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ANA FLAVIA FISCHER MÜLLER

SISTEMAS NANOEMULSIONADOS CONTENDO EXTRATO DE FLORES DE Allamanda cathartica L.:

ESTUDOS TECNOLÓGICOS E AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E EFICÁCIA

Itajaí (SC) 2017

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS




Tese submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Prof. Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva Co-orientadora: Prof. Dra. Angela Malheiros

Itajaí (SC) Novembro de 2017

FICHA CATALOGRÁFICA

M912d

Muller, Ana Flavia Fischer Sistemas nanoemulsionados contendo extrato de flores de Allamanda catártica L. [manuscrito] : estudos tecnológicos e avaliação da segurança e eficácia / Ana Flavia Fischer Muller. – 2017. 154 f. : il. ; 30 cm

Cópia de computador (Printout(s)). Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade do Vale do Itajaí, Pró-reitoria de Pesquisa. Pós-graduação, Extensão e Cultura, 2017. “Orientador: Prof. Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva, coorientador: Prof. Dra. Angela Malheiros”. Bibliografia: f. 139-151.

1. Produtos naturais. 2. Substâncias sintéticas bioativas. 3. Nanotecnologia. 4. Cosméticos. 5. Extratos vegetais. 6. Matéria médica vegetal. I. Universidade do Vale do Itajaí. II. Título.

CDU: 615.32

Cristina Martins Viana – CRB 14/966

AGRADECIMENTOS

Buscando as palavras corretas para escrever nesta parte de minha tese encontrei uma frase que pode exprimir meus sentimentos neste momento que diz “a gratidão é a lembrança do coração”. Sem dúvida isso faz sentido, pois, nestes 4 anos de dedicação, pessoas especiais continuaram na minha vida e outras passaram marcando com sentimentos passíveis de registro, que seja em minha memória.

Agradeço aos meus pais Norival e Gleusa que desde sempre me incentivaram a não desistir de meus sonhos e colaboraram sempre para torna-los realidade.

Agradeço o carinho e compreensão de meu marido Valmir José, que incansavelmente não me permitiu desistir e tolerou todas as vezes que precisei dizer não, me ausentando de algum momento especial.

Agradeço a toda minha família, meus irmãos Ana Paula, Arthur, Ana Claudia e Ana Luiza, meus cunhados Rafael, Flavia, João Paulo, José Henrique, Joseana, meus amados sobrinhos, que sem perceber sempre me apoiaram e compreenderam as vezes que estive ausente. Obrigada a todos meus familiares que me apoiam e vibram sempre com minhas conquistas, meus sogros Valmir e Rosana, Tia Carmen.

Meu sentimento de gratidão à minha exímia Professora Dra.Ruth Meri Lucinda da Silva, que incansavelmente me orientou na realização desta tese. Desculpe se por algumas noites consumi seu sono, interrompi algumas refeições, encurtei finais de semana. Agradeço por sempre me ensinar, orientar e guiar. Sempre admirável, meus sinceros agradecimentos.

A minha co-orientadora, Professora Dra. Angela Malheiros que sempre de forma solícita e alegre me ajudou todas as vezes que precisei, obrigada pelas conversas incentivadoras. Meus agradecimentos.

Agradecimentos especiais às amigas de laboratório Roseni de Carli, Anna Rocha, Giovanna Rodrigues, Liliani Thiesen, Ingrid Vicente Farias, que sempre se colocaram à disposição, me auxiliando sempre que possível. Obrigada pela parceria de todas.

Às professoras Dra. Angélica Couto e Dra Tania Mari Bellé Bresolin pelos ensinamentos, correções e sugestões da tese.

Agradecimentos à Jaqueline Góes e Tiago Bonomini, pelas colaborações com as pesquisas realizadas com Allamanda cathartica.

Agradecimentos especiais às queridas Clarissa Amorim K, Tailyn Zermiani, por me ajudarem a resolver problemas e tirar dúvidas sempre que solicitei, à Milena Guimarães, Fernanda Stenger, Thaisa Baccarin, Damaris Vieira Martins, Amanda Müller, Anna Karoline por de alguma maneira terem colaborado com a melhor convivência e realização desta tese.

Agradecimento ao técnico do laboratório Deivisson Wolf que me ajudou na realização das análises de permeação e dissolução. Às técnicas Núbia Fagundes, Carla, Bruna Oliveira, Joel A, que sempre me socorreram na busca por materiais, estendendo assim os agradecimentos aos técnicos e colaboradores que de alguma forma me auxiliaram.

Agradeço ao secretário da Pós-Graduação, Juliano Santos e Helenize Heyse por sempre me atenderem prontamente.

Não posso deixar de agradecer imensamente a toda a equipe de trabalho fantástico a qual tenho o enorme prazer de fazer parte, Equipe Senac Brusque, Ana Cristina, Mara, Suzana, Cristiane, Sandra, Edison, Katiuscia, Letícia, Graziela, Victor, todos os professores da Faculdade Senac e funcionários, pela compreensão e pela alegria de trabalhar com vocês. Agradeço à CAPES pela taxa escolar e ao CNPq e FAPESC (Edital PRONEM) e à CAPES (edital PVE) pelo apoio financeiro.

Por fim, com a bênção do Divino Espírito Santo conduzo meu caminho diariamente e à Ele agradeço sempre a todas as oportunidades que ocorrem na minha vida bem como todas estas pessoas maravilhosas que me rodeiam e marcam o meu crescimento como pessoa.

“Aqueles que passam por nós, não vão sós, não nos deixam sós, deixam

um pouco de si, levam um pouco de nós” Antoine de Saint-Exúpery.



ANA FLAVIA FISCHER MÜLLER Novembro/2017

Orientadora: Profa. Ruth Meri Lucinda da Silva, Dra. Co-orientadora: Profa. Angela Malheiras, Dra. Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 149. No desenvolvimento de novos produtos cosméticos, a nanotecnologia aliada aos princípios ativos dermocosméticos de origem vegetal tem apresentado grande potencial inovador. Este estudo teve por objetivo desenvolver e avaliar a eficácia e a segurança de sistemas nanoemulsionados contendo extrato mole (EM) de flores de Allamanda cathartica L. O EM foi obtido e caracterizado, sendo reprodutível a sua obtenção. Foram preparados sistemas emulsivos do tipo nanoemulsão (NE), microemulsão com mesofases líquido cristalinas (ME-MLC) e emulgeis (SEPI) com (1) e sem (2) EM. As formulações foram caracterizadas quanto aos aspectos organolépticos, estabilidade física, tamanho de fase interna, potencial zeta, teor de marcadores por CLAE, comportamento reológico, propriedades mecânicas, teor de fenólicos totais, dissolução e permeação cutânea in vitro em célula de Franz usando acetato de celulose e pele de orelha suína, respectivamente. A segurança in vitro foi avaliada pelos métodos de HET-CAM e hemólise com hemoglobina humana. A eficácia fotoprotetora e antioxidante do EM foi avaliada pelos métodos espectrofotométrico de Mansur e de consumo do radical DPPH. As formulações foram submetidas ao estudo de estabilidade acelerada por 180 dias, mantidas a 5 ± 2 ºC e a 40 ± 1 ºC e analisadas quanto ao aspecto físico, valor de pH, tamanho médio de fase interna, polidispersidade, potencial zeta e teor de plumierídeo (PMD). As formulações apresentaram valores de pH entre 6 e 6,9. Os sistemas NE e ME-MLC apresentaram fase interna menor que 50 nm e monodispersa. Os emulgeis com e sem EM apresentaram fase interna polidispersa com tamanho de 435,2 nm e 557,8 nm, respectivamente. As NE apresentaram alta fluidez, seguidas do sistema emulgel, com característica semissólida e dos sistemas ME-MLC, que apresentaram alta viscosidade. Os sistemas apresentaram comportamento reológico não-newtoniano, pseudoplástico e tixotrópico. O teor de marcadores químicos foi semelhante ao valor teórico esperado, enquanto o teor de fenólicos totais foi menor do que o encontrado no EM, principalmente no emulgel. Na análise do perfil de dissolução, cerca de 80% do PMD dissolveu em 180 min, enquanto 60% de PMD dissolveu no mesmo período de tempo a partir do EM. As formulações nanoestruturadas apresentaram menor taxa de dissolução de PMD, com taxa constante na ME-MLC e liberação sustentada na

NE. O emulgel apresentou taxa de dissolução do PMD superior ao dos sistemas nanoemulsionados. O tipo de sistemas influenciou a permeação cutânea do extrato. As NE promoveram a permeação cutânea, enquanto as ME-MLC promoveram a penetração, porém não a permeação cutânea. Já o emulgel apresentou menor penetração e permeação do EM. Nas análises de segurança, o EM e as formulações foram classificadas como seguras. A ME-MLC 1 apresentou maior potencial antioxidante com CE50 de 38,60 mg/mL, enquanto a NE e o SEPI apresentaram CE50 de 71,93 e 64,82 mg/mL, respectivamente. O EM a 1,0 mg/mL possui um FPS de ~18. Os produtos desenvolvidos apresentam potencial como nanofitocosméticos antioxidante e fotoprotetor e seguros, sendo promissores na obtenção de um produto inovador a partir das flores de A. cathartica.

Palavras-chave: Allamanda cathartica. Antioxidante. Fotoproteção. Nanoemulsões. Cristal líquido. Emulgel. Permeação cutânea.

NANOEMULSIFYING SYSTEMS CONTAINING EXTRACT OF FLOWERS OF Allamanda cathartica L.:

TECHNOLOGICAL STUDIES AND SAFETY AND EFFICACY ASSESSMENT


November 2017

Advisor: Prof. Ruth Meri Lucinda da Silva, PhD. Co-advisor: Prof. Angela Malheiras, PhD. Area of Concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Drugs Number of Pages: 149 In the development of new cosmetic products, nanotechnology linked to dermocosmetic active substances of vegetal origin has presented great innovative potential. This study aimed to develop and evaluate the efficacy and safety of nanoemulsifying systems containing soft extract (SE) of flowers of Allamanda cathartica L. The SE was obtained and characterized using a reproducible process. Nanoemulsion (NE), microemulsion with liquid crystalline mesophase (ME-MLC), and emulgels (SEPI) with (1) and without (2) SE were obtained. The formulations were analysed in relation to organoleptic aspects, physical stability, internal phase size, zeta potential, marker content by HPLC, rheological behavior, mechanical properties, total phenolic content, dissolution, and skin permeation in vitro using Franz cell and cellulose and porcine ear skin as membranes. In vitro safety was evaluated by HET-CAM and hemolysis methods. Antioxidant and photoprotector potential were evaluated by the DPPH radical consumption and Mansur spectrophotometric methods, respectively. The formulations were submitted to the accelerated stability study (180 days at 5 ± 2°C and 40 ± 1°C) and analysed in relation to physical appearance, pH value, mean internal phase size and polydispersity, zeta potential, and plumieride (PMD) content. The formulations presented pH values of between 6 and 6.9. The NE and ME-MLC systems presented a monodisperse internal phase of less than 50 nm. The emulgels with and without SE presented an polydisperse internal phase with average sizes of 435.2 nm and 557.8 nm, respectively. The NEs presented high fluidity, followed by the emulgel system with semi-solid characteristics and the ME-MLC systems, which presented high viscosity. The systems showed non-Newtonian, pseudoplastic and thixotropic

rheological behavior. The content of chemical markers was similar to the expected theoretical value, while the total phenolic content was lower than that found in SE, particularly in emulgel. In the dissolution profile analysis, about 80% of the PMD dissolved in 180 min, while 60% of the PMD from the SE dissolved in the same length of time. The nanostructured formulations presented a lower PMD dissolution rate, with constant rate in ME-MLC and sustained release in NE. Emulgel showed a higher PMD dissolution rate than that of the nanoemulsion systems. The type of system influenced the cutaneous permeation of the extract. The NEs promoted cutaneous permeation, while ME-MLC promoted penetration, but not cutaneous permeation. Emulgel presented lower penetration and permeation power of SE. In the safety analyses, The SE and formulations were classified as safe. ME-MLC 1 presented higher antioxidant potential, with EC50 of 38.60 mg/mL, while NE and SEPI had EC50 of 71.93 and 64.82 mg/mL, respectively. SE at 1.0 mg/mL had an SPF of approximately 18. The developed products present potential as antioxidant, photoprotective and safe nanophytocosmetics, and are promising sources of an innovative product from A. cathartica flowers. Keywords Allamanda cathartica. Antioxidant. Photoprotection. Nanoemulsions. Liquid crystal. Emulgel. Skin permeation.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Ilustração com as camadas da pele, incluindo estrato córneo, lúcido, granuloso, espinhoso e basal da epiderme, a derme; com esquema a esquerda indicando sequência da renovação celular. ........................ 30

Figura 2 Ilustração da incidência dos raios UVA e UVB na epiderme e derme. ............................................................................................... 33

Figura 3 Fluxograma com resumo das teorias envolvidas no envelhecimento cutâneo. ............................................................................................. 35

Figura 4 Estrutura básica dos flavonoides. .............................................. 37

Figura 5 Partes aéreas da flor Allamanda cathartica ............................... 39

Figura 6. Estrutura química de compostos isolados das flores de A.

cathartica, plumierideo e rutina. ....................................................... 40

Figura 7. Representação dos mecanismos de instabilidade das emulsões O/A. .......................................................................................................... 47

Figura 8. Diagrama ternário utilizado no desenvolvimento de nanoemulsão com óleo de arroz, tensoativos e água. .............................................. 50

Figura 9 - Ilustração da estufa com os ovos (a) e ovo após 10 dias (b) .... 71

Figura 10 - Perfil cromatográfico em CLAE do extrato mole (EM) de A.

cathartica em 230 nm, 4,63 mg/g da rutina (RUT) e em 355 nm, 211,54 mg/g do plumierídeo (PMD). ............................................................ 78

Figura 11 Análise direta e visual dos sistemas nanoemulsionados e do emulgel com (1) e sem (2) extrato das flores de A. cathartica. ......... 80

Figura 12 - Perfil de distribuição de tamanho da fase interna dos produtos dermocosméticos com e sem extrato das flores de A. cathartica. ..... 85

Figura 13. Perfil reológico das formulações de nanoemulsão com (NE 1) e sem (NE 2) extrato de A. cathartica 1%. Resultados apresentados em tensão de cisalhamento (A) e viscosidade (B)................................... 87

Figura 14. Perfil reológico das formulações de microemulsão com mesofases líquido cristalinas com (ME-MLC 1) e sem (ME-MLC 2) extrato de A.

cathartica 1%. Resultados apresentados em tensão de cisalhamento (A) e viscosidade (B). .............................................................................. 88

Figura 15. Perfil reológico das formulações emulgel com (SEPI 1) e sem (SEPI 2) extrato de A. cathartica 1%. Resultados apresentados em tensão de cisalhamento (A) e viscosidade (B)................................... 89

Figura 16. Perfil cromatográfico em CLAE das nanoemulsões com (NE 1) e sem (NE 2) extrato mole de A. cathartica em 230 nm e 355 nm. ..... 94

Figura 17. Perfil cromatográfico em CLAE das microemulsões com mesofases líquido cristalinas com (ME-MLC 1) e sem (ME-MLC 2) extrato mole de A. cathartica em 230 nm e 355 nm. ......................... 95

Figura 18. Perfil cromatográfico em CLAE dos emulgeis com (SEPI 1) e sem (SEPI 2) extrato mole de A. cathartica em 230 nm e 355 nm. .. 96

Figura 19. Perfil de dissolução do plumierídeo puro (PMD) (solução a 200 µg/mL) e a partir do extrato das flores de Allamanda cathartica em solução (EM) e incorporado em nanoemulsão (NE), microemulsão (ME-MCL) e emulgel (SEPI), em aparato de célula de difusão usando membrana de acetato de celulose e tampão acetato pH 4,5 como meio de dissolução. A – Expresso em fração dissolvida por tempo. B – Expresso em quantidade permeada por cm2. ..................................... 106

Figura 20. Perfil de dissolução da rutina a partir do extrato das flores de A.

cathartica em solução (EM) e incorporado em nanoemulsão (NE), microemulsão (ME-MCL) e emulgel (SEPI), em aparato de célula de difusão usando membrana de acetato de celulose e tampão acetato pH 4,5 como meio de dissolução. A – Expresso em fração dissolvida por tempo. B – Expresso em quantidade permeada por cm2. .................. 107

Figura 21. Perfil de dissolução de flavonoides totais (FT) a partir do extrato das flores de A. cathartica em solução (EM) e incorporado em nanoemulsão (NE), microemulsão (ME-MCL) e emulgel (SEPI), em aparato de célula de difusão usando membrana de acetato de celulose e tampão acetato pH 4,5 como meio de dissolução. A – Expresso em fração dissolvida por tempo. B – Expresso em quantidade permeada por cm2. ................................................................................................... 108

Figura 22 – Perfil de permeação cutânea ex vivo da solução de plumierídeo (PMD) usando célula de difusão do tipo Franz, pele de orelha de porco como membrana, tampão acetato pH 4,5 como meio aceptor e temperatura de 32 ºC. A – PMD permeado em µg/cm2; B – PMD permeado em %. ................................................................................ 112

Figura 23 Perfil de permeação cutânea ex vivo da solução de rutina (RUT) usando célula de difusão do tipo Franz, pele de orelha de porco como membrana, tampão acetato pH 4,5 como meio aceptor e temperatura de 32 ºC. A – RUT permeado em µg/cm2; B – RUT permeado em %. . 113

Figura 24 - Perfil de permeação cutânea ex vivo da solução de extrato das flores de A. cathartica expresso em plumierídeo (PMD), rutina (RUT) e flavonoides totais expressos em rutina (FT) usando célula de difusão do tipo Franz, pele de orelha de porco como membrana, tampão acetato pH 4,5 como meio aceptor e temperatura de 32 ºC. A – PMD permeado em µg/cm2; B – RUT e FT permeados em µg/cm2; C – PMD, RUT e FT permeados em %. .............................................................................. 114

Figura 25 - Perfil de permeação cutânea ex vivo do extrato das flores de A.

cathartica expresso em plumierídeo (PMD), rutina (RUT) e flavonoides totais expressos em rutina (FT) incorporado em nanoemulsão. O ensaio foi realizado em aparato de célula de difusão do tipo Franz, usando pele de orelha de porco como membrana, tampão acetato pH 4,5 como meio aceptor e temperatura de 32 ºC. A – PMD permeado em µg/cm2; B – RUT e FT permeado em µg/cm2; C – PMD, RUT e FT permeado em %. n = 4. ................................................................................................. 118

Figura 26 Perfil de permeação cutânea ex vivo do extrato das flores de A.

cathartica expresso em plumierídeo (PMD), rutina (RUT) e flavonoides totais expressos em rutina (FT) incorporado em microemulsão com mesofase líquido-cristalina. O ensaio foi realizado em aparato de célula de difusão do tipo Franz, usando pele de orelha de porco como membrana, tampão acetato pH 4,5 como meio aceptor e temperatura de 32 ºC. A – PMD permeado em µg/cm2; B – RUT e FT permeado em µg/cm2; C – PMD, RUT e FT permeado em %. n = 4. ..................... 119

Figura 27 - Perfil de permeação cutânea ex vivo do extrato das flores de A.

cathartica expresso em plumierídeo (PMD), rutina (RUT) e flavonoides totais expressos em rutina (FT) incorporado no emulgel. O ensaio foi realizado em aparato de célula de difusão do tipo Franz, usando pele de orelha de porco como membrana, tampão acetato pH 4,5 como meio aceptor e temperatura de 32 ºC. A – PMD permeado em µg/cm2; B – RUT e FT permeado em µg/cm2; C – PMD, RUT e FT permeado em %. n = 4. ................................................................................................. 121

Figura 28 Resultados do Método HET-Cam para controle positivo, controle negativo, sistemas nanoemulsionados, emulgel com extrato mole (EM) de A. cathartica nos tempos zero (T0), 1 minuto (T1) e 3 minutos (T3). .......................................................................................................... 124

Figura 29. Perfil de absorção no UVA (315-400 nm) e UVB (280-315 nm) (A) e valores de FPS calculado espectrofotometricamente (B) do extrato das flores de A. cathartica em diferentes concentrações. .................. 129

Figura 30 - Curvas de consumo do radical DPPH para obtenção da CE50 do extrato mole de A. cathartica e dos sistemas nanoemulsionados contendo EM. .................................................................................... 131

Figura 31 - Curvas de consumo do radical DPPH para obtenção da CE50 dos emulgéis com e sem extrato mole de A. cathartica. .......................... 133

LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Resultados da caracterização do extrato mole de A. cathartica.

................................................................................................. 77

Tabela 2 Resultados da análise de pH e resistência mecânica à centrifugação dos produtos dermocosméticos com e sem extrato das flores de A.

cathartica ................................................................................. 82

Tabela 3 - Resultados da análise do potencial zeta, polidispersão (PDI) e tamanho médio (nm) dos produtos dermocosméticos com e sem extrato das flores de A. cathartica ............................................ 83

Tabela 4 - Análise da viscosidade média, tixotropia e índice de comportamento de fluxo (n) dos produtos dermocosméticos com e sem extrato das flores de A. cathartica. ................................... 86

Tabela 5 Resultados da análise das propriedades de textura de preparações tópicas contendo extrato das flores de A. cathartica, usando modo TPA em analisador de textura (os resultados são expressos em média ± desvio padrão). ........................................................... 91

Tabela 6 Teor de marcadores plumierídeo e rutina e extrato mole de A.

cathartica na análise da precisão do método por CLAE para o emulgel com extrato mole. ....................................................... 93

Tabela 7 - Teor apresentado pelos sistemas nanoemulsionados e emulgel contendo extrato das flores de A. cathartica (µg/g de formulação– FT expresso em rutina).** ........................................................ 93

Tabela 8 - Fenólicos totais (mg/g de resíduo seco) do extrato mole de A.

cathartica e dos sistemas nanoemulsionados e emulgel com e sem extrato mole. Resultados apresentados pela média ± desvio padrão. ................................................................................................. 97

Tabela 9 – Valores de pH dos sistemas nanoemulsionados e emulgel contendo extrato das flores de A. cathartica ao longo do estudo de estabilidade acelerada. Resultados apresentados pela média ± desvio padrão. .......................................................................... 99

Tabela 10 - Viscosidade média (Pa.s) dos sistemas nanoemulsionados e emulgel contendo extrato das flores de A. cathartica ao longo do estudo de estabilidade acelerada. Resultados apresentados pela média ± desvio padrão. ............................................................ 100

Tabela 11 - Tamanho médio e índice de polidispersão dos sistemas nanoemulsionados e emulgel contendo extrato das flores de A.

cathartica ao longo do estudo de estabilidade acelerada. Resultados apresentados pela média ± desvio padrão. ............. 101

Tabela 12 - Potencial zeta dos sistemas nanoemulsionados e emulgel contendo extrato das flores de A. cathartica ao longo do estudo de estabilidade acelerada. Resultados apresentados pela média ± desvio padrão. ........................................................................... 102

Tabela 13 - Teor de plumierídeo em mg/g nos sistemas nanoemulsionados e emulgel contendo extrato das flores de A. cathartica nos diferentes intervalos de tempo do estudo de estabilidade. Resultados apresentados pela média ± desvio padrão. ................................ 102

Tabela 14 - Solubilidade aparente do extrato de A. cathartica em diferentes meios de dissolução. ................................................................. 104

Tabela 15 - Cinética do perfil de dissolução dos marcadores presentes no extrato das flores de A. cathartica usando os modelos cinéticos de ordem zero e lei da potência. .................................................... 110

Tabela 16 - Resultados da quantificação do plumierídeo (PMD), rutina (RUT) e flavonoides totais expressos em rutina (FT) quantificados no fluido aceptor, na porção viável da pele (epiderme viável e derme) e na superfície da pele (superfície e estrato córneo) após 24 h de análise de permeação cutânea ........................................... 115

Tabela 17 - Parâmetros cinéticos da permeação ex-vivo do plumierídeo (PMD), rutina (RUT), extrato mole das flores de Allamanda cathartica (EM) e nanoemulsões (NE), microemulsões com mesofases líquido cristalinas (ME) e emulgel (SEP) contendo 1 % de extrato mole d A.cathatica usando os modelos de ordem zero e Higuchi ..................................................................................... 116

Tabela 18. Determinação dos valores de hemólise em diversas concentrações do EM e sistemas nanoemulsionados e emulgel com e sem extrato das flores de A. cathartica em 540 nm. .................................... 126

Tabela 19. Determinação dos valores de hemólise em diversas concentrações do EM e sistemas nanoemulsionados e emulgel com e sem extrato das flores de A. cathartica em 576 nm. .................................... 127

Tabela 20 - Valores de CE50 calculados a partir das curvas analíticas para o extrato mole de A. cathartica, sistemas nanoemulsionados com EM e emulgel com e sem EM .................................................. 132

LISTA DE QUADROS Quadro 1 - Escala de pontuação para o teste HET-Cam .......................... 55

Quadro 2 - Classificação do grau de irritação cutânea no modelo de agarose overlay. ....................................................................... 55

Quadro 3- Composição do sistema eluente no modo gradiente usado no método analítico para análise dos derivados das flores de A.

cathartica por CLAE................................................................ 61

Quadro 4 - Composição do emulgel contendo extrato das flores de A.

cathartica. ................................................................................ 63

Quadro 5 - Composição das nanoemulsões (NE) e microemulsões (ME) com e sem extrato mole das flores de A. cathartica. ................ 64

Quadro 6 – Sistemas solventes empregados na seleção do meio de dissolução para o extrato mole de A. cathartica. ...................... 68

Quadro 7 - Concentrações das amostras para ensaio de hemólise ........... 73

Quadro 8 - Ponderação empregada no cálculo do fator de proteção solar por espectrofotometria com um fator de correção igual a dez. 74

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABTS = ácido 2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico CE50 = concentração efetiva para redução de 50% de radicais DPPH CLAE = cromatografia líquida de alta eficiência DPPH = 2,2-difenil-1-picrilidrazila ER = espécies reativas ERO = espécies reativas de oxigênio ERN = espécies reativas de nitrogênio ERS = espécies reativas de enxofre FC = fator de correção HET-CAM = Hen’s Egg Test-Chorioallantoic Membrane/ membrana corioalantóide de ovos de galinha ME = microemulsão ME-MLC = microemulsão com mesofase líquido cristalina ME-MLC 1 = microemulsão com mesofase líquido cristalina com extrato mole de Allamanda cathartica L. a 1% ME-MLC 2 = microemulsão com mesofase líquido cristalina sem extrato mole NE= nanoemulsão NE 1= nanoemulsão com extrato mole de Allamanda cathartica L. a 1% NE 2 = nanoemulsão sem extrato mole PDI = polydispersion index/índice de polidispersão PMD = plumierídeo RUT = rutina SEPI = emulgel Sepigel® 305 SEPI 1 = emulgel com extrato mole de Allamanda cathartica L. a 1% SEPI 2 = emulgel sem extrato mole SNE = sistemas nanoemulsionados

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .................................................................................... 25 2 OBJETIVOS ......................................................................................... 27 2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................. 27 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................... 27 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................ 29 3.1 FOTOENVELHECIMENTO CUTÂNEO ..................................................... 29 3.2 FLAVONOIDES NA PREVENÇÃO DO FOTOENVELHECIMENTO .............. 36 3.3 ALLAMANDA CATHARTICA L. ................................................................. 38 3.4 SISTEMAS NANOEMULSIONADOS .......................................................... 44 3.5 MÉTODOS PARA COMPROVAÇÃO DE SEGURANÇA DE PRODUTOS

COSMÉTICOS ............................................................................................... 52 3.5.1 Citotoxicidade pelo método MTT ...................................................... 54 3.5.2 Citotoxidade pelo método de vermelho neutro (Neutral Red Uptake -

NRU) ........................................................................................................... 54 3.5.3 Teste HET-CAM (Hen’s Egg Test-Chorioallantoic

Membrane/membrana corioalantóide) ...................................................... 54 3.5.4 Teste de irritação cutânea in vitro .................................................... 55 3.5.5 Avaliação da permeação e retenção cutânea ................................... 56 4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................. 57 4.1 MATERIAL ............................................................................................ 57 4.1.1 Material vegetal ................................................................................. 57 4.1.2 Reagentes ........................................................................... 57 4.1.3 Equipamentos e materiais ................................................. 58 4.2 OBTENÇÃO DO EXTRATO MOLE DAS FLORES DE A. CATHARTICA ........ 59 4.3 CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO MOLE ............................................... 59 4.3.1 Determinação do valor de pH ........................................................... 59 4.3.2 Determinação do resíduo seco .......................................................... 60 4.3.3 Determinação do teor de marcadores por CLAE ............................. 60 4.4 PREPARAÇÃO DO EMULGEL CONTENDO EXTRATO MOLE DAS FLORES

DE A. CATHARTICA ...................................................................................... 62 4.5 PREPARAÇÃO DE SISTEMAS NANOEMULSIONADOS CONTENDO

