Seher Başaran İ.Ü., İstanbul Tıp Fak., Tıbbi Genetik AD

GEN

transkripsiyon

1941-1990

transkripsiyon-translasyon

DNA RNA PROTEİN

Promoter

Kırpılma

Translasyon

Protein

Primertranskript(RNA)

Wellcome Trust

Olgun mRNA

Ekzon1-İntron1- E2- İ2- E3- İ3- E4

nukleus

sitoplazma

90 000-100 000 gen olduğu düşünülüyordu.Genom Projesi ile 20,000 fonksiyonel (protein kodlayan) gen olduğu bulundu.

Tüm genomun

İnsan genlerinin transkripsiyonel karmaşası

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

kısa RNA

snoRNAncRNA

miRNA

kısa RNA

3’ 5’

kısa RNA

Antisens ncRNAAntisens ncRNA

kısa RNA

p telomer q telomer

Transkripsiyonal çeşitlilik

A2A1 B3 B4

Translasyonda yeni bir protein

A proteiniEkzonlar

A geni B geni

A1 A2 A3 A4 B4B3B2B1 B proteini

Translasyonal çeşitlilik

İki insanın genomu %99.9 birbirine benzerGRCh37; Genome Reference Consortium human genome (build 37)

13 isimsiz gönüllü, kan grubu “O” olan bireyler

Yani farklarımız sadece %0.1

İnsan Genetik Varyasyonları

• Genomda 300 bp de bir nükleotid polimorfiktir. • Genelde iki formda olur (A ya da G; C yada T gibi).

1) Single nucleotide polimorfizm (SNPs) (tüm varyasyonların %90 ı);

2) Kopya sayısı varyantları (CNVs);

Referans genomla kıyaslandığında, farklı sayıda bulunan, boyutu 1 Kb veya daha fazla olan DNA segmentlerine Kopya Sayısı Varyasyonu (CNV) denir.

Varyasyonlar;1) Patojenik (Mutasyon)2) Zararsız (benign) (toplumda >%1); a. Sık veya b. Ender görülen3) Klinik anlamı kesin olarak bilinmeyen (Variants of uncertain

significance –VUS veya VOUS) değişimler olabilir!!!

GENOMUMUZ VARYASYONLARLA DOLUHer bireyin genomunda 300 patolojik varyasyon olabilir, eğer o birey sağlıklı ise

bu durumunu genomundaki diğer milyonlarca varyasyona borçludur.

Craig Venter2007 de genom dizisini yayınladı.1.2 milyon SNP317 geninde patolojik varyasyon.Zellweger hastalığına neden olan mutasyonu taşıyor.GSTM1 geninde mutasyon taşıyor (çevre toksinlerine karşı düşük direnç; ailesinde cilt kanseri yaygın).

James D. Watson2008 de genom dizisini yayınladı.3.3 milyon SNP23 CNV (26 kb-1.6 Mb)32 hastalık ilişkili mutasyon (retinitispigmentosa, konj. nefrotik sendrom, vs).

Güney Afrikalı Başpiskopos Desmond Tutu 2010 yılında genom dizisi yayınlandı. SLC24A5 genindeki varyantı fazla melanin salgılıyor.VDR genindeki homozigot varyantı kemik mineral yoğunluğunu arttırıyor.ACTN3 homozigot varyantı, kas gücünü arttırıyor.PTC varyantı tat duyusunda toksik madde ayırımı yapabiliyor.

OMIM 22 Kasım 2017 ~10.000 tek gen hastalığıMoleküler temeli belli 6.115 fenotipİlişkili mutasyon-fenotipi belli gen 3.846

1 Fenotip ile ilişkili gen 2.6322 Fenotip ile ilişkili gen 7223 Fenotip ile ilişkili gen 259>4 Fenotip ile ilişkili gen 233

TEK GEN Hastalıkları

OMIM 15 Mayıs 2018 ~10.000 tek gen hastalığı6.201 fenotip3.907

2.677732265233

OMIM İstatistikGen/Fenotip

OMIM’de tanımlı gen sayısı 15 858

% 7511 965 genin fenotipeyansıması bilinmiyor

% 253 893 gen defektininklinik ilişkisi biliniyor

10.Nisan.2018

1. «SANGER Dizileme»

DNA’nın Nukleotid (bazlar A, G, T ve C) Dizisinin Belirlenmesi

• Halӑ «gold standart» test• Tek tek, ekzon ekzon dizileme gerekiyor, her dizilemede ~600 baz okunur• Zaman alıcı• Büyük genler (örn. Distrofin geni 79 ekzon) için tanı amaçlı imkansız• İnsan gücü ve maliyet artar • Mozaikleri (<%30), büyük del/dup, inv, ins gösteremez

Bazı sık görülen «Tek gen» hastalıkları ve sıklıklarıHastalık İnsidans Taşıyıcı sık.

