SELECCIÓN DE LEVADURAS AUTÓCTONASPARA LA ESTANDARIZACIÓN Y MEJORADEL QUESO DE CABRALESRM2006-00003

Baltasar MayoBaltasar MayoIPLA-CSICIPLA-CSIC

INSTITUTO DE PRODUCTOS LÁCTEOS DE ASTURIAS

OBJETIVOS

1.- Identificación y tipificación fenotípica y molecular1.1.- Clasificación fenotípica1.2.- Clasificación molecular1.3.- Tipificación

2.- Caracterización fisiológica y tecnológica2.1.- Análisis de actividades deseables y no deseables2.2.- Actividad de las cepas en leche2.3.- Relación de las cepas con bacterias lácticas y penicilios

3.- Selección de cepas como cultivos adjuntos

TIPIFICACIÓN DEL QUESO DE CABRALES

PTR1995-0556-OP, AGL2003-07631-C02-01

Análisis microbiológico Queso de Tielve

0123456789

10

LECHE CUAJADA QUESO 7D QUESO 30D QUESO 60D

Periodo de maduración

log uf

c/ml

totales

coliformes

enterococos

estafilococos

lactococos

lactobacilos

leuconostroc

mohos y lev

Análisis microbiológico Queso de Canales

0123456789

10

LECHE CUAJADA QUESO 7D QUESO 30D QUESO 60D

Periodo de maduración

log uf

c/ml

totales

coliformes

enterococos

estafilococos

lactococos

lactobacilos

leuconostroc

mohos y lev

TIPIFICACIÓN DEL QUESO DE CABRALES

Medio de cultivo-MRS

Lb. brevis

Lb. farciminis

Lb. kefiriLb. casei/ Lb. paracasei

Leuconostoc spp.

Lb. plantarum/ Lb. paraplantarum

Lactococcus spp.

Medio de cultivo-MSE

Ln. pseudomesenteroidesLn. citreum

Ln. mesenteroides

Medio de cultivo-M17

E. faecium

E. durans Enterococcus spp.Strep. parauberis

Lc. lactis subsp.. lactis

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS

TIPIFICACIÓN DEL QUESO DE CABRALES

MICROORGANISMO QuesoLeche Cuajada Superficie Interior TOTAL

LEVADURASZygosaccharomyces spp. 2 12 14Debaryomyces hansenii 14 14 (6)*Kluyveromyces lactis 1 4 6 11 (4)Pichia fermentans 3 1 5 9 (3)Pichia membranafaciens 5 5 (2)Rhodotorula mucilaginosa 3 2 (5)Candida rugosa 3 1 (4)Rhodotorula spp. 3 1 (4)Pichia norvegensis 1 1Kluyveromyces marxianus 1 1Yarrowia lipolytica 1 1Sporobolomyces salmonicolor 1 (1)Sin identificar 1 1 2

Geotrichum candidum 1 9 10

TOTAL 8 7 27 40 82

IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS

IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA

IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURASIDENTIFICACIÓN MOLECULAR

PCR-RFLP gen 5.8S Regiones ITS1 e ITS2

ITS 1 ITS 2

18 S 5.8 S 28 S

Comparación de los patrones de bandas con las bases de datos

RestricciónHaeIII

HinfI

AluIRsaIHhaI

Sau3AI

IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR

D. hansenii

HaeIII

HinfI

420

15090

2 x 325

HaeIII

400

HinfI

20011090

G. candidum

IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS

CLASIFICACIÓN MOLECULAR

A

B8

M

M M

M

7654321 14131211109 1615

87654321 14131211109 1615

Figure 1.- Different RFLP profiles with both HaeIII (A) and HinfI (B) of the ITS1-5.8S-ITS2region of representative yeast isolates from all 16 molecular species identified

IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS

CLASIFICACIÓN MOLECULAR

AACTGCGCTCCAGCGCGCACGCTT

CTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTCAGATCAGGCAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTCAGATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCA

ATATTGGTGCGCGGACC---TTGGCCGCCGAACTCAATTTGCCACCT--CTGGGGCGGCCGGCGAACTGCTTTGGCCGCCGAACTTGGCCGCCGAGCGAAAA

CGGCTTTACATCGAGCTCGACTATAC----ACTAAGCTCGACTCTA-----AT-----TCGACTATTAC--CA---AGCTCGACTTTA-----ACTAAGCTCGACAAAAACACCATTGAGCTCGAC

GTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGTTTCCATCTCACGC-TGCTGCCGTGCGGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGCGC-A-A-GCAGAG--TTGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCTGTGGTATTCCGCAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGGTTCATTCTATTGATAGATGGGCTGAGTTGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCGCTGGTATTCCGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGGA------GCGGAG-CTTGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGCGC-A-A-GCAGAG--TTGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCGTCGGTATTCCGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGTGC-A-CCGCGGGGTCTT

GTGCGCGTGGGGGCGGGGTGGAGCTGGCAGCGCCTAG-GCCTTGCCGAAAAGAAACGAGGAGAAGCGG--GCGGGGGCAGCGATGCCGCCGCTGAAAAGGAGCGATTGCGGACGCGAGCGAACTAAA-GTGGTTG--CCCGCCAGGGCGTCGTTTATTTGAAATACAA--GACTACGGTTTA-GTTGTGCTACT--ACGTAGGGCTGTCTTTTTGGACGGCGCGCCCAAAGCGA---G-GGGCCTTCTG-CGCGAACTAGA-CTGTGCG--AGAACAG--GCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACG-TCGTGGACGA-AGTGAACTAAA-CATTTAGAGCTGGCCGTGCCACTGGCCCGGCCGAAAAGAAACG-TTGCGGACGA-AGCGAACTACATCGGGAC

C-T--T

CCAGCCAGCGATGGACGTGG--------------------AC---------------GAG-CAG--A-CCTGGC--------------------------GCAG--ATCCTCTCTGCGCA

AAAACTTTCAACAACGGATCCGTTAGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCACCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGGCATCGTGAATCAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCA

TCGATCGATCGATCGATCGATCGA

TGT---TAAGAATTACAAGAAACCG-TAT----AAAGTTAAG--AAATCCACTTTAACAAAAC--GATCTAAAAGAAT

CTGTGATAC-----CCTTC--CAC-TGTGTGGGCG-TACGAAACACTGCAAACATGTAAT--ACGGAAGTCAAG-GAACCTGTGATTT--CTTTCC---ACACGTGCGTGAGCG-CAC-AAACACCT-AAA--CGTATGT-AGCCTAGTCAA--ACCT

AAATAGCGGAGGAACNTNANC-TGCGNTTTAG--AC-AAGCTCATGNAANTTTTAAGTATTGATACCCAAAGAACCCTGTGATTT----ATCACC-ACAC-TGCGTGGGCGACACGAAACACCG-AAACC--GA----ACGCACGCCGTC-AAGCCTGTGATTT--ATATCTTATACACATGCGTGAGCG-CACCAAACACCT-AAAATTGTAATA-CTAATTGTCAGT-AAGTCTGTGATTATACCAACACC-ACAC-TGTGTGGGCG-CACAAAACACCT-AAACCTGGAGTATACACACGTCAAC-AAAA

3AD151AD83AD7

3AD16P. fermentans*

P. membranaefaciens**

3AD151AD83AD7

3AD16P. fermentans*

P. membranaefaciens**

3AD151AD83AD7

3AD16P. fermentans*

P. membranaefaciens**

3AD151AD83AD7

3AD16P. fermentans*

P. membranaefaciens**

3AD151AD83AD7

3AD16P. fermentans*

P. membranaefaciens**

ITS 1

ITS 2

5.8S

26S

CTG

TIPIFICACIÓN DE LEVADURASGeotrichum candidum

A BM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M10

Sorensen Coefficient

1AM13AM93AM13AM41AM33AM23AM33AM103AM193AM20

0,52 0,6 0,68 0,76 0,84 0,92 1

C

ari1 omt1

IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS

COMPARACIÓN CLASIFICACIÓN FENOTÍPICA-MOLECULAR

IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA

No. of isolates

bp of the PCR

product1

Restriction fragment length wit h the restriction enzyme2

IDENTIFICACIÓN MOLECULARHaeIII HinfI

Candida curvata (4AD6) 1 500 500 2503 Trichosporon coremiiforme

Candida intermedia (4AD4) 1 400 400 210+190 Candida intermedia

Candida rugosa (3AD13) 3 410 410 210+190 Candida catenulata

(3AD19) 1 420 420 220+200 Candida pararugosa

Debaryomyces hansenii (1AD6) 14 650 420+150+90 3253 Debaryomyces hansenii

Kluyveromyces lactis (3AD14) 11 740 655+80 290+185+120+80+65 Kluyveromyces lactis

