UNIVERSIDAD SIMN BOLVAR

DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES

COORDINACIN DE INGENIERA DE MATERIALES

PREPARACIN DE MATERIALES PARA LA REGENERACIN DE CARTLAGO

CONDRAL BASADO EN QUITOSANO / AMPS

Por:

Eduardo Gustavo Hernndez Ojeda

INFORME DE PASANTA

Presentado ante la Ilustre Universidad Simn Bolvar

como requisito para optar al ttulo de

Ingeniero de Materiales

Sartenejas, Enero de 2014

UNIVERSIDAD SIMN BOLVAR

DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES

COORDINACIN DE INGENIERA DE MATERIALES

PREPARACIN DE MATERIALES PARA LA REGENERACIN DE CARTLAGO

CONDRAL BASADO EN QUITOSANO / AMPS

Por:

Eduardo Gustavo Hernndez Ojeda

Realizado con la asesora de:

Tutor Acadmico: Karem Noris

Tutor Industrial: Luis Rodrguez Lorenzo

INFORME DE PASANTA

Presentado ante la Ilustre Universidad Simn Bolvar

como requisito para optar al ttulo de

Ingeniero de Materiales

Sartenejas, Enero de 2014

ACTA DE EVALUACIN DEL PROYECTO

iv

PREPARACIN DE MATERIALES PARA LA REGENERACIN DE CARTLAGO

CONDRAL BASADO EN QUITOSANO/AMPS

Realizado por: Eduardo Gustavo Hernndez Ojeda

RESUMEN

Durante esta investigacin se sintetizaron copolmeros de quitosano-AMPS (cido

2-acrilamido-2-metilpropano sulfnico) entrecruzados con tripolifosfto de sodio

(TPP) con la finalidad de obtener andamios porosos para el cultivo de clulas

condrocticas que servirn para crear un tejido cartilaginoso para la sustitucin del

mismo tejido daado en el cuerpo. As se evalu en estos andamios su correcta

sntesis (verificacin del mecanismo de sntesis), sus propiedades mecnicas y su

microestructura mediante SEM. Para lograr todo esto se realiz la sntesis del

copolmero quitosano-AMPS usando dos quitosanos de diferentes marcas

registradas, Protasan e Idebio, previamente caracterizados mediante FTIR, DRX y

RMN 1H; adems de un iniciador de persulfato de sodio (PS) en medio acuoso bajo

atmsfera de nitrgeno. Se vari el porcentaje de AMPS, TPP y PS. Asimismo se

verific el mecanismo de copolimerizacin entre quitosano y AMPS. Tambin se

realiz el anlisis del porcentaje de injerto obtenido para cada muestra y su

distribucin mediante EDS. Posteriormente, fueron realizados pruebas de

hinchamiento y degradacin en PBS a distintos pHs. Del mismo modo, se valor la

porosidad de las muestras, se determin el tamao de poro promedio y la distancia

entre lminas haciendo uso de fotomicrografa de SEM. Finalmente fue calculado el

peso molecular entre nudos (MC) a travs de los modelos viscosimtricos y de Peppas

y Merrill. Se obtuvo que el mecanismo de copolimerizacin se ocurre a travs de los

grupos aminos y no por apertura de anillo. Los porcentajes de injerto se encuentran

entre 22 y 95% obtenindose los ms altos valores con el mayor porcentaje de AMPS,

iniciador y entrecruzante. Todas las muestras presentaron una distribucin del

AMPS homognea. Con respecto al hinchamiento ambos tipos de muestra (con

quitosano Protasan o Idebio) presentan una tendencia a hinchar ms mientras

tengan mayor porcentaje de injerto, pero las muestras de quitosano Idebio hinchan

v

al menos un 20% ms que las muestras de Protasan. Fue observado que el

porcentaje de hinchamiento aumenta con la disminucin del pH. Se obtuvieron

muestras 100% porosas, con una microestructura de lminas paralelas porosas que

crecen direccionadas. Por ltimo los valores de MC obtenidos fueron desde los 18.000

a los 4.000 g/mol con una tendencia a disminuir al crecer el porcentaje de iniciador y

de entrecruzante.

vi

Para toda mi familia y amigos,

son mi mundo entero.

y para Atonella,

eres mi esperanza del futuro

vii

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar agradezco a quienes me dieron la vida y todo lo que tengo, mis

amados padres, Guillermo Hernndez y Liley Ojeda, miles gracias los amo

demasiado. Tambin le doy infinitas gracias a toda mi familia: a mis hermanas,

primos, tos, sobrinos, tanto Hernndez Carvajal como Ojeda Fung que de una forma

u otra me apoyaron durante todo el camino.

Por otra parta tanto a mi tutor industrial, Luis Rodrguez Lorenzo, como a mi tutor

acadmico, Karem Noris, que llevaron con xito esta investigacin y me prestaron

una ayuda de incalculable valor. Asimismo doy gracias a todo el grupo de

Biomateriales del CSIC, quienes siempre estuvieron dispuestos a ayudarme en todo.

Del mismo modo agradezco enormemente a Maria Luisa Arnal y Evis Penott por sus

aportes en conocimientos cientficos.

A la seora Paloma Montoro, no hubiera podido sobrevivir a Madrid sin ella. Y por

supuesto a mis queridas roomies (Daniela, Ines e Ina), quienes despejaron mi

estrs cuando senta que no poda continuar.

Por ltimo, pero no menos importante, a mis amigos (la familia que se elige)

quienes me apoyaron en todo momento y a los que quiero con toda mi alma. A los

nacionales: Alicia, Joselyn, Daniela Prez, Daniela Da Costa, Suhail, Alejandra,

Carlos, Yise, Nella la lista es infinita, todos saben que los aprecio mucho. Y a los

internacionales, que aun estando lejos se preocupan por m: Elena, Aida, Jorge,

Juan, Marzia Gracias a todos. Si a alguien olvido, pido mil disculpas.

viii

NDICE GENERAL

Pgina

RESUMEN ..................................................................................................................... iv

AGRADECIMIENTOS ................................................................................................ vii

INTRODUCCIN .......................................................................................................... 1

CAPTULO I: DESCRIPCIN DEL INSTITUTO ....................................................... 3

1.1. Sobre la Agencia Estatal Consejo Superior de Investigaciones Cientficas ... 3

1.2. Sobre el Instituto de Ciencia y Tecnologa de Polmeros ................................ 4

1.3. Sobre el grupo de Biomateriales ...................................................................... 5

CAPTULO II: MARCO TERICO ............................................................................... 7

2.1. Quitina y Quitosano .......................................................................................... 7

2.2. Propiedades del quitosano ................................................................................ 8

2.2.1. Cristalinidad ............................................................................................. 10

2.3. Copolimerizacin de Injerto ............................................................................ 10

2.3.1. Copolimerizacin con AMPS .................................................................... 12

2.4. Cartlago .......................................................................................................... 13

2.5. Geles polimricos ............................................................................................ 17

2.5.1. Comportamiento en estado hinchado ...................................................... 19

2.5.2. Geles sensibles al pH ............................................................................... 20

2.5.3. Tamao de la malla .................................................................................. 20

2.6. Andamios ......................................................................................................... 20

CAPTULO III: DISEO EXPERIMENTAL ............................................................. 24

3.1. Materiales ....................................................................................................... 24

3.2. Caracterizacin de los reactivos de partida ................................................... 25

3.3. Sntesis de copolmeros entrecruzados quitosano-AMPS .............................. 28

3.4. Mecanismo de Copolimerizacin de Injerto ................................................... 30

3.5. Porcentaje de Injerto (%G: Grafting Percentage) .......................................... 31

3.6. ndice de Hinchamiento (SI: Swelling Index) y degradacin ........................ 31

ix

3.8. Peso Molecular Entre Nudos (Mc) .................................................................. 33

3.9. Microscopa Electrnica de Barrido (SEM: Scanning Electron Microscopy) 35

CAPITULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIN ........................................................ 36

4.1. Caracterizacin de los quitosanos .................................................................. 36

4.1.1. Determinacin del grado de desacetilacin (DA: Deacetylation Degree) y

el grado de polimerizacin (DP: Polymerization Degree) .................................... 36

4.1.2. Espectroscopia Infrarroja de Transformada de Fourier ......................... 43

4.1.3. Difraccin de Rayos-X (DRX) ................................................................... 45

4.2. Caracterizacin del cido 2-acrilamido-2-metilpropano sulfnico (AMPS) .. 47

4.3. Mecanismo de la copolimerizacin de injerto ................................................ 51

4.4. Porcentaje de Injerto (%G: Grafting Percentage) .......................................... 55

4.5. ndice de Hinchamiento (SI: Swelling Index) ................................................ 59

4.6. Degradacin .................................................................................................... 62

4.7. Porosidad ......................................................................................................... 63

4.8. Peso molecular entre nudos (Mc) ................................................................... 69

CONCLUSIONES ........................................................................................................ 74

RECOMENDACIONES ............................................................................................... 76

REFERENCIAS ........................................................................................................... 77

x

ndice de Tablas

Pgina

Tabla 2.4.1.: Caractersticas de los distintos de tipos de cartlagos: hialino, elstico y

fibroso ............................................................................................................................ 16

Tabla 3.2.1.: Asignacin de los protones a cada pico del espectro RMN 1H de

quitosanos clorados ...................................................................................................... 26

Tabla 3.3.1: Porcentaje de reactivos en funcin de la cantidad de quitosano ............ 29

Tabla 4.1.1.: Correspondencia de picos en cada espectro: estimacin y experimental

....................................................................................................................................... 42

Tabla 4.1.2.: Grado de desacetilacin y peso molecular de los quitosanos Protasan e

Idebio ............................................................................................................................. 42

Tabla 4.2.1.: Correspondencia de las seales con sus respectivos nodos para la

estimacin y el espectro experimental ......................................................................... 49

Tabla 4.8.1.: Peso molecular entre nudos terico, determinado mediante modelo

viscosimtrico (mtodo 1) y mediante modelo de Peppas y Merrill (mtodo 2) .......... 71

Tabla A.1. Porcentaje de azufre de las muestras de quitosano y sus copolmeros. .... 82

Tabla A.2. Porcentaje de injerto respecto al porcentaje de AMPS, iniciador (PS) y

entrecruzante (TPP) tanto para el quitosano PT como para el ID ............................. 83

