skrining, isolasi, dan uji aktivitas antibakteri …

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI METABOLIT BIOAKTIF JAMUR ENDOFIT DARI TUMBUHAN GINSENG KUNING

(Rennellia elliptica Korth.)

SKRIPSI

AINUL MARDIAH NIM. 109102000046

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA OKTOBER 2013

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI METABOLIT BIOAKTIF JAMUR ENDOFIT DARI TUMBUHAN GINSENG KUNING

(Rennellia elliptica Korth.)

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

AINUL MARDIAH NIM. 109102000046

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA OKTOBER 2013

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Ainul Mardiah

NIM : 109102000046

Tanda Tangan :

Tanggal : 2 Oktober 2013

iv

Skrining, Isolasi dan Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Bioaktif Jamur Endofit dari Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.)

HALAMAN PERSETUJUAN SKRIPSI

Nama : Ainul Mardiah NIM : 109102000046 Program Studi : Farmasi Judul Skripsi :

Menyetujui,

Pembimbing I

Dr. Andria Agusta

NIP. 1969081661994031003

Pembimbing II

Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Si., Apt.

Mengetahui,

Kepala Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt.

v

Skrining, Isolasi, dan Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Bioaktif Jamur Endofit dari Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.)

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi ini diajukan oleh : Nama : Ainul Mardiah NIM : 109102000046 Program Studi : Farmasi Judul Skripsi :

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

DEWAN PENGUJI

Pembimbing 1 : Dr. Andria Agusta ( )

Pembimbing 2 : Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Si., Apt. ( )

Penguji 1 : Lina Elfita, M.Si., Apt ( )

Penguji 2 : Eka Putri, M.Si., Apt. ( )

Ditetapkan di : Jakarta Tanggal : 2 Oktober 2013

vi

Skrining, Isolasi, dan Uji Aktivitas Antibakteri Metabolit Bioaktif Jamur Endofit dari Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.)

ABSTRAK

Nama : Ainul Mardiah Jurusan : Farmasi Judul :

Sebanyak dua puluh tiga isolat jamur endofit dari tumbuhan bagian akar, biji, daun dan batang tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth) telah dikultivasi pada medium Potato Dextrose Broth/ PDB selama tiga minggu pada suhu ruang dan kondisi statis. Jamur endofit GKBt 2 yang diisolasi dari bagian batang menunjukkan aktivitas antibakteri paling besar terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli pada uji menggunakan metode bioautografi. Scaling Up kultivasi jamur GKBt 2 selama 3 minggu menghasilkan sebanyak 830 mg ekstrak etil asetat media PDB. Fraksinasi dan pemurnian fraksi aktif yang dilakukan dengan menggunakan kromatografi kolom dan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif menghasilkan fraksi F.5.8a dan F.5.8b masing- masing memiliki bobot 4,5 mg dan 5 mg. Hasil uji Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) menunjukkan bahwa F.5.8a dan F.5.8b aktif melawan bakteri S. aureus masing-masing sebesar 256 µg/mL sedangkan nilai KHM terhadap bakteri E. coli masing-masing sebesar 128 µg/mL. Kata kunci : Ginseng Kuning, Rennellia elliptica Korth, jamur endofit, aktivitas antibakteri, Jamur GKBt 2, fraksi aktif.

vii

Screening, Isolation, and Antibacterial Activity of Bioactive Metabolite From Endophytic Fungi Associated with Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.)

ABSTRACT

Name : Ainul Mardiah Program study : Pharmacy Title :

Twenty-three isolates of endophytic fungi from root, seed, leaf and stem of Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth) was cultivated in Potato Dextrose Broth for three weeks in room temperatur and static condition. GKBt 2, the endophytic fungus was isolated from the stem showed the most active of antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Escherichia coli by using bioautography method. Scaling up cultivation of GKBt 2 in 5 L PDB yielded 830 mg ethyl acetat exctract of media. Fractionation and purification of bioactive compound which was performed by using column chromatography and preparative thin layer chromatography produced two fractions, they are F.58a (4,5 mg) and F.58b (5 mg). Fractions F.5.8.a and F.5.8b showed antibacterial activities against S. aureus with Minimum Inhibitory Concentration (MIC) value is 256 µg/ml respectively whereas the MIC value of the fractions against E. coli is 128 µg/ml. Keywords : Ginseng Kuning, Rennellia elliptica Korth, endophytic fungi, antibacterial activity, GKBt 2 fungi, active fraction.

viii

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmanirrahiim.

Alhamdulillah, puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala

rahmat dan anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan

penelitian dan penulisan skripsi ini. Shalawat beriring salam atas

junjungan besar Nabi Muhammad SAW yang telah memberikan petunjuk

kebenaran sebagai rahmat sekalian alam

Skripsi dengan judul “Skrining, Isolasi, dan Uji Aktivitas

Antibakteri Metabolit Bioaktif Jamur Endofit dari Tumbuhan Ginseng

Kuning (Rennellia elliptica Korth)” ini disusun untuk memenuhi salah satu

syarat memperoleh gelar sarjana farmasi di Program Studi Farmasi,

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

Penulis menyadari bahwa tanpa adanya bantuan dan bimbingan

dari banyak pihak, penelitian dan penyelesaian skripsi ini akan dirasakan

sulit. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Bapak Dr. Andria Agusta selaku pembimbing pertama dan Ibu Prof. Dr.

Atiek Soemiati, M.Si, Apt selaku pembimbing kedua yang senantiasa

memberikan arahan, dukungan, semangat, saran dan solusi selama

melaksanakan penelitian dan penyelesaian skripsi ini. Semoga Allah

membalas jasa Bapak dan Ibu dengan sebaik-baiknya balasan.

2. Kementrian Agama RI selaku pemberi beasiswa, sehingga penulis dapat

menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas kedokteran

dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta.

3. Prof. Dr. (hc) dr. M.K. Tadjudin, Sp. And. selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

4. Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta.

ix

5. Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan

bimbingan dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program

Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

6. Ibu Dr. Praptiwi, Ibu Yuliasri Jamal, M.Sc., Mas Toni, Teh Dewi, Pak

Asep, Pak Lukman beserta staf lain dari Lab Biosains Bidang Botani

Puslit LIPI Cibinong yang telah banyak membantu selama penelitian

7. Ayahanda Abdul Jalil AR dan Ibunda Rohani, yang tiada jemu

memberikan doa, dukungan, dan nasihat. Keluarga besar Kak Nia, Kak

Eli, Kak Indah, Bang Di, Bang Wan, Bang Rus dan Bang Yon yang

selalu memberikan motivasi dan kebahagiaan dalam kehidupan ini.

8. Nurul Robiatul Adawiyah, sahabat, kakak, dan teman berbagi duka dan

suka yang selalu memberikan keceriaan.

9. Rekan-rekan CSS MoRA 2009 (Community Santri Scholar of Ministry

of Religious Affair), teman-teman Farmasi 2009, teman-teman IMAPA,

terkhusus untuk sahabat-sahabat terbaik Dian, Mayra, Tika, Rya, Kak

ya, Kak Ki, Amah, Elia, Susi, Fina, Leli, Nuyung, Feri, Zaki, Ema,

Neneng, Yunita, Dyah, Cucut yang selalu menyemangatiku ketika

lelah dan menjadi motivator bagiku.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam

penulisan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis sangat berterimakasih

terhadap adanya kritik dan saran yang membangun sehingga skripsi ini

bisa menjadi lebih baik lagi.

Saya berharap semoga skripsi ini bermanfaat dan dapat menjadi

sumbangan pengetahuan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran

dan Ilmu kesehatan khususnya, Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta dan pembaca pada umumnya.

Ciputat, 2 Oktober 2013

Penulis

x

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : Ainul Mardiah

NIM : 109102000046

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah

saya, dengan judul :

SKRINING, ISOLASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI

METABOLIT BIOAKTIF JAMUR ENDOFIT DARI TUMBUHAN

GINSENG KUNING (Rennellia elliptica Korth.)

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada tanggal : 2 Oktober 2013

Yang menyatakan,

(Ainul Mardiah)

xi

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .......................................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................. iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. iv

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ v

ABSTRAK ........................................................................................................... vi

ABSTRACT ........................................................................................................ vii

KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ........................ x

DAFTAR ISI ....................................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii

DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xv

BAB 1 PENDAHULUAN .................................................................................. 1

1.1 Latar Belakang Masalah .................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ............................................................................. 3

1.3 Hipotesis ............................................................................................. 3

1.4 Tujuan Penelitian................................................................................ 3

1.5 Manfaat Penelitian.............................................................................. 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 5

2.1 Jamur Endofit .................................................................................... 5

2.2 Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.) .................. 7

2.3 Antimikroba ...................................................................................... 9

2.4 Uji Aktivitas Antimikroba .................................................................. 10

2.5 Kromatografi ...................................................................................... 15

2.6 Bakteri Gram Positif dan Negatif ...................................................... 21

2.7 Bakteri Uji ......................................................................................... 22

BAB 3 METODE PENELITIAN ...................................................................... 24

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................... 24

3.2 Alat dan Bahan .................................................................................. 24

Halaman

xii

3.3 Tahapan Penelitian ............................................................................ 26

3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Skrining Produksi Metabolit Sekunder ................................. 26

3.4.2 Uji Aktivitas Antibakteri ......................................................... 27

3.4.3 Scaling Up Kultivasi Jamur GKBt 2 ...................................... 29

3.4.4 Ekstraksi Kultur Jamur hasil Scaling Up .............................. 30

3.4.5 Fraksinasi Metabolit Ekstrak Etil Asetat GKBt 2 ................. 31

3.4.6 Uji Aktivitas Antibakteri Hasil Purifikasi ............................. 32

3.4.7 Pengamatan Morfologi Jamur Endofit GKBt 2 ...................... 35

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 36

4.1 Skrining Bioproduksi Metabolit Sekunder ......................................... 36

4.2 Uji Aktivitas Antibakteri .................................................................. 38

4.3 Scaling Up Kultivasi Jamur Endofit GKBt 2 .................................... 42

4.4 Ekstraksi Kultur Jamur Endofit Hasil Scalling Up ............................ 43

4.5 Fraksinasi Metabolit Ekstrak Etil Asetat GKBt 2 .............................. 45

4.6 Uji Aktivitas Antibakteri Hasil Purifikasi .......................................... 48

4.7 Pengamatan Morfologi Jamur Endofit GKBt 2.................................. 50

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 53

5.1 Kesimpulan ........................................................................................ 53

5.2 Saran .................................................................................................. 53

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 54

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth) .................. 7

Gambar 2.2. Klasifikasi metode uji antimikroba ................................................. 12

Gambar 4.1. Hasil skrining bioproduksi metabolit sekunder ekstrak ................... 37

Gambar 4.2. Hasil skrining antibakteri ekstrak etil asetat ................................... 39

Gambar 4.3. Hasil bioautografi antibakteri elusi ekstrak etil asetat GKBt 2 ........ 42

Gambar 4.4. Hasil KLT ektstrak GKBt 2 hasil Scaling Up .................................. 44

Gambar 4.5. Hasil fraksinasi fraksi F.5................................................................. 46

Gambar 4.6. Noda bercak pada preparatif setelah dielusi .................................... 46

Gambar 4.7. Hasil KLT preparatif fraksi murni ................................................... 47

Gambar 4.8. Hasil KLT 2 dimensi fraksi murni ................................................... 48

Gambar 4.9. Pengamatan morfologi jamur endofit GKBt 2 ................................. 51

Halaman

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1. Rangkuman jenis kromatografi ..................................................... 16

Tabel 2.2. Ciri bakteri gram positif dan gram negatif .................................... 21

Tabel 3.1. Data 23 isolat jamur endofit tumbuhan Ginseng Kuning ............. 25

Tabel 4.1. Bobot 23 ekstrak etil asetat isolat jamur endofit ............................36

Tabel 4.2. Diameter zona hambat hasil uji aktivitas antibakteri .....................40

Tabel 4.3. Data hasil uji MIC terhadap bakteri uji ..........................................49

Halaman

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Alur Penelitian ........................................................................... 58

Lampiran 2. Bagan Kerja Uji Aktivitas Antibakteri ...................................... 59

Lampiran 3. Bagan kerja Scaling up dan ektraksi hasil scalling up .............. 60

Lampiran 4. Bagan kerja fraksinasi ................................................................61

Lampiran 5. Perhitungan koloni bakteri uji ................................................... 62

Lampiran 6. Skema pengenceran larutan uji ...................................................63

Lampiran 7. Hasil Uji MIC .............................................................................64

Lampiran 8. Hasil pewarnaan gram bakteri uji ...............................................65

Lampiran 9. Komposisi Media ........................................................................66

Lampiran 10. Alat dan Bahan yang digunakan ...............................................69

Halaman

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Semakin meningkatnya laju pertumbuhan masyarakat, kebutuhan

akan senyawa baru yang berguna untuk memperbaiki dan mengobati

kondisi masyarakat dalam aspek kesehatan semakin meningkat

(Strobel & Daisy, 2003). Kondisi masyarakat yang dimaksud adalah

semakin meningkatnya kasus infeksi terhadap penyakit yang disebabkan

oleh virus, jamur, dan juga bakteri.

Kasus infeksi merupakan salah satu masalah kesehatan terbesar

yang tidak saja terjadi di Indonesia, tapi juga di seluruh dunia

(Mardiastuti, et al., 2007). Untuk itu, salah satu penatalaksanaan bagi

penderita penyakit infeksi adalah melalui pengobatan menggunakan

antibiotik. Namun seiring dengan meluasnya penggunaan antibiotik,

timbul masalah baru yaitu meningkatnya resistensi bakteri terhadap obat

antibakteri (Mardiastuti, et al., 2007).

Resistensi bakteri terhadap obat antibakteri merupakan masalah

yang serius di bidang kesehatan dan telah menjadi perhatian masyarakat

global. Sehingga pencarian obat antibakteri baru, menjadi penting dan

semakin berkelanjutan (Liang, et al., 2012). Berbagai penelitian telah

dilakukan untuk mengisolasi metabolit yang aktif sebagai antibakteri,

termasuk yang bersumber dari mikroba endofit.

Mikroba endofit merupakan mikroorganisme yang berada dalam

jaringan tanaman hidup dan merupakan produk alam baru yang potensial

untuk dieksploitasi di bidang kedokteran, pertanian, dan industri

(Strobel & Daisy, 2003). Mikroba endofit menyediakan cadangan yang

melimpah terhadap metabolit bioaktif untuk eksploitasi obat

(Liang, et al., 2012).

Produk alami yang dihasilkan oleh mikroba endofit umumnya

diperoleh untuk menghambat atau membunuh sejumlah besar dari agen

yang membahayakan termasuk agen penyebab penyakit, yang tidak

2


terbatas pada fitopatogen, tetapi juga terhadap bakteri, fungi, virus, dan

protozoa yang menyerang hewan atau tumbuhan (Strobel & Daisy, 2003).