EXTRATO DAS FLORES DE A. CATHARTICA ................................................. 63 4.6 CARACTERIZAÇÃO DOS PRODUTOS ...................................................... 64 4.6.1 Características organolépticas .......................................................... 64

4.6.2 Resistência mecânica......................................................................... 64 4.6.3 Determinação do pH.......................................................................... 64 4.6.4 Análise de tamanho e de propriedades de superfície ........................ 64 4.6.5 Teor de marcadores por CLAE ......................................................... 65 4.6.6 Análise reológica ............................................................................... 66 4.6.7 Análise de propriedades de textura ................................................... 66 4.6.8 Determinação do teor de fenólicos totais .......................................... 66 4.7 ESTUDO DE ESTABILIDADE ACELERADA ............................................. 67 4.8 ESTUDO DE LIBERAÇÃO IN VITRO ......................................................... 68 4.8.1 Seleção do meio aceptor .................................................................... 68 4.8.2 Análise do perfil de dissolução .......................................................... 68 4.9 ESTUDO DE PERMEAÇÃO E RETENÇÃO CUTÂNEA IN VITRO ................. 69 4.10 AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA IN VITRO DOS SISTEMAS CONTENDO

EXTRATO DAS FLORES DE A. CATHARTICA .................................................. 70 4.10.1 Método HET-CAM .......................................................................... 70 4.10.2 Método de hemólise ......................................................................... 72 4.11 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA IN VITRO DOS SISTEMAS CONTENDO

EXTRATO DAS FLORES DE A. CATHARTICA .................................................. 73 4.11.1 Fotoproteção por espectrofotometria .............................................. 73 4.11.2 Determinação da atividade antioxidante in vitro pela captura do

radical livre DPPH ..................................................................................... 74 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................... 77 5.1 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA SOLUÇÃO EXTRATIVA E DO

EXTRATO MOLE .......................................................................................... 77 5.2 PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS PRODUTOS

DERMOCOSMÉTICOS CONTENDO EXTRATO DAS FLORES DE A. CATHARTICA

..................................................................................................................... 79 5.2.1 Aspectos físicos e de valor de pH ...................................................... 79 5.2.2 Análise de tamanho e potencial zeta ................................................. 83 5.2.3 Análise reológica e de textura ........................................................... 86 5.2.4 Análise de teor dos marcadores químicos por CLAE ....................... 92 5.2.5 Análise do teor de fenólicos totais ..................................................... 97 5.3 ESTUDO DE ESTABILIDADE ACELERADA ............................................. 98 5.4 ANÁLISE DO PERFIL DE DISSOLUÇÃO IN VITRO .................................. 104 5.5 ESTUDO DE PERMEAÇÃO E RETENÇÃO CUTÂNEA EX VIVO ................. 110 5.6 AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA IN VITRO DOS SISTEMAS CONTENDO

EXTRATO DAS FLORES DE A. CATHARTICA ................................................ 123

5.6.1 Método HET-CAM .......................................................................... 123 5.6.2 Método de hemólise ......................................................................... 125 5.7 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA IN VITRO .................................................... 128 5.7.1 Fotoproteção pelo modelo espectrofotométrico .............................. 128 5.7.2 Atividade antioxidante pela captura do radical DPPH .................. 130 6 CONCLUSÕES .................................................................................... 135 REFERÊNCIAS ...................................................................................... 139

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1 INTRODUÇÃO

Alinhado às transformações da sociedade, o segmento de cosméticos anti-idade ganha atributos diversificados, onde a alteração de aspecto visual e sensorial da pele provocadas naturalmente pelo envelhecimento como hiperpigmentação, discromias, rugas entre outros, geram grande desconforto. Assim, a fotoproteção, hidratação, estímulo da regeneração celular e umectação, entre outras propriedades fornecidas pelos cosméticos, promovem aparência jovial por mais tempo, além da melhoria da auto-estima e do bem-estar. Dessa forma, o desenvolvimento de cosméticos voltados para a prevenção ou tratamento dos sinais de envelhecimento da pele é uma área promissora para o mercado cosmético e para o investimento da indústria em pesquisas e em novas tecnologias (FRANQUILINO, 2017). O conhecimento sobre os mecanismos de envelhecimento da pele é importante no desenvolvimento de novos produtos capazes de retardar e reduzir os efeitos secundários ao envelhecimento da pele. Considerando a relação da formação de radicais livres pela exposição a fatores internos e externos com o envelhecimento cutâneo, um dos mecanismos para prevenir tais alterações inclui o uso de agentes antioxidantes naturais (BARROS, 2015; KAMMEYER; LUITEN, 2015) Os fitocosméticos, que em sua composição contém como princípio ativo derivados vegetais como extratos, óleos essenciais, resinas, ceras, entre outros, destacam-se como produtos com forte potencial antioxidante, sendo uma alternativa promissora para prevenir ou tratar o envelhecimento da pele (HETTA, 2016). No desenvolvimento tecnológico de novos produtos cosméticos, a nanotecnologia apresenta grande potencial transformador e de inovação, com alto potencial para melhorias da eficácia e do aspecto sensorial do produto. Dentre os sistemas nanométricos, na aplicação cosmética destacam-se as nanoemulsões, microemulsões e também microemulsões com mesofases líquido cristalinas. Além de apresentarem maior potencial de permeabilidade de princípios ativos, suas propriedades tecnológicas melhoram ou potencializam a atividade dos princípios ativos dermocosméticos, principalmente os de origem vegetal, devido a limitada solubilidade ou permeabilidade cutânea (CAMPOS et al., 2017; MUSAZZI et al., 2017).

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Neste contexto, estudos vinculados ao Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas da UNIVALI, têm buscado novos princípios ativos de origem vegetal com potencial aplicação dermocosmética e a incorporação destes em sistemas nanométricos, como nanoemulsões, micro e nanopartículas poliméricas e nanopartículas lipídicas sólidas. Dentre as espécies estudadas, destaca-se o potencial do extrato das flores de Allamanda

cathartica L. como antioxidante, inibidor da tirosinase, antimelanogênico, anti-inflamatório e citoprotetor (BONOMI, 2017; FISCHER MÜLLER, 2013; GÓES, 2017).

Em estudos anteriores, usando diagrama de fases peseudoternário foram desenvolvidas 16 formulações contendo extrato das flores de A. cathartica e caracterizadas como nanométricas. Dentre os diferentes sistemas nanoemulsionados obtidos, foram selecionadas 3 com propriedades características de nanoemulsão, microemulsão e microemulsão com mesofase líquido cristalina. Os resultados obtidos foram promissores em relação à potencialização da atividade antioxidante avaliada pelo consumo de radical ABTS e DPPH, e à análise de permeabilidade e penetração cutânea das formulações em modelo ex vivo (FISCHER MÜLLER, 2013). Somado a isto, novos estudos têm apontado o potencial citoprotetor e antimelanogênico do extrato (GÓES, 2017).

Nesse sentido, no presente estudo prosseguiu-se com os estudos de desenvolvimento de um dermocosmético inovador contendo o extrato mole das flores de A. cathartica, com a realização de estudos tecnológicos, de eficácia e de segurança dos produtos. Para tanto, foram selecionadas três diferentes bases emulsionadas, nanoemulsão, microemulsão com mesofase líquido cristalino e emulgel, por possuírem diferentes nanoestruturação e provável diferente influência na performance do produto.

Nos estudos já conduzidos envolvendo o desenvolvimento de um novo fitocosmético a partir das flores de A. cathartica, alguns aspectos positivos podem ser destacados como a facilidade de cultivo da espécie, o alto rendimento de matéria-prima vegetal na estação de eflorescência (primavera-verão), assim como reprodutibilidade na obtenção do extrato, facilidade de análise e determinação do teor de marcadores, a segurança e a potente atividade do extrato. Estes justificam e embasam o projeto e apontam para o sucesso deste novo produto. Cabe ressaltar que até o momento não há registro de produto cosmético contendo o extrato de A. cathartica.

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2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral

Desenvolver sistemas nanoemulsionados contendo extrato de flores de Allamanda cathartica L. e avaliar a eficácia e a segurança visando o uso do fitocosmético com aplicação como antioxidante e antienvelhecimento. 2.2 Objetivos Específicos

- Preparar e caracterizar o emulgel contendo extrato de flores de

Allamanda cathartica;

- Preparar e caracterizar sistemas nanoemulsionados do tipo nanoemulsão e microemulsão com mesofase líquido cristalina contendo extrato de flores de A. cathartica;

- Analisar a estabilidade dos sistemas contendo extrato de flores de A.

cathartica em estudo acelerado e de longa duração; - Analisar a liberação dos marcadores plumierídeo, rutina e flavonoides

totais das formulações em aparato de células de Franz; - Analisar a permeação cutânea dos marcadores plumierídeo, rutina e

flavonoides totais das formulações em aparato de células de Franz usando pele de orelha de porco;

- Avaliar a ação antioxidante das formulações in vitro;

- Avaliar a segurança das formulações em modelos in vitro pelos métodos de hemólise e de irritação de mucosas HET-CAM (Hens Egg Test-

Chorion Allantoic Membrane-Membrana corioalantoide de ovos de galinha). - Determinar o potencial fotoprotetor do extrato usando método

espectrofotométrico.

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3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 Fotoenvelhecimento Cutâneo

O envelhecimento é um processo biológico considerado complexo, pois é contínuo e se caracteriza por apresentar alterações celulares e moleculares, com diminuição progressiva da capacidade de homeostase do organismo, senescência e ou morte celular (PIVETTA; ZORZETTO, 2017).

Contudo, quando se destaca o envelhecimento cutâneo, este pode ser caracterizado como um processo multifatorial, pois há uma junção de fatores que impulsionam para a aceleração ou retardo do mesmo. Levando em consideração que a pele é o órgão que mais demonstra o envelhecimento, é através dela que se torna possível avaliar lesões, discromias ou hipercromias causadas pelo envelhecimento prematuro da pele, provocadas pela ação dos radicais livres, ou pela ineficiência crescente de nossas defesas naturais antioxidantes (CEFALI, 2009; SILVA; COSTA, 2012). A pele é o maior órgão humano que abrange a superfície do corpo e consiste em três camadas principais: a epiderme de superfície, a derme subjacente e o tecido subcutâneo. Uma função importante da pele é proteger de estímulos externos. A pele consiste principalmente em três tipos de células: queratinócitos, melanócitos e fibroblastos. Os queratinócitos compõem a maior parte do epitélio, sofrem queratinização e formam a camada superficial morta da pele (HIROBE, 2014).

A epiderme é um epitélio escamoso histologicamente estratificado e de acordo ao descrito, requer renovação constante. Além disso, um papel importante da epiderme é proteger a pele de muitos tipos de estresses ambientais, como a exposição a bactérias; vírus; produtos químicos; radiação UV; radiação ionizante; ondas eletromagnéticas; e lesões físicas, térmicas e mecânicas (HIROBE, 2014). A renovação celular da epiderme se dá pela eliminação da placa mais externa de queratinócitos, que pela constante descamação são substituídos por células derivadas de células mitóticas na camada mais baixa da epiderme (camada basal). Assim, as células de nível superior são sucessivamente deslocadas pelas novas células abaixo delas. À medida que se movem para cima, produzem queratina e se acumulam novamente, dando sequência a

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renovação da pele, num processo natural, conforme Figura 1 (HIROBE, 2014). Figura 1 Ilustração com as camadas da pele, incluindo estrato córneo, lúcido, granuloso, espinhoso e basal da epiderme, a derme; com esquema a esquerda indicando sequência da renovação celular.

Fonte: Moreno, 2017.

Os melanoblastos são precursores de melanócitos que sintetizam e armazenam pigmento de melanina dentro de organelas lisossomereladas fechadas em membrana chamados melanosomas. No entanto, o pigmento que está na pele é principalmente dentro dos queratinócitos, as células receptoras para a melanina. A transferência de pigmento ocorre dentro das unidades de melanina epidérmica nas quais os melanócitos prolongam dendritos longos que contatam até os queratinócitos (DELEVOYE, 2014). A melanina confere cor aos cabelos e pele e com o envelhecimento da pele pode haver o acúmulo deste pigmento de forma não uniforme caracterizando as hiperpigmentações. Já nos cabelos, a melanina pode sofrer diminuição de produção conferindo a perda de cor (HIROBE, 2014).

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Os melanócitos se localizam na camada basal e a melanina é produzida a partir de L-Tirosina (L-Tyr) com o auxílio de reações enzimáticas por tirosinase (Tyr), proteína Tyr (Tyrp) -1 e Tyrp2. Na maioria das espécies epidérmicas, os melanócitos migram para os folículos pilosos e colonizam melanócitos da matriz do cabelo e pele, não colonizando regiões glabras (SHAH; MAHAJAN, 2013). Na pele humana, a unidade de melanina epidérmica, que compreende queratinócitos e melanócitos, tem papel fundamental na regulação da pigmentação e da homeostase da epiderme. Além disso, a transferência de melanina é necessária para a fotoproteção da pele. O desenvolvimento de distúrbios de transferência de melanina resulta em defeitos de pigmentação da pele e ainda no caso de alterações de transferência de melanina pode haver um impacto na quimiorresistência do melanoma (DELEVOYE, 2014; SHAH; MAHAJAN, 2013). Por sua vez, a derme, que consiste de fibroblastos, forma um espessamento abaixo da epiderme e se desenvolve em uma papila dérmica. Estas modificações são responsáveis pela sustentação da pele. No envelhecimento da pele, com a alteração na redução de fibroblastos, esta sustentação é prejudicada (HIROBE, 2014). Outros três componentes estruturais primários da derme devem ser destacados, o colágeno, a elastina e as glicosaminoglicanos (GAGs), uma vez que no processo de envelhecimento da pele eles sofrem decréscimo significativo, gerando características visíveis. As GAGs auxiliam na hidratação da derme pela ligação com a água. Na pele fotoenvelhecida, os GAGs podem estar associados a material elástico anormal e, portanto, não podem funcionar efetivamente (GANCEVICIENE et al., 2012). A distribuição escassa e a diminuição do teor de colágeno na pele fotoenvelhecida podem ser devidas ao aumento da degradação do colágeno por várias metaloproteinases da matriz, além de outras proteases independentemente da produção de colágeno. Na pele envelhecida, o colágeno parece irregular e desorganizado, uma vez que o teor global de colágeno por unidade de área da superfície da pele é conhecido por declinar aproximadamente 1% ao ano (GANCEVICIENE et al., 2012). A alteração na produção, renovação e eliminação de todas estas substâncias constituintes da pele e a melhor elucidação do processo de envelhecimento da pele tem sido descrita por duas teorias. A primeira classifica o processo em intrínseco ou cronológico e a segunda teoria defende

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o envelhecimento extrínseco ou fotoenvelhecimento (BAGATIN, 2009; HIRATA; SATO; SANTOS, 2004). Mesmo havendo evidências que ambos processos de envelhecimento possuam mecanismos biológicos, bioquímicos e moleculares em parte sobrepostos, o primeiro é determinado por fatores genéticos e também pela degeneração celular que ocorre progressivamente desde o momento do nascimento do ser humano bem como resultados da ação genética, hormonais e fatores ambientais. Já o extrínseco é causado por fatores externos e é agravado por exposição abusiva aos raios ultravioleta, tabagismo, poluição e também radiação infravermelho e ainda pela ação de radicais livres na pele (BAGATIN, 2009; HIRATA; SATO; SANTOS, 2004; OLIVEIRA et al., 2013).

Cerca de 80% dos sinais visíveis causados no envelhecimento são provocados pelos raios UV e os principais causadores são os radicais livres, proporcionando a aceleração do envelhecimento cutâneo, aumento de rugas, espessamento da epiderme, perda da firmeza e diminuição da elasticidade da pele, modificando sua permeabilidade e funcionamento normal. Portanto, permite-se dizer que o envelhecimento extrínseco nada mais é que a relação da superposição dos efeitos biológicos da radiação ultravioleta A e B (UVA e UVB) sobre o envelhecimento intrínseco (BAGATIN, 2009; HIRATA; SATO; SANTOS, 2004; OLIVEIRA et al., 2013).

Por sua vez, o envelhecimento intrínseco é embasado pela relação direta com o encurtamento e ruptura dos telômeros, que são pares de bases repetidas de DNA nas porções finais dos cromossomos que não se replicam em mitoses. Todo este processo ocorre de forma natural durante o ciclo biológico de vida programado para cada tipo celular, acelerado pela exposição aos raios UV e dos danos causados ao DNA (BAGATIN, 2009).

Os telômeros são estruturas de DNA situadas nas extremidades dos cromossomos. Atribui-se a esses segmentos de material genético a função de proteger o restante da fita de DNA. Cada vez que o material genético duplica e a célula se divide, os telômeros encolhem 2%, que de forma direta controlam o considerado início do envelhecimento das células, além da manutenção do patrimônio genético carregado por elas. Com o passar dos anos, a produção de telomerase diminui, como consequência ocorrem o encurtamento dos telômeros, provocando do envelhecimento das células (PIVETTA; ZORZETTO, 2017).

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Somente a enzima telomerase é capaz de recuperar o comprimento dos telômeros e nos mamíferos, porém, a maioria das células adultas não produz telomerase, geralmente sintetizada pelas células-tronco. Com capacidade restrita de recuperação, os telômeros encurtam com a idade e ativam o envelhecimento (PIVETTA; ZORZETTO, 2017).

Além disso, ocorre a diminuição do ácido hialurônico, substância que influencia diretamente no turgor da pele; também apresentam alterações bioquímicas, fazendo com que ocorra a perda de elasticidade e compressibilidade da pele. Diminuição no número de melanócitos enzimaticamente ativos, diminuindo a barreira de proteção contra a radiação ultravioleta (UV). Há ainda a diminuição de colágeno e elastina, já citados (LACERDA, 2013).

Com a incidência de radiação solar na pele (Figura 2), as radiações UVB e UVA2 penetram na epiderme e derme, enquanto a radiação UVA1 atinge a derme profunda. A radiação UVA1 age sobre o metabolismo das células da pele, como queratinócitos e fibroblastos, gera sobrecarga de espécies reativas de oxigênio (ERO), que acaba esgotando os mecanismos celulares de defesa natural, iniciando o processo celular de senescência (BAGATIN, 2009).

Figura 2 Ilustração da incidência dos raios UVA e UVB na epiderme e

derme.

Fonte: Adaptado de Leonel, 2015.

UVA 2

UVA 1

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A exposição aos raios UVA e UVB, gera o estresse oxidativo que causa dano à membrana celular da pele por aceleração da glicação protéica e formação de glicoxidação (produção de AGE advanced glycation end

product). A glicação das proteínas ocorre quando o açúcar no sangue reage com a proteína, como o colágeno, presente na pele, para formar AGE, levando à degradação do colágeno. A glicação é uma reação não enzimática entre proteínas e glicose ou ribose que geram os produtos de glicação avançada (AGE). A relevância deste mecanismo está relacionada ao fato de as AGE serem produtos do fotoenvelhecimento e contribuírem com a aceleração deste tipo de envelhecimento por precipitar a apoptose dos fibroblastos (BAGATIN, 2009; KAMMEYER; LUITEN, 2015).

Outros mecanismos estão relacionados com efeitos epidérmicos e dérmicos sobre o gene p53 e as células “sunburn”, sendo o gene supressor de tumor que codifica a proteína p53, porém quando sofre mutação torna-se indutor de tumores, tornando as células neoplásicas. Erros de mutações do DNA não relacionadas à radiação ultravioleta também podem ser um dos mecanismos para explicar o envelhecimento cutâneo (BAGATIN, 2009). Por fim, o fumo, relacionando a nicotina com a vasoconstrição, com a consequente hipóxia tissular, que colabora na produção dos radicais livres, aumenta a agregação plaquetária e dessa forma, aumenta a atividade da elastase e a hidroxilação do estradiol (BAGATIN, 2009).

Ainda que o envelhecimento (esquematicamente apresentado na Figura 3) ocorra como uma consequência do decorrer do tempo, além deste fator preponderante, vários outros influenciam, que mesmo sendo secundários, podem acelerar ou retardar o processo de envelhecimento. Apesar de o envelhecimento cutâneo constituir uma parte de todo o processo de envelhecimento, estudos mostram que, conforme a expectativa de vida aumenta, a população busca alternativas de intervenção que melhorem sua aparência e revertam os sinais de envelhecimento. Talvez isto explique a razão pelo qual no futuro é aguardado um aumento expressivo de consultas aos profissionais de estética, nutricionistas, dermatologistas e até mesmo aos cirurgiões plásticos. Baseado nestes relatos, pesquisas voltadas à prevenção buscam estratégias mais eficazes em relação ao envelhecimento cutâneo e ao câncer de pele.

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Figura 3 Fluxograma com resumo das teorias envolvidas no envelhecimento cutâneo.

Envelhecimento Desgaste da pele Alterações cutâneas

Decorrem de fatores

INTERNOS

EXTERNOS

Fumo

Radiação solar

Estresse

Células

DERME

EPIDERME

Redução da renovação celular

Redução do gel coloidal

Perde capacidade de

Manter equilíbrio

Reter água Eliminar toxinas

Nutrição e oxigenação celular

Colágeno

Elastina

Na produção

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É neste contexto que tratamentos com antioxidantes são eficazes (SILVA; COSTA, 2012). Ou seja, a prevenção do envelhecimento dérmico pode estar diretamente relacionada com a eliminação dos radicais livres endógenos. Desta forma, impedir a penetração das radiações UVA e UVB e neutralizar a ação de radicais livres são tidas como as principais estratégias na prevenção e tratamento do fotoenvelhecimento. No combate aos radicais livres, o uso de antioxidantes tópicos e sistêmicos, como por exemplo betacaroteno, vitamina C e, fitocosméticos contendo espécies com potencial ação antioxidante têm sido explorados (BAGATIN, 2009; FISCHER MÜLLER; 2013; SAHASRABUDHE; DEODHAR, 2010). 3.2 Flavonoides na prevenção do fotoenvelhecimento Os flavonoides são constituintes e pigmentos naturais presentes nas plantas e que protegem o organismo contra danos produzido por agentes oxidantes, como os raios ultravioleta, poluição ambiental, produtos químicos nos alimentos, etc, danos estes que podem gerar uma cascata de consequências drásticas ao organismo, como o envelhecimento cutâneo e desenvolvimento de doenças (BELING; PUJOL; ANDRADE; 2007; MARTÍNEZ-FLÓREZ et al., 2002; RODRIGUES et al., 2003). No organismo, o sistema de proteção antioxidante pode ser basicamente divido em dois grupos: antioxidantes enzimáticos e antioxidantes não-enzimáticos. Enzimas como superóxido dismutases, catalases e glutationa peroxidases são exemplos de antioxidantes enzimáticos produzidos pelo organismo. Enquanto os antioxidantes não-enzimáticos são adquiridos pela alimentação ou suplementação, como é o caso da vitamina C, vitamina E e carotenoides presentes em plantas, frutas, vegetais e em várias bebidas representam substâncias da parte não energética da dieta humana (MARTÍNEZ-FLÓREZ et al., 2002; MESQUITA; TEIXEIRA; SERVULO, 2017). Os flavonoides contêm na sua estrutura química um número variável de grupos hidroxílicos fenólicos desenvolvendo excelente atividade quelantes do ferro e outros metais de transição, o que lhes confere uma excelente capacidade antioxidante (GUARATINI, MEDEIROS, COLEPICOLO, 2007). Estes produtos naturais e seus compostos purificados têm recebido maior atenção, sendo reconhecidos como uma solução alternativa para inúmeros problemas de saúde. Seu potencial antioxidante inibe a geração de

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radicais livres e apresenta significância na proteção contra o dano oxidativo e possuem efeitos terapêuticos incluindo prevenção de cardiopatia isquêmica, aterosclerose e câncer (MARTÍNEZ-FLÓREZ et al., 2002; SINGH et al., 2014; WANG; LI; BI, 2017). Os flavonoides removem as EROS especialmente sob a forma de ânions superóxido (O2●-), radicais hidroxila (OH●), óxido nítrico (NO), peróxidos lipídicos (L●) ou peróxidos de hidrogênio (H2O2). Desta forma, eles bloqueiam a ação deletéria das referidas substâncias nas células. Os seus efeitos citoprotetores são, por exemplo, bem conhecidos em fibroblastos da pele humana, queratinócitos, células endoteliais e ganglios sensoriais cultivados na presença de sulfoxina-butionina, um inibidor irreversível da glutationa sintetase é também capaz de bloquear a indução de danos à molécula de DNA (BRIEGER et al., 2012; HOENSCH, OERTEL, 2015; MARTÍNEZ-FLÓREZ et al., 2002; RUFINO et al., 2007).

Quimicamente os flavonoides são compostos de baixo peso molecular que compartilham um esqueleto comum de difenilpiranos C6-C3-C6, conforme apresentado na Figura 4, composto por dois anéis fenil, aneis A e B, ligados através de um anel de pirano (heterocíclico). Os átomos de carbono nos anéis C e A são numerados de 2 a 8, e os do anel B de 2 'a 6' 12 (WANG; LI; BI, 2017). Figura 4 Estrutura básica dos flavonoides.

Fonte: Santos, Rodrigues; 2017.

Para um flavonoide desenvolver a capacidade antioxidante, alguns critérios químicos devem ser considerados, como por exemplo, a presença de estrutura de O-dihidroxi no anel B; conferindo maior estabilidade à forma radical e participando das compensações dos elétrons. Além de apresentar ligação dupla, em conjunto com a função 4 do anel C e grupos 3 e 5-OH com

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função 4-orto nos anéis A e C necessários para exercer o máximo potencial de antioxidante. Características estas apresentadas, por exemplo, pela rutina (MARTÍNEZ-FLÓREZ et al., 2002, WANG; LI; BI, 2017). Ramanlho e Jorge (2006), descrevem a classificação dos antioxidantes como:

■ primários - são compostos fenólicos, que promovem a remoção ou inativação dos radicais livres formados durante a iniciação ou propagação da reação, através da doação de átomos de hidrogênio a estas moléculas, interrompendo a reação em cadeia, formando espécies inativas e um radical inerte (A•). BHA e BHT, terc-butil-hidroquinona (TBHQ), galato de propila (PG) e tocoferóis são exemplos desta classe;

■ sinergistas - são substâncias com pouca ou nenhuma atividade antioxidante, que podem aumentar a atividade dos antioxidantes primários somente quando usados em combinação adequada;

■ removedores de oxigênio - capturam o oxigênio presente no meio, através de reações químicas estáveis, tornando-os, consequentemente, indisponíveis para atuarem como propagadores da auto-oxidação. O ácido ascórbico é um agente comumente utilizado;

■ biológicos - incluem várias enzimas com potencial antioxidante; ■ agentes quelantes - se complexam com íons metálicos como cobre e

ferro, que atuam catalisando a oxidação lipídica. São exemplos destes agentes o ácido cítrico e sais de ácido etileno diamino tetraacético (EDTA);

■ antioxidantes mistos - incluem compostos de plantas e animais, incluindo nesta classe os flavonoides, sendo o foco de estudo da presente tese.

3.3 Allamanda cathartica L.

A família Apocynaceae encontra-se distribuída de maneira preponderante em regiões tropicais e subtropicais. Compreendem aproximadamente 400 gêneros e 3700 espécies e, no Brasil, são cerca de 90 gêneros e 850 espécies (SOUZA; LORENZI, 2008). O gênero Allamanda

compreende 10 espécies distribuídas no Brasil e destas, três têm sido estudadas quanto a sua composição química e propriedades farmacológicas pelo NIQFAR da UNIVALI: Allamanda cathartica, Allamanda blanchetti e

Allamanda sschotti (BARBETTA; RAMOS, 2006; BERRI; SCARIOT, 2004; BONOMINI, 2017; MALHEIROS; SCHUQUEL; VIDOTTI, 1997; RICOBOM, 2009; SCHAAB, 2005).

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A Allamanda cathartica L. (Figura 5) é conhecida popularmente como trompete dourada, dedal de dama ou de rainha, sino amarelo, alamanda amarela e alamanda da flor grande. É uma planta ornamental amplamente cultivada e encontrada em diferentes locais, como encostas de rios, campos e próximo a praias. O uso popular das folhas se dá como purgativa ou emética, febrífuga, bem como para o tratamento de tosse, dores de cabeça, icterícia e baço aumentado resultante da malária. Esta espécie também possui propriedades antibacterianas e possivelmente anticancerígenas (CONRAD; DIKE; AGBARA, 2013; LORENZI; MOREIRA, 2001; PRABHADEVI et al., 2012; SCHENKEL et al., 2010).

Figura 5 Partes aéreas da flor Allamanda cathartica

Fonte: o autor.

A espécie A. cathartica L. se apresenta como um arbusto exótico,

perene, trepador, com folhas lisas e espessas, flores amareladas brilhantes (figura 5). É de fácil cultivo, necessitando de luz solar. É bastante resistente ao clima seco e tolera pouco o frio, devendo ser plantada com espaçamento de 90 a 150 cm. Seu nome provém do botânico suíço Dr. Frederic Allamand, que no século 18, nomeou tal gênero. Por sua vez, a palavra catártica provém da palavra purgativo (GILMAN, 1999; LING; KIAN; HOON, 2009; LOSS et al., 2008; PRABHADEVI et al., 2012; SCHENKEL et al., 2010; SOUZA; LORENZI, 2008).