Tabla A.3.: ndice de hinchamiento para las muestra de quitosano PT e ID con 10%

de AMPS (3 repeticiones de cada muestra). ................................................................ 84

Tabla A.4.: ndice de hinchamiento para las muestra de quitosano PT e ID con 20%

de AMPS (3 repeticiones de cada muestra). ................................................................ 84

Tabla A.5.: ndice de hinchamiento para las muestra de quitosano PT e ID con 30%

de AMPS (3 repeticiones de cada muestra). ................................................................ 85

Tabla A.4.: Porcentaje de prdida en peso para las muestras de quitosano ID y PT

con 10% de AMPS (3 repeticiones de cada muestra) ................................................... 87

xi

Tabla A.5.: Porcentaje de prdida en peso para las muestras de quitosano ID y PT

con 20% de AMPS (3 repeticiones de cada muestra) ................................................... 87

Tabla A.6.: Porcentaje de prdida en peso para las muestras de quitosano ID y PT

con 30% de AMPS (3 repeticiones de cada muestra) ................................................... 88

Tabla A.7.: Densidad aparente y densidad real para determinadas muestras de

quitosano PT e ID ......................................................................................................... 88

Tabla A.8.: Porosidad aparente en funcin del contenido de TPP y AMPS ................ 89

Tabla A.9.: Promedio y desviacin estndar del grosor de lmina, distancia entre

lminas, dimetro mayor y menor de los poros pequeos ........................................... 91

Tabla A.10.: Mdulo de almacenamiento para las diferentes muestras de quitosano

PT e ID .......................................................................................................................... 92

Tabla A.11.: Masa de la muestra seca despus de hinchar (mo), hinchada (ms) y del

polmero en estado relajado (mr), fraccin volumtrica del polmero hinchado (v2.s) y

en estado relajado (v2,r) ................................................................................................. 94

Tabla A.12.: Peso molecular entre nudos terico y determinado mediante los

mtodos 1 y 2, para muestras de quitosano ID y PT ................................................... 96

Tabla A.13.: Peso molecular entre nudos terico y determinado mediante el mtodo 2

en funcin del porcentaje de entrecruzante (TPP) e iniciador (PS) ............................ 97

xii

ndice de Figuras

Pgina

Figura 2.1.1.: Unidades repetitivas de quitina y quitosano .......................................... 7

Figura 2.3.1.: Representacin esquemtica de la copolimerizacin alternante, de

bloque y de injerto. ........................................................................................................ 11

Figura 2.3.2.: Unidad repetitiva de heparina y poli(AMPS) ....................................... 13

Figura 2.5.1.: Representacin esquemtica de la microestructura de un gel

polimrico: polmero ideal entrecruzado por final de cadena; gel entrecruzado por

final de cadena con cadenas colgantes y loops; polmero entrecruzado aleatoriamente

15. .................................................................................................................................... 18

Figura 2.6.1.: Representacin del proceso de implantacin de una construccin

celular ............................................................................................................................ 21

Figura 3.1.1: Estructura qumica del tripolifosfto de sodio ...................................... 24

Figura 3.2.1.: Tpico espectro RMN 1H de un quitosano clorado con un porcentaje de

desacetilacin de 85% ................................................................................................... 26

Figura 3.3.1.: Montaje realizado para la sntesis de los copolmeros entrecruzados . 30

Figura 4.1.1.: Espectro RMN 1H de la solucin preparada a partir de quitosano PT

(Protasan) ...................................................................................................................... 37

Figura 4.1.2.: Espectro RMN 1H de la solucin preparada a partir del quitosano ID

(Idebio). .......................................................................................................................... 38

Figura 4.1.3.: Reaccin de Quitosano con cido Nitroso resultando como producto

Quitosa (1) ..................................................................................................................... 39

Figura 4.1.4.: Estimacin del espectro RMN 1H del quitosano incluyendo las

correspondencias de cada pico con cada protn ........................................................... 40

Figura 4.1.5.: Estimacin del espectro RMN 1H de la quitosa incluyendo las

correspondencias con cada protn ................................................................................ 41

xiii

Figura 4.1.7.: Patrones DRX del quitosano PT e ID .................................................... 45

Figura 4.1.8.: Patrones DRX de quitosano de PT, cangrejo de china (quitosano CCC),

ID y quitina purificada ................................................................................................. 46

Figura 4.2.1.: Espectro FTIR del AMPS ...................................................................... 47

Figura 4.2.2.: Espectro RMN 1H experimental del AMPS .......................................... 48

Figura 4.2.3.: Estimacin del espectro RMN 1H del AMPS ........................................ 49

Figura 4.2.4.: Espectros FTIR del quitosano PT, AMPS y muestra SN4.01 (Menor

contenido de AMPS con mayor contenido de TPP) ...................................................... 50

Figura 4.2.5.: Espectros FTIR del quitosano ID, AMPS y muestra SN4.1 (Menor

contenido de AMPS y mayor contenido de TPP).......................................................... 51

Figura 4.3.1.: Representacin esquemtica de los mecanismos de copolimerizacin de

injerto del quitosano y el AMPS, empleando como iniciador Persulfato de Sodio (PS)

....................................................................................................................................... 52

Figura 4.3.2.: Estimacin del espectro RMN H1 del quitosano copolimerizado con

AMPS con la unin del mismo mediante una apertura de anillo ............................... 53

Figura 4.3.3.: Estimacin de espectro RMN H1 del quitosano copolimerizado con

AMPS con la unin del mismo a travs de grupos amino ........................................... 54

Figura 4.3.4.: Espectro RMN H1 experimental la muestra copolimerizada SN11.01

sin entrecruzante .......................................................................................................... 55

Figura 4.4.1.: Porcentaje de injerto en funcin del porcentaje de AMPS, porcentaje

de iniciador y porcentaje de entrecruzante tanto para el quitosano Idebio como para

el Protasan .................................................................................................................... 56

Figura 4.4.2.: Mapeo del elemento azufre en las muestras de quitosano Protasan e

Idebio con 10%, 20% y 30% de AMPS respectivamente .............................................. 58

Figura 4.4.3.: Mapeo del elemento fsforo de las muestras de quitosano Idebio con

10% de AMPS. ............................................................................................................... 59

Figura 4.5.1.: Curvas de hinchamiento para los el quitosano Protasan e Idebio

muestras con 10,20 y 30% de AMPS a pH 7,5 y 30% de AMPS a pH 4,0 ................... 60

xiv

Figura 4.5.2.: Esquema de protonacin del grupo amino del quitosano ..................... 61

Figura 4.6.1.: Prdida en peso de las muestras de con 10%, 20% y 30% de AMPS de

quitosano PT e ID ......................................................................................................... 62

Figura 4.7.1.: Valores de la porosidad aparente de acuerdo a la cantidad de AMPS y

TPP para los quitosanos PT e ID ................................................................................. 64

Figura 4.7.2.: Microfotografa de quitosano PT con 10% y 30% de AMPS, a 30X de

magnificacin ................................................................................................................ 65

Figura 4.7.3.: Fotomicrografa de las muestras con 10% de AMPS de quitosano PT y

quitosano ID, a 30X de magnificacin .......................................................................... 66

Figura 4.7.4.: Representacin esquemtica del arreglo estructural del quitosano en

un plano ......................................................................................................................... 67

Figura 4.7.5.: Representacin esquemtica del apilamiento de planos de quitosano.

....................................................................................................................................... 67

Figura 4.7.6.: Fotomicrografas de superficie radial y seccin transversal de la

muestra con 30% de AMPS de quitosano ID a 30x y 100x de magnificacin ............. 68

Figura 4.7.7.: Fotomicrografas de poros grandes y poros pequeos de muestras con

10% y 30% de AMPS de quitosano ID, a 100X de magnificacin ................................ 69

Figura 4.8.1.: DSC para el quitosano PT (muestra SN 11.01) y para el quitosano ID

(muestra SN11.1) .......................................................................................................... 70

Figura 4.8.2.: Peso molecular entre nudos (Mc) en funcin del porcentaje TPP e

iniciador ......................................................................................................................... 72

Figura A.1.: Medicin del grosor y el distanciamiento de las lminas de la muestra

SN1.1 con una magnificacin de X30. Todas las medidas en centmetros ................. 89

Figura A.2.: Medicin del dimetro mayor y menor de los poros grandes y pequeos

de las muestras SN1.1, SN5.1 y SN11.1. Todas las medidas en micrmetros ........... 90

Figura A.3.: Anlisis de las curvas termogravimtricas para la muestra SN1.01

hinchada y seca ............................................................................................................. 93

xv

Lista de Smbolos

NaOH Hidrxido de sodio.

Forma cristalina de la quitina y el quitosano, cadenas orientadas

paralelamente.

Forma cristalina de la quitina y el quitosano, cadenas orientadas

antiparalelamente.

Forma cristalina de la quitina y el quitosano, por cada cadena orientada

hacia abajo hay dos orientadas hacia arriba.

C Grados centgrados.

MC Peso molecular entre nudos.

G Mdulo de almacenamiento.

Tamao de malla o longitud de correlacin.

m Micrmetros.

g Gramos.

mol Moles.

mg Miligramos.

mL Mililitros.

D2O Agua deuterada.

L Microlitros.

M Molar.

DCl Deuterio cloruro.

NaNO2 Nitrito de sodio.

NaOD Hidrxido de sodio deuterado.

K1 Pico del espectro RMN 1H de protn 1 de la quitosa.

H1D Pico del espectro RMN 1H de protn 1 de las unidades GlcN.

xvi

H1A Pico del espectro RMN 1H de protn 1 de las unidades GlcNAc.

K3 Pico del espectro RMN 1H de protn 3 de la quitosa.

HDO Seal del solvente en el espectro RMN 1H.

H2D Pico del espectro RMN 1H de protn 2 de las unidades GlcN.

HAc Pico del espectro RMN 1H de protn 3 del acetil de las unidades

GlcNAc.

NH2 Grupo amino.

Da Dalton.

%G Graft Percentage: Porcentaje de injerto.

%S Porcentaje de azufre.

mti Masa del polmero a cada determinado tiempo i de hinchamiento o

degradacin.

mt0 Masa inicial del polmero.

mh Masa del polmero hinchada a 7 das.

aparente Densidad aparente.

real Densidad real.

etanol Densidad del etanol.

Wa Peso de la muestra en aire.