Kluyveromyces marxianus 1 740 655+80 290+185+120+80+65 Kluyveromyces lactis

Pichia fermentans (3AD16) 9 450 340+80 250+200 Pichia fermentans

Pichia membranaefaciens (3AD15) 4 500 330+110 300+200 Pichia membranaefaciens A

(1AD8) 1 450 330+90 250+200 Pichia membranaefaciens B

Pichia norvegensis (3AD3) 1 630 420+140+80 3153 Pichia dubia

Rhodotorula mucilaginosa (2BD6) 5 640 425+215 340+225+75 Rhodotorula mucilaginosa

Rhodotorula spp. 4 640 425+215 340+225+75 Rhodotorula mucilaginosa

Sporobolomyces salmonicolor (3AD18) 1 600 400+200 290+190+120 Sporobolomyces ruberrimus

Yarrowia lipolytica (4AD16) 1 380 380 1903 Yarrowia lipolytica

Zygosaccharomyces spp. (3AD7) 13 450 330+120 250+200 Pichia spp.

(4AD7) 2 775 500+110 400+375 Saccharomyces unisporus(4AD2) 1 850 325+230+170+125 375+365+110 Saccharomyces cerevisiae

IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS

1AD8 (=CECT 13027T, =CBS 11679T)

NUEVA ESPECIE

IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS

Candida cabralensis CECT 13027T (FJ755462)

Pichia manshurica NRRL Y-17349 (EF550223)

Pichia sp. NRRL YB-4149 EF550224Candida ethanolica NRRL Y-12615T (EF550225)Pichia deserticola NRRL Y-12918T (EF550226)

Pichia sp. NRRL Y-27261 EF550229Candida californica NRRL Y-27254T (EF550230)

Pichia membranifaciens NRRL Y-2026T (EF550227)

Pichia sp. NRRL Y-27259 (EF550228)Candida thaimueangensis NRRL Y-27416T (EF550231)

Pichia kudriavzevii NRRL Y-5396T (EF550222)Pichia sporocuriosa NRRL Y-27347T (EF550232)

Candida pseudolambica NRRL Y-17318T (EF550231)

Candida inconspicua NRRL Y-2029T (EF550240)Pichia cactophila NRRL Y-10963T (EF550241)

Pichia pseudocactophila NRRL Y-17239T (EF550242)Pichia norvegensis NRRL Y-7687T (EF550239)

Pichia sp. NRRL Y-12827 (EF550245)Pichia sp. NRRL Y-12824 (EF550246)Candida rugopelliculosa NRRL Y-17079T (EF550238)Pichia occidentalis NRRL Y-7552T (EF550236)

Pichia exigua NRRL Y-10920T (EF550237)Pichia scutulata NRRL Y-7663T (EF550243)Pichia sp. NRRL Y-12830 EF550244

Pichia fermentans NRRL Y-1619T (EF550234)Pichia terricola NRRL YB-4310T (EF550233)

Pichia heedii NRRL Y-10967T (EF550252)Pichia barkeri NRRL Y-17350T (EF550247)Pichia nakasei NRRL Y-7686T (EF550248)

Pichia eremophila NRRL Y-17224T EF550249Pichia cephalocereana NRRL Y-17225T (EF550250)Pichia kluyveri NRRL Y-11519T (EF550251)

Schizosaccharomyces pombe NRRL Y-12796T

(AY048171)

6694

55

84

99

100

99

97

96

99

55

98

99

58100

97

77

86

51

0.05

Candida cabralensis

RELACIÓN DE LEVADURAS CON OTROS MICROORGANISMOSCultivos y co-cultivos de hongos y bacterias lácticas

