lumineszcencia spektrometria –...
TRANSCRIPT
Lumineszcencia spektrometria – összefoglaló
Ismétlés:
fény (elektromágneses sugárzás) elnyelés: abszorpció
elektron gerjesztés: excitáció
alap és gerjesztett állapot
atomi energiaszintek, energiaszintek energia különbsége, foton energia, rezonancia feltétel
elektromos, vibrációs, rotációs energiaszintek és azok függetlensége → Jablonsky diagram
(termséma)
szinglet és triplet állapot, multiplicitás
Lumineszcencia jelensége:
lumineszcencia típusok gerjesztés típusa szerint
fluorofór = fluoreszcens molekula / jelölő
jelenségek összekapcsolása: abszorpció‐emisszió, gerjesztés‐visszagerjesztés (excitáció‐deexcitáció),
foton és elektron kölcsönhatása
gerjesztés és emisszió jelenségének értelmezése a Jablonsky diagram segítségével,
spontán emisszió tulajdonságai
időbeliség, koherencia
irány, divergencia
hullámhossz
polarizáltság
Lumineszcencia típusok triplet és szinglet állapotok szerint:
fluoreszcencia és foszforeszcencia összehasonlítása
S1 → S0 és T1 → S0 átmenet, spinátfordulás, tiltott és engedélyezett átmenetek
időbeliség, átlagos élettartam
foton energia, emissziós spektrumok az elektromágneses spektrumon
Lumineszcencia típusok értelmezése a Jablonski diagram segítségével
Kasha szabály
sugárzásos és nem sugárzásos átmenetek
tükör szimmetria, Stokes‐féle eltolódás (vörös eltolódás)
fluoreszcencia átlagélettartam, kvantumhatásfok
polarizáció, polarizált fény, abszorpciós és elektromos vektor, fotoszelekció jelensége
Fluorofórok:
intrinsic és extrinsic fluorofórok
fluoreszcencia (és fluorofórok) alkalmazási lehetőségei
Lumineszcencia spektroszkópia – fluoriméter:
egységek és geometria: fényforrás, monokromátor(ok), minta, detektor (PMT), adatgyűjtő és
kiértékelő egység (PC)
működési elv: merőleges elrendezés, gerjesztési és emissziós ág
2012.02.11.
1
Lumineszcencia spektroszkópia
Elektron+vibrációs+rotációs-spektroszkópia alapjai
Fizika-Biofizika II. szemeszter
2012. február
Orbán József
PTE ÁOK Biofizikai Intézet
Kengurupatkány vese epitéliumsejt mitotikus osztódása
DNS Mikrotubulus Mitokondrium
forrás: http://micro.magnet.fsu.edu/cells/fluorescencemitosis/index.html3
2012.02.11.
2
Lumineszcencia
tulajdonságoktulajdonságok• Szinglet/triplet állapot
• Energetika
• Időbeliség, koherencia
• Irány (divergencia)
• Polarizáltság
Szinglet és triplet állapot (molekulák)0
Eredő spin?s = S = ?
Multiplicitás: = 2 S+1
Ene
rgia
Abszorpció
h
S1
s = S = ?
S = 0
T1
S = 1
= 2·S+1
M = 1 M = 3
S0
Pauli elvnek megfelel → engedélyezett átmenet
S0
Pauli elvnek ellentmond → tiltott átmenet
2012.02.11.
3
Molekula orbitál elmélet
Hidrogén → H2
1 p+, 1 e-
H atom H atom
ener
gia
H gáz (H2)
Eredő spin?s = S = ?
e
1s
s: bonding molecular orbitals*: antibonding molecular orbital
Molekula orbitál elmélet
Hélium → He2
2 e-
H l k l (H )He atom He atom
ener
gia
He molekula (He2)
Eredő spin?s = S = ?
e
1s
2012.02.11.
4
Molekula orbitál elméletOxo-/karbonil csoport>C=O
C O kettős kötés
C atom O atom
ener
gia
C, O kettős kötés
n
e
Eredő spin?
s = S = 0Multiplicitás: M = 2S+1
Molekula orbitál elmélet
C atom O atom
ener
gia
nHOMO:Highest occ pied MO
LUMO:Lowest unoccupied MO(legalacsonyabbbetöltetlen MO)Nincs eredő
spin változás!
e
Highest occupied MO(legmagasabb betöltött MO)
→ →n→→n→
2012.02.11.