Wfl Peso de la muestra en etanol.

Mr Peso molecular de la unidad repetitiva.

XTTP Fraccin molar del entrecruzante.

mm Milmetros.

cm Centmetros.

f Funcionalidad del entrecruzante.

R Constante universal de los gases ideales.

T Temperatura.

xvii

v2,s Fraccin volumtrica de polmero hinchado.

v2,r Fraccin volumtrica del polmero en estado relajado.

Pa Pascal.

K Grados absolutos Kelvin.

dis Densidad del disolvente.

ms Masa del polmero hinchado.

mr Masa del polmero en estado relajado.

mo Masa del polmero seco despus de hinchado.

v Volumen especfico del PBS.

cm3 Centmetros cbicos.

V1 Volumen molar del PBS.

Parmetro de interaccin polmero-solvente de Flory-Huggins.

kV Kilovoltios.

ngulo de difraccin.

Grados.

S Azufre.

O Oxgeno.

N Nitrgeno.

H Hidrgeno.

C Carbono.

P Fsforo.

ppm Partes por milln.

s Segundos.

NH3+ Grupos amino protonados.

min Mintos.

xviii

rad Radianes.

xix

Lista de Abreviaturas

AMPS cido 2-acrilamido-2-metilpropano sulfnico.

CSIC Consejo Superior de Investigaciones Cientficas.

JAE Junta para Ampliacin de Estudios e Investigaciones Cientficas.

ICTP Instituto de Ciencia y Tecnologa de Polmeros.

HEMPOL Grupo de Qumica Fsica de Materiales Polimricos Heterogneos.

FUPOL Grupo de Funcionalizacin de Polmeros.

FQMM Grupo de Fsico-Qumica y Modelizacin de Macromolculas.

GlcN Unidades desacetiladas de la cadena de quitina o quitosano.

GlcNAc Unidades acetiladas de la cadena de quitina o quitosano.

MEC Matriz extracelular.

GAGs Glicosaminoglicanos.

3D tres dimensiones.

PGA Poli-cido gliclico.

PLA Poli-cido lctico.

PLAGA Poli-cido gliclico/Poli-cido lctico.

CAD Computer Assisted Design: Diseo computacional asistido.

PT Protasan.

ID Idebio.

PS Persulfato de sodio.

TPP Tripolifosfto de sodio.

TEMED N, N, N 1, N-1-tetrametiletilendiamina.

PBS Phosphate Saline Buffer: Bufer de solucin salina de fosfato.

ASTM American Society for Testing and Materials: Sociedad Americana para

Ensayos y Materiales.

xx

DA Deacetylation Degree: Grado de desacetilacin.

DP Polymerization Degree: Grado de polimerizacin.

1H NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Espectrocopa de

Resonancia Magntica Nuclear de Protn (RMN 1H).

FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy: Espectroscopa Infrarroja con

Transformada de Fourier.

DRX Difraccin de rayos-X.

DSC Differential Scanning Calorimetry: Calorimetra Diferencial de Barrido.

SEM Scanning Electron Microscopy: Microscopa Electrnica de Barrido.

EDS Energy Disperse X-Ray Spectroscopy: Espectroscopia de fluorescencia

de rayos-X de energa dispersa.

NH2 Grupos amino del quitosano.

Mu Muestra.

%P Porcentaje de prdida en peso.

1

INTRODUCCIN

El mal funcionamiento de tejidos y rganos en el cuerpo humano es uno de los

problemas ms frecuentes y devastadores en medicina. Las tcnicas teraputicas

actuales han logrado mejorar la calidad de vida pero estas se encuentran asociadas a

claras limitaciones incluida la disponibilidad del donador, infecciones, pobre

integracin y un potencial rechazo del implante. La medicina regenerativa ha

desarrollado terapias que ayudan a superar estas limitaciones y a encontrar

revolucionarias y poderosas terapias para el tratamiento de enfermedades de

tejidos, con la idea bsica de reparar o recrear tejidos u rganos con el propsito de

restaurar sus funciones. La manera mediante la cual se ha logrado esto es a travs

de la sntesis de emulsiones polimricas de hidrogeles que una vez formados se

pueden secar y obtener andamios porosos donde se pueden cultivar clulas, todo este

sistema se implanta en el cuerpo. Las clulas en el cultivo se adhieren, proliferan y

forman tejido al mismo tiempo que el andamio se degrada y es reabsorbido por el

cuerpo.

El diseo de estos andamios es un proceso complejo, debido a que todo el conjunto

debe ser biocompatible, bioabsorbible y poseer propiedades mecnicas similares a las

del tejido que va a reemplazar. Estas propiedades se obtienen mediante la adecuada

seleccin de los materiales de partida, as como de los mtodos de produccin.

La quitina es el polmero natural ms abundante en el planeta despus de la

celulosa, se encuentra en la concha de los camarones, en algunas algas e insectos. La

quitina se extrae de la concha del camarn mediante procesos de desmineralizacin.

El quitosano se obtiene a travs de la quitina por un mtodo de desacetilacin,

debido a que la quitina por si sola es insoluble, difcil de manipular y no es activa

biolgicamente. El quitosano posee un grado de cristalinidad, de desacetilacin y

como todo polmero un grado de polimerizacin que dictamina el comportamiento del

mismo. Ahora bien, el quitosano se emplea como cadena principal en

2

copolimerizaciones de injerto, aunque existen diferentes injertos uno de los ms

usados es el cido 2-acrilamido-2-metilpropano sulfnico (AMPS) que posee un grupo

inico que cuelga de la cadena principal. Debido a su mimetismo con la heparina el

AMPS inhibe la coagulacin lo que lo convierte en el componente complementario

para el quitosano ya que este no es hemocompatible, es decir, desencadena la

coagulacin por lo que por s solo no puede estar en contacto con la sangre. Adems

de copolimerizarse el conjunto quitosano-AMPS se entrecruza para obtener el

hidrogel, la cantidad de entrecruzante determinar el comportamiento en estado

hinchado de dicho gel, esto incluye el tamao de malla y su desempeo mecnico,

por lo tanto se debe tener especial cuidado en ello. El comportamiento mecnico de

los geles estar controlado en un alto grado por la microestructura de la red

polimrica. Por lo que la modificacin del porcentaje de entrecruzante e injerto,

modificar en cierto grado dicho comportamiento, la determinacin de estos

parmetros es entonces primordial en la sntesis de copolmeros. Del mismo modo la

porosidad de los andamios juega un rol fundamental en el comportamiento en estado

hinchado lo que, como se mencion con anterioridad, se traduce en comportamiento

mecnico.

Por otra parte, el cartlago es un tejido conectivo que est formado principalmente

por una matriz extracelular de colgeno y protenas que le confieren la resistencia

mecnica necesaria para soportar presiones altas (en cartlago articular: rodillas,

codos, muecas, etc.). Embebido en esta matriz se encuentran los condrocitos y los

condroblastos, estas son clulas capaces de crear y destruir el tejido cartilaginoso

respectivamente. Es posible realizar cultivos de condrocitos y condroblastos en

andamios porosos de quitosano con la finalidad de regenerar tejido cartilaginoso. El

objetivo de esta investigacin es por tanto, la preparacin de un andamio

tridimensional bioactivo que permita la regeneracin de cartlago sin la necesidad de

inducir nuevas lesiones en el organismo. As se pretende preparar copolmeros de

quitosano-AMPS y luego preparar andamios porosos con estos.

CAPTULO I

DESCRIPCIN DEL INSTITUTO

Considerado como el mayor instituto de investigacin cientfica en Espaa y el

tercero en Europa, la Agencia Estatal Consejo Superior de Investigaciones

Cientficas (CSIC), adjuntada al Ministerio de Economa y Competitividad de

Espaa, tiene como objetivo principal desarrollar y promover investigaciones en

beneficio del progreso cientfico y tecnolgico, por tanto est a disposicin para la

colaboracin con otras entidades tanto extranjeras como espaolas 1.

1.1. Sobre la Agencia Estatal Consejo Superior de Investigaciones Cientficas

En 1907 es creada por Amalio Gimeno, ministro de Instruccin Pblica y Bellas

Artes, la Junta para Ampliacin de Estudios e Investigaciones Cientficas (JAE) lo

que por medio de ciertas reformas y cambios se convertira en 1939 en el Consejo

Superior de Investigaciones Cientficas. El CSIC cumple un rol primordial en la

poltica tecnolgica y cientfica de Espaa, debido a que comprende tanto la

investigacin bsica como la divulgacin al sector productivo. Adems abarca todos

los mbitos del conocimiento1:

Humanidades y Ciencias Sociales.

Biologa y Biomedicina.

Recursos Naturales.

Ciencias Agrarias.

Ciencia y Tecnologas Fsicas

Ciencia y Tecnologa de Materiales.

Ciencia y Tecnologa de Alimentos.

Ciencia y Tecnologas Qumicas 1.

4

El presidente actual del CSIC es el doctor en Ciencias Fsicas Emilio Lora-Tamayo

DOcn, quien ha dirigido el Instituto desde enero de 2012 1.

Las funciones principales del CSIC son las siguientes:

Investigacin cientfica y tcnica de carcter multidisciplinario.

Asesoramiento cientfico y tcnico.

Transferencia de resultados al sector empresarial.

Contribucin a la creacin de empresas de base tecnolgica.

Formacin de personal especializado.

Gestin de infraestructura y grandes instalaciones.

Fomento de la cultura de la Ciencia.

Representacin cientfica de Espaa en el mbito internacional 1.

Los investigadores del CSIC han elaborado una gran red de relaciones

internacionales de la misma forma que como entidad ha mantenido relaciones

institucionales con entes y organismos de investigacin en casi todo el mundo, con

excepcin de frica donde slo mantienen relaciones con dos pases. Forman parte

del Espacio Europeo de Investigacin 1.

El CSIC est formado por diversos institutos y centros, mixtos y propios que se

encuentran emplazados por toda Espaa. Dentro de estos institutos se encuentra el

Instituto de Ciencia y Tecnologa de Polmeros (ICTP) 1.

1.2. Sobre el Instituto de Ciencia y Tecnologa de Polmeros

El Instituto de Ciencia y Tecnologa de Polmeros (ICTP) es un organismo pblico

de investigacin. Se encuentra localizado en el Centro de Qumica Orgnica Manuel

Lora-Tamao en Madrid. El ICTP tiene como principal objetivo realizar

investigacin en polmeros para el avance cientfico y tecnolgico en estos materiales

2.