Pada kebanyakan kasus, hubungan endofit dengan tanaman inang adalah

simbiosis dan mungkin mutualistik. Banyak yang mampu mensintesis

senyawa bioaktif yang dapat digunakan oleh tanaman untuk pertahanan

terhadap jamur dan bakteri (Nithya & Muthumary, 2011).

Sejak berhasil ditemukannya senyawa "emas" paclitaxel dari jamur

endofit Taxomyces andreanae pada tahun 1993, banyak ilmuwan yang

semakin berminat untuk mempelajari jamur endofit sebagai produsen yang

potensial untuk menghasilkan senyawa bioaktif baru. Selama dua dekade

terakhir, banyak senyawa bioaktif yang bernilai dengan berbagai aktivitas

ditemukan, seperti sebagai antimikroba, insektisida, sitotoksik, dan anti

kanker yang telah berhasil ditemukan pada jamur endofit

(Zhang, et al., 2006 dalam Zhao, et al., 2010).

Salah satu kekayaan alam di Indonesia adalah Ginseng Kuning atau

Rennellia elliptica. Rennellia merupakan genus asli Asia Tenggara yang

pertama kali ditemukan oleh Korthals pada tahun 1851. Tercatat ada dua

spesies Rennellia dari Sumatra, yaitu R. elliptica Korth. dan R. ovalis

Korth. Hingga sekarang, variasi dan distribusi dari spesies Rennellia di

Indonesia belum lengkap diketahui (Suratman, 2008).

Hasil dekok dari akar R.elliptica digunakan oleh masyarakat lokal

untuk bermacam kegunaan, termasuk sebagai aprodisiak, nyeri badan dan

kejang setelah melahirkan. Sebuah studi awal oleh Yusoff, et al., (2010)

melaporkan bahwa terdapatnya antrakuinon pada akar tumbuhan

R.elliptica (Osman, et al., 2010). Pada tahun 2010, Osman melaporkan

bahwa adanya aktivitas antiplasmodik pada ekstrak diklorometan dari akar

R.elliptica yang ditunjukkan dengan kemampuannya menghambat

Plasmodium falciparum (Osman, et al., 2010) serta telah diketahui adanya

aktivitas antioksidan dari ekstrak metanol tanaman R.elliptica

(Ahmad, et al., 2010).

Sejauh ini, belum ditemukan adanya studi yang terfokus pada

aktivitas antibakteri yang terdapat dalam ekstrak jamur endofit pada

3


tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.). Oleh karena itu,

penelitian ini bertujuan untuk melakukan skrining dan isolasi metabolit

bioaktif jamur endofit yang terdapat pada tumbuhan Ginseng Kuning

(Rennellia elliptica Korth.) sebagai antibakteri.

1.2. Rumusan Masalah

1. Adakah diantara 23 ekstrak jamur endofit yang diisolasi dari tumbuhan

Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.) yang menunjukkan

aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan

Escherichia coli?

2. Berapakah nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dari metabolit

bioaktif yang diisolasi dari jamur terpilih ?

1.3. Hipotesis

Metabolit bioaktif jamur endofit yang diisolasi dari jamur endofit

yang diisolasi dari tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.)

mempunyai aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji Staphylococcus

aureus dan Escherichia coli.

1.4. Tujuan Penelitian

1. Untuk melakukan skrining aktivitas antibakteri metabolit bioaktif

jamur endofit yang diisolasi dari tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia

elliptica Korth.) terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan

Escherichia coli.

2. Untuk melakukan isolasi metabolit dari jamur terpilih yang memiliki

aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus dan

Escherichia coli.

3. Untuk melakukan penentuan nilai Konsentrasi Hambat Minimum

(KHM) terhadap hasil isolasi metabolit bioaktif dari jamur terpilih

terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.

4


1.5. Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah untuk memperoleh informasi

terkait aktivitas antibakteri dari jamur endofit yang diisolasi dari tumbuhan

Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.) sebagai wujud pemanfaatan

sumber daya alam dalam usaha mendapatkan sumber obat baru yang

bermanfaat bagi ilmu pengetahuan.


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Jamur Endofit

Endofit adalah mikroba yang mendiami biotop yaitu tumbuhan

tingkat tinggi, yang baru-baru ini dianggap sebagai sumber metabolit

sekunder yang menawarkan potensi di bidang kesehatan, agrikultural dan

industri. Endofit mampu hidup pada variasi suhu yang luas, dengan suhu

optimum yang biasanya tampak pada suhu 20 0C dan 26 0C

(Labeda, 1990).

Baru-baru ini endofit dianggap dapat menjadi sumber utama dalam

produk bioaktif alami karena banyak endofit yang menduduki jutaan

tumbuhan tingkat tinggi (Strobel & Daisy, 2003). Bukti adanya kaitan

tanaman dengan mikroba yang ditemukan dalam jaringan fosil batang dan

daun menunjukkan bahwa asosiasi endofit mungkin telah berevolusi dari

waktu dimana tumbuhan tingkat tinggi pertama kali muncul di bumi,

ratusan juta tahun yang lalu (Bacon & White, 2000 dalam Zhao, et al.,

2010).

Jamur endofit merupakan kombinasi antara jamur dan tumbuhan

dimana jamur hidup secara sistematik dan umumnya berada di dalam

tumbuhan (Labeda, 1990). Sebagai sumber daya yang baru dan melimpah,

jamur endofit memiliki kemampuan khusus untuk menghasilkan senyawa

yang serupa dengan senyawa yang berasal dari tanaman inangnya, serta

senyawa bioaktif lainnya (Zhao, et al., 2010).

Karena jumlah spesies tumbuhan di dunia begitu besar, perlu

diketahui strategi tertentu untuk mempermudah pencarian endofit yang

memiliki bioaktivitas (Strobel & Daisy, 2003). Beberapa hipotesis yang

masuk akal sebagai strategi pemilihan tanaman yang dapat

dipertimbangkan untuk mendapatkan jamur endofit yang memiliki

bioaktivitas adalah sebagai berikut (Strobel & Daisy, 2003) :

a. Tanaman dari keadaan lingkungan yang unik, terutama dengan kondisi

biologi yang tidak biasa.

6


b. Tanaman yang memiliki sejarah ethnobotanical (digunakan oleh

masyarakat) yang berhubungan dengan penggunaan atau aplikasi

tertentu merupakan hal menarik untuk diteliti. Tanaman ini dipilih baik

secara kontak langsung dengan masyarakat lokal atau melalui literatur.

c. Tanaman yang endemik, yang memiliki umur tanaman yang tidak biasa.

d. Tanaman yang tumbuh di daerah keanekaragaman hayati yang besar.

Selama periode panjang ko-evolusi, jamur endofit telah beradaptasi

dalam micro environments khusus secara bertahap dengan berbagai variasi

genetik, termasuk penyerapan dari beberapa segmen DNA tanaman ke

dalam genom jamur, serta penyisipan segmen DNA jamur ke dalam

genom inang. Hal ini bisa menyebabkan endofit tertentu memiliki

kemampuan untuk mensintesis beberapa "phytochemical" yang berasal

dari tumbuhan inangnya (Zhang, et al., 2006 dalam Zhao, et al., 2010).

2.1.1 Kultivasi Endofit

Dalam dua dekade terakhir, para ilmuwan fokus melakukan

penyelidikan terutama tentang keanekaragaman jamur endofit, hubungan

antara jamur endofit dan tanaman inangnya, pencarian senyawa bioaktif

alami yang berasal dari jamur endofit, dan peningkatan produktivitas dari

beberapa kandidat yang potensial dengan pemanfaatan rekayasa genetika,

proyek fermentasi mikroba dan langkah-langkah lainnya (Strobel & Daisy,

2004 dalam Zhao, et al., 2010).

Dibandingkan dengan media kultur untuk sel tanaman, media

kultur untuk sel jamur lebih sederhana, murah dengan persediaan yang

melimpah, dan biaya produksi yang relatif rendah. Selain itu, periode

fermentasinya cenderung singkat, proses fermentasi mikroba dapat

memberikan kondisi pertumbuhan dan pemeliharaan yang baik dan

parameter dalam berbagai kultur dapat dikontrol sesuai dengan keinginan

(Zhao, et al., 2010).

7


2.2 Tumbuhan Ginseng Kuning / Rennellia elliptica Korth

2.2.1 Klasifikasi Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica

Korth)

Kingdom : Plantae

Filum : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Ordo : Rubiales

Family : Rubiaceae

Genus : Rennellia

Spesies : Rennellia elliptica

(Species 2000 & ITIS Catalogue of Life, 2012).

2.2.2 Morfologi

Kayu kecil atau belukar, tinggi 1,5-2 m; batang lignosus; daun

ellips, panjang 8-23 cm, warna hijau pucat–hijau gelap, halus; petiolus

panjang; infloresens terminal; bunga berwarna putih atau ungu tua, sangat

wangi, pembuluh korola berwarna ungu; infructescence terminal; buah

bundar, berwarna hijau (Suratman, 2008).

Gambar 2.1. Tumbuhan Ginseng Kuning / Rennellia elliptica Korth.

(Ismail, et al., 2012)

Rennellia merupakan genus asli Asia Tenggara, Rennellia pertama

kali ditemukan oleh Korthals (1851) didasarkan atas nama dari seorang

ahli kelautan inggris J.Rennell (1742-1830). Dia mencatat ada dua spesies

Rennellia dari Sumatra, yaitu R. Elliptica dan R. ovalis (Suratman, 2008).

8


2.2.3 Distribusi

Di Indonesia, spesies ini berasal dari Borneo, Sumatra Utara,

Sumatra Barat dan Sumatra Selatan (Suratman, 2008).

2.2.4 Habitat dan Ekologi

Ditemukan di sepanjang tepian sungai atau hutan dataran rendah,

pada ketinggian 40-650 m diatas permukaan laut (Suratman, 2008).

2.2.5 Nama Daerah

Ginseng Kuning, Jarum-Jarum Betina, Kayu Kuni, Kayu Kemik

(Minangkabau) (Suratman, 2008).

2.2.6 Kegunaan

Hasil dekok dari akar R.elliptica digunakan oleh masyarakat lokal

untuk bermacam kegunaan, termasuk sebagai aprodisiak, nyeri badan,

post tonik natal. Dalam penelitian ilmiah diketahui bahwa adanya aktivitas

antiplasmodik pada ekstrak diklorometan dari akar R. elliptica yang

ditunjukkan dengan kemampuannya menghambat Plasmodium falciparum

(Osman, et al., 2010) dan adanya aktivitas antioksidan dari ekstrak

metanol tanaman R. elliptica (Ahmad, et al., 2010).

2.2.7 Kandungan Senyawa

Uji fitokimia yang dilakukan menemukan bahwa tumbuhan ini

mengandung 1,2- dimetoksi-6-metil-9,10-antrakuinon (Osman,

et al., 2010), nordamnakantal, 2-formil-3-hidroksi-9,10-antrakuinon,

damnakantal, 1-hidroksi-2-metoksi-6-metil-9,10-antrakuinon, lusidin-ω-

metil eter, 3- hidroksi -2-metoksi-6-metil-9,10-antrakuinon, rubiadin , 3-

hidroksi -2- metil-9,10-antrakuinon, rubiadin-1-metileter dan 3-hidroksi-2-

hidroksimetil-9,10-antrakuinon (Ismail, et al., 2012).

9


2.3 Antimikroba

Antimikroba ialah obat pembasmi mikroba khususnya mikroba

yang merugikan manusia. Obat yang digunakan untuk membasmi mikroba

penyebab infeksi pada manusia ditentukan harus memiliki toksisitas

selektif setinggi mungkin. Artinya, obat itu haruslah bersifat sangat toksik

untuk mikroba tetapi relatif tidak toksik pada hospes (Setiabudy, 2007).

Obat-obat antimikroba efektif dalam pengobatan infeksi karena

toksisitas selektifnya, kemampuan obat tersebut membunuh

mikroorganisme yang menginvasi penjamu tanpa merusak sel. Pada

kebanyakan kasus, toksisitas lebih relatif daripada absolut, yang

memerlukan kontrol konsentrasi obat secara hati-hati untuk menyerang

mikroorganisme sehingga dapat ditolerir oleh tubuh. Terapi antimikroba

mempunyai keuntungan dengan adanya perbedaan biokimia yang timbul

antara mikroorganisme dan manusia (Mycek, et al., 2001).

Antibiotik ialah zat yang dihasilkan oleh suatu mikroba, terutama

fungi, yang dapat menghambat atau membasmi mikroba jenis lain. Banyak

antibiotik dewasa ini dibuat secara semi sintetik atau sintetik penuh.

Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antimikroba yang bersifat

menghambat pertumbuhan mikroba, dikenal sebagai aktivitas

bakteriostatik; dan ada yang bersifat membunuh antimikroba, dikenal

sebagai aktivitas bakterisid. Kadar minimal yang diperlukan untuk

menghambat pertumbuhan mikroba atau membunuhnya, masing-masing

dikenal dengan kadar hambat minimal (KHM) dan kadar bunuh minimal

(KBM). Antimikroba tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari

bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar antimikrobanya ditingkatkan

melebihi KHM (Setiabudy R, 2007).

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antimikroba dibagi dalam 5

kelompok (Setiabudy R, 2007), yaitu :

a. Antimikroba yang mengganggu metabolisme sel mikroba.

Antimikroba yang termasuk dalam kelompok ini adalah sulfonamid,

trimetropim, asam p-aminosalisilat (PAS) dan sulfon. Mikroba

membutuhkan asam folat untuk kelangsungan hidupnya, mikroba

10


mensintesis sendiri asam folat dari asam amino benzoat (PABA) untuk

kebutuhan hidupnya. Bila antimikroba menang bersaing dalam

pembentukan asam folat, maka terbentuk analog asam folat yang

nonfungsional. Akibatnya, kehidupan mikroba akan terganggu.

b. Antimikroba yang menghambat sintesis dinding sel mikroba.

Obat yang termasuk kedalam kelompok ini adalah penisilin,

sefalosporin, basitrasin, vankomisin, dan sikloserin.

c. Antimikroba yang mengganggu keutuhan membran sel mikroba.

Obat yang termasuk ke dalam kelompok ini adalah polimiksin,

golongan polien, serta berbagai antimikroba kemoteurapetik. Kerusakan

membran sel menyebabkan keluarnya berbagai komponen penting dari

dalam sel mikroba yaitu protein, asam nukleat, nukleotida dan lain-lain.

d. Antimikroba yang menghambat sintesis protein sel mikroba.

Obat yang termasuk dalam golongan ini adalah golongan

aminoglikosida, makrolid, linkomisin, tetrasiklin dan kloramfenikol.

