

METODY JONIZACJIMETODY JONIZACJI

WIDMO EI KWASU OCTOWEGOWIDMO EI KWASU OCTOWEGO

ZALEŻNOŚĆ STOPNIA FRAGMENTACJIZALEŻNOŚĆ STOPNIA FRAGMENTACJI OD SIŁY POLA ELEKTRYCZNEGOOD SIŁY POLA ELEKTRYCZNEGO

To MS

Orifice Plate

Curtain Plate

Drying Gas

Curtain Gas

LC

Droplet Formation

Desolvation & Fission

Gas Phase Ion Generation

5kV

Nebulizing Gas

ESIESI

++

+++

REDUKCJA KROPLI I POWSTAWANIE JONÓWREDUKCJA KROPLI I POWSTAWANIE JONÓW

ESIESI

Tryb jonów dodatnich

Tryb jonów ujemnych

[M+H]+

[M+nH]n+ i [M+Na+]+

[M-H]-

•[M-nH]n- i [M+I-]-

• PotrójnyPotrójny KwaKwadrupol (QqQ)drupol (QqQ)– 2 kwadrupole filtrujące masy i jedna cela

zderzeń.

• Pułapka jonowaPułapka jonowa (IT) (IT)– Pojedyncza pułapka działa jako analizator

mas i cela zderzeń.

• HybrydyHybrydy ( (npnp. LIT). LIT)– Instrument wygląda jaki QqQ ale jeden

kwadrupol pełni rolę pułapki jonów.

ESIESI

Q1 Q2 Q3Q0

Cela zderzeńFiltrowanie jonów Filtrowanie jonów

POTRÓJNY KWADRUPOLPOTRÓJNY KWADRUPOL

Akumulacja jonów

• Q1 selkcjonuje [M+H]+ • Q2 fragmentuje wyselkcjonowany jon.• Q3 filtruje i monitoruje tylko wybrany jon.

Q0 Q1 Q2 Q3

N2 CAD Gas

Precursor ion selection

Ion accumulation

Fragmentation

POTRÓJNY KWADRUPOLPOTRÓJNY KWADRUPOL

WIDMO ESI ZWIĄZKU O NISKIEJ MASIEWIDMO ESI ZWIĄZKU O NISKIEJ MASIE

WIDMO ESI SYNTETYCZNEGO WIDMO ESI SYNTETYCZNEGO OLIGONUKLEOTYDUOLIGONUKLEOTYDU

WIDMO ESI KOMPLEKSÓW 18-C-6 WIDMO ESI KOMPLEKSÓW 18-C-6 Z KATIONAMI LITOWCÓWZ KATIONAMI LITOWCÓW

WIDMO ESI PEPTYDU O MASIE 16952,20 DaWIDMO ESI PEPTYDU O MASIE 16952,20 Da

ROZDZIELCZOŚĆ SPEKTROMETRU MASROZDZIELCZOŚĆ SPEKTROMETRU MAS

FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGOFRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO

y3

b2

y2 y1

b3a2 a3

HO NH3+

| |

R1 O R2 O R3 O R4

| || | || | || |H -- N --- C --- C --- N --- C --- C --- N --- C --- C --- N --- C -- COOH | | | | | | | H H H H H H H

b2-H2O

y3 -H2O

b3- NH3

y2 - NH3

FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGOFRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO

FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGOFRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO

G V D L K

mass0

Inte

nsity

mass0

MS/MSIdentyfikacja

peptydu

IDENTYFIKACJA PEPTYDÓW/BIAŁEK PRZYIDENTYFIKACJA PEPTYDÓW/BIAŁEK PRZY UŻYCIU MS/MSUŻYCIU MS/MS

TANDEM MSTANDEM MS

Peptide Mass Fingerprinting (PMF)

„„ODCISK PALCA” W MSODCISK PALCA” W MS

p53

G6PDH

Trypsin+ Gel punch

PROTEOMIKA - MSPROTEOMIKA - MS

Trx

MPSER……

GTDIMRPAKID

……

HPLCdo MS/MSMPSERGTDIMRPAKID......

BIAŁKOBIAŁKO PEPTYDYPEPTYDY(tryptic peptides)(tryptic peptides)

ENZYMATYCZNA HYDROLIZA BIAŁEK ENZYMATYCZNA HYDROLIZA BIAŁEK DO PEPTYDÓWDO PEPTYDÓW

>Białko 1acedfhsakdfqeasdfpkivtmeeewendadnfekqwfe

>Białko 2acekdfhsadfqeasdfpkivtmeeewenkdadnfeqwfe

>Białko 3MASMGTLAFD EYGRPFLIIK DQDRKSRLMG LEALKSHIMA AKAVANTMRT SLGPNGLDKMMVDKDGDVTV TNDGATILSM MDVDHQIAKL MVELSKSQDD EIGDGTTGVV VLAGALLEEAEQLLDRGIHP IRIAD

Sekwencja Masa (M+H) Peptydy trypt.

4842.05

4842.05

14563.36

acedfhsakdfgeasdfpkivtmeeewendadnfekgwfe

acekdfhsadfgeasdfpkivtmeeewenkdadnfeqwfe

SQDDEIGDGTTGVVVLAGALLEEAEQLLDR2DGDVTVTNDGATILSMMDVD HQIAKMASMGTLAFDEYGRPFLIIK2TSLGPNGLDKLMGLEALKLMVELSKAVANTMRSHIMAAKGIHPIRMMVDKDQDR

BIBLIOTEKA PEPTYDÓW TRYPTYCZNYCHBIBLIOTEKA PEPTYDÓW TRYPTYCZNYCH

RT: 0.01 - 80.02

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Relati

ve Ab

undanc

e

13891991

1409 21491615 1621

14112147

161119951655

15931387

21551435 19872001 21771445 1661

19372205

1779 21352017

1313 22071307 23291105 17071095

2331

NL:1.52E8

Base Peak F: + c Full ms [ 300.00 - 2000.00]

S#: 1708 RT: 54.47 AV: 1 NL: 5.27E6T: + c d Full ms2 638.00 [ 165.00 - 1925.00]

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

850.3

687.3

588.1

851.4425.0

949.4

326.0524.9

589.2

1048.6397.1226.9

1049.6489.1

629.0

LC

S#: 1707 RT: 54.44 AV: 1 NL: 2.41E7F: + c Full ms [ 300.00 - 2000.00]

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

638.0

801.0

638.9

1173.8872.3 1275.3

687.6944.7 1884.51742.11212.0783.3 1048.3 1413.9 1617.7

MS

MS/MSIon

Source

MS-1collision

cell MS-2

TANDEM MSTANDEM MS

SSeekkwweennccjjaa

S#: 1708 RT: 54.47 AV: 1 NL: 5.27E6T: + c d Full ms2 638.00 [ 165.00 - 1925.00]

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

850.3

687.3

588.1

851.4425.0

949.4

326.0524.9

589.2

1048.6397.1226.9

1049.6489.1

629.0

MS/MS instrumentMS/MS instrument

Analiza przy użyciu baz danych

ANALIZA DANYCHANALIZA DANYCH

PMF online• Mascot

• www.matrixscience.com

• ProFound– http://129.85.19.192/profound_bin/WebProFound.exe

• MOWSE• http://srs.hgmp.mrc.ac.uk/cgi-bin/mowse

• PeptideSearch• http://www.narrador.embl-heidelberg.de/

GroupPages/Homepage.html

• PeptIdent• http://us.expasy.org/tools/peptident.html