Un incremento en los aos 1945-47 en la utilizacin de los plsticos en Espaa y

con la visin de impulso en dicho sector obligaron al CSIC a la creacin de una

5

Seccin de Plsticos en 1947. Posteriormente en el ao 1952 se constituye como

Departamento y para 1967 es llamado Instituto de Plsticos y Caucho, tomando

como emplazamiento la sede actual. Es entonces en 1987 cuando finalmente es

nombrado Instituto de Ciencia y Tecnologa de Polmeros. Siendo su director en la

actualidad el Dr. Daniel Lpez Garca 2.

El ICTP posee mltiples departamentos entre ellos:

Departamento de Fsica de Polmeros, Elastmeros y Aplicaciones

Energticas: con los grupos de Aplicaciones Energticas, Elastmeros y Fsica

de Polmeros.

Departamento de Nanomateriales Polimricos y Biomateriales: con los grupos

de Biomateriales y Nanomateriales Polimricos.

Departamento de Fsica de Polmeros: con los grupos Sistemas Polimricos

Nanoestructurados y Multicomponentes, Qumica-Fsica de Materiales

Polimricos Heterogneos (HEMPOL) y Nanohbridos y Polmeros

Interactivos.

Departamento de Qumica Macromolecular Aplicada: con los grupos de

Fotoqumica de Polmeros, Funcionalizacin de Polmeros (FUPOL) y

Policondensacin y Membranas Polimricas.

Departamento de Qumica y Propiedades de Materiales Polimricos: con los

grupos de Ingeniera Macromolecular, Ingeniera de Polmeros y Fisico-

Qumica y Modelizacin de Macromolculas (FQMM) 2.

Esta investigacin fue realizada particularmente en el grupo de Biomateriales del

departamento de Nanomateriales Polimricos y Biomateriales.

1.3. Sobre el grupo de Biomateriales

El grupo de Biomateriales del ICTP, con 15 aos de antigedad, est centrado en la

creacin y perfeccionamiento de dispositivos biomdicos y bioactivos que otorguen

una contribucin positiva al estado de salud de pacientes, del mismo modo se enfoca

en la preparacin y diseo de sistemas polimricos con una accin teraputica

6

especfica. Dicha actividad es nombrada como Terapia con Polmeros y est

contemplada como uno de las corrientes ms modernas del desarrollo de la

nanomedicina 3.

El trabajo del grupo es diverso, dirigido por el Dr. Julio San Romn, han abarcado

reas como: la liberacin controlada de frmacos, en el rea vascular con stents

coronarios, dispositivos para oftalmologa, membranas para regeneracin de tejido,

entre otros. Adems de obtener numerosas publicaciones en importantsimas

revistas cientficas, muchos de los dispositivos desarrollados han obtenido patentes y

han sido llevadas al mercado 3.

CAPTULO II

MARCO TERICO

2.1. Quitina y Quitosano

La quitina es un elemento abundante en el exoesqueleto de los artrpodos, estos

son: crustceos, arcnidos, insectos, entre otros. Tambin se encuentra presente en

algunos hongos y algas, esto hace que la quitina despus de la celulosa sea la

sustancia orgnica ms abundante del planeta. La quitina es un polisacrido

conformado por un alto porcentaje de poli[-(1-4)-2-acetamida-2-desoxi-D-

glucopiranosa] (en adelante GlcNAc) y con un muy bajo porcentaje de poli[-(1-4)-2-

amino-2-desoxi-D-glucopiranosa] (en adelante GlcN) es denominado quitosano (Ver

figura 2.1.1) 4.

Figura 2.1.1.: Unidades repetitivas de quitina y quitosano 4.

Aunque la quitina posee propiedades de inters biolgico, debido a su insolubilidad

y, por ser inerte, adems de biolgicamente inactiva, es un biopolmero difcil de

manipular. Aunque, si bien la quitina no es citotxica, es decir, no es daina para

8

las clulas, no presenta interaccin con estas debido a que no est desacetilada. Por

tal razn, la quitina es sometida a un proceso del que se hablara a continuacin, con

la finalidad de desacetilar la mayor cantidad de unidades repetitivas posibles. Por

acuerdo tcito se considera quitosano si al menos el 50% del polmero se encuentra

desacetilado 4.

El proceso mediante el cual se extrae la quitina de la fuente ms comn, es decir,

del exoesqueleto de los camarones, es a travs de un proceso de desmineralizacin

con cido clorhdrico y desproteinizacin con hidrxido de sodio. Se obtiene la quitina

y entonces pueda ser desacetilada al ser sometida a temperaturas superiores a 60C

en un medio alcalino muy concentrado. ste medio puede ser una solucin alcohlica

o acuosa de NaOH. Si se desea evitar la depolimerizacin de la quitina y la

generacin de especies reactivas se debe tener cuidado de proteger la reaccin del

oxgeno purgando con nitrgeno o aadiendo borohidrato de sodio.4,5

2.2. Propiedades del quitosano

Biocompatibles: Se conoce que ambos, tanto la quitina como el quitosano, son

materiales altamente biocompatibles, debido a que provienen de fuentes

naturales y poseen baja toxicidad. Sin embargo, el efecto que causan

depender del material de partida y de los mtodos con los que se haya

obtenido dicho quitosano. Por ejemplo, es conocido que generalmente el

quitosano puede mantener clulas vivas e incluso funcionar como soporte de

ciertos tejidos. Pero dependiendo de su arreglo microestructural esta funcin

ser optima o no. Del mismo modo se sabe que el quitosano es citocompatible,

esto significa que las clulas o alguno de sus componentes poseen afinidad

hacia el mismo, de forma tal que las clulas al contacto con el quitosano

rpidamente se adhieren y pueden proliferar de manera apropiada. Esta

capacidad se encuentra asociada a la naturaleza catinica del quitosano, es

por ello que la quitina es menormente usada, ya que mientras mayor sea el

grado de desacetilacin mayor es la densidad de carga. Y como se mencion

con anterioridad la quitina posee 50% o un menor porcentaje de desacetilacin

9

por lo que posee una densidad de carga menor y una citocompatibilidad

reducida 4.

Biodegradables: Esta propiedad es atractiva debido a que el quitosano puede

emplearse en aplicaciones biomdicas. Es conocido que la degradacin del

mismo es enzimtica, especficamente por la enzima lisozima. Esta enzima

hidroltica se encuentra en el mucus nasal, lgrimas y saliva, entre otros

lugares. El quitosano es degradado por sta enzima mediante hidrolisis del

mismo. Los productos de esta hidrlisis son oligosacridos que no son dainos

para el cuerpo humano y que son degradados fcilmente por enzimas. La

aplicacin especfica depende en sumo grado de la velocidad de degradacin

por lo que es un factor trascendente al momento de disear el biopolmero. Es

conocido que la quitina altamente desacetilada no es reconocida por la enzima

lizosima y por lo tanto se degrada lentamente, el quitosano parcialmente

desacetilado se degrada ms rpidamente. La biodegradabilidad est

ntimamente relacionada con la biocompatibilidad, debido a que la una alta

velocidad de degradacin puede ocasionar una respuesta inflamatoria severa

4.

Hipocolesterolmicas: Debido a que interacciona con los lpidos impidiendo su

absorcin en el intestino, consumir quitosano ayuda a mantener un nivel bajo

de colesterol. De esta forma evita que crezcan placas arteriosclerticas o

ateromas, estos es la acumulacin de lpidos en las paredes de las arterias 4.

Mucoadhesivas: El quitosano interacciona con la mucosidad estomacal, por lo

que puede emplearse para el transporte de frmacos, protenas, entre otras

molculas por medio de la mucosa. Una vez ingerido y debido a que es

susceptible a las variaciones intestinales, se disuelve en el pH cido del

estmago y tambin puede ser degradado por enzimas del colon, es usado para

liberacin de compuestos activos en colon, estmago u otras mucosas 4.

Hemocompatibles: El quitosano y la quitina no son hemocompatibles. Esto es,

no pueden ser empleados para prtesis vasculares, es decir, no puede estar en

10

contacto directo con la sangre. La razn es que ambos desencadena el sistema

de complemento y el sistema de coagulacin, debido a que pueden absorber

protenas. El sistema de complemento es parte del sistema inmune y consiste

en una defensa contra los microorganismos que invaden el cuerpo, por otra

parte el sistema de coagulacin se encarga de dar una respuesta para evitar la

prdida de sangre cuando se origina una herida, as como de repararla. Tanto

el quitosano como la quitina al entrar en contacto con la sangre rpidamente

produce una repuesta hemosttica, esto significa que origina de inmediato la

coagulacin de la sangre incluso en condiciones anticoagulantes, en caso del

quitosano. Si bien la quitina posee una respuesta plaquetaria ms intensa, el

quitosano produce mayor acumulacin de glbulos rojos por lo que es mejor

coagulante. De esta manera se ha intentado modificar el quitosano o

combinarlo con otros polmeros que sean capaces de rechazar

electrostticamente las protenas y plaquetas que ocasionan la coagulacin,

esto sin afectar las propiedades anteriores 4,6.

2.2.1. Cristalinidad

La quitina as como el quitosano poseen una estructura cristalina

considerablemente organizada, determinado a partir de los estudios de rayos X. Han

sido evidenciadas tres formas polimrficas , y . Dichas formas se diferencian por

la posicin de las cadenas dentro de las regiones cristalinas. Si bien la forma ms

comn es la -quitina en donde las cadenas se encuentran posicionadas de manera

antiparalela, las otras dos formas se encuentran presentes tambin en menor grado.

La -quitina posee las cadenas en posicin paralela y la -quitina cada dos cadenas

orientada hacia arriba, existe una cadena orientada hacia abajo. Adems de ser la

ms abundante, la forma parece ser la ms estable ya que de forma muy sencilla

se puede convertir a las otras dos formas mediante tratamientos especficos 4.

2.3. Copolimerizacin de Injerto

Existen mltiples formas de modificar qumicamente el quitosano, tales como:

oligomerizacin, alquilacin, acilacin, cuaternizacin, hidroxialquilacin,

11

carboxialquilacin, tiolacin, sulfatacin, fosforilacin, modificaciones enzimticas y

copolimerizacin de injerto. Pero para efectos de esta investigacin, se explicar con

mayor detalle slo la copolimerizacin de injerto 4.