Sintesis protein berlangsung di ribosom, dengan bantuan tRNA dan

mRNA. Pada bakteri, ribosom terdiri dua unit (30S dan 50S). Misalnya,

streptomisin berikatan dengan komponen ribosom 30S dan

menyebabkan kode pada mRNA salah dibaca oleh tRNA, akibatnya

terbentuk protein yang abnormal dan nonfungsional bagi sel mikroba.

e. Antimikroba yang menghambat sintesis asam nukleat sel mikroba.

Antimikroba yang termasuk dalam kelompok ini adalah rifampisin dan

golongan kuinolon.

2.4 Uji Aktivitas Antimikroba

Metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi aktivitas

antimikroba dalam produk alam terbagi menjadi tiga kelompok, yaitu

metode bioautografi, difusi,dan dilusi. Metode bioautografi dan difusi

dikenal sebagai tehnik kualitatif karena metode ini hanya memberikan

informasi mengenai ada atau tidaknya aktivitas antimikroba dalam suatu

sampel uji. Sedangkan metode dilusi merupakan tehnik kuantitatif yang

dapat digunakan untuk mengukur Konsentrasi Hambat Minimum / KHM

11


(Vanden & Vlientink, 1991 dalam Valgas, et al., 2007). Klasifikasi metode

uji antimikroba dapat dilihat pada gambar 2. 3.

2.4.1 Metode Difusi

Metode difusi sering digunakan untuk uji antimikroba yang rentan

terhadap senyawa murni, senyawa polar ataupun non polar (Steward, et

al., 1999 dalam Choma & Grzelak, 2010). Pada prosedur ini, kertas filter

cakram (kira-kira berdiameter 6 mm), berisi senyawa uji yang ditempatkan

pada permukaan yang sebelumnya telah diinokulasi dengan mikroba uji.

Agen antimikroba akan berdifusi ke dalam agar dan menghambat

pertumbuhan dari mikroba uji. Cawan petri diinkubasi dan zona inhibisi

diukur. Pada metode silinder, silinder dari stainless steel atau porcelin

dengan ukuran yang seragam (biasanya 8mm x 6 mm x 10 mm)

ditempatkan diatas agar terinokulasi didalam cawan petri, dan diisi dengan

sampel dan standar. Setelah diinkubasi, silinder dipindahkan dan zona

inhibisi yang terbentuk diukur (Choma & Grzelak, 2010).

Pada uji menggunakan hole-plate, beberapa milimiter lubang digali

pada permukaan agar yang diinokulasi dan kemudian diisi sampel. Larutan

senyawa uji akan berdifusi kedalam medium agar dan menghambat

pertumbuhan organisme. Cawan petri dibiarkan pada suhu ruangan untuk

proses inkubasi. Kemudian, zona hambat yang terbentuk diukur

(Shitandi, et al., 2005 dalam Choma & Grzelak, 2010).

12


Gambar 2.2 Klasifikasi metode uji antimikroba (Choma & Grzelak, 2010).

2.4.2 Metode Dilusi

Metode ini memiliki kemampuan untuk mengukur KHM ( Kadar

Hambat Minimum) dan KBM (Kadar Bunuh Minimum) (Pratiwi, 2008).

Dua jenis metode dilusi adalah dilusi agar dan pengenceran tabung

(Choma & Grzelak, 2010). Pratiwi (2008) membedakan metode dilusi

menjadi dilusi cair (serial dilution) dan dilusi padat. Pada dilusi cair,

dibuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang

ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar

terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji

Bioauto

grafi

Metode dilusi

Klasifikasi metode dalam skrining aktivitas antimikroba

Metode difusi

Cakram

Silinder

Hole-plate assay

Dilusi Agar

Pengenceran Tabung

Kontak

Imersi / overlay

Langsung

13


ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM dikultur

ulang tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan

diinkubasi selama 18–24 jam pada suhu 37 0C. Media cair yang terlihat

tetap jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM (Pratiwi, 2008).

Metode dilusi padat serupa dengan metode dilusi cair tapi

menggunakan media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu

konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji

beberapa mikoba uji (Pratiwi, 2008).

2.4.3 Bioautografi

Prosedur menggunakan metode bioautografi hampir sama dengan

prosedur pada metode difusi. Perbedaannya bahwa senyawa uji berdifusi

ke medium agar dari kromatografi, yang mengandung adsorben atau kertas

(Meyers, et al., 1964 dalam Choma & Grzelak, 2010).

Bioautografi adalah suatu teknik laboratorium untuk mendeteksi

zat yang mempengaruhi tingkat pertumbuhan organisme uji dalam

campuran yang kompleks dan matriks (Choma, 2005). Metode

bioautografi merupakan metode sederhana yang digunakan untuk

menunjukkan adanya aktivitas antibakteri atau antikapang. Metode ini

menggabungkan penggunaan tehnik kromatografi lapis tipis dengan

respons dari mikroorganisme yang diuji berdasarkan aktivitas biologi dari

suatu analit yang dapat berupa anti bakteri, anti kapang dan anti protozoa

(Kusumaningtyas, et al., 2008).

Bidang utama yang digunakan dalam bioautografi adalah (Choma,

2005) :

a. Mencari zat antibiotik dan anti jamur baru, antitumor, dan senyawa

antiprotozoa dengan mempelajari aktivitas biologis zat yang berasal

dari tanaman, mikroorganisme atau kimia kombinatorial

b. Penyelidikan antibiotik dan senyawa biologis aktif lainnya dalam air

limbah, air minum, cairan tubuh, pakan, dan makanan

c. Kontrol kualitas obat-obatan antibiotik

14


d. Mencari senyawa antimikroba yang efektif melawan bakteri dan jamur

patogen pada tanaman

e. Deteksi dan penentuan racun (misalnya, aflatoksin) atau senyawa

fototoksik (misalnya, furokumarin).

Metode bioautografi dibagi menjadi tiga kategori (Choma, 2005):

a. Bioautografi Kontak atau Difusi Agar

b. Imersi atau Bioautografi Agar Overlay

c. Bioautografi Langsung.

2.4.3.1 Bioautografi kontak atau Difusi Agar

Bioautografi kontak dilakukan dengan meletakkan lempeng

kromatogram hasil eluasi senyawa yang akan diuji di atas media padat

yang sudah diinokulasi dengan mikroba uji. Adanya senyawa antimikroba

ditandai dengan adanya daerah jernih yang tidak ditumbuhi anti mikroba

(Kusumaningtyas, et al., 2008).

Pada bioautografi kontak, terjadi difusi senyawa antimikroba dari

pelat atau kertas KLT ke agar yang diinokulasi bakteri uji

(Meyers, et al., 1964 dalam Choma, 2005). Kromatogram ditempatkan

menghadap ke bawah lapisan agar yang diinokulasi bakteri dan dibiarkan

beberapa menit atau beberapa jam untuk memungkinkan difusi.

Kromatogram kemudian dipindahkan dan kemudian diinkubasi

(Choma, 2005).

Zona hambat diamati pada permukaan agar di tempat dimana agen

antimikroba menempel dengan agar. Metode ini menyerupai metode

cakram. Kelemahan dari bioautografi kontak ini adalah kesulitannya dalam

memperoleh kontak yang lengkap antara agar dan lempeng uji serta daya

adsorben terhadap permukaan agar (Choma, 2005).

2.4.3.2 Imersi atau Bioautografi Agar Overlay

Dalam bioautografi imersi, kromatogram ditutupi dengan media

agar cair. Setelah pemadatan, inkubasi dan pewarnaan (biasanya dengan

garam tetrazolium), pita penghambatan atau pertumbuhan divisualisasikan

15


(Nicolaus, 1961 dalam Choma, 2005). Terkadang, sebelum proses

inkubasi, pelat dibiarkan selama beberapa jam pada suhu rendah untuk

memungkinkan difusi. Tehnik agar overlay merupakan gabungan dari

bioautografi kontak dan langsung (Choma, 2005).

Antimikroba ditransfer dari pelat KLT ke lapisan agar seperti

dalam uji kontak tetapi selama inkubasi dan visualisasi lapisan agar tetap

berada pada plate seperti dalam bioautografi langsung. Dibandingkan

dengan metode bioautografi langsung, kerugian utama dari metode ini

adalah sensitivitas yang lebih rendah disebabkan oleh cairan antibakteri

dalam lapisan agar. Metode agar overlay biasanya disarankan bila

bioautografi langsung mustahil dilakukan (Choma, 2005).

2.4.3.3 Bioautografi Langsung

Dalam bioautografi langsung, pelat dicelupkan dalam suspensi

mikroorganisme yang tumbuh dalam kaldu yang cocok atau suspensi

disemprotkan ke pelat (Homans, 1970 dalam Choma, 2005). Pelat

diinkubasi dan mikroorganisme tumbuh langsung di atasnya. Oleh karena

itu, pemisahan, prakondisi, inkubasi dan visualisasi yang dilakukan

langsung di plate. Untuk lokasi dan visualisasi aktivitas antibakteri, garam

tetrazolium biasanya digunakan, yang dikonversi oleh adanya aktivitas

enzim dehidrogenase pada mikroorganisme hidup mereduksi tetrazolium

menjadi zat yang berwarna intens/ ungu, formazan (Choma, 2005). Jika

aktivitas antimikroba pada pelat KLT aktif membunuh bakteri, maka tidak

terjadi pembentukan warna dan terbentuk zona penghambatan yang

berwarna pucat pada latar yang berwarna ungu. Pewarna tetrazolium yang

paling sering digunakan adalah 3-{4,5-Dimetiltiazol-2-il} -2,5-

difeniltetrazoliumbromida, disebut MTT (Choma, 2005).

2.5 Kromatografi

Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani

Rusia Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen

berwarna dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter

16


dalam kolom gas yang berisi kalsium karbonat (Gandjar & Rohman,

2007). Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, dimana

komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan diantara dua fase,

salah satu fase tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan

yang luas, dan fase lain sebagai fluida yang mengalir di sepanjang

landasan stasioner (Day & Underwood, 2002).

Fase stasioner bisa berupa padatan maupun cairan, sedangkan fase

bergerak bisa berupa cairan maupun gas. Empat kategori kromatografi

berdasakan fase stasioner dan fase bergerak Tabel 2.1

Tabel 2.1. Rangkuman jenis Kromatografi

Fase

Stasioner

PADAT CAIR

Fase

Bergerak

Cair Gas Cair Gas

Contoh-

contoh

Kromatografi

asli Tswett,

dengan

larutan

petroleum

eter dan

kolom

CaCO3

Kromatografi

gas-padat,

atau GSC

Kromatografi

partisi pada

kolom silica

gel

Kromatografi

Gas Cair atau

GLC

Kromatografi

pertukaran

ion

Kromatografi

Kertas

Menurut Gandjar & Rohman (2007), Kromatografi dapat

dibedakan atas berbagai macam tergantung pengelompokannya.

Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan

menjadi : a)kromatografi adsorbsi; b) kromatografi partisi; c) kromatografi

pasangan ion; d) kromatografi penukar ion; e) kromatografi eksklusi

ukuran; dan f) kromatografi afinitas (Gandjar & Rohman, 2007).

17


Dalam semua tehnik kromatografi, zat-zat terlarut yang dipisahkan

bermigrasi sepanjang kolom dan tentu saja dasar pemisahan terletak dalam

laju perpindahan yang berbeda untuk larutan yang berbeda

(Day & Underwood, 2002).

2.5.1 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan

Schraiber pada tahun 1938. Kromatografi lapis tipis merupakan bentuk

kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Fase

gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang

fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik

(ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara

menurun (descending) (Gandjar & Rohman, 2007).

Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih

sederhana dan dapat dikatakan bahwa hampir semua laboratorium dapat

melaksanakan setiap saat secara cepat (Gandjar & Rohman, 2007).

Beberapa keuntungan lain dari kromatografi lapis tipis adalah

(Gandjar & Rohman, 2007):

a. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis

b. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi

warna, flouresensi, atau radiasi dengan sinar ultraviolet

c. Dapat dilakukan eluasi secara menaik (Ascending), menurun

(descending) atau dengan cara elusi 2 dimensi.

d. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang

akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

Fase diam pada KLT dapat berupa lapisan yang seragam (uniform)

pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat

aluminium, atau pelat plastik (Gandjar & Rohman, 2007). Fase diam yang

digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan

diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel

fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin

baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya. Penjerap yang

18


paling sering digunakan adakah silika dan serbuk selulosa, sementara

mekanisme sorpsi yang utama dalam KLT adalah adsorpsi dan partisi

(Gandjar& Rohman, 2007).

Pada fase gerak dalam KLT, sistem yang paling sederhana ialah

campuran dua pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut

ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi

secara optimal. Beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase

gerak adalah sebagai berikut (Gandjar & Rohman, 2007) :

1. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT

merupakan tehnik yang sensitif

2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf

antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.

3. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika

gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang

berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat

sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil

benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.

4. Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran

pelarut sebagai fase geraknya. Penambahan sedikit asam etanoat atau

amonia masing-masing akan meningkatkan solut solut yang bersifat

basa dan asam.

Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan

diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan

sesempit mungkin. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan

bercak yag menyebar dan pucak ganda. Untuk memperoleh

reprodusibilitas, volume sampel yang akan ditotolkan paling sedikit 0,5 μl.

Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10 μl maka

penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan

antar totolan (Gandjar & Rohman, 2007).

Media pemisahannya adalah lapisan kaca dengan ketebalan sekitar

0,1 sampai 0,33 mm zat padat adsorben pada lempeng kaca, plastik, atau

aluminium. Lempeng yang paling umum digunakan berukuran 8 x 12 inchi

19


dan zat padat yang umumnya digunakan adalah alumina, gel silika, dan

selulosa (Day & Underwood, 2002).

Sampel yang biasanya berupa campuran senyawa organik

diteteskan di dekat salah satu sisi lempengan dalam bentuk larutan dalam

jumlah kecil, biasanya beberapa mikrogram senyawa. Sebuah suntikan

hipodermik atau sebuah pipet gelas kecil dapat digunakan. Noda sampel

dikeringkan dan kemudian sisi lempengan tersebut dicelupkan ke dalam

fase gerak yang sesuai. Pelarut bergerak naik di sepanjang lapisan tipis zat

padat di atas lempengan, dan bersamaan dengan pergerakan pelarut

tersebut, zat terlarut sampel dibawa dengan laju yang bergantung pada

kelarutan zat terlarut tersebut dalam fase bergerak dan interaksinya dengan

zat padat. Setelah garis depan pelarut bergerak sekitar 10 cm, lempengan

dikeringkan dan noda-noda zat terlarutnya diperiksa seperti pada

kromatografi kertas (Day & Underwood, 2002).

