sebenta de biocel
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SEBENTA
BIOLOGIA CELULAR E
MOLECULAR I
BERNARDO MANUEL DE SOUSA PINTO
FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO
Bernardo Manuel de Sousa Pinto Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Sebenta de Biologia Celular e Molecular I
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Índice Metodologia do estudo da célula……………………………………….…………………………..………3
Microscopia……………………………………………………………………...…………..……3
Isolamento e cultura celular ………….…………………………………………………….……..7
DNA e DNA-binding proteins……………………………...………….…………………………….……11
Replicação do DNA……………………….…………………………….……………………...…………15
Reparação e recombinação do DNA………………………...…………….………………………………19
Transcrição do DNA…………………………………………………….…………………...……………24
Transcrição: Síntese do mRNA………………………..……………………...…………………24
Transcrição: Síntese do rRNA e tRNA…….………...……………...………………….………..29
Núcleo celular…………………………………………………………….…………….…………………32
Genoma humano e doenças associadas ao DNA…………………….……………………………………37
Técnicas de biologia molecular……………………………………...….……………………...…………41
Síntese e degradação de proteínas……………………..……………….……………………….…………45
Controlo da expressão génica e especialização celular…………….…...…………………………………51
Membranas biológicas…………………………………………………………………...………..………55
Transporte transmembranar ………….………………………………………………………..…………..58
Tradução eléctrica de estímulos: Membrana neuronal………….…………………………..……….……63
Modelos experimentais de controlo da expressão génica……………………….………………...………67
Citosqueleto……………………….………………………...…………….………………………………72
Actina………………………………………..…………………………………...………………72
Microtúbulos e filamentos intermediários...………………..…………………………..………..78
Atlas de Microscopia…………….………………………...…………….………………………..………82
Tipos de células……………………………..…………………………………...………………82
Núcleo...………………..………………………………………………...…….…….…………..91
Estão incluídos nesta sebenta, resumos das aulas de Biologia Celular e Molecular I da Faculdade de
Medicina da Universidade do Porto, bem como um atlas com as imagens de microscopia observadas.
Desde já agradeço a quem me ajudou na elaboração da sebenta, através da correcção de eventuais erros
inicialmente presentes, ou através de ideias e sugestões.
Bom trabalho e votos de sucesso nos exames,
Bernardo M. Sousa Pinto
Bernardo Manuel de Sousa Pinto Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
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Microscopia
O microscópio permite, não só, ampliar aquilo que vemos, mas também, ver mais pontos como pontos
distintos, pois permite uma resolução maior que uma simples lupa. Existem dois grandes tipos de
microscópio: O microscópio de luz, onde é possível ver até às células, e o microscópio electrónico, que
teoricamente daria para ver até aos átomos.
Limite de resolução
O limite de resolução de um microscópio é a distância mínima entre dois pontos de um objecto, em que
estes são passíveis de ser observados como pontos distintos, exprimindo-se em subunidades do metro.
O limite de resolução do microscópio óptico é calculado pela fórmula
, sendo , o valor do
comprimento de onda da luz utilizada e o produto expresso no denominador muitas vezes indicado pelo
fornecedor.
O limite de resolução mínimo do microscópio óptico, por causa da radiação é de 200 nm, ou seja, não se
conseguem observar estruturas que distam menos de 200 nm, que é a distância mais ou menos que
existe entre os organelos. O microscópio electrónico tem um limite de resolução teórico de 0,1 nm, mas
na prática, o limite de resolução é raramente menor que 1 nm.
Preparações para microscopia
Para elaborar preparações definitivas para microscópio óptico, em primeiro lugar, devemos parar os
processos metabólicos das células, matando-as e conservando a sua estrutura – fixação. De seguida,
corta-se o tecido endurecido (frequentemente em parafina) em fatias finas (entre 5 e 6 μm de
espessura), pois só assim podem ser atravessadas por um feixe de luz. Finalmente, coloca-se este no
suporte de vidro.
Como as células são incolores, nomeadamente as animais, absorvem/reflectem muito poucas radiações
visíveis, devendo-se por isso fazer colorações, utilizando-se corantes citológicos, básicos (ou acidófilos),
para corar estruturas ácidas, como o núcleo (devido à grande quantidade de ácidos nucleicos), ou
corantes citológicos ácidos (ou basófilos), para corar estruturas básicas (geralmente têm maior afinidade
com o citoplasma). Como as colorações podem induzir alterações morfológicas nas células, há por vezes
a necessidade de observar células vivas e não coradas. Para isto, utilizam-se frequentemente,
microscópios de contraste de fase.
Já em microscopia electrónica, os cortes têm de ser ultra-finos (80 a 100 nm), sendo estes colocados
numa grelha metálica e fixados numa cera muito dura.
Coloração de Gram
As células procarióticas não têm núcleo, nem organelos membranares individualizados. As bactérias são
indivíduos procariontes, que se classificam de acordo com o modo como coram, quando submetidas à
técnica de Gram. Sendo assim, as bactérias Gram-positivas coram a roxo e as bactérias Gram-negativas
coram a encarnado/magenta.
Estas diferenças em termos de coloração prendem-se com a presença ou ausência de peptidoglicano
nas paredes bacterianas. As Gram-positivas possuem uma grande quantidade de peptidoglicano que
funciona como uma “esponja muito grossa e permeável”, enquanto as Gram-negativas possuem uma
quantidade muito reduzida de peptidoglicano.
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Microscopia de contraste de fase
A microscopia de contraste de
fase permite acompanhar
culturas de células vivas, pois
neste método não é necessária
a coloração histológica das
células. As imagens são nos
dadas, pois, por um contraste,
que faz parecer que estas
apresentam relevo. Isto
acontece porque as radiações
que atravessam organelos mais
“densos” e “espessos”, como o
núcleo sofrem um
retardamento, enquanto as que
atravessam regiões de menor
resistência, ficam em fase.
Dessa forma, essas diferenças
de fase de radiação, nos diferentes locais da célula, vão ser convertidas pelos microscópios de contraste
de fase, num contraste, onde estruturas mais “densas” são menos brilhante e as menos “densas” são
mais. Este método é útil para observar células individuais, ou finas camadas de células, mas não tecidos
espessos.
O contraste de interferência diferencial (ou contraste de interferência diferencial de Nomarski) é uma
variante da microscopia de contraste de fase, pois converte diferenças de fase também num contraste,
mas os objectos, nas imagens, parecem ter uma sombra, algo que resulta de uma diferença no índice de
refracção deste, relativamente ao meio. Isto é particularmente útil para a observação de objectos
espessos e pequenos detalhes.
Microscopia de fluorescência
Através de microscopia de fluorescência, é possível detectar os fluorocromos, moléculas fluorescentes.
Um composto diz-se fluorescente, caso absorva luz a um dado comprimento de onda de excitação e, por
consequência, emita luz, num maior comprimento de onda específico. São por isso detectadas duas
radiações – uma associada à excitação dos electrões e outra à emissão de energia por parte destes.
Por isso, neste tipo de microscopia utiliza-se um filtro que deixa passar apenas as radiações que excitam
os fluorocromos. Graças a outro filtro, vemos também somente as radiações luminosas emitidas pelos
fluorocromos. O resto aparece a negro.
Dado existirem muito poucas moléculas naturalmente fluorescentes, somos forçados a recorrer a
técnicas de imunocitoquímica – utilizamos, pois, anticorpos com fluorocromos, pois os anticorpos são
muito específicos para determinados antigénios. Podemos classificar as técnicas de imunocitoquímica
em directas, se recorrerem somente a um anticorpo marcado para cada molécula, o que acontece
muito raramente; ou indirectas, se recorrerem a um anticorpo primário, ao qual se ligam vários
anticorpos secundários marcados (sendo que os dois anticorpos têm de ser produzidos em animais
diferentes – só assim os anticorpos secundários reconhecem o anticorpo primário como um antigénio!).
Podem igualmente ser usadas enzimas com marcação fluorescente.
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Dado o contraste nas imagens de fluorescência ser tão grande, é possível ver estruturas menores que
200 nm, a menos que distem menos que 200 nm!
As imagens de microscopia de fluorescência podem apresentar um fundo (noise), algo que é superado
com recurso a radiação laser muito intensa, em microscópios mais sofisticados. A microscopia confocal
e de deconvolução permitem observações de estruturas tri-dimensionais sem aberrações de imagem. A
microscopia de Apo-Tome permite um aumento de nitidez nas imagens obtidas por microscopia de
fluorescência.
GFP – Green Fluorescent Protein
Esta proteína permite-nos ver, com recurso a técnicas de fluorescência, células vivas, ou proteínas (por
vezes criam-se proteínas híbridas, com um segmento de GFP, que não altera o funcionamento natural
destas e permite observar o seu “caminho natural”).
FRET – Förster resonance energy transfer
Esta é uma técnica de microscopia de fluorescência, que permite observar a interacção directa entre
duas moléculas muito próximas (nomeadamente reacções de transferência de energia), do seguinte
modo:
FRAP – Fluorescence recovery after photobleaching
Esta técnica é útil para observação de cinética molecular, pois faz-se um branqueamento de todas as
moléculas fluorescentes numa área restrita e depois vai-se acompanhando as migrações moleculares, ou
seja, a sua “recuperação”.
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TIRF - Total internal reflection fluorescence microscope
Permite excitar os electrões que estão mais à superfície na lâmina, permitindo ver só moléculas
individuais específicas.
Microscopia electrónica de transmissão
Este tipo de microscopia
electrónica utiliza um feixe de
electrões, emitidos por um
filamento de tungsténio, após ter
sido criada uma grande diferença
de potencial, o que mata células
eventualmente vivas. Como as
células são muito permeáveis à
passagem de electrões e os
metais pesados não, cria-se uma
fixação à base de elementos
densos, como o ósmio, ou o
acetato de uranilo…levando à
génese de um contraste.
Em microscopia electrónica
aplicam-se também técnicas de
imunocitoquímica,
nomeadamente
imunocitoquímica ultra-estrutural, onde, recorrendo a anticorpos marcados com metais pesados (p.e.
esferas de ouro), conseguimos detectar determinadas estruturas.
Microscopia crioelectrónica
Consiste na congelação muito rápida de material biológico em azoto líquido, algo essencialmente útil
para a identificação de vírus. Pode preceder o processo de sombreamento metálico, algo que é
extremamente útil para revelar o interior de biomembranas.
Sombreamento metálico
Consiste na colocação de um metal pesado no material biológico, obtendo-se uma réplica da superfície
que se consegue ver a microscópio electrónico – à espécie de um molde.
Microscopia electrónica de varrimento
Quando observamos estruturas em microscopia electrónica de varrimento, fazemos incidir electrões em
ângulos diferentes, relativamente aos do microscópio electrónico de transmissão. Obtemos assim uma
imagem da superfície do material biológico (que não é atravessado pelos electrões), embora o limite de
resolução neste tipo de microscópio seja menor.
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Isolamento e cultura celular
Isolamento de células
Microdissecção por laser
Este processo permite recortar regiões da célula, muito selectivamente, submetendo-as a radiação
laser, após estas terem sido cobertas por um polímero.
Citometria de fluxo
A citometria de fluxo permite a separação de células, através de diferença de cargas. Algumas células
são marcadas por fluorescência, sendo que as marcadas, recebem uma determinada carga e as que não
têm recebem outra. É feita posteriormente uma triagem com base nas cargas das células.
Cultura de células in vivo:
A cultura de células in vivo é muito importante em termos científicos, sendo aceite em termos éticos e
poupando recursos financeiros. Estas células são cultivadas em meio de cultura líquido, asséptico,
suplementado com aminoácidos, vitaminas e soro animal, estando todos os factores controlados. Para
além disso, estas células mantêm as características das originais. Contudo, existe a possibilidade da
contaminação destas culturas com microrganismos.
As células que retiramos podem se dividir num número limitado de vezes (normalmente podem
efectuar até 40 divisões), morrendo posteriormente. Contudo, algumas células normais de roedores e
células tumorais têm capacidade de se dividir indefinidamente – linhas de células imortais – um
exemplo de células imortais, são as células da linha HeLa, a primeira linha celular, que foi isolada a
partir de um cancro do colo do útero.
Células imortais cultivadas in vivo são utilizadas na criação de células híbridas. As células híbridas
resultam da cultura de duas células com conteúdo genético não muito diferente. Para se criarem células
híbridas, recorre-se ao polietilenoglicol, formando-se depois um heterocaryon, porque as membranas
das células tornam-se muito permeáveis. Formam-se depois, por mitose, células com informação
genética de ambos os tipos de células. As células híbridas são utilizadas, por exemplo, para a produção
de anticorpos monoclonais, por parte de hibridomas, células resultantes da fusão de linfócitos B com
células tumorais, o que lhes confere imortalidade. As células híbridas têm ainda aplicações na
investigação e no diagnóstico de patologias.
Isolamento de organelos:
Os organelos são isolados, de forma a permitir um melhor conhecimento da sua constituição, algo
essencial, por exemplo, para a produção de fármacos. Para proceder à obtenção de organelos isolados,
em primeiro lugar, a membrana citoplasmática das células é rompida, através de um método mecânico
– o homogeneizador. De seguida, procede-se a uma centrifugação, onde se aplica uma grande força
centrífuga, maior que a da gravidade, de modo a obter um sedimento, constituído pelas estruturas mais
densas e um sobrenadante, constituído pelas restantes. O núcleo será o primeiro organelo a constituir o
sedimento, dada a sua elevada densidade. Contudo, é necessária a separação dos sobrenadantes, algo
que se faz recorrendo-se a uma centrifugação diferencial, a forças cada vez maiores.
Como as fracções obtidas nunca são 100% puras, utilizamos um gradiente, onde a base tem maior
concentração de soluto (p.e. de sacarose) que o topo. Obtém-se aí uma coluna com bandas, o que
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permite a purificação de sedimentos, quer constituídos por diferentes organelos, quer constituídos
somente por núcleos. Um controlo adicional da pureza é feito, recorrendo ao microscópio electrónico.
Este processo pode ser utilizado para a obtenção de macromoléculas específicas isoladas. Neste caso, a
ultracentrifugação é realizada à conta de forças muito superiores e tempo muito longa, estando sempre
associada a um gradiente muito concentrado em soluto. As macromoléculas, “deslocam-se” ao longo do
gradiente até encontrarem uma zona, cuja densidade seja igual às suas, estabilizando aí. Todavia, esta
não é a técnica de excelência para a separação de moléculas como o DNA e o RNA.
Separação de proteínas:
SDS-PAGE
Para separar proteínas, recorremos à electroforese, um processo que permite separar moléculas com
carga eléctrica, quando se encontram em solução, através da aplicação de corrente eléctrica, estando a
migração das moléculas dependente da sua carga, forma e massa.
No DNA, a migração está apenas dependente da massa (associada ao número de pares de bases), visto
as moléculas de DNA terem carga negativa (devido à presença do anião fosfato) e forma similar, mas nas
proteínas tal não acontece. Neste grupo de moléculas verifica-se variedade na carga e forma, o que leva
a que tenhamos de realizar alguns processos, de modo a eliminar essas “variáveis” e a podermos
separar as proteínas somente pela sua massa.
Para eliminarmos a “variável carga”, aplicamos SDS (dodecilsulfato de sódio), que confere carga
negativa a todas as proteínas (estas ficam todas com a mesma carga). Isto leva também, a que haja
repulsões entre as proteínas, algo que ajuda à sua desnaturação e linearização. Posteriormente, aplica-
se DTT – ditiotreitol – e β-mercaptoetanol – agentes que quebram as pontes dissulfureto, contribuindo
para a perda de tridimensionalidade das proteínas.