5
Jablonsky-féle termsémamolekuláris rendszerre
0
S1. Excitáció (gerjesztés)
Ene
rgia
S1
S2
(g j )Abszorpció (elnyelés)
Energiafelvétel közben az e-
egyik szintről a másikra jut.Fotont nyel el a rendszer.
2. De-excitációEmisszió (kibocsátás)Abszorpcióh
S0
Emisszió (kibocsátás)Energialeadás közben az e-
egyik szintről a másikra jut.Fotont bocsát ki a rendszer.
pEmisszió h
A lumineszcencia típusai
A gerjesztés módja szerint:
EM sugárzás elnyelése fotolumineszcencia
kémiai reakció kemi-, biolumineszcencia
termikusan aktivált ion rekombináció termolumineszcencia
töltés által indukált elektrolumineszcencia
nagy energiájú részecske v. sugárzás radiolumineszcencia
mechanikai (súrlódás) tribolumineszcencia
hanghullámok sonolumineszcencia
A gerjesztett állapot szerint:
szinglet állapot fluoreszcencia
triplet állapot foszforeszcencia
A termolumineszcencia nem azonos a (fekete test) hősugárzással!
2012.02.11.
6
Milyen időskálán zajlanak a folyamatok?
gerjesztés
Fluoreszcencia10-9 s
Foszforeszcencia10-3 s
alapállapotgerjesztett állapot
10-15 s
g j p
relaxáció
fluoreszcencia kioltás, FRET
Belső átalakulás (Internal conversion,
hő)
Abszorpció (t ~ 10-15s) S0→Sn
Sugárzásos (radiatív) átmenetekLumineszcenciaFluoreszcencia (F) S1→S0
Foszforeszcencia (P) T →S
AT
VR
IC
IC
VR
VRS2
T2
S1
szinglet triplet
Foszforeszcencia (P) T1→S0
Sugárzás nélküli (nonradiatív) átmenetek:Belső konverzió (IC)Intersystem crossing (ISC)
Vibrációs relaxáció (VR)
VR
IC
ISC
ISC
IC
IC
PF
AS
AX
VR
VR
T1
Kasha-szabály (kivéve foszforeszcencia esete):
minden radiatív lecsengés csakis az első gerjesztett állapot (S1) legalsóvibrációs szintjéről indulhat (földi körülmények között).
S0
2012.02.11.
7
Jabłonsky-féle termsémamolekuláris rendszerre
0
S1. Excitáció (gerjesztés)
Ene
rgia
S1
S2
(g j )Abszorpció (elnyelés)
Energiafelvétel közben az e-
egyik szintről a másikra jut.Fotont nyel el a rendszer.
2. De-excitációEmisszió (kibocsátás)Abszorpcióh
S0
Emisszió (kibocsátás)Energialeadás közben az e-
egyik szintről a másikra jut.Fotont bocsát ki a rendszer.
pEmisszió h
SPONTÁN EMISSZIÓ!
Jabłonsky-féle termsémamolekuláris rendszerre
0
SIC: internal conversionBelső átrendeződés
Ene
rgia
S1
S2
Abszorpcióh
T1
ISC: intersystem crossingRendszerek közti átmenet
VR: vibrációs relaxációTermikus relaxáció
Belső átrendeződés
S0
pEmisszió h
fluoreszcencia foszforeszcencia
2012.02.11.
8
FLUORESZCENCIA
GerjesztésTermikus relaxáció (Kasha-szabály)EmisszióS1-S0 átmenet: szinglet-szinglet
Reakcióséma
S0+ h → S1
S1 → S0 + hflnincs spinátfordulást = 10-9s (ns)
FOSZFORESZCENCIA
GerjesztésTermikus relaxációIntersystem crossing (S T)
S1 → S0 + hfluor
S0+ h → T1Intersystem crossing (S-T)Termikus relaxációEmisszióT1-S0 átmenet: triplet-szinglet
spinátfordulással (!)t = 10-6 – 10 s (µs – s)
0 1
T1 → S0 + hfoszf
Emisszió típusok tulajdonságai
SpontánIndukált(a foton abszorpcióhoz képest)
• Időben késleltetve → nem koherens
• Minden irányban (3D)
A beérkező fotonnal…
• Egy időben (azonnal) → koherens
• Egyező irányban (kis divergencia)
• nem azonos → nem monokrom.