2.5.2 Nilai Rf

Pemisahan pada kromatografi planar (kromatografi kertas dan

kromatografi lapis tipis) pada umumnya dihentikan sebelum semua fase

gerak melewati seluruh permukaan fase diam. Solut pada kedua

kromatografi ini dikarakterisasi dengan jarak ujung fase geraknya. Faktor

retardasi solut (Rf) didefinisikan sebai perbandingan antara jarak yang

ditempuh oleh solut terhadap jarak yang ditemput oleh fase gerak

(Gandjar & Rohman, 2007).

Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut

mempunyai perbandingan distribusi (D) dan faktor retensi (K’) sama

dengan 0 yang berarti solut bermigrasi dengan kecepatan yang sama

dengan fase gerak. Nilai minimum Rf adalah 0 dan ini teramati jika solut

tertahan pada posisi titik awal di permukaan fase diam

(Gandjar & Rohman, 2007).

20


2.5.3 Kromatografi Kolom

Pada kromatografi kolom, berbagai ukuran kolom dapat digunakan,

dimana hal utama yang dipertimbangkan adalah kapasitas yang memadai

untuk menerima sampel-sampel tanpa melalui fase diamnya. Merupakan

aturan praktis yang umum bahwa panjang kolom harus sekurang-

kurangnya sepuluh kali ukuran diameternya. Bahan pengemasnya, suatu

adsorben seperti alumina atau mungkin suatu resin pertukaran ion,

dimasukkan dalam bentuk suspensi ke dalam porsi fase bergerak dan

dibiarkan diam di dalam hamparan basah dengan sedikit cairan tetap

berada di atas permukaannya (Day & Underwood, 2002).

Laju alir yang diinginkan diperoleh semata-mata dari gravitasi,

dengan menyisipkan ujung keluaran kolom itu ke dalam bejana yang, atau

dengan memompa cairan melalui ujung atas kolom, laju alir yang lazim

dapat sebesar beberapa puluh milimeter per menit dan mungkin lebih cepat

jika pemisahan tidak terlalu sulit (Day & Underwood, 2002). Terkadang

tidak ada satupun fase bergerak yang cocok dengan elusi dari seluruh

komponen sampel. Misalnya dalam adsorpsi, pelarut yang cukup nonpolar

mungkin ideal untuk mengelusi beberapa zat terlarut yang kurang polar

dimana zat terlarut yang lebih polar kemudian dapat memperlihatkan suatu

retensi panjang yang berlebihan. Pada kasus seperti ini, teknik elusi

gradien lebih bermanfaat. Komposisi fase gerak diubah secara kontinu

dengan membiarkan pelarut yang lebih polar mengalir ke dalam reservoar

yang mengandung zat terlarut yang kurang polar, pada saat campuran zat

terlarut mengalir ke dalam kolom. Dimana zat terlarut yang lambat akan

mengalir lebih cepat dengan meningkatnya kemampuan mengelusi dari

campuran pelarut (Day & Underwood, 2002).

Kelemahan dari metode ini adalah pengerjaan yang konvensional

lebih lambat dan merepotkan namun kolom-kolom yang cukup panjang

dapat digunakan dimana kapasitasnya memadai untuk pekerjaan membuat

preparat (Day & Underwood, 2002).

21


2.6 Bakteri Gram positif dan negatif

Bakteri merupakan sel prokariotik yang uniseluler (sel tunggal)

dengan struktur internal sederhana. Tumbuh pada media laboratoris

buatan. Reproduksi aseksual, khasnya dengan pembelahan sel sederhana.

Ukuran khas 0,5 – 1,5 μm x 1,0- 3,0 μm. Sel-sel individu bakteri dapat

berbentuk seperti elips, bola, batang (silindris), atau spiral (heliks)

(Pelczar & Chan, 1986).

Berdasarkan komposisi dinding selnya, bakteri dibagi menjadi dua

golongan ; bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (Goering, et al.,

2008). Bakteri Gram negatif mengandung lipid, lemak atau substansi

seperti lemak dalam persentase lebih tinggi daripada yang dikandung

bakteri Gram positif. Dinding sel bakteri Gram negatif juga lebih tipis

daripada sel bakteri Gram positif (Pelczar & Chan, 1986).

Tabel 2.2. Ciri bakteri Gram positif dan Gram negatif (Pelczar & Chan,

1986).

CIRI Perbedaan Relatif

Gram positif Gram negatif

Struktur dinding sel Tebal ( 15-80 nm), berlapis

tunggal

Tipis ( 10-15 nm),

Berlapis tiga (multi)

Komposisi dinding

sel

Kandungan lipid rendah (1-

4%) Peptidoglikan ada

sebagai lapisan tunggal,

komponen utama

merupakan lebih dari 50 %

berat kering pada beberapa

sel bakteri

Asam Tekoat

Kandungan lipid tinggi

(11-22%) Peptidoglikan

ada didalam lapisan kaku

sebelah dalam; jumlahnya

sedikit, merupakan sekitar

10% berat kering

Tidak ada asam tekoat

Kerentanan

Terhadap penisilin

Lebih rentan Kurang rentan

Persyaratan nutrisi Relatif rumit pada banyak

spesies

Relatif sederhana

Resistensi terhadap

gangguan fisik

Lebih resisten Kurang resisten

22


2.7 Bakteri Uji

2.7.1 Staphylococcus aureus

Staphylococcus merupakan bakteri kokus Gram positif, berdiame-

ter 1 μm (Parija, 2009). Kokusnya tersusun khas seperti setandan anggur

yang tidak teratur. Bentuk seperti anggur yang tidak teratur ini tampak bila

bakteri ditumbuhkan pada media padat, tetapi biasanya terlihat seperti

rantai pendek bila ditumbuhkan pada medium cair. Apusan yang diambil

dari nanah menunjukkan keberadaan yang tunggal atau berpasangan,

tandanan, atau rantai pendek yang terdiri dari tiga atau empat sel

(Parija, 2009).

S. aureus menyebabkan penyakit pada berbagai jaringan, menye-

barkan toksin, dan merangsang inflamasi. Bakteri ini menempel dan

membahayakan kulit, mukosa dan permukaan jaringan. Staphylococcus

aureus merupakan patogen primer pada manusia dan hewan, hidup pada

kulit, kelenjar kulit dan membran mukus. Kira-kira 35-50 % terdapat pada

orang dewasa, 10 % pada perinium dan 5 – 10% pada vagina

(Parija, 2009). Bakteri ini juga menyebabkan penyakit toxin-mediated

seperti keracunan makanan, toxic shock syndrome (TSS), dan

staphylococcal scalded skin syndrome (Parija, 2009). Determinan utama

tehadap patogenitas adalah enzim dan toksin. Enzim yang terkandung

yaitu koagulase (karakteristik yang memperkuat), hialuronidase,

stapilokinase, nuklease, dan penisillinase. Toksinnya adalah β-hemolysins,

leukocidin, enterotoksin, eksfoliatif dan shock syndrome toxin. Bakteri

menempati nasofaring dan kulit (Talaro, 2005).

2.7.2 Escherichia coli

Family : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia

Species : E. coli

( Pommerville, 2011)

23


E. coli merupakan bakteri enterik utama. Bertindak sebagai patogen

juga sebagai bakteri yang menguntungkan. Dan menyebabkan bermacam

penyakit seperti diare, infeksi pada saluran urin (Talaro, 2005).

E. coli merupakan bacilus Gram negatif yang berukuran sekitar 1-3

x 0,4-0,7 μm. Basil tersusun secara tunggal atau berpasangan

(Parija, 2009). Menurut Parija (2009), E. coli merupakan bakteri aerob dan

anaerob fakultatif. Tumbuh pada rentang suhu 10-140 C (suhu optimum

370 C) dan pH 7,2. Bakteri tumbuh pada berbagai media, termasuk

Mueller-Hinton Agar, Nutrient Agar, Blood Agar, dan MacConkey Agar.

Isolasi utama dapat ditemukan dari Nutrient Agar dan Blood Agar

(Parija, 2009).

E.coli merupakan bakteri utama pada flora normal usus. Bakteri ini

dikenali sebagai bakteri yang sedikit membahayakan dan juga patogen.

E.coli menyebabkan penyakit dengan spektrum luas pada manusia.

Merupakan penyebab penting penyakit enterik, infeksi saluran urin,

neonatal sepsis dan neonatal meningitis. Hemolytic Uremic Syndrome

merupakan komplikasi serius terhadap infeksi enterik dengan rantai

spesifik E.coli (Parija, 2009).


BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biosains, Bidang Botani,

Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI),

Cibinong. Waktu pelaksanaan penelitian dimulai dari bulan April hingga

Agustus 2013.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat –alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: autoklaf

(Hiclave HVE 5.0 Hirayama), cawan petri, jarum ose, lampu bunsen,

kolom, kapas steril, pipa kapiler, pinset, pipet mikro, tabung reaksi

(pyrex), spatula, shaker incubator, inkubator, vacuum rotary evaporator

(Heidolph WB 2000), UV cabinet (CAMAG), chamber, Lamina Air Flow

(LAF), 96 microwell titer plate, labu evaporator (pyrex), neraca analitik

(and hr-202i), corong pisah, erlenmeyer dan alat-alat gelas lainnya.

3.2.2 Bahan

Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah 23 isolat

jamur endofit yang diisolasi dari bagian akar, batang, daun dan biji

tumbuhan Rennellia elliptica koleksi Laboratorium Biosains, Bidang

Botani, Puslit Biologi LIPI Cibinong (Tabel 3.1)

Bakteri uji yang digunakan meliputi bakteri uji Gram positif

(Staphylococcus aureus LIPIMC 114), bakteri uji Gram negatif

(Escherichia coli LIPIMC 186).

Media Potato Dextrose Agar/ PDA (difcoTM), media Potato

Dextrose Broth / PDB (difcoTM), media Mueller-Hinton Broth/ MHB

(criterion), media Mueller-Hinton Agar / MHA (criterion), media Brain

Heart Infussion/ BHI cair (BBLTM), pelat Kromatografi Lapis Tipis

(KLT) silica gel 60 F254 (Merck), Silika gel 70-230 mesh (Merck),

25


sephadex LH-20, pelarut kimia etil asetat, aseton, kloroform, metanol, n-

heksana, alkohol 96 %, alkohol 70%, aquades, aquades steril, reagen

warna p-iodonitrotetrazolium / INT (Sigma), pewarna trypan blue, kristal

violet, safranin, larutan iodin, kloramfenikol (Sigma), eritromisin (Sigma),

kertas saring, gas nitrogen dan penampak noda serium sulfat.

Tabel 3.1. Data 23 isolat jamur endofit dari tumbuhan Ginseng Kuning

(Rennellia elliptica Korth)

No Asal Isolat Nama Jamur No Asal Isolat Nama Jamur

1 Akar GKA ¼ 1 Daun GKD 2

2 GKA 2 2 GKD 3/4

3 GKA 3 3 GKD 5

4 GKA 5 4 GKD 6

5 GKA 6 5 GKD 7

6 GKA 7 6 GKD 8

1 Biji GKB 1 1 Batang GKBt 1

2 GKB 2 2 GKBt 2

3 GKB 3 3 GKBt 3/4

4 GKB 4 4 GKBt 5/6

5 GKB 5

6 GKB 6

7 GKB 7

26


3.3 Tahapan Penelitian

1. Skrining bioproduksi metabolit sekunder ekstrak

2. Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi

3. Scaling up kultivasi jamur endofit GKBt 2

4. Ekstraksi jamur endofit hasil Scaling Up

5. Isolasi metabolit jamur endofit GKBt 2

6. Penentuan nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)

7. Identifikasi jamur endofit GKBt 2

3.4. Prosedur Kerja

3.4.1 Skrining Bioproduksi Metabolit Sekunder Ekstrak

3.4.1.1 Kultivasi isolat jamur endofit ke dalam medium PDB

a. Pembuatan medium kultivasi

Medium PDB dibuat sebanyak 750 mL dengan cara mensuspensikan

18 g PDB ke dalam 750 mL aquades. Setelah tercampur, medium

dipanaskan hingga larut sempurna, kemudian dituangkan ke dalam 25

tabung uji masing-masing sebanyak 40 mL. Medium disterilkan dengan

autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit.

b. Kultivasi isolat jamur endofit

Kultivasi isolat jamur endofit dilakukan terhadap 23 isolat jamur

endofit yang diisolasi dari bagian akar, biji, daun dan batang tumbuhan

Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth). Setiap isolat jamur endofit

dinokulasikan sebanyak 1 ose ke dalam masing-masing tabung yang

berisi medium PDB steril, kemudian diinkubasi dalam kondisi statis

pada suhu kamar selama tiga minggu. Inkubasi juga dilakukan terhadap

1 tabung yang berisi medium PDB steril saja, sebagai kontrol sterilitas

media.

3.4.1.2 Ekstraksi isolat jamur endofit

Sebanyak dua puluh tiga kultur jamur endofit masing-masing

diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat dengan perbandingan pelarut

dan kultur jamur 1:1, proses ekstraksi dilakukan sebanyak tiga kali.

27


Ekstraksi juga dilakukan terhadap satu tabung yang berisi medium PDB

saja. Hasil ekstraksi dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotary

evaporator hingga didapat ekstrak pekat.

3.4.1.3 Skrining bioproduksi metabolit sekunder ekstrak

Sebanyak dua puluh tiga ekstrak etil asetat dari jamur endofit

Ginseng Kuning dianalisis metabolit sekundernya dengan Kromatografi

Lapis Tipis (KLT) menggunakan eluen diklorometan:metanol (10:1).

Ekstrak dilarutkan ke dalam aseton dengan konsentrasi 10 mg/mL, volume

penotolan sebanyak 10 µL. Penotolan dilakukan diatas pelat KLT 20x7

cm. Sebagai kontrol pelarut dan medium, ditotolkan pula ekstrak medium

PDB dan aseton. Pola kromatogram yang terbentuk dimonitor dengan

sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, lalu disemprot

dengan pereaksi penampak noda serium sulfat/ Ce(SO4)2.

3.4.2 Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi

3.4.2.1 Sterilisasi Alat dan Bahan

Semua alat dan bahan (media) yang akan digunakan untuk uji

mikrobiologi disterilisasi dengan proses sterilisasi yang cocok. Sterilisasi

dilakukan menggunakan autoklaf suhu 121 0C selama 15 menit.

Sebelumnya, semua alat yang akan disterilisasi dibungkus dengan plastik

tahan panas. Untuk pengerjaan uji antibakteri dilakukan di dalam Laminar

Air Flow.

3.4.2.2 Pembuatan Medium

a. Medium Peremajaan Bakteri

Medium Nutrient Agar (NA)

NA ditimbang sebanyak 0,23 g dilarutkan dalam 10 mL aquades.

