Sklonost ka krvarenju zbog poremedaja formiranja primarnog

ugruška

Prof. Dr Dragan Gvozdid

2020-21.

Vežba 7-8.

1

Hemostaza – zaustavljanje krvarenja

• Tri preklapajuda procesa:

1. Obrazovanje primarnog ugruška (primarna hemostaza)

2. Pretvaranje primarnog ugruška u stabilan ugrušak ojačan fibrinom (koagulacija)

3. Fibrinoliza

2

Sažetak 1

1) Prva faza u procesu hemostaze je stvaranje primarnog tromba. Da bi se formirao primarni tromb neophodno je da dođe do aktivacije, adhezije i agregacije trombocita uz pomod fon Vilebrandovog faktora - fVF (nem. von Willebrand Factor);

2) Poremedaji u stvaranju primarnog tromba koji dovode do sklonosti ka krvarenju nastaju kada postoji trombocitopenija, trombopatija i kada nedostaje fVF;

3) Osnovna dijagnostika poremedaja formiranja primarnog tromba uključuje: određivanje vremena krvarenja, broja trombocita i koncentracije fVF

3

Prva faza hemostaze:

• Aktivacija trombocita: inicijalna aktivacija trombocita se odigrava u kontaktu sa kolagenom, pod dejstvom trombina, tromboksana A2 (koga stvaraju sami trombociti) i adenin dinukleotid fosfata (ADP) koji se oslobađa iz granula trombocita

• Jedna od posledica aktivacije je višestruko povedanje površine membrane trombocita kao i promena položaja fosfatidilserina (fosfolipida) koji sa unutrašnje prelazi na spoljnu stranu membrane

4

Fosfatidilserin

• Ovaj fosfolipid je nosilac negativnog naelektrisanja koje omogudava vezivanje faktora koagulacije pomodu Ca++ i njihovo lokalizovanje na mestu stvaranja primarnog tromba

5

Adhezija i agregacija trombocita:

• Za adheziju je neophodno da se u plazmi nalazi kompleksni multimerni protein označen kao fon Vilebrandov faktor, a na trombocitima b1 integrin - receptor za fVF

• Ovaj protein je zapravo spona koja povezuje trombocite i kolagena vlakna na ogoljenom subendotelu

• Deficit fVF dovodi do najčešdeg urođenog poremedaja hemostaze kod pasa

• Agregacija trombocita se odigrava paralelno sa adhezijom

• Agregaciju obezbeđuje fibrinogen koji povezuje trombocite preko specifičnih receptora (b3 integrina)

6

I na kraju...

• Poslednji efekat aktivacije trombocita je njihova kontrakcija koja čini osnovu retrakcije koaguluma

7

Poremedaji prve faze hemostaze:

• Pada broja trombocita

• Poremedaj funkcije trombocita

• Nedostatka fVF

8

Trombocitopenija:

• Pad broja trombocita nastaje zbog njihovog

– smanjenog stvaranja (ređe),

– ubrzane potrošnje (diseminovane intravaskularne koagulacije),

– ubrzanog uklanjanja iz cirkulacije (imunski posredovana) i/ili sekvestracije u slezini kada je ona uvedana

• Za sve vrste domadih životinja (osim živine) smatra se da je trombocitopenija pad broja trombocita ispod 100 x 109/L

• Pad broja trombocita na oko 50 x 109/L najčešde ne dovodi do kliničkih znakova bolesti, ali tokom hirurških intervencija može dovesti do obilnih krvarenja

• Pad broja trombocita ispod 25 x 109/L vrlo često dovodi do klinički vidljive sklonosti ka krvarenju

9

Kliničke manifestacije trombocitopenije:

• Krvarenje u koži i sluzokoži: – Petehije - jasno ograničena tačkasta krvarenja na koži

– Ehimoze – jasno ograničena tačkasta krvarenja na serozama i mukozama

– Purpure – nešto veda krvarenja u koži (do 1 cm prečnika)

• Produženo estralno krvarenje (kuje)

• Melena – svarena krv u fecesu

• Hematurija – krv u mokradi

• Krvarenja u meka tkva – infiltracije, sugelacije, sufuzije

10

Trombocitastenija:

• Urođeni poremedaji se odnose na nedostatak specifičnih receptora na trombocitima ili poremedaja u građi membrana organela trombocita