Aplica-se uma carga eléctrica às proteínas, então em gel de poliacriloenil, que migram do cátodo (-), até
ao ânodo (+), sendo que quanto maiores, menor a sua mobilidade. Para visualizarmos as bandas
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obtidas, estas são coradas com nitrato de prata e azul de Coomassie e comparar os valores obtidos com
valores-padrão.
Focagem Isoelectrónica
Esta é uma forma de electroforese, na qual as proteínas são separadas de acordo com o seu ponto
isoelectrónico – o valor do pH do meio, para o qual a proteína fica globalmente neutra. Sabe-se que ao
ser aplicada electroforese em proteínas neutras, estas não migram, por isso numa tina onde existe um
gradiente de pH, fornecemos corrente a proteínas carregadas, sendo que estas migram até ao local
onde é atingido o seu ponto isoelectrónico.
Electroforese bidimensional
As proteínas são separadas com base nos seus pontos isoelectrónicos, por focagem isoelectrónica e
depois, por SDS-PAGE, pela sua massa molecular.
Western-blotting
O método de Western-blotting consiste na transferência das proteínas separadas por electroforese
bidimensional para uma membrana. Aplica-se coloração de Ponceau’s e depois aplicam-se os anticorpos
marcados com enzimas ou fluorescência para identificar as proteínas de interesse (imunoblotting).
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Separação e hibridação de ácidos nucleicos:
No DNA, a migração por electroforese é feita em gel de acrilamida e agarose e está apenas dependente
da massa (associada ao número de pares de bases), visto as moléculas de DNA terem carga negativa
(devido à presença do anião fosfato) e forma similar. Dadas as dimensões da molécula de DNA, por
vezes é necessário cindi-la, com recurso a enzimas de restrição. A visualização das bandas de DNA é
possível graças ao SYBR green (antigamente recorria-se ao brometo de etídio, contudo, este é
cancerígena).
É possível a hibridação de ácidos nucleicos, podendo-se obter cadeias de DNA/DNA, RNA/RNA e
DNA/RNA. Para isso, aumenta-se inicialmente a temperatura das moléculas “originais”, o que leva à
quebra das pontes de hidrogénio e desnaturação destas. De seguida, obtêm-se moléculas híbridas,
graças à diminuição de temperatura.
Southern-blotting
O método de Southern-blotting é análogo ao de Western-blotting. Esta técnica é capaz de detectar um
fragmento de restrição específico, com uma enzima de restrição. Quando uma mistura de DNA
complexa é submetida a electroforese é notável a presença de vários fragmentos diferentes com
aproximadamente a mesma massa, não sendo detectável, cada um, como uma banda particular. Dessa
forma, o southern-blotting recorre à hibirdação para identificar um fragmento de DNA particular – os
fragmentos de restrição são transferidos para uma membrana, que é deixada a incubar em condições de
hibridação com uma sonda específica de DNA marcada radioactiva. Após se dar a hibridação dos dois
fragmentos, identificamos a sua localização, por autoradiografia.
Nothern-blotting
O método de Northern-blotting permite determinar a localização da expressão de um gene particular,
sendo análoga para RNA que é separado por electroforese e induzido em hibirdação com uma sonda de
DNA marcada radioactivamente. Este método necessita da extracção de mRNA de uma célula ou
conjunto de células, dessa forma, para manter a informação posicional da célula, em estudos mais
precisos, é necessário realizar hibridização in situ.
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DNA e DNA binding proteins
Molécula de DNA
A molécula de DNA apresenta como unidades básicas os nucleotídeos, compostos por uma base
azotada, uma desoxirribose e um grupo fosfato. Ao conjunto da base azotada, mais a dexosirribose dá-
se o nome de nucleosídeo. Quanto às bases, existem as pirimídicas, que são a timina e a citosina e que
apenas apresentam um anel azotado, e as púricas, que apresentam dois anéis azotados, sendo por isso
a adenina e a guanina.
O grupo fosfato estabelece duas ligações éster com a desoxirribose, dizemos por isso que se
estabelecem ligações fosfodiéster na molécula de DNA. Uma das ligações é estabelecida no 5º carbono
da desoxirribose, enquanto a outra é no 3º carbono de uma desoxirribose diferente. Dessa forma, a
sequência de nucleotídeos é sempre lida de 5’ para 3’.
A cadeia de DNA é formada por dois polímeros lineares com tendência a formar uma dupla hélice,
estabelecendo-se pontes de hidrogénio entre as bases azotadas, de ambas as cadeias, que se dispõe
antiparalelamente. Relativamente ao emparelhamento de bases, podemos afirmar que estas formam
sempre pares de Watson e Crick, ou seja a adenina emparelha sempre com a timina, através de duas
pontes de hidrogénio e a guanina com a citosina, por 3 pontes de hidrogénio. De referir que na molécula
de DNA distinguimos dois “sulcos”, um maior e outro menor, sendo que em cada volta, encontramos um
sulco de cada. Já as pontes de hidrogénio estabelecem um “efeito velcro”, pois são muito frágeis
individualmente, mas, no seu conjunto, constituem uma junção muito forte.
Relativamente aos tipos de DNA, quanto ao seu arranjo em dupla hélice, podemos considerar o BDNA, o
ZDNA e o ADNA. O BDNA corresponde à
maior parte do DNA existente nas células.
Regista-se nele uma rotação para a direita
e existem 10,1 bases por volta completa
(que tem 3,6 nm). Já o ADNA apenas
existe em laboratório e em condições de
desidratação extrema, sendo por isso,
semelhante à estrutura do BDNA, mas
mais compacto. Por último, o ZDNA
apresenta uma rotação para a esquerda e,
embora por vezes se encontre nas células,
não se sabe qual a sua função.
Desnaturação da molécula de DNA
A molécula de DNA é muito estável, todavia, a separação das duas cadeias é possível, através do
aumento de temperatura (dado a elevação térmica aumentar a cinética dos electrões). A esta separação
dá-se o nome de desnaturação do DNA, sendo este processo reversível. Valores extremos do pH
também levam à quebra das pontes de hidrogénio, isto porque as cadeias passam a repelir-se, quer pelo
facto das bases ficarem protonadas (em meio ácido), ou com carga negativa (em meio básico). Também
a diminuição da concentração de iões é um factor que contribui para a desnaturação da molécula de
DNA.
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As quebras de ligações nas moléculas de DNA são
passíveis de ser monitorizadas, através da
espectrofotometria. De facto, as cadeias simples
absorvem uma quantidade muito maior de
radiação UV de comprimento de onda 260 nm. A
temperatura para a qual se dá um aumento
muito brusco da absorção de radiação de 260 nm
é designada por melting-point (também
designado por “temperature of melting”, ou Tm).
O melting-point é mais elevado quando há mais
pares de bases guanina-citosina, do que quando
há mais pares de bases adenina-timina. Isto,
porque entre a guanina e a citosina estabelecem-se mais pontes de hidrogénio, que entre a adenina e a
timina.
Disposição do DNA na célula
O DNA não se dispõe aleatoriamente no núcleo das células
em interfase – ocupa os chamados territórios
cromossómicos, locais restritos ocupados de forma
ordenada pelo DNA, entre os quais existe o espaço
intercromossomal. O DNA encontra-se então no núcleo
associado a proteínas, o que constitui a cromatina. A
cromatina pode se encontrar sob uma forma muito
condensada (heterocromatina), ou pouco condensada
(eucromatina), estando essa última forma, geralmente
associada à transcrição activa.
Quando se encontra em solução hipotónica, o DNA
apresenta-se na forma de fibras de cromatina de 10 nm de
diâmetro, assemelhando-se a um colar de contas, sendo que cada conta é um nucleossoma – a unidade
básica de compactação de DNA nas células, constituído por 147 pares de bases ligados a um octâmero
(constituído por um conjunto de oito histonas, de quatro tipos diferentes).
As histonas apresentam resíduos de aminoácidos carregadas positivamente, sendo que após a tradução
destas é possível, que estas sofram alterações (código das histonas), que determinarão a sua função e
compactação. Uma histona importante é a H1, por permitir a formação de fibras de cromatina de 30 nm
de diâmetro, estas fibras iniciam a sua formação pela orientação de duas colunas de DNA para esquerda
e enroladas sobre si próprias, originando depois, no seu conjunto, uma dupla hélice com orientação
para a esquerda.
De entre as histonas é igualmente de destacar a acção da HP1, ao permitir uma maior condensação do
DNA, levando à génese de mais heterocromatina. Essa maior condensação está pois associada a
trimetilações, enquanto as acetilações estão sobretudo associadas a um impedimento da condensação
da cromatina.
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De referir, que este processo avança ciclicamente,
até aparecer um “elemento de fronteira”, que
impede o resto da proliferação da heterocromatina.
O processo da produção de heterocromatina pode
ser então descrito pelo esquema da direita.
De entre a heterocromatina, é igualmente
importante referir que existe heterocromatina que
está permanentemente condensada e que se
denomina heterocromatina construtiva, não sendo
praticamente transcrita.
Estrutura do cromossoma
O cromossoma apresenta DNA associado a proteína,
designando-se cada molécula de DNA presente no
cromossoma por cromatídea. As cromatídeas estão
unidas por um centrómero. A extremidade do
cromossoma é o telómero.
Existem proteínas que, não sendo histonas,
desempenham importantes funções na manutenção
da estrutura do cromossoma – loops de DNA
associados a um scaffold cromossómico de proteínas
não histónicas, formam umas “argolas” designadas por SMC - Structural maintenance of chromosome.
A condensina é entendida como largos complexos proteicos com uma função fundamental na estrutura
de um cromossoma.
O cariótipo é entendido como o diagrama organizado dos cromossomas metafásicos de uma espécie e
tem em conta, o número de cromossomas de uma determinada espécie, a sua forma e tamanho.
DNA binding proteins
AS DNA binding proteins são as proteínas que se ligam ao DNA (mais particularmente à sua periferia),
estas têm acesso às bases no interior da molécula de DNA, sem ser necessário desnaturá-la. Isso é
possível, especialmente, graças ao “sulco grande” da molécula de DNA, que permite a exposição das
bases nucleotídicas. As ligações estabelecidas entre o DNA e as proteínas são muito específicas,
formando à espécie de um efeito velcro.
Frequentemente, ligam-se ao DNA proteínas com estrutura secundária em α-hélice, mas as folhas
pragueadas β também conseguem reconhecer a dupla hélice de DNA, bem como ansas de aminoácidos
(como as da proteína p53, supressora tumoral).
A helix-turn-helix é um domínio comum de ligação ao DNA, sendo compostas por duas hélices e um
grupo turn, em ângulo fixo, sendo que uma hélice, a hélice de reconhecimento liga se à major groove do
DNA. O basic helix-loop-helix (bHLH) é uma variante, onde duas hélices estão conectadas por um loop.
Um caso particular de helix-turn-helix é o homeodomain e é observado nos repressores bacterianos.
O zinc finger é o motivo mais abundante de ligação nos animais. Tem um átomo de zinco a unir vários
resíduos de aminoácidos (entre 23 e 28), apresenta várias formas possível, mas geralmente, tem uma
hélice de reconhecimento.
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O leucin-zipper consiste em duas α-héllices de DNA, unidas por interacções hidrofóbicas, ao nível das
leucinas. Está associada à expressão de genes.
Os heterodímeros são resultado da junção entre o leucin-zipper e as hélice-ansa-hélice básicas, tendo
diferente especificidade de ligação ao DNA. Contudo, o número de combinações em cada célula é
limitado, dependendo sempre da sequência de aminoácidos de cada cadeia.
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Replicação de DNA
A replicação de DNA é o processo pelo qual se formam 2 moléculas de DNA exactamente, iguais à quais
lhe deu origem e entre si. É um processo semi-conservatvo feito por complementaridade de bases, algo
que foi comprovado numa experiência que utilizou isótopos de azoto num gradiente de Césio.
DNA Polimerase
A DNA Polimerase é a principal enzima a catalisar o processo de replicação DNA. Existem vários tipos de
DNA polimerase – nos procariotas, podemos referir as DNA Polimerases I, II e III (a DNA Polimerase III é
a principal, adicionando nucleotídeos e tendo capacidade de proof-reading, as restantes, sobretudo a II
intervêm somente no processo de reparação do DNA), enquanto nos eucariotas, são de salientar a DNA
polimerase α (também designada por DNA primase), a DNA polimerase β (que actua nos processos de
reparação de DNA) e as DNA polimerases δ/ε (com capacidade de adição de nucleotídeos e de proof-
reading. A DNA polimerase δ actua ao nível da cadeia leading, enquanto a ε actua ao nível da cadeia
lagging). A DNA Polimerase δ/ε é a enzima mais importante nas células eucarióticas, criando ligações
difosfoéster, de 5’ para 3’, quando as bases já estão emparelhadas, entre a molécula de DNA e um
desoxirribonucleosídeo trifosfato (levando à libertação de dois fosfatos). Esta enzima é similar a uma
mão fechada, com “dedos”, “polegar” e “palma”.
Esta enzima é incapaz de adicionar os desoxirribonucleotídeos a uma cadeia simples. Tem que existir,
por isso, na cadeia de DNA, um pouco de ligação dupla. Isto é algo que não acontece com a enzima DNA
primase.
Cadeia condutora (leading) e cadeia rápida (lagging)
Em microscopia electrónica é possível observar a replicação de DNA. As moléculas de DNA circular vão
sendo abertas, havendo crescimento bidireccional das cadeias, com formação das forquilhas de
replicação. A forquilha de replicação é a estrutura com forma de diapasão que se forma, aquando da
replicação do DNA. Nela distinguimos duas cadeias, a cadeia condutora, ou leading, e a cadeia lenta ou
lagging. A cadeia condutora é aquela onde o DNA é sintetizado de modo contínuo. A sua orientação 5’
para 3’ é de acordo com a direcção de síntese de DNA pela DNA polimerase. Por outro lado, na cadeia
lenta o DNA é sintetizado de modo descontínuo, alternando os fragmentos de Okazaki com primers de
RNA.
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Os fragmentos de Okazaki são as sequências de DNA, que se vão formando nas cadeias lentas e têm
cerca de 100-200 nucleotídeos nos eucariotas e 1000 a 2000 nos procariotas. Os primers de RNA são
pequenas regiões de ribonucleotídeos, com 3 a 10 nucleotídeos, acrescentados pela DNA primase (DNA
polimerase α), de forma a ser possível a síntese de DNA na cadeia lenta. Na cadeia leading também é
necessário um primer, para que se possa iniciar a replicação, dado que a DNA polimerase não pode
acrescentar nucleotídeos de novo.
A remoção dos primers é feita por acção da RNase H. Dado a presença de ribonucleotídeos nas cadeias
de DNA ser facilmente detectada nas células como algo anómalo e aberrante, estes são fácil e
rapidamente removidos. Os espaços livres são então preenchidos por desoxirribonucleotídeos
colocados pela DNA polimerase. A enzima DNA ligase, por seu turno, à conta de ATP, estabelece a
última ligação fosfodiéster.
Proteínas acessórias da DNA polimerase
A DNA helicase é essencial ao processo de replicação do DNA, pois permite a abertura da dupla hélice e,
por outro lado, o desenrolamento das cadeias simples, aquando da formação de uma nova cadeia dupla.
Esta proteína tem forma de anel, que progride, abrindo a cadeia de DNA.