Setelah semua bahan tercampur, medium dipanaskan hingga larut

sempurna, lalu disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15

menit.

28


b. Medium Untuk Suspensi Bakteri.

Medium Brain Heart Infussion (BHI) cair

BHI ditimbang sebanyak 5,55 g dilarutkan dalam 150 mL aquades.

Setelah semua bahan tercampur, medium dipanaskan hingga larut

sempurna, lalu disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15

menit.

3.4.2.3 Persiapan Inokulum

Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah

Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.

a. Identifikasi bakteri uji dengan pewarnaan Gram

Kaca objek dan kaca penutup dibersihkan dengan alkohol 70 %, bakteri

uji disuspensikan ke dalam aquades steril yang terdapat diatas kaca

objek, kemudian diratakan membentuk area apusan dan difiksasi

dengan cara melewatkannya di atas api bunsen. Zat warna kristal violet

diteteskan ke atas area apusan, dibiarkan selama 60 detik dan dicuci

dengan air aquades kemudian dibiarkan beberapa saat. Larutan iodin

diteteskan ke atas apusan dan dibiarkan selama 1 menit kemudian

dicuci dengan alkohol hingga larutan yang mengalir tidak berwarna lagi

dilanjutkan dengan pencucian dengan aquades, dibiarkan beberapa saat.

Zat warna safranin diteteskan dan dibiarkan selama 60 detik. Kemudian

dicuci dengan akuades, dibiarkan beberapa saat. Preparat ditutup

dengan kaca penutup diamati dengan mikroskop cahaya.

b. Peremajaan Bakteri Uji

Bakteri uji diremajakan pada medium Nutrient Agar (NA) steril.

Mikroba uji diinokulasi sebanyak satu ose ke dalam medium NA dan

diinkubasi pada suhu 37 0C selama 20 jam. Pengerjaan dilakukan dalam

kondisi steril di dalam Laminar Air Flow (LAF).

c. Pembuatan Suspensi Bakteri

Sebanyak satu ose isolat Bakteri Staphylococcus aureus dan

Escherichia coli masing-masing diinokulasikan kedalam 20 mL

medium Brain Heart Infussion (BHI) cair steril. Masing-masing

29


diinkubasi selama 20 jam dalam shaker incubator 100 rpm pada suhu

37 0C. Pengerjaan dilakukan dalam kondisi steril di dalam Laminar Air

Flow (LAF)

3.4.2.4 Persiapan Sampel

Sebanyak dua puluh tiga ekstrak etil asetat jamur endofit dari

Ginseng Kuning masing-masing dilarutkan dengan pelarut aseton sehingga

didapat larutan dengan konsentrasi 10 mg/mL. Masing-masing ekstrak

jamur, dan kontrol negatif (pelarut aseton dan ekstrak media PDB)

ditotolkan sebanyak 10 μL kedalam pelat KLT ukuran 8x8 cm.

Kloramfenikol sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 1 mg/mL dalam

pelarut metanol ditotolkan sebanyak 10 μL dan 5 μL pada pelat KLT

ukuran 4x7 cm.

3.4.2.5 Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Bioautografi

Suspensi bakteri uji dibuat dengan mensuspensikan 5 mL inokulum

ke dalam 45 mL medium BHI cair (perbandingan medium dan suspensi

inokulum 9:1) di dalam cawan petri steril berdiameter 14,5 cm, kemudian

suspensi bakteri uji diratakan dengan menggunakan spreader steril. Pelat

KLT yang telah ditotolkan sampel, kontrol positif dan kontrol negatif

dicelupkan ke dalam cawan petri yang berisi suspensi bakteri uji.

Kemudian, pelat tersebut diletakkan kedalam cawan petri steril yang telah

diletakkan kapas basah pada kedua sisi petri. Kemudian diinkubasi pada

suhu 37 0C selama 20 jam. Pengerjaan dilakukan dalam kondisi steril di

dalam Laminar Air Flow (LAF).

3.4.3 Scaling Up bioproduksi jamur endofit GKBt 2

3.4.3.1 Pembuatan medium kultivasi

Medium PDB dibuat sebanyak 5 L dengan komposisi 24 gram

PDB dalam 1 L aquadest. Setelah semua komponennya larut, medium

tersebut dibagi menjadi 15 erlenmeyer yang masing-masingnya diisi 200

mL medium dalam erlenmeyer 500 mL dan 4 erlenmeyer yang berisi 500

30


mL medium dalam erlenmeyer 2 L. Medium disterilkan dengan autoklaf

selama 15 menit pada suhu 121 oC.

3.4.3.2 Kultivasi Jamur Endofit

Koloni murni jamur GKBt 2 berumur 14 hari yang telah

ditumbuhkan pada medium PDA diambil kira-kira seluas 1x1 cm sebanyak

3 blok dan diinokulasi ke dalam medium PDB steril. Kemudian, kultur

diinkubasi pada suhu ruang dalam kondisi statis selama tiga minggu.

Pengerjaan kultivasi jamur endofit GKBt 2 dilakukan dalam kondisi steril

di dalam Laminar Air Flow (LAF)

3.4.4 Ekstraksi kultur jamur GKBt 2 Hasil Scaling Up

Hasil kultivasi jamur endofit GKBt 2 selanjutnya diekstraksi.

Kultur jamur dipisahkan menjadi media jamur dan biomassa jamur.

Media jamur GKBt 2 diekstraksi dengan pelarut etil asetat dengan

perbandingan pelarut dan kultur media 1:1, proses ekstraksi dilakukan

sebanyak tiga kali. Jumlah pelarut etil asetat yang digunakan adalah lima

liter. Lapisan atas yang merupakan fraksi etil asetat dipisahkan dan

dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator.

Sedangkan biomassa jamur dimaserasi dengan aseton selama

semalam, dan dilakukan sebanyak tiga kali. Aseton yang digunakan

untuk maserasi berjumlah 3 x 500 mL. Hasil maserasi dievaporasi

dengan vacuum rotary evaporator hingga tersisa fraksi air. Fraksi air

kemudian dipartisi dengan etil asetat dengan perbandingan pelarut dan

fraksi air 1:1, proses ekstraksi dilakukan sebanyak 3 kali. Lapisan atas

yang merupakan fraksi etil asetat dipisahkan dan dipekatkan dengan

vacuum rotary evaporator. Ekstrak pekat dilarutkan dengan 100 mL

metanol 100% dan dipartisi kembali dengan pelarut n-heksan sebanyak 3

kali. Hasil partisi metanol dan n-heksan masing-masing dipekatkan

dengan vacuum rotary evaporator. Ekstrak pekat baik biomassa dan

media ditotolkan pada pelat KLT kemudian dielusi dengan eluent

diklorometan : metanol (10:1) dan hasilnya diamati dibawah sinar UV

31


254 nm dan 366 nm serta disemprot dengan pereaksi penampak noda

serium sulfat/ Ce(SO4)2.

3.4.5 Fraksinasi Metabolit Ekstrak Etil Asetat GKBt 2

Kromatografi Kolom

Ekstrak etil asetat media GKBt 2 sebanyak 830 mg difraksinasi

menggunakan kolom sephadex LH-20 dengan larutan pengelusi

alkohol 96 %. Fraksi-fraksi yang keluar dari kolom ditampung dalam

tabung reaksi dan setiap tabung dimonitor dengan KLT menggunakan

eluen diklorometan:metanol (10:1). Selanjutnya, fraksi-fraksi yang

memiliki noda yang sama digabung menjadi satu fraksi sehingga didapat

15 fraksi.

Dari hasil fraksinasi menggunakan fase diam Sephadex LH-20,

Fraksi F.5 yang berjumlah 47 mg difraksinasi kembali menggunakan

kromatografi kolom dengan fase diam silica gel (70-230 mesh). Fase gerak

yang digunakan adalah kloroform:metanol dengan perbandingan masing-

masing 10:1, 5:1 dan 0:1. Fraksi – fraksi yang keluar kemudian ditampung

dalam tabung reaksi dan setiap tabung dimonitor dengan KLT

menggunakan eluen diklorometan: metanol (10:1). Selanjutnya, fraksi-

fraksi yang memiliki bercak noda yang sama digabung menjadi satu fraksi

sehingga didapatkan 10 fraksi.

KLT Preparatif

Fraksi F.5.8 sebanyak 9,8 mg dilanjutkan dengan purifikasi

menggunakan KLT preparatif. Sebelumnya, larutan fraksi dilarutkan

dalam aseton dengan konsentrasi 5 mg/mL dan dioptimasi dengan eluen

yang sesuai untuk mendapatkan kondisi optimum untuk preparatif pada

pelat KLT. Eluen yang digunakan adalah kloroform : metanol dengan

perbandingan 7:1.

Bercak noda yang muncul dikerok dengan spatula logam diatas

kertas bersih, dibilas dengan aseton dan kemudian disaring. Filtrat

32


dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator dan dikeringkan dengan gas

nitrogen. Kemudian bobot fraksi ditimbang.

Uji kemurnian fraksi dilakukan dengan menggunakan KLT dua

dimensi. Dimana fraksi tunggal yang didapatkan dielusi menggunakan dua

sistem elusi yaitu kloroform: metanol (7:1) dan kloroform: metanol (5:1).

3.4.6 Uji aktivitas antibakteri hasil purifikasi

Hasil purifikasi diuji aktivitas antibakterinya dengan menentukan

nilai KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) menggunakan metode

mikodilusi cair pada suatu microwellplate yang berjumlah 96 sumuran.

3.4.6.1Persiapan Medium

Medium pertumbuhan bakteri uji yang digunakan yaitu medium

MHB dan MHA

a. Medium MHB (Mueller Hinton Broth) dibuat dua komposisi, yaitu

medium MHB 1 dibuat dengan melarutkan 21 g MHB dalam 1 L

aquadest dan medium MHB 2 dibuat dengan komposisi dua kali

medium MHB 1 (42 g MHB dalam 1 L aquadest). Medium tersebut

disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 0C.

b. Medium MHA (Mueller Hinton Agar) dibuat dengan melarutkan 38 g

MHA dalam 1 L aquadest. Setelah larut, medium disterilkan dengan

autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 0C, kemudian dituang dalam

cawan petri dan dibiarkan memadat.

3.4.6.2 Persiapan Larutan Uji dan Larutan Kontrol

Larutan uji yang digunakan yaitu fraksi F.5.8 a (4,5 mg) dan

F.5.8.b (5 mg). Larutan uji dipersiapkan dengan konsentrasi 1024 μg/mL

sebanyak 1 mL menggunakan pelarut etanol 20 %. Pembuatan larutan uji

dimulai dengan melarutkan masing-masing fraksi kedalam dalam 1 mL

etanol 96%, lalu dipipet sebanyak 1024 µL dari larutan tersebut ke dalam

vial dan dipekatkan dengan nitrogen. Kemudian ditambahkan etanol 96%

33


sebanyak 200 µL dan ditambah aquadest sebanyak 800 µL sehingga

volume larutan menjadi 1 mL.

Kloramfenikol dan eritromisin sebagai kontrol positif dipersiapkan

dengan membuat larutan masing-masing dengan konsentrasi 10 mg/mL

dalam etanol 96% (larutan stock). Kemudian diencerkan menjadi

konsentrasi 512 µg/mL sebanyak 5 mL, pembuatan larutan kontrol positif

dibuat dengan dengan cara menambahkan 4744 µL aquadest ke dalam

256 µL larutan stock di dalam vial.

3.4.6.3 Persiapan Inokulum

Bakteri uji yang digunakan adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia

coli.

a. Pembuatan suspensi inokulum

Sebanyak masing-masing 1 ose isolat bakteri uji diinokulasikan ke

dalam 20 mL medium MHB. Kemudian, diinkubasi selama 20 jam

dalam shaker incubator pada suhu 37 0C untuk memperoleh suspensi

inokulum.

b. Perhitungan jumlah koloni suspensi

Suspensi yang didapat diencerkan untuk mempermudah perhitungan

koloni, yaitu dengan cara dipipet 50 µL suspensi ke dalam 4,95 mL

medium MHB. Suspensi tersebut diencerkan lagi dengan cara yang

sama hingga didapat suspensi dengan pengenceran 10-4, 10-6, 10-8, dan

10-10. Suspensi dengan pengenceran diinokulasikan sebanyak 100 µL

ke dalam medium MHA. Setelah itu diinkubasi selama 20 jam pada

suhu 37 0C. Koloni yang tumbuh dihitung.

Jumlah koloni suspensi

c. Pengenceran suspensi inokulum

Setelah diketahui jumlah koloni suspensi, dilanjutkan dengan

pengenceran suspensi inokulum untuk mendapatkan jumlah 105

CFU/mL.

34


3.4.6.4 Penentuan Nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)

1. Pengenceran Larutan Uji : sumur yang pertama diisi 100 µL medium

MHB 2, sumur 2-8 diisi 100 µL medium MHB 1. Pada sumur 1 diisi

100 µL larutan uji dengan konsentrasi 1024 µg/mL. Dihomogenkan

dengan menggunakan pipet mikro. Diambil sebanyak 100 µL dan

dimasukkan ke dalam sumur 2 dihomogenkan. Dilakukan hal yang

sama hingga sumur 8. Pada sumur 8 dibuang sebanyak 100 µL

campuran. Kemudian, masing-masing sumur ditambahkan 100 µL

inokulum bakteri uji.

2. Pengenceran Larutan kontrol positif : sumur yang pertama diisi 100 µL

medium MHB 2, sumur 2-8 diisi 100 µL medium MHB 1. Pada sumur

1 diisi 100 µL larutan kontrol positif dengan konsentrasi 512 µg/mL.

Dihomogenkan dengan menggunakan pipet mikro. Diambil sebanyak

100 µL dan dimasukkan ke dalam sumur 2 dihomogenkan. Dilakukan

hal yang sama hingga sumur 8. Pada sumur 8 dibuang sebanyak 100 µL

campuran. Kemudian, masing-masing sumur ditambahkan 100 µL

inokulum bakteri uji.

3. Sumur lain berisi 200 µL broth (kontrol media/kontrol sterilisasi).

4. Sumur lain berisi 100 µL broth dan 100 µL inokulum bakteri uji

kemudian dihomogenkan dengan pipet mikro (kontrol pertumbuhan).

5. Sumur lain berisi 100 µL broth, 100 µL pelarut (etanol 20 %),

dihomogenkan dengan pipet mikro dan dibuang sebanyak 100 µL

campuran. Kemudian ditambahkan 100 µL inokulum bakteri (kontrol

pelarut)

6. Microwellplate kemudian diikubasi selama 20 jam pada suhu 37 0C.

3.4.6.5 Penentuan Nilai KHM

Nilai KHM ditentukan dengan penambahan reagen warna INT

(IodoNitroTetrazolium) konsentrasi 4 mg/mL sebanyak 10 µL, didiamkan

selama 60 menit. Adanya aktivitas penghambatan ditunjukkan pada

konsentrasi dimana sumur masih mempertahankan kebeningannya.