Akondroplazi 1/10.000NF 1 1/3.500Marfan sendromu 1/5.000Beta Talasemi (Türkiye) 1/2.500 1/23Kistik Fibroz 1/2.000 1/22Fenilketonuri (Türkiye) 1/4.500 KAH 1/10.000SMA 1/10.000 DMD (E) 1/3.000Frajil X Sendromu 1/4.000 1/6.000Hemofili 1/4.000

(A1/8.000, B1/20.000)

TEK GEN HastalıklarıDoğumdaki prevalans ~1:100

2. «Yeni Nesil (Next Generation) Sekanslama»

Whole Genome Sequencing (WGS)Tüm Genom Sekanslama, 6 milyar bazın dizilenmesi

Whole Exome Sequencing (WES) %1,5 Genomdaki ~20.000 genin sadece ekzon ve UTR bölgelerinin dizilenmesi (Mendel kalıtımı gösteren tek gen hastalıklarındaki mutasyonların %85’i ekzonlardabulunmaktadır).

Targeted Gene Panel (TGP)Belli bir fenotip ile ilişkili bilinen genlerin ekzon ve UTR’lerinin dizilenmesi

Tüm genomun

Whole Genome Seq(WGS)

Whole Exome Seq(WES)

Targeted Seq(NGS-Panel)

Hedefin büyüklüğü (bp) 3x109 5x107 500 000

Her çalışmadaki örnek sayısı 6-15 120 Gen sayısı/büyüklüğü belirler

Kapsama derinliği x30 x100 > 500

Bioinformatik analiz/örnek >48 hr 4 hr 1 hr

www.centogene.com 18

Likelihood of detecting a mutation: The scores depicted combine how good the target is covered

and the sensitivity of the method in detecting any point mutation with the region that is targeted.

Information content: amount of information captured by a given technique. It scales linearly with

the size of the region that is being probed for the respective test.

Centogene Product Genes Depth Coverage

Information

content

Likelihood of

detecting a

specific mutation

Whole Genome Sequencing

(CentoGenome®)~20.000 ~30x ~99% >10x ~3.2GB ~97.6%

Whole Exome Sequencing

(CentoXome®) ~20.000 ~100x ~97% >10x ~60MB ~93.2%

Clinical Exome Sequencing

(CentoDx Plus™)~6.700 ~150x ~95% >20x ~15MB ~94.1%

NGS Panel Genomic ~10-1000 ~30x ~99% >10x 200-500MB ~99.1%

NGS Panel Plus 10-200 ~200x 100% 20-400KB ~99.1%

NGS Panel 10-1000 ~200x ~98% >20x 20-400KB ~96.1%

Single Gene Sequencing (Sanger) 1 NA NA 0.2-5KB ~99.9%

Hot Spot Testing 1- few NA NASingle base

pair~99.9%

NEW

NEW

Which test to choose?

VUS=Variant of Uncertain (unknown) Significance

Klinik bulgu ve kalıtım modeline göre

TIBBİ GENETİKÇİ

OLGU; • 30 y [G2 A1] G1. 2017 yılında anembriyonik gebelik 27(-) hafta gebelik• USG bulguları:

– Kalpte ARSA ve perimembranöz outlet VSD– Timus hipoplazisi– Solda dudak yarığı, primer sert damak intakt

• VSD, ARSA, timus hipoplazisi, sol dudak yarığı nedeniyle – 22q11.2 mikrodelesyon sendromu – diğer mikrodel-dup sendromları – CHARGE sendromu

• Kromozom+ DGS-FISH+mikroarray; Normal

• ÖNERİ: Prenatal WES-Klinik ekzom (Centogene)• 32 (+) haftalık gebelik• USG bulguları:

– Kalpte ARSA ve perimembranöz outlet VSD – Timus hipoplazik– Solda dudak yarığı, primer sert damak intakt görünümde– Sağ pelviektazi [AP çapı 9.4 mm] ölçüldü. Sağ böbrek korteksinde minimal en büyüğü 3.4 mm

ölçülerinde kistik lezyonlar saptandı.

1. OD CHARGE sendromu ilişkili CHD7 geninde heterozigot c.6070C>T [p.Arg2024*] 2. OD BOR sendromu ilişkili EYA1 geninde heterozigot c.229C>T[p.Arg77*]

Bu mutasyonların ikisi de nonsense değişiklikleri olduğundan ve HGMDE2017.3 versiyonunda sırasıyla Class I ve Class II olarak sınıflandırıldığından, patojenik özellikte oldukları söylenebilir.