Contudo, é necessário, que as cadeias simples, uma vez desenroladas, se mantenham simples. Esta é a
função da RPA – Replication Protein A, que simultaneamente mantém as cadeias simples acessíveis à
deposição de novos nucleótidos.
Já a PCNA - Proliferating Cell Nuclear Antigen – é uma proteína com três subunidades que permite que a
DNA polimerase esteja mais tempo ligada à molécula de DNA e não se separe desta. Isto porque a DNA
polimerase, por si só, tem pouca afinidade com a molécula de DNA. Nos procariotas, a sua homóloga é a
sliding-clamp protein.
O RFC – Replication Factor C - é um complexo que “trabalha em conjunto” com a DNA polimerase e que
se está constantemente a formar e a dissociar na cadeia lenta, visto dissociar-se do complexo que forma
com a DNA polimerase e com a PCNA e da própria molécula de DNA, quando se inicia a síntese de um
primer.
Nos procariontes, destaque ainda para a clamp-loading protein, que faz a hidrólise de ATP, permitindo
assim que ocorra a adição de desoxirribonucleotídeos.
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São igualmente necessários
mecanismos que evitem a
ocorrência de sobre-enrolamento
no DNA, função assegurada pelas
topoisomerases, que dão
pequenos cortes na molécula de
DNA, com esse intuito, e depois
restabelecem essas mesmas
ligações fosfodiéster, por elas
quebradas. Existem duas classes
de topoisomerases – a
topoisomerase I quebra a cadeia
simples de DNA e está muito
próxima da forquilha de abertura
e a topoisomerase II quebra a
cadeia dupla, assumindo um
papel fundamental para que
ocorra a separação dos
cromossomas e a “mudança de
lugar da cadeia de DNA”.
Ao conjunto formado entre a DNA
helicase a DNA primase dá-se o
nome de primossoma.
Verificação da replicação pela DNA polimerase
Apenas um em cada 109 nucleotídeos é incorporado incorrectamente durante a replicação de DNA.
Embora, ao ser realizada a polimerização de nucleotídeos, um em cada 105 nucleotídeos seja
incorporado erroneamente, o mecanismo de exonucleotytic proofreading, operado pela enzima DNA
polimerase, permite que apenas subsista um erro em cada 102 nucleotídeos e o processo de Strand
directed mismatched repair, leva a que também apenas subsista um erro em cada 102 nucleotídeos. A
acção combinada destes três mecanismos leva então a que apenas “passe” um erro em cada 109
nucleotídeos sintetizados.
O processo de proof-reading da DNA polimerase é possível graças à actividade de exonuclease desta
enzima. Este processo é possível de 3’ para 5’, sendo que a DNA polimerase reconhece os nucleotídeos
mal-emparelhados, pois esses não formam uma cadeia dupla correcta. A enzima em questão remove o
nucleotídeo errado e adiciona o correcto. Se a polimerização de nucleotídeos ocorresse, eventualmente,
de 3’ para 5’ nalguma das cadeias, ao se operar o processo de proof-reading, quando fosse detectado
um nucleotídeo errado e, posteriormente, removido, a cadeia ficaria incompleta e não poderia crescer
mais.
Origem e velocidade da replicação
Em E. coli, as origens de replicação são regiões do DNA ricas em pares A-T, que têm ligações mais fracas
(por apenas duas pontes de hidrogénio).
Nas células eucarióticas, a velocidade de replicação é 10 vezes mais lenta que nas procarióticas, devido à
presença de nucleossomas. Por isso, o genoma das células eucarióticas têm obrigatoriamente várias
origens de replicação, muito diferentes entre si às quais se ligam ORC – Origin Recognition Complex –
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proteínas com 6 subunidades cuja função é a de reconhecer as regiões de origem de replicação, ciclinas
e DNA-helicases. A um conjunto formado por entre 20 a 80 origens de replicação, dá-se o nome de
unidade de replicação.
É importante referir que o DNA não replica todo simultaneamente nas células eucarióticas, replicando
primeiro a cromatina menos condensada (eucromatina), contudo, todo o genoma é replicado.
Formação dos nucleossomas
Os tetrâmeros de histonas H3 e H4 nunca se separam durante a replicação, contrariamente às H2A e
H2B. A síntese dessas histonas é então feita imediatamente após a replicação de DNA. Como as
moléculas recém-formadas de DNA possuem então já histonas, as que se formam de novo, podem ser
depois modificadas de acordo com as que já estão ligadas ao DNA.
Replicação dos telómeros
A enzima telomerase assegura a replicação do DNA no telómero – extremidade cromossómica, que
apresenta no ser humano a sequência repetitiva GGGATT, pois este não é sintetizado na cadeia lenta,
pois, como é uma extremidade, seria aí impossível para a DNA polimerase sintetizar nucleotídeos.
Contudo, a maioria das células somáticas não exprimem a enzima telomerase, contrariamente às células
tumorais e embrionárias. Dessa forma, vão ficando com as extremidades cromossómicas cada vez mais
curtas, até ao ponto dos cromossomas se fundirem. Essa perda cromossómica leva à morte celular,
estando assim explicado, o motivo pelo qual as células somáticas normais apenas têm capacidade de
efectuar 40 replicações.
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DNA: Reparação e Recombinação
Danos no DNA
Cada célula humana sofre em média, por dia 104 a 10
6 eventos, físicos ou químicos, conducentes a
danos do DNA e, dessa forma, é essencial para a célula possuir mecanismos de reparação do DNA. A
célula não pode evitar que se dêem estes danos, visto que muitos são originados por produtos das
reacções metabólicas celulares, sendo a sua ocorrência normal.
De entre os danos que se registam no DNA, salientamos as reacções de hidrólise, de entre as quais,
despurinações – reacções de hidrólise, em que as bases púricas deixam de o ser – e as desaminações –
remoção de um grupo amina nas bases citosina, adenina e guanina. Também os danos oxidativos, onde
há perda de ligações oxidativas contribuem para lesões no DNA, bem como as alquilações, de onde se
salientam as metilações, onde grupos metilo se ligam a átomos de azoto.
Contudo, não são apenas agentes endógenos que contribuem para as lesões do DNA. A exposição a
certos agentes exógenos, como as radiações UV, que levam à formação de dímeros de timina ou
citosina, ou alguns produtos químicos, que levam por exemplo a metilações e etilações, propicia à
ocorrência de danos na molécula de DNA.
Cada cadeia de DNA apresenta uma cópia (um backup), devido ao facto de se encontrar ligada a uma
cadeia com bases complementares. Isto faz com que a molécula de DNA seja a molécula ideal para
armazenamento de informação genética. A presença de apenas quatro nucleotídeos diferentes facilita
igualmente, a reparação de erros.
Reparação directa do DNA
Existem mecanismos de reparação directa do DNA,
nomeadamente a reversão directa (direct reverse) de um dímero
de timina, formado aquando da exposição a radiação UV e que é
possível em bactérias e algumas células eucarióticas, sendo
levada a cabo por uma enzima. Algumas enzimas das células
humanas têm também a capacidade de cortar um grupo metilo
indevidamente ligado a um nucleotídeo.
Reparação por remoção e substituição de bases ou
de nucleotídeos
O processo de base-excision-repair (reparação por excisão de
uma base) é útil para quando ocorrem desaminações, um tipo de
mutação muito frequente. Dessa forma, quando devido a este
tipo de mutações, se geram nucleotídeos errados, a enzima DNA-
glicosilase quebra as ligações entre a base nucleotídica e a
desoxirribose, deixando o local apuriníco, ou apirimídico – temos
então um AP-site. Os AP-sites também se podem formar por
perda espontânea de uma base.
De seguida, a AP endonuclease corta a ligação fosfodiéster entre
dois nucleotídeos, no AP-site e a desoxirribosefosfodiesterase,
uma exonuclease, remove o que restava daquele nucleotídeo
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antigo. Isto permite finalmente que a DNA
polimerase e a DNA ligase possam repor o
nucleotídeo correcto.
Todavia, muitas mutações não podem ser
corrigidas simplesmente pela remoção de uma
base e um nucleotídeo mutado altera, inclusive, a
configuração local da molécula de DNA. Quando
temos dímeros de timina e de citosina, o processo
utilizado é a nucleotide excision repair, onde as
helicases removem uma grande quantidade de
nucleotídeos adjacentes ao dímero.
Posteriormente, reconstrói-se a região em falta,
com recurso à DNA polimerase e à DNA ligase.
Nas células dos mamíferos, estes danos do DNA
são reconhecidos pelas proteínas XPA – XPG
(sendo que algumas destas proteínas têm
também função de helicase e até endonuclease),
e mutações nestas levam à doença Xeroderma
pigmentosum, onde se registam frequentes
tumores cutâneos.
O processo de reparação do DNA associada à transcrição em células eucarióticas (transcription-coupled
repair) é importante na medida em que as mutações do DNA são reparadas mais rapidamente se
ocorrerem numa região transcricionalmente activa, pois as RNA polimerase que estão a fazer a
transcrição param se encontrarem um dano que lhes impeça de realizar a sua função. Essa paragem é
prontamente detectada pelas proteínas CSA e CSB que activam as proteínas XPA-XPG, que realizam um
processo que será depois similar ao anterior. Associado à deficiência na capacidade das células
repararem DNA que está sendo transcrito, temos o síndrome de Cockayne, cujos pacientes apresentam
desordens multi-sistémicas.
Reparação associada à replicação
Após ocorrer replicação de DNA, a enzima DNA
polimerase tem capacidade de proof-reading e detecta
emparelhamentos errados, substituindo-os por correctos.
Porém, por vezes escapam mismatches. Estes
mismatches são detectados e corrigidos pelo processo de
mismatch repair, que ocorre após a replicação do DNA.
A detecção de regiões onde ocorrem mal-
emparelhamentos é feita à conta de proteínas,
nomeadamente, nos procariotas, as proteínas Mut (Mut
S, Mut L e Mut H), que reconhecem nucleótidos
metilados. A Mut L, a Mut S, uma helicase e uma
exonuclease contribuem para a excisão do fragmento
onde se encontra o nucleótido mal-emparelhado.
Finalmente, a DNA polimerase e a DNA ligase colocam um
fragmento correcto, em substituição.
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Nos eucariotas, o mismatch repair é operado pelas proteínas MSH. O reconhecimento do mismatch é
levado a cabo pela MSH2 e MSH6, a excisão pela DNA helicase, pela DNA exonuclease, pela MLH1
endonuclease e pela PMS2. Finalmente, a regeneração da cadeia fragmentada é levada a cabo pela DNA
polímerase e pela DNA ligase. Apesar disso, não se sabe muito bem como é que as MSH detectam quais
os nucleótidos que foram colocados erradamente. Mutações nas proteínas MSH leva a uma tendência
para os indivíduos desenvolverem cancro do colo do útero e colo-rectal.
Reparação error-prone
Quando nenhum dos
mecanismos enumerados
anteriormente funciona e
quando, aquando de uma
nova replicação, a DNA
polimerase encontra uma
situação aberrante (por
exemplo, um dímero de
timina), esta enzima pára a
sua actividade, pois não
sabe o que fazer. Passa
então a actuar uma nova
DNA polimerase – a DNA
polimerase error-prone –
que não tem capacidade
de proof-reading e inicia a
polimerização de nucleotídeos “à toa”, inserindo muitos por estimativa (e obviamente, muitos errados).
Contudo, isto evita que a célula morra, algo que aconteceria, caso não ocorresse replicação, de todo. A
cadeia nova que se forma, serve então como
molde para a remoção do erro que estava na
cadeia original. Este processo designa-se por
reparação por translesion DNA synthesis, ou
reparação error-prone.
Reparação por end-joining
O processo de reparação por end-joining ocorre,
quando se verificam quebras na dupla cadeia de
DNA. Ocorre então o reconhecimento dessas
extremidades por parte das proteínas Ku e por
acção destas e de outras proteínas, ocorre
remoção de nucleotídeos próximos das
extremidades e, depois, junção destas. Isto, claro,
leva a perda de informação genética.
Recombinação homóloga do DNA
Já o processo de recombinação homóloga do DNA
ocorre entre regiões homólogas de cromossomas
muito similares, aquando de um fragmento num
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dos cromossomas. Ocorre então remoção da
região em torno das extremidades do
fragmento, por acção de uma exonuclease e
forma-se posteriormente um heteroduplex,
após uma strand invasion, operada pelo
cromossoma homólogo. O heteroduplex
formado permite que a cadeia com a região
fragmentada, por complementaridade de
bases, relativamente ao cromossoma
homólogo, possa “preencher” a região em
falta.
As proteínas RecA (nos procariontes) e Rad51
(nos mamíferos) são essenciais para a
formação do heteroduplex, pois catalisam a
ligação de uma cadeia simples de DNA a uma
dupla. A proteína Rad52 favorece a ligação da
Rad51 à cadeia simples de DNA. As regiões de
heteroduplex podem migrar da cadeia dupla,
espalhando-se por branch migration. Isto
pode ocorrer sem acção de enzimas (e então
ocorre bidireccionalmente) ou,
unidireccionalmente, com acção de enzimas
(com função de helicase). Neste processo não
ocorre perda de nucleotídeos.
A recombinação molecular genética homóloga
que ocorre na meiose é muito similar à reparação por recombinação. A Spo11 e a Mre11 vão começar
por provocar falhas na molécula de DNA de um cromossoma, estimulando-a à invasão do cromossoma
vizinho, promovendo-se assim a recombinação genética homóloga, através das junções de Holliday
(uma junção móvel entre quatro cadeias de DNA).
Isto permite o processo
designado por crossing-
over, que ocorre em cerca
de 10% das moléculas de
DNA, bem como o processo
de conversão genética.
Enquanto no processo de
crossing-over ocorre uma
troca de segmentos entre
cromossomas, no processo
de conversão genética um
cromossoma transfere uma
pequena porção para outro (sem que haja perda de informação genética para o cromossoma dador). A
recombinação pode ser prevenida, caso não haja homologia entre as sequências de nucleotídeos,
através de um mecanismo de mismatch repair.
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Recombinação não-homóloga do DNA
A recombinação não-homóloga de DNA não implica homologia de sequências específicas de DNA.
Participam neste processo, recombinases que funcionam de modo similar às topo-isomerases. As
recombinases reconhecem dadas sequências de DNA, cortam-nas e recombinam-nas com sequências
não-homólogas. Este processo de “site specific recombination” é muito importante para a formação dos
anticorpos e daí, 25000 genes originarem cerca de 1011
anticorpos diferentes. Este processo de RV(D)J
Recombination é possível graças à presença das proteínas RAG 1 e RAG 2, expressas especificamente
nos linfócitos.
Esta diversidade tal de anticorpos é essencial ao funcionamento do sistema imunitário dos vertebrados,
na medida em que permite que uma imensa quantidade de antigénios seja reconhecida.
Amplificação genética
Em algumas células como as tumorais ou de ovócito, alguns genes são replicados muitas vezes (muito
amplificados) antes de se dar a replicação completa do genoma total, num processo designado por
amplificação genética. Isto permite aumentar a influência que esse gene apresenta no fenótipo.
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Transcrição: Síntese do RNA mensageiro
A ribose é o monossacarídeo presente na molécula de RNA. Esta estrutura tem um grupo –HO, em vez
de um grupo –H, no carbono 2, como acontece com a desoxirribose. Isto torna o RNA muito mais
reactivo e leva a que este se encontre, quase sempre, sob a forma de cadeia simples (estrutura primária
do RNA). Apesar disso, o RNA pode assumir estruturas tri-dimensionais, que determinam diferentes
funções. De entre as estruturas secundárias formadas encontramos o hairpin e o stem loop e de entre
as terciárias, destaque para o pseudo-nó. A formação de estruturas tri-dimensionais do RNA é muito
importante, na medida em que permite a activação de reacções químicas, por parte do RNA. As
ribozimas são então RNA com actividade enzimática.