Penentuan nilai KHM dilakukan sebanyak 3 kali ulangan.

35


3.4.7 Pengamatan Morfologi Jamur Endofit GKBt 2 pada medium

PDA (Potato Dextrose Agar)

Identifikasi jamur endofit GKBt 2 dilakukan secara morfologi

mengikuti metode Gandjar (2006) yaitu dengan melakukan pengamatan

makroskopis dan mikroskopis. Isolat jamur endofit GKBt 2 diinokulasikan

ke dalam cawan petri yang berisi media PDA dan diinkubasi pada suhu

kamar, pengamatan dilakukan pada hari ke 7 hingga hari ke 20. Pada hari

ke-20, kira-kira satu ose jamur diambil dan diletakkan diatas kaca objek,

diteteskan trypan blue kemudian ditutup dengan kaca penutup, dilakukan

pengamatan mikroskopis menggunakan mikroskop cahaya dengan

perbesaran 1000 x.


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Skrining Bioproduksi Metabolit Sekunder

Secara keseluruhan, sampel isolat jamur endofit yang diisolasi dari

Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.) berjumlah 23

isolat yang terdiri dari 6 isolat jamur endofit yang berasal dari akar, 7

isolat jamur endofit yang berasal dari biji, 6 isolat jamur endofit yang

berasal dari daun dan 4 isolat jamur endofit yang berasal dari batang

(Tabel 4.1). Seluruh isolat tersebut dikultivasi pada medium Potato

Dextrose Broth (PDB). Bobot masing-masing ekstrak etil asetat jamur

endofit dari tumbuhan Ginseng Kuning ditimbang untuk mengetahui

kemampuan masing-masing isolat jamur dalam memproduksi metabolit

sekunder. Berdasarkan data yang didapat, diketahui bahwa ekstrak etil

asetat dari isolat jamur endofit GKB 3 memiliki bobot ekstrak yang paling

besar yaitu 92,1 mg. Hal ini menunjukkan bahwa isolat jamur endofit

GKB 3 memiliki kemampuan terbesar dalam memproduksi metabolit

sekunder. Sedangkan ekstrak etil asetat dari isolat jamur endofit GKBt 2

memiliki bobot ekstrak yang paling kecil yaitu 11,2 mg. Hal ini

menunjukkan bahwa isolat jamur endofit GKBt 2 memiliki kemampuan

terkecil dalam memproduksi metabolit sekunder.

Tabel 4.1. Bobot 23 ekstrak etil asetat asetat isolat jamur endofit yang

diisolasi dari tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth).

No Asal

Isolat

Nama

Jamur

Bobot

ekstrak

(mg)

No Asal

Isolat

Nama

Jamur

Bobot

Ekstrak

(mg)

1 Akar GKA 1/4 22,7 14 Daun GKD 2 25,9

2 GKA 2 33 15 GKD 3/4 52,5

3 GKA 3 27,9 16 GKD 5 28,3

4 GKA 5 44,7 17 GKD 6 81

5 GKA 6 21,6 18 GKD 7 77,8

6 GKA 7 47,1 19 GKD 8 31,7

37


U

n

Untuk mengetahui profil bioproduksi metabolit sekunder dari

masing-masing ekstrak, maka dilakukan analisis dengan Kromatografi

Lapis Tipis (KLT) dengan menggunakan eluen diklorometan : metanol

perbandingan 10:1 terhadap 23 ekstrak etil asetat jamur endofit. Pola

kromatogram yang terbentuk dimonitor dengan sinar UV pada panjang

gelombang 254 nm dan 366 nm, lalu disemprot dengan pereaksi penampak

noda Ce(SO4)2, hal ini bertujuan untuk memperjelas pengamatan

bioproduksi metabolit sekunder ekstrak secara umum (Gambar 4.1).

(a)

(b)

7 Biji GKB 1 33,7 20 Batang GKBt 1 64,1

8 GKB 2 48,6 21 GKBt 2 11,2

9 GKB 3 92,1 22 GKBt ¾ 21,4

10 GKB 4 26,8 23 GKBt 5/6 18,7

11 GKB 5 18,1

12 GKB 6 36

13 GKB 7 11,5

38


(c)

Gambar 4.1. Hasil Skrining Bioproduksi Metabolit Sekunder dari 23

ekstrak etil asetat jamur endofit yang diisolasi dari tumbuhan Ginseng

Kuning (Rennellia elliptica Korth) (a) Hasil monitor dengan sinar UV

pada panjang gelombang 254 nm (b) Hasil monitor dengan sinar UV pada

panjang gelombang 366 nm (c) Hasil Penyemprotan dengan pereaksi

penampak noda Ce(SO4)2.

4.2. Uji Aktivitas Antibakteri 23 Ekstrak Jamur Endofit

Pengujian aktivitas antibakteri pada penelitian ini, dilakukan

terhadap 23 ekstrak etil asetat dengan konsentrasi 10 mg/mL sebanyak

10 µL melawan bakteri uji Staphylococcus aures dan Escherichia coli.

Uji aktivitas antibakteri dalam penelitian ini menggunakan metode

bioautografi. Bioautografi adalah suatu teknik untuk mendeteksi zat yang

mempengaruhi tingkat pertumbuhan organisme uji dalam campuran yang

kompleks dan matriks (Choma, 2005). Metode ini menggabungkan

penggunaan tehnik kromatografi lapis tipis dengan respons dari

Keterangan Gambar :

1 GKA1/4 6 GKA 7 11 GKB 5 16 GKD 5 21 GKBt 2

2 GKA 2 7 GKB 1 12 GKB 6 17 GKD 6 22 GKBt ¾

3 GKA 3 8 GKB 2 13 GKB 7 18 GKD 7 23 GKBt 5/6

4 GKA 5 9 GKB 3 14 GKD 2 19 GKD 8 PDB

5 GKA 6 10 GKB 4 15 GKD 3/4 20 GKBt 1 Aseton

39


mikroorganisme yang diuji berdasarkan aktivitas biologi suatu sampel

yang memiliki aktivitas antibakteri (Kusumaningtyas, et al., 2008).

Aktivitas antibakteri positif ditunjukkan apabila terbentuk zona

hambat berwarna putih di sekitar ekstrak pada latar pelat KLT berwarna

merah setelah penyemprotan larutan IodoNitroTetrazolium (INT). Hal ini

disebabkan karena terjadinya reaksi enzimatik antara larutan INT dengan

bakteri, dimana INT yang awalnya tidak berwarna akan direduksi oleh

enzim dehidrogenase yang terdapat pada bakteri sehingga berubah menjadi

formazan yang berwarna merah. Hasil uji aktivitas antibakteri larutan

ekstrak etil asetat dari jamur endofit ginseng kuning dan kontrol positif/

kloramfenikol dengan menggunakan metode bioautografi ditunjukkan

pada Gambar 4.2. Sedangkan untuk mengetahui berapa besar kemampuan

antibakteri dari ekstrak maka dilakukan pengukuran diameter zona hambat

yang ditunjukkan pada Tabel 4.2.

(a) (b)

40


(c) (d)

Gambar 4.2. Hasil Skrining Antibakteri dengan Metode Bioautografi (a)

Skrining antibakteri 23 ekstrak etil asetat jamur terhadap bakteri uji

Escherichia coli (b) Skrining antibakteri 23 ekstrak etil asetat jamur

terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus (c) Bioautografi kloramfenikol

/ kontrol (+) terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus (d) Bioautografi

kloramfenikol / kontrol (+) terhadap bakteri uji Escherichia coli.

Keterangan Gambar

1 GKA1/4 6 GKA 7 11 GKB 5 16 GKD 5 21 GKBt 2

2 GKA 2 7 GKB 1 12 GKB 6 17 GKD 6 22 GKBt ¾

3 GKA 3 8 GKB 2 13 GKB 7 18 GKD 7 23 GKBt 5/6

4 GKA 5 9 GKB 3 14 GKD 2 19 GKD 8 Aseton

5 GKA 6 10 GKB 4 15 GKD 3/4 20 GKBt 1 PDB

Tabel 4.2. Diameter Zona Hambat Hasil Uji Aktivitas Antibakteri

No Ekstrak Jamur

Endofit

Bakteri Uji

Staphylococcus

aureus

Escherichia coli

Diameter Hambat

(mm)

Diameter Hambat

(mm)

1 GKA ¼ - - - -

2 GKA 2 - - - -

3 GKA 3 - - - -

4 GKA 5 - - - -

41


5 GKA 6 - - - -

6 GKA 7 + 7 mm + 7 mm

7 GKB 1 + 7 mm + 7 mm

8 GKB 2 - - - -

9 GKB 3 - - - -

10 GKB 4 + 8 mm + 8 mm

11 GKB 5 + 10 mm + 10 mm

12 GKB 6 - - - -

13 GKB 7 + 10 mm + 10 mm

14 GKD 2 - - - -

15 GKD ¾ - - - -

16 GKD 5 - - - -

17 GKD 6 - - - -

18 GKD 7 - - - -

19 GKD 8 - - - -

20 GKBt 1 - - - -

21 GKBt 2 + 20 mm + 18 mm

22 GKBt ¾ + 10 mm + 8 mm

23 GKBt 5/6 - - - -

24 Kloramfenikol + 25 & 32 mm + 28 & 33 mm

Ket : (-) Tidak ada aktivitas antibakteri ; (+) Ada aktivitas antibakteri

Dari hasil skrining menggunakan metode bioautografi, diketahui

bahwa ekstrak etil asetat jamur GKBt 2 memiliki aktivitas antibakteri yang

paling besar dibandingkan ekstrak yang lain dengan diameter zona hambat

20 mm pada bakteri S. aureus dan 18 mm terhadap bakteri E. coli. Oleh

itu, untuk mengetahui senyawa dengan nilai Rf (Retardation Factor)

mana saja yang aktif sebagai antibakteri, maka dilakukan bioautografi

elusi dimana ekstrak etil asetat dari GKBt 2 dielusi dengan konsentrasi

10 mg/mL, volume penotolan 10 µL dan menggunakan eluen

diklorometan : metanol (10:1). Hasil bioautografi elusi ditunjukkan pada

Gambar 4.3.

42


(a) (b) (c) (d)

Gambar 4.3. Hasil bioautografi elusi ekstrak etil asetat jamur GKBt 2

(a) Hasil monitor KLT ekstrak etil asetat GKBt 2 pada UV 254 nm

(b) Hasil monitor KLT ekstrak etil asetat GKBt 2 pada UV 366 nm

(c) KLT-Bioautografi ekstrak etil asetat GKBt 2 terhadap bakteri uji

Staphylococcus aureus

(d) KLT-Bioautografi ekstrak terhadap bakteri Escherichia coli.

Berdasarkan hasil bioautografi elusi terhadap bakteri uji

Staphylococcus aureus, diduga bahwa pada ekstrak etil asetat dari jamur

endofit GKBt 2, senyawa dengan nilai Rf 0-0,24 tidak aktif sebagai

antibakteri, karena tidak terbentuk zona hambat pada perlakuan uji

bioautografi antibakteri secara elusi. Sedangkan senyawa dengan nilai Rf

0,25-1 diduga memiliki aktivitas sebagai antibakteri karena tebentuk zona

hambat. Sedangkan, hasil bioautografi terhadap bakteri uji Escherichia

coli menunjukkan bahwa senyawa dengan nilai Rf 0,18-1 diduga memiliki

aktivitas sebagai antibakteri karena tebentuk zona hambat pada hasil

pengujian aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi.

4.3. Scaling Up Kultivasi Jamur Endofit GKBt 2 pada medium

PDB ( Potato Dextrose Broth)

Untuk memperbanyak hasil produksi metabolit sekunder dari

jamur endofit GKBt 2, maka dilakukan perbesaran skala kultivasi jamur

endofit GKBt 2 pada media. Media yang digunakan adalah sebanyak 5 L

43


media Potato Dextrose Broth/PDB steril. Selain itu isolat juga

diinokulasikan kedalam media PDA miring dan disimpan sebagai stok

kultur.

Secara keseluruhan, semua erlenmeyer yang berisi media dan

inokulan diinkubasi dalam kondisi yang sama yaitu pada suhu kamar

dalam kondisi statis selama 3 minggu. Selama proses Scaling Up, terjadi

perubahan warna media dari kuning menjadi merah tua, hal ini

menunjukkan bahwa jamur GKBt 2 mampu tumbuh dan menghasilkan

metabolit sekunder pada media PDB tersebut.

4.4. Ekstraksi Kultur Jamur Endofit Hasil Scaling Up

Ekstraksi kultur jamur GKBt 2 dibagi menjadi dua, yaitu ekstraksi

media jamur dan biomassa jamur. Berat ekstrak etil asetat dari media

jamur GKBt 2 yang didapatkan, berwarna merah sebanyak 830 mg dari

total 5 L medium PDB. Proses pengekstrakan media dilakukan dengan etil

asetat. Etil asetat merupakan pelarut yang bersifat semipolar, dan umum

digunakan sebagai pelarut untuk mengekstraksi jamur endofit. Ekstrak etil

asetat GKBt 2 yang diperoleh kemudian dianalisis menggunakan

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan diamati dibawah sinar UV 254 nm

dan 366 nm serta disemprot dengan pereaksi penampak noda Ce(SO4)2.

Pola KLT yang terbentuk dari hasil analisis KLT diberikan pada gambar

4.4.a

Dari hasil ekstraksi, berat ekstrak etil asetat dari biomassa jamur

endofit GKBt 2 sebanyak 1,77 g. Profil KLT dari ekstrak etil asetat

biomassa jamur endofit GKBt 2 dapat dilihat pada gambar 4.4.b.

Berdasarkan profil KLT dan tekstur ekstrak yang berminyak, diduga

terdapat banyak lemak dari ekstrak etil asetat biomassa jamur GKBt 2.

Oleh itu, dilakukan partisi dengan pelarut heksana dan metanol dengan

perbandingan 1:1, untuk memisahkan senyawa-senyawa yang bersifat non

polar dengan senyawa-senyawa yang bersifat polar. Profil KLT dengan

eluen diklorometan: metanol (10:1) dari hasil partisi dapat dilihat pada

gambar 4.4.c dan 4.4.d.