ControlCultivos puros

2- C. famata1- D. hansenii2- K. lactis1- Y. lipolytica

3- G. candidum

1- P. membranaefaciens

1- C. pararugosa1- P. fermentans

2- Lc. lactis

1- Ln. citreum1- Lb. casei

107105

48h 25ºC48h 25ºC

Viableslevadurasbacterias pH

AspectoPerfil aromático

Compuestosvolátiles(GS-MC)

Ácidos orgánicos (HPLC)

RELACIÓN DE LEVADURAS BACTERIAS LÁCTICAS

µg/100gde leche C

ontr

ol

Lc. l

actis*

Ln.c

itreu

m

Lb.c

asei

G.c

andi

dum**

K.la

ctis*

C.fa

mat

a*

D.h

anse

nii

Y. li

poly

tica

C. p

arar

ugos

a

P. fe

rmen

tans

P. m

embr

anaf

acie

ns

G.c

andi

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K.la

ctis

C.fa

mat

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D.h

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Y. li

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tans

P. m

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G.c

andi

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K.la

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D.h

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Y. li

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P. m

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acie

ns

G.c

andi

dum

K.la

ctis

C.fa

mat

a

D.h

anse

nii

Y. li

poly

tica

C. p

arar

ugos

a

P. fe

rmen

tans

P. m

embr

anaf

acie

ns

Láctico 75589609702113677548 779108410591008 7661687 748 81778363880488118892976289258751 817686439249951486741003899718886 83441043996491136692928174926410997

Orótico 592837893709 303624215722562855745840574456424746 26513404360737443698405136623859 26223711374841153584 419942293845 2250 31462897 3392274432233525 3522

Cítrico 45334487 312 795299751582540557150285080 0 2715 33263633387139801953385941481953 0 0 0 0 3349 0 200 0 2165 0 0 0 0 7091764 0

Úrico 193821982169 2211 8421497224820151021 19824031902 11802000197220812016169118932036 9101971196321421979 166422051981 1053 20741864 2244179416522406 2246

Fórmico 663 545 433 484 201 724 602 745 726 990 616 447 346 457 508 489 398 563 347 360 246 442 473 431 524 543 493 449 274 449 489 0 481 606 537 554

Pirúvico 82 627 444 698 525 270 199 414 288 34 451 151 778 694 740 602 542 438 541 482 697 308 468 246 450 321 192 352 325 197 484 223 273 455 431 297

Propiónico 23 1011 330 867 192 571 305 610 609 67 238 532 119 97 382 638 164 834 196 760 216 227 349 614 406 300 220 438 508 452 683 637 8331044 918 504

Succínico 1384 177 28 57 19 536 495 171 5461204 153 0 216 235 255 171 227 250 166 18 30 18 21 15 19 41 29 21 380 23 36 29 31 160 513 25

Butírico 0 111 375 519 75 0 0 0 0 0 0 0 104 85 74 4 127 108 48 113 226 207 43 151 73 524 250 178 286 412 398 326 393 212 323 360

Acético 0 0 708 666 0 44 413 0 0 5 767 0 0 0 0 0 338 0 0 329 400 765 734 666 0 831 796 664 178 810 723 838 634 706 562 808

Cultivos individuales CocultivosLc. lactis* Ln. citreum2BC7 Lb. casei VI-19

ÁCIDOS ORGÁNICOS

RELACIÓN DE LEVADURAS BACTERIAS LÁCTICAS

COMPUESTOS VOLÁTILES

Identificación + de 50 compuestos volátiles

Acetaldehido Aroma a yogur0

50

100150

200

250

300

CONTROLL. la

ctis

L. citr

eum

L. case

iG. c

andid

umK. la

ctis

C. famata

D. han

senii

P. ferm

entan

s

Y. lipo

lytica

C. para

rugosa

P.men

brana

efacie

ns

50

100150

200

250

300

CONTROLL. la

ctis

L. citr

eum

L. case

iG. c

andid

umK. la

ctis

C. famata

D. han

senii

P. ferm

entan

s

Y. lipo

lytica

C. para

rugosa

P.men

brana

efacie

ns

Diacetilo Olor a mantequillay queso fresco

2-metil butanal3-metil butanal2-metil propanol

Compuestos málticos

Etanol

010203040506070

K. lacti

sK. L

actis

+ L. lacti

sK. L

actis

+ L. lacti

sK. L

actis

+ L. citre

umK. la

ctis+ L. ca

sei

Acetoína 2-propanolAcetona

Ningún patrón de interacción determinado entre BAL y levadurasLas interacciones parecen ser especie-específicas e incluso cepa-específicas