Primeramente se debe comprender que un copolmero se produce por la

polimerizacin en cadena de dos monmeros diferentes. Estadsticamente cada

monmero puede organizarse en el espacio de forma diferente, de all que existan

distintos tipos de copolmeros. En los copolmeros al azar, cada monmero est

posicionado de forma aleatoria a lo largo de la cadena principal, mientras que en los

copolmeros alternantes a un monmero le sigue el otro y as sucesivamente. Para

los copolmeros de bloque, un grupo (bloque) del mismo monmero es sucedido por

un bloque o grupo del otro monmero a lo largo de la cadena principal. Por ltimo los

copolmeros de injerto estn conformados por un monmero en la cadena principal

mientras que el otro monmero parte de la cadena principal en ramificaciones

regulares (ver Figura 2.3.1) 7.

La copolimerizacin de injerto resulta atractiva para la modificacin de las

propiedades tanto fsicas como qumicas de la quitina y en especial del quitosano, de

forma tal que se le puedan dar muchas ms aplicaciones. Las propiedades de este

copolmero dependern de las caractersticas de las cadenas, incluyendo el peso

molecular, el largo de las mimas y la cantidad 7.

Figura 2.3.1.: Representacin esquemtica de la copolimerizacin alternante, de

bloque y de injerto.

12

Ahora bien, la iniciacin de esta copolimerizacin puede suceder mediante

mltiples mtodos. Entre estos se encuentra el uso de iones cerio, estos llevan a cabo

un mecanismo de apertura de anillo a 90C formndose un imina-radical que luego

se hidroliza y forma un aldehdo que por accin del medio cido se oxida y se obtiene

un radical acilo que puede iniciar la polimerizacin. En segundo lugar se encuentra

el reactivo de Fenton que emplea una sal acuosa de hierro y perxido de hidrgeno

para formar radicales hidroxilo que posteriormente generan el macroradical.

Tambin se debe mencionar la radiacin gama y por ltimo el uso de compuestos

redox. Este ltimo es el mtodo empleado en esta investigacin, con un iniciador de

Persulfato de Sodio, que forma un radical libre al extraer un hidrgeno de la cadena

de quitosano creando as el macroradical que posteriormente forman los copolmeros,

mientras que el azufre se reduce y el sodio se oxida. Debido a que el persulfato de

sodio es un compuesto inorgnico y es txico para el organismo, debe ser eliminado

por completo del copolmero si se desea emplear en alguna aplicacin donde debe

estar en contacto con clulas vivas 4,8.

2.3.1. Copolimerizacin con AMPS

El AMPS es uno de los monmeros que puede ser copolimerizado por injerto va

redox. Siendo un monmero aninico que posee un grupo que es un cido fuerte, un

grupo sulfnico, el AMPS est usualmente ionizado en todo el intervalo de pHs 7.

Tiene una cantidad bastante amplia de propiedades que lo han hecho atrayente en

el rea mdica. Los derivados del AMPS en determinadas ocasiones se le pueden

atribuir propiedades superabsorbentes, ya que dicho compuesto tiene una muy

buena capacidad de absorcin, por esta razn es ideal para la sntesis de hidrogeles.

Adems de ser un componente biocompatible su propiedad ms notoria es aquella

ligada a lo que le otorga sus grupos inicos, esto es una naturaleza sulfnica, esta le

brinda la particularidad de ser anticoagulante debido a su similitud a la heparina

(ver Figura 2.3.2). La heparina es una molcula que puede provenir de la mucosa

intestinal del cerdo, estas molculas son cadenas de diferentes tamaos de grupos

13

sulfatos y azcares. El efecto de esta en el organismo es potenciar en un factor de

mil la velocidad de asociacin de la glicoprotena encargada de detener la

coagulacin con el factor de coagulacin, el AMPS causa el mismo efecto pero en

menor grado 7,9.

Figura 2.3.2.: Unidad repetitiva de heparina (derecha) y poli(AMPS) (izquierda) 10,11.

Como se mencion anteriormente el quitosano desencadena la coagulacin al estar

en contacto con la sangre, es por ello que al combinarlo con el AMPS el cual inhibe la

coagulacin disminuye el efecto no hemocompatible del mismo.

En cuanto a las aplicaciones del AMPS fuera del mbito biomdico se encuentra la

formacin de complejos con polielectrolitos lo que lo hace atractivo como componente

activo en el tratamiento de aguas. Por su estabilidad mecnica, trmica e hidroltica

y su naturaleza hidroflica tambin se emplea en el mbito de ltex, adhesivos y

fibras acrlicas as como tambin en determinadas cremas y aceites para el cuidado

personal 7.

2.4. Cartlago

Es un tejido de soporte, avascular y articular esqueltico que consiste en clulas en

una matriz extracelular (MEC) que puede estar o no mineralizada dependiendo del

tipo de cartlago. Dicha matriz es firme y slida pero tambin un poco maleable. El

14

cartlago es depositado por clulas productoras de cartlago, como los condroblastos y

condrocitos, y removido por condroclstos. Las clulas cartilaginosas estn

separadas unas de otras por matrices pericelulares y extracelulares y su composicin

es fundamental para la supervivencia de los condrocitos ya que no existe una red

vascular en el tejido. Al contrario de las clulas de los huesos, los condrocitos no

poseen procesos celulares 12,13.

La MEC hidratada del cartlago vertebral est compuesta principalmente por

glicosaminoglicanos (GAGs), ciertos sulfatos de condroitinas y proteoglicanos. Los

GAGs se encuentran en grandes cantidades dentro de la MEC y facilita la difusin

de sustancias entre los vasos sanguneos del tejido conjuntivo prximo y los

condrocitos que se encuentra dentro de la matriz, de esta forma se puede sustentar

la viabilidad del tejido. Por otra parte los proteoglicanos soportan el peso, sobre todo

en aquellos puntos donde el movimiento es constante, por ejemplo las articulaciones

sinoviales 12,13.

El colgeno es una protena extracelular que se organiza en forma de fibrillas que

poseen una alta resistencia tensil, por lo que es fundamental en los tejidos

conectivos como lo es el cartlago. Existen 20 tipos de colgeno segn la organizacin

de las 33 cadenas polipeptdicas que poseen los mamferos. En el tejido cartilaginoso

el colgeno mayoritario es colgeno tipo II 14.

El cartlago resiste presin, tiene un alto contenido de fluido, es un tejido

anaerbico por lo que tiene un consumo de oxgeno bajo. En la etapa embrionaria de

los vertebrados el cartlago posee funciones de tejido endoesqueletico (cartlago

primario). Posteriormente se transforma en cartlago articular y su funcin es como

tejido articular en las uniones de los huesos endocondrales 12.

Los tipos de tejido cartilaginoso se diferencian segn las caractersticas de la

matriz y son diferentes en lo referente a prestaciones mecnicas y aspecto 13.

15

Hialino: En este tipo de cartlago las fibras presentes en la MEC son de

colgeno tipo II, tambin la matriz contiene proteoglicanos, GAG y protenas

multiadhesivas 13.

Elstico: Adems de poseer el material extracelular del cartlago hialino

posee lminas y fibras elsticas 13.

Fibroso: Posee gran cantidad de fibras de colgeno tipo I as como tambin el

material extracelular del hialino 13.

En la tabla 2.4.1 se presenta la ubicacin, funcin y algunas otras caractersticas

de cada tipo de cartlago.

El cartlago articular que se encuentra en constante compresin y modificacin del

contenido de agua para soportar las cargas aplicadas progresivamente se desgasta,

los condrocitos reciben seales qumicas y elctricas de la MEC y proceden a formar

cartlago nuevo. Con el transcurso del tiempo tanto la matriz como los condrocitos no

son capaces ni de enviar ni de recibir seales por lo que la produccin de cartlago se

detiene. Por otra parte una vez ocasionada alguna lesin en el cartlago articular,

este no vuelve a crecer. Tambin existe la enfermedad articular denominada artrosis

que consiste en la disminucin de proteoglicanos y de la inhibicin de la produccin

de este y de colgeno tipo II por parte de los condrocitos lo que degenera en un dao

al tejido, esta enfermedad es ms comn en personas de avanzada edad 13.

16

Tabla 2.4.1.: Caractersticas de los distintos de tipos de cartlagos: hialino, elstico

y fibroso 13.

Caracterstica Cartlago hialino Cartlago elstico Cartlago fibroso

Ubicacin

Tejido esqueltico fetal, discos

epifisarios, superficie

articular, cartlagos costales,

cartlagos de las cavidades

nasales, laringe, anillos

traqueales, placas

cartilaginosas bronquiales

Pabelln auricular, conducto

auditivo externo, algunos

cartlagos larngeos

Discos intervertebrales, discos

articulares (articulaciones

esternoclavicular y

temporomandibular),

meniscos, articulacin de la

mueca, inserciones

tendinosas

Funcin

Resistente a la compresin,

provee amortiguacin,

superficie lisa y de baja

friccin para las

articulaciones, sostn

estructural en el aparato

respiratorio, constituye el

fundamento del desarrollo del

esqueleto fetal, la osificacin

endocondral y el crecimiento

de los huesos largos

Provee sostn flexible Resiste la deformacin por

fuerzas externas

Tipos

celulares Condroblastos, condrocitos Condroblastos, condrocitos Condrocitos, fibroblastos

Componentes

tpicos de la

matriz extra

celular

Fibrillas de colgeno de tipo

II, agrecano (proteoglicano

ms importante)

Fibrillas de colgeno de tipo

II y fibras elsticas,

agrecano

Fibras de colgeno de los tipos

I y II, versicano (proteoglicano

secretado por los fibroblastos)

Crecimiento Intersticial y por aposicin; muy limitado en los adultos

Reparacin Capacidad muy limitada; en general forma una cicatriz con generacin de cartlago fibroso

17

2.5. Geles polimricos

Los geles polimricos son redes entrecruzadas de polmeros que se comportan como

slidos viscoelsticos. Debido a que la red polimrica se encuentra entrecruzada, la

red del gel consiste en una cadena polimrica muy larga y ramificada que se

expande a lo largo del mismo. Aunque los geles pueden ser suaves y deformables

tambin pueden mantener su forma como los slidos. Dependiendo de la estructura

fsica de la red polimrica, los geles polimricos se pueden clasificar como fuertes,

dbiles y pseudo geles. Geles polimricos qumicamente entrecruzados son

considerados geles fuertes. Los entrecruzamientos son permanentes y no pueden ser

restituidos si se rompen. Geles dbiles contienen entrecruzamientos que pueden

separarse y restituirse como los geles coloidales 15.