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Algumas das espécies pertencentes ao gênero Allamanda possuem metabólitos secundários que apresentam expressiva atividade antioxidante e anti-inflamatória como iridoides, flavonoides, cumarinas e terpenoides (BONOMINI, 2017; FISCHER MÜLLER, 2013; GÓES, 2017; LI et al., 2006; NASCIMENTO et al., 2014; SCHMIDT et al., 2006).

Estudos fitoquímicos realizados com A. cathartica relatam o isolamento da quercetina das flores, β-sitosterol, β-amirina e ácido ursólico dos caules e folhas. Dos caules e raízes foram isolados os iridoides plumericina, isoplumericina e o plumierideo (ABDEL-KADER et al., 1997; MAFRA; BONONOMINI, 2008; NESTOR; CARBALLEIRA; CRUZ, 1998). Nas flores a composição química predominante é de flavonoides como a rutina (1,5-2,0% m/m de flavonoides totais) e o iridoide plumierídeo (aproximadamente 20% m/m) (BONONOMINI et al., 2017; FISCHER MÜLLER et al., 2015). As estruturas destes dois compostos estão apresentadas na Figura 6. O plumierídeo destaca-se pela sua função anti-inflamatória e nociceptiva em diversos modelos experimentais in vivo de inflamação, obtendo resultados similares ao glicocorticoide dexametasona (GÓES, 2011; SIMÃO DA SILVA, 2007). Enquanto a rutina apresenta potencial como antioxidante e na prevenção da fragilidade capilar (BABY, 2007). A presença destes dois compostos nas flores impulsiona as pesquisas na busca de um produto cosmético inovador.

Figura 6. Estrutura química de compostos isolados das flores de A. cathartica, plumierideo e rutina.

Plumierídeo Rutina

Fonte: Góes, 2011; Bonomini 2017.

O isolamento do marcador plumierídeo foi padronizado por Bonomini

(2013). A extração foi realizada por extração assistida por micro-ondas. Os

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parâmetros foram determinados pela aplicação de um planejamento fatorial (BONOMINI et al., 2017).

O processo de obtenção do extrato mole das flores foi desenvolvido por Góes (2011) empregando delineamento fatorial por maceração dinâmica, variando tempo de extração, graduação alcoólica e proporção droga vegetal:solvente. Foram padronizadas como condições de extração, a partir das flores secas de A. cathartica, empregando a solução hidroetanólica 90% v/v como solvente, relação droga vegetal:solvente 1:10, método de maceração dinâmica por 4 h e temperatura ambiente.

Estudos analíticos para padronização e análise quali e quantitativa do extrato mole das flores de A. cathartica foram conduzidos por Fischer-Muller et al. (2015). Um método por CLAE-UV foi desenvolvido e validado. O método mostrou-se rápido, linear, seletivo, preciso, exato e robusto para quantificação do plumierideo. Os extratos obtidos continham cerca de 21% m/m de plumierídeo. O método também permitiu a análise quantitativa dos extratos quanto ao teor de flavonoides totais expressos em rutina, que é um flavonoide majoritário presente no extrato. O teor médio de flavonoides totais expressos em rutina foi de 1,28% m/m.

Estudos tecnológicos visando o desenvolvimento de produtos dermocosméticos contendo o derivado vegetal das flores de A. cathartica

foram conduzidos por Góes (2011) e Fischer-Muller (2013). Góes (2011) incorporou o extrato mole de A. cathartica em preparações semissólidas do tipo gel e a atividade antioxidante e anti-inflamatória foram determinadas in

vitro e in vivo, respectivamente. O produto contendo 1% do derivado vegetal apresentou alto potencial antioxidante e anti-inflamatório quanto incorporado em formulações tópicas do tipo gel.

Estes resultados foram confirmados com desenvolvimentos de sistemas nanoemulsionados, impulsionado a aplicação do extrato de A. cathartica em fitocosméticos com ação antioxidante na prevenção do fotoenvelhecimento (FISCHER MULLER, 2013). O estudo demonstrou significativa atividade antioxidante do extrato mole quando avaliado pelos métodos de consumo de radical DPPH e ABTS. A incorporação do extrato em sistemas nanoemulsionados resultou no aumento da atividade antioxidante e foi observado uma relação entre o aumento da atividade antioxidante e o aumento da concentração de tensoativos nas formulações. A partir do interesse no desenvolvimento de um produto a base dos extratos das flores, a segurança do extrato foi avaliada em modelo

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toxicológico agudo. Foram realizados estudos toxicológicos com extratos das flores e com o plumierideo por meio de ensaios de toxicologia aguda (dose única 2000 mg/kg), analisando os parâmetros hematológicos, bioquímicos, histopatológicos dos rins e fígados. Também foram empregados os métodos de mutagenicidade (micronúcleo), atividade hemolítica, modelo de deambulação e coordenação motora. Não foram observados sinais de toxicidade, quer durante as observações comportamentais ou na análise histopatológica, bem como o extrato e o composto não apresentaram mutagenicidade, citotoxicidade ou atividade hemolítica (BONOMINI et al., 2017).

O ensaio de viabilidade celular do extrato das flores de A. cathartica, em células das linhagens B16F10 e L929 foi realizado usando brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium (MTT). O extrato apresentou viabilidade superior a 80% após 48 h de cultivo. O extrato na concentração de 75 µg/mL, em células L929 (fibroblasto murino), demonstrou ter atividade proliferativa o que condiz com a atividade anti-inflamatória que o extrato possui (GÓES, 2017).

O potencial de irritação cutânea do extrato mole das flores de A

cathartica e dos produtos nanoemulsionados contendo o extrato foi analisado in vitro pelo método de agarose overlay. O extrato apresentou um potencial irritante leve. Os produtos nanoemulsionados contendo o extrato apresentaram nível de irritação moderado, que pode estar relacionado com o potencial irritante dos tensoativos, considerados com grau de irritação severo, embora sejam tensoativos polietoxilados não-iônicos e usados como ingredientes em produtos dermocosméticos (FISCHER-MULLER, 2013).

A atividade antioxidante do extrato das flores de A. cathartica foi avaliada por Góes (2017) utilizando os métodos de DPPH, ABTS, FRAP, quelação de metais e no sistema β-caroteno ácido linoleico. O teor de fenólicos totais do extrato também foi avaliado com o objetivo de estimar a presença de compostos com capacidade redutora e correlacionar com a capacidade antioxidante averiguada nos métodos específicos de captação de radicais livres. O extrato das flores apresentou teor de fenólicos totais de 32,83 ± 0,03 mg EAG/g RS; na concentração de 74,18 mg/mL, consumo de radical ABTS equivalente a 1.000 µM de trolox; no método de FRAP, a solução a 77 mg/mL foi equivalente a 1.000 µM de sulfato ferroso; e o potencial quelante de metais foi equivalente a 0,48 mM de EDTA. No sistema β-caroteno ácido linoleico, o extrato na concentração de 1,83 mg/mL inibiu

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63,06% da oxidação atuando tanto na fase inicial do processo de oxidação quanto no bloqueio de produtos formados no processo de oxidação (GÓES, 2017).

A atividade inibitória da melanogênese em células de melanoma murinho B16F10 foi testada por Góes (2017). As células foram tratadas com o extrato das flores de A. cathartica (100 µg/mL) e ácido kójico (controle positivo) por 48 h. O extrato inibiu em 7,58% a quantidade de melanina formada em relação ao meio com DMSO. O extrato também foi analisado quanto ao potencial para inibir a atividade da tirosinase celular. Foram testadas as concentrações de 100, 250, 500, 750 e 1000 µg/mL. O extrato apresentou inibição de 5,24% da atividade da enzima. A enzima tirosinase catalisa duas distintas reações de síntese de melanina: a hidroxilação da L-tirosina a L-DOPA e a oxidação de L-DOPA a DOPAQUINONA. A tirosinase é uma enzima chave, uma vez que regula diretamente a quantidade de melanina produzida. O extrato apresentou potencial aplicação como inibidor da síntese de melanina.

O estudo de permeação cutânea das formulações nanoemulsionadas contendo extrato das flores foi realizado por Fischer-Muller (2013), usando aparato de célula de difusão de Franz e pele de orelha de suíno como membrana. O autor relatou não haver permeação significativa dos marcadores incorporados nos sistemas nanoemulsionados. Das três formulações testadas, nanoemulsão, microemulsão e cristal líquido, somente para a nanoemulsão foi detectado plumierídeo no líquido aceptor. O extrato aplicado na forma de solução alcoólica 10% permeou através da pele sendo detectado 2,72 µg/cm2 de plumierídeo. Os flavonoides não foram detectados no líquido aceptor, quanto incorporados nos sistemas nanoemulsionados. Já para o extrato em solução, houve permeação de 0,98 µg/cm2 de flavonoides.

A retenção de marcadores ocorre na epiderme, ou seja, provavelmente atravessaram o estrato córneo, porém não atravessaram a derme. Na análise da pele após tape stripping (retirada do estrato córneo), foi encontrado maior quantidade dos marcadores quanto incorporado na formulação do tipo cristal líquido. A maior proporção de tensoativos nesta formulação pode ter promovido a maior penetração do extrato, porém o grau de organização do sistema não permitiu a permeação cutânea dos marcadores. Todas as formulações testadas promoveram a penetração cutânea dos marcadores, pois estes foram quantificados nas análises de tape stripping (FISCHER-MULLER, 2013). Estes resultados são promissores uma vez que não seria

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interessante valores altos para permeação cutânea, pois busca-se o efeito tópico destas formulações visando a aplicação dermocosmética do extrato incorporado nos nanossistemas

3.4 Sistemas nanoemulsionados A nanotecnologia é consideravelmente recente na história e se aplica a praticamente todos os setores da pesquisa. A habilidade de caracterizar, manipular e organizar materiais em escala nanométrica está promovendo uma revolução na ciência e tecnologia, está sendo aplicada em diferentes áreas, principalmente por proporcionar meios para atingir as metas de forma anteriormente inacessíveis (CAMARGO, 2008; CASTRO, 2014; CEVC; VIERL, 2010). As proporções de melhoria ainda são imensuráveis e alguns são os desafios, dentre eles estão incluídos o desenvolvimento de produtos nanotecnológicos para qualquer tratamento para o corpo humano que seja eficaz e seguro. Outro desafio está na regulamentação destes produtos (CEVC; VIERL, 2010). Agências regulatórias mudialmente importantes, como o FDA (Food and Drug Administration) não possuem uma definição e regulamentaçãopara os nanomateriais. Em junho de 2014, o FDA emitiu uma orientação para ajudar a fornecer clareza regulatória na regulamentação de produtos que contenham nanotecnologia (Guidance for Industry Con, June 2014) (KATZ; DEWAN; BRONAUG, 2015). Neste guia, a FDA desenvolveu certos pontos a serem considerados ao tentar identificar aplicações de nanotecnologia. Os produtos são classificados em 2 grupos: o grupo 1 é relacionado a um material ou o produto final que seja projetado para ter pelo menos uma dimensão externa, ou uma estrutura interna ou de superfície, em nanoescala (aproximadamente 1 nm a 100 nm), e grupo 2 o material de engenharia ou produto final que exibe propriedades ou fenômenos incluindo propriedades físicas, químicas ou efeitos biológicos que sejam atribuíveis às suas dimensões, mesmo que essas dimensões se afastem da nanoescala, até um micrometro (KATZ; DEWAN; BRONAUG, 2015). Por sua vez, a regulamentação cosmética da União Europeia (UE) afirma que um nanomaterial é um "material insolúvel ou biopersistante e foi fabricado intencionalmente com uma ou mais dimensões externas, ou uma

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estrutura interna, na escala de 1 a 100 nm” (Regulamento (CE) n. 1223/2 e 9). Desta forma, se a estabilidade e solubilidade são consideradas, certas classes instáveis de nanomateriais (lipossomas, nanopartículas lipídicas sólidas e carreadores lipídicos nanoestruturados) podem não ser consideradas nanosistemas sob este regulamento (KATZ; DEWAN; BRONAUG, 2015). Quando à regulamentação destes produtos no Brasil, um estudo exploratório utilizando dados secundários obtidos das bases de dados SICON e LexML, disponíveis no site oficial do Senado Federal Brasileiro relata o estágio desta regulamentação. Os resultados obtidos mostraram que haviam 4 projetos de lei (PL) elaborados desde 2013 e somente 1 deles estava em tramitação, o PL 6741/2013, que dispõe sobre a Política Nacional de Nanotecnologia, a pesquisa, a produção, o destino de rejeitos e o uso da nanotecnologia no país, e dá outras providências. Além disso, este estudo também relatou a formação de um grupo de trabalho em nível governamental, o Grupo de Trabalho (GT) sobre Marco Regulatório no Fórum de Competitividade de Nanotecnologia. Este Fórum foi criado no final de 2009, por iniciativa do Ministério da Indústria e Comércio (MDIC), de acordo com os objetivos da Política de desenvolvimento produtivo (PDP), fortalecendo a Nanotecnologia como programa mobilizador em área estratégica (FERREIRA; SANTÁNNA, 2015). Por fim, o levantamento realizado afirmou que não há nenhuma regulamentação nacional de nanoprodutos, nem existem quaisquer definições acordadas ou terminologia para a nanotecnologia. Ainda não há protocolos acordados para os testes de toxicidade de nanopartículas, e não há protocolos padronizados para avaliar os impactos ambientais de nanopartículas. Por outro lado, há uma crescente comercialização de produtos com tecnologia nano; denotando, desta maneira, a necessidade de avaliações seguras, mitigando potenciais impactos à saúde e o ambiente (FERREIRA; SANTÁNNA, 2015). No entanto, ao contrário de outras tecnologias emergentes do passado, a nanotecnologia tem o potencial de mudar profundamente não só o padrão de vida dos brasileiros como a economia mundial. Sendo importante considerar todas as vantagens tecnológicas e prosseguir com estudos que busquem garantir métodos eficazes e seguros de comprovação o uso destes sistemas (FERREIRA; SANTÁNNA, 2015). Dentre os sistemas nanométricos, destacam-se os sistemas emulsionados. De acordo com o diâmetro da fase interna, os sistemas

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emulsionados são classificados como: macroemulsão (2-20 µm), nanoemulsão (100 e 200 nm) e microemulsão (<100 nm). Levando em consideração os sistemas nanométricos, diferente das microemulsões que são sistemas termodinamicamente estáveis, as nanoemulsões são cineticamente estáveis. Não requerem altas concentrações de tensoativos (entre 3,0 a 10%), já as microemulsões podem ter de 20% a 40%, principalmente quando é estruturada por mesofases líquido-cristalinas (ALLEN JR.; ANSEL; POPPOVICH, 2007; CAMARGO, 2008; FISCHER MÜLLER, 2013).

Comparação os sistemas emulsionados já conhecidos, as nanoemulsões podem ser classificadas como emulsões com gotículas uniformes e extremamente pequenas com tamanho que podem atingir a faixa de 1 a 200 nanometros, enquanto que as emulsões clássicas são caracterizadas por um tamanho maior de gotículas podendo chegar a 1 µm (MUSAZZI et al., 2017). As nanoemulsões são formulações que consistem basicamente em óleo, água, tensoativos e, eventualmente co-tensoativos. Dentre os componentes comumente ultizados destaca-se a combinação de lipoaminoácido, glicérides, poliglicérides e ésteres de ácido graxo. Tensoativos sintetizados a partir de derivados lipídicos como etilexil, etilexanoato e etilexil isononanoato têm sido os melhores para criar nanoemulsões com uma boa aparência e sensorial adequado na pele. Os óleos preferidos para utilização são os minerais, ésteres, éteres de cadeia longa, polideceno, ciclopentaxilosano e uma combinação destes (GUGLIELMINI, 2008; MONTENEGRO, 2014). O tamanho das gotículas ainda gera leve discordância quando se analisam vários autores. Para Camargo (2008) as nanoemulsões (NE) são constituídas por gotículas entre 20 a 500 nm. E esta alteração de faixa de tamanho médio embasa a diferenciação entre as características físicas e visuais apresentadas, sendo que NE entre 200 e 500 nm apresentam aspecto leitosa, e inferior a 200 nm, desenvolve aparência transparente ou translúcida, e apresentam uma coloração azulada brilhante característica denominada de efeito Tyndall azulado, que é um fenômeno de dispersão luminosa observado com frequência em dispersões coloidais (MUSAZZI et al., 2017). A maior estabilidade cinética das nanoemulsões em relação às emuslões se dá pelo tamanho da gotícula das nanoemulsões gerando menor tendência de ocorrência de cremeação, sedimentação, floculação ou coalescência, esquematicamente apresentado na Figura 7. O termo estabilidade cinética da emulsão refere-se à capacidade que uma emulsão tem em resistir a estas alterações em sua estrutura ao longo do tempo, e por isso estas são definidas

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como sistemas termodinamicamente instáveis. Tendem a se romper com o tempo, resultando em duas fases líquidas separadas (COUTO 2014; MUSAZZI et al., 2017).

Figura 7. Representação dos mecanismos de instabilidade das emulsões O/A.

Fonte: Adaptado de McClements (2005).

A estabilidade das nanoemulsões está diretamente relacionada também

ao emprego de tensoativos não-iônicos e/ou polímeros que conferem estabilização estéricas entre as gotículas, proporcionando a redução da possibilidade de coalescência, e ainda pela superação da força da gravidade atuante nessas gotículas pelo movimento browniano presente nesses sistemas, evitando assim processos de instabilidade (CASTRO, 2014). Nas emulsões as gotículas ou glóbulos emulsionados são estruturas globulares formadas por um agregado de moléculas anfipáticas, ou seja, formada por compostos que possuem características polares e apolares simultaneamente, dispersa em um líquido, constituindo uma das fases de um coloide. Estes glóbulos se mantêm em constante movimento, justamente pela presença de cargas elétricas entre eles que gera repulsão, caracterizando o movimento browniano. Nos sistemas nanoemulsionados a composição das gotículas colabora com a estabilização do sistema, alterando a ocorrência deste movimento, aumentando a estabilidade (FRANZOL; REZENDE, 2015). As propriedades físico-químicas e as vantagens das nanoemulões tem impulsionado a aplicação em diferentes produtos como alimentos, cosméticos e medicamentos. As principais vantagens destes sistemas são (CASTRO, 2014; MUSAZZI et al., 2017; PEREIRA et al., 2016):

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■ são passíveis de escalonamento e produção em escala industrial; ■ oferecem maior estabilidade física durante a vida útil do produto; ■ apresentam propriedades de textura aprimoradas do produto final; ■ apresentam alta estabilidade cinética; ■ promovem a liberação de substâncias ativas na pele; ■ apresentam excelente aspectos sensoriais e estéticos e menor necessidade de uso de tensoativos, reduzindo a possibilidade de irritação da pele e também custos de produção, em comparação com as microemulsões; ■ possuem baixa tensão interfacial que promove maior espalhabilidade da formulação e facilita a penetração das gotículas através das rugosidades da pele, possibilitando maior capacidade de hidratação; ■ promovem a penetração de substâncias ativas na pele; ■ a fluidez do sistema e o pequeno tamanho das gotículas proporcionam uma distribuição uniforme do produto sobre a pele; ■ a fluidez natural do sistema, com baixas concentrações de fase oleosa, confere aspecto sensorial muito valorizado em produtos cosméticos, ■ podem ser alternativas aos lipossomas, os quais possuem baixa estabilidade, e é possível em alguns casos obter estruturas líquido-cristalinas ao redor das gotículas. Assim como as nanoemulsões, as microemulsões e os cristais líquidos apresentam vantagens semelhantes, pois conseguem modificar a velocidade de liberação, oferecer benefícios como o aumento da solubilidade e absorção, assim como um maior controle da biodisponibilidade de fármacos. Como sistemas reservatórios, os mesmos podem alterar parâmetros farmacocinéticos, diminuindo a toxicidade e aumentando a eficácia clínica (FORMARIZ et al., 2005). As nanoemulsões não se formam espontaneamente, sendo necessário o fornecimento de energia ao sistema que podem ser preparadas por métodos de alta ou baixa energia de emulsificação. Os métodos que utilizam alta energia de emulsificação são baseados na geração de energia mecânica através de alta tensão de cisalhamento, homogeneizadores de alta pressão, microfluidizadores, ou pela utilização de ultrassom. Este último chamado de emulsificação ultrasônica é um dos métodos de alta energia documentado como um método rápido e eficiente, com formação de gotículas de pequeno diâmetro e polidispersão baixa (CASTRO, 2015; GHOSH; MUKHERJEE; CHANDRASEKARAN, 2013).

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Estes processos de alta energia algumas vezes podem ser desfavoráveis para aplicações industrial, pois necessitam de equipamentos caros e custos levados para seu funcionamento, além de utilizarem alta taxa de cisalhamento, podendo romper as gotículas, dificultando a encapsulação de bioativos, por exemplo. Neste sentido há grande interesse nos métodos de baixo consumo de energia na produção de nanoemulsões, utilizando equipamentos mais simples com menor custo de implementação (BORRIN, 2015). Aocontrário do observado em métodos de alta energia, estes métodos favorecem a encapsulação, proteção e liberação controlada de bioativos. Talvez uma desvantagem do método de baixa energia envolva o fato da necessidade de uso de maiores quantidades de tensoativo. Porém esta questão pode ser monitorada afim de não extrapolar limites aceitáveis no uso (BORRIN, 2015). Os métodos de emulsificação por baixa energia fazem uso de propriedades físico-químicas do sistema e utilizam a inversão espontânea na curvatura do tensoativo para obtenção de tamanho reduzido. As NE podem ser obtidas pelo método de temperatura de inversão de fases, chamado de transicional ou PIT (Phase Inversion Temperature) e ainda por inversão de fases pela alteração da fração volumétrica ou EPI (Emulsion Phase Inversion) (CASTRO, 2015; FRONZA; CAMPOS; TEIXEIRA, 2004; PEY et al., 2006). No desenvolvimento de sistemas nanomulsinados, o diagrama de fases pseudoternário é empregado como estratégia de planejamento das formulações. O diagrama ternário utiliza um triângulo equilátero com 3 componentes: água, óleo e tensoativo, e recebe o nome de diagrama pseudoternário quando envolve os 3 componentes, contudo a região do tensoativo, representa um sistema tensoativo composto por dois ou mais tensoativos e/ou co-tensoativo (DAMASCENO et al., 2011).

Durante o desenvolvimento do diagrama, as propriedades dos triângulos equiláteros devem ser extremamente exploradas, de modo que a soma dos lados perpendiculares de determinado ponto no triângulo seja igual à sua altura, e sempre devem resultar em 100%, de acordo com Figura 8, onde por exemplo o ponto 10 sinalizado na imagem representa que aquele ponto de análise que contêm 40 % de óleo de arroz, 50 % de tensoativos e 10 % de água, diferindo do ponto 20, que apresentou 50 % de óleo, 30 % de tensoativo e 20% de água (BERNARDI, 2011; DAMASCENO et al., 2011).

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Figura 8. Diagrama ternário utilizado no desenvolvimento de nanoemulsão com óleo de arroz, tensoativos e água.

Fonte: BERNARDI, 2011.

Para melhor compreensão dos sistemas nanoemulsionados, um fator relevante é a caracterização destes sistemas. Em relatório técnico (Report of

the Joint) do Grupo de Trabalho de Regulamento de Cooperação Internacional em Cosméticos (ICCR), composto Canadá, Comissão Européia, Japão e Estados Unidos, foram listados os métodos mais relevantes para a caracterização de nanomateriais e aplicáveis aos nanocosméticos (KATZ; DEWAN; BRONAUG, 2015). Cada método foi avaliado em termos do parâmetro a ser mensurado, sensibilidade da medida e os princípios subjacentes envolvidos na determinação. Em 2013, o mesmo grupo técnico publicou um relatório sobre segurança de nanomateriais em cosméticos. A conclusão deste levantamento foi de que os excipientes utilizados no desenvolvimento de nanomateriais não eram diferentes dos observados em formulações convencionais (KATZ; DEWAN; BRONAUG, 2015). Sendo assim, metodologias já aplicadas para sistemas cosméticos semelhantes aos das nanoemulsões podem também ser utlizados para caraterização destes sistemas, sendo necessário no entanto levar em consideração além dos métodos já recomendados, as tecnologias desenvolvidas especificamente para estes tamanhos de gotículas. Neste sentido, as nanotecnologias que foram usadas para criar os recursos em chips de computador nos últimos 20 anos e no entanto, através da invenção de técnicas de imagem como o microscópio de varredura e o

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microscópio de força atômica, a compreensão do mundo nanométrico melhorou drasticamente e isso está levando a uma capacidade aprimorada para controlar a estrutura em nanoescala (DOWLING, 2004). As técnicas de análises por microscopia eletrônica identificam características morfológicas, como a estrutura interna. As comumente utilizadas na caracterização de nanoemulsões são a microscopia eletrônica de transmissão – MET (transmission eletron microscopy - TEM), a microscopia eletrônica de varredura – MEV (scanning eletron microscopy - SEM) e a microscopia de força atômica - MFA (atomic force microscopy - AFM) (KLANG et al., 2012). A MET não utiliza a luz para visualizar a amostra e, sim, emissão de elétrons, esta técnica emprega o vácuo e a imagem obtida é resultado da interação da amostra com os elétrons, ou seja, dispersão de elétrons. A resolução na MET é proporcional à aceleração da voltagem dos elétrons, sendo que para sistemas coloidais são usadas voltagens entre 80 e 200 kV, e resolução entre 0,3 e 1,0 nm, não alcançando resultados nítidos em resoluções menores. Para melhor análise pode ser empregado contraste negativo, como sais de metais pesados como tungstênio, molibdênio ou urânio (DAL MAS, 2015; KLANG et al., 2012). Além da microscopia outros métodos são comumento utilizados, como as técnicas em que se avaliada a aparência, o pH, o tamanho médio de fase interna, da distribuição de tamanho e do potencial zeta das formulações. Os valores do índice de polidispersidade (PDI) variam de 0 a 1, onde quanto menor o valor, a amostra se encontra monodispersa, sendo para nanoemulsões um ideal de até 0,3, e quanto mais próximo de 1 estiver, mais polidispersa será a dispersão das gotículas do sistema (FAYAD et al., 2009). Para as análises de tamanho médio de fase interna, distribuição de tamanho e potencial zeta, a espectroscopia de correlação de fótons pode ser aplicada. O potencial zeta é medido pela aplicação de um campo elétrico através da dispersão. As partículas que possuem um potencial zeta migram para o eletrodo de carga oposta com uma velocidade proporcional ao valor de seu potencial, ou seja, o potencial zeta indica a carga de superfície apresentada pela amostra (FAYAD et al., 2009).

Outro método utilizado, porém não exclusivo de nanosistemas, é a análise reológica, que é o estudo da deformação e do escoamento da matéria. A caracterização reológica completa de um sistema inclui a influência em testes sensoriais, que auxiliem para verificar a aceitação do consumidor final.

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Esta análise adquiriu posição permanente nos testes de estabilidade, uma vez que estas características são propriedades importantes a serem consideradas na fabricação, estocagem e aplicação de produtos de uso tópico. Ela interfere na forma de aplicação do produto, na adesão ao tratamento e, também, na aceitação do produto pelo consumidor (ISAAC et al., 2008). Já a identificação da estrutura interna das microemulsões com mesofases líquido cristalina, além de ser muito importante, é também complexa. Técnicas semelhantes às utilizadas pelas nanoemulsões são utilizadas como condutividade iônica, medidas reológicas, espectroscopia de fotocorrelação, microscopia de luz polarizada, entre outros, podendo ser incluídas o espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), espalhamento de nêutrons a baixo ângulo (SANS), espalhamento de luz (light scattering), microscopia eletrônica de transmissão e ressonância magnética nuclear (CHORILLI et al., 2009) 3.5 Métodos para comprovação de segurança de produtos cosméticos Os cosméticos são definidos como preparações que contêm substâncias naturais ou sintéticas, de uso externo nas diversas partes do corpo humano, com o objetivo exclusivo ou principal de limpá-los, perfumá-los, alterar sua aparência e ou corrigir odores corporais e ou protegê-los ou mantê-los em bom estado (BRASIL, 2012). Deste modo, com a exposição permanente e diária a estes produtos, cresce a consciência da necessidade em oferecer produtos cosméticos seguros. Assim sendo, eles devem ser seguros para o consumidor nas condições normais ou razoavelmente previsíveis de uso. Além do conhecimento do nível de absorção cutânea, são necessárias outras informações para o estudo dos riscos de ingredientes e produtos cosméticos (BRASIL, 2012; CRUZ; ANGELIS, 2012). A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), como órgão regulador, na missão de promover e proteger a saúde da população, determina metodologias de análise a serem realizadas para comprovação da segurança de produtos cosméticos. Até os dias atuais, as metodologias para determinar os riscos ou o perfil toxicológico dos cosméticos se baseiam principalmente em experimentos com animais (BRASIL, 2012; CRUZ; ANGELIS, 2012).