• Kisebb energiájú
• Azonos hullámhossz → monokromatikus
2012.02.11.
9
Fluoreszcencia spektrum: tükörszimmetria, Stokes–féle eltolódás ()
Int. f:10-9 – 10-6 s
p:10-6 – 10 s
bfluor. foszfor.
absz.gerj.
Fluoreszcencia spektrum: tükörszimmetria, Stokes – féle eltolódás
2012.02.11.
10
Tükörszimmetria oka
Source: http://www.olympusfluoview.com/theory/fluoroexciteemit.html
Fluoreszcencia élettartam ()A molekula gerjesztett állapotból fotonemisszióval kerül vissza alapállapotba. A fluoreszcencia-élettartam az az idő, amely alatt a gerjesztett állapotban levő molekulák száma az e-ed részére csökken.
τ= 1 / (kf + kic + kisc) = 1 / (kf + knr ) ≈ ns-os tartomány
ahol knr = kic + kisc
kkf - a fluoreszcencia-átmenet valószínűségeic - internal conversion (belső konverzió)isc - intersystem crossing (rendszerek közti átmenet)nr - nonradiativ (sugárzás nélküli átmenet)
2012.02.11.
11
Fluoreszcencia kvantumhatásfok
Q = Nemit. / N abs. < 1
Q = kf / (kf + kic + kisc) = kf ·
Polarizált fény, abszorpciós vektor, elektromos vektor
Elektromos dipolmomentum
Elektromágneses hullám elektromos térerősség vektora, rezgési sík
2012.02.11.
12
Síkban ill. lineárisan polarizált fény
Az animáció egyfüggőleges síkban polarizált
hullámot mutat be.
A metszősíkot szemből nézveaz alábbi kép tárul elénk:
Ha az elektromos térerősség vektora
http://esr.elte.hu/~noemi/labor/cd/demo0.html
Ha az elektromos térerősség vektoraa tér valamely, a fénysugárvonalában lévő, rögzített pontjábanegy egyenes mentén rezeg, akkorsíkban vagy lineárisan polarizálthullámról beszélünk.
Az alábbi animáció egy vízszintes síkban polarizált hullámot mutat be.
A metszősíkot szemből nézve
http://esr.elte.hu/~noemi/labor/cd/demo0.html
2012.02.11.
13
Elektromos és abszorbciós vektorok
Abszorbciós vektor
forgáskúp !!!
meghatározza az abszorbcióvalószínűségét
Elektromos térerősség vektor
Abszorpció maximális, ha az abszorpciós vektor és a fény p yelektromos térerősség vektora párhuzamos.
Abszorpció képessége függ cos2θ-tól (θ az absz. vektor és a fény elektromos térerősség vektora közötti szög).
A kúpon belüli abszorpciós vektor esetén a fluorofor gerjesztésének valőszínűségenagyobb, mint 50%. (függőleges polariáció esetén)
polarizálatlan fény
FotoszelekcióVéletlenszerű, izotróp eloszlás
vertikálisan polarizált fényfluoroforok
random
Anizotróp eloszlás
„fotoszelekció” =rendezett orientációjú
szubpopuláció szelektálódik
randomorientációjú populációja
izotróp: irányfüggetlenMinden irányban azonos.
2012.02.11.
14
Fluorofórok
Ismétlés: Fehérjék abszorpciója - aminosavak
A három fontos aminosav,amelyek UV ban abszorbeálnakamelyek UV-ban abszorbeálnak,azaz gerjeszthetők.
exti
nkc
ió
hullámhossz
2012.02.11.