Las propiedades de los geles polimricos pueden controlarse mediante la

manipulacin de la microestructura del polmero y del lquido que lo rodea, si

hubiera alguno. La resistencia de un gel es generalmente proporcional a la densidad

de entrecruzamientos. Los geles ms rgidos poseen una mayor densidad de

entrecruzamientos. Un gel puede hacerse ms flexible aumentando el espacio entre

los entrecruzamientos o nodos, as como tambin diluyendo el gel en un lquido o

incrementando el peso molecular de la cadena polimrica que conecta los nodos, ste

ltimo es denominado peso molecular entre nudos y existen diferentes modelos

tericos para determinarlo 15.

Alternativamente, pueden aadirse defectos a la red polimrica. Para un polmero

dado, un polmero ideal entrecruzado por final de cadena es aquel en el que todas las

cadenas polimricas se encuentran conectadas en cada final a un entrecruzante y

todos los entrecruzantes se encuentran enlazados completamente a la red

polimrica, dicho polmero tendr el mayor de los mdulos. Si existe un desbalance

entre el nmero de cadenas polimricas y entrecruzante, entonces los defectos se

introducen en la red como loops y finales de cadena colgantes, esto se traduce en

geles ms flexibles. Los geles formados por proceso aleatorios como irradiacin,

18

formarn redes con muchos defectos (ver Figura 2.5.1). As, para aplicaciones

determinadas, existen mltiples formas de ajustar las propiedades del gel polimrico

para optimizar su desempeo mediante el control de la microestructura del gel y las

condiciones de procesamiento 15.

Figura 2.5.1.: Representacin esquemtica de la microestructura de un gel

polimrico: a) polmero ideal entrecruzado por final de cadena; b) gel entrecruzado

por final de cadena con cadenas colgantes (verdes) y loops (naranjas); c) polmero

entrecruzado aleatoriamente 15.

La compleja estructura de los geles polimricos causa una respuesta del gel a

fuerzas externas que vara extensamente dependiendo de la escala de tiempo de la

aplicacin de la fuerza (viscoelstico). En pocas palabras, un gel es un conjunto de

polmeros. En una solucin diluida, las cadenas polimricas tienen un espectro de

tiempos de relajacin que definen que tan rpido un polmero puede relajarse a

partir de una deformacin. Las deformaciones estiran y alinean segmentos de

polmero, reduciendo el nmero de conformaciones posibles y por lo tanto reduce la

entropa del polmero. Para un gel polimrico, el peso molecular efectivo es infinito,

as como el tiempo de relajacin esto significa que la red nunca se relajara por

completo de una deformacin. Pero, al contrario de un slido elstico, los geles

polimricos pueden sufrir rearreglos internos y disipar energa lo que le confiere un

19

carcter viscoelstico. Esto es cierto especialmente para polmeros que poseen un

largo de cadena tal que pueden permitirse enredos moleculares consigo mismo 15.

2.5.1. Comportamiento en estado hinchado

Debido a que los geles tienen aplicaciones biomdicas, en la mayora de los casos

dichos geles pasaran a estar sumergidos en agua o en fluidos biolgicos. Geles

polimricos hinchados en lquido son denominados hidrogeles. Es importante

mencionar que aparte de poseer comonomeros unidos por enlaces covalentes y

entrecruzamientos tambin pueden poseer puentes de hidrgeno e interacciones de

van der Waals entre las cadenas 16.

Ahora bien el comportamiento fsico de los hidrogeles depende de su

comportamiento dinmico y en equilibrio en estado hinchado, desde su preparacin

deben de estar en contacto permanente con agua para que la reaccin tenga un buen

rendimiento. Una vez que se extrae el agua de dicho polmero mediante mtodos que

sern explicados ms adelante, ste xerogel (hidrogel ya seco) es colocado en agua o

en lquido biolgico. Entonces, las cadenas macromoleculares interaccionarn con las

molculas del solvente con las que comparten una relativamente buena

compatibilidad termodinmica. Finalmente, la red se expande hasta el estado

solvatado 16.

La teora de Flory-Huggins puede ser usada para calcular las cantidades

termodinmicas relacionadas a este proceso mixto. Flory fue el creador de la

primera teora del hinchamiento de geles polimricos entrecruzados usando una

distribucin Gaussiana de las cadenas polimricas. Su modelo describe el grado en el

cual una red polimrica se rige por las fuerzas elsticas retractivas de las cadenas

polimricas y la compatibilidad termodinmica de las molculas del polmero y el

solvente. A partir de este modelo Peppas y Merrill desarrollaron un modelo que

considera los volmenes del polmero despus de entrecruzado (estado relajado),

hinchado y seco despus de hinchado, este modelo es al que se le denomina mtodo 2

en esta investigacin. Por otra parte existe otro modelo que considera medidas

20

viscoelsticas para determinar el peso molecular entre nudos, de esta manera se

puede determinar MC a partir de medidas experimentales del mdulo de

almacenamiento G 16.

2.5.2. Geles sensibles al pH

Uno de los tipos de hidrogeles ms estudiados segn su respuesta fisiolgica, son

aquellos que responden a los cambios de pH. Estos hidrogeles son redes inicas

hinchadas que contienen cidos o bases como grupos colgantes, se debe recordar que

el AMPS posee un grupo cido colgante. En medio acuoso con pH apropiado y fuerza

inica, los grupos colgantes pueden ionizarse desarrollando cargas fijas en el gel.

Todos los materiales inicos exhiben sensibilidad al pH y fuerzas inicas. Las

fuerzas de hinchamiento desarrolladas en este sistema se incrementan con respecto

a los materiales no inicos. Este incremento en las fuerzas de hinchamiento se debe

a la localizacin de las cargas fijas de los grupos colgantes 16.

2.5.3. Tamao de la malla

El transporte de soluto hacia adentro del hidrogel se asume que es llevado a cabo

primordialmente por las regiones llenas de agua delimitadas por las cadenas

polimricas. El tamao promedio de estos espacios es denominado tamao de malla

o longitud de correlacin (). De esta forma cualquier factor que reduzca este tamao

retardara la difusin de soluto hacia dentro del hidrogel. En general para un

polmero covalentemente entrecruzado, la difusin de soluto decrece con el aumento

de la densidad de entrecruzamientos y el aumento de tamao de soluto. Pero para

hidrogeles inicamente entrecruzados con pequeos cambios de pH el tamao de

malla cambiar significativamente y con esto la difusin 17.

2.6. Andamios

La medicina regenerativa o ingeniera de tejidos desde sus orgenes ha crecido

rpidamente y ha atrado el inters de muchos cientficos y cirujanos alrededor del

mundo. Actualmente, la medicina regenerativa abarca diferentes estrategias para la

21

creacin de nuevo tejido incluyendo el uso de clonacin, de clulas aisladas, de

estructuras no celulares y de construcciones celulares. Dichas construcciones

consisten en un cultivo in vitro de clulas bajo condiciones de control preciso en un

material tridimensional poroso que acta como un andamio para el crecimiento

celular y la proliferacin. Una vez implantado en el cuerpo humano, el andamio es

eventualmente bioabsorbido y el espacio que ocupa es reemplazado por el nuevo

tejido producido por las clulas (ver Fiugra 2.6.1) 18.

Figura 2.6.1.: Representacin del proceso de implantacin de una construccin

celular 18.

Entonces se define como andamio a un soporte, vehculo surtidor o matriz que

facilita la migracin, fijacin y transporte de las clulas o molculas bioactivas

usadas para reemplazar, reparar o regenerar tejidos. Es importante mencionar que

los andamios de ltima generacin intentan ser tan biomimticos como sea posible,

en trminos de desempeo mecnico, morfologa 3D y qumica superficial, y son

diseados de acuerdo a estos lineamientos 18.

Los andamios funcionales deben por lo menos seguir los siguientes requerimientos:

ser biocompatibles; tener propiedades mecnicas consistentes con las del tejido al

22

que van a reemplazar; ser bioreabsorbibles; degradarse a una velocidad igual a la

formacin del nuevo tejido; tener unas propiedades superficiales para permitir la

adhesin, proliferacin y diferenciacin celular as como para promover formacin de

matriz extracelular; y tener unas propiedades estructurales optimas en trminos de

tamao de poro, porosidad, interconectividad de poros, y permeabilidad de modo que

permitan la eficiente difusin de nutrientes y remuevan los desperdicios. Debido a

este ltimo requerimiento controlar el tamao de malla es fundamental 18.

Todas estas propiedades dependern fundamentalmente del material empleado

para realizar el andamio y del mtodo de elaboracin, por lo que se debe tener

especial cuidado en estos dos aspectos. Si bien ya es conocido que el mtodo

empleado para sintetizar el hidrogel usado en esta investigacin es mediante

copolimerizacin de injerto con entrecruzante, el producto obtenido es un hidrogel

que se encuentra en solucin, existen diferentes mtodos para secar dicho hidrogel y

obtener el andamio poroso que se requiere 18.

Usando la misma tecnologa empleada para la industria textil, en los inicios de la

ingeniera de tejidos se realizaban fibras de 10-15 m de polmeros como el PGA

(poli-cido gliclico) y PLA (poli-cido lctico) que conformaban tejidos muy porosos

(ms de 95%). Otra tcnica es la lixiviacin de partculas, en la cual una solucin

polimrica es colocada en un molde que contiene partculas de la dimensin de poro

deseada. Despus de la evaporacin del solvente, las partculas son lixiviadas por

inmersin en agua, se preparaba por este mtodo polmeros como PLA y PLAGA

(PLA/PGA). Una de los ms recientes mtodos de fabricacin es mediante tcnicas

computarizadas que involucran el diseo del modelo del andamio a travs de

sistemas CAD (Computer Assisted Design: Diseo computacional asistido), de esta

forma se obtiene la estructura precisa de cada poro, luego se construye el modelo

mediante impresin aditiva o impresin 3D. Aunque existen otros mtodos el ms

verstil y econmico es la liofilizacin o secado por congelacin, esta consiste en

congelar la solucin polimrica de forma tal que la estructura del lquido quede

fijada. El agua y/o solventes orgnicos subsiguientemente son extrados por

sublimacin, colocando la solucin congelada en vaco, y dejando un polmero con

23

una porosidad usualmente mayor a 90%. Las desventajas de este ltimo mtodo es

que consume tiempo y energa, y puede tardar varios das en secarse por completo 18.