44


Untuk mengetahui senyawa dengan nilai Rf (Retardation Factor)

mana saja yang aktif sebagai antibakteri pada hasil partisi, maka dilakukan

bioautografi elusi. Hasil bioautografi elusi ditunjukkan pada Gambar 4.4.e,

4.4.f, 4.4.g, dan 4.4.h

(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h)

Gambar 4.4. Hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ekstrak scalling Up

media PDB

(a) Profil KLT ekstrak etil asetat media GKBt 2 setelah penyemprotan

serium sulfat

(b) Profil KLT Ekstrak etil asetat biomassa jamur endofit GKBt 2 setelah

penyemprotan reagen serium sulfat

(c) Profil KLT hasil partisi ekstrak etil asetat biomassa jamur endofit

GKBt2 dengan heksana

(d) Profil KLT hasil partisi ekstrak etil asetat biomassa jamur endofit

GKBt2 dengan metanol setelah penyemprotan reagen serium sulfat

(e) Hasil KLT bioautografi hasil partisi ekstrak etil asetat biomassa jamur

GKBt 2 fraksi metanol melawan bakteri S.aureus

(f) Hasil KLT bioautografi hasil partisi ekstrak etil asetat biomassa jamur

GKBt 2 fraksi Metanol melawan bakteri E.coli

(g) Hasil KLT bioautografi hasil partisi ekstrak etil asetat biomassa jamur

GKBt 2 fraksi Heksan melawan bakteri S.aureus

45


(h) Hasil KLT bioautografi hasil partisi ekstrak etil asetat biomassa jamur

GKBt 2 fraksi Heksan melawan bakteri E.coli.

Dari hasil bioautografi, diketahui bahwa aktivitas senyawa yang

memiliki aktivitas antibakteri pada ekstrak jamur partisi metanol lebih

besar dibandingkan dengan ekstrak jamur hasil partisi menggunakan

heksana. Diduga pada ekstrak jamur hasil partisi dengan metanol, senyawa

dengan nilai Rf 0,45-1 memiliki aktivitas sebagai antibakteri.

4.5. Fraksinasi Metabolit Ekstrak Etil Asetat Media GKBt 2

Ekstrak media GKBt 2 sebanyak 830 mg difraksinasi

menggunakan kolom sephadex LH-20 dengan larutan pengelusi alkohol

96 %. Hal ini bertujuan untuk memisahkan antara senyawa yang memiliki

bobot molekul tinggi dengan senyawa yang bobot molekulnya rendah.

Sephadex LH-20 merupakan gel yang umum digunakan dalam isolasi

bahan alam untuk senyawa yang bersifat non polar atau semi polar (Sarker,

et al., 2006). Dari fraksinasi menggunakan kolom sephadex LH-20

menghasilkan 15 fraksi dengan bobot masing-masing fraksi yaitu 205 mg

(F.1), 387 mg (F.2), 58,9 mg (F.3), 40,2 mg (F.4), 47 mg (F.5), 9,7 mg

(F.6), 21 mg (F.7), 4,1 mg (F.8), 1,5 mg (F.9), 2,2 (F.10), 22,2 mg (F.11),

1,8 mg (F.12), 1,2 mg (F.13), 0,6 mg (F.14), 15,2 mg (F.15).

Fraksi F.5 yang berjumlah 47 mg difraksinasi kembali

menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam silica gel (70-230

mesh) yang bertujuan untuk memisahkan senyawa dengan polaritas yang

berbeda. Eluen yang digunakan dipilih berdasarkan optimasi kondisi

kolom, dengan memilih perbandingan eluen yang memberikan nilai Rf

fraksi target sekitar 0,3 yaitu dimulai dari kloroform : metanol

perbandingan 10:1. Fraksi yang didapatkan sejumlah 10 fraksi dengan

bobot masing-masing fraksi yaitu 3,4 mg (F.5.1), 3,2 mg (F.5.2), 1,7 mg

(F.5.3), 2,9 mg (F.5.4), 4,7 mg (F.5.5), 3,5 mg (F.5.6), 0,3 mg (F.5.7), 9,8

mg (F.5.8), 7,3 mg (F.5.9), 10,5 mg (F.5.10). Hasil fraksinasi dapat dilihat

pada gambar 4.6

46


Gambar 4.5.Hasil fraksinasi F.5 menggunakan kromatografi kolom

dengan Fase diam Silica gel 70-230 mesh.

Gambar 4.6. Noda bercak yang muncul pada pelat KLT preparatif setelah

dielusi dengan eluen koroform:metanol 7:1

Fraksi F.5.8 sebanyak 9,8 mg dilanjutkan dengan purifikasi

menggunakan kromatografi kolom preparatif. Sebelumnya, larutan fraksi

dilarutkan dalam aseton dengan konsentrasi 5 mg/mL dan dioptimasi

dengan eluen yang sesuai untuk mendapatkan kondisi optimum untuk

preparatif pada pelat KLT. Eluen yang digunakan adalah kloroform :

metanol dengan perbandingan 7:1. Hasil elusi dapat dilihat pada gambar

4.7

Noda bercak yang muncul dikerok dengan spatula logam diatas

kertas bersih, dibilas dengan aseton dan kemudian disaring. Filtrat

47


dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator dan dikeringkan dengan

gas nitrogen. Dari hasil preparatif, didapat dua fraksi masing-masing

F.5.8a yang berupa serbuk berwarna oranye dengan bobot 4,5 mg dan

F.5.8b yang berupa serbuk berwarna jingga-merah dengan bobot 5 mg.

Kedua fraksi dielusi dengan kloroform : metanol perbandingan 7:1,

Fraksi F.5.8.a memiliki nilai Rf sebesar 0, 41 sedangkan fraksi F.5.8.b

memiliki nilai Rf sebesar 0,24. Hasil ditunjukkan pada gambar 4.7.

Gambar 4.7. Hasil KLT preparatif fraksi F.5.8. a) Fraksi F.5.8.a

b) Fraksi F.5.8.b

Setelah didapatkan fraksi murni, maka dilakukan uji kemurnian

fraksi. Uji kemurnian yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan

KLT dua dimensi. KLT dua dimensi dilakukan dengan mengaplikasikan

satu sampel tunggal pada pelat KLT dan dielusi menggunakan dua proses

pengembangan. Pelat KLT awalnya dikembangkan dengan sistem

pengembang pertama, dibiarkan kering dan kemudian dilanjutkan elusi

dengan menggunakan sistem pengembang kedua (Cazes, 2004).

Hasil KLT 2 dimensi terhadap fraksi murni menggunakan eluen

Kloroform : Metanol (7:1) dan Kloroform : Metanol (5:1) ditunjukkan

pada gambar 4.8

48


(a) (b)

Gambar 4.8. Hasil KLT 2 dimensi fraksi murni. a) F.5.8.a b) F.5.8.b

4.6. Uji Aktivitas Antibakteri Hasil Purifikasi

Dari hasil fraksinasi, didapat dua fraksi murni yang dideteksi

dengan kromatografi lapis tipis (KLT) yaitu fraksi F.5.8.a dan F.5.8.b.

Kedua fraksi dengan spot tunggal tersebut dilanjutkan dengan melakukan

penentuan nilai KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) dengan metode

mikrodilusi cair. Metode mikrodilusi cair ini merupakan adaptasi dari

metode makrodilusi. Hanya saja pada metode mikrodilusi cair, digunakan

pelat plastik microtiter wellplate sehingga memungkinkan penggunaan

pelarut dan sampel dalam jumlah yang kecil (Schwalbe, et al., 2007).

Sebagai kontrol positif digunakan antibiotik kloramfenikol dan

eritromisin. Kloramfenikol merupakan antibakteri spektrum luas yang

berkhasiat bakteriostatis terhadap hampir semua bakteri gram positif dan

gram negatif (Hoan Tjay, et al., 2002) sedangkan eritromisin merupakan

antibiotik yang bersifat bakteriostatis terhadap bakteri terutama bakteri

gram positif (Hoan Tjay, et al., 2002). Data hasil uji KHM fraksi murni

melawan bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dapat

dilihat pada tabel 4.3

49


Pada uji KHM, Suspensi bakteri uji yang digunakan berisi koloni

bakteri sebanyak 105 CFU/mL, bakteri uji yang dipipet sebanyak 100 µL

kedalam masing-masing sumur yang berisi seri pengenceran larutan uji

dan media MHB. Inkubasi dilakukan selama 20 jam pada suhu 370C,

adanya aktivitas penghambatan antibakteri ditunjukkan pada sumur

dimana konsentrasi larutan uji masih mempertahankan kebeningannya

pada pengamatan visual. Untuk mempermudah pengamatan, maka

digunakan reagen IodoNitroTetrazolium (INT) yang akan tereduksi oleh

enzim dehidrogenase pada bakteri menjadi formazan sehingga akan terjadi

perubahan warna dari tak berwarna menjadi warna merah. Dari hasil uji

KHM, diketahui bahwa terjadinya aktivitas penghambatan antibakteri

Staphylococcus aureus dari fraksi F.5.8.a (256 µg/mL) dan F.5.8.b

(256 µg/mL). Pada uji KHM terhadap bakteri E.coli, diketahui F.5.8 a dan

F.5.8b menghambat pertumbuhan bakteri masing-masing pada konsentrasi

128 µg/mL. Bila dibandingkan dengan hasil uji terhadap larutan kontrol

positif, kloramfenikol mampu memberikan nilai KHM sebesar 4 µg/mL

terhadap S. aureus dan 8 µg/mL terhadap E.coli. Sedangkan eritromisin

memberikan nilai KHM sebesar ≤1 µg/mL terhadap S.aureus dan

64 µg/mL terhadap E. coli.

Pada uji KHM digunakan juga kontrol lain berupa GC (Growth

Control) yaitu kontrol pertumbuhan yang menunjukkan bahwa bakteri uji

dapat tumbuh pada kondisi atau perlakuan uji ditandai dengan larutan GC

terlihat keruh atau berwana merah setelah penambahan reagen INT yang

Tabel 4.3 Data Hasil Uji KHM terhadap bakteri S.aureus dan E.coli

No Larutan Uji Nilai KHM( µg/mL)

S.aureus E.coli

1 F.5.8a 256 128

2 F.5.8b 256 128

3 Eritromisin ≤1 64

4 Kloramfenikol 4 8

50


menandakan terjadinya pertumbuhan bakteri, SC (Sterility Control) yaitu

kontrol sterilitas yang berisi medium saja untuk menjamin bahwa medium

atau pelat microtiter yang digunakan steril dan tidak ditumbuhi bakteri,

ditandai dengan tidak keruhnya larutan SC sebagai tanda bahwa tidak ada

bakteri yang tumbuh dan SoC (Solvent Control/ kontrol pelarut) yang

berisi pelarut dan media yang menunjukkan bahwa pelarut yang digunakan

tidak mempengaruhi konsentrasi hambat larutan uji terhadap bakteri

artinya larutan SoC terlihat keruh/berwarna merah setelah penambahan

reagen INT.

4.7 Pengamatan Morfologi Jamur Endofit GKBt 2 pada medium

PDA (Potato Dextrose Agar)

Identifikasi jamur GKBt 2 secara makroskopis dilakukan dengan

melihat karakter seperti warna dan permukaan koloni, ada tidaknya garis

radial serta ada tidaknya garis konsentris (Gandjar, 1999). Hasil

identifikasi jamur secara makroskopis yang diinokulasi pada medium PDA

pada hari ke-7 menunjukkan ciri dengan tekstur permukaan seperti kapas,

warna krem dengan bagian tengah berwarna hijau tua kecoklatan dan

bagian tepi rata, bagian tengah berwarna, miselia tumbuh cepat (fast

growing) dan memiliki garis radial dan konsentris sedangkan tampak

belakang terlihat koloni berwarna kuning kecoklatan dengan bagian tengah

berwarna coklat, memiliki garis radial dan konsentris (Gambar. 4.9 a dan

4.9.d). Terjadi perubahan warna koloni pada hari ke-7, ke-14 hingga ke-

20. Pada hari ke-14, warna pada tampak belakang koloni menjadi abu-abu

–hitam (Gambar 4.9.b dan 4.9.e) sedangkan pada hari ke-20 berwarna

hitam (Gambar 4.9.c dan 4.9.f).

Sedangkan identifikasi jamur GKBt 2 secara mikroskopis

dilakukan dengan melihat karakter hifa (berseptum atau tidak), hifa

berwarna, tidak berwarna atau gelap, spora seksual atau spora aseksual.

Hasil pengamatan secara mikroskopis menunjukkan bahwa hifa jamur

berseptat dan berwarna gelap (hitam keabu-abuan), spora aseksual

berbentuk sederhana seperti klamidospora interkalar (Gambar 4.9.h dan

51


4.9.i). Diduga jamur GKBt 2 merupakan jamur yang berasal dari kelas

Hypomycetes family Dematiaceae. Hypomycetes merupakan fungi yang

hanya membentuk miselium dan tidak memiliki ascocarp (Gandjar, 2006).

Pada fungi kelas Hypomycetes umumnya memiliki miselia steril atau

dengan spora yang tidak diproduksi pada acervuli maupun pycnidia

(Vashsista,1992). Hifa kapang dematiaceae umumnya berwarna coklat,

kehijauan atau kehitaman, hitam kelam atau hitam keabuan (Gandjar,

1999).

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

52


(g) (h) (i)

Gambar.4.9. Pengamatan Morfologi Jamur Endofit GKBt 2 pada medium

PDA (a) umur 7 hari / tampak depan (b) umur 14 hari/ tampak depan (c)

umur 20 hari/ tampak depan (d) umur 7 hari /tampak belakang e) umur 14

hari/ tampak belakang (f) umur 20 hari/ tampak belakang (g) Pengamatan

mikroskopik fungi Dematiaceae pada mikroskop cahaya perbesaran 600x

(Lestari, 2008) (h) dan (i) Pengamatan mikroskopik pada mikroskop

cahaya perbesaran 1000x.

53 UIN Syarif Hdayatullah Jakarta

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Dari hasil skrining aktivitas antibakteri, terdapat ekstrak etil asetat dari isolat jamur

endofit yang memiliki aktivitas antibakteri paling besar yaitu ekstrak etil asetat

dari isolat jamur GKBt 2

2. Dari hasil fraksinasi dan pemurnian didapatkan dua fraksi murni yaitu fraksi

F.5.8a (4,5 mg) dan F.5.8b (5 mg)

3. Hasil uji KHM menunjukkan bahwa F.5.8a dan F.5.8b aktif melawan bakteri uji S.

aureus masing-masing sebesar 256 µg/mL sedangkan nilai KHM terhadap bakteri

uji E. coli masing-masing sebesar 128 µg/mL.

4. Dari hasil identifikasi, jamur GKBt 2 diduga merupakan jamur kelas Hypomycetes,

family Dematiacea.

5.2 Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap fraksinasi dan pemurnian

fraksi lain pada jamur endofit GKBt 2 yang memiliki aktivitas terhadap bakteri uji

yang lebih tinggi.


DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, Mahbob, Noor, Z.M., Ismail, N.H., Lajiz, N.H., Shaari, K., 2010.