15
Fluorofórokfluoreszcenciára alkalmas kémiai anyagok
1. Intrinsic, natív (belső) fluorofórok
Fehérjékben: aromás aminosavakElőny: Nem kell módosítani a vizsgált biológiai rendszertElőny: Nem kell módosítani a vizsgált biológiai rendszert.
Élő sejtek saját fluoreszcenciája
Aequorea victoriaGFP (green fluorescent protein)
szalagdiagrammja
2012.02.11.
16
Kémiai módosításokkal egy alapvegyület abszorpciója és emissziója hangolható!
2. Extrinsic (külső) fluorofórok - fluoreszcens festékekA jelölő kémiai anyagok minősége és elhelyezkedése tervezhető.
A fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez köthetjük. (pl.: cisztein, glutamin, lizin)
A fehérje aktivitását tesztelni kell.
IAEDANS PIRÉNIAF
példák:
IAEDANS-IAF: FRET donor-akceptor pár
Pirén: aktin polimerizáció
fluoreszcein, dansyl, rhodamine száramzékok...
Aktin monomer szalagdiagramja
2012.02.11.
17
Kémiai háttér
Könnyű gerjeszteni az elektronokat, ha
R
• Aromás gyűrűben, vagy
• Konjugált kettős kötésű rendszerben
találhatók.
Minél több kettős kötés van a molekulában, annál kisebb energia kell a gerjesztéshez! Hangolható, tervezhető!
Külső (extrinsic) fluorofór alkalmazásakor:fluorofór
A kromofór (fluorofór) lokális
makromolekula
A kromofór (fluorofór) lokális mozgása elkülöníthetőa molekula egészénekmozgásától.
Térszerkezeti változás a makromolekulában hat a kromofór mozgására is. Ez a változás mérhető.
2012.02.11.
18
Fluoreszcencia alkalmazási lehetőségeiJól detektálható jel (alacsony koncentrációjú minták esetén is).
A fluoreszcencia paraméterek érzékenyek a környezeti tényezők
megváltozására.
A molekuláris szintű vizsgálatok fontos eszköze
Szerkezeti és dinamikai információt ad a vizsgált rendszerről.
Biológiai rendszerek vizsgálata (nem károsítjuk a vizsgálandó rendszert).
Molekulák közötti és molekulán belüli kölcsönhatások tanulmányozása.
Molekuláris mozgások vizsgálata (polarizáció, anizotrópia).
Molekuláris szintű távolságmérés (FRET).
Molekulák rugalmasságának jellemzése (FRET).
Molekula szerkezeti részleteinek, és az egyes csoportok elérhetőségének
feltérképezése (quenching).
További alkalmazások:
Szerkezeti tulajdonságok vizsgálataF hé j d á ió kö é• Fehérje denaturáció nyomonkövetése
• Protein-ligand kapcsolat vizsgálata• Szerkezet vizsgálata a környezeti paraméterek (pH, ionok) változásának függvényében
Dinamikus tulajdonságok vizsgálata• Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája• Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a membrán belsejében lévő viszkozitásról•Fehérjékhez kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a fehérjemátrix flexibilitásáról
2012.02.11.
19
Mikroszkópia – fluoreszcens jelöléssel
Aktin filamentum
Mikrotubulus
DNS
Hogyan mérjük a fluoreszcenciát?Egy fluoriméter működésének elméleti sémája
gerjesztésimonokromátor
fényforrás Minta
emissziósmonokromátor
Kiértékelés (PC)
Detektor
Fény (gerjesztés)Fény (emisszió)Elektromos jel
2012.02.11.
20
Fluoreszcencia mérése – spektrofluoriméter‘steady – state’
Fényforrás DetektorFényforrás
Lámpa
lézer
G j s tési
Detektor
Polarizátorok / Szűrők
Gerjesztési
monokromátor
(λgerjesztési)
Emissziós
monokromátor
(λemissziós)Minta
küvetta
A fluoreszcencia élettartam
Fluoreszcencia lecsengési görbe
A fluorofórok sajátsága, jele:
2012.02.11.
21
Fázis fluorimetriaIn
tenz
itás
Idő (ns)
Fény-anyag kölcsönhatás: hullámhossz - energiaszintek