Los andamios de quitosano, han sido ampliamente investigados para el cultivo de

condrocitos, estos han respondido positivamente produciendo colgeno de tipo II y

glicosaminoglicanos, que como se mencion anteriormente son parte de la matriz

extracelular del cartlago hialino y no slo le otorgan a este las propiedades

mecnicas sino que funciona como receptor y transmisor de impulsos que activan su

regeneracin. De esta forma se ha logrado el crecimiento de tejido cartilaginoso

sobre andamios porosos de quitosano 19.

CAPTULO III

DISEO EXPERIMENTAL

3.1. Materiales

Quitosanos clorados: Protasan UP CL 2013 (Novamatrix C.A.) e Idebio (Idebio

S.L.). En adelante PT e ID, respectivamente.

cido 2-Acrilamido-2-Metilpropano Sulfnico (Alfa Aesar): Este ser el

copolmero y en adelante se denominar AMPS. (Peso molecular: 207,25 g/mol

y 98% de pureza).

Persulfato de Sodio (Sigma-Aldrich Co): Se emplear como iniciador y se

mencionar como PS. (Peso molecular: 238,1 g/mol y 98% de pureza).

Tripolifosfato de Sodio (Sigma-Aldrich Co): Usado como entrecruzante y

nombrado como TPP. (Peso molecular: 367,864 g/mol y 85% de pureza).

Figura 3.1.1: Estructura qumica del tripolifosfto de sodio 7.

N,N,N1,N 1-tetrametiletilendiamina (Acros Organics): Cumple la funcin de

acelerador y se abreviar como TEMED. (Peso molecular: 116,2 g/mol y 99%

de pureza).

25

Tapn fosfato salino (Phosphate Saline Buffer): PBS (pH 7,4 y pH 4,0).

3.2. Caracterizacin de los reactivos de partida

En primer lugar se determin el grado de desacetilacin (DA: Deacetylation

Degree) y el grado de polimerizacin (DP: Polymerization Degree) de ambos

quitosanos clorados, mediante la norma ASTM (American Society for Testing and

Materials: Sociedad Americana para Ensayos y Materiales) 2260-03: Determinig

Degree of Deacetylation in Chitosan Salts by Proton Nuclear Magnetic Resonance

(1H NMR) Spectroscopy (Determinacin del Grado de Desacetilacin de Sales de

Quitosano mediante Espectroscopia de Resonancia Magntica Nuclear de Protn

(RMN 1H)).

Siguiendo el procedimiento indicado en dicha norma, se tom 33 mg de cada

quitosano, PT e ID. Posteriormente, cada uno, fueron disueltos en 3,3 mL de agua

deuterada (D2O) agitndose fuertemente hasta su completa disolucin. A

continuacin se aadi 250 L de una solucin 1M de deuterio cloruro (DCl) y se

agit, chequendose si el pH de cada solucin era menor a 2. Se agreg 100 L de

una solucin recin hecha de nitrito de sodio (NaNO2), con una concentracin de 10

mg/mL en D2O. Ambas muestras fueron almacenadas en la oscuridad durante

cuatro horas. Despus de esto empleando unas soluciones de 0,1M y 1M de

deuterxido de sodio (NaOD) se ajust el pH de ambas muestras entre 3,8 y 4,2.

Finalmente se transfiri 0,7 mL de cada muestra a un tubo de RMN 1H para su

posterior anlisis, mediante un espectrmetro de resonancia magntica nuclear

Bruker Avance 3000. Se debe acotar que para otras sales de quitosano el

procedimiento es diferente, pero a efectos de esta investigacin no son necesarios.

Una vez obtenidos los espectros de cada muestra se obtiene el valor de la integral

(rea bajo la curva) de los siguientes picos 20:

26

Figura 3.2.1.: Tpico espectro RMN 1H de un quitosano clorado con un porcentaje de

desacetilacin de 85% 20.

Los picos asignados por la anterior norma se describen de la siguiente forma:

Tabla 3.2.1.: Asignacin de los protones a cada pico del espectro RMN 1H de

quitosanos clorados 20.

Denominacin Protn

K1 1 de la quitosa

H1D 1 de las unidades GlcN

H1A 1 de las unidades GlcNAc

K3 3 de la quitosa

HDO Seal del solvente (D2O)

H2D 2 de las unidades GlcN

HAc 3 del acetil de las unidades GlcNAc

27

Una vez identificados los picos y calculadas sus integrales, se procede a la

determinacin del grado de desacetilacin y de polimerizacin empleando las

ecuaciones:

Ecuacin 3.2.120

Ecuacin 3.2.220

Donde A y D son:

(

)

Ecuacin 3.2.320

Ecuacin 3.2.420

Tambin se emple el software ChemDraw Ultra (Versin 12.0.2.1076) para

realizar las estimaciones de los espectros RMN 1H con la finalidad de comparar con

los experimentales y contribuir a la diferenciacin de los picos especficos.

En segundo lugar se les realiz a ambos quitosanos Espectroscopia Infrarroja con

Transformada de Fourier (FTIR: Fourier Transform Infrared Spectroscopy)

empleando un espectrofotmetro Perkin-Elmer Spectrum One. Para el anlisis se

us una cantidad pequea de cada muestra de quitosano.

Asimismo se aplic difraccin de rayos-X (DRX) a cada quitosano, empleando un

difractmetro Bruker D8 Advance.

Por otra parte se analiz el AMPS con la finalidad de reflejar en un espectro FTIR

los grupos funcionales que podran existir cuando ste sea introducido a los

quitosanos. Del mismo modo se obtuvo un espectro RMN 1H y su respectiva

estimacin mediante software.

28

3.3. Sntesis de copolmeros entrecruzados quitosano-AMPS

Para la realizacin de los copolmeros fue necesaria la preparacin de las siguientes

soluciones: una solucin de quitosano con 5 g de quitosano PT en 100 mL agua. Se

debe resaltar que el quitosano ID fue necesario diluirlo en cido actico. Se disolvi

10 g de quitosano ID en 800 mL de una solucin de cido actico (5,72%). Tambin

se prepar una solucin de AMPS con 20 g en 100 mL (1M) de agua. Asimismo una

solucin de PS con 5g en 100 mL de agua. Por ltimo una solucin de TPP de 1% o

5% (peso/volumen) en base a la concentracin de quitosano ms AMPS.

La reaccin se realiz bajo atmsfera de nitrgeno. Para ello se verti en un baln

de dos bocas de 100 mL las respectivas cantidades de quitosano, AMPS, PS, TEMED

y TPP (ver Figura 3.3.1). Primero se coloc el quitosano dejando burbujear nitrgeno

durante cinco minutos, luego se adicion el AMPS y con la ayuda de un agitador

magntico, a continuacin se aadi rpidamente el PS y el TEMED y finalmente el

TPP. Se complet los 100 mL de reaccin con agua ultra pura por lo que el TPP para

el quitosano PT fue disuelto en 100mL, mientras que para el quitosano ID fue

disuelto en 50mL. Los tiempos de reaccin fueron de 2 horas. Se coloc un tapn con

un globo cuya funcin es mantener la atmsfera de nitrgeno dentro del baln

durante toda la reaccin. A continuacin se presentan las concentraciones de los

reactivos de cada muestra.

29

Tabla 3.3.1: Porcentaje de reactivos en funcin de la cantidad de quitosano.

Quitosano AMPS PS/TEMED TPP Nombre Tiempo de

Dilisis Peso (mg) Porcentaje

0,1

87% 10% 1% 1% SN1.01**

24 horas

82% 10% 1% 6% SN2.01*

85% 10% 2% 1% SN3.01

80% 10% 2% 6% SN4.01

77% 20% 1% 1% SN5.01

72% 20% 1% 6% SN6.01

75% 20% 2% 1% SN7.01

70% 20% 2% 6% SN8.01

67% 30% 1% 1% SN9.01

61% 30% 1% 7% SN10.01

63% 30% 3% 1% SN11.01

57% 30% 3% 7% SN12.01

1,0

87% 10% 1% 1% SN1.1

48 horas

82% 10% 1% 6% SN2.1

84% 10% 2% 1% SN3.1

80% 10% 2% 6% SN4.1

76% 20% 1% 1% SN5.1

72% 20% 1% 6% SN6.1

74% 20% 2% 1% SN7.1

69% 20% 2% 6% SN8.1

66% 30% 1% 1% SN9.1

61% 30% 1% 7% SN10.1

63% 30% 3% 1% SN11.1

58% 30% 3% 7% SN12.1

Quitosano PT

Quitosano ID

30

Figura 3.3.1.: Montaje realizado para la sntesis de los copolmeros entrecruzados.

Una vez finalizada la reaccin se realiz la dilisis de las muestras de hidrogeles

(cada muestra son 100 mL), colocando las mismas en membranas de dilisis

Spectrum Laboratories Inc con un tamao de poro de 3500 Da. Esto a su vez fue

sumergido en 1 litro de agua ultra pura en constante agitacin, las muestras con

0,1% de quitosano (quitosano PT) fueron dializadas por 24 horas mientras que las

muestras con 1% (quitosano ID) de quitosano se dializaron por 48 horas cambiando

el agua a 24 horas. Al finalizar la dilisis se procede a congelar la muestra y

colocarla en un liofilizador TELSTAR LyoQuest, usualmente hasta que se

encontrara totalmente seca, normalmente de 24 a 48 horas. Finalizado el liofilizado

se procedi a pesar cada muestra.

3.4. Mecanismo de Copolimerizacin de Injerto

Como ya se ha mencionado surgen dos mecanismos de copolimerizacin para el

sistema quitosano-AMPS por lo que para dilucidar cul de los dos ocurre realmente,

31

se obtuvieron las estimaciones de los espectros RMN 1H as como tambin el

espectro experimental.