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Com isso, a descoberta de uma substância medicinal capaz de auxiliar no tratamento de uma patologia dá início a um processo longo de pesquisa e desenvolvimento. Dentro das necessidades e rotinas da área da pesquisa destacam-se os testes in vitro e in vivo para a realização destas análises. Contudo, este conceito vem passando por alterações e necessidades de atualizações em sua aplicabilidade. Discussões acerca do uso de modelos que utilizam roedores e não roedores são contestados, surgindo assim um consenso de que é preciso desenvolver métodos alternativos de pesquisa farmacêutica que evitem tais análises (CHIARI et al., 2012; HERMANN, 2014). Em 1993 foi criado o European Centre for the Validation of Alternative

Methods (ECVAM), que tem como finalidade promover a aceitação científica e regulatória dos métodos alternativos aos ensaios animais. Em 1997, nos Estados Unidos, foi criado o Interagency Coordinating Committee on the

Validation of Alternative Methods (ICCVAM) pelo National Institut of

Environmental Health Sciences (NIEHS), que tem por finalidade validar e regular métodos de ensaios toxicológicos (HARRIS, 2013). No guia para avaliação de segurança de produtos cosméticos, testes como irritação ou corrosividade cutânea sugeriam aplicação da amostra sobre o dorso tricotomizado de coelhos albinos; entre outros. Contudo, devido a evolução técnico científica citada, o uso de métodos alternativos sugere por exemplo, avaliação do potencial de irritação ocular por metodologias como BCOP - avaliação do potencial irritativo após a aplicação sobre a córnea isolada de bovino, através da medida de opacidade e da permeabilidade após o contato com o produto teste. HET-CAM, ensaio que avalia o potencial irritante de um ingrediente sobre a membrana cório-alantoide de ovo embrionário de galinha, no 10° dia de incubação. O guia também propõe outros métodos de análise para irritação dérmica, como citotoxicidade pela difusão em gel de agarose e pelo método do vermelho neutro e MTT (BRASIL, 2012). Analisando as situações propostas, métodos alternativos que mimetizam testes tradicionais podem ser extremamente preditivos e urgentes. Dentre estes pode se citar um exemplo de estudos reprotóxicos conduzidos com células tronco embrionárias, bem como ensaios de transformação celular para carciogenicidade, produção de kits de pele artificial para testes de sensibilidade de cosméticos, estudos com larvas capazes de substituir mamíferos em exames de toxicidade ou a redução do número de roedores no

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controle de qualidade de vacinas, bem como a técnica de tape stripping entre outras (HARRIS, 2013; KLANG et al., 2012; MARQUES, 2014). 3.5.1 Citotoxicidade pelo método MTT

Nesta metodologia a citotoxicidade é avaliada com a ajuda de um corante vital MTT ou 3-(4,5 dimetil tiazol-2il)-2,5 difenil tetrazólico bromide. Os parâmetros de avaliação observados são a porcentagem de morte celular e a concentração do produto que inibe 50% do crescimento celular (IC50). O método é restrito para produtos solúveis em água (BRASIL, 2012). 3.5.2 Citotoxidade pelo método de vermelho neutro (Neutral Red Uptake -

NRU)

A citotoxicidade é avaliada utilizando-se uma cultura de células SIRC CCL 60 ou outras, adicionadas do corante vermelho neutro. A captação do corante pelas células viáveis é quantificada por espectrofometria, através de um leitor automático de microplacas. Este método pode ser empregado para todo tipo de formulação, exceto aquelas que possuam propriedades fixadoras, como formulações alcoólicas (BRASIL, 2012). 3.5.3 Teste HET-CAM (Hen’s Egg Test-Chorioallantoic

Membrane/membrana corioalantóide) O objetivo do ensaio é avaliar semi-quantitativamente o potencial irritante de um ingrediente, quer seja sob a forma de emulsões, géis ou óleos, sobre a membrana corioalantoide de ovo embrionado de galinha, no décimo dia de incubação. O ensaio é baseado na observação dos efeitos irritantes (hiperemia, hemorragia e coagulação), após 5 minutos da aplicação do produto, puro ou diluído, sobre a membrana corioalantoide. Obtém-se uma escala que considera os fenômenos observados, conforme quadro 1 (BRASIL, 2012; MCKENZIE et al., 2015).

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Quadro 1 - Escala de pontuação para o teste HET-Cam Pontuação Escala Descrição Sem ocorrência da hemorragia 0 Não irritante Apenas descoloração visível da membrana

1 Irritante leve

Estruturas cobertas parcialmente pela hemorragia

2 Irritante

moderado Estruturas cobertas completamente pela hemorragia

3 Irritante grave

Fonte: McKenzie et al., 2015.

3.5.4 Teste de irritação cutânea in vitro

A avaliação do potencial de dano sobre a pele pode ser feita através do uso de métodos in vitro, visando verificar a ação irritativa ou corrosiva de produtos e substâncias (BRASIL, 2012).

Para a determinação do potencial irritante das formulações a técnica de agarose overlay baseia-se na aplicação de uma amostra em uma superfície de um gel de agarose em contato com células de tecido conjuntivo de camundongo da linhagem NCTC – clone 929 (ATCC CCL1). Por exemplo, a citotoxicidade é avaliada com a ajuda de um corante vital, o MTT ou Vermelho Neutro, observando-se o diâmetro médio do halo de lise celular revelado pela coloração. O halo reflete a citotoxicidade de um produto testado e a sua capacidade em se difundir no gel de agarose, de acordo com os valores referência apresentado no quadro 2 (UNITED STATES PHARMACOPEA, 2013).

Quadro 2 - Classificação do grau de irritação cutânea no modelo de agarose overlay.

Classificação Reatividade Descrição da zona de reatividade

0 Nenhum Nenhuma reatividade ao redor da amostra

1 Leve Alguma má – formação ou degeneração ao

redor da amostra

2 Médio Zona limitou a área ao redor da amostra

3 Moderado Zona estende 0,5 a 1,0 cm além da

amostra

4 Severo Zona de extensão maior que 1,0 cm além

da amostra Fonte: United States Pharmacopoeia (2013)

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3.5.5 Avaliação da permeação e retenção cutânea

O objetivo do estudo é avaliar in vitro a permeação cutânea e retenção cutânea de um fármaco. Como membrana modelo para este estudo pode ser usada pele da orelha do porco não escaldada, pele de cobre ou pele humana proveniente de cirurgia plástica (BRASIL, 2012). As técnicas in vitro têm sido usadas frequentemente para quantificar o trânsito de substâncias através da pele, e estas permitem tomar amostras analíticas com grande precisão para a avaliação da permeação de uma substância ativa. Experimentos de permeação in vitro são realizados com o uso de células de difusão, chamadas de célula de Franz (BRASIL, 2012).

57

4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Material 4.1.1 Material vegetal

As flores de A. cathartica foram coletadas no município de Barra Velha (SC), nos meses de fevereiro a abril de 2015 e 2016. Foram secas e estabilizadas em estufa de ar circulante a 40 ºC por até 5 dias. A droga vegetal foi acondicionada em saco plástico com revestimento de papel e mantida em sala com controle de umidade e temperatura.

Foi determinado o rendimento de material vegetal seco e a perda por dessecação do mesmo. A exsicata está depositada no Herbário Barbosa Rodrigues em Itajaí-SC, sob o código HBR 52742. 4.1.2 Reagentes

● Acetato de sódio anidro, Alphatec, lote 23504, ● Acetonitrila HPLC AS1122-001, Panreac (Alemanha), lote 0000470339, ● Ácido acético glacial, Dinâmica® Química Contemporânea Ltda, lote 41279, ● Álcool cetoestearílico, Audaz (Brasil), AF 1022, lote 1609013, ● Álcool etílico absoluto 99,7%, Alphatec, lote 23889, ● Álcool metílico HPLC, Panreac (Alemanha), lote 0000492476, ● Álcool metílico, VETEC Química Fina, lote1203778, ● Alkest CSO 400 H, Oxiteno, lote 130817M58483, ● BHT (butilhidroxitolueno), Vetec – Sigma-Aldrich, ● CrodalanTM® LA (Cetyl Acetate (and) Stearyl Acetate (and) Oleyl Acetate

(and) Acetylated Lanolin Alcohols), Croda, São Paulo-SP, Brasil, ● EDTA (N-(2-Hidroxietil)etilenodiamina), Sigma-Aldrich® , lote 13006157, ● Folin Ciocauteu, Dinâmica® Química Conteporânea Ltda, lote: 84049,

• Miristato de isopropila, Alphatec, lote 24133, ●Ovos de galinhas férteis, Borges Comércio de Frangos, Balneário Camboriú- SC, Brasil, ● Phenonip®, All Chemistry, Espanha, lote 4410, ● Plumierídeo – isolado e identificado a partir das flores de A. cathartica -

laboratório de fitoquímica, pureza maior que 99%,

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● Polymol® 812 (Triglicérides de ácido cáprico e caprílico), AQIA Química Industrial Ltda, (Guarulhos-SP, Brasil), lote PG10545 ● Propilenoglicol, Eficácia, Balneário Camboriú-SC, Brasil, ● Rutina hidratada, Sigma-Aldrich, pureza de 95%, ● Sepigel®305, SEPPIC FRANCE, França, lote 160217018790, ● Span® 80, Sigma – Aldrich, São Paulo, Brasil, ● Tampão PBS, pH 7,2, LB LaborClin, lote 80708011, ● Vaselina líquida. 4.1.3 Equipamentos e materiais

● Agitador mecânico, Fisatom®, mod. 713D, ● Aparelho de células de Franz Microette, Q-Park-Hanson Research, ● Aparelho AP22 Homogeneizador de sangue Phoenix ● Balança Uni Bloc Schimadzu, mod. AUW22D, ● Balança BEL Engineering, mod. UMark 250A, ● Banho de Ultrassom Eco-Sonis, Lavadoras Ultrassônicas, ● Cabo de bisturi n.4, ABC Instrumentos Cirúrgicos LTDA, ● Centrífuga micro, Fanem®, mod.243, ● Centrífuga Micro High Speed refrigerated Centrifuge Vision, VS 15000 CFN II – Brushless DC.Motor, ● Centrífuga Harrier 18/80 Regrigerated, MSE, ● Chapa de aquecimento, Fisatom®,

● Cromatógrafo Schimadzu PDA, modelo: LC-20AT, constituído dos seguintes sistemas: DAD SPD – M2OA, Auto sampler SIL – 20AHT, degasser in line DGU – 20A5, comunicador CBM – 20ª e forno CTO – 1AS VP, software Schimadzu LC Solution, ● Equipamento de difração de luz laser e potencial zeta, Zetasizer®, mod. Nano Sizer, Malvern Instruments, acoplado ao software DTS Nano, ● Espectrofotômetro Jasco V-630, UV/VIS, Jasco/ C323961148, ● Espectrofotômetro Spectrostar Nano, BMG Labtech, ● Estufa com renovação e circulação de ar, Marconi®, mod. MA 037, ● Estufa FANEM – ORION® de temperatura controlada, ● Filtro para seringa, Chromafil® RC-45/15 MS, lote 2.310, com membrana 0,45 µm e filtro 15mm,

● Filtro Millex LCR com membrana PTFE 0,45 µm, ● Frasco com EDTA de coleta BD, 4 mililitros,

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● Lâminas de bisturi n.4, (aço carbono), Wiltex Plus, estéril, descartável, ● Placa para cultivo de células de 96 poços fundo chato, Kasvi, modelo K12-096, ● Membrana de celulose,

• Multiprocessador, All in one Philco 4x1, modelo 2801500,

• pHmetro digital Digimed – AJMICRONAL, modelo AJX-512,

• Pipeta Microman, Gilson S.A.S – 100 µg com capilares de 250 µL e pistons de 250 µL, ● Seringa de insulina, BD Ultra-Fine™ 6mm (sem agulha) descartável, ● Seringa de vidro, Arti Glass, 10 cc/mL, ● Tamis, Bertel®, abertura de 1,18 mm, ● Ultrapurificador de água, Purelab Classic Elga, ● Viscosímetro rotacional, Haake® UT550, K10, DC30, tipo cone placa, e cone, acompanhado à um banho de água termostatizado e software Rheowin® v. 4 Data Manager 430.0013 e Rheowin® v. 4 Job Manager. 4.2 Obtenção do extrato mole das flores de A. cathartica A solução extrativa foi obtida pelo método otimizado por Góes (2011). A droga vegetal foi colocada em contato com o solvente extrator (solução hidroetanólica 90% (v/v) na proporção droga:solvente 1:10 para obtenção de 2 litros e submetida à extração pelo método de maceração dinâmica em agitador mecânico a 300 rpm por 6 h, protegido da luz. Após extração, a solução foi filtrada primeiramente em tecido de poliéster e na sequência em papel filtro e acondicionada em frasco de vidro âmbar, sob refrigeração. A solução extrativa foi concentrada em banho de água a 44-45 ºC até obtenção de um extrato mole com teor de umidade de aproximadamente 20% (aspecto pastoso).

4.3 Caracterização do extrato mole 4.3.1 Determinação do valor de pH

O extrato foi diluído em água purificada a 10%, disperso em banho de ultrassom por 15 min e realizado a leitura direta em triplicata em potenciômetro digital.

60

4.3.2 Determinação do resíduo seco

O resíduo seco do extrato mole foi determinado conforme metodologia descrita na Farmacopeia Brasileira (2010). As amostras do extrato mole (cerca de 0,5 g) foram pesadas em cadinhos de porcelana previamente dessecados, dessecadas em estufa a 105 ± 5 °C por 3 horas, resfriadas em dessecador por 15 minutos e pesadas.

As análises foram realizadas em triplicata e o resultado expresso em percentual de resíduo sólidos das amostras após dessecação.

4.3.3 Determinação do teor de marcadores por CLAE

O método utilizado para determinação de teor de marcadores por CLAE foi otimizado e validado em trabalho anterior realizado pelo grupo de pesquisa (FISCHER MÜLLER et al., 2015). Resumidamente, o método possui boa adequabilidade e simetria de pico com DPR de 2,84% e 0,28% para os valores de área e tempo de retenção do plumierídeo (PMD), respectivamente e fator de Tailing de 1,08 (4,12%). O método é linear na faixa de 10 a 750 µg/mL com coeficiente de determinação (r²) maior que 0,99, com equação de y= 26368x-58577. O método apresenta reprodutibilidade inter e intracorrida, com DPR inferior a 2% nos três níveis de concentração avaliados (50, 105 e 150 µg/mL de PMD). O método é exato com recuperação superior a 100% e DPR < 5,00% nos três níveis analisados (50, 100 e 150 µg/mL de PMD). O método é robusto para pequenas alterações de temperatura com DPR < 2,00%, pouco robusto para alteração de pH da água da fase móvel com DPR < 10,50% e não é robusto para alterações de fluxo da fase móvel com DPR < 18,90%. Os limites de detecção e de quantificação são 0,369 e 1,238 µg/mL, respectivamente.

Para quantificação da rutina, no presente estudo foram elaboradas as curvas analíticas do PMD, rutina e flavonoides totais a partir da quantificação do extrato mole nas concentrações de 0,1 a 1,0 mg/mL e da rutina pura na concentração de 10 a 50 µg/mL. Conforme apresentado no Apêndice A, o método é linear para PMD, rutina e flavonoides totais presentes no extrato mole com r2 > 0,99, com as seguintes equações de reta: y= 7000000x+42902 (r2 = 0,9989) para PMD; y= 288221x+2623,9 (r2 = 0,9989) para rutina e y= 560762x+3064,3 (r2 = 0,9988) para flavonoides totais. O método apresentou uma resposta linear para quantificação da rutina pura na faixa de concentração de 10 a 50 µg/mL, com r2 de 0,9987 e equação da reta de y= 38015x-29734 (Apêndice A).

61

Assim, as condições experimentais estabelecidas foram: fluxo de 1,0 mL/min, temperatura de 30 ºC em coluna de fase reversa Phenomenex® Luna C18, 5 µm, volume de injeção de 20 µL, tempo de análise de 25 min, fase móvel composta por acetonitrila e água acidificada (pH 3,5, ácido acético) em sistema gradiente (Quadro 3) e detecção em de 230 e 355 nm para quantificação do plumierídeo e flavonoides, respectivamente.

A preparação das soluções empregadas na análise das amostras por CLAE estão descritas a seguir. 4.3.3.1 Preparação da fase móvel

A água acidificada foi preparada com a adição de ácido acético glacial em água ultrapura, sob agitação, até pH 3,5 seguido de filtração em filtro 0,45 µm, sob vácuo e armazenada em frasco de vidro âmbar.

O solvente acetonitrila grau HPLC foi usado sem prévia filtração.

Quadro 3- Composição do sistema eluente no modo gradiente usado no método analítico para análise dos derivados das flores de A.

cathartica por CLAE.

Tempo (min)

Acetonitrila (%)

Água acidificada (pH 3,5)

0,01 15 85

10 30 70

20 15 85

25 15 85

* Água acidificada com ácido acético pH 3,5; Fluxo: 1,0 mL/min.

4.3.3.2 Solução de extrato mole 1,0 mg/mL (SE1):

Para obtenção da solução do extrato mole 1 mg/mL, exatamente cerca de 25 mg de extrato mole foi pesado em balão volumétrico de 25 mL (descontando a umidade do extrato mole), cerca de 20 mL de metanol foi adicionado e submetido à dissolução com agitação em banho de ultrassom por 30 min. Após este período, o volume foi completado com metanol e filtrado em filtro de 0,45 µm.

Para análise em CLAE foi utilizada a solução do extrato na concentração de 500 µg/mL. Para tanto, em frasco tipo vial, a solução SE1 (1,0 mg/mL) foi diluída na proporção 1:1 com metanol grau HPLC. Na

62

análise foi considerado o resíduo seco do extrato e as análises foram realizadas em sextuplicata.

4.3.3.3 Solução estoque de Plumierideo 1,0 mg/mL (SE2)

Exatamente cerca de 25 mg de PMD foi pesado em balão volumétrico de 25 mL. Aproximadamente 20 mL de metanol foi adicionado e dissolvido com auxílio de banho de ultrassom por 30 min. O volume foi completado e filtrado em filtro de 0,45 µm. Para análise em CLAE foi utilizada a solução na concentração de 100 µg/mL, por meio da diluição da SE2 na proporção 1:10 com metanol grau HPLC.

4.3.3.4 Solução estoque de RUT 100 µg/mL (SE3):

Exatamente 2,5 mg de RUT foi pesada em balão volumétrico de 25 mL. Cerca de 20 mL de metanol foi adicionado e dissolvido com auxílio de banho de ultrassom por 30 min. O volume foi completado com metanol e a solução filtrada em filtro de 0,45 µm. Para análise em CLAE, a solução SE3 foi diluída para obtenção da concentração de 20 µg/mL usando metanol grau HPLC. 4.4 Preparação do emulgel contendo extrato mole das flores de A.

cathartica A formulação do tipo emulgel contendo extrato de A. cathartica foi

preparado usando a formulação descrita no Quadro 4. O produto foi preparado pelo método de emulsificação convencional. Após a temperatura das fases aquosa (FA) e oleosa (FO) atingir 70 °C, a FA foi vertida sobre a FO, com agitação manual até homogeneização e resfriamento do produto. O EM foi dissolvido com propilenoglicol 1% e adicionado na fase oleosa da emulsão.

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Quadro 4 - Composição do emulgel contendo extrato das flores de A. cathartica.

Componentes Concentração (%)

SEP1 SEP2* Sepigel (FO) 7,5 7,5 Vaselina (FO) 1 1 Crodalan (FO) 2 2

Miristato de isopropila (FO) 2 2 BHT (FO) 0,1 0,1 Álcool cetoestearílico (FO) 3 3

Phenonip (FO) 0,7 0,7 EDTA (FA) 0,1 0,1

Água purificada (FA) qsp qsp Ext. A. cathartica %** 1,0 -

*SEPE2 (amostra branco); **dissolvido com propilenoglicol 1%; FA – fase aquosa; FO - Fase oleosa 4.5 Preparação de sistemas nanoemulsionados contendo extrato das flores de A. cathartica Os sistemas nanoemulsionados foram preparados pelo método de inversão de fases. A formulação dos sistemas está descrita no Quadro 5. As fases aquosa (água ultrapura) e oleosa (triglicérides de ácido cáprico e caprílico-CCT, óleo de rícino polietoxilado-Alkest CSO 400 e mono-oleato de sorbitano - Span® 80, Phenonip® e extrato mole de A. cathartica) foram aquecidas em banho-maria até 80 ± 2°C. Após gotejamento da fase aquosa, sob agitação mecânica a 600 rpm, o sistema foi mantido sob aquecimento e agitação por 5 min, retirado do aquecimento e mantida a agitação por mais 5 min. O método e as concentrações foram selecionados de acordo com estudo realizado anteriormente por Fischer Müller (2013).

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Quadro 5 - Composição das nanoemulsões (NE) e microemulsões (ME) com e sem extrato mole das flores de A. cathartica.

Componentes Composição (%)

NE1 NE2 ME1 ME2 Span® 80 1,73 1,73 4,60 4,60 Alkest® CSO 400 13,27 13,27 35,40 35,40

Polymol® 10 10 10 10 Phenonip® 1,0 1,0 1,0 1,0 Água purificada 73 74 48 49

Ext. A. cathartica* 1,0 - 1,0 - *Quantidade em resíduo seco do extrato mole; 4.6 Caracterização dos produtos 4.6.1 Características organolépticas

Os aspectos físicos cor e turbidez foram analisados por percepção direta e visual. 4.6.2 Resistência mecânica

A resistência mecânica dos sistemas foi analisada pela presença da separação de fases e/ou cremeação antes e após serem submetidos à centrifugação a 3000 rpm por 15 min. 4.6.3 Determinação do pH

O valor de pH foi determinado usando potenciômetro calibrado com soluções de fosfato e acetato, pH 7,0 e 4,0, respectivamente. As amostras foram diluídas 1:10 (g/mL) com água ultrapura e as leituras realizadas em triplicata. 4.6.4 Análise de tamanho e de propriedades de superfície

A distribuição de tamanho, o tamanho médio de fase interna e o índice de polidispersidade (PDI) foram determinadas pelo método de espectroscopia de correlação de fótons usando equipamento Nano Series (Malvern Instruments) acoplado ao software DTS Nano. As amostras foram dispersas em água purificada na concentração de 1:50, homogeneizadas e analisadas a 23 ± 2 ºC.

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O potencial zeta foi determinado em analisador de carga de superfície a partir da velocidade de migração das partículas em um meio eletroforético com auxílio de difração de luz laser (Zetasizer Nano Series, Malvern Instruments).

4.6.5 Teor de marcadores por CLAE

As amostras foram analisadas conforme metodologia analítica descrita por Ficher-Muller et al. (2015) e apresentada no item 4.3.3. A validação do método para quantificação do extrato nas formulações do tipo nanoemulsão (NE) e microemulsão (ME) foram descritas no referido trabalho. O método se mostrou reprodutível com valores de DPR < 4,0% quando analisado em dois dias e com precisão intermediária (DPR <5%). O método é seletivo para detecção dos marcadores PMD, rutina (RUT) e flavonoides, não havendo interferência da composição dos sistemas sobre a integração dos picos usados na quantificação dos marcadores para o extrato mole (EM) (FISCHER MÜLLER et al., 2015). Para confirmação da utilização da metodologia analítica na determinação do teor do extrato mole no emulgel, foi realizada análise de precisão do método em um único nível e em um único dia, conforme descrito em 4.6.5.1. Para análise das preparações contendo extrato de A. cathartica, foram preparadas soluções na concentração de 100 mg/mL usando como solvente metanol em balão volumétrico de 10 mL e com dissolução e agitação em banho de ultrassom por 30 min. Após filtração, 500 µL da dispersão foram transferidos para um vial e adicionados 500 µL de metanol grau HPLC, obtendo soluções com concentração teórica de 500 µg/mL de extrato de A.

cathartica. Soluções de EM e dos marcadores PMD 100 µg/mL e RUT 20 µg/mL foram utilizadas e injetadas em quadruplicatas durante as análises. 4.6.5.1 Análise de precisão do método para o emulgel

A precisão do método foi verificada pela determinação da repetibilidade (precisão inter-corrida). Para análise da precisão pesou-se exatamente cerca de 1 g do emulgel com EM de A. cathartica em sextuplicata em balão de 10 mL, e em unicata para 1 g da amostra sem EM em balão de 10 mL. Foi adicionado 5 mL de metanol e com auxílio de banho de ultrassom permaceu por 1 hora para dissolução. Após este período, foi completado o volume. Em seguida a solução foi filtrada com membrana 0,45 µm, diluída na proporção

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1:1 com metanol grau HPLC. Cada amostra foi analisada em duplicata em CLAE, usando a metodologia descrita no item 4.3.3. As soluções de EM e dos marcadores PMD e RUT foram injetadas em quadruplicata durante a análise. 4.6.6 Análise reológica

Para análise reológica dos sistemas foi utilizado o aparelho viscosímetro rotacional usando aparato cone-placa para o emulgel e microemulsão e cilindro coaxial para as nanoemulsões. As análises foram conduzidas com aumento de taxa de cisalhamento de 0 a 80 1/s em intervalo de 180 s, taxa de cisalhamento constante de 80 1/s no intervalo de 180s e redução da taxa de cisalhamento de 80 a 0 1/s em 180 s a 25 °C. Em cada ciclo foram coletados 100 pontos. As análises foram realizadas em duplicata. Os resultados foram expressos em perfil de tensão de cisalhamento, perfil de viscosidade, viscosidade média, índice de comportamento de fluxo, calculado segundo equação da lei da potência, e tixotropia. Os resultados foram analisados usando o software Rheowin® 4 Data Manager 430.0013. 4.6.7 Análise de propriedades de textura

As propriedades mecânicas dos sistemas (com e sem extrato mole) foram determinadas em analisador de textura usando modo de análise de perfil de textura (TPA – texture profile analysis). Aproximadamente 10 g da formulação foram transferidas para um béquer de 25 mL, cuidando para evitar a incorporação de bolha de ar. Em modo TPA, a sonda de 10 mm de diâmetro foi forçada a penetrar 10 mm na amostra a uma velocidade de 1 mm/s com um intervalo de 20 s entre a primeira e a segunda etapa. O ensaio foi realizado a temperatura de 23 ± 2 °C, em triplicata.

A partir do gráfico de força x distância e força x tempo, os parâmetros de firmeza, adesividade, espalhabilidade e pegajosidade foram calculados com auxílio do software Texture® exponente Lite versão 5.0.9.0 (BRUSCHI et al., 2007). 4.6.8 Determinação do teor de fenólicos totais

O teor de fenólicos totais foi determinado de acordo com método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau adaptado por Góes (2017) e Neves

67

et al. (2009). Para tanto o extrato mole de A. cathartica L. foi diluído com metanol, para obter valores de absorbância entre 0,2 a 0,630. Em balão volumétrico de 10 mL foi pesado exatamente cerca de 10 mg do EM (levando em consideração o teor de umidade), adicionado cerca de 5 mL de metanol e dissolvido com auxílio de banho de ultrassom por 30 min. Após este período, o volume foi completado com metanol. Para a análise de compostos fenólicos totais nos produtos, em béquer foi pesado cerca de 5 g de cada amostra com e sem EM. Foi adicionado 5 mL de metanol e dissolvido em banho de ultrassom por aproximadamente 1 hora. Após foi transferido para balão de 10 mL e completado o volume, esta dispersão foi acondicionada em um tubo Falcon® e centrifugado por 5 minutos a 5000 rpm. A partir do líquido sobrenadante, retirou-se uma alíquota para quantificação de fenólicos. Em seguida, 25 µL de cada solução foi complexada com 125 µL de reagente Folin-Ciocalteau e 1500 µL de água purificada e homogeneizada em vórtex. Após 1 min, 500 µL de carbonato de sódio a 15% foi adicionado à solução, seguido de agitação por aproximadamente 30 s em vórtex. Para completar o volume para 2,5 mL, foi adicionado mais 350 µL de água purificada. A análise foi realizada em triplicata para todas as amostras A fim de evitar interferência da turbidez fornecida pelas formulações, antes da leitura as amostras dos sistemas foram filtradas com filtro 0,45 µm. A leitura da absorbância foi realizada após 30 min em 780 nm, usando como branco a mistura de todos os reagentes, exceto o EM, sendo substituído pelo metanol. O teor de fenólicos totais foi expresso em mg de equivalente de ácido gálico (mg de EAG), com base na curva analítica de ácido gálico com concentração entre 0,05 a 1 mg/mL e equação da reta y= 1,0417x +0,0089 obtida com a regressão linear (r²= 0,9998).

4.7 Estudo de Estabilidade Acelerada A estabilidade física e química das formulações foi avaliada em estudo de estabilidade acelerado. As formulações foram acondicionadas em bisnaga de alumínio com revestimento de plástico, identificadas e mantidas sob refrigeração (5 ± 2 ºC) e em estufa a 40 ± 1 ºC. As amostras foram analisadas nos tempos zero, 30, 90 e 180 dias quanto ao aspecto físico, valor de pH, resistência mecânica, viscosidade média, distribuição de tamanho, potencial zeta e teor de PMD por CLAE.