OLGU;

Fetus 1 (2015) 25. GH USG bulguları; lizensefali+mikrosefali+interhemisferik kist

• Öneri; Karyotip+aCGH - Normal,

• SIX3 geni (2 ekzon) Sanger dizi- Normal

Fetus 2 (2017) 27. GH USG bulguları; lizensefali+mikrosefali+interhemisferik kist+ sloping alın

• Post mortem bulgular; geniş burun kökü+hipertelorizm+malar hipoplazi+ bil. 5. parmak klinodaktili+geniş haluks

• TANI: MKA/MR

• Kromozom+a-CGH; Normal

• Öneri: WES (CentoXome GOLD)

SONUÇ; RTTN geninde ekzon 28’de het. c.3705C>A (p.Tyr1235*) ve intron 35’de het. c.4748-19T>ACLP1 geninde ekzon 3’de het. c.419G>A (p.Arg140His)

Anne het. RTTN geni c.4748-19T>A ve het. CLP1 geni c.419G>A Baba het. RTTN geni c.3705C>A (p.Tyr1235*)

YORUM;RTTN geni c.4748-19T>A varyantı daha önce tanımlanmamış, Alamut v.2.7.1. program analizine göre

transkripte kırpılma hatasına yol açıyor. c.3705C>A gen transkriptinde «dur» kodonu oluşturuyor. Mikrosefali, kısa boy, polimikrogri ve epilepsi ile karakterize bir hastalıkla ile ilişkili (MIM#614833). Fetusta, OR bileşik heterozigot formda RTTN geni fenotip ilişkili gen olarak değerlendirildi.

CLP1 geni OR pontoserebellar hipoplazi tip 10 ilişkili ve c.419G>A tanımlanmış bir mutasyon. Ancak fetus ve anne heterozigot, ancak WES tüm delesyon mutasyonlarını gösteremediğinden fetusta diğer allelinincelenmesi önerilir.

Prenatal olgularda Prenatal WES-Klinik Exom Sonuçlarımız

USG katarakt -terminasyon-WES- CRYBB1 geni - İzole katarakt

USG multiple kontraktürler-terminasyon- WES- ASCC1 geni- konj. Fraktürlü SMA

USG mikroretrognati- WES- TCOF geni- Treacher Colins send.- doğdu ve ex

USG izole postaksiyel polidaktili – WES- BBS10 geni – Bardet Biedel send.-terminasyon

USG VSD+NT+plevral eff.+hepatosistemik şant- WES- RIT1 geni-Noonan send.-IUMF

USG hiperekojenik böbrek-WES- OD-PKD1 geni – doğdu

USG VSD+IUGG+hipopadias- WES- Normal- doğdu gelişimi normal

USG-izole unilateral CL-WES-Normal- doğdu gelişimi iyi

4xHidrops –WES- normal

Prenatal WES (Klinik Exom) Algoritması?• Ağır USG Malformasyon (terminasyon endikasyonu olanlar)

– 1. Genetik danışma– 2. Hızlı anöploidi testi –Normal ise– 3. Karyotip + Mikroarray– 4. Aday genler Sanger dizileme (örn. Akondro/Hipokondroplazi)– 5. Genetik danışma– 6. Klinik Exom

• Gebelik sonlandırıldıktan sonra mı? • Gebelik sürerken mi?

• Pozitif USG Bulguları (genetik tanıya göre terminasyonendikasyonu olanlar)– 1. Genetik danışma– 2. Hızlı anöploidi testi –Normal ise– 3. Karyotip + Mikroarray– 4. Aday genler Sanger dizileme (örn. Noonan için)– 5. Genetik danışma– 6. Klinik Exom– 7. Genetik danışma – terminasyon kararı

ve tüm organizasyon ekibineve tüm dinleyenlereteşekkür ederim.

OLGU;

• 3 aylık erkek olgu hipertrofik kardiomiyopati ve bil. katarakt bulguları ile izleniyor

• Anne baba 4. derece kuzen evliliği, ilk doğan erkek hipertrofik kardiomiyopati ile 4,5 aylıkken kaybedilmiş.

• Doğumdan 2 gün önce anne ilk çocuğundan söz etmiş ve detaylı USG de hipertrofikkardiomiyopati, ventrikülomegali, vermis hipoplazisi, pelviektazi, polihidramniossaptanmış.

• Doğum sonrası sepsis

• Dismorfik bulgular; skafosefali, bitemporal basıklık, sarı ince telli saçlar, bil. epikantus, kısa burun, kalkık üst dudak, dar damak, retrognati, gingiva hipertrofisi, bükülebilir heliks üst krus silinmiş kulak

• Hipoton

• KLİNİK TANI; MKA/MR, A/T Sengers, I-Cell….

• Karyotip ve mikroarray sonuçları NORMAL

• Öneri; WES-Klinik exom (Centogene)

Sonuç; OR EPG5 geninde homozigot c.1252+1G>A mutasyonu TANI: VICI sendromu (İmmün yetmezlik+ yarık damak/dudak + katarakt + hipopigmentasyon + korpus kallozum agenezisi)Anne - baba bu mutasyon için heterozigot (taşıyıcı), tekrarlama riski %25GD: Prenatal tanı / PGD, ailedeki diğer taşıyıcıların belirlenmesi