3.5. Porcentaje de Injerto (%G: Grafting Percentage)

El porcentaje de injerto puede ser determinado mediante el anlisis elemental de

cada muestra. Se emple un analizador elemental de carbono, hidrogeno, nitrgeno

y azufre LECO CHNS-932. As el porcentaje de injerto se puede calcular a partir del

contenido de azufre (%S), de la siguiente forma:

Ecuacin 3.5.1

Luego la fraccin de AMPS es:

Ecuacin 3.5.2

As el porcentaje de AMPS o el porcentaje de injerto es:

Ecuacin 3.5.3

3.6. ndice de Hinchamiento (SI: Swelling Index) y degradacin

Para realizar el hinchamiento de las muestras, se coloc por separado un pequeo

cubo de las siguientes muestras SN2.01, SN2.1 (ambas con 10% AMPS), SN6.01,

SN6.1 (ambas con 20% AMPS), SN10.01 Y SN10.1 (ambas con 30% AMPS), en una

rejilla metlica. Se pes el conjunto, rejilla y muestra, y una a la vez se sumergi en

PBS. Se pesaron a los 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90 y 120 segundos, llevando a cabo

tres repeticiones por cada muestra. Esto se realiz a pH 7,4 y para las muestras con

30% de AMPS a pH 4,0 se realizaron medidas a 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 180,

240, 300, 600, 1200, 1800, 3600 y 7200 (dos horas).

Se determina el SI mediante la siguiente ecuacin:

32

Ecuacin 3.6.1

Donde mti es la masa a cada determinado tiempo i y mt0 es la masa inicial.

Para evaluar la degradacin, las muestras permanecieron en las rejillas

sumergidas por siete semanas. Se midi el peso semanalmente. El pH se midi

primeramente a diario para determinar si exista un cambio, cuando el cambio fue

mayor a 0,2 decimales, se reemplaz la solucin de PBS.

La degradacin se midi en funcin del porcentaje de prdida en peso, calculndose

de siguiente forma:

Ecuacin 3.6.2

Donde mh es la masa de la muestra hinchada a los 7 das.

3.7. Porosidad

La porosidad se determina con la siguiente ecuacin:

Ecuacin 3.7.121

As que se debi determinar tanto la densidad aparente como la densidad real. La

densidad aparente se determina mediante la medicin de la masa de un trozo de

muestra en el aire (Wa) y luego sumergida en etanol (Wfl). Luego se obtiene la

densidad de la siguiente forma, estos valores fueron obtenidos por una balanza de

cuarzo arrojando el resultado directo de la densidad, se realizaron 4 repeticiones de

cada muestra para obtener as un promedio 21:

Ecuacin 3.7.2 21

Por otra parte la densidad real se obtiene haciendo uso de un picnmetro

micromeritics AccuPyc 1330, las muestras se insertaron molidas al cubilete del

33

picnmetro. Dicho equipo realiza 10 mediciones sucesivas de la densidad empleando

helio y proporciona un promedio con su respectivo error.

3.8. Peso Molecular Entre Nudos (Mc)

Para determinar el peso molecular entre nudos terico se hizo uso de la siguiente

ecuacin:

Ecuacin 3.8.122

Donde Mr es el peso molecular de la unidad repetitiva y XTPP es la fraccin molar de

entrecruzante. Existen mltiples mtodos para determinar experimentalmente

dicho peso molecular. Pero para esta investigacin se emplearon dos principales

modelos. El modelo viscosimtrico y el modelo de Peppas y Merrill.

Para el modelo viscosimtrico (mtodo 1) se hizo uso de un remetro TA

INSTRUMENTS AR G2 con una geometra de plato con estras y trampa de

disolvente de 20 mm de aluminio. Primeramente se determin cual era el intervalo

viscoelstico lineal para as definir una frecuencia que garantizara dicha linealidad.

Se realiz entonces un ensayo a frecuencia constante para obtener el mdulo de

almacenamiento (G) de las muestras SN1.01, SN2.01, SN3.01, SN5.01, SN9.01,

SN10.01, SN11.01, SN1.1, SN2.1, SN3.1, SN5.1, SN9.1, SN10.1 y SN11.1. Las

muestras se cortaron en discos de 20 mm de dimetro aproximadamente y 1 cm de

espesor. Luego fueron sumergidas en PBS (pH 7,4) por 2 minutos. Una vez

hinchadas se colocaron en el remetro. Se hicieron 3 repeticiones de cada muestra.

Se siguieron las siguientes ecuaciones para determinar el peso molecular entre

nudos a partir del mdulo elstico:

(

)

Ecuacin 3.8.222

En dicha ecuacin f es la funcionalidad del entrecruzante (para el TPP es 5), es la

densidad real de la muestra, R la constante universal de los gases ideales (8314470

cm3Pa/molK) y T la temperatura de ensayo (20C=293K) Los valores dev2,s y v2,r se

34

denominan fraccin volumtrica del polmero hinchado y fraccin volumtrica del

polmero en estado relajado respectivamente. Estas fracciones se obtuvieron as:

[

] Ecuacin 3.8.322

[

] Ecuacin 3.8.422

Donde real y dis son la densidad real del polmero y la densidad del disolvente

(PBS considerado agua con una densidad de 1 g/cm3).Las masas ms, mr y mo son la

masa del polmero hinchado (en PBS), la masa del polmero en estado relajado y la

masa del polmero seco despus de hinchado respectivamente.

Se desea entonces conocer la temperatura a la cual se puede secar el polmero

hinchado de forma tal que no ocurra ningn cambio. De esta forma se realiza un

anlisis de calorimetra diferencial de barrido (DSC: Differential Scanning

Calorimetry) a una muestra con quitosano PT (SN11.01) y otra con quitosano ID

(SN11.1) en un PerkinElmer DSC 8500.

La medicin de las masas se realiz en un analizador termogravimtrico TA

Instruments TGA Q500. Conociendo la temperatura de a la cual se pueden secar las

muestras a partir del DSC, se aplic dicha temperatura (90C) por media hora a una

muestra sin hinchar, el peso final de esta corrida ser el peso mr. Luego se aplic la

misma temperatura por una hora a las muestras previamente hinchadas en PBS

(pH 7,5) por dos minutos, la masa inicial de dicha corrida ser ms y la masa final mo.

Finalmente se calcul el peso molecular entre nudos tambin mediante el modelo

de Peppas y Merrill (mtodo 2), se determina a partir de la siguiente ecuacin:

[

]

[ ( )

] Ecuacin 3.8.522

Siendo v el volumen especfico del PBS (considerado agua 1 cm3/g) y V1 es el

volumen molar del PBS (considerado agua 18 mol/cm3). es el parmetro de

35

interaccin polmero-solvente de Flory-Huggins y se determina de la siguiente

forma:

Ecuacin 3.8.622

3.9. Microscopa Electrnica de Barrido (SEM: Scanning Electron Microscopy)

Una pequea porcin de las muestras con 10 (SN1.01 y SN1.1), 20 (SN5.01 y

SN5.1) y 30% (SN11.01 y SN11.1) de AMPS, se tomaron para introducirlo en un

microscopio electrnico de barrido HITACHI SU8000 con un voltaje de aceleracin

de 0,5 kV. Se registraron imgenes a 30X y 100X as como tambin se realiz un

mapeo de fsforo, azufre, nitrgeno y oxgeno. Asimismo se llev a cabo un mapeo de

azufre mediante espectroscopia de fluorescencia de rayos-X de energa dispersa

(EDS: Energy Disperse X-Ray Spectroscopy).

CAPITULO IV

RESULTADOS Y DISCUSIN

4.1. Caracterizacin de los quitosanos

4.1.1. Determinacin del grado de desacetilacin (DA: Deacetylation Degree)

y el grado de polimerizacin (DP: Polymerization Degree)

A continuacin se presentan los espectros obtenidos mediante Resonancia

Magntica Nuclear de Protn, RMN 1H (1H NMR: Proton Magnetic Resonance

Spectroscopy) de ambos quitosanos empleados para la formulacin de andamios,

preparados segn la norma ASTM 2260-03 (American Society for Testing and

Materials: Sociedad Americana para Ensayos y Materiales) anteriormente

mencionada. Se debe indicar que esta tcnica se basa en las propiedades magnticas

de los protones contenidos en los tomos de hidrgeno, por lo que cada pico

corresponde al protn de un tomo de hidrogeno de alguna de las especies, dicha

tcnica es muy poderosa para determinar la estructura de compuesto orgnicos 23.

37

Figura 4.1.1.: Espectro RMN 1H de la solucin preparada a partir de quitosano PT

(Protasan).

38

Figura 4.1.2.: Espectro RMN 1H de la solucin preparada a partir del quitosano ID

(Idebio).

Empleando las ecuaciones 3.2.1, 3.2.2, 3.2.3 y 3.2.4, se obtiene tanto el grado de

desacetilacin como el grado de polimerizacin. Se debe dejar claro que segn la

norma, este grado de polimerizacin corresponde a la cantidad de unidades

repetitivas en la cadena. Con el fin de explicar el origen de este valor, es necesario

realizar las estimaciones de RMN 1H correspondientes a las molculas que, en

principio, deben encontrarse presentes en las soluciones preparadas 20.

Ahora bien, segn esta norma para una correcta obtencin de los espectros las

cadenas deben poseer mucha movilidad por lo que el quitosano debe tener un bajo

grado de polimerizacin, por lo tanto debe ser depolimerizado, entonces se emplea

cido nitroso en agua deuterada para reducir las cadenas polimricas. Esta reaccin

39

es estequiomtrica con respecto a las unidades desacetiladas (unidades GlcN) y corta

la cadena antes de un monmero desacetilado quedando enlazadas las unidades

acetiladas, transformndose as en 2,5-anhidro-D-manosa (Quitosa), la reaccin

ocurre de la siguiente forma 20.

Figura 4.1.3.: Reaccin de Quitosano con cido Nitroso resultando como producto

Quitosa (1) 24.

De esta forma se han predicho los espectros de RMN 1H tanto para la quitosa como

para el quitosano.

40

Figura 4.1.4.: Estimacin del espectro RMN 1H del quitosano incluyendo las

correspondencias de cada pico con cada protn.

41

Figura 4.1.5.: Estimacin del espectro RMN 1H de la quitosa incluyendo las

correspondencias con cada protn.

42

La correspondencia de los picos es la siguiente:

Tabla 4.1.1.: Correspondencia de picos en cada espectro: estimacin y

experimental.

Experimental

(PPM)

Pico Denominacin Estimacin (PPM) PT ID

1 K1 4.69 5.01 5.01

2 H1D 4.00 4.70 4.82

3 H1A 3.79-