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4.8 Estudo de liberação in vitro 4.8.1 Seleção do meio aceptor

Para seleção do meio aceptor, a solubilidade do extrato foi determinada em diferentes meios compostos por tampão acetato e tensoativos, conforme apresentado no Quadro 6.

Quadro 6 – Sistemas solventes empregados na seleção do meio de dissolução para o extrato mole de A. cathartica.

Amostra Meios

Tween 1% LSS 0,5% Tampão acetato pH 4,5 A X X

B X X C X

LSS – lauril sulfato de sódio

Em balão volumétrico de 10 mL foram adicionados extrato mole (1,5

mg/mL) e o meio de dissolução apresentado no quadro 6. As soluções foram agitadas por 48 h a 50 rpm, a 25 ± 2 °C e protegidos da luz. A análise foi realizada em duplicata. Após este período, as amostras foram filtradas e diluídas na proporção 1:10 em metanol e quantificadas por CLAE, em duplicata, usando método descrito no item 4.3.3.

4.8.2 Análise do perfil de dissolução

O estudo de dissolução in vitro foi realizado em aparato de célula de Franz (volume de 6,63 mL), utilizando membrana de acetato de celulose (tamanho de poro 12.000 Da). Cortes de 2,5 cm de diâmetro da membrana ficaram por 12 horas submersos em água destilada, em béquer de vidro, coberto com plástico filme e armazenadas em geladeiras por 12 h, para hidratar. Foram utilizadas 0,2 g de formulação sem diluições e as análises foram realizadas em quadruplicata para as formulações com extrato e em duplicata para as amostras sem extrato.

Também foram analisados os perfis de difusão através da membrana da solução de extrato mole (1 mg/mL) e de PMD (200 µg/mL), dissolvidos em meio tampão selecionado a partir do método descrito no item 4.8.1. As

69

amostras foram analisadas em triplicata, com aplicação de 100 µL sobre a membrana de acetato de celulose.

O ensaio foi realizado na temperatura de 32 °C. O tempo de análise foi de 24 h, com coletas em 30 min, 1, 3, 6, 12 e 24 horas. Foram retiradas alíquotas de aproximadamente 1000 µL, armazenadas em frasco tipo ependorff para posteriormente serem filtradas e quantificadas por CLAE, em duplicata. Durante a análise por CLAE, os marcadores PMD, RUT e o extrato mole também foram analisados em triplicata no início da análise e durante a análise em intervalos pré-determinados para controle.

Os resultados foram expressos em proporção dos marcadores PMD, RUT e flavonoides totais (FT) expressos em rutina, dissolvidos por tempo, assim como a quantidade destes marcadores permeadas por área de contato na célula de difusão (µg/cm2).

A cinética dos perfis de liberação foi analisada pelo modelo de ordem zero e da equação geral de liberação (equação 1), em que Q é a quantidade dissolvida/permeada por tempo, K é a constante de difusão, t é o tempo em minutos e n é o índice de liberação.

� = �. �� (1) 4.9 Estudo de permeação e retenção cutânea in vitro O estudo de permeação in vitro foi realizado em aparato de célula de Franz, onde a membrana para análise foi pele de orelha de suíno. As orelhas foram adquiridas junto ao Frigorífico Irmãos Glau (Blumenau – SC). As orelhas utilizadas não passaram por processo de escalda.

Após a aquisição, as orelhas foram lavadas em água corrente uma a uma, secas com papel toalha descartável, embrulhadas em papel alumínio e armazenadas em congelador por até 30 dias.

Para o uso das orelhas, após descongelamento, foram retirados os pelos da face interna da orelha isenta de lesões, com auxílio de lâmina de barbear, com cuidado para não lesionar a pele. Foram utilizados cortes da pele de 2,5 cm de diâmetro e espessura média da 0,3 cm. Para hidratação foram submersos em água destilada, em béquer de vidro, coberto com filme plástico e armazenadas em geladeira por 12 h.

Foram utilizados aproximadamente 0,2 g das amostras, analisadas em triplicata e quantificadas em duplicada por CLAE.

70

O ensaio foi realizado na temperatura de 32 °C. O tempo de análise foi de 24 h, com coletas em 30 min, 1, 3, 6, 12 e 24 horas Foram retiradas alíquotas de aproximadamente 1000 µL, armazenadas em frasco tipo ependorff para posteriormente serem filtradas e quantificadas por CLAE em duplicata. Também foi realizada a quantificação de amostra retida na pele após as 24 horas de análise, usando a técnica de tape stripping. A técnica se caracteriza como não invasiva, na qual o estrato córneo é removido sequencialmente após aplicações repetidas de fita adesiva, para posterior análise por CLAE. Para tanto, foi utilizado um peso padrão de 200 g. Antes de retirar a pele das células de Franz, colocou-se um pedaço de fita adesiva de aproximados 4,7 cm da largura por 10 cm de comprimento sobre os cortes de orelha, e sobre a fita o peso padrão de 200 g por 30 s. Após a fita foi retirada. O mesmo procedimento foi repetido por mais quatro vezes. Posteriormente, as fitas adesivas foram recortadas em pedaços pequenos e submetidas à extração com aproximadamente 5 mL de metanol sob agitação em banho de ultrassom por 1 h. Após este período, a solução foi transferida para balão volumétrico de 10 mL e o volume completado com metanol. A solução foi filtrada e quantificada por CLAE, em duplicata.

Para quantificação dos marcadores retidos na pele, após a técnica de tape stripping, a pele foi recortada em pequenos pedaços e submetida a extração com aproximadamente 5 mL de metanol, em banho de ultrassom por 1 hora. Após este período, transferiu-se o líquido obtido para balão de 10 mL, e lavando a amostra com metanol, completou-se o volume com metanol. Então, preparou-se viais de cada amostra, os quais foram quantificados por CLAE, em duplicata. Durante a análise por CLAE os marcadores plumierídeo, rutina e o extrato mole foram analisados em triplicata no início da análise e durante a análise por mais 3 vezes.

4.10 Avaliação da segurança in vitro dos sistemas contendo extrato das flores de A. cathartica 4.10.1 Método HET-CAM

O ensaio HET-CAM foi adaptado de McKenzie et al. (2015) e Chiari et al. (2012). Foram utilizados como substâncias de referência para demonstrar proficiência da técnica o cloreto de sódio 0,9%, p/v como controle negativo

71

e hidróxido de sódio 0,1 N como controle positivo, em água purificada. A nanoemulsão foi testada diretamente, enquanto os sistemas de cristal líquido e emulgel foram preparados por meio de diluições na proporção de aproximadamente 1:10 em NaCL 0,9%. Foi utilizado aproximadamente 50 µL de cada amostra na análise.

Os ovos de galinha férteis foram adquiridos e armazenados na horizontal em estufa de temperatura controlada próximo de 37 °C e umidade monitorada (Figura 9-a). Por 10 dias foram realizadas rotações de 180° até 3 vezes ao dia, proporcionando relação com o período de desenvolvimento dos ovos galados em seu habitat (CHIARI et al., 2012; MCKENZIE et al., 2015). Figura 9 - Ilustração da estufa com os ovos (a) e ovo após 10 dias (b)

(a) Estufa com bandeja de ovos férteis

(b) ovo fértil viável após 10°dia

Fonte: o autor.

Após este período, os ovos viáveis foram selecionados e utilizados. Para

determinar a viabilidade dos ovos, fez-se uso de iluminação apropriada em cabine escura (Figura 9-b), sendo possível constatar a presença da membrana e do embrião desenvolvido, bem como da câmara de ar que foi identificada com caneta na superfície da casca, facilitando a realização da quebra da casca desta área para aplicação das amostras.

72

A quebra dos ovos viáveis ocorreu pela área demarcada da câmara de ar com o auxílio de ferramenta de corte doméstico. De forma delicada fez-se a retirada da membrana protetora do embrião, expondo o embrião para a aplicação das amostras. Para controle e avaliação do método foram feitas fotos em aparelho fotográfico Samsumg nos tempos zero, 1 min e 3 min. Após a análise, os ovos foram descartados no grupo de resíduos apropriado. 4.10.2 Método de hemólise

O ensaio de hemólise foi determinado através da atividade lítica membranar (NOGUEIRA et al., 2012). Para este método foi utilizado sangue humano. Foi realizada a coleta do sangue, armazenada em frascos de 4 mL com EDTA. Então foram colocados em centrífuga por 10 min a fim de promover separação do plasma sanguíneo. Na sequência foi retirada a borda contida de plasma, adicionado o mesmo volume de PBS, e repetido a centrifugação até total limpidez do plasma sobrenadante. Este sangue lavado foi armazenado por no máximo 24 horas em geladeira.

A suspensão de hemoglobina humana (25 µL) foi exposta à diferentes concentrações de uma solução inicial a 2 mg/mL de extrato mole de A.

cathartica e de soluções com os sistemas emulsionados contendo EM e dissolvidos em PBS. As soluções foram analisadas nas concentrações de 10, 50, 100, 200, 500 e 1000 µg/mL, conforme apresentado no Quadro 7. Como controle positivo foi utilizado a ressuspensão de eritrócitos e água destilada, e como controle negativo a ressuspensão de eritrócitos em tampão PBS.

As amostras foram incubadas à temperatura ambiente sob agitação constante no homogeneizador de sangue durante 10 min, e depois foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 5 min. O sobrenadante foi transferido para placas de 90 poços e a absorbância da hemoglobina liberada quantificada em leitor de placa em 540 nm.

Considerando que a hemoglobina e seus derivados apresentam espectros de absorção característicos e que a oxiemoglobina é um dos derivados observados na hemólise. A análise foi realizada em 2 comprimentos de onda, pois a oxiemoglobina apresenta duas faixas (β e α) em 540 e 576 nm (ALVES et al., 2003).

A taxa de hemólise foi calculada por comparação com a absorbância do controle positivo. As curvas dose-resposta foram traçadas a partir dos

73

resultados da hemólise e as concentrações que induziram 50% de hemólise (HC50) foram calculadas.

Quadro 7 - Concentrações das amostras para ensaio de hemólise.

Concentração (µL/mL)

Soluções iniciais

(µL) PBS (µL)

Eritrócitos (µL)

Água purificada

(µL) 10 5 970 25 -

50 25 950 25 -

100 50 925 25 -

200 100 875 25 -

500 250 725 25 -

1000 500 475 25 -

*C- - - 25 975

*C+ - 975 25 - *Sendo C- controle negativo e C+ controle positivo

4.11 Avaliação da eficácia in vitro dos sistemas contendo extrato das flores de A. cathartica 4.11.1 Fotoproteção por espectrofotometria

A determinação do FPS in vitro de filtros químicos pode ser realizada por meio da leitura espectrofotométrica de suas soluções diluídas e posterior tratamento matemático por meio da determinação da transmitância ou da absorbância (VELASCO et al., 2011). Foi selecionado o metanol para dissolver o EM, e as soluções foram preparadas nas concentrações de 0,25, 0,50, 0,75, 1,0 e 1,25 mg/mL e foram analisadas em duplicata em espectrofotômetro. A análise foi relizada por varredura no intervalo de 190 a 1100 nm. A região de interesse foi de 290 a 320 nm. Para o cálculo do FPS foi utilizada a equação 2 (MANSUR, 1986 apud VELASCO et al., 2011) e os coeficientes apresentados no Quadro 8. �� = �. ∑ . ��. 2.��. ��

�� (2)

74

Onde: FC = fator de correção; EE (λ) = efeito eritematogênico da radiação de comprimento de onda (λ); Ι (λ) = intensidade de luz solar no comprimento de onda (λ); Abs (λ) = leitura espectrofotométrica da absorbância da formulação em solução no comprimento de onda (λ).

Quadro 8 - Ponderação empregada no cálculo do fator de proteção solar por espectrofotometria com um fator de correção igual a dez.

λ (nm) *EE (λ) x **I (λ) valores relativos

290 0,0150 295 0,0817 300 0,2874 305 0,3278 310 0,1864 315 0,0839 320 0,0180

*EE (λ) = efeito eritematogênico da radiação de comprimento de onda (λ); **Ι (λ) = intensidade de luz solar no comprimento de onda (λ); Fonte: VELASCO et al. (2011)

4.11.2 Determinação da atividade antioxidante in vitro pela captura do

radical livre DPPH

O método DPPH baseia-se na captura do radical DPPH (2,2-difenil-1- picril-hidrazil) por antioxidantes, produzindo um decréscimo da absorbância em 515 nm. O radical livre pode ser obtido diretamente por dissolução do reagente em meio orgânico (RUFINO et al., 2007; SALACHNA; GRZESZCZUK; SOBÓL, 2017). A avaliação quantitativa da atividade antioxidante foi realizada seguindo metodologia de Rufino et al. (2007). A solução do radical DPPH foi preparada com a dissolução de cerca de 1,0 mg de DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) em 25 mL de etanol. A solução foi armazenada em frasco âmbar fechado e mantida sob refrigeração. Para a determinação da atividade antioxidante por DPPH do extrato, preparou-se uma solução a 1 mg/mL. Cerca de 25 mg de EM foi pesado em balão de 25 mL, foi adicionado cerca de 12,5 mL de metanol e submetido a agitação em banho de ultrassom por 30 minutos ou até completa dissolução. Então foi completado o volume com metanol.

75

Para a análise da atividade antioxidante dos sistemas emulsionados com e sem EM, foi pesado aproximadamente cerca de 2,5 g de formulação em balão de 25 mL, foi acrescentado 12,5 mL de metanol e mantido em banho de ultrassom por 30 minutos ou até completa dissolução. Então foi completado o volume com acetato de etila. Para evitar a influência da turbidez da amostra na quantificação, as dispersões foram centrifugadas a 5000 rpm por 5 min e o sobrenadante foi filtrado em membrana de 0,45 µm. Para os sistemas nanoemulsionados NE 1 e NE2 não foi necessário realizar a centrifugação e as amostras não foram filtradas.

Uma alíquota de 0,3 mL das soluções preparadas foi adicionada a 2,7 mL de solução estoque de DPPH, em tubo de ensaio. Após exatos 30 minutos, foi realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro em 515 nm. As análises foram realizadas em triplicata. A solução branca foi obtida a partir de 0,3 mL da solução de EM somadas a 2,7 mL de etanol.

A atividade antioxidante (AA) foi determinada pela equação 3, em que Abscontrole é a absorbância inicial da solução etanólica de DPPH e Absamostra é a absorbância da mistura DPPH com a amostra.

%�� = �� !"#$!%&'��()!�#$('��$(" !�� !"#$!%&

* . 100 (3)

Partindo dos resultados obtidos foi determinado a porcentagem de atividade antioxidante ou sequestradora de radicais livres e ou porcentagem de radical DPPH remanescente no meio reacional, sendo que a quantidade de antioxidante necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50% do efeito antioxidante máximo estimado de 100% é denominada concentração eficiente (CE50). Para CE50 foram preparadas 5 diferentes concentrações das soluções dos sistemas emulsionados: 10, 20, 50, 70 e 100 mg/mL. E, para o extrato mole, foram utilizadas as concentrações de 0,1, 0,2, 0,5, 0,7 e 1 mg/mL. As análises foram realizadas em duplicata.

77

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Obtenção e caracterização da solução extrativa e do extrato mole

As etapas de coleta e processamento das flores de A. cathartica foram realizadas de acordo com métodos padronizados por Góes (2011), assim como a preparação da solução extrativa e do extrato mole.

A partir de 200 g de droga vegetal foi obtida a solução extrativa que, após concentração, rendeu 70,32 g de extrato mole com resíduo seco de 81,05 ± 0,17%. Considerando o resíduo seco de extrato, a relação entre droga vegetal:extrato seco (extrato mole menos o teor de umidade) foi de 3,5:1, ou seja, 3,5 g de droga vegetal para obtenção de 1 g de extrato mole da planta.

O extrato mole apresentou valor de pH de 4,02, conforme apresentado na Tabela 1. O extrato mole apresentou odor característico, coloração marrom esverdeada e consistência pastosa.

Tabela 1 - Resultados da caracterização do extrato mole de A.

cathartica. Parâmetros Extrato Mole

pH 4,02 ± 0,036

RS % 81,05 ± 0,17

PMD (mg/g) 206,93 ± 1,94

Rutina (mg/g) 4,63 ±0,08

FT (mg/g) 8,36 ± 0,12

Nota: RS – resíduo seco; PMD- plumierídeo; FT – flavonoides totais Resultados expressos em média ± desvio padrão. O extrato mole foi analisado quali e quantitativamente por CLAE. Os

perfis cromatográficos dos marcadores PMD e rutina, com tempo de retenção de 9,57 e 11,54 min, respectivamente, são apresentados na figura 10. O PMD apresenta-se como componente majoritário no extrato mole com 211,54 mg/g, ou seja, 21,15%. Os flavonoides estão em menor proporção no extrato. A concentração da rutina é de 4,63 mg/g (0,59%) e flavonoides totais de 8,36 mg/g (0,84%) (Tabela 1).

78

Figura 10 - Perfil cromatográfico em CLAE do extrato mole (EM) de A. cathartica em 230 nm, 4,63 mg/g da rutina (RUT) e em 355 nm, 211,54 mg/g do plumierídeo (PMD).

EM (230 nm)

EM (355nm)

PMD (230 nm)

Rutina (355 nm)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min-100

0

100

200

300

400

500

600mAU

230nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

0

5

10

15

mAU355nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

0

100

200

mAU230nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

0

25

50

75

100

125

mAU355nm,4nm (1.00)

200 250 300 350 400 450 500 550

0

100

200

300

400

PMD

F1

F2

F3

RUT

200 250 300 350 400 450 500

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25

200 250 300 350 400 450 500

-20

-10

0

10

20

30

40

50

200 250 300 350 400 450 500

-10

0

10

20

30

40

200 250 300 350 400 450 500 550-20

-10

0

10

20

30

40

RUT

PMD

79

Os perfis cromatográficos apresentados estão de acordo com os apresentados por Góes (2011) e Fischer Müller et al. (2015), assim como o teor dos marcadores químicos do extrato. Os resultados mostram que a obtenção do extrato mole é reprodutível. 5.2 Preparação e caracterização dos produtos dermocosméticos contendo extrato das flores de A. cathartica

O extrato mole de A. cathartica foi incorporado na concentração de 1% em três diferentes bases dermocosméticas: nanoemulsão (NE), microemulsão com mesofases líquido cristalinas (ME-MLC) e emulgel (SEPI).

Os sistemas nanoemulsionados (NE 1 e 2 e ME-MLC 1 e 2) foram formulados e obtidos a partir do estudo realizado por Fischer-Müller (2013). No estudo anterior foram desenvolvidos sistemas nanoemulsionados contendo o extrato das flores de A. cathartica e, dos sistemas com diferentes nanoestruturação foram selecionados para a continuidade dos estudos no presente trabalho duas formulações: a nanoemulsão, por sua característica fluida e de aumento de permeação cutânea e a microemulsão com mesofases líquido-cristalinas, por apresentar maior grau de organização, maior consistência e maior capacidade de retenção na pele.

Essas formulações foram selecionadas com o intuito de realizar estudos de estabilidade acelerada, avaliar ação antioxidante in vitro, a segurança em diferentes modelos de análise e o potencial fotoprotetor, confirmando sua promissora atividade antioxidante.

Buscando comparar os sistemas nanoemulsionados com uma formulação emulsiva com maior tamanho de fase interna, o extrato também foi incorporado em uma base do tipo emulgel usando a base autoemulsionante Sepigel® 305. Esta base foi escolhida por sua ampla utilização no mercado, praticidade de obtenção e aspectos sensoriais.

As formulações obtidas foram caracterizadas quanto aos aspectos físico, físico-químicos e químicos.

5.2.1 Aspectos físicos e de valor de pH

Os sistemas obtidos foram caracterizados quanto às suas características organolépticas de cor, turbidez e fluidez. As análises foram realizadas por percepção direta e visual e estão apresentadas na Figura 11.

80

Figura 11 Análise direta e visual dos sistemas nanoemulsionados e do emulgel com (1) e sem (2) extrato das flores de A. cathartica.

NE 1 NE 2

ME-MLC 1 ME-MLC 2

SEPI 1 SEPI 2

Nota NE 1 – nanoemulsão com extrato; NE 2 – nanoemulsão sem extrato; ME-MLC 1 – microemulsão com mesofases líquido cristalinas com extrato; ME-MLC 2 – microemulsão com mesofases líquido cristalinas sem extrato; SEPI 1 – emulgel com extrato; SEPI 2 - emulgel sem extrato. A nanoemulsão NE 1 apresentou coloração esverdeada leitoso claro

fluorescente clara influenciada pela coloração do próprio EM e do sistema nanométrico; além de características fluídas e translúcida. O sistema NE 2 apresentou coloração fluorescente brilhante e aspecto fluído e translúcido característico da formulação. Os aspectos físicos observados são característicos de nanoemulsão. São sistemas isotrópicos, transparente ou

81

translúcidos e fluidos (CHOUDHURY et al., 2017; SINGH et al., 2017). As NE com e sem extrato foram semelhantes fisicamente às formulações obtidas em nosso estudo anterior, em que tais sistemas foram obtidos com concentração de fase oleosa entre 5 e 10% e Sistema tensoativo entre 10 e 20% (FISCHER MULLER, 2013). O produto do tipo microemulsão com mesofase líquido cristalina (ME-MLC 1) apresentou características de gel, com coloração marrom esverdeada transparente, resultante da coloração do extrato e do aspecto transparente característico das microemulsões. O ME-MLC 2 apresentou também características de gel, porém de incolor a esbranquiçado. Os sistemas microemulsionados com mesofases líquido cristalinas (MLC) foram obtidos com o aumento da proporção do sistema tensoativo de 15 para 40%. A formação das MLC é resultado da auto-organização molecular dos tensoativos em meio aquoso atingindo máxima estabilidade termodinâmica. Estes sistemas se apresentam fisicamente como géis estruturados, envolvendo estruturas do tipo cubossomas formado por camadas paralelas de tensoativos ou hexossomas, formados por estruturas hexagonais de cilindros longos bidimensionais (FORMARIZ et al., 2005; KADHUM et al., 2017). O emulgel (SEPI 1) foi obtido usando 5% de óleo, adicionado de 3% de agente de consistência (álcool cetoestearílico) e 7,5% de base autoemulsionante constituída por cera (Laurethe-7®), agente gelificante (poliacrilamida) e parafina. A incorporação de agente gelificante em sistema emulsionado permite explorar a capacidade de incorporação cutânea dos sistemas emulsionados e promoção da permeação dos óleos, como o miristato de isopropila, juntamente com a capacidade estruturante e de retenção na pele promovida pelos polímeros gelificantes. Por isto os emulgéis, bem como, o nanoemulgéis têm sido considerados promissores veículos para administração tópica para produtos farmacêuticos e cosméticos (CHOUDHURY et al., 2017; DHAWAN; AGGARWAL; HARIKUMAR, 2014). O emulgel contendo extrato (SEPI 1) apresentou aspecto de creme, com coloração amarelo esverdeado com brilho, enquanto o produto sem extrato (SEPI 2) apresentou aspecto de creme branco e com brilho. As formulações do tipo NE e emulgel apresentaram coloração semelhantes, diferenciando da ME, resultado este relacionado com o grau de divisão e organização dos diferentes sistemas. Após 24 h do preparo, os sistemas foram analisados quanto ao valor de

82

pH, à alteração dos aspectos físicos (cor, separação de fases, cremagem e fluidez) quando submetidos ao teste de resistência mecânica por centrifugação. Os resultados são apresentados na Tabela 2. Tabela 2 Resultados da análise de pH e resistência mecânica à centrifugação dos produtos dermocosméticos com e sem extrato das flores de A. cathartica

Produtos pH1

Resistência mecânica2

Separação de

fases Cor

Cremagem e

fluidez

NE 1 6,18 ±0,07a conforme conforme conforme NE 2 6,88 ±0,04b conforme conforme conforme ME-MLC 1 6,29 ±0,01a conforme conforme conforme ME-MLC 2 6,88 ±0,02b conforme conforme conforme SEPI 1 6,25 ±0,04a conforme conforme conforme SEPI 2 6,56 ±0,02c não conforme conforme conforme

Nota NE 1 – nanoemulsão com extrato; NE 2 – nanoemulsão sem extrato; ME-MLC 1 – microemulsão com mesofases líquido cristalinas com extrato; ME-MLC 2 – microemulsão com mesofases líquido cristalinas sem extrato; SEPI 1 – emulgel com extrato; SEPI 2 - emulgel sem extrato. 1Letras iguais significam valores estatisticamente semelhantes usando nível de significância de 95% e análise ANOVA seguida de teste de Tukey. 2As amostras foram consideradas em conformidade quando não houve separação de fases, alteração de coloração e cremeação e fluidez. Após a centrifugação, os sistemas nanoemulsionados NE 1, NE 2, ME-MLC1 e ME-MLC2 não apresentaram separação de fases e alteração de coloração, enquanto as bases SEPI 1 e SEPI 2 apresentaram separação de um fino filme oleoso incolor característico de óleo. Os produtos não apresentaram alteração de coloração. Analisando os resultados de pH apresentado na tabela 2, as formulações apresentaram valor de pH entre 6,18 e 6,88. A incorporação de 1% do extrato nas diferentes bases dermatológicas resultou em uma leve redução do valor de pH, sem significância estatística (p > 0,05). O extrato mole apresenta um pH de 4,02, o que pode ter resultado na redução observada. Das bases analisadas, o emulgel sofreu menor alteração do valor de pH (0,31).

83

5.2.2 Análise de tamanho e potencial zeta

A distribuição de tamanho, o tamanho médio e índice de polidispersidade (PDI) da fase interna dos sistemas foram determinados por espectroscopia de correlação de fótons. Os resultados estão apresentados na Tabela 3. Os sistemas nanoemulsionados, nanoemulsão e microemulsão, apresentaram tamanho de fase interna entre 17 e 34 nm. A incorporação do extrato praticamente não alterou o tamanho médio de fase interna dos sistemas. Os valores de tamanho médio de fase interna destes sistemas não diferem estatisticamente. Embora fisicamente os dois sistemas apresentam diferenças importantes de fluidez e consistência, o tamanho da fase interna foi menor que 50 nm. Alguns autores têm descrito que a classificação dos sistemas nanoemulsionados simplesmente pela faixa de tamanho não é adequado, pois como observado no presente estudo, sistemas com tamanho de fase interna semelhante, apresentam propriedades físico-químicas diferentes (CAMARGO, 2008; MUSAZZI et al., 2017). A organização estrutural do sistema e suas propriedades cinéticas e termodinâmicas são mais pertinentes para classificá-los como nanoemulsão ou microemulsão. Tabela 3 - Resultados da análise do potencial zeta, polidispersão (PDI) e tamanho médio (nm) dos produtos dermocosméticos com e sem extrato das flores de A.

cathartica

Sistemas Tamanho

médio (nm)* PDI*

Potencial Zeta (mV)*

NE 1 34,05 ±0,221a 0,128 ±0,009a -18,3± 0,808a

NE 2 33,05± 0,45a 0,271± 0,013b -9,3± 0,708b

ME-MLC 1 17,29± 0,083a 0,277± 0,023 b -7,5± 2,16b

ME-MLC 2 23,55 ± 0,171a 0,393± 0,005c -11,8± 2,24b

SEPI 1 435,2 ± 21,62b 0,501 ± 0,028d -68,4± 0,824c

SEPI 2 557,8 ± 85,22c 0,590 ± 0,048e -64,9± 2,55c

Nota NE 1 – nanoemulsão com extrato; NE 2 – nanoemulsão sem extrato; ME-MLC 1 – microemulsão com mesofases líquido cristalinas com extrato; ME-MLC 2 – microemulsão com mesofases líquido cristalinas sem extrato; SEPI 1 – emulgel com extrato; SEPI 2 - emulgel sem extrato. *Letras iguais significam valores estatisticamente semelhantes usando nível de significância de 95% e análise ANOVA seguida de teste de Tukey.

Os sistemas emulgel apresentaram tamanho de fase interna superior a 400 nm, sendo por esta característica classificados como nanoemulgéis. A

84

incorporação do extrato no sistema reduziu de forma significativa o tamanho de fase interna. Este comportamento foi observado nos sistemas ME-MLC, assim como tem sido descrito para sistemas nanoemulsionados contendo derivados vegetais (DAL MAS et al., 2016).

O índice de polidispersão também foi avaliado e por meio desta análise é possível compreender o estado de dispersão das gotículas presentes na amostra. Sendo que quanto mais próximas do número 1 for o resultado, mais heterogêneo será o tamanho da fase interna dos sistemas, podendo ser um fator determinante na estabilidade física dos sistemas. A nanoemulsão com extrato (NE1) apresentou PDI de 0,128, valor estatisticamente diferente da polidispersidade da NE sem extrato (0,271), mostrando que a incorporação do extrato resulta em sistemas mais monodispersos, com consequente aumento da estabilidade física. Nanoemulsões com PDI < 0,2 são consideradas monodispersas (SINGH et al., 2017). O comportamento monodisperso de distribuição de tamanho pode ser visualizado na Figura 12.