RNA polimerases e RNAs transcritos
A transcrição de DNA é entendida pela polimerização de RNA utilizando uma cadeia molde de DNA,
adicionando-se ribonucleotídeos por complementaridade de bases. O crescimento da cadeia de RNA
ocorre sempre de 5’ para 3’, sendo a reacção catalisada pelas RNA polimerases, sem necessidade da
adição prévia de primers. Existem três classes de RNA polimerases que codificam diferentes RNAs:
Estas enzimas distinguem-se também pela diferente sensibilidade a uma toxina, a α-amanitina, sendo
que a RNA polimerase II é mais sensível que a RNA polimerase III a RNA polimerase I é lhe insensível.
Todas as RNA polimerases são constituídas por várias subunidades, algumas delas homólogas com as da
DNA polimerase, sendo a estrutura dessas subunidades muito conservada durante a evolução. De entre
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as subunidades encontramos duas maiores do tipo β (as quais nos eucariotas, denominamos por RPB1 e
RPB2), duas do tipo α e uma do tipo ω. As RNA polimerases adicionam erradamente 1 em cada 10000
nucleotídeos. Contudo, estas enzimas possuem capacidade de proof-reading (não tão elevada como a
da DNA polimerase).
A RNA polimerase II apresenta, numa das suas subunidades grandes, uma cadeia carboxílica terminal (C
Terminal Domain), que é constituída por cadeias repetidas de sete aminoácidos, variando o número de
repetições entre 26 e 52 (são 52 nos vertebrados). Esta cadeia sofre hiperfosforilação durante a etapa
de iniciação da transcrição, sendo essencial no processo de transcrição, nomeadamente, em regiões
onde existe muita actividade nesse sentido.
Transcrição do DNA em mRNA
O processo de transcrição de DNA inicia-se ao nível do nucleotídeo +1. Todos os nucleótidos que se
encontram antes desse nucleótido, dizem que se encontram “a montante”, ou upstream, sendo
contados negativamente. Dos nucleótidos que se encontram depois, diz-se que estão a “jusante”, ou
downstream, contando-se positivamente. Este processo envolve genericamente três etapas – iniciação
(que concerne a abertura da cadeia de DNA, ficando desemparelhados 14 nucleotídeos), a fase de
alongamento e a terminação.
As sequências de consenso são sequências com cerca de 10 nucleotídeos, que são muito conservadas e
que se encontram próximas dos locais de início de transcrição. A estas sequências, da qual é exemplo a
TATA box, ligam-se factores proteicos, essenciais para que a RNA polimerase possa actuar. Alguns genes,
contudo, não necessitam de sequências de consenso dos promotores para serem transcritos,
apresentando estes, normalmente, baixa actividade transcriptiva. Existem ainda regiões do DNA que
funcionam como activadoras e de aumento da actividade transcriptiva – são os Promotor-proximal
elements, que se encontram 100 a 200 bp upstream do local +1 e os enhancers, a mais de 200 bp do
local +1 (quer upstream, quer downstream). O complexo mediador é o responsável por “fazer a ponte”
entre a RNA polimerase II e as regiões activadoras.
A TBP liga-se à TATA box, seguindo-se o TFIID (o maior transcription factor destes aqui presentes) e o
TFIIB (TF significa transcription factor). Liga-se então a RNA polimerase II e, simultaneamente, o TFIIF.
Por último, liga-se o TFIIE e o TFIIH, ficando assim formado o complexo de iniciação. O TFIIH tem função
de helicase, permitindo a abertura da cadeia de DNA e de síntese, ligando grupos fosforilados à cadeia
carboxílica terminal (a ordem de ligação dos factores de transcrição é dada pela mnemónica, “Deus
Bom, Fé Em altura”, representando-se a altura por h como na física).
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Assim que se dá a fosforilação da CTD e adição do primeiro
ribonucleotídeo, desmonta-se o complexo de iniciação e
inicia-se a fase de alongamento. Nas células eucarióticas, a
velocidade de adição de ribonucleotídeos é muito
reduzida, nomeadamente devido ao super-enrolamento
verificado no DNA, a jusante da RNA polimerase e que é
gerado pela própria enzima (que paradoxalmente facilita o
desenrolamento do DNA à volta das histonas nos
nucleossomas). Contudo, o recurso a topo-isomerases
para desenrolar a cadeia é por vezes necessário.
No pré-mRNA formado existem sequências de
ribonucleotídeos que assinalam o início e o fim da
transcrição. O início é marcado pelo elemento upstream,
enquanto o fim é marcado pelo elemento downstream.
Processamento
Após a transcrição forma-se um pré-mRNA, ou seja um
mRNA que ainda não sofreu processamento e que ainda
não está pronto para ser traduzido. O processamento
conduz assim à formação de um mRNA maduro e envolve a
ocorrência de capping, clivagem, splicing e poli-adenilação.
O capping ocorre na extremidade 5’, que se liga a uma
guanosina, quando o mRNA começa a sair da RNA polimerase (através de uma ligação 5’-5’). Essa
guanosina é então metilada, originando-se 7-metilguanosina. O cap permite a protecção da
extremidade 5’ da degradação enzimática e que aquela molécula seja reconhecida como mRNA. Por
outro lado, o cap é um factor que contribui no transporte do mRNA para o citoplasma. De referir que o
capping ocorre concomitantemente à metilação da ribose do primeiro nucleotídeo.
Ao mRNA recém-formado ligam-se também proteínas (levando à formação de ribonucleoproteínas -
RNP), com o objectivo de prevenir a formação de estruturas tri-dimensionais e de reconhecimento de
sequências de nucleotídeos. Existem igualmente RNA-binding proteins, cujo objectivo é o de manter a
estabilidade do RNA.
Na clivagem (cleavage)
ocorre um corte na
molécula de pré-mRNA,
no sentido da região do
elemento downstream
(ou seja na extremidade
3’), algo que é catalisado
por endonucleases e que
requer a existência de
factores de estimulação
deste processo,
nomeadamente o CstF e o
CPSF.
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O processo de splicing, por sua vez, consiste na remoção dos intrões do pré-mRNA. Quando este é
muito longo e contém muitos intrões, o splicing é feito ainda aquando da transcrição. Contudo, quando
o pré-mRNA é pequeno, ocorre mais ou menos simultaneamente splicing e poli-adenilação. A poli-
adenilação é um processo que consiste na adição de uma cauda poli-A (sem que seja necessária a
adição de outras estruturas prévias), constituída por uma elevada quantidade de adeninas, à
extremidade 3’, por acção da enzima PAP (polyadenylate polymerase). A cauda poli-A impede a
degradação do mRNA, podendo-se ligar proteínas a esta estrutura – as poli-A binding proteins.
Para que ocorra splicing é necessária a intervenção de pequenos RNA, que reconhecem regiões de
intrões e promovem a sua eliminação da cadeia de mRNA. O mecanismo de splicing envolve então o
reconhecimento de três sequências de consenso do intrão – o local de splicing em 5’, o local de splicing
em 3’ e o branch point (sítio de ramificação, onde a extremidade 5’ se vai ligar) Dessa forma,
compreende-se que o emparelhamento entre o pré-mRNA e os pequenos RNA (nomeadamente os
pequenos RNA U1 e U2) seja essencial para que ocorra este processo. O primeiro pequeno RNA a ligar-
se é o U1, na extremidade 5’ de um intrão. Seguem-se as proteínas/factores de splicing BBP e U2AF e
posteriormente liga-se, no branch point, o pequeno RNA U2. Ligam-se depois os pequenos RNAs U4, U5
e U6, sendo formado um complexo ribo-proteico, ao qual se dá o nome de spliceossoma, que tem
aproximadamente a massa de um ribossoma. Após sucessivas ligações RNA-RNA, que envolvem gastos
de ATP, o intrão é eliminado da cadeia de RNA, sob a forma de lariat intron (intrão em forma de laço) e,
já sob a forma linear, degradado no interior do núcleo, por acção de enzimas.
De forma a não serem removidos os exões, durante o processo de splicing, ligam-se proteínas aos exões
– as proteínas SR. Os intrões, de maiores dimensões, formam complexos hnRNP (heterogeneous
nuclear riboproteins) e são posteriormente degradados. Estas ligações são fundamentais, de forma a
permitir que o spliceossoma distinga intrões de exões. Se um exão for removido indevidamente, podem
ser originadas patologias, da qual é exemplo a atrofia muscular espinhal.
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Nas células eucarióticas há outros mecanismos de splicing, que são, contudo mais raros, nomeadamente
o splicing do tipo U12, que ocorre com ligação do pequeno RNA U11 à extremidade 5’ do intrão e do
pequeno RNA U12 ao branch point. Já o trans-splicing consiste num mecanismo, em que dois exões
separados se ligam, ocorrendo concomitantemente remoção do fragmento de intrão que entre eles se
interpunha. Este processo ocorre com a intervenção de pequenos RNA e é característico do
Trypanosoma e dos nemátodos.
Em alguns protozoários existe self-splicing, onde o próprio RNA catalisa as reacções de splicing, sem que
haja intervenção de proteínas. No self-splicing, um cofactor de guanosina liga-se ao local de splicing em
5’ do intrão, que tem actividade enzimática (Grupo I); ou o próprio intrão apresenta uma adenosina que
“ataca” o local de splicing em 5’, catalisando a sua clivagem (Grupo II) e, consequentemente, a sua
própria remoção. O splicing alternativo ocorre em fragmentos que contenham muitos exões, podendo
ser removidos alguns, sem perda de função celular e, como tal, podem ocorrer inúmeras combinações
entre exões, o que contribui para um aumento da variabilidade genética. Analogamente ao splicing
alternativo, existe também cleavage alternativa.
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Transcrição do DNA: Síntese do tRNA e do rRNA
Numa célula em crescimento rápido, cerca de 80% do RNA é rRNA, sendo que quanto maior for a
actividade metabólica da célula, maior a percentagem de rRNA. O tRNA, por sua vez, conta cerca de 15%
da quantidade de RNA existente na célula e apenas 5% do RNA celular é mRNA.
Síntese do rRNA
A RNA polimerase I participa ao nível da síntese de rRNA, actuando unicamente ao nível dos nucléolos,
onde este processo ocorre. Um nucléolo é constituído por um componente fibrilar denso, um centro
fibirlar e um componente granular. O componente fibrilar
denso, que apresenta um aspecto mais escuro, quando
visualizado em microscopia electrónica, é o local onde
ocorre síntese activa de rRNA. Este migra para o
componente granular, o local do nucléolo, onde é visível a
presença de grânulos de cerca de 15 nm de diâmetero e
onde ocorre a maturação do rRNA, através da sua
clivagem. O centro fibrilar apresenta um aspecto mais
claro, onde está presente o DNA codificante de rRNA, que
não está transcricionalmente activo naquele momento.
Finalmente, completada a maturação, o rRNA migra para o
citoplasma.
No final da telofase, aparecem vários pequenos nucléolos, que depois se unem, aquando da replicação
do DNA e se separam outra vez, aquando da mitose. Como já foi referido, quanto maior forem as
dimensões e o número de nucléolos, maior a actividade metabólica da célula.
Os genes que codificam os nucléolos, no final
da telofase, são os NOR (organizadores
nucleolares), que não se encontram no
nucléolo (nesta estrutura apenas
encontramos genes que codificam para
rRNA), mas nos pares de cromossomas
13,14,15, 21 e 22.
A transcrição activa de rRNA pode ser
observada através das imagens de árvore de
Natal. A bactéria E. coli apresenta 7 cópias
para o gene que codifica rRNA, enquanto o
ser humano tem entre 200 e 250 cópias, não
sendo todas transcritas activamente, em
simultâneo. Este número muito elevado de
cópias, permite a produção de muitas cópias
de rRNA por intervalo de tempo. Estas cópias
dispõe-se numa sequência em tandem
array, constituída por sequências de
unidades de transcrição intervaladas com
DNA spacers, que não são transcritos. Nas
unidades de transcrição, existem ainda
partes que são transcritas, mas não são
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codificantes.
No DNA que codifica o pré-rRNA, existe um upstream
element (UCE), a entre 155 e 60 nucleotídeos a montante do
local de início da transcrição e um core element que se
encontra no local entre -40 e +5. Para a RNA polimerase I se
ligar aos promotores é necessário que se liguem primeiro
factores de transcrição, nomeadamente, o UBF (upstream
transcription factor), o Selectivity Factor 1 (SL-1, composto
pelos TAF) e o core factor (CF). O UBF tem como função o
reconhecimento do upstream element (sendo por isso um
upstream binding factor), ao qual se liga também o SL-1. O
core factor reconhece o core element. Uma das subunidades
do SL-1 é a TATA binding protein, apesar de no DNA em
questão não existir nenhum promotor com sequência
homóloga à TATA box.
Após ocorrer o processo de transcrição (que fica completo
aquando da clivagem da extremidade 3’ do DNA), forma-se
um transcripto primário com 45S (unidades de
sedimentação), que vai sofrer um processamento, que inclui
clivagem (é retirada a extremidade 5’ e as regiões não
funcionais) e modificações químicas nas bases (por exemplo, metilações nas riboses). Este transcrito
originará, então, por clivagem, uma cadeia de 28S, uma de 5.8S (unindo-se estas duas, que se formam a
partir de uma de 32 S, para originar o que será a subunidade grande do ribossoma, juntamente com
uma cadeia de 5S) e uma cadeia de 20S (que depois passará a 18S, originando a subunidade pequena do
ribossoma).
O pequeno RNA U3 é o responsável pela remoção da extremidade 5’, sendo que as restantes regiões
não-codificantes de RNA são clivadas e imediatamente degradadas por enzimas. Os snoRNAs (pequenos
RNAs nucleolares), que são pequenos RNAs que são transcritos
pela RNA polimerase II, pela RNA polimerase III e até por
intrões, participam no processo de processamento de RNA,
nomeadamente, por complementaridade de bases, permitem
a exposição das bases que devem ser metiladas ou sofrer
outras alterações. Os snoRPs box C+D posicionam uma enzima
que metilará bases do pré-rRNA (tendo, por isso, actividade de
metil-transferase), enquanto os snoRNPs box H + ACA
posicionam uma enzima que converte a uridina em pseudo-
uridina.
O RNA ribossomal 5S integra a subunidade grande do
ribossoma e é sintetizado pela RNA polimerase III. O complexo
de iniciação envolve a presença dos factores de transcrição
TFIIIA, TFIIIB e TFIIIC (TF significa transcription factor), sendo o
promotor associado a este processo a box c.
O ribossoma não é apenas constituído por rRNA,
apresentando também proteínas. O processamento do rRNA
ocorre simultaneamente à associação com proteínas, sendo
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31
que a subunidade pequena é “produzida”
mais depressa que a grande, pois
começa-se a ligar a proteínas ainda na
fase de transcrição. Já a subunidade
grande sofre a clivagem final no
citoplasma, após ter migrado, algo
importante, na medida em que, isto
impede que a síntese de proteínas ocorra
no núcleo. De referir que a subunidade
grande sofre também controlo de
qualidade (depois de actuarem helicases,
com o objectivo de fazer a clivagem de
eventuais snoRNAs que se ligaram ao
rRNA). O transporte desta subunidade é
também muito lento, visto que esta é do
tamanho do poro nuclear, tendo que se
desligar primeiro a maior parte das
estruturas que lhe estavam ligadas.