Abu

ndan

cia

rela

tiva

Abu

ndan

cia

rela

tiva

3-METIL BUTANAL

ACETALDEHIDO

RELACIÓN DE LEVADURAS BACTERIAS LÁCTICAS

Ethanol

0,00

5000,00

10000,00

15000,00

20000,00

25000,00

MILK 2BA1 Wg2 2BC7 VI-19 1AD5,2BD10

3AD19 3AD24 1AM3,3AM4,3AM9

2BD19,3AD10

3AD16 1AD8 4AD16

Acetaldehyde

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

MILK 2BA1 Wg2 2BC7 VI-19 1AD5,2BD10

3AD19 3AD24 1AM3,3AM4,3AM9

2BD19,3AD10

3AD16 1AD8 4AD16

2-propanol

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

160,00

180,00

MILK 2BA1 Wg2 2BC7 VI-19 1AD5,2BD10

3AD19 3AD24 1AM3,3AM4,3AM9

2BD19,3AD10

3AD16 1AD8 4AD16

Diacetyl

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

160,00

MILK 2BA1 Wg2 2BC7 VI-19 1AD5,2BD10

3AD19 3AD24 1AM3,3AM4,3AM9

2BD19,3AD10

3AD16 1AD8 4AD16

2+3-methyl-butanol

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

MILK 2BA1 Wg2 2BC7 VI-19 1AD5,2BD10

3AD19 3AD24 1AM3,3AM4,3AM9

2BD19,3AD10

3AD16 1AD8 4AD16

2+3-methyl-butanal

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

MILK 2BA1 Wg2 2BC7 VI-19 1AD5,2BD10

3AD19 3AD24 1AM3,3AM4,3AM9

2BD19,3AD10

3AD16 1AD8 4AD16

Lactic acid bacteria or yeast species

Rel

ativ

e ab

ound

ance

of t

he c

ompo

unds

COMPUESTOS VOLÁTILES

CEPAS SELECCIONADAS

1.- Geotrichum candidum:1AM33AM9

2.- Debaryomyces hansenii:3AD24

3.- Kluyveromyces lactis:2BD19

4.- Yarrowia lipolytica:4AD16

PRODUCCIÓN CIENTÍFICA

- Flórez, A. B., P. Álvarez-Martín, T. M. López-Díaz, and B. Mayo. 2007. Morphotypic and molecular identification of filamentous fungi from Spanish blue-veined Cabrales cheese and technological characterisation of Penicillium roqueforti and Geotrichum candidum strains. International Dairy Journal, 17: 350-357.

- Álvarez-Martín, P., A. B. Flórez, T. M. López-Díaz, and B. Mayo. 2007. Phenotypic and molecular identification of yeast species associated with Spanish blue-veined Cabrales cheese. International Dairy Journal, 17:961-967.

- Álvarez-Martín, P., A. B. Flórez, A. Hernández-Barranco, and B. Mayo. 2008. Interaction between dairy yeasts and lactic acid bacteria strains during milk fermentation. Food Control, 1: 62-70.

- Flórez, A. B., C. Belloch, P. Álvarez-Martín, A. Querol, and B. Mayo. 2010. Candida cabralensis sp. nov., a new yeast species isolated from the Spanish traditional blue-veined cheese Cabrales. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, (Aceptado).

- Álvarez-Martín, P., Flórez, A. B., and B. Mayo. 2010. Biochemical and technological properties of Penicillium roqueforti and Geotrichum candidum strains from Cabrales, a Spanish traditional, blue-veined, starter-free cheese. Acta Alimentaria, (Enviado).