Os sistemas ME-MLC apresentaram valores de PDI superior ao das NE, porém também foi observada uma menor polidispersão no sistema contendo extrato (0,277 contra 0,393). Este mesmo comportamento também foi observado nos emulgéis. Os emulgéis por serem sistemas menos organizados estruturalmente, assim como para o tamanho médio, também apresentaram maior intervalo de distribuição de tamanho de fase interna, conforme apresentado na Figura 12, não sendo considerados sistemas monodispersos.

Os resultados mostram que a incorporação do extrato mole das flores de A. cathartica pode ter influenciado na distribuição de tamanho da fase interna dos sistemas. Os perfis de distribuição de tamanho da fase interna apresentados na Figura 12, mostram que as formulações nanoemulsionadas são monodispersas, enquanto o emulgel apresenta uma maior distribuição de tamanho com o aparecimento de uma segunda população de tamanho, principalmente na formulação sem extrato. O potencial elétrico de superfície ou potencial zeta foi determinado em analisador de carga de superfície a partir da velocidade de migração das partículas em um meio eletroforético com auxílio de difração de luz laser (Zetasizer). Os sistemas nanoemulsionados (NE e ME-MLC) apresentaram potencial zeta menor que 20 mV, sendo que os valores encontrados para os sistemas ME-MLC foram menores do que para as NE. Como observado em estudos anteriores de desenvolvimento de nanoemulsões contendo tensoativo não iônico polietoxilado (DAL MAS et al., 2016), estes sistemas tendem a

85

ter baixo valor de potencial zeta e, as ME-MLC provavelmente por possuírem maior proporção deste tensoativo apresentaram menor valor de potencial zeta. Não foi observada influência do extrato na carga da interface dos sistemas, pois não houve uma tendência à redução ou aumento do valor do potencial zeta, exceto para a NE, que apresentou maior potencial quando contendo extrato. Figura 12 - Perfil de distribuição de tamanho da fase interna dos produtos dermocosméticos com e sem extrato das flores de A. cathartica.

NE 1 NE 2

ME-MLC 1 ME-MLC 2

SEPI 1 SEPI 2 Nota NE 1 – nanoemulsão com extrato; NE 2 – nanoemulsão sem extrato; ME-MLC 1 – microemulsão com mesofases líquido cristalinas com extrato; ME-MLC 2 – microemulsão com mesofases líquido cristalinas sem extrato; SEPI 1 – emulgel com extrato; SEPI 2 - emulgel sem extrato. As formulações emulgel apresentaram potencial zeta de -68 e -64 mV para as amostras com e sem extrato, respectivamente, valores estes muito superiores aos observados para os sistemas nanoemulsionados. A base

0

5

10

15

20

25

0.1 1 10 100 1000

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ber

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cent

)

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30

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ber

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Size (d.nm)

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Sepigel™ usada no produto é composta por Laurethe-7, parafina e poliacrilamida (Polyacrylamide (and) C13-14 Isoparaffin (and) Laureth-7). A composição química desta base influenciou o potencial elétrico na interface da emulsão obtida. 5.2.3 Análise reológica e de textura

Os produtos foram caracterizados quanto ao comportamento reológico. Esta análise é importante na avaliação de produtos semissólidos, pois analisa indiretamente propriedades sensoriais, de espalhabilidade, além do comportamento de fluxo, podendo fornecer importantes informações a respeito das mudanças fundamentais na estrutura do fluido durante um determinado processo, como emulsificação, homogeneização e acondicionamento (DIAZ; VENDRUSCOLO; VENDRUSCOLO, 2004). Os perfis reológicos das formulações na forma de curvas de tensão de cisalhamento e viscosidade são apresentados nas Figuras 13 a 15 e os valores de viscosidade média, tixotropia e índice de comportamento de fluxo (n) são apresentados na Tabela 4. Tabela 4 - Análise da viscosidade média, tixotropia e índice de comportamento de fluxo (n) dos produtos dermocosméticos com e sem extrato das flores de A. cathartica.

Amostra Viscosidade

(mPa.s) Tixotropia

(mPa) n

NE1 2,93±0,688 5,79.10¹¹ 0,51

NE2 4,75±1,384 1,57.1012 0,36

ME-MLC1 44746,21 ± 9103,52 -1,39.1015 0,02

ME-MLC2 60796,21 ± 16409,03 8,85.1015 0,34

SEPI 1 4397,59 ± 0,79 1,73.1014 0,26

SEPI 2 3571,65 ± 1,48 1,52.1014 0,27

Nota NE 1 – nanoemulsão com extrato; NE 2 – nanoemulsão sem extrato; ME-MLC 1 – microemulsão com mesofases líquido cristalinas com extrato; ME-MLC 2 – microemulsão com mesofases líquido cristalinas sem extrato; SEPI 1 – emulgel com extrato; SEPI 2 - emulgel sem extrato. As NE possuem viscosidade inferior a 5 mPa.s, demostrando a fluidez do sistema, enquanto as ME com mesofase líquido cristalina apresentaram viscosidade maior que 40000 mPa.s, confirmando o aspecto gelificado deste

87

sistema. A incorporação do extrato reduziu a viscosidade dos sistemas, sendo esta diferença significativa nas ME-MLC. O emulgel apresentou valor de viscosidade entre 3000 e 5000 mPa.s, valores característicos de emulsões semissólidas. Figura 13. Perfil reológico das formulações de nanoemulsão com (NE 1) e sem (NE 2) extrato de A. cathartica 1%. Resultados apresentados em tensão de cisalhamento (A) e viscosidade (B).

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 20 40 60 80 100

τPa

ϔ (1/s

NE 2

NE 1

0

100

200

300

400

500

600

700

0 20 40 60 80 100

ηPa.s

ϔ (1/s

NE 2

NE 1

A

B

88

Figura 14. Perfil reológico das formulações de microemulsão com mesofases líquido cristalinas com (ME-MLC 1) e sem (ME-MLC 2) extrato de A. cathartica 1%. Resultados apresentados em tensão de cisalhamento (A) e viscosidade (B).

0

500

1000

1500

2000

2500

0 20 40 60 80 100

τPa

ϔ (1/s

ME-MLC 2

ME-MLC 1

0

200

400

600

800

1000

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1400

1600

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2000

0 20 40 60 80 100

ηPa.s

ϔ (1/s

ME-MLC 2

ME-MLC 1

A

B

89

Figura 15. Perfil reológico das formulações emulgel com (SEPI 1) e sem (SEPI 2) extrato de A. cathartica 1%. Resultados apresentados em tensão de cisalhamento (A) e viscosidade (B).

Independentemente de muitas vantagens das nanoemulsões, a aplicação tópica é limitada por sua baixa viscosidade e espalhabilidade. A obtenção de nanoemulgel a partir das NE tem sido uma estratégia empregada comumente

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 20 40 60 80 100

τPa

ϔ (1/s

SEPI 2

SEPI 1

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40

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ηPa.s

ϔ (1/s

SEPI 2

SEPI 1

A

B

90

na administração tópica destes sistemas (CHOUDHURY et al., 2017; SINGH et al., 2017). Nos perfis de comportamento reológico das amostras foi possível observar a maior resistência ao fluxo das formulações sem extrato (amostras 2) do que as contendo 1% de extrato das flores de A. cathartica (amostras 1). Nos perfis de viscosidade, houve uma redução da viscosidade com o aumento da taxa de cisalhamento, sendo a resistência recuperada com a redução da taxa de cisalhamento. O comportamento observado é característico de sistemas não newtonianos pseudoplásitcos. O comportamento de fluxo foi confirmado pela análise cinética dos perfis e a determinação do índice de comportamento de fluxo (n). As formulações apresentaram valor de n menor do que 1, confirmando a pseudoplasticidade dos sistemas. No estudo reológico dos sistemas, também foi avaliada a alteração do fluxo do material frente ao tempo quanto submetido a alterações do gradiente de cisalhamento, ou seja, se estes apresentavam comportamento tixotrópico. Conforme observado nos perfis reológicos e nos valores de tixotropia apresentados na Tabela 4, todas as formulações possuem comportamento tixotrópico sendo o valor da área de esterese (tixotropia) dependente da viscosidade do sistema. Assim como observado para os valores de viscosidade média, a incorporação do extrato reduziu o valor de tixotropia do sistema. Buscando melhor caracterizar as propriedades sensoriais dos produtos contendo o extrato de A. cathartica, as propriedades de textura foram caracterizadas em analisador de textura usando modo TPA e expressas quantitativamente em firmeza, adesividade, espalhabilidade e coesividade (Tabela 5). A firmeza ou dureza do sistema é determinada como a força necessária para deformação do sistema por meio da penetração da sonda de 10 mm de diâmetro. Este parâmetro é importante pois está relacionado com a força necessária para remover a amostra da embalagem, assim como a espalhabilidade na pele (MAZIA et al., 2016).

Em concordância com os resultados de viscosidade, a NE apresentou a menor firmeza, seguida do emulgel e da ME-MLC. Assim como observado nos outros ensaios de caracterização de consistência, a incorporação do extrato reduziu a firmeza das formulações, sendo a redução proporcionalmente maior nas ME-MLC, seguida do emulgel e da NE, sendo

91

de cerca de 90%, 30% e 10%, respectivamente. Os resultados indicam que a presença do extrato na ME-MLC reduz a organização líquido cristalina presente nestas formulações, mostrando que cristalinidade proporcionada pelas moléculas do tensoativo é reduzida. A estrutura física das NE não sofre esta mesma influência do extrato. Tabela 5 Resultados da análise das propriedades de textura de preparações tópicas contendo extrato das flores de A. cathartica, usando modo TPA em analisador de textura (os resultados são expressos em média ± desvio padrão).

Amostra Firmeza

(g) Adesividade (g.s)

Fator de Espalhabilidade

Coesividade

NE 1 140,63 ±

13,89 - 0,454 ± 0,04 0,826 ± 0,01

NE 2 154,87 ±

2,67 - 0,532 ± 0,09 0,701 ± 0,19

ME-MLC1

5407,21 ± 693,24

-22311,08 ± 3391,56 0,598 ± 0,018 0,861 ± 0,06

ME-MLC2

58503,35 ±

4259,63 -296992,63 ± 4653,82 0,072 ± 0,02 0,179 ± 0,04

SEPI 1 1600,80 ± 17,51

-9815,25 ± 572,04 0,667 ± 0,01 1,019 ± 0,02

SEPI 2 2310,42 ± 99,13

-14870,81 ± 2287,68 0,632 ± 0,06 0,973 ± 0,03

NE1 – nanoemulsão contendo 1% de extrato mole; NE2 – nanoemulsão branco; ME-MLC1 – microemulsão contendo 1% de extrato mole; ME-MLC2 – microemulsão branco; SEPI1 – emulgel contendo 1% de extrato mole e SEPI2 – emulgel branco. A adesividade da formulação traz indício da pegajosidade das formulações. Esta propriedade é determinada como a força necessária para quebrar a atração entre a superfície da amostra e a superfície da sonda do equipamento. Preparações com maior adesividade podem apresentar maior retenção na superfície da pele e, consequentemente, poderá melhorar a eficácia clínica (MAZIA et al., 2016). As formulações do tipo NE não apresentaram adesividade provavelmente por sua fluidez elevada. Enquanto as ME -MLC apresentaram alta adesividade. Embora a incorporação do extrato tenha reduzido mais de 90% da adesividade do sistema, a ME-MLC com extrato possui adesividade superior às demais formulações. A base

92

emulgel também apresentou redução da adesividade com a incorporação do extrato. A espalhabilidade das formulações é resultante da consistência (firmeza) e adesividade. A ME-MLC sem extrato que apresentou maior viscosidade e firmeza, também apresentou menor espalhabilidade, podendo ser justificado por sua alta pegajosidade e viscosidade. As demais formulações apresentaram espalhabilidade entre 0,4 e 0,7. O emulgel apresentou maior taxa de espalhabilidade do que as NE. Na análise por TPA a sonda é penetrada duas vezes na amostra afim de avaliar a recuperação do sistema e sua coesividade após uma primeira ruptura pela penetração da sonda. Como observado nos resultados, a ME-MLC sem extrato embora apresente maior valor de firmeza, sua estrutura cristalina é alterada e não se reestrutura após retirada da sonda. Esta propriedade também pode ser observada na análise reológica em que a alta resistência observada inicialmente é reduzida com o aumento do gradiente de cisalhamento e não há recuperação dos valores iniciais de recuperação após redução da taxa de cisalhamento, caracterizando o sistema como tixotrópico. 5.2.4 Análise de teor dos marcadores químicos por CLAE

O método utilizado foi anteriormente otimizado e validado por Fischer Müller et el. (2015), na ocasião se mostrou reprodutível inter e intracorrida, com DPR < 3,00% para as soluções (dos sistemas nanoemulsionados) analisadas no dia 1, <4,0% no dia 2 mostrando que o mesmo possui repetibilidade. Além disso, o método, mostrou ser é seletivo para detecção dos marcadores PMD e RUT, não havendo interferência da composição dos sistemas nanoemulsionados sobre a integração dos picos usados na quantificação dos marcadores para o EM, conforme observado nos cromatogramas presentes nas figuras 16 e 17. Neste estudo, a análise de precisão intracorrida para o emulgel, o método apresentou valores próximos a 5% (Tabela 6) e, analisando os perfis cromatográficos apresentados na figura 18, o método se mostrou também seletivo para esta formulação. O teor de extrato das formulações foi expresso como a concentração dos marcadores analíticos plumierídeo, rutina e flavonoides totais expressos em rutina por grama de formulação. Baseado no teor de marcadores no extrato (Tabela 7) e na concentração teórica de extrato nas formulações (1%), a concentração teórica das formulações é: plumierídeo 2069,30 µg/g; rutina

93

46,30 µg/g e flavonoides totais expressos em rutina 83,60 µg/g. Conforme apresentado na Tabela 7, o teor de plumierídeo foi aproximadamente 119,1%, 110,6% e 98,0% para a NE, ME-MLC e SEPI; de rutina de 78,1%, 75,3% e 67,2%, enquanto o de flavonoides totais foi de 83,0%, 79,3% e 71,2%, respectivamente. Tabela 6 Teor de marcadores plumierídeo e rutina e extrato mole de A. cathartica na análise da precisão do método por CLAE para o emulgel com extrato mole.

Amostra Concentração (µg/mL) Concentração (µg/g)

PMD Rutina FT PLU Rutina FT 1 177,20 2,61 5,22 1771,99 26,13 52,20 2 162,12 2,45 4,89 1621,15 24,50 48,88 3 177,32 2,68 5,42 1773,20 26,75 54,15 4 155,37 2,35 4,72 1553,69 23,52 47,21 5 172,10 2,63 5,30 1720,95 26,28 53,05 6 165,72 2,54 5,13 1657,15 25,40 51,27

Média 168,30 2,54 5,11 1683,02 25,43 51,12 s 8,80 0,12 0,26 87,99 1,22 2,62

DPR% 5,23 4,80 5,13 5,23 4,80 5,13 Tabela 7 - Teor apresentado pelos sistemas nanoemulsionados e emulgel contendo extrato das flores de A. cathartica (µg/g de formulação– FT expresso em rutina).**

Sistemas Marcadores (µg/g de sistema)

Plumierideo Rutina Flavonoides

totais*

NE 1 2464,25 ± 102,56a 36,15 ± 1,53a 69,39 ± 3,14

ME-MLC 1 2289,54 ± 123,35a,b 34,87 ± 1,94a 66,32 ± 3,87

SEPI 1 2028,39 ± 254,52b 31,15 ± 3,61a 59,50 ± 6,81

*Flavonoides Totais expressos em rutina. ** Os resultados são expressos em média ± desvio padrão. *Letras iguais significam valores estatisticamente semelhantes usando nível de significância de 95% e análise ANOVA seguida de teste de Tukey.

94

Figura 16. Perfil cromatográfico em CLAE das nanoemulsões com (NE 1) e sem (NE 2) extrato mole de A. cathartica em 230 nm e 355 nm.

NE 1 – PMD 230 nm NE 1 – Flavonoides 355nm

NE 2 – 230 nm NE 2 – 355nm

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min-100

0

100

200

300

400

500

600mAU

230nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

0

5

10

15

20mAU

355nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min-100

0

100

200

300

400

500

600mAU

230nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

-2

-1

0

1

2

3

4

mAU355nm,4nm (1.00)

95

Figura 17. Perfil cromatográfico em CLAE das microemulsões com mesofases líquido cristalinas com (ME-MLC 1) e sem (ME-MLC 2) extrato mole de A. cathartica em 230 nm e 355 nm.

ME-MLC 1 – PMD 230 nm ME-MLC 1 – Flavonoides 355nm

ME-MLC 2 – 230 nm ME-MLC 2 – 355nm

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

0

100

200

300

400

500mAU

230nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

0

5

10

15

mAU355nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min-100

0

100

200

300

400

500

600mAU

230nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

-2

-1

0

1

2

3

4

mAU355nm,4nm (1.00)

96

Figura 18. Perfil cromatográfico em CLAE dos emulgeis com (SEPI 1) e sem (SEPI 2) extrato mole de A. cathartica em 230 nm e 355 nm.

SEPI 1 – PMD 230 nm SEPI 1 – Flavonoides 355nm

SEPI 2 – 230 nm SEPI 2 – 355nm

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

0

100

200

300

400

mAU230nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

0

5

10

15

mAU355nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

0

100

200

300

mAU230nm,4nm (1.00)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min-2.5

0.0

2.5

5.0

mAU355nm,4nm (1.00)

97

O maior teor apresentado pelas formulações NE e ME-MLC pode estar relacionado com a perda de água durante a preparação das formulações, pois o produto é obtido a 80 °C, sob gotejamento lento da água. Embora, durante o preparo tenha-se cuidado em reduzir ao máximo a evaporação da água, o rendimento do produto ficou abaixo de 100%. Diferentemente do emulgel (SEPI), que por ser preparado pela técnica convencional de emulsificação, tem-se uma menor perda de água.

5.2.5 Análise do teor de fenólicos totais

Os compostos fenólicos são formados a partir das reações dos metabólitos secundários nas plantas, sendo essenciais para seu desenvolvimento, além de atuarem como agentes antioxidantes, biologicamente ativos e contribuírem na pigmentação das espécies vegetais. Mais de 8000 compostos fenólicos já foram identificados (NEVES; ALENCAR; CARPES, 2009; SILVA et al., 2010). O teor de fenólicos totais do EM e dos sistemas nanoemulsionados e emulgel com e sem EM de A. cathartica foi determinado através do método espectrofotométrico, utilizando o reagente de Folin-Ciocalteu e curva analítica de ácido gálico. Os resultados foram expressos em mg de fenólicos totais em equivalente de ácido gálico (EAG) por g de resíduo seco. Os resultados estão apresentados na Tabela 8. Tabela 8 - Fenólicos totais (mg/g de resíduo seco) do extrato mole de A. cathartica e dos sistemas nanoemulsionados e emulgel com e sem extrato mole. Resultados apresentados pela média ± desvio padrão.

Amostras Fenólicos Totais

EAG1 mg/g de EM EAG mg/g do produto EM 32,58 ± 1,92a - NE 1 22,29 ± 0,19b 0,22 ± 0,002 NE 2 0,02 ± 0,00c 0,00 ± 0,00 ME-MLC 1 41,30 ± 3,07d 0,41 ± 0,03 ME-MLC 2 18,26 ± 0,96b 0,18 ± 0,01 SEPI 1 19,41 ± 0,84b 0,19 ± 0,01 SEPI 2 16,53 ± 1,54b 0,16 ± 0,02

1 Fenólicos totais expressos em equivalente em ácido gálico. *Letras iguais significam valores estatisticamente semelhantes usando nível de significância de 95% e análise ANOVA seguida de teste de Tukey.

98

A quantificação espectrométrica de compostos fenólicos pode ser realizada por meio de uma variedade de técnicas, porém o método que utiliza o reagente Folin-Ciocalteu figura entre as metodologias mais extensivamente utilizadas, uma vez que coloração formada na reação do reagente com a amostra permite a determinação da concentração das substâncias com potencial antioxidantes (GÓES, 2017; SOUZA et al., 2007). Fazendo a correlação do EM de A. cathartica com os sistemas nanoemulsionados e levando em consideração que as soluções utilizadas para esta análise estavam na concentração 100 vezes menor que a utilizada para o EM, é possível perceber na Tabela 8 que os valores são correspondentes. As amostras com EM apresentaram valores maiores que as amostras sem EM. O sistema ME-MCL 1 apresentou maior teor de fenólicos totais, porém se subtrair a influência do branco, ou seja, 23,04 mg/g de EM, seu valor é semelhante ao encontrado para a NE 1, que não apresentou praticamente influência da NE sem extrato (branco). Estas formulações apresentaram um teor cerca de 70% se comparado ao EM. Já o emulgel apresentou um valor menor e não houve diferença significativa entre o branco e o SEPI com extrato. Góes (2017) avaliou o teor de fenólicos totais também para o EM das flores de A. cathartica e obteve um teor de 32,59 mg EAG por g resíduo seco. No presente estudo o valor foi de 32, 59 mg EAG, mostrando a repetibilidade do método para análise do extrato. 5.3 Estudo de Estabilidade Acelerada

O estudo de estabilidade acelerada tem como propósito fornecer

evidências de como a qualidade de um produto se comporta com o tempo, sob influência de uma variedade de fatores ambientais, como temperatura, umidade e luz, e até mesmo para estabelecer um prazo de validade para os produtos além de recomendar condições de armazenamento adequadas (ORIQUI; MORI; WONGTSCHOWSK, 2013).

Para a estabilidade física e química das formulações, estas foram submetidas ao estudo de estabilidade acelerado, com análises nos tempos zero, 30, 90 e 180 dias. Os sistemas foram preparados e armazenados em bisnagas de alumínio revestida com filme plástico, devidamente identificadas, mantidas em geladeira a 5 ± 2 ºC e em estufa a 40 ± 1 ºC. Os resultados estão apresentados nas Tabelas 9 a 13.

99

Tabela 9 – Valores de pH dos sistemas nanoemulsionados e emulgel contendo extrato das flores de A. cathartica ao longo do estudo de estabilidade acelerada. Resultados apresentados pela média ± desvio padrão.

Tempo (dias)

t0

t30 t90 t180

Temperatura geladeira estufa geladeira estufa geladeira estufa

Amostras

NE 1 6,18 ± 0,073 (1,19)a

5,43 ± 0,03 (0,47)d

5,41 ± 0,01 (0,18)b

6,10 ± 0,025 (0,41)a

5,24 ± 0,025 (0,47)c

6,30 ± 0,02 (0,36)e

5,19 ± 0,01 (0,19)c

NE 2 6,88 ± 0,04 (0,55)a

7,10 ± 0,02 (0,37)b

6,02 ± 0,02 (0,41)c

6,46 ± 0,015 (0,24)d

5,96 ± 0,015 (0,25)e

6,99 ± 0,01 (0,36)f

5,78 ± 0,015 (0,26)g

ME-MLC 1 6,29 ± 0,005 (0,09)a

6,53 ± 0,02 (0,26)b

5,97 ± 0,01 (0,16)c

6,17 ± 0,015 (0,25)d

5,70 ± 0,01 (0,175)e

6,60 ± 0,025 (0,38)f

4,37 ± 0,01 (0,26)g

ME-MLC 2 6,88 ± 0,015 (0,22)a

6,85 ± 0,02 (0,30)a,b

5,56 ± 0,00 (0,00)c

6,45 ± 0,02 (0,32)d

5,22 ± 0,03 (0,58)e

6,79 ± 0,04 (0,59)b

5,70 ± 0,02 (0,35)f

SEPI 1 6,25 ± 0,04 (0,66)a

6,39 ± 0,01 (0,18)b

6,05 ± 0,02 (0,34)c

6,02 ± 0,025 (0,42)c

5,69 ± 0,005 (0,10)d

6,68 ± 0,03 (0,39)e

5,93 ± 0,01 (0,17)f

SEPI 2 6,56 ± 0,015 (0,23)a

6,82 ± 0,02 (0,30)b

6,28 ± 0,03 (0,60)c

6,32 ± 0,0 (0,0)c

6,05 ± 0,02 (0,34)d

6,69 ± 0,02 (0,26)e

6,51 ± 0,015 (0,23)f

NE1 – nanoemulsão contendo 1% de extrato mole; NE2 – nanoemulsão branco; ME-MLC1 – microemulsão contendo 1% de extrato mole; ME-MLC2 – microemulsão branco; SEPI1 – emulgel contendo 1% de extrato mole e SEPI2 – emulgel branco. *Letras iguais significam valores estatisticamente semelhantes usando nível de significância de 95% e análise ANOVA seguida de teste de Tukey.

100

Tabela 10 - Viscosidade média (Pa.s) dos sistemas nanoemulsionados e emulgel contendo extrato das flores de A. cathartica ao longo do estudo de estabilidade acelerada. Resultados apresentados pela média ± desvio padrão.

Tempo (dias)

t0

t30 t90 t180

Temperatura geladeira estufa geladeira estufa geladeira estufa

Amostras

NE 1 2,93±0,68 (.10-3)a

22,92±3,11 (.10-3)b

23,88±0,87 (.10-3)b

73,12±49,64

(.10-3)b 36,44±0,04

(.10-3)b 52,38±7,78

(.10-3)b NE 2 4,75±1,38

(.10-3)a

42,687±3,027 (.10-3)b

36,49±7,32 (.10-3)b

54,48 ± 0,70 (.10-3)b

38,21±13,26 (.10-3)b

53,55±6,13 (.10-3)b

ME-MLC 1 4,474 ± 1,034a,b

8,729 ± 0,170c,d

9,540 ±0,791c,d

2,847±0,114b 9,791±1,311c 6,846±0,505a,d 3,361

±0,225b

ME-MLC 2 7,525 ± 2,494a 6,643±2,013a 9,371±3,906a 7,309 ±

0,344a 11,822±3,173a 6,221±0,379a 5,896±0,079a

SEPI 1 4,397 ± 0,292a 9,841±1,968b 10,446±1,450b 2,234±0,072

b 13.241±3,489b 7,731±1,477b 1,692±0,131b

SEPI 2 3,571 ± 0,186a 13,695±2,152b 10,344±2,044b 3,307±0,031

b 12,361±1,899b 14,573±1,150b 2,555±1,104b


101

Tabela 11 - Tamanho médio e índice de polidispersão dos sistemas nanoemulsionados e emulgel contendo extrato das flores de A.

cathartica ao longo do estudo de estabilidade acelerada. Resultados apresentados pela média ± desvio padrão.

Amostras t0 t30 t90 t180

geladeira estufa geladeira estufa geladeira estufa

Tamanho médio (nm)

NE 1 34,05 ±0,28a 38,40 ± 0,68b 41,63 ± 0,46c 38,98 ± 0,46b 40,44 ± 0,12d NA 43, 31 ± 0,18e

NE 2 33,05± 0,45a 38,23 ± 0,76b 49,32 ± 0,52c 39,23 ± 0,39b 64,30 ± 0,42d NA 56, 03 ± 0,23e

ME-MLC 1 17,29± 0,08a 23,32 ± 0,45b 25,84 ± 0,20c 21,72 ± 0,24d 23,43 ± 0,09b 19,59 ± 0,13e 24,95 ± 0,16f

ME-MLC 2 23,55 ± 0,17a 32,06 ± 0,39b 40, 64 ± 1,19c 29,72 ± 0,53d

32,92 ± 0,40b 24, 68 ± 0,04a 33,20 ± 0,50b

SEPI 1 435,2 ± 21,62a 536,1 ± 61,76b 290, 2 ± 23,43c 245 ± 22,51c

547,1 ± 34,10b 311,5 ± 24,80c 401,4 ± 12,38a

SEPI 2 557,8 ± 85,22a 338, 1 ± 9,35a,b 249,7 ± 8,99b 528,7 ± 198,6a,b

581,1 ± 159,6a 423,1 ± 17,82a,b

361,3 ± 17,89a,b

Índice de Polidispersão (PDI)

NE 1 0,13 ±0,01a,b 0,15 ± 0,01a,c 0,15 ± 0,00a,b,c 0,123 ± 0,01b 0,13 ± 0,01a,b,c 0,15 ± 0,01c 0,15 ± 0,01c

NE 2 0,27± 0,01a 0,20 ± 0,01b 0,25 ± 0,01a 0,190 ± 0,00b 0,39 ± 0,02c 0,27 ± 0,00a 0,27 ± 0,00a

ME-MLC 1 0,28± 0,02a 0,38 ± 0,01b 0,25 ± 0,00a,c 0, 321 ± 0,00d 0,21 ± 0,00e 0,23 ± 0,01c,e 0,16 ± 0,01f

ME-MLC 2 0,39± 0,01a 0,39 ± 0,01a 0,38 ± 0,02a 0,276 ± 0,00b 0,25 ± 0,01b,c 0,23 ± 0,01c,d 0,20 ± 0,02d

SEPI 1 0,50 ± 0,03a 0,90 ± 0,13b 0,44 ± 0,05a 0,432 ± 0,04a 0,62 ± 0,02c 0,67 ± 0,07c 0,70 ± 0,05c

SEPI 2 0,59 ± 0,05a 0,63 ± 0,14a 0,56 ± 0,02a 0,664 ± 0,05a 0,68 ± 0,08a 1,00 ± 0,00b 0,62 ± 0,04a

NE1 – nanoemulsão contendo 1% de extrato mole; NE2 – nanoemulsão branco; ME-MLC1 – microemulsão contendo 1% de extrato mole; ME-MLC2 – microemulsão branco; SEPI1 – emulgel contendo 1% de extrato mole e SEPI2 – emulgel branco. *Letras iguais significam valores estatisticamente iguais para nível de significância de 95% e análise ANOVA seguida de teste de Tukey.