A RNA polimerase III tem como função a síntese do tRNA, que ocorre ao nível do nucleoplasma. Para se
formar o complexo de iniciação para a RNA polimerase III, ligam-se primeiro o TFIIIC (que se liga aos
promotores box A e box B) e o TFIIIB. Após a transcrição, o tRNA sintetizado sofre clivagens
(nomeadamente na extremidade 5’ e na extremidade 3’). Depois, é adicionada à extremidade 3’, uma
sequência CCA, essencial para a ligação dos aminoácidos, aquando do processo de tradução. Segue-se a
modificação de cerca de 10% dos nucleótidos do tRNA, podendo este ainda sofrer splicing. O splicing no
tRNA ocorre exclusivamente por acção de enzimas proteicas, nomeadamente endonucleases,
fosfotransferases e ligases. Os tRNA produzidos são exportados para o citoplasma, através do complexo
de poro nuclear por acção de uma exportina.
Aquando da síntese de snRNAs na presença da RNA-polimerase III, o promotor apresenta a TATA box,
estando ligados ao promotor o TFIIIB e o SNAP, aquando da presença do complexo de iniciação.
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Núcleo celular
O núcleo é um organelo extremamente dinâmico e que apresenta grandes dimensões,
comparativamente aos restantes organelos celulares (cerca de 6 μm, nas células dos mamíferos). A
presença deste organelo é um elemento-chave para fazer a distinção entre células eucarióticas e
procarióticas.
Observação e estudo do núcleo celular
O núcleo cora por acção de corantes básicos, devido à presença substancial de ácidos nucleicos.
Contudo, estes corantes não permitem distinguir o DNA e o RNA. Dessa forma, o método de Feulgen
emprega-se com o fim de evidenciar histologicamente somente o núcleo – ocorre remoção do RNA
existente nos núcleos, por acção do ácido clorídrico, dando-se a quebra entre as ligações ocorridas entre
as bases púricas e os grupos desoxirribose. Isto permite que haja reacção com o reagente de Schiff e que
o DNA apareça visível, de cor vermelha. Utilizando esta técnica, os nucléolos aparecem incolores, pois
são, sobretudo, compostos por RNA. A
observação do núcleo por imunofluorescência é
igualmente possível, sendo utilizado o DAPI, um
corante fluorescente, que se liga ao DNA, sendo
emitida, por consequência, uma cor azul.
O método da contrastação regressiva do EDTA
permite igualmente o estudo do núcleo celular –
entre a aplicação de acetato de uranilo e citrato
de chumbo, utiliza-se EDTA, um ácido que
permite a obtenção de um “negativo” do que
seriam as imagens de normal contraste, isto é, as
partes claras correspondem a locais de maior
presença de DNA e as partes mais escuras a
locais como fibirlas e grânulos. Os núcleos
celulares podem igualmente ser isolados e
purificados por ultracentrifugação, sendo os
primeiros organelos a sedimentar, devido à sua
massa.
Territórios cromossómicos e corpos nucleares
As moléculas de DNA, em interfase, não ocupa áreas aleatórias do
núcleo, designando-se essas áreas restritas ocupadas por cada
cromossoma por território cromossómico. Após cada ciclo celular, os
cromossomas continuam a ocupar aproximadamente os mesmos
territórios cromossómicos. Entre esses territórios, existem domínios
intercromossómicos, onde ocorrem reacções muito importantes.
No núcleo encontramos vários domínios, denominados corpos
nucleares (também designados por domínios nucleares), que não
são rodeados por membranas, mas que mesmo assim, apresentam
concentrações elevadas de proteínas específicas e RNAs, o que leva à
formação de estruturas quase esféricas. Os corpos nucleares mais
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proeminentes são os
nucléolos. Contudo, existem
muitos outros que têm vindo
a ser detectados devido a
técnicas de
imunofluorescência ou à
contrastação progressiva por
EDTA.
Os focos ou fábricas de
replicação são os locais onde
se origina a replicação
cromossómica, sendo que
estes só se observam durante
a fase S do ciclo celular. Já os domínios de transcrição podem ser observados recorrendo a técnicas de
imunofluorescência, quer no núcleo, quer nos nucléolos.
Os locais onde ocorre a síntese e amadurecimento dos rRNA são os nucléolos, locais onde é possível
distinguir um componente fibrilar denso, um centro fibrilar e um componente granular. Os nucléolos
são formados em torno de loci específicos – os NORs (regiões organizadoras de nucléolos).
As fibrilas pericromatínicas estão sempre entre os domínios intercromossómicos, na periferia da
cromatina condensada. As fibrilas são enriquecidas em RNA e provavelmente são locais de splicing do
pré-mRNA e de poliadenilação.
Os grânulos pericromáticos são regiões cuja função ainda não é bem conhecida. Provavelmente,
participam na acumulação de transcritos primários de RNA pré-mensageiro, que não sofreram
amadurecimento (por exemplo, splicing), não tendo sido ainda degradados. Em microscopia electrónica,
estes grânulos são regiões escuras, rodeadas por uma auréola clara.
Os gânglios intercromatínicos são também designados por speckles, sendo pequenas estruturas de
difícil visualização, devido ao facto de não se encontrarem em regiões de ocorrência de splicing. Pensa-
se que estas estruturas estão relacionadas com o armazenamento de snRPs e proteínas envolvidas no
splicing de pré-mRNa, que são lançadas no nucleoplasma, quando é necessário.
Os corpos espiralados, também designados por corpos de Cajal são locais onde os pequenos RNAs são
produzidos, sofrem maturação e são reciclados. Acredita-se que o processamento das histonas do
mRNA também ocorre ao nível dos corpos de Cajal. Cada célula eucariótica tem entre 3 e 10 corpos de
Cajal e estes são identificados graças à presença de coilina, o seu principal componente. Esta proteína,
que permite a ligação do corpo de Cajal ao nucléolo, hibridiza com a GFP, permitindo a detecção dos
corpos de Cajal.
Os corpos nucleares PML (Promyelocytic Leukemia) apresentam essa designação (associada à leucemia),
pois neles está presente uma mutação em indivíduos que padecem de leucemia. Existem entre 10 e 30
corpos nucleares PML por núcleo, embora não haja certeza relativamente à sua função. Provavelmente,
estes corpos funcionam como locais para modificação de complexos proteicos envolvidos na reparação
de DNA e na indução de apoptose.
Os corpos nucleares simples e os corpos nucleares complexos têm ainda função desconhecida, embora
se saiba que surgem aquando de um estímulo hormonal.
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A matriz nuclear é entendida como um “citosqueleto do núcleo”. Desconhece-se se esta existe de facto,
ou se as observações que induzem a crer na existência desta estrutura não são mais que o resultado das
preparações agressivas (quer por método de Comerford, quer por método de Kaufmann) às quais o
núcleo é sujeito, quando se procura averiguar a existência da matriz.
Invólucro nuclear
O invólucro nuclear delimita o núcleo e é formado por
uma membrana externa (com ribossomas associados e
em continuidade com o retículo endoplasmático rugoso),
uma membrana interna, separada da externa pela
cisterna perinuclear. Profundamente, à membrana
interna encontramos a lâmina nuclear, que é fibrosa e de
difícil visualização e dissociação. A atravessar o invólucro
nuclear encontramos poros nucleares.
Relativamente às lâminas nucleares, sabe-se que estas
estruturas contribuem para a regulação da replicação do
DNA e da divisão celular, para a organização da
cromatina e como forma de ancorar os complexos de
poro nuclear. As lâminas nucleares, ao ligarem-se
firmemente à membrana interna, dão mais resistência ao
núcleo. Estas estruturas são compostas por laminas (as laminas A, B e C), cuja fosforilação leva à
desagregação do invólucro nuclear durante a profase. A desfosforilação das laminas leva à
reorganização do invólucro nuclear. Quando ocorrem mutações nas lâminas nucleares podem ocorrer
laminopatias, patologias que resultam muitas vezes em progerias (doenças do envelhecimento
acelerado) e distrofias musculares.
O complexo do poro nuclear é formado por nucleoporinas e está fortemente ligado à lâmina nuclear.
Estes complexos são estruturas de grande dimensão que apresentam simetria octogonal, formando uma
estrutura “em cesto”. Estes complexos são essenciais para o processo de transporte nuclear.
Os canais aquosos são constituídos também por nucleoporinas, dispostas num arranjo em malha,
podendo ser atravessados por pequenas moléculas ou iões, por difusão simples. Moléculas com massa
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molecular superior a 40 kDa podem atravessar os canais aquosos, mas esse transporte depende de um
rearranjo da malha das nucleoporinas, de modo a ser possível formar um espaço maior.
Importação e exportação de proteínas
A importação de proteínas do citoplasma é levada a cabo pelas importinas. Estas proteínas ligam-se a
proteínas ligadas a NLS (sequências de reconhecimento nuclear) no citoplasma, formando o complexo
de carga. O complexo, por sua vez, entra no nucleoplasma, juntamente com o Ran-GDP. No citoplasma,
o Ran-GDP é fosforilado (à conta de GTP, numa reacção que envolve o composto GEF - guanine
nucleotide exchange factor – como “agente intermediário”), originando Ran-GTP, que se liga à
importina, levando ao desligamento da proteína de carga. O complexo formado pelo Ran-GTP e pela
importina atravessa então o poro nuclear e no citoplasma, este desmembra-se, por desfosforilação do
Ran-GTP.
Já a exportação de proteínas do núcleo é feita à conta da formação de um complexo, no núcleo, que
envolve a ligação de uma exportina a uma proteína ligada a NES (Nuclear export sign) e a Ran-GTP. Este
complexo atravessa o poro nuclear e no citoplasma desmembra-se, devido à desfosforilação do Ran-
GTP. Posteriormente, a exportina que é libertada no decurso dessa reacção entra “sozinha” no núcleo.
As proteínas responsáveis pela importação e pela exportação de proteínas (importinas e exportinas) são
genericamente classificadas como carioferinas.
A exportação de tRNAs e subunidades ribossomais ocorre de forma similar, mas o tRNA liga-se
directamente à exportina-t, enquanto as subunidades do ribossoma ligam-se à exportina Crm1.
Importação e exportação de RNA
A exportação de mRNA do núcleo não depende de Ran-GTP, sendo controlada por fosforilação e
desfosforilação de proteínas. Os mRNAs são então transportados pelo complexo de poro nuclear através
do mRNA exporter, um heterodímero. A ligação entre o mRNA e o complexo é levada a cabo pelo Factor
de exportação nuclear 1 (NXF1) e ocorre à conta de uma desfosforilação. Ainda no núcleo, antes do
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mRNA atravessar o poro nuclear, algumas proteínas dissociam-se nos complexos formados, algo que
ocorre à conta de uma fosforilação do complexo Npl3 associado ao mRNA. Outras são exportadas
juntamente com o mRNA, dissociando-se no citoplasma (passando, depois, “livres” para o núcleo).
Os snRNA, por sua vez, são exportados do núcleo integrados num complexo proteico. Estes complexos
atravessam o poro nuclear e dissociam-se no citoplasma. A entrada nos snRNAs para o núcleo é feita por
via de complexos proteicos com várias binding proteins – os snRNPs.
As hnRNPs (heterogeneous nuclear ribonucleoproteins) são complexos formados com pré-mRNA e
proteínas, como forma de indicar que o mRNA ainda não foi processado e que, como tal, ainda não está
preparado para ser transportado. Dessa forma, a exportação de RNAs funciona como um sistema de
controlo dos RNAs transcriptos. Os mRNA são transportados apenas após splicing completo e os tRNA
após modificações nas bases nucleotídicas.
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Genoma humano e doenças associadas ao DNA
O cariótipo de um organismo é definido pelo seu número, tamanho e forma dos cromossomas. O
cariótipo humano é constituído por 23 pares de cromossomas, sendo cada cromossoma constituído por
um braço longo (q) e um braço curto (p). A identificação dos genes é feita em primeiro pelo número do
cromossoma onde se encontram, seguindo-se a letra correspondente ao braço e depois o locus.
Genoma e complexidade dos organismos
O genoma humano é constituído por cerca de 30 000 genes, tendo cada região codificante 1,4 kb e um
gene 30 kb. Cada gene contém oito exões (com 135 bp) e 7 intrões (2200 bp). A densidade genica é de
apenas 11,5 genes por cada mega par de bases. Isto mostra que o número de regiões não-codificantes
do nosso genoma é muito maior que o número de regiões codificantes.
Na verdade, a complexidade dos organismos está intimamente relacionada com a percentagem de
regiões não-codificantes no genoma, nomeadamente sequências repetidas, pois quanto maior for esta,
mais complexos são os organismos. De resto, a complexidade dos organismos não está relacionada com
o tamanho dos genomas nem com o número de genes/cromossomas que estes apresentam.
Constituição do genoma humano
Os genes são constituídos por exões (que constituem entre 3 a 5% do genoma humano) e intrões, sendo
os intrões regiões não-codificantes. Do genoma humano fazem ainda parte os pseudogenes – unidades
não-funcionais resultantes da duplicação de genes previamente existentes. Estas duplicações do DNA
ocorrem aquando da replicação de um gene original e vão adquirindo mutações ao longo do tempo,
sem que para isso comprometam o organismo. Isto é um importante factor evolutivo, na medida em
que o pseudogene vai adquirindo características próprias e, eventualmente, funcionalidade, o que está
na base do aparecimento de famílias proteicas.
O conceito de “um gene, uma proteína” está hoje completamente obsoleto, pois devido aos processos
de splicing alternativo, ou por locais alternativos de início (alternative transcription start sites) e fim da
transcrição (alternative transcription termination sites), um determinado gene origina mais que um
mRNA e, por consequência, mais que uma proteína. De referir que a mesma porção de DNA pode conter
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genes diferentes, sobrepostos e em orientação oposta. Por exemplo os intrões de um dado gene podem
conter os exões de outro gene garantido a não partilha de regiões exónicas.
Também existe RNA não
codificante (ncRNA), que não é
traduzido (não originando,
portanto, nenhuma proteína), mas
que desempenha funções
importantes na célula.
Sequências repetidas do genoma
No genoma humano existem sequências repetidas, que se podem classificar em sequências repetidas
em tandem e sequências intercaladas.
As sequências repetidas em tandem
são também denominadas por DNA
microsatélite e consistem em
repetições de um pequeno conjunto de
nucleótidos. Estas sequências
classificam-se como STR (short tandem
repeat), caso o número de repetições
seja inferior a 10, ou VNTR (variable
number of tandem repeat), caso o
número de repetições seja inferior a 50.
Estas repetições originam-se aquando
da replicação do DNA e, dado o seu grau elevado de variabilidade, são amplamente utilizadas em testes
de paternidade ou na investigação forense, em processos como o DNA fingerprint. As sequências
repetidas em tandem representam cerca de 10% do nosso genoma.
As sequências intercaladas são também
designadas por transposões e são
elementos móveis não-funcionais, que
constituem entre 30% a 45% do nosso
genoma. O processo pelo qual estes
elementos móveis são copiados e inseridos
em novos locais no genoma é denominado
de transposição.
Os DNA transposões são obtidos por cópia
de uma sequência de DNA e “colagem”
noutro sítio, enquanto os retrotransposões
formam-se através de uma cópia de RNA,
que através da enzima transcriptase
reversa é reconvertida em DNA, que se
insere noutro sítio. Os retrotransposões
podem ser de vários tipos, destacando-se
os SINEs (short interspersed repeated sequences), cujo número de bases é inferior a 500, e os LINEs
(long interspersed repeated sequences), que têm origem viral.