Evaluation of Antioxidant Potential of Medicinal Plants from

Malaysian Rubiaceae ( subfamily Rubioideae). African Journal of

Biotechnology. Vol 9, No.46, pp. 7948-7954.

Casez, 2004. Encyclopedia of Chromatography. USA : University of

Toronto and Marcel Dekker.Inc

Choma, I., 2005. The Use of Thin-Layer Chromatography with Direct

Bioautography for Antimicrobial Analysis. LCGC Europe, Vol 18,

Issue 9, Desember 2005. Diakses pada 5 Januari 2013 pada

http://www.chromatographyonline.com

Choma, I.M & Grzelak, E.M., 2010. Bioautographic detection in thin-layer

chromatography. Journal Of Chromatography A. Poland : Elsevier.

Day, R.A., A.L, Underwood. 2002. Analisis kimia Kuantitatif. Jakarta:

Erlangga.

Gandjar, I.G., Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta :

Pustaka Pelajar.

Gandjar, I., R., A., Samson, K. Van den Tweel-Vewmeulen, A.Oetari, I.,

Santoso. 1999. Pengenalan Kapang Tropik Umum. Jakarta :

Yayasan Obor Indonesia.

Gandjar, I., W. Sjamsudrizal, dan A. Oetari. 2006. Mikologi :Dasar dan

Terapan. Jakarta : Yayasan Obor Indonesia.

Hoan tjay, T., Rahardja, K., 2002. Obat-obat penting : khasiat,

penggunaan dan efek sampingnya.5th ed. Jakarta : PT Elex Media

Komutindo.

Ismail, NH., Alias, A., Osman, C.P. 2012. Alkaloids and Antraquinones

from Malaysian Flora, Phytochemicals - A Global Perspective of

Their Role in Nutrition and Health, Diakses di

www.intechopen.com pada 20 Februari 2013.

Jamal, Y., Praptiwi, Fathoni, A., Agusta, A., 2011. Bioproduksi

Flouroglusinol oleh Endofit Coelomicetes AFAS-AF3 yang

http://www.chromatographyonline.com/

http://www.intechopen.com/

55


Diisolasi dari Tumbuhan Archangelesia flava L.Merr. Berkas

Penelitian Hayati Vol. 16, hal 169-172.

Kusumaningtyas, E., Astuti, E., Darmono. 2008. Sensitivitas Metode

Bioautografi Kontak dan Agar Overlay dalam penentuan senyawa

anti kapang. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. Vol.6, No.2, hal

75 – 79.

Labeda, D., P., 1990. Isolation biotechnologic Organisme From Nature.

New York : McGraw- Hill Publishing Company.

Lestari. I., D., 2008. “Kajian Awal Potensi Tumbuhan Indigeous dan

Keragaman Funginya untuk Revegetasi Lahan Bekas Tambang

Timah di Pulau Bangka”. Program Pasca Sarjana. Institut Pertanian

Bogor.

Liang, H., Xing, Y., Chen, J., Zhang, D., Guo, S., Wang, C. et al., 2012.

Antimicrobial activities of endophytic fungi isolated from

Ophiopogon japonicus (Liliaceae). BMC Complementary and

Alternative Medicine. Beijing.

Mardiastuti, Kurniawan, A., Kiranasari, A., Ikaningsih, Kadarsih, R.,

2007. Emerging Resistance Pathogen: Situasi Terkini di Asia,

Eropa, Amerika Serikat, Timur Tengah dan Indonesia. Majalah

Kedokteran Indonesia, Vol.57, No.3.

Mycek, Mary, J., Harvey, R.A., Champe, P.,C., 2001. Farmakologi :

Ulasan Bergambar Edisi 2. Jakarta : Penerbit Widya Medika.

Nithya, K. & Muthumary, J., 2011. Bioactive Metabolite Produced By

Phomopsis Sp, an Endophytic fungus in Allamanda cathartica

Linn. Recent Research in Science and Technology. Vol.3, No.3, p

44-48.

Osman, C.P., Ismail, N.H., Ahmad, R., Ahmat, N., Awang, K., Jaafar,

F.M., 2010. Anthraquinones with Antiplasmodial Activity from the

Roots of Rennellia elliptica Korth. (Rubiaceae). Molecules. Vol.

15, hal : 7218-7226;

Parija, C.,S., 2009. Textbook of Microbiology & Immunology. India : El

sevier.

56


Pelczar, M.,J., & E.,C.,S., Chan .1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid I.

Penterjemah: R.S. Hadioetomo et al. Jakarta: UI Press.

Pratiwi, S.,T., 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga.

Prescott, L.M., JP, Harley, D.A. Klein. 2005. Microbiology, 6th Ed. New

York : McGraw-Hill Co Inc.

Sarker, D.S., Latif Zahid, Gray, I.A. 2006. Natural Product Isolation, 2nd

edition. New Jersey : Humana Press Inc.

Schwalbe, R., Steele-Moore, L., Goodwin, A.,C., 2007. Antimicrobial

Susceptibility testing Protocols. USA : CRC Press.

Setiabudy, R., 2007. Farmakologi Dan Terapi. Ed5. Departemen

Farmakologi dan Terapeutik FKUI, Jakarta : Balai Penerbit FKUI.

Species 2000 & ITIS Catalogue of Life. 2010. Indexing The World’s

Known Species. Diakses tanggal 5 januari 2013, di

http://www.catalogueoflife.org/annualchecklist/2010/details/specie

s/id/4088607

Strobel, G.A., Daisy, B., 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes

and Their Natural Products. Vol. 67, No. 4 p. 491–502. American

Society for Microbiology.

Suratman. 2008. The Indonesian Species of Rennellia Korth. (Rubiaceae).

Jurnal Biodiversitas. Vol 9, No. 4, hal 259 – 263.

Talaro, K.,P., 2005. Foundation in Microbiology, 5th ed. New York : Mc

Graw Hill Higher Education.

Valgas, C., de Souza, S.M., Smania, E.F., Smania, A. 2007. Screening

Methode To Determine Antibacterial Activity Of Natural Product.

Brazilian Journal of Microbiology. Vol 34, p 369-380.

Vashista, B.,R., 1992. Botany for Degree Student: Fungi. S.Chand and

Company.

Zhao, J., Mou, Y., Shan, T., Li, Y., Zhou, L., Wang, M., Wang, J., 2010.

Antimicrobial Metabolites from the Endophytic Fungus Pichia

guilliermondii Isolated from Paris polyphylla var. Yunnanensis.

Jurnal molekul, Vol 15.

http://eol.org/content_partners/14

http://www.catalogueoflife.org/annualchecklist/2010/details/species/id/4088607

http://www.catalogueoflife.org/annualchecklist/2010/details/species/id/4088607

57


Zhao, J., Zhou, L., Wang, T., Shan, T., Zhong, L., Liu1, X., dan Gao, X.,

2010. Endophytic fungi for producing bioactive compounds

originally from their host plants. Current research, Technology and

education Topics in applied Microbiology and Microbial

Biotechnology.

Zuhud, E. A.,M., 2009. Potensi Hutan Tropika Indonesia sebagai

Penyangga Bahan Obat Alam untuk Kesehatan Bangsa. Jurnal

Bahan Alam Indonesia. Vol. 6, No.6, hal : 227-232.

58

Lampiran 1. Alur Penelitian

Ekstraksi hasil scalling Up Jamur endofit

Jamur diiidentifikasi

secara morfologi

Scalling Up kultivasi Jamur dengan aktivitas antibakteri paling

besar

Skrining aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi

Skrining produksi metabolit sekunder ekstrak

Ekstraksi hasil kultur jamur endofit

Masing-masing 23 isolat jamur endofit yang diisolasi dari akar, batang, daun dan biji Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia

elliptica Korth)

Kultivasi pada medium PDB

Isolasi metabolit sekunder

F1 F2

F3 F4 F5

Fn

Fraksi murni dan aktif

Uji nilai MIC

59


Lampiran 2. Bagan Kerja Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi

Pelat KLT

Ditotolkan 10 μL pada pelat KLT ukuran 8 x 8 cm

Kons. Ekstrak 10 mg/mL dalam aseton

23 ekstrak etil asetat jamur endofit dari

Ginseng Kuning

Dicelupkan pada cawan petri steril yang berisi suspensi

bakteri uji

Terbentuk zona bening pada latar pelat KLT berwarna

merah (Aktivitas antibakteri (+) )

Diletakkan pada cawan petri yang telah diletakkan kapas steril basah

Inkubasi selama 20 jam pada suhu 37 0C

Disemprotkan INT 4 mg/mL ke permukaan pelat

60


Lampiran 3. Bagan Kerja Scaling Up dan Ekstraksi Hasil Scaling Up

Ekstraksi dengan etil asetat 3x

Dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator

Dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator

Evaporasi ekstrak dengan vacum rotary evaporator

Ekstrak pekat

Ekstak Heksana

Ekstrak pekat

Ekstak Metanol

Dilarutkan dengan 100 mL metanol partisi dengan 100 mL heksana 3 x

Ekstrak pekat

Ekstrak EtOAc

Fraksi air

Dipekatkan dengan vacum rotary evaporator

Ekstrak pekat

Media

Ekstraksi dg etil asetat 3 x

Ekstrak Ekstrak

Maserasi dengan aseton 3 x

Biomassa

Diinkubasi 3 minggu pada suhu kamar dengan kondisi statis

500 mL x 4 erlemeyer ukuran 2 L

200 mL x 15 erlenmeyer ukuran 500 mL

Diinokulasi pada media PDB didalam

erlenmeyer

Isolat GKBt 2 pada media PDA miring

Diinokulasi pada media PDA miring sebagai Stock Culture

61


Lampiran 4. Bagan Kerja Fraksinasi

F.5.8.b

5 mg

F.5.8.a

4,5 mg

Purifikasi menggunakan KLT preparatif dengan eluen Kloroform : Metanol 7:1

F.5.10

10,5 mg

F.5.9

7,3 mg

F.5.8

9,8 mg

F.5.7

0,3 mg

F.5.6

3,5 mg

F.5.5

4,7 mg

F.5.4

2,9 mg

F.5.3

1,7 mg

F.5..2

3,2 mg

F.5.1

3,4 mg

Fraksinasi menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam silica 70 – 230 mesh, menggunakan fase gerak kloroform : Metanol (10:1, 5:1, 0:1)

F.8

4,1mg

F.14

0,6mg

F.15

15,2mg

F.13

1,2mg

F.12

1,8mg

F.11

22,2mg

F.10

2,2mg

F.9

1,5 mg

F.7

21 mg

F.6

9,7mg

F.5

47 mg

F.4

40,2mg

F.3

58,9mg

F.2

387 mg

F.1

205 mg

Fraksinasi menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam Sephadex LH 20, menggunakan fase gerak Alkohol 96 %

Ekstrak media GKBt2 830 mg

62


Lampiran 5. Perhitungan Koloni Bakteri

1. Koloni bakteri S.aureus


Jumlah koloni suspensi = 105x106 / 10-1

= 1,05 x 109

Diencerkan menjadi koloni 105 CFU/mL :

2. Koloni Bakteri E.coli


Jumlah koloni suspensi = 65x108 / 10-1

= 6,5 x 1010

Diencerkan menjadi koloni 105 CFU/mL :

63


Lampiran 6. Skema Pengenceran Larutan Uji

Kemudian, ditambahkan inokulum bakteri uji kedalam larutan uji masing-masing sumuran 100 µL :

64

Lampiran 7. Hasil Uji MIC

(a) (b) (c) (d)

(e) (f) (g) (h)

a. Fraksi F.5.8.a terhadap S. aureus e. Fraksi F.5.8.a terhadap E. coli

b. Fraksi F.5.8.b terhadap S. aureus f . Fraksi F.5.8.b terhadap E. coli

c. Eritromisin terhadap S. aureus g. Kloramfenicol terhadap E.coli

d. Kloramfenikol S. aureus h. Eritromisin terhadap E. coli

SC = Sterility Control; GC = Growth Control ;SoC = Solvent Control.

65


Lampiran 8. Gambar hasil pewarnaan gram pada bakteri uji

(a) (b)

Gambar hasil pewarnaan gram pada pengamatan menggunakan mikroskop

cahaya,

a. Hasil pewarnaan gram pada bakteri gram positif / S.aureus (perbesaran

40x10)

b. Hasil pewarnaan gram pada bakteri gram negatif / E.coli (perbesaran

40x10x10)

66


Lampiran 9. Komposisi Media

1. Media Potato Dextrose Agar / PDA (DifcoTM)

Bahan Jumlah

Agar-agar 15 g

Seduhan kentang 4 g

Dekstrosa 20 g

Air 1 L

pH akhir 5,61± 0,2, suhu 250

C

Cara Pembuatan :

39 gram PDA disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut

sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.

2. Media Potato Dextrose Broth /PDB (DifcoTM)

Bahan Jumlah

Pati kentang 4 g

Dekstrosa 20 g

Air 1 L

pH akhir 5,1± 0,2, suhu 250 C

Cara Pembuatan :

24 gram PDB disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut

sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit

67


3. Media Mueller Hinton Broth / MHB (Criterion)

Bahan Jumlah

Asam kasein hidrolisis 17,5 g

Ekstrak sapi 2 g

Pati 1 ,5 g

Air 1 L

pH akhir 7,4 ± 0,2, suhu 25 0C

Cara pembuatan:

21 gram MHB disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut


4. Media Nutrient Agar /NA (DifcoTM)

Bahan Jumlah

Agar 15 g

Gelatin pepton 5 g

Ekstrak daging sapi 3 g

Air 1 L

pH akhir 7,4 ± 0,2 suhu 25 0C

Cara pembuatan:

23 gram NA disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut


68


5. Media Mueller Hinton Agar /MHA (CriterionTM)

Bahan Jumlah

Asam Kasein Hidrolisat 17,5 g

Ekstrak Daging Sapi 2 g

Pati 1,5 g

Agar 17 g

Air 1 L


Cara pembuatan:

38 gram MHA disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut

sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit

6. Media Brain Heart Infussion/BHI ( BBLTM)

Bahan Jumlah

Brain Heart, Infusion from (solids) 6 g

Peptic Digest of Animal Tissue 6 g

Sodium Klorida 5 g

Dekstrosa 3 g

Pancreatic Digest of Gelatin 14,5g

Disodium fosfat 2,5


Cara pembuatan:

37 gram BHI disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut


69


Lampiran 10. Gambar Alat-Alat yang Digunakan

Rotary evaporator Incubator

Shaker incubator UV Cabinet

Mikroskop cahaya

Laminar air flow Autoklave Oven

Timbangan digital

skrining, isolasi, dan uji aktivitas antibakteri …

Documents