102

Tabela 12 - Potencial zeta dos sistemas nanoemulsionados e emulgel contendo extrato das flores de A. cathartica ao longo do estudo de estabilidade acelerada. Resultados apresentados pela média ± desvio padrão.

Amostras t0 t30 t90 t180


NE 1 -18,3± 0,81a,b -20,9 ± 2,32a -16,4 ± 1,01b,c -12,5 ± 0,80d -14, 3 ± 1,22c,d -14,9 ± 0,92c,d -19,9 ± 0,25a

NE 2 -9,3± 0,71a -18,7± 0,40b,c -17,6 ± 1,78c,d -14,1 ± 1,52d -15,90 ± 1,15c,d -18,1 ± 1,88c -21,8 ± 0,51b

ME-MLC 1 -7,5± 2,16a -14,4 ± 2,39b,c -9,97 ± 1,31a,c -14,9 ± 1,45b -9,44 ± 0,91a -10,7 ± 1,69a,b,c -23,5 ± 1,62d

ME-MLC 2 -11,8± 2,24a -12,1 ± 0,56a -6,33 ± 0,70b 14,9 ± 2,73a -11,0 ± 0,91a -10,7 ± 1,69a -12,1 ± 0,37a

SEPI 1 -68,4± 0,82a -55,0 ± 1,40b -57,8 ± 1,78b -68,7 ± 1,30a -87,0 ± 1,69c -62,9 ± 0,98d -75,7 ± 2,92e

SEPI 2 64,9± 2,55a -59,9 ± 5,93a,b -52,6 ± 1,68b -63,6 ± 5,30a -68,2 ± 3,24a -64,3 ± 2,16a -64,9± 2,55a

Tabela 13 - Teor de plumierídeo em mg/g nos sistemas nanoemulsionados e emulgel contendo extrato das flores de A. cathartica nos diferentes intervalos de tempo do estudo de estabilidade. Resultados apresentados pela média ± desvio padrão.

t0

t30 t90 t180


NE 1 2,46 ± 0,10a 2,33 ± 0,06a 2,36 ± 0,02a 2,94 ± 0,06b 3,14±0,07b,c 3,15±0,14c 3,04 ± 0,06c

ME-MLC1 2,29 ± 0,12a 2,29 ± 0,05a 1,96±0,28b 3,01 ±0,01c 2,92±0,03c 2,97±0,18c 2,93 ± 0,19c

SEPI 1 2,19 ± 0,07a,b 2,00±0,15a 2,23 ±0,02b 2,52±0,15c 2,43±0,09c NA NA


103

Durante o estudo de estabilidade acelerada, o pH dos sistemas nanoemulsionados e do emulgel foram acompanhados e aqueles que inicialmente apresentaram valores de pH entre 6 e 7 (Tabela 9), mostraram leve redução do pH ao longo do estudo, principalmente NE e ME-MLC.

O valor de pH das NE e ME-MCL contendo extrato foi de 5,19 e 4,37 em 180 dias de análise quando armazenadas em estufa, respectivamente. O emulgel apresentou maior estabilidade do valor de pH ao longo do estudo. A incorporação do extrato resultou em produtos com menor valor de pH já no tempo zero, e esta redução foi ampliada ao longo do estudo nos sistemas em que o extrato estava nanoparticulado, que pode ser resultante do próprio sistema, pois os sistemas sem extrato também apresentaram redução do valor de pH ao longo do estudo.

Os valores médios de viscosidade das formulações são apresentados Tabela 10. As NE, que inicialmente apresentavam viscosidade inferior a 5 mPa.s, sofreram significativo aumento ao longo do estudo, alcançando valores de aproximadamente 50 mPa.s em 180 dias em estufa, não apresentando diferença significativa entre as formulações com e sem extrato.

Enquanto as ME com mesofase líquido cristalina apresentaram viscosidade inicial maior que 4000 mPa.s e não apresentaram alteração significativa da viscosidade em 180 dias de análise em ambas as temperaturas estudadas, confirmando o aspecto gelificado e fisicamente estável deste sistema.

O emulgel apresentou na análise inicial valor de viscosidade entre 3500 e 4400 mPa.s, ao final do estudo acelerado (estufa) apresentou significativa redução dos valores de viscosidade dos produtos.

Quanto ao tamanho médio de fase interna, nos sistemas NE e ME-MCL foi observado aumento do tamanho, porém ainda permanecendo inferior a 50 nm. O aumento foi maior em estufa do que em geladeira, mostrando a importância da temperatura na estabilidade cinética dos sistemas (Tabela 11). O PDI destas formulações também se manteve estável, mostrando que as formulações sofreram pouca alteração física ao longo do estudo, demonstrando a estabilidade cinética.

As formulações emulgel, por serem emulsão convencional com tamanho de fase interna maior que 400 nm inicialmente, apresentaram maior instabilidade de tamanho e homogeneidade de tamanho ao longo do estudo. Nestas formulações foi observado uma leve redução do tamanho médio em 180 dias, porém estatisticamente não possui diferença significativa.

104

Os sistemas também se mantiveram estáveis quanto ao valor de potencial zeta, conforme apresentado na Tabela 12. Ao final do estudo, independente da temperatura de acondionamento, o valor ao final de 180 dias de estudo, foi semelhante ao determinado no tempo zero, sendo que para algumas amostras não foi observada diferença significativa. Conforme apresentado na Tabela 13, ao longo do estudo de estabilidade foi observado um aumento no teor de plumierídeo. Estes resultados podem estar relacionados com a perda de umidade do produto. 5.4 Análise do perfil de dissolução in vitro

Para determinação do perfil de dissolução das formulações, inicialmente foi realizado um estudo para a seleção do meio de dissolução. Foram testados como meio de dissolução o tampão acetato pH 4,5 acrescidos ou não de Tween® e lauril sulfato de sódio (LSS) como agentes de solubilidade. O extrato foi adicionado na concentração de 1,5 mg/mL e os resultados da quantificação das amostras por CLAE foram expressos como percentual dissolvido dos marcadores plumierideo (PMD) e rutina (RUT). Confome apresentado na Tabela 14, os resultados obtidos foram estatisticamente semelhantes com valor de p=0,411 para o PMD e p=0,507 para a rutina. Desta forma, foi selecionado o tampão acetato pH 4,5 para a continuidade da análise.

Tabela 14 - Solubilidade aparente do extrato de A. cathartica em diferentes meios de dissolução.

Meio PMD (%) RUT(%) A1 106,62 105,22 A2 108,96 89,21 B1 107,75 89,37 B2 150,04 128,15 C1 159,68 137,07 C2 124,96 110,44 EM 106,62 105,22

A - Tween 1% + tampão acetato pH 4,5, B - LSS 0,5% + tampão acetate pH 4,5, C - tampão acetato pH 4,5

105

Os estudos de liberação in vitro são de extrema importância para compreender a relação que existe entre as características estruturais dos produtos emulsivos propostos e a dissolução do extrato mole de A. cathartica. Nesta avaliação é importante que a membrana utilizada não seja um fator limitante, a fim de que o comportamento de dissolução seja resultante do controle ou mecanismo de liberação do sistema que contém o princípio ativo. Além disso, o meio receptor selecionado deve garantir condições “sink” de dissolução, ou seja, que o volume do meio seja superior pelo menos 3 vezes ao volume mínimo para dissolução do total do fármaco a ser dissolvido (RISSI, 2013). O estudo do perfil de dissolução do extrato incorporado nas formulações foi realizado utilizando célula de difusão do tipo Franz e membrana de acetato de celulose. Foi quantificada a dissolução dos marcadores químicos do extrato mole (PMD, rutina e flavonoides totais expressos em rutina) e os resultados expressos em proporção dissolvida (%) e quantidade difundida por área (µg/cm2). Conforme apresentado na Figura 19, no perfil da proporção dissolvida por tempo, cerca de 80% do plumierídeo puro (PMD) dissolveu em 180 min de análise e quando analisado a partir do extrato mole (EM), cerca de 60% dissolveu no mesmo período de tempo. A dissolução do PMD a partir das formulações contendo EM foi mais lenta do que o composto puro ou presente no EM. A NE e o emulgel (SEPI) apresentaram uma taxa semelhante nos primeiros 60 min, porém a NE reteve o composto liberando menos de 40% até o final do teste, enquanto o SEPI liberou 80% do PMD em 12 h de análise. A microemulsão com mesofase líquido cristalino (ME-MLC) apresentou uma liberação mais lenta inicialmente, porém cerca de 60% do composto foi liberado em 12 h de análise. Este sistema possui uma maior organização, o que resulta em uma liberação lenta do fármaco nas primeiras horas, porém com o tempo o sistema vai fluidificando e permite alcançar uma proporção de liberação do fármaco superior ao da NE. Aparentemente, a NE libera mais rapidamente no início do estudo e depois retém o fármaco, enquanto a ME possui um comportamento contrário. Os resultados, quando expressos em quantidade difundida por área, apresentam uma alteração do perfil, pois depende da quantidade de composto ou formulação presente inicialmente no ensaio. Embora, o comportamento

106

do perfil, ou seja, taxa inicial e formação de platô, seja semelhante ao observado no perfil expresso em % dissolvido por tempo. Figura 19. Perfil de dissolução do plumierídeo puro (PMD) (solução a 200 µg/mL) e a partir do extrato das flores de Allamanda cathartica em solução (EM) e incorporado em nanoemulsão (NE), microemulsão (ME-MCL) e emulgel (SEPI), em aparato de célula de difusão usando membrana de acetato de celulose e tampão acetato pH 4,5 como meio de dissolução. A – Expresso em fração dissolvida por tempo. B – Expresso em quantidade permeada por cm2.

Tempo (min)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Plu

mie

rid

eo

dis

so

lvid

o (

%)

0

20

40

60

80

100

PLU EM NE ME-MCL SEPI

Tempo (min)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Plu

mie

rid

eo

(µ

g/c

m2)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

PLU EM NE ME-MCL SEPI

A

B

107

Os perfis de dissolução dos flavonoides a partir do extrato mole e das formulações contendo extrato são apresentados nas Figuras 20 e 21. A rutina e os flavonoides totais expressos em rutina (FT) quando analisados a partir do EM, dissolveram cerca de 50% em 180 min, e não mais que 60% até o final do ensaio. Figura 20. Perfil de dissolução da rutina a partir do extrato das flores de A. cathartica

em solução (EM) e incorporado em nanoemulsão (NE), microemulsão (ME-MCL) e emulgel (SEPI), em aparato de célula de difusão usando membrana de acetato de celulose e tampão acetato pH 4,5 como meio de dissolução. A – Expresso em fração dissolvida por tempo. B – Expresso em quantidade permeada por cm2.

Tempo (min)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Ru

tin

a d

isso

lvid

a (

%)

0

20

40

60

80

100

EM NE ME-MCL SEPI

Tempo (min)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Ru

tin

a (

µg

/cm

2)

0

5

10

15

20

EM NE ME-MCL SEPI

A

B

108

No emulgel contendo o EM, houve uma dissolução mais lenta nas primeiras horas, se comparado ao EM puro, porém em 12 horas alcançou mais de 60% de dissolução. A base embora tenha liberado mais lentamente os marcadores, permitiu uma maior proporção dissolvida ao final do ensaio. Figura 21. Perfil de dissolução de flavonoides totais (FT) a partir do extrato das flores de A. cathartica em solução (EM) e incorporado em nanoemulsão (NE), microemulsão (ME-MCL) e emulgel (SEPI), em aparato de célula de difusão usando membrana de acetato de celulose e tampão acetato pH 4,5 como meio de dissolução. A – Expresso em fração dissolvida por tempo. B – Expresso em quantidade permeada por cm2.

Tempo (min)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

FT

dis

so

lvid

o (

%)

0

20

40

60

80

100

EM NE ME-MCL SEPI

Tempo (min)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

FT

(µ

g/c

m2)

0

10

20

30

40

EM NE ME-MCL SEPI

A

B

109

A dissolução dos flavonoides a partir do EM incorporado nos sistemas nanoemulsionados apresentou perfil diferente dos observados para o PMD. Quando incorporado em NE, não mais que 20 % foi dissolvido durante o período de estudo, enquanto a ME-MLC apresentou liberação retardada dos flavonoides, com início somente a partir de 180 min. Esta diferença de comportamento dos marcadores incorporados nas bases nanoemulsionadas pode estar relacionada com a maior afinidade dos flavonoides pela fase interna oleosa, portanto uma menor partição para o meio aquoso. Enquanto o PMD, por ser uma substância mais hidrofílica apresentou maior partição para o meio aquoso e, consequentemente uma maior proporção foi dissolvida. A cinética de dissolução dos marcadores a partir das formulações contendo EM foi analisada pelo modelo de ordem zero e pela lei da potência. Os resultados são apresentados na Tabela 15. Os perfis de dissolução apresentaram melhor ajuste ao modelo de Lei da potência, exceto para ME-MCL, pois este modelo é ajustado em escala logarítmica. A constante de dissolução do PMD no período de três horas iniciais foi menor para o SEPI seguido da ME, enquanto para os flavonoides, a ME-MLC apresentou a menor taxa de dissolução, conforme já observado nos perfis de dissolução. Para a maioria das amostras o valor de n foi maior do que 0,5, mostrando que a dissolução dos marcadores não é dependente somente da difusão, ou seja, da diferença de concentração dos dois lados da membrana, mas que outros fatores, como a estrutura e organização das formulações, também influenciam na velocidade de dissolução. Em relação à liberação prolongada, os cristais líquidos vêm sendo considerados excelentes sistemas de liberação, devido sua grande área interfacial interna, com características físico-químicas diferentes da área externa, formando microambientes distintos. A liberação prolongada pode ocorrer por difusão, por influência da solubilidade e o coeficiente de partição, e também por fatores físico-químicos relacionados com os arranjos, tais como a porosidade, a geometria e a tortuosidade dos poros e a proporção e a natureza dos componentes da mistura (RISSI, 2013).

110

Tabela 15 - Cinética do perfil de dissolução dos marcadores presentes no extrato das flores de A. cathartica usando os modelos cinéticos de ordem zero e lei da potência.

Amostra Ordem zero Lei da Potência

r2 k r2 k n

Plumierídeo

PMD 0,642 0,352 0,9454 1,265 0,90 EM 0,492 0,127 0,882 1,592 0,74 NE 0,569 0,039 0,887 1,603 0,56 ME-MCL

0,955 0,091 0,947 1,415 0,66

SEPI 0,814 0,104 0,978 1,230 0,69 Rutina EM 0,479 0,055 0,856 1,828 0,62 NE 0,667 0,024 0,887 1,604 0,56 ME-MCL

0,974 0,007 0,438 0,561 0,24

SEPI 0,881 0,086 0,990 0,968 0,66

Flavonoides totais EM 0,480 0,052 0,858 1,804 0,62 NE 0,950 0,046 0,925 0,805 0,49 ME-MCL

0,970 0,005 0,331 0,619 0,18

SEPI 0,890 0,079 0,984 0,908 0,64

PMD – solução de plimierídeo; EM – solução de extrato mole; NE – nanoemulsão contendo 1% de extrato mole; ME-MCL – microemulsão contendo 1% de extrato mole e SEPI – emulgel contendo 1% de extrato mole A composição básica dos cristais líquidos, ou mesofase líquido cristalinas leva em consideração a presença de sais, de óleos e de co-tensoativos, assim como a temperatura e estrutura do tensoativo e a concentração de água na formulação (RISSI, 2013). 5.5 Estudo de permeação e retenção cutânea ex vivo

A análise de permeação cutânea ex vivo dos sistemas nanoemulsionados

e do emulgel com extrato mole de A. cathartica foi realizada em aparato de célula de difusão de Franz com pele de orelha de porco como membrana e

111

solução tampão acetato pH 4,5 como meio aceptor. Foi realizado também a análise dos marcadores plumierídeo e rutina e do extrato mole. O estudo envolveu a determinação da permeação cutânea, ou seja, a quantificação no meio aceptor, a penetração cutânea, por meio da quantificação na pele viável (derme e epiderme) e na retenção da superfície da pele e estrato córneo por meio da quantificação usando a técnica de tape stripping. Os resultados são apresentados nas Figuras 22 a 27 e nas Tabelas 16 e 17. Em estudos de penetração através da pele, utilizando método de avaliação in vitro, a situação ideal seria utilizar pele humana como modelo, porém a pouca disponibilidade deste tipo de material, dificuldades e custos de armazenamento e a viabilidade deste modelo de membrana tornam seu uso limitado (BABY et al., 2008). Como alternativa de membrana, a escolha da pele de orelha de porco se justifica justamente pela semelhança do ponto de vista fisiológico quanto à densidade de folículos pilosos humano, sendo uma das espécies animais empregadas nos ensaios de segurança de cosméticos. Desta forma servem como modelo de membrana para estudos de permeação in vitro. Sua permeabilidade tem sido amplamente estudada e tem provado ser um bom modelo animal para simular a pele humana (BABY et al., 2008; CHORILLI et al., 2009).

Inicialmente foi analisada a permeação do marcador PMD em solução de tampão acetato. Conforme apresentado na Figura 22, na primeira hora de análise houve a permeação de 16,57 µg/cm2 de PMD seguido por platô, que traduz a parada de permeação do composto nos tempos posteriores. Comparado com a quantidade total de PMD aplicado sobre a pele, o total permeado foi de cerca de 10%. Na análise da pele após 24 horas de ensaio, cerca de 11% de PMD foi encontrado na pele viável, enquanto cerca de 1,16% foi quantificado no estrato córneo (Tabela 16).

A rutina, na forma de solução, apresentou maior taxa de permeação nos primeiros 30 minutos de análise, depois sendo observada uma redução da quantidade do composto no meio aceptor (Figura 23). Somente cerca de 1% da rutina foi quantificada na pele viável, enquanto no estrato córneo não foi encontrado o composto. Estes resultados indicam a limitação do método para análise da permeação deste composto, provavelmente devido sua solubilidade em meio aquoso.

Na análise de permeação da dispersão do extrato mole de A. cathartica

em tampão acetato foi observado maior taxa de permeação dos marcadores

112

químicos quando comparado com eles isolados (Figura 24). Cerca de 29,20% do PMD sofreu permeação, sendo cerca de três vezes superior ao composto puro. Já para a rutina e para os FT, foi obtido cerca de 15% e 13% de permeação, respectivamente. Figura 22 – Perfil de permeação cutânea ex vivo da solução de plumierídeo (PMD) usando célula de difusão do tipo Franz, pele de orelha de porco como membrana, tampão acetato pH 4,5 como meio aceptor e temperatura de 32 ºC. A – PMD permeado em µg/cm2; B – PMD permeado em %.

Os resultados mostram que a matriz complexa presente no extrato bruto das flores, permite uma maior permeação dos compostos na pele, reforçando

0

5

10

15

20

25

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35

40

45

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0 5 10 15 20 25 30

PM

D P

erm

eado

µg/

cm2

Tempo (h)

0

10

20

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40

50

0 5 10 15 20 25 30

PM

D P

erm

eado

%

Tempo (h)

A

B

113

a importância do uso de extratos vegetais pela sinergia que pode ser encontrada entre os compostos presentes. Neste estudo foi evidenciada a influência da matriz na transposição da barreira cutânea.

A determinação da retenção do extrato na pele viável e no estrato córneo, mostrou que cerca de 12% do PMD estava retido na pele, enquanto uma menor proporção foi encontrada na superfície. Já para os flavonoides não foi possível quantificar no material biológico, provavelmente devido a menor proporção destes no extrato, quando comparado ao PMD. Figura 23 Perfil de permeação cutânea ex vivo da solução de rutina (RUT) usando célula de difusão do tipo Franz, pele de orelha de porco como membrana, tampão acetato pH 4,5 como meio aceptor e temperatura de 32 ºC. A – RUT permeado em µg/cm2; B – RUT permeado em %.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 5 10 15 20 25 30

RU

T P

erm

eada

µg/

cm2

Tempo (h)

0,0

5,0

10,0

15,0

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25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

50,0

0 5 10 15 20 25 30

RU

T P

erm

eada

%

Tempo (h)

A

B

114

Figura 24 - Perfil de permeação cutânea ex vivo da solução de extrato das flores de A. cathartica expresso em plumierídeo (PMD), rutina (RUT) e flavonoides totais expressos em rutina (FT) usando célula de difusão do tipo Franz, pele de orelha de porco como membrana, tampão acetato pH 4,5 como meio aceptor e temperatura de 32 ºC. A – PMD permeado em µg/cm2; B – RUT e FT permeados em µg/cm2; C – PMD, RUT e FT permeados em %.

0

10

20

30

40

50

0 10 20 30

Per

mea

ção

µg/

cm2

Tempo (h)

0,0

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0 5 10 15 20 25 30

Per

mea

ção

µg/

cm2

Tempo (h)

RUTFT

0

10

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40

50

0 10 20 30

Per

mea

ção

(%)

Tempo (h)

PMDRUTFT

A

B

C

115

Tabela 16 - Resultados da quantificação do plumierídeo (PMD), rutina (RUT) e flavonoides totais expressos em rutina (FT) quantificados no fluido aceptor, na porção viável da pele (epiderme viável e derme) e na superfície da pele (superfície e estrato córneo) após 24 h de análise de permeação cutânea

Amostra Permeado* Epiderme e derme Estrato córneo e superfície

µg % µg % µg %

PMD 10,37 ± 1,24 9,16 ± 1,09 22,84 ± 1,93 11,42 ± 0,97 2,33 ± 0,54 1,16 ± 0,27

RUT 0,29 ± 0,15 6,31 ± 2,11 0,11 ± 0,03 1,07 ± 0,31 nd nd

EM PMD 37,25 ± 0,08 29,20 ± 0,06 27,03 ± 10,81 12,00 ± 4,80 10,80 ± 0,12 4,79 ± 0,05

EM RUT 1,34 ± 0,14 15,04 ± 2,74 nd nd nd nd

EM FT 2,31 ± 0,19 13,25 ± 2,07 nd nd nd nd

NE PMD 26,02 ± 10,72 16,69 ± 6,88 6,46 ± 1,92 2,35 ± 0,70 3,86 ± 1,64 1,40 ± 0,59

NE RUT 0,35 ± 0,19 8,79 ± 0,16 nd nd nd nd

NE FT 0,66 ± 0,38 9,64 ± 0,34 nd nd nd nd

ME PMD 18,11 ± 0,49 7,67 ± 0,21 240,24 ± 35,83 57,65 ± 8,60 148,15 ± 48,60 35,55 ± 11,66

ME RUT 0,07 ± 0,02 1,32 ± 0,45 4,41 ± 0,60 47,34 ± 6,43 3,28 ± 1,22 35,26 ± 13,07

ME FT 0,10 ± 0,03 1,06 ± 0,32 7,93 ± 1,05 47,08 ± 6,25 5,76 ± 1,82 34,19 ± 10,83

SEP PMD nd nd 17,86 ± 4,31 4,49 ± 1,08 5,41 ± 2,84 1,69 ± 0,63

SEP RUT 0,14 ± 0,03 2,46 ± 0,48 0,45 ± 0,14 4,50 ± 1,43 0,16 ± 0,09 2,02 ± 0,86

SEP FT 0,17 ± 0,01 1,62 ± 0,08 0,73 ± 0,21 3,88 ± 1,11 nd nd *Quantidade permeada em 24h de análise.

116

Tabela 17 - Parâmetros cinéticos da permeação ex-vivo do plumierídeo (PMD), rutina (RUT), extrato mole das flores de Allamanda cathartica (EM) e nanoemulsões (NE), microemulsões com mesofases líquido cristalinas (ME) e emulgel (SEP) contendo 1 % de extrato mole d A.cathatica usando os modelos de ordem zero e Higuchi

Amostra Marcador Intervalo

(h)

Ordem Zero Higuchi

J (µg/cm2/h)

r2 J (µg/cm2/h)

r2

PMD 0-0,5 27,668 19,564 0,5-6,0 -0,512 0,24 -1,807 0,294

Rutina 0-0,5 2,312 1,635 0,5-6,0 -0,077 0,4 -0,275 0,494

EM

PMD 0-0,5 72,165 51,028 0,5-6,0 0,3649 0,418 1,35 0,56

RUT 0-0,5 2,923 2,067

0,5-6,0 -0,024 0,961 -0,074 0,899

FT 0-0,5 5,217 3,689

0,5-6,0 -0,054 0,999 -0,173 0,987

NE

PMD 0-0,5 45,827 32,405

0,5-6,0 -0,127 0,282 -0,3509 0,211

RUT 0-0,5 0,804 0,568

0,5-6,0 -0,013 0,709 -0,041 0,672

FT 0-0,5 1,469 1,039

0,5-6,0 -0,024 0,567 -0,072 0,518

ME

PMD 0-0,5 2,272 1,606

0,5-6,0 0,598 0,471 2,148 0,594 0-24 h 0,69 0,941 3,544 0,948

RUT 0-0,5 0 0

0,5-6,0 -0,003 0,04 -0,001 0,058 0-24 h 0,003 0,859 0,013 0,743

FT 0-0,5 0 0

0,5-6,0 -0,001 0,001 -0,001 0,002 0-24 h 0,004 0,846 0,019 0,759

SEP

PMD 0-0,5 0 0

0-24 h 0 0 0 0

RUT 0-0,5 0 0

0-24 h 0,036 0,798 0,007 0,704

FT 0-0,5 0 0

0-24 h 0,0461 0,812 0,008 0,627

117

A permeação do extrato incorporado nos produtos emulsionados foi inferior a taxa obtida com o extrato em solução. Tal comportamento pode estar relacionado com a disponibilidade dos marcadores para permeação cutânea, pois diferentemente da solução extrato, nos produtos é necessário a liberação do extrato para posterior permeação.

Os três produtos analisados apresentaram perfil diferente de permeação e penetração dos marcadores na pele. A NE promoveu a permeação de cerca de 16% do PMD, sendo quantificado o composto na pele viável (cerca de 2%) e na superfície da pele (1,4%), conforme apresentado na Figura 25 e Tabela 16. As NE são sistemas fluidos que tendem a promover a permeação cutânea e tem sido explorada como veículo para aumento da permeação cutânea de princípios ativos com baixa solubilidade em meio aquoso (CHOUDHURY et al., 2017; SINGH et al., 2017). Portanto, são sistemas que tendem a serem mais eficazes para compostos apolares. O PMD por ser um composto solúvel em meio aquoso, pode estar particionado na fase aquosa da emulsão e, por isto, não ter sido observado um aumento na permeação cutânea do composto quando incorporado na base nanoemulsionada.

A ME-MLC promoveu um comportamento de permeação e retenção do extrato diferente da NE (Figura 26 e Tabela 16). Para o PMD foi encontrada uma menor taxa de permeação, porém cerca de 58% do composto foi quantificada na derme e epiderme, enquanto cerca de 35% foi quantificado na superfície da pele. Este comportamento está relacionado com a estrutura bidimensional estruturada nestes sistemas (FORMARIZ et al., 2005; KADHUM et al., 2017). Resultados semelhantes foram encontrados em estudos anteriores, que demonstraram maior retenção do extrato na pele, quando comparado com os sistemas nanoemulsinados (FISCHER MULLER, 2013). O mesmo comportamento foi observado para os flavonoides presentes no extrato. Estes resultados são promissores pois mostram que o sistema permite maior retenção dos ativos nas camadas viáveis da pele, porém com baixa taxa de permeação. Este comportamento é esperado para produtos dermocosméticos com propriedades fotoprotetora, antioxidante e antienvelhecimento, pois nestas camadas estão concentradas as alterações celulares consequentes dos danos provocados à pele por fatores intrínsecos e extrínsecos.

118

Figura 25 - Perfil de permeação cutânea ex vivo do extrato das flores de A. cathartica expresso em plumierídeo (PMD), rutina (RUT) e flavonoides totais expressos em rutina (FT) incorporado em nanoemulsão. O ensaio foi realizado em aparato de célula de difusão do tipo Franz, usando pele de orelha de porco como membrana, tampão acetato pH 4,5 como meio aceptor e temperatura de 32 ºC. A – PMD permeado em µg/cm2; B – RUT e FT permeado em µg/cm2; C – PMD, RUT e FT permeado em %. n = 4.