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Os transposões são importantes veículos em termos de evolução e diversidade genética, uma vez que a
transposição genética, ao ocorrer, “arrasta” consigo, por vezes, genes adjacentes, que ao mudarem de
posição adquirem novas funções. Contudo, o processo de transposição ocorre muito pouco
frequentemente na espécie humana, verificando-se sobretudo ao nível das células germinativas.
Calcula-se que uma transposição ocorra nos seres humanos uma vez, em cada oito indivíduos!
Mutações
Uma mutação é entendida como uma qualquer alteração na sequência de DNA. Estima-se que ocorra
uma taxa de três mutações por indivíduo em cada geração, sendo as suas causas diversas. Parte das
mutações são transmitidas hereditariamente, mas existem outras que estão associadas a danos no DNA
provocados por factores ambientais (como o tabaco), ou agentes químicos (como a radiação UV).
Também eventos genéticos como a recombinação ou a transposição podem levar à ocorrência de
mutações. De referir que o último nucleótido do codão é o menos importante e o que mais sofre
mutações.
Os polimorfismos são modificações do genoma humano, que são frequentes (a sua frequência na
população excede o 1%, algo que ocorre por exemplo ao nível da anemia falciforme, que representava
uma vantagem evolutiva nos países onde a malária é endémica, visto proteger os indivíduos contra essa
doença). Podem ser silenciosos ou manifestar-se, por exemplo, como uma patologia. Contudo, mesmo
os polimorfismos silenciosos podem se manifestar através de uma ligeira alteração ou subtilezas no
modo de funcionamento, por exemplo, de uma dada proteína.
As mutações podem ser classificadas como génicas (pontuais), se ocorrerem somente numa base ou
estruturais (cromossómicas), caso seja afectada uma grande porção do cromossoma. Relativamente às
mutações de bases, podemos citar a formação de dímeros de timina por acção da radiação UV, a
metilação de citosinas, que pode levar à formação de timinas e o facto das sequências repetidas em
tandem serem locais frequentes de inserção/delecção, levando à génese de mutações durante a
replicação.
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Em termos de mutações cromossómicas, podemos referir as delecções (perda de segmentos
cromossómicos), as translocações (modificação do cromossoma onde estava inserido determinado
segmento), as inversões (modificação do local de um dado segmento cromossómico, dentro do próprio
cromossoma) e as alterações do número de cópias dos cromossomas. Estas mutações estruturais estão
geralmente associadas a graves patologias.
Embora as mutações sejam frequentemente entendidas como algo negativo, a verdade é que estas são
o grande motor da evolução. Já aqui foi referido, a título de exemplo, o caso do aparecimento dos
pseudogenes. Também a mutação que leva à manifestação de anemia falciforme no fenótipo não é de
todo prejudicial – é uma alteração génica presente nas populações de origem africana, visto ser benéfica
na protecção contra a malária.
O OMIM é a base de dados que apresenta toda a informação conhecida sobre patologias genéticas.
Técnicas de Biologia Molecular
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Cerca de 40% do genoma humano ainda está por caracterizar, nomeadamente genes que
aparentemente não têm relações com patologias ou com funções básicas do organismo. O estudo do
genoma assenta em várias técnicas, que se têm vindo a revelar úteis em termos de avanços da
medicina. As técnicas de biologia molecular passam pela análise de ácidos nucleicos, pela análise de
proteínas e pela regulação da expressão génica.
PCR
O PCR (Polymerase Chain Reaction) é uma técnica que permite amplificar um fragmento de DNA
através da utilização de dois primers específicos que determinam o início e o fim da região a amplificar.
É igualmente necessária a Taq DNA polimerase - uma DNA polimerase que é obtida através da bactéria
Thermus aquaticus e que suporta elevadas temperaturas, pois este processo ocorre em condições
térmicas que para a maioria das enzimas são incapacitantes. Finalmente, são necessários
desoxirribonucleotídeos, que vão sendo acrescentados às cópias de DNA produzidas.
O PCR consiste em 30
ciclos de 3 passos cada
– a primeira etapa é a
desnaturação da dupla
cadeia de DNA (ou seja
separação das cadeias),
algo que ocorre a uma
temperatura situada
entre 90º e 100ºC. O
segundo passo prende-
se com a ligação dos
primers – esta ocorre a
temperaturas situadas
entre os 50º e 65ºC e
designa-se por
annealing. Finalmente,
o processo de
elongação ocorre a
72ºC, temperatura
óptima para a Taq DNA
polimerase, sendo
neste processo adicionados os restantes nucleótidos. De referir que apenas ao fim de três ciclos,
conseguimos ter cadeias duplas com os fragmentos a ser amplificados com as dimensões certas.
Actualmente, utiliza-se muito o PCR em tempo real (Quantitative Real Time PCR), pois este processo
permite acompanhar a reacção de amplificação ao longo do tempo, através da molécula de CYBR green,
que é fluorescente e se intercala na cadeia dupla de DNA. A quantidade de fluorescência apresentada é
assim proporcional à quantidade de DNA produzida.
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Sequenciação de DNA
O metódo de Sanger é actualmente o mais utilizado para levar a acabo a sequenciação de DNA, apesar
de apenas ser possível a sequenciação de uma cadeia de cada vez. Para que este processo ocorra é
necessário que um fragmento de DNA já tenha sido previamente amplificado.
Para que este método ocorra, a síntese de DNA ocorre in vitro, sendo os fragmentos colocados em locais
onde existam primers (para ser levada a cabo a iniciação), nucleótidos normais e nucleótidos stop.
Existem então quatro locais onde decorrerá a sequência, sendo que cada local apresenta um tipo de
nucleotídeo stop diferente (um deles apresenta guanina stop, o outro citosina stop…), contudo, em
todos eles apenas existe 1 nucleotídeo stop em cada 100 nucleotídeos. Os nucleotídeos stop, que são
na verdade dideoxirribonucleosídeos trifosfato (ddNTP), apresentam um grupo –H ligado ao terceiro
carbono, em vez de um grupo –OH. Isto significa que, após um ddNTP ter sido integrado numa cadeia de
DNA, mais nenhum nucleotídeo pode ser acrescentado a esta.
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Dessa forma, as reacções procedem de
forma muito simples – As DNA polimerases
vão integrando nucleótidos nos diferentes
fragmentos de DNA presentes. Quando
calha de integrar um nucleótido stop numa
cadeia de DNA, a polimerização nessa
cadeia pára, mas continua nas outras, até à
integração de nucleótidos stop nestas.
Depois, para analisar a sequência de DNA
procede-se à electroforese em gel de
agarose, havendo revelação por
autorradiografia ou à análise automática
por uma máquina sequenciadora.
DNA microarray
O DNA microarray, ou chip array, permite analisar em simultâneo a expressão diferencial de milhares
de genes em populares celulares diferentes, algo particularmente útil para o estudo de doenças
poligénicas, como o Alzheimer, a esquizofrenia, ou o cancro.
Para levar a cabo este processo, extrai-se o mRNA de indivíduos de dois grupos, sendo que através da
trasncriptase reversa procede-se à síntese do respectivo cDNA. O cDNA é depois marcado com cores
fluorescentes diferentes, para distinguir os grupos. Os cDNAs são depois misturados e hibridizados com
as cadeias presentes nos chips (onde encontramos todos os genes com uma localização conhecida em
diferentes spots). De seguida, procede-se à sobreposição dos scans obtidos nos chips, permitindo, pelas
cores registadas em cada spot compreender quais os genes expressos em ambos os grupos e em cada
um dos grupos.
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Isto permite, a título de exemplo, classificar vários
tipos de cancro, nomeadamente que se traduzem
num fenótipo similar, de acordo com o seu perfil de
expressão genética. Isto é muito útil para a
administração de uma terapia personalizada, de
acordo com as características genéticas do indivíduo.
DNA recombinante em bactérias
O DNA recombinante permite a inserção e
propagação de DNA (por exemplo, um gene que
codifica uma proteína de interesse) em bactérias
(geralmente a E. coli) e requer para isso uma inserção
contendo o gene de interesse, um vector (um
plasmídeo, geralmente). Os plasmídeos são porções
de DNA circular, que não são essenciais para a
sobrevivência das bactérias e cuja replicação é
independente da do restante DNA bacteriano,
apresentando por isso uma origem de replicação.
Neste processo intervêm enzimas de restrição,
endonucleases que reconhecem sequências
específicas de 4 a 8 nucleótidos e que fazem a
clivagem dessas sequências palindrómicas (ou seja, que apresentam um eixo de simetria). Essa clivagem
origina extremidades “blunt” (ou seja, extremidades em que o corte é feito de forma abrupta,
orientado segundo uma linha recta), ou extremidades coesivas (extremidades em que o corte é feito
em “ziguezague”, formando uma espécie de encaixe) nos fragmentos de DNA. De referir que apenas são
utilizadas neste processo as enzimas que fragmentam o DNA, deixando extremidades coesivas.
O fragmento de DNA é então introduzido e integrado no plasmídeo, por acção da enzima DNA ligase (a
maior parte das vezes é utilizada a T4 DNA ligase). A entrada do plasmídeo para a bactéria, por sua vez,
é feita por choque térmico (transformação bacteriana por método químico), ou por um choque
eléctrico (transformação bacteriana por electroporação).
Para seleccionarmos quais os indivíduos que apresentam
a inserção, colocamos as bactérias num meio com um
antibiótico, visto que na inserção é sempre colocado
juntamente com o gene de interesse, um gene que
confere resistência a um antibiótico, já com o intuito de
fazer essa selecção. Obviamente, que as bactérias que
não apresentam a inserção morrem, aquando do
contacto com o antibiótico.
Finalmente, as bactérias sobreviventes são então
colocadas num meio de cultura, de forma a possibilitar a
síntese da proteína de interesse.
Actualmente, é possível realizar o processo de
transfecção – inserção de plasmídeos em células
eucarióticas e, inclusive, usar outros vectores que não
plasmídeos, tais como fagos lambda.
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Síntese e degradação proteica
Todos os componentes celulares têm um tempo de semi-vida, o qual é designado por turn-over e isto
inclui as proteínas, sendo que o seu turn-over é variável de acordo com a sua utilidade (proteínas mais
importantes, têm um período de semi-vida maior) e daí ser importante falar em síntese e degradação
proteica.
O dogma central da biologia celular assenta na ideia de que o DNA é transcrito em RNA, sendo a
informação contida no mRNA traduzida em proteínas. Contudo, é importante referir que para a síntese
proteica não intervém apenas o mRNA – o tRNA é também essencial, porque trazem aminoácidos para o
ribossoma, enquanto moléculas de rRNA estão contidas na “maquinaria” dos ribossomas.
Estrutura do mRNA
O mRNA apresenta, na sua extremidade 5’, um cap (7-metilguanoisna, que é vital para o
reconhecimento e ligação do mRNA ao ribossoma, bem como para a protecção contra exonucleases) e
na sua extremidade 3’, uma cauda poli-A, que contém entre 150 a 200 nucleótidos de adenina e que
protege o mRNA da degradação. No mRNA está ainda contida uma região, a ORF (ou Open Reading
Frame), que contém o conjunto de informação que será traduzida, sendo a ORF ladeada pela 5’UTR e
pela 3’UTR, regiões que não serão traduzidas, mas que contêm informações sobre o turn-over do mRNA.
As regiões UTR (Untranslated Regions) contêm, portanto, informações relativamente à estabilidade do
mRNA, contribuindo para esta. De referir que o mRNA é sempre lido de 5’ para 3’ e a construção dos
polipeptídeos é sempre feita do terminal amina, para o terminal carboxilo.
Dada a redundância do código genético (um aminoácido pode ser “codificado” por vários codões), cada
aminoácido pode se ligar a vários tRNAs. Apesar disso, não existe ambiguidade no código genético, ou
seja, um codão não pode codificar vários aminoácidos. Existem ainda três codões stop (UGA, UAA e
UAG, decoráveis através da mnemónica “U Go Away, U Are Away, U Are Gone”), que não são
reconhecidos por nenhum aminoácido, e um codão de iniciação (AUG, o único codão que codifica a
metionina). Com excepção da metionina, o triptofano é o único aminoácido codificado também por um
só codão (UGG). De referir que o código genético utilizado pela mitocôndria varia ligeiramente.
Estrutura do tRNA
O tRNA tem uma estrutura em forma de trevo,
tendo quatro loops, um dos quais contém o
anticodão, sequência pela qual o tRNA se liga
ao mRNA. Na extremidade 3’ do tRNA
encontramos a sequência de ligação ao
aminoácido.
O número de moléculas de tRNA diferentes é
igual ao número de codões diferentes
existentes. Contudo, os tRNAs com anticodões
redundantes não existem na célula na mesma frequência, havendo preferência de codões em todos os
organismos.
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46
Quando temos uma molécula de
tRNA ligada a um aminoácido,
dizemos que temos um aminoacil-
tRNA. As aminoacil tRNA sintetases
catalisam a formação de aminoacil
tRNA. Em primeiro lugar, um
aminoácido específico liga-se ao seu
respectivo local de ligação,
concomitantemente ao ATP, que se
liga ao seu local próprio nesta
sintetase. O ATP é então
desfosforilado, originando AMP,
ocorrendo a esterificação dos
aminoácidos. Aquando da ligação do
tRNA ao seu local específico naquela enzima, o AMP “desliga-se da enzima” e o tRNA pode finalmente
ligar-se ao aminoácido em causa, formando-se assim um aminoacil-tRNA.
Ribossomas
O ribossomas são ribozimas, pois o RNA presente (rRNA) tem acção catalítica. Estas estruturas são
constituídas por duas subunidades – a subunidade grande apresenta 49 proteínas e um coeficiente de
sedimentação de 60 S, enquanto a subunidade pequena apresenta 33 proteínas e um coeficiente de
sedimentação de 40 S. Contudo, o coeficiente de sedimentação total do ribossoma é de 80 S e não de
100 S, porque a sedimentação num gradiente de densidade não depende apenas do tamanho da
estrutura, mas também da sua forma. De referir que a percentagem de RNA num ribossoma é maior que
a de proteínas, estimando-se que seja de 60%. Os rRNAs apresentam estruturas secundárias e terciárias,
sendo estas conservadas em todas as espécies.
Podemos considerar três locais nos ribossomas – o local A (ou aminoacil) é o local por onde entram os
aminoacil-tRNAs. Por outro lado, o local P (ou peptidil) é aquele em que se forma a cadeia peptídica. Por
último, o local E é o local exit, por onde sai o tRNA. De referir que o resíduo C-terminal permanece
ancorado no local P ao seu tRNA.
Nos procariontes, os ribossomas apresentam 70S (a subunidade grande apresenta 50S e a pequena
30S), sendo a percentagem de RNA cerca de 66%.
Tradução
A tradução comporta três etapas – a iniciação (fase mais importante, pois é aquela em que se registam o
mecanismos de controlo), o alongamento e a finalização.
Iniciação
Em primeiro lugar, a subunidade pequena do ribossoma, liga-se ao mRNA, no local de iniciação, que se
inicia com a sequência AUG. Depois liga-se o tRNA iniciador (com a metionina) a essa região, sendo a
metionina depois removida na maior parte das proteínas.