• Stečeni poremedaji u funkciji trombocita nastaju tokom uremije, poremedaja funkcije jetre, postojanja neoplazija, infekcije sa rikecijom Ehrilchia canis, infekcije FeLV, tokom DIK-a, primene nesteroidnih antiinflamatornih lekova (NSAIL) i kortikosteroida

11

Deficit fVF

• Nedostatak fVF kod pasa (prevashodno pasa rase dobreman) je najčešdi genetski defekt koji je praden poremedajem hemostaze

• Vedina nosilaca mutacije ima subklinički oblik bolesti koji prelazi u klinički ukoliko se kod životinje pojavi i trombocitopenija ili trombopatija, pri čemu je stvaranje primarnog tromba višestruko poremedeno

• Najjednostavnija metoda kojom se može utvrditi teži deficit fVF je određivanje vremena krvarenja

12

Testovi za prvu fazu hemostaze:

• Brojanje trombocita

• Procena broja trombocita sa krvnog razmaza

• Određivanje bukalnog vremena krvarenja (Buccal Mucosal Bleeding Time, BMBT)

• Određivanje koncentracije fVF

13

Brojanje trombocita

• 1% rastvor amonijum oksalata u destilovanoj vodi • Rastvor amonijum oksalata lizira eritrocite, i stabilan je mesec dana,

ali ga svaki put pre upotrebe treba obavezno profiltrovati • U melanžer za eritrocite krv se uvlači do oznake 1, a rastvor do

oznake 101 • Sadržaj se blago promudka, prva kap iz melanžera se odbaci, a zatim

se napuni komorica za brojanje, koja je prethodno pokrivena tankom ljuspicom koja se koristi za preparate

• Komora se postavi u vlažnu komoru 30 minuta, a zatim se trombociti broje na velikom uvedanju u pet polja (80 najmanjih kvardratida), kao i eritrociti

• Trombociti se vide kao svetlucave pločice koje prilikom podešavanja mikrometarskog zavrtnja refraktuju svetlost

14

• Primer:

100/80 x 400 x 10 x 100 x 106/L= 500 x 109/L

15

Procena broja trombocita sa krvnog razmaza:

• Broj trombocita se može aproksimativno proceniti brojanjem trombocita pod imerzionim uveličanjem na 10 mikroskopskih polja i izračunavanjem njihove prosečne vrednosti

• Dobijeni broj se ponoži sa faktorom 20 x 109 da bi se dobio aproksimativan broj trombocita u litri krvi

• Primer :

Prosečna broj trombocita na 10 vidnih polja je 12

Broj trombocita u litri krvi je: 12 x 20 = 240 x 109/L

16

Vreme krvarenja:

• Vreme krvarenja se izvodi tako što se životinja (pas) anestezira ili sedira

• Gornja usna se zavrne tako da se vidi sluznica i fiksira se blagim vezivanjem njuške

• Posebnom vrstom lancete napravi se 5 mm dučak, plitak rez na sluznici i ukljudi štoperica

• Svaka kap krvi koja se pojavi uklanja se filtar papirom

• Štoperica se isključuje kada nove kapi krvi prestanu da se pojavljuju. Kod pasa ovo vreme iznosi 2 do 4 minuta, a kod mačaka 3 do 4 minuta.

17

Vreme krvarenja – buccal mucosal bleeding time - BMBT

1 -5 minuta

18

ZADATAK 1:

• Nacrtati šemu prve faze hemostaze koja uključuje sledede elemente: trombocite, ogoljeni kolagen, fon Vilebrandov faktor i fibrinogen.

19

20

ZADATAK 2:

• Odrediti približan broj trombocita sa krvnog razmaza:

1. Krvni razmaz je napravljen iz krvi (navedi vrstu):

________________________________________

2. Razmaz je obojen (navedi metodu):

________________________________________

3. Približan broj trombocita iznosi (upiši formuli i izračunaj):

________________________________________

21

Sklonost ka krvarenju zbog poremedaji koagulacije krvi

Prof. Dr Dragan Gvozdid

2018-19.

Vežba 8.

22

Hemostaza – zaustavljanje krvarenja

• Tri preklapajuda procesa:

1. Obrazovanje primarnog ugruška (primarna hemostaza)

2. Pretvaranje primarnog ugruška u stabilan ugrušak ojačan fibrinom (koagulacija)

3. Fibrinoliza

23

Sažetak vežbe:

1) Koagulacija je druga faza hemostaze čija efikasnost zavisi od koncentracije faktora koagulacije ali i od koncentracije inhibitora koagulacije

2) Sklonost ka krvarenju može nastati zbog nedostatka faktora koji učestvuju u unutrašnjem, spoljašnjem i zajedničkom putu koagulacije

3) Određivanjem grupnih vremena koagulacije može se utvrditi koji put koagulacije je poremeden

4) Diseminovana intravaskularna koagulacija nastaju kao kombinacija poremedaja stvaranja primarnog tromba, koagulacije i fibrinolize

24

Koagulacija:

• Koagulacija se odvija kroz niz kaskadnih proteolitičkih reakcija u koje se po određenom redosledu uključuju svi faktori koagulacije iz cirkulacije

• Koagulacija se završava stvaranjem fibrinskog ugruška koji je posledica pretvaranja rastvorljivog molekula fibrinogena koji teče krvlju, u gel stanje povezanih molekula fibrina koji zatvaraju defekt krvnog suda

25

26

27

Unutrašnji put koagulacije:

• Unutrašnji put koagulacije (kontaktni put) se aktivira po kontaktu XII faktora koagulacije sa negativno naelektrisanim kolagenim vlaknima

• Osim XII faktora, u njemu učestvuju i VIII, IX i XI faktor, Ca++ joni i negativno nalektrisani fosfolipidi poreklom iz trombocita.

• Za odvijanje unutrašnjeg puta koagulacije in vivo, i in vitro neophodno je prisustvo svih faktora koagulacije koji učestvuju u unutrašnjem i zajedničkom putu koagulacije kao i prisustvo Ca++ jona i fosfolipida trombocita (Šema 1)

28

Spoljašnji put koagulacije:

• Za odvijanje spoljašnjeg puta koagulacije (put tkivnog faktora) je neophodno prisustvo tkivnog faktora koji se oslobađa iz oštedenog tkiva, VII faktora, faktora zajedničkog puta koagulacije i prisustvo Ca++ jona i fosfolipida trombocita

• Zajednički put koagulacije: oba puta koagulacije se susredu u aktivaciji X faktora

• Faktor Xa u kompleksu sa faktorom Va, vezan za fosfolipide na trombocitima i uz prisustvo Ca++ omogudava aktivaciju protrombina (šema 1)

29

APTT

• Aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme (APTT) je test kojim se meri aktivnost svih faktora koagulacije osim faktora VII i XIII i njime se utvrđuje aktivnost faktora unutrašnjeg i zajedničkog puta koagulacije

• Na vrednosti APTT ne utiče trombocitopenija

• Ovim testom se može odrediti pad aktivnosti faktora koagulacije ispod 30% od normalne vrednosti

• Kako ženke prenosioci gena za hemofiliju A ili B imaju aktivnost VIII ili IX faktora koagulacije od oko 60% fiziološke vrednosti, APTT ne može biti od koristi pri njihovom testiranju

30

Reagens za APTT sadrži:

• Kontakni aktivator koagulacije (različiti oblici silicijum dioksida, kaolin ili elagična kiselina) koji služi za kompletnu aktivaciju XII faktora i

• Tzv. „parcijalni tromboplastin“ koji se sastoji od fosfolipida koji zamenjuje površinu trombocita

• Fosfolipidi se uglavnom izdvajaju iz različitih tkiva životinjskog porekla

31

Određivanje APTT

• Za određivanje APTT se koristi reagens koji sadrži kaolin kao površinski aktivator koagulacije (imitira kolagen) i mešavinu visoko prečišdenih fosfolipida (imitiraju fosfolipide trombocita).

• Količina od 50 mL reagensa se meša sa 50 mL plazme i inkubira 2 minuta na 37°C

• Reakcija počinje kada se tom rastvoru doda 50 mL CaCl2 preinkubiranog na 37°C

• Uređaj za merenje vremena (tajmer) se automatski zaustavlja po formiranju fibrinskog koaguluma

32

APTT – fiziološke vrednosti:

• APTT:

• 50 mL reagensa +

• 50 mL plazme +

• 50 mL CaCl2 vreme?

• ------------------------

• Pas: 9-11 sec

• Mačka: 10-15 sec

• Konj: 25-45 sec

33

Promenjeno APTT

• APTT je produženo kod hemofilija, oboljenja jetre, deficita vitamina K, trovanja rodenticidima i DIK-a, kao i u nekim slučajevima lupus erythematosus-a (zbog stvaranja antitela na VIII faktor koagulacije koja dovode do njegovog brzog uklanjanja iz cirkulacije)

• APTT može da bude skradeno kod pojačane aktivnosti VIII faktora

• Faktor VIII je protein akutne faze i njegova koncentracija raste u toku akutnih i hroničnih inflamatornih stanja

34

PT

• Protrombinsko vreme (PT) je test kojim se meri aktivnost VII faktora i faktora zajedničkog puta koagulacije (osim XIII faktora)

• Reagens za PT sadrži takozvani „kompletni tromboplastin“ koji se sastoji od tkivnog faktora (rekombinantni ili izdvojen iz tkiva mozga različitih životinja) i fosfolipida koji zamenjuje površinu trombocita

• Uz to, u reagensu se nalazi i odgovarajuda količina CaCl2 za rekalcifikaciju citratne plazme

35

Određivanje PT

• Reagens za PT sadrži mešavinu tkivnog faktora i fosfolipida koji imatiraju površinu trombocita

• Uz to, u reagensu se nalazi i odgovarajuda količina CaCl2

• 100 mL reagensa za PT se inkubira 4 minuta na 37°C

• Dodaje 50 mL plazme preinkubirane 1 minut na 37°C

• Reakcija počinje odmah i tajmer se zaustavlja po formiranju fibrinskog koaguluma

36

PT – fiziološke vrednosti:

• PT:

• 100 mL reagensa

• 50 mL plazme vreme?

------------------------------------

• Pas 6.4 – 7.4 sec

• Mačka 7 – 11.5 sec

• Konj 9.5 – 11.5 sec

37

Promenjeno PT

• Protrombinsko vreme je produženo kod oboljenja jetre, ranog i kasnog deficita vitamina K, trovanja rodenticidima i DIK-a

• PT može biti produženo i kod primene kortikosteroida, tetraciklina i antikoagulantne terapije

38

Diseminovana intravaskularna koagulacija - DIK

• Najteži poremedaj hemostaze koji predstavlja kombinaciju:

1. Poremedaja stvaranja primarnog tromba

2. Poremedaja koagulacije krvi

3. Poremedaja fibrinolize

• Tromboembolija udružena sa hemoragičnom dijatezom – trombohemoragični poremedaj!

• Sekundarno – posledica primarnog poremedaja!

39

Diseminovana intravaskularna koagulacija - DIK

• Produženo APTT i PT

• Smanjena koncentracija fibrinogena

• Trombocitopenija

• Ubrzana fibrinoliza

• Povedanje fibrin degradacionih proizvoda (FDP) u koje spadaju i D-dimeri

40

DIK se javlja kod:

• Virusna infekcija

• Bakterijska infekcija

• Invazija protozoa

• Parazitska oboljenje

• Neoplazije

• Toplotni udar

• Sepsa

41

KLINIČKA KORELACIJA

Primer 1.

Opšti podaci o pacijentu: Persijska mačka, stara 4 godine

Anamneza: Dovedena na kliniku zbog iznenadnog krvarenja iz nosa. Klinički pregled: Brojne petehije po koži

Rezultati analize Referentne vrednosti

Hematološke analize Broj eritrocita (x1012/L) 4.8 5-10 Hematokrit (%) 23% 24-45

Hemoglobin (g/L) 75 g/L 80-150

Retikulociti 65 x109/L Proteini (g/L) 67 60-80

Broj leukocita (x109/L) 12 6-18

Segmentirani neutrofili 10 3-12

Mladi neutrofili 0 0-0.3

Limfociti 1.7 1.5-7

Monociti 0.85 0,05-0.85

Eozinofili 0 0.01-1,2

Procena broja trombocita† 1-2 ~ 10

†Procena broja trombocita sa krvnog razmaza (prosek na vidnom polju)

Pregled koštane srži: hiperplazija eritocitne loze i megakariocita. 42

Objašnjenje nalaza:

• Anemija, retikulocitoza i hiperplaziju eritrocitne loze upuduju na regenerativnu anemiju.

• Leukogram: nema stresa, nema inflamacije. • Trombocitopenija usled poremedaja u stvaranju trombocita u

koštanoj srži se može odbaciti zbog povedanja broja megakariocita. Sekvestracija trombocita je takodje odbačena jer palpacijom nije uočena organomegalija niti tumorska masa. Krvarenje skoro nikad ne daje značajnu trombocitopeniju. DIK ide uz preteranu inflamaciju, čega ovde nije bilo. Zaključeno je da je u pitanju imunski posredovana trombocitopenija, a da je blaga anemija nastala usled krvarenja prouzrokovanog trombocitopenijom.

• Terapija: • Data je terapija steroidima i stanje životinje se posle 10 dana

popravilo.

43

Primer 2.

Opšti podaci o pacijentu: Ženka

dobermana, 2 godine stara

Anamneza: već deset dana ima epistaksu,

melenu, gingivalna krvarenja i ehimoze i

petehije po sluznici usta. Epizodu

epistakse je imala i pre 3 meseca, ali je

ubrzo spontano prestala.

44

Rezultati analize Referentne vrednosti

Broj eritrocita (x1012/L) 1.5 5,5-8,5

Hematokrit (%) 9 37-55

Hemoglobin (g/L) 25 120-180

MCV (fL) 60 60-77

MCHC (g/L) 277 320-360

Broj retikulocita (x109/L) 278 ≤80

Morfologija eritrocita sferocitoza Broj leukocita (x109/L) 35 6-17

Eritroblasti/100 leukocita 7 Segmentirani neutrofili 23 3,6-11,5

Mladi neutrofili 2.8 0-0,3

Limfociti 2.1 1-4,8

Monociti 5.7 0,15-1,35

Eozinofili 1,4 0,01-1,25

Broj trombocita (x109/L) 12 200-900

Procena broja trombocita† retki

Proteini (g/L) 45 60-80

Hemostaza PT (s) 6 6-8

APTT (s) 18 12-21

Fibrinogen (g/L) 3,5 1,1-2,6

Plazma FDP (mg/mL) ≤5 ≤5

vWF: Ag (%) 12 70-180

Laboratorijske analize

†Procena broja trombocita sa krvnog razmaza

Rezultat ELISA testa u literaturi ima oznaku fVF: Ag (%) zato što se koncentracija fVF (u procentima) izražava u odnosu na

standardnu plazmu za koju je dogovoreno da je koncentracija fVF 100%. 45

Pitanja!

• Sudedi na osnovu kliničkih znakova, koja faza hemostaze je poremedena i da li je poremedaj nasledan ili stečen?

46

Odgovor:

• Prva faza hemostaze!

• Stečeni poremedaj!

47

Objašnjenje nalaza:

• Gingivalna krvarenja govore o poremedaju prve faze hemostaze i to samih trombocita (petehijalna krvarenja se retko javljaju kada postoji samo deficit fVf)

• Najčešdi poremedaji funkcije trombocitia su stečeni

• Ipak, kako je pas mlad i ima istoriju krvarenja koja se ponavlja, a u pitanju je rasa kod koje je vrlo čest defict fVf, nije nemogude da se radi o naslednom deficitu fVf, u kombinaciji sa stečenim poremedajem funkcije trombocita

48

• Kako bi ste objasnili promene krvne slike i profila koagulacije?

• Da li deficit fon Vilebrandovog faktora uzrokuje poremedaje koagulacije?

49

Objašnjenje:

• Pas ima tešku mikrocitnu, hipohromnu, regenerativnu anemiju. Regeneracija je evidentna jer ima 18% retikulocita i njihov apsolutni broj je veliki.

• Anemija ima dvojako poreklo:

• 1) posledica krvarenja (u prilog krvarenju ide snižena koncentracija proteina)

• 2) mikrocitoza i sferocitoza su posledice autoimunske hemolitičke anemije.

50

Objašnjenje – bela krvna slika

• Leukocitoza sa neutrofilijom i skretanjem u levo i monocitoza ukazuje na inflamaciju.

• Inflamacija je nastala zbog hemolize i teške hipoksije tkiva i pradena je porastom koncentracije fibrinogena, proteina akutne faze.

• Koncentracija fon Vilebrandovog faktora je jako niska, što zajedno sa trombocitopenijom doprinosi spontanim krvarenjima.

• Inače je nasledna fon Vilebrandova bolest česta pojava kod pasa rase doberman.

51

• Da li DIK može da bude prisutan?

• Zašto da, a zašto ne?

• Da li se kod krvarenja povedavaju FDP i D-dimeri?

52

Objašnjenje – trombociti i koagulacioni profil

• Teška trombocitopenija je sigurno važan uzrok krvarenja

• Trombocitopenija kao i anemija su sigurno posledica autoimunskog odgovora

• Koagulacija nije poremedena jer je koagulacioni profil normalan, što istovremeno ukazuje i na odsustvo DIK-a

53

Terapija

• Posle terapije kortikosteroidima pacijentu se stanje popravilo

• Na koji način su delovali kortikosteroidi?

54

KLINIČKA KORELACIJA

• Primer 1a.

• Opšti podaci o pacijentu: Mačak Moe, mužjak, godinu dana star,

• Anamneza: Veliki hematom u ingvinalnoj regiji. Sličan problem se javio i pre dva meseca.

55

Laboratorijske analize Rezultati analize Referentne vrednosti

Broj eritrocita (x1012/L) 2.2 5.5-10

Hematokrit (%) 16 27-50

Hemoglobin (g/L) 55 80-150

MCV (fL) 72 40-55

MCHC (g/L) 352 310-340

Procenat retikulocita (%) 6 0-2

Morfologija eritrocita Anizocitoza+ Polihromatofilija+

Broj leukocita (x109/L) 17 4-15

Eritroblasti/100 leukocita /

Segmentirani neutrofili 15,5 2.5-12.5

Mladi neutrofili / 0-0,3

Limfociti 0,9 1.5-7.0

Monociti 0,8 0.0-0.8

Eozinofili 0 0.0-1.5

Procena broja trombocita† Normalan broj

Agregirani trombociti Da

Veličina trombocita Uvedani

Hemostaza

56

Proteini i grupna vremena koagulacije

PT (s) 8.6 7.5-9.9

APTT (s) 27.7 9.6-13.8

Proteini (g/L) 44 54-77

Albumini (g/L) 19 21-32

Globulini (g/L) 25 33-45

57

Objašnjenje slučaja:

• Krvna slika: Umerena do teška, blago regenerativna anemija. Promene na leukogramu ukazuju na stres.

• Proteini: Hipoproteinemija koja je rezultat i hipoalbuminemije i hipoglobulinemije je najverovatnije nastala usled krvarenja zbog koga je životinja i dovedena.

58

Objašnjenje:

• Koagulacija: Produženo APTT, a normalno PT ukazuje na problem u unutrašnjem putu koagulacije, i to najverovatnije zbog deficita VIII ili IX faktora koagulacije. Za dalja ispitivanja su potrebne specifične analize.

• • Dijagnoza: Hemofilija A ili B • • Zaključak: Bez obzira na transfuziju sveže pune krvi i

plazme, Moe je uginuo usled masivnih intratorakalnih i intrapulmonalnih hemoragija posle tri meseca od postavljanja dijagnoze.

59

Primer 2a.

• Opšti podaci o pacijentu: Konj, star 12 godina.

• Anamneza: Počeo je da pokazuje znake uznemirenosti, valja se i znoji. Neiskusni vlasnik mu je aplikovao lekove za sedaciju.

• Kada je posle tri sata stigao veterinar konju su se izgubili inicijalni znaci, ali su mu sluznice bile jako blede i imao je izražena petehijalna krvarenja. Krv je takođe jako curela na mestu venepunkcije.

60

• Da li su opisani tipovi krvarenja karakteristični za poremedaj I ili II faze hemostaze ili obe?

61

Laboratorijske analize:

Hemostaza Rezultati analize Referentne vredosti

PT (s) 17 8-12

APTT (s) 98 20-50

Fibrinogen (g/L) 5,5 1,5-5,0

FDP (mg/mL) >120 <10

Antitrombin III (%) 55 85-125

Broj trombocita (x 109/L) 23 100-500

62

• Koje stanje je u pitanju?

• Šta bi mogao da bude uzrok?

• Da li je ovo tipična slika pretpostavljenog poremedaja?

63