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10

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Per

mea

ção

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Tempo (h)

RUTFT

0

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-P

erm

eaçã

o %

Tempo (h)

PMDRUTFT

A

B

C

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Figura 26 Perfil de permeação cutânea ex vivo do extrato das flores de A. cathartica

expresso em plumierídeo (PMD), rutina (RUT) e flavonoides totais expressos em rutina (FT) incorporado em microemulsão com mesofase líquido-cristalina. O ensaio foi realizado em aparato de célula de difusão do tipo Franz, usando pele de orelha de porco como membrana, tampão acetato pH 4,5 como meio aceptor e temperatura de 32 ºC. A – PMD permeado em µg/cm2; B – RUT e FT permeado em µg/cm2; C – PMD, RUT e FT permeado em %. n = 4.

0

10

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0 5 10 15 20 25 30

Per

mea

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µg/

cm2

Tempo (h)

0,0

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0,8

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0 5 10 15 20 25 30

Per

mea

ção

µg/

cm2

Tempo (h)

RUT

FT

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0 10 20 30

Per

mea

ção

%

Tempo (h)

PMDRUTFT

A

B

C

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Diferentemente da NE e da ME-MLC, o emulgel não promoveu a penetração e permeação cutânea do extrato. O PMD não foi quantificado no líquido aceptor e menos de 5% foi encontrado na derme e epiderme e uma proporção ainda menor foi encontrada na superfície (Figura 27 e Tabela 16). Nesta base, os flavonoides apresentaram permeação inferior a 3%. Quando comparado com os resultados de liberação, esta base apresentou cerca de 60% dos marcadores dissolvidos em 12 horas de análise (Figura 21), porém esta cedência não foi observada na permeação cutânea. Estudos adicionais são necessários para compreender o mecanismo e particionamento dos marcadores para pele.

Assim, levando em conta as características particulares de cada sistema analisado é relevante ressaltar que as nanoemulsões e microemulsões são sistemas coloidais formadas por água, óleo, tensoativo e co-tensoativo, as quais têm a capacidade de incorporar fármacos hidrofílicos em meio lipofílico, lipofílicos em meio aquoso e anfifílicos na interface óleo/água, além de atuarem como promotores de permeação de vários fármacos, devido ao tamanho reduzido das gotículas formadas e ao seu elevado conteúdo em tensoativos, que desorganiza os lipídeos presente na pele (SOARES et al., 2015). Esses fatores podem ajudar a explicar a maior permeação do iridoide plumierídeo apresentado pelos sistemas nanoemulsionados, pois, o PMD possui características hidrofílicas, enquanto a rutina é menos solúvel em meio aquoso. Importante ressaltar a diferença de comportamento de permeação dos sistemas nanoemulsionados. Na Figura 25, demonstra uma maior concentração de PMD no meio aceptor nas primeiras coletas, valores próximos a 25 µg/cm², mas no decorrer da análise mantêm praticamente constante até o final das 24 horas de análise. O mesmo é observado para os flavonoides RUT e FT que nas coletas iniciais atingem concentrações entre 0,5 e 1 µg/cm² e se mantém praticamente constante até o final da análise.

Enquanto a ME-MLC 1, Figura 26, inicia a liberação dos marcadores nas coletas iniciais mas atinge suas concentrações máximas próximo das 24 horas de análise, com comportamento semelhante para os flavonoides e apresentando uma liberação prolongada dos marcadores. Estes resultados possuem relação com o comportamento de dissolução apresentado pelo extrato incorporado neste sistema (Figura 19 e 20), mostrando a influência da matriz no controle de liberação e também na modulação da penetração e retenção dos princípios ativos na pele. Microemulsões com mesofases

121

contínuas (cúbicas, hexagonais, esponjas) têm sido relatadas como sistemas capazes de garantir um efeito reservatório epicutâneo de fármacos nas camadas da pele (CEVC; VIERL, 2010). Figura 27 - Perfil de permeação cutânea ex vivo do extrato das flores de A. cathartica expresso em plumierídeo (PMD), rutina (RUT) e flavonoides totais expressos em rutina (FT) incorporado no emulgel. O ensaio foi realizado em aparato de célula de difusão do tipo Franz, usando pele de orelha de porco como membrana, tampão acetato pH 4,5 como meio aceptor e temperatura de 32 ºC. A – PMD permeado em µg/cm2; B – RUT e FT permeado em µg/cm2; C – PMD, RUT e FT permeado em %. n = 4.

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%

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C

122

Valenta, Nowack e Bernkop-Schnürch, 1999 apud Baby (2007), verificaram a permeação de rutina, como substância química modelo, veiculada na forma cosmética gel à base de deoxicolato de sódio, hidroxietilcelulose e polímero carboxivinílico. Os veículos apresentaram valores de viscosidade aparente distintas. Os pesquisadores empregaram membrana artificial e pele de rato para a avaliação da permeação da rutina, com quantificação posterior por CLAE, com detecção a 350 nm, e por espectrofotometria a 405 nm. Os resultados indicaram que o gel à base de deoxicolato de sódio favoreceu a permeação da rutina, atuando como veículo promotor. Os géis formulados com hidroxietilcelulose e polímero carboxivinílico não obtiveram resultados satisfatórios comparados com os obtidos com a preparação controle (solução aquosa de rutina). A eficácia de produtos cosméticos e fármacos é dependente da penetração limitada destes na pele. A pele é um dos focos para a pesquisa na entrega de fármacos, e atualmente muitas são as pesquisas para avaliar a administração. No entanto, penetração e retenção de princípios ativos na epiderme não é uma tarefa simples. De fato, a camada mais externa da pele, o estrato córneo, é uma barreira tanto para o transporte de água para fora do corpo e a permeação química interna. Além das barreiras físicas, a depuração dos capilares na derme e o metabolismo cutâneo através das enzimas metabólicas também pode reduzir a biodisponibilidade local de fármacos. Entre as possíveis abordagens para superar essas questões, são apresentados os sistemas nanocarreadores como novas estratégias para melhorar o tratamento local de afecções cutâneas (ALEXANDER et al., 2012; MUSAZZI et al., 2017). A penetração de fármacos em toda a pele é limitada justamente pela função de barreira gerada pela estrutura enormemente organizada do estrato córneo que acontece, pois, os corneócitos que são células ricas em proteínas (70-80% de queratina) estão ligadas por corneodesmossomas que se encontram incorporados numa matriz lipídica, organizada em bicamadas, compostas por ceramidas, ácidos graxos e colesterol. Assim organizada constituem uma “parede” onde os corneócitos seriam os “tijolos” e a matriz lipídica intercelular o “cimento, conferindo significativa barreira limitante para penetração de princípios ativos (ALEXANDER et al., 2012; SOARES et al., 2015). Além disso, os corneócitos são revestidos por uma fina camada irregular e descontínua (manto hidrolipídico), que consiste no sebo secretado pelas

123

glândulas sebáceas, juntamente com o suor, bactérias e células mortas da pele. E esse revestimento é considerado uma barreira adicional à permeação de substâncias através da camada córnea (ALEXANDER et al., 2012). 5.6 Avaliação da segurança in vitro dos sistemas contendo extrato das flores de A. cathartica 5.6.1 Método HET-CAM

O método Hen’s Egg Test-Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) tem como objetivo avaliar semi-quantitativamente o potencial irritante de um produto (produtos solúveis, emulsões, géis e óleos), sobre a membrana corioalantóide de ovo embrionado de galinha, no décimo dia de incubação, permitindo a análise dos efeitos imediatos das substâncias sólidas ou líquidas na membrana do ovo de galinha embrionado (BRASIL, 2012). Devido às características estruturais do ovo embrionário possibilita considerar similar aos tecidos altamente vascularizados da conjuntiva presente nos olhos humanos. Esta similaridade permite simular in vitro e correlacionar ao in vivo. E também, levando em consideração a necessidade de se encontrar métodos alternativos de análise que não utilizem de animais potencializa a aplicabilidade deste método, sendo uma alternativa por exemplo para o método clássico de Draize, que utiliza coelhos (BRASIL, 2012). Após a determinação dos ovos viáveis, a casca dos ovos foi quebrada e a membrana protetora retirada para exposição do embrião. Então foi realizada a aplicação e acompanhamento do provável desenvolvimento de irritação por 3 minutos. As análises foram realizadas com as formulações e também com controles negativo cloreto de sódio 0,9% e positivo, hidróxido de sódio 0,1 N (Figura 28). O ensaio HET-CAM baseia-se na determinação de alterações macroscópicas (extravasamento ou coagulação sanguínea) que podem ocorrer na membrana cório-alantoide em decorrência da aplicação de excipiente com potencial irritante (OLIVEIRA et al., 2012).

124

Figura 28 Resultados do Método HET-Cam para controle positivo, controle negativo, sistemas nanoemulsionados, emulgel com extrato mole (EM) de A. cathartica nos tempos zero (T0), 1 minuto (T1) e 3 minutos (T3).

T0 T1

Con

trol

e P

osit

ivo

NaO

H 1

%

Con

trol

e N

egat

ivo

NaC

l 0.9

%

T3

Cri

stal

líqu

ido

com

EM

Se

pige

l co

m E

M

Nan

oem

ulsã

o co

m E

M

125

A análise das imagens mostra que o controle positivo mostrou extravasamento sanguíneo após um e três minutos em relação ao tempo zero (Figura 28). Por sua vez, o controle negativo não apresentou extravasamento sanguíneo e formação de coágulos sanguíneos nos microvasos, mesmo após 3 minutos da aplicação, confirmando a escolha do uso dos mesmos como controle positivo e negativo. Levando este fator em consideração, a análise da aplicação dos sistemas nanoemulsionados e do emulgel contendo EM mostrou que não houve extravasamento sanguíneo nem mesmo formação de coágulos sanguíneos nos microvasos presentes nos embriões. McKenzie et al. (2015) pela análise semi-qualitativa em seu estudo determinou a gravidade de qualquer hemorragia apresentada durante a análise de HET-CAM, classificando em escala de 0 (nenhuma reação) a 3 (reação forte), de acordo com o Quadro 1. Desta forma, é possível determinar que os sistemas analisados não apresentaram ocorrência de hemorragia, sendo assim todos podem ser classificados na escala de número zero que os descreve como não irritantes. 5.6.2 Método de hemólise

O ensaio de hemólise in vitro avalia a biocompatibilidade entre formulação e organismo, pela análise dos componentes da formulação (tensoativos, lipídios) através do impacto destas em humanos, pela quantificação de hemoglobina liberada (BACARIN et al., 2015) A compreensão de que a membrana celular do eritrócito é composta por 46 a 55% de proteínas, 35 a 45% de lipídios e 10% de oligossacarídios, auxilia em possíveis conclusões acerca de como os tensoativos (catiônicos, aniônicos e não-iônicos) interagem com a membrana celular (ALVES, 2003; NOGUEIRA et al., 2012). Considerando a característica não iônica dos tensoativos utilizados no desenvolvimento dos dermocosméticos com e sem extrato de A. cathartica, a atividade irritante sobre a pele e membranas mucosas está diretamente relacionada à sua concentração, o comprimento da cadeia do grupo lipofílico, ou seja, a interação com o meio biológico pode ser explicada por suas propriedades físico-químicas (ALVES, 2003).

126

Tabela 18. Determinação dos valores de hemólise em diversas concentrações do EM e sistemas nanoemulsionados e emulgel com e sem extrato das flores de A. cathartica em 540 nm.

Concentração da amostra (µL/mL)

10 50 100 200 500 1000

EM 1,79 ±0,54 3,01 ±1,01 2,57 ±0,43 2,21 ±0,16 2,09 ±0,17 2,62 ±0,04

NE 1 3,33 ±1,43 3,61 ±1,01 3,87 ±0,43 4,25 ±0,16 2,75 ±0,17 2,42 ±0,04

NE 2 2,78 ±0,36 3,34 ±0,65 2,93 ±0,90 2,88 ±0,59 2,56 ±0,38 2,37 ±0,76

ME-MCL 1 2,27 ±0,34 2,22 ±0,24 1,79 ±0,523 2,14 ±0,69 2,51 ±1,95 1,67 ±0,49

ME- MCL 2 2,61 ±0,53 3,05 ±0,48 3,36±0,46 2,03 ±0,07 2,13 ±0,62 1,66±0,10

SEPI 1 2,55 ±0,37 2,29 ±0,21 2,20 ±0,26 2,63 ±0,46 2,87 ±0,26 4,87±1,22

SEPI 2 2,10 ±0,29 2,48 ±0,10 2,59 ±0,53 3,43 ±0,63 3,58 ±1,16 6,16±0,87

127

Tabela 19. Determinação dos valores de hemólise em diversas concentrações do EM e sistemas nanoemulsionados e emulgel com e sem extrato das flores de A. cathartica em 576 nm.

Concentração da amostra (µL/mL)

10 50 100 200 500 1000

EM 1,83 ±0,42 3,03 ±0,94 2,62 ±0,45 2,19 ±0,22 2,08 ±0,16 2,54 ±0,17

NE 1 3,52 ±1,55 4,35 ±0,93 4,55 ±0,88 4,43 ±1,42 3,05 ±0,81 2,49 ±0,17

NE 2 2,97 ±0,30 3,73 ±0,36 3,18 ±0,78 3,11 ±0,68 2,67 ±0,51 2,27 ±0,59

ME-MCL 1 2,48 ±0,29 2,43 ±0,18 1,98 ±0,64 2,34 ±0,69 2,82 ±2,19 1,86 ±0,51

ME- MCL 2 2,74 ±0,53 3,18 ±0,54 3,49 ±0,52 2,13 ±0,08 2,24 ±0,634 1,76 ±0,09

SEPI 1 2,81 ±0,49 2,45 ±0,07 2,38 ±0,33 2,76 ±0,32 2,93±0,29 4,52 ±0,82

SEPI 2 2,33 ±0,17 2,77 ±0,08 2,86 ±0,38 3,86 ±0,93 3,97 ±1,02 6,85 ±0,66

128

Admite-se que a incorporação do tensoativo não iônico à porção lipoprotéica da membrana celular possa causar uma desordem parcial da membrana e/ou mudanças na permeabilidade celular, podendo levar à hemólise (ALVES, 2003). Porém os resultados obtidos e apresentados nas Tabelas 18 e 19, demonstram que os produtos desenvolvidos não possuem atividade hemolítica com EC50 > 1000 µL/mL. 5.7 Avaliação da eficácia in vitro 5.7.1 Fotoproteção pelo modelo espectrofotométrico

Durante as últimas décadas, danos substancialmente gerados à camada protetora de ozônio resultaram em um aumento significativo da radiação solar atingindo a terra. Como consequência, a incidência de várias doenças e distúrbios relacionados à exposição excessiva à radiação ultravioleta solar aumentou alarmantemente (NAPAGODA et al., 2016; VELASCO et al., 2011) Os 3 tipos de radiação UV são classificados dependendo do comprimento de onda; UVA (320-400 nm) UVB (290-320 nm) e UVC (200-290 nm). Esta última é efetivamente filtrada pela camada de ozônio. Conhecidamente a exposição intensa ou excessiva a UV-A e UV-B leva a queimaduras solares, eritema, inflamação, hiperpigmentação, rugas, hiperplasia, imunossupressão local, fotoenvelhecimento e fotocarcinogênese (NAPAGODA et al., 2016). As consequências da exposição à radiação UV são o fotoenvelhecimento com a formação de regiões hiperpigmentadas, presença de efélides e queratoses actínicas. Além disso, promovem alterações moleculares, que interferem na expressão de metaloproteinases, que diminuem fibras de colágeno e elastina e aumentam de forma significativa a produção de EROS (KAMMEYER; LUITEN, 2015). A geração de EROS exerce efeitos deletérios pela oxidação de moléculas biologicamente essenciais, danos oxidativos induzidos que de forma cumulativas promovem danos à pele pela exposição ao longo da vida. Assim, a avaliação da eficácia dos fotoprotetores e possíveis ativos antioxidantes, colabora no desenvolvimento e prevenção destas reações (NAPAGODA et al., 2016; VELASCO et al., 2011). No presente estudo, a capacidade fotoprotetora do extrato das flores de A. cathartica foi determinada pelo método espectrofotométrico de Mansur.

129

O método quantifica a capacidade fotoprotetora pela absorção de radição UV entre 290 e 320 nm. Para análise foram preparadas soluções do EM de A.

cathartica em concentrações de 0,25, 0,50, 0,75, 1,0 mg/mL em metanol. Os resultados são apresentados na Figura 29. Figura 29. Perfil de absorção no UVA (315-400 nm) e UVB (280-315 nm) (A) e valores de FPS calculado espectrofotometricamente (B) do extrato das flores de A.

cathartica em diferentes concentrações.

O extrato das flores de A. cathartica, além de seu composto majoritário

o PMD, possui entre 1 e 2% de flavonoides. Tais compostos possuem absorção de luz UV na faixa de comprimento de onda relacionada com os

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

200 250 300 350 400 450

Abs

orbâ

ncia

λ (nm)

0,25 mg/mL0,50 mg/mL0,75 mg/mL1,00 mg/mL

02468

101214161820

0,25 0,50 0,75 1,00

FP

S

Concentração (mg/mL)

A

B

130

raios UVB (290-320 nm), com três bandas de absorção, sendo uma com máxima absorção em 300 nm (Figura 29A). O extrato apresentou absorbância dependente da concentração na faixa de 0,25 a 1,0 mg/mL. Quanto aplicado no modelo matemático proposto por Mansur, tais valores de absorbância resultaram em FPS de 6,4 a 18,12 (Figura 29B), sendo a resposta FPS versus concentração linear entre 0,5 e 1,0 mg/mL (r2 de 0,9984). O FPS obtido para o EM de A. cathartica mostra-se promissor quando comparado com outras plantas que foram avaliadas usando a mesma metodologia. Rosa et al (2008) avaliaram o FPS de extratos vegetais aquosos na concentração de 10% de algumas espécies, sendo FPS 8 para Achillea

Millefolium, FPS5 para as espécies Brassica oleracea e Porophyllum

ruderale, FPS 2 para Plectranthus barbatus e FPS 1 para Cyperus rotundus.

O FPS do extrato das folhas de Litchi chinensis foi determinado por Thiesen et al. (2017) em concentrações de 0,25 a 1,0 mg/mL. O extrato apresentou um FPS de 18,90 na concentração de 1 mg/mL. Este valor foi semelhante ao obtido para o extrato de A. cathartica, demonstrando o alto potencial fotoprotetor do extrato e consequentemente dos produtos contendo o extrato de A. cathartica a 10 mg/g (1%). 5.7.2 Atividade antioxidante pela captura do radical DPPH

A metodologia de avaliação da capacidade antioxidante foi adaptada de Rufino et al. (2007) e o método baseia-se na transferência de elétrons e, por ação de um antioxidante ou uma espécie radicalar, o DPPH que possui cor púrpura é reduzido formando difenil-picril-hidrazina, de coloração amarela, com consequente desaparecimento da cor, podendo a mesma ser monitorada pelo decréscimo da absorbância. A partir dos resultados obtidos determinou-se a porcentagem de atividade antioxidante ou sequestradora de radicais livres do extrato mole das flores de A. cathartica e das formulações contendo extrato. Os resultados foram comparados com as bases emulsionadas sem extrato.

Na figura 30 são apresentadas as curvas de consumo do radical DPPH na análise do extrato mole de A. cathartica e também as curvas para os sistemas nanoemulsionados NE e ME-MLC contendo extrato. As bases NE e ME-MLC sem extrato não apresentaram atividade antioxidante, pois não reduziram a concentração de radicais no meio reacional em diferentes concentrações analisadas, por isto não estão relatadas na Tabela 20.

131

Figura 30 - Curvas de consumo do radical DPPH para obtenção da CE50 do extrato mole de A. cathartica e dos sistemas nanoemulsionados contendo EM.

Extrato mole

Nanoemulsão

Microemulsão com mesofase líquido cristalina

y = 85,907x + 3,7863R² = 0,9926

y = 84,889x + 3,6156R² = 0,9958

0

20

40

60

80

100

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

AA

%


y = 0,63x + 3,76R² = 0,9955

y = 0,6385x + 5,0141R² = 0,9858

0,0010,0020,0030,0040,0050,0060,0070,0080,00

0 20 40 60 80 100 120

AA

%


y = 0,7924x + 18,66R² = 0,9964

y = 0,8278x + 18,831R² = 0,9961

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

0 20 40 60 80 100 120

AA

%


132

As amostras apresentaram resposta linear do consumo de radical livre frente à concentração. Conforme apresentado na Tabela o extrato apresentou uma CE50 de 0,54 mg/mL. Quando incorporado nos diferentes sistemas, o potencial antioxidante foi potencializado quando incorporado nas ME-MLC, pois esta apresentou uma CE50 30% menor do que o valor teórico esperado (54 mg/mL), pois o extrato foi incorporado a 1% nas formulações. Tabela 20 - Valores de CE50 calculados a partir das curvas analíticas para o extrato mole de A. cathartica, sistemas nanoemulsionados com EM e emulgel com e sem EM

Amostras DPPH

CE50 (mg/mL) Extrato mole A. cathartica 0,54 ± 0,01 NE 1 71,93 ± 2,83 ML-MLC 1 38,60 ± 1,34 SEPI 1 64,82 ± 0,47 SEPI 2 47,06 ± 3,22

A NE apresentou CE�� maior do que o valor teórico, mostrando uma

leve redução do efeito antioxidante se comparado ao extrato não incorporado, conforme apresentado na Tabela 20.

O produto do tipo emulgel sem extrato apresentou atividade antioxidante quando analisado pelo método de DPPH, conforme apresentado na Figura 31 e na Tabela 20. Por isto, embora o emulgel contendo extrato tenha apresentado CE�� de 64,82 mg/mL, o produto sem extrato apresentou uma CE�� de 47,06 mg/mL, mostrando mais potente do que o produto adicionado de extrato. Estes resultados podem estar relacionados com a dificuldade de dispersar e extrair os compostos presentes na matriz gelificada, bem como, a possível inibição de radical DPPH por componentes presente na base emulsiva. Por isto, estudos adicionais devem ser conduzidos para esclarecimento destes resultados. A atividade antioxidante do extrato mole de A. cathartica pelo método de DPPH foi determinada por Góes (2017). O estudo descreve uma CE�� de 6,85 mg/mL, valor este inferior ao obtido no presente estudo.

133

Figura 31 - Curvas de consumo do radical DPPH para obtenção da CE50 dos emulgéis com e sem extrato mole de A. cathartica.

Emulgel com extrato mole de A.cathartica

Emulgel sem extrato mole de A.cathartica

y = 0,6954x + 5,1515R² = 0,9419

y = 0,7152x + 3,4007R² = 0,9487

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

0 20 40 60 80 100 120

AA

%


y = 0,9804x - 6,0985R² = 0,9938

y = 0,9457x - 3,347R² = 0,9962

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

0 20 40 60 80 100 120

AA

%


135

6 CONCLUSÕES

O extrato mole de Allamanda cathartica foi obtido e caracterizado apresentando rendimento, aspectos organolépticos, pH e concentrações dos marcadores plumierídeo e rutina similares aos estudos anteriores realizados pelo nosso grupo de pesquisa.

Produtos dermocosméticos em base nanoestruturada (nanoemulsão - NE e microemulsão com mesofases líquido cristalinas - ME) e o emulgel (Sepigel) foram obtidos e caracterizados.

Os sistemas nanoemulsionados (NE e ME) foram formulados com os tensoativos não iônicos Alkest CSO400 e Span®80 e triglicérides de ácido cáprico e caprílico como fase oleosa. As NE apresentaram tamanho médio de 34,05 nm e 33,05 nm para formulação com e sem EM. Enquanto as ME apresentaram tamanho médio de 17,29 nm e 23,55 nm para formulação com e sem EM. O emulgel apresentou tamanho médio de 435,2 para emulgel com EM (SEPI 1) e 557,8 nm para emulgel sem EM (SEPI 2).

Quanto ao comportamento reológico, os produtos apresentaram comportamento do tipo não-newtoniano, pseudoplástico e tixotrópico. As NE apresentaram valores de viscosidade inferior a 5 mPa.s, demostrando a fluidez do sistema, enquanto as ME com mesofase líquido cristalina apresentaram viscosidade maior que 40000 mPa.s, confirmando o aspecto gelificado deste sistema. O emulgel (SEPI), por sua vez, apresentou valor de viscosidade entre 3000 e 5000 mPa.s, valores característicos de emulsões semissólidas.

Em concordância com os resultados de viscosidade, a NE apresentou a menor firmeza, seguida do creme-gel e da ME-MLC. Assim como observado nos outros ensaios de caracterização de consistência, a incorporação do extrato reduziu a firmeza das formulações, sendo a redução proporcionalmente maior nas ME-MLC, seguida do emulgel e da NE, sendo de cerca de 90, 30 e 10%, respectivamente.

O teor de fenólicos totais foi avaliado pelo método espectrofotométrico com reagente de Folin-Ciocalteu e os resultados foram expressos em equivalente EAG mg/g de EM. O EM apresentou 32,58 EAG1 mg/g de EM e a formulção ME-MLC 1 superou este valor e apresentou 41,30 EAG mg/g de EM. NE 1 22,29 e o emulgel apresentou menor concentração de equivalente em ácido gálico, com 19,41 EAG mg/g de EM.

136

A estabilidade física e química das formulações armazenadas em geladeira e estufa (40 ºC) foi analisada por 180 dias quanto ao aspecto físico, valor de pH, tamanho médio de fase interna e polidispersidade, potencial zeta, viscosidade e teor de PMD. As formulações se mantiveram estáveis, sendo observado alteração somente no teor de PMD.

Na análise do perfil de dissolução em célula de difusão e usando membrana de acetato de celulose, cerca de 80% do plumierídeo (PMD) dissolveu em 180 min, enquanto 60% de PMD dissolveu no mesmo período a partir do extrato mole (EM). As formulações nanoestruturadas apresentaram menor taxa de dissolução de PMD, com taxa constante na ME e liberação sustentada na NE. O emulgel apresentou taxa de dissolução do PMD superior ao dos sistemas nanoemulsionados.

Comportamento de dissolução semelhante foi observado para os flavonoides, excetuando que a taxa de dissolução das ME foi menor do que para as NE.

A cinética de dissolução dos marcadores a partir das formulações contendo EM foi analisada pelo modelo de ordem zero e pela lei da potência, apresentando melhor ajuste ao modelo de Lei de potência. Os resultados indicaram que a liberação ocorre por mais de um mecanismo, sendo a difusão preponderante principalmente para os sistemas ME.

Na análise da permeação cutânea in vitro com modelo de pele de orelha de porco as diferenças físicas entre os sistemas influenciaram a permeação cutânea do extrato. As NE promoveram a permeação cutânea, enquanto as ME-MLC promoveram a penetração cutânea, porém não a permeação. Já o emulgel apresentou menor poder de penetração e permeação do EM

O extrato e as formulações não apresentaram irritação quanto analisados pelo método HET-CAM. Não foi observado extravasamento sanguíneo nem mesmo formação de coágulos sanguíneos nos microvasos presentes nos embriões.

O extrato e as formulações não apresentaram potencial hemolítico quanto analisados pelo método de hemólise com hemoglobina humana.

A avaliação de eficácia pelo consumo do radical DPPH mostrou maior potencial antioxidante para as microemulsões com mesofase líquido cristalina, pois ela apresentoua CE50 (mg/mL) de 38,60, NE 1 71,93 e SEPI 1 64,82.

137

O potencial fotoprotetor do extrato foi analisado pelo método de Mansur e o extrato apresentou FPS concentração dependente entre 0,5 e 1,0 mg/mL, resultando em FPS de aproximadamente 18 na concentração de 1,0 mg/mL. Os produtos desenvolvidos apresentam potencial como nanofitocosméticos antioxidante, fotoprotetor e seguros, sendo promissores na obtenção de um produto inovador a partir das flores de A. cathartica.

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151

APÊNDICE A - Curvas analíticas do extrato mole e da rutina por CLAE.

Figura 32. Curva analítica do plumierideo a partir da análise do extrato mole de A.cathartica por CLAE, em 230 nm.

Figura 33. Curva analítica da rutina a partir da análise do extrato mole de A.

cathartica por CLAE, em 355 nm.

y = 7E+06x + 42902R² = 0,9989

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

UA

Plu

mie

ride

o

Extrato (mg/mL)

y = 288221x + 2623,9R² = 0,9989

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

UA

Rut

ina

Extrato (mg/mL)

152

Figura 34. Curva analítica expressa em flavonoides totais a partir da análise do extrato mole de A. cathartica por CLAE, em 355 nm.

Figura 35. Curva analítica da rutina por CLAE, em 355 nm.

y = 560762x + 3064,3R² = 0,9988

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

UA

Fla

vono

ides

tota

is

Extrato mole (mg/mL)

y = 38015x - 29734R² = 0,9987

0200000400000600000800000

100000012000001400000160000018000002000000

0 10 20 30 40 50 60

UA

Rutina (µg/mL)

sistemas nanoemulsionados contendo extrato de …siaibib01.univali.br/pdf/ana flavia fischer...

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