A tradução começa sempre no codão de iniciação AUG, sendo a sua identificação essencial para definir
que proteína se quer de facto produzir, dado que existem vários quadros de leitura (reading frames)
possíveis no RNA. Este codão é então encontrado pelo seu contexto – nos procariontes existe uma
sequência 8 bp upsteram (a montante) ao AUG inicial (a sequência de Shine-Dalgarno), que se vai
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emparelhar com uma sequência complementar, encontrando-se esta na extremidade 3’ de uma
unidade de 16S de rRNA. Nos eucariotas, temos em torno do codão AUG uma sequência Kozak muito
conservada, que é reconhecida por um scan feito pela subunidade pequena do ribossoma.
O tRNA de iniciação que se liga ao codão AUG sofre então fosforilação nos eucariontes e formilação nos
procariontes. Este tRNA é o único que se liga ao lugar P do ribossoma e as alterações referidas têm por
objectivo, permitir a ligação deste tRNA ao local P. De resto, todos os outros aminoacil tRNAs ligam-se
ao local A. Associados ao processo de iniciação, existem factores de iniciação (IFs para os procariontes e
eIFs para os eucariontes).
Nos procariontes, o IF1 liga-se ao local A para que nele não se ligue outro tRNA, o IF2 liga o aminoacil
tRNA de iniciação ao local P e o IF3 impede a ligação das duas subunidades e destabiliza a capacidade de
outros tRNA se ligarem ao local P. Forma-se então um complexo de pré-iniciação, em conjunto com a
subunidade pequena. O IF2-GTP é posteriormente hidrolizado, o que leva à ligação da subunidade
grande e à formação do ribossoma funcional.
Já nos eucariontes, o eIF1A e o eIF2 têm função similar aos IF1 e IF2, respectivamente. O eIF4 remove as
estruturas secundárias do mRNA e ao ligar-se às extremidades, permite formar um loop entre o cap e a
cauda poli-A. Caso o loop não possa ser formado, nomeadamente, devido à ausência de cap, ou a uma
pequena extensão da cauda, o mRNA é degradado nos Processing bodies (P-bodies), que existem no
citoplasma e são estruturas dinâmicas, aparecendo e desaparecendo. Depois deste controlo de
qualidade (etapa limitante da iniciação), o eIF3 e o eIF6 associam-se respectivamente às subunidades
pequena e grande, mantendo-as separadas. O aminoacil-tRNA liga-se então à subunidade pequena,
ajudado pelo eIF2-GTP, forma-se um complexo nesta subunidade. Após esta fase, os eIF4 ligam-se à
subunidade pequena e fazem um scan, de modo a encontrar a sequência de Kozak e o codão de
iniciação. Posto isto, dá-se a hidrólise do eIF5 e do eIF2, algo que leva à dissociação dos factores de
iniciação e à adição da subunidade grande. Forma-se então um ribossoma funcional de 80S e a tradução
prossegue para a fase de alongamento.
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Há, contudo, nos eucariontes quantidades muito pequena de mRNA que podem ser traduzidas de forma
similar à dos procariontes, sem existir scanning (sendo a tradução, por isso, independente do cap),
referimo-nos aos locais de iniciação internos (IRES), que existem no mRNA, aquando de stress ou
infecções virais.
Alongamento
O processo de alongamento é muito
similar nos eucariotas e nos
procariotas. Os aminoacil tRNAs vão
se ligar ao mRNA, através do local A
do ribossoma. Em termos de
factores de alongamento,
encontramos os EFs nos
procariontes e os eEFs nos
eucariontes.
Em primeiro lugar, o aminoacil tRNA
entra para o local A, ligando-se ao
mRNA, sendo a cadeia polipeptídica
entretanto formada transportada
para o aminoacil RNA, algo que
ocorre concomitantemente à
hidrólise do GTP. O tRNA que ficou
livre no local P (uncharged tRNA) é então expulso pelo local E, ficando o lugar que ocupava (lugar P),
preenchido pelo polipeptil tRNA, que se encontrava no local A, através de um processo designado por
translocação e que ocorre à custa da hidrólise de GTP.
Para serem formadas ligações peptídicas entre os diferentes aminoácidos intervém uma enzima – a
peptidil transferase, presente na subunidade grande do ribossoma. De referir que a cadeia nascente sai
sempre pelos aminoácidos iniciais (a metionina é a primeira estrutura a sair, saindo primeiro o grupo
amina).
Terminação
Os codões stop, não têm tRNA correspondente. Os RFs (Release Factors) são parecidos com o tRNA
estrutural, o que permite que estes factores entrem no local A do ribossoma, levando à separação do
complexo ribossómico (nos eucariotas temos o eRF1 para três codões STOP, enquanto para os
procariotas temos o RF1 para actuar nos codões UAG e UAA e o RF2 para actuar nos codões UGA e
UAA). O RF3 (nos eucariotas, eRF3) é uma proteína associada ao GTP, que através da hidrólise deste,
promove a quebra do complexo peptidil-tRNA. Por último, voltam-se a ligar, às subunidades
ribossomais, o eIF3 e o eIF6, de modo a manter as subunidades separadas.
Folding proteico
Associada à tradução, temos sempre chaperones, proteínas que facilitam o folding da proteína em
formação, mediando a sua estrutura correcta, algo que ocorre à conta de gastos energéticos. As HSP
(heat shock proteins) são proteínas com acção de folding proteico, cujos níveis estão aumentados em
situações de choques térmicos, de forma a responder ao aumento da desnaturação das proteínas.
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Optimização do processo de tradução
Dado o facto de a tradução ser um processo que envolve gastos energéticos, a verificação prévia do
mRNA é muito importante. Por outro lado, os procariontes acoplam a transcrição com a tradução,
enquanto nos eucariontes, como a
tradução é muito lenta, esta é
realizada em polirribossomas (os
polirribossomas são também
designados por polissomas e são uma
série de ribossomas que traduz uma
mesma cadeia de mRNA), ou
associada ao retículo endoplasmático
rugoso. A tradução por polissomas
permite aumentar a velocidade e taxa
de síntese proteica. Esta é também
aumentada pela reciclagem das
subunidades ribossomais.
Inibidores da síntese proteica
Existem vários inibidores da síntese proteica. A puromicina provoca a conclusão prematura da cadeia
pela entrada no local A e transferência para a cadeia peptidil. Existem ainda inibidores dos ribossomas
nos procariotas, nomeadamente o cloranfenicol, que liga a subunidade grande e inibe a actividade da
peptidil transferase e a estreptomicina, a gentamicina e Kanamicina, que inibem a síntese proteica
através da ligação ao rRNA da subunidade pequena provocando erros de tradução na leitura dos codões
por causa de alterações conformacionais no ribossoma. Em termos de inibidores da síntese proteica nos
eucariotas, encontramos a toxina diftérica, uma enzima produzida pela bactéria C. Diphteriae que utiliza
cataliticamente o NAD para inactivar o eEF2 e a cicloheximida, que inibe o elongamento da cadeia
(competidor inibitório da peptidil transferase).
Degradação proteica
Cerca de 30 % das proteínas recém
sintetizadas são rapidamente
degradadas devido a erros. Contudo,
todas as proteínas têm o seu turn-
over. A degradação proteica é feita
nos lisossomas, ou, mais
frequentemente, é mediada pelo
sistema ubiquitina-proteassoma,
degradando este sistema, as proteínas
que se encontram no citoplasma. A
ubiquitina é constituída por 76
aminoácidos, que é por vezes
denominada “kiss of death”, pois as
proteínas poli-ubiquitinadas são
degradadas no proteossoma.
Os proteassomas funcionam como
“trituradoras de papel” - as proteínas
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entram por um complexo de 19S, saindo por outro, os aminoácidos livres. Como a acumulação de
proteínas é prejudicial para o organismo, pois leva a doenças neurodegenerativas, o proteossoma
desempenha um papel fulcral na célula. O proteossoma desempenha ainda funções importantes numa
variedade de processos celulares fundamentais tais como a regulação do ciclo, divisão, desenvolvimento
e diferenciação celular; apoptose; tráfego celular e modulação das respostas imunes e inflamatórias.
Existem patologias, em que devido a mutações, as proteínas não conseguem sair da membrana
biológica, acumulando-se no retículo endoplasmático rugoso, onde são degradas pelo proteossoma.
Dado serem proteínas necessárias para desempenhar funções biológicas vitais, torna-se aí importante,
atenuar a acção do proteossoma.
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Controlo da expressão génica e especialização celular
Todas as células de um dado organismo têm o mesmo DNA, que está contido no seu genoma, apesar de
células distintas produzirem diferentes proteínas e terem diferentes regiões do seu genoma activas.
Desse modo, compreende-se a importância do controlo da expressão génica, algo também constatado
através das nefastas consequências registadas aquando de alterações nessa regulação (que passam pelo
aparecimento de tumores, ou de patologias que surgem durante o desenvolvimento). A importância do
controlo da expressão genética é ainda mais importante ao nível dos procariotas, visto que estes
dependem deste processo para ir buscar ao meio aquilo que necessitam e, desse modo, sobreviver.
Existem cinco níveis de controlo da expressão
génica – ao nível da trasncrição, do
processamento de mRNA, do transporte de
RNA, da tradução e do controlo da
actividade proteica. Contudo, o nível de
controlo mais importante é o primeiro, pois
permite poupar recursos energéticos e tempo
(a célula evita, desde logo, a produção de
compostos desnecessários).
Para a célula determinar quais os genes que deve transcrever, existe um promotor, activadores,
sequências reguladoras e binding-proteins. Os repressores são moléculas que se ligam a determinadas
zonas do DNA e reprimem a transcrição genética. Já os activadores ligam-se a zonas do DNA, permitindo
a activação da transcrição.
Regulação génica nos procariotas
Nos procariotas a regulação da expressão génica é feita ao nível da transcrição. A transcrição é mediada
pelas interacções registadas entre o DNA e as proteínas e pela RNA polimerase, funcionando, por isso,
os mecanismos de regulação de expressão genético como “interruptores genéticos”. A título de
exemplo, podemos citar o operão da lactose, na E. coli.
Operão lac
Os genes incluídos no operão lac permitem a síntese de
enzimas que degradam a lactose, sendo uma forma de as
bactérias obterem glicose, aquando da sua falta. O operão
apresenta um promotor, um operador, genes lac e um
sítio para a CAP. Ao promotor liga-se a RNA polimerase, ao
operador, o repressor e à zona para a CAP, a CAP
(catabolite activator protein), uma proteína activadora
dependente de cAMP e que vai favorecer a transcrição.
Aquando de elevadas concentrações de glicose e baixas de
lactose, a bactéria não necessita de gastar energia a
produzir enzimas e a degradar a lactose. Dessa forma, um
repressor liga-se à zona do operador, impedindo a RNA
polimerase, juntamente com o factor σ70
de iniciar a
transcrição dos genes lac. O CAP também não se liga ao
seu sítio respectivo nesta situação.
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Quando existem concentrações elevadas de glicose e de lactose, a bactéria realiza transcrição dos genes
lac em baixa quantidade. A transcrição é realizada porque a lactose liga-se ao repressor, impedindo-o de
se ligar ao operador (o que leva a que a RNA polimerase se ligue ao promotor e inicie a transcrição).
Contudo, a transcrição é feita em níveis reduzidos, porque o CAP não se liga à sua região, pois este não é
activado, devido às baixas concentrações de cAMP. Contudo, quando a concentração de glicose é baixa
e a concentração de lactose é elevada, ocorre a activação do CAP, pelo cAMP e a transcrição é feita a
níveis elevados (o que é compreensível dada a situação do meio).
Regulação à distância
A regulação génica nos procariotas também pode ocorrer à distância. A regulação da ligação σ54
-RNA
polimerase é levada a cabo pela NtrC (nitrogen regulatory protein C), que se liga a um enhancer. Os
dímeros fosforilados da NtrC encontram-se muito longe da região do promotor, mas através da
formação de uma “dobra” conseguem contactar com a σ54
-RNA polimerase.
Regulação génica nos eucariotas
Nos eucariotas o processo é mais complexo, devido à estrutura da cromatina (nomeadamente, a
heterocromatina) e as sequências activadoras têm um papel muito mais fulcral que as repressoras.
Existe também um número muito maior de sequências reguladoras. Nos eucariotas, por fim, os
elementos regulatórios tanto se podem encontrar muito próximos, como muito longe dos locais de
iniciação de transcrição.
Dentro do grupo de sequências
activadoras, destacam-se os
enhancers, regiões de DNA, às
quais se ligam proteínas, o que
leva a uma aumento exponencial
da taxa de transcrição (não
sendo, apesar disso, promotores).
Os factores de transcrição são activadores transcripcionais que se ligam ao DNA, nomeadamente aos
promotores e aos enhancers e que apresentam geralmente um domínio de ligação ao DNA (raramente
apresentam mais que um) e um ou vários domínios de activação. Estes factores interagem com a RNA
polimerase II. A Gal4 é um exemplo de um factor de transcrição na levedura.
Os repressores transcripcionais, por seu turno, apresentam uma estrutura similar aos activadores e a
ausência da actividade repressora pode ter consequências nefastas, por exemplo, a ausência de
repressão do gene EGR-1 no rim em desenvolvimento, leva ao desenvolvimento do tumor de Wilms.
As proteínas activadoras e repressoras interagem com co-activadores (que aumentam a expressão de
um gene e co-repressores (que diminuem a expressão de um gene). O complexo mediador, formado
por uma cauda, uma cabeça, uma região média e um módulo CDK, permite a interacção entre os
activadores e a RNA-polimerase, funcionando como um co-activador.
A combinação de várias proteínas activadoras e repressoras (ou seja, de várias proteínas reguladoras)
aumenta a variedade de controlo genético, nomeadamente através da formação de complexos. Dessa
forma, a célula não necessita de ter um número infindável de proteínas reguladoras. Nestes complexos,
podemos ter proteínas activadoras a participar em complexos de repressão, contudo, elas continuam a
ser activadoras, não passam a ser proteínas repressoras! O mesmo se passa com as proteínas
repressoras, que integram complexos de activação, continuam a ser proteínas repressoras. Os
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monómeros desses complexos são heterodímeros, num processo que se designa por combinação
heterodimérica dos factores de transcrição.
A cromatina também é modulada aquando da transcrição de
genes, pois a sua condensação implica a ausência de
transcrição, enquanto a sua descondensação está associada a
transcrição activa. Dessa forma, os repressores promovem a
deacetilação das histonas e metilação de algumas classes e a
sua, contribuindo assim para a formação de heterocromatina.
Por outro lado, os promotores promovem a acetilação das
histonas, bem como a metilação de algumas. A metilação é
uma forma de silenciamento de certos genes, nos vertebrados.
Quando esse padrão de metilação é estabelecido, cada local
metilado é passado para as células descendentes. Porém, na
verdade, para o gene estar completamente silenciado, segue-
se a ligação de proteínas até à região metilada e a ocorrência
de deacetilações. O processo de imprinting ocorre com
silenciamento de um alelo proveniente de um progenitor,
através de metilações e outras modificações histónicas. Nos
indivíduos do sexo feminino ocorre igualmente inactivação
aleatória de um cromossoma X, por condensação da sua
cromatina.
Mecanismos alternativos de controlo da expressão génica
Mecanismos pré-transcripcionais e transcripcionais
Um processo de controlo de expressão génica, ainda antes de ocorrer a transcrição, prende-se com a
inserção de genes móveis (transposões) no meio de um gene que codifica uma proteína, o que leva a
que se produza depois um mRNA ou uma proteína não funcional. As proteínas truncadas, por exemplo,
são proteínas incapazes de desempenhar determinadas funções, porque lhes faltam resíduos de
aminoácidos
Hormonas esteróides também podem assumir também uma função vital enquanto reguladores da
expressão génica, pois ligam-se a proteínas receptoras que formam um complexo, que por sua vez se
liga ao DNA, permitindo a sua transcrição. A ausência destas hormonas impede a ocorrência de
transcrição.
Mecanismos pós-transcripcionais
Após a transcrição, inúmeros processos podem ocorrer no sentido de controlar a expressão genética.
Contudo, estes processos são secundários, quando comparados com os de controlo ao nível da
transcrição.
Em primeiro lugar, a longevidade e estabilidade do mRNA pode ser alterada, havendo ligações para
impedir a sua degradação. Por exemplo, aquando da amamentação, a prolactina liga-se ao mRNA da
caseína, impedindo a sua digestão pela ribonuclease e permitindo a sua tradução em caseína, proteína
do leite. Isto não acontece, aquando da glândula mamária não-lactante.
O RNA editing consiste em alterações da sequência nucleotídica de mRNA, sendo estas feitas por
substituição (por exemplo, o gene APOB é transcrito e traduzido no fígado sem sofrer editing, contudo,
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no intestino, o seu mRNA o codão CAA sofre editing e origina UAA, um codão stop, de modo a evitar a
sua tradução) ou por inserção/delecção (como acontece com o gene de uma subunidade da oxidase do
citocromo c no Trypanosoma brucei).
O uso de RNA de interferência (RNAi, ou RNA interference) é um processo com bastantes aplicações na
investigação científica e no qual um pequeno fragmento de RNA se vai hibridizar com o mRNA,
formando uma cadeia dupla de RNA. Esta é reconhecida como anómalo pela célula e, por isso, vai ser de
imediato degradada, impedindo que o mRNA seja traduzido.
Também ao nível do processamento pode
ocorrer controlo da expressão génica. O
splicing é uma etapa do processamento, na
qual são removidos intrões e unem-se os
exões. Através do processo de splicing
alternativo, podemos combinar várias
sequências de exões e um fragmento genético
pode originar várias proteínas diferentes,
permitindo que com se origine um número de proteínas superior ao número de genes existentes. O
splicing alternativo permite então que um mesmo pré-mRNA origine, quer um activador, se for
integrado um exão que codifica uma região de activação, ou um repressor, se essa região não for
integrada.
Existem ainda mecanismos de repressão da tradução do mRNA, em que as proteínas não são
traduzidas, ou não sofrem alterações pós-traduções, que lhes seriam vitais para assumirem as suas
funções.
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Membranas biológicas
As membranas biológicas são estruturas com uma espessura que varia entre 5 e 9 nanómetros e que
separam o conteúdo de organelos, ou da própria célula, do meio exterior, permitindo delimitar essas
estruturas. O núcleo e as mitocôndrias têm uma dupla membrana e o lúmen do retículo endoplasmático
rugoso é separado do citosol também por uma membrana biológica.
As membranas biológicas, cuja principal função é a de isolamento, são formadas por uma dupla camada
fosfolipídica e por proteínas que se podem ancorar à membrana ou atravessá-la.
Dupla camada fosfolipídica
Os fosfolípidos são constituídos por cabeças polares e hidrofílicas, constituídas por colina, serina ou
etanolamina, fosfato e glicerol e por caudas hidrofóbicas, constituídas por ácidos gordos, sendo por isso
designadas por moléculas anfipáticas.
As moléculas polares são hidrofílicas, visto que nelas ocorre distribuição de cargas e, por isso, quando
entram em contacto com a água, as cargas positivas interagem com o oxigénio e as cargas negativas
com o hidrogénio (a água é, ela própria, uma molécula polar).
Já nas moléculas apolares, como não ocorre distribuição das cargas eléctricas, não existe um dipólo.
Dessa forma, essas moléculas não interagem com as moléculas de água, que preferem interagir umas
com as outras. Diz-se que são moléculas hidrofóbicas.
Dessa forma, os lípidos, quando colocados em água podem-se arranjar formando micelas, no caso de
terem uma estrutura “em cunha”, sendo que as partes hidrofílicas ficam em contacto com a água, ou
bicamadas, como no caso dos fosfolípidos. Contudo, a bicamada fosfolipídica é obrigada a fechar, por
acção de forças hidrofóbicas, formando uma estrutura esférica.
Fosfolípidos das membranas
Existem quatro fosfolípidos integrantes das membranas biológicas. São eles a fosfatidiletanolamina, a
fosfatidilserina, a fosfatidilcolina e a esfingomielina.
A fosfatidiletanolamina é um fosfolípido existente no folheto interno da bicamada, sendo formada por
etanolamina, fosfato, glicerol e dois ácidos gordos. A etanolamina tem uma carga positiva e o fosfato
tem uma carga negativa, o que leva a que a carga geral da fosfatidiletanolamina seja nula.
A fosfatidilserina é um fosfolípido existente no folheto interno da bicamada, sendo formada por serina,
fosfato, glicerol e dois ácidos gordos. A serina tem uma carga positiva e uma negativa e o fosfato tem
uma carga negativa, o que leva a que a fosfatidilserina tenha carga negativa. Isto revela-se uma
característica essencial em termos de sinalização.
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A fosfatidilcolina é um fosfolípido existente no folheto externo da bicamada, sendo formada por colina,
fosfato, glicerol e dois ácidos gordos. A colina tem uma carga positiva e o fosfato tem uma carga
negativa, o que leva a que a carga geral da fosfatidilcolina seja nula.
A esfingomielina é um fosfolípido existente no folheto externo da bicamada, sendo formada por colina,
fosfato, esfingosina e dois ácidos gordos. A colina tem uma carga positiva e o fosfato tem uma carga
negativa, o que leva a que a carga geral da esfingomielina seja nula. A esfingomielina é o único
esfingolípido constituinte das membranas biológicas. Todos os restantes são fosfoglicerídeos.
Existe ainda um quinto fosfolípido constituinte da membrana, embora presente em baixas
concentrações – o fosfatidilnositol. Este encontra-se no folheto interno da bicamada, sendo formado
por inositol, fosfato, glicerol e dois ácidos gordos. É uma molécula com uma carga negativa, o que lhe
confere propriedades de sinalização.
Formação de membranas biológicas
Os fosfolípidos constituintes das membranas
biológicas são formados no folheto interno do
retículo endoplasmático rugoso, ocorrendo a adição
de fosfolípidos com o contributo da enzima
scramblase, uma enzima não específica, que
permite que o número de fosfolípidos fique igual em
ambos os folhetos. A “membrana” produzida no
retículo é então exportada por exocitose. Contudo,
esta ainda não é assimétrica, ou seja ainda não há
uma distribuição dos diferentes tipos de fosfolípidos
pelos respectivos folhetos. Essa distribuição é levada
a cabo pela enzima flippase, uma enzima específica
que permite também os movimentos de flip-flop nas
membranas.
Movimentos ocorridos ao nível das membranas biológicas
A membrana biológica é uma estrutura fluida – os fosfolípidos realizam fácil e espontaneamente
movimentos laterais e de rotação. Contudo, a mudança de camada pelos fosfolípidos (movimentos de
flip-flop) não se realiza dessa maneira fácil e espontânea, mas sim à conta da flippase e da scramblase.
Isto leva a que esses movimentos ocorram
muito menos frequentemente que os
restantes.
Existem factores, contudo, que contribuem
para variações na fluidez da membrana. Um
deles prende-se com a saturação das cadeias
fosfolipídicas – cadeias insaturadas levam à
formação de membranas mais fluidas,
enquanto cadeias saturadas levam à formação
de membranas mais rígidas. Isto acontece,
porque quando as cadeias de fosfolípidos
estão insaturadas, formam uma “dobra”, à qual se dá o nome de kink. Isto faz com que quando temos
várias cadeias insaturadas, haja um maior espaço entre os fosfolípidos e a espessura da membrana seja
menor. Este mecanismo descrito é utilizado por bactérias para efeitos de termorregulação.
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Também a presença de colesterol influencia a fluidez das membranas. O colesterol é um esteróide que
preenche os espaços entre os fosfolípidos. O seu anel esteróide torna o rígido, levando a que a
mobilidade dos fosfolípidos fique reduzida, bem como a permeabilidade da membrana. Contudo, o
colesterol pode actuar também no sentido de prevenir a cristalização da membrana.
Por fim, o tamanho das cadeias de ácidos gordos tem forte influência na fluidez das membranas –
cadeias maiores resultam em menor fluidez e cadeias menores resultam em maior fluidez.
Sinalização celular por acção dos fosfolípidos
Os fosfolípidos com carga negativa têm um importante papel em termos de sinalização celular. Por
exemplo, quando a célula vai entrar em apoptose, a acção da flippase diminui e a da scramblase
aumenta. Isto leva a que a fosfatidilserina migre para o folheto externo da membrana celular, onde é
reconhecida por macrófagos, levando à apoptose da célula.
O fosfatidilinositol, por seu turno, é importante para a activação da cínase do fosfatidilinositol (PI 3
kinase) ou fosfolipase C, sendo um mensageiro intracelular de importância considerável.
Glicolípidos
Os glicolípidos estão presentes no folheto externo das membranas biológicas. Têm associados
oligossacarídeos a lípidos e como funções a protecção celular e intervir na interacção inter-celular.
Proteínas membranares
As membranas biológicas têm-lhes associadas diversas proteínas membranares. Estas podem ser
integrais, caso atravessem a membrana ou lhe estejam ancoradas, por uma ligação muito forte (por
exemplo, covalente), ou periféricas, caso a ligação que tenham à membrana não seja muito forte. As
proteínas membranares são muitas vezes receptores, transportadores ou canais iónicos, embora
também possam desempenhar função enzimática, ou de tradução de sinais.
As proteínas transmembranares são moléculas anfipáticas, contactando as
regiões hidrofílicas (que são constituídas por aminoácidos hidorfílicos) com
o meio aquoso e as regiões hidrofóbicas (que são constituídas por
aminoácidos hidrofóbicos) com as regiões hidrofóbicas das membranas.
Essas proteínas podem atravessar uma vez a membrana sob a forma de uma
hélice α, que tem entre 20 a 30 aminoácidos hidrofóbicos (a glicoforina A é
uma proteína dos eritrócitos que só atravessa a membrana uma vez e tem
estrutura em hélice α) , ou várias vezes, sob a forma de sucessivas hélices α
(a título de exemplo, é possível citar a bacteriorodopsina, que atravessa a
membrana sete vezes, sendo uma “bomba” transportadora de protões). As
folhas β também podem atravessar a membrana biológica, formando
estruturas tipo canal (como exemplo, temos as porinas, proteínas com
várias passagens transmembranares, que são canais presentes na
membrana plasmática externa da E.coli). Já as proteínas ancoradas podem
se ligar à membrana por “pontes” de oligossacarídeos.
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Transporte transmembranar
As membranas biológicas podem ser atravessadas por moléculas por difusão simples ou por processos,
nos quais intervêm proteínas mediadoras, nomeadamente a difusão facilitada e o transporte activo.
Tipo de transporte Moléculas transportadas Via de transmissão A favor do gradiente
Selectivo
Difusão simples Gases, moléculas hidrofóbicas e pequenas moléculas polares
Dissolução na membrana transportadora
Difusão facilitada Grandes moléculas polares e moléculas com carga
Canais iónicos e transportadores passivos
Transporte activo Solutos contra o gradiente de concentração
Transportadores activos (bombas)
Difusão simples
O processo de difusão simples não
requer a presença de qualquer
proteína. É, portanto, um processo
não-mediado em que gases,
moléculas apolares e pequenas
moléculas polares (tais como água e
etanol, embora a probabilidade de
estas moléculas atravessarem a
membrana biológica seja menor)
atravessam a membrana por
dissolução na bicamada fosfolipídica,
algo que ocorre sem dispêndio
energético, visto que este processo ocorre a favor do gradiente de concentração. De referir que, dadas
as características deste processo, este é considerado não selectivo.
Transportadores e canais iónicos
Os canais iónicos são proteínas incorporadas na membrana, que abrem um caminho aquoso nesta. O
contacto com a bicamada fosfolipídica é feito através de aminoácidos hidrofóbicos, enquanto, a zona de
abertura está revestida por aminoácidos hidrofílicos. Estes canais nem sempre estão abertos e
participam em processos de difusão facilitada.
Os transportadores proteicos, por seu turno, nunca abrem por completo – Abrem-se de um lado,
permitindo a ligação do soluto e, fechando-se nesse lado, abrem-se no outro, permitindo a saída de
soluto. A sua presença nas membranas biológicas também obriga a que apresentem aminoácidos
hidrofóbicos, para contactar com a bicamada fosfolipídica, e hidrofílicos, para contactar com a região
aquosa. Os transportadores proteicos podem participar no processo de difusão facilitada, sendo aí
denominados por transportadores passivos, e no processo de transporte activo, sendo aí denominados
por bombas. Ambos os tipos de transportadores estão sujeitos a alterações conformacionais.
Em termos de rapidez, podemos afirmar que os canais iónicos são 100 000 vezes mais rápidos que os
transportadores.
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Difusão facilitada
O processo de difusão facilitada permite a passagem de moléculas polares a favor do gradiente
electroquímico (o processo de difusão simples ocorre unicamente a favor do gradiente químico, uma
vez que as moléculas que atravessam esta membrana por este processo são apolares) e, como tal, sem
dispêndio energético. Este é um processo selectivo, que é mediado por proteínas (transportadores e
canais iónicos).
Transporte activo
O processo de transporte activo permite a passagem de solutos contra o gradiente de concentração,
algo que ocorre à conta do consumo de energia, sendo um processo selectivo. Esta energia pode partir
da hidrólise do ATP, bem como da acoplação de um processo de transporte a favor do gradiente
electroquímico ao processo de transporte contra o gradiente. Algumas bactérias utilizam também a luz
para permitir a passagem de solutos contra o gradiente de concentração.
Relativamente aos tipos de
transportadores, temos uniportes, se
apenas transportarem um soluto numa
única direcção; simportes, se
transportarem dois solutos numa
mesma direcção e antiportes se
transportarem quase simultaneamente
dois solutos em direcções diferentes.
Aquando da entrada de glicose nos
enterócitos, verificamos que estão envolvidos os três tipos de transportadores – como a glicose existe
em maior concentração no interior do enterócito, que no lúmen intestinal, esta entra para o enterócito
por via de um simporte, visto que o processo de entrada desta ose está acoplada à entrada de Na+. A
saída da glicose do enterócito é feita por difusão facilitada, através de um uniporte, pois a concentração
de glicose é maior dentro do enterócito que no fluido extracelular. Finalmente, é possível manter o
gradiente de sódio, através da bomba de sódio e potássio, que é um antiporte.
O funcionamento do simporte da glicose explica-se pelo princípio da cooperatividade (que ocorre
quando uma molécula facilita a passagem de outra) – 2 Na+ ligam-se em primeiro lugar ao
transportador, o que aumenta a
afinidade deste para a glicose,
permitindo a sua entrada e ligação
ao receptor. Depois, os 2 Na+
saem do transportador, o que
diminui a afinidade do
transportador à glicose e permite
a sua saída.
Relativamente à bomba de sódio
e potássio, esta tem uma grande
afinidade para o Na+, de tal modo
a que este se liga a este
transportador. A bomba é então
fosforilada, por via da hidrólise do
ATP, o que altera a conformidade do transportador, diminuindo a sua afinidade para o Na+, que se
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desliga deste. Por consequência, a afinidade ao K+ aumenta, permitindo o seu transporte por processos
similares. De referir que este transportador bombeia para fora da célula 3 Na+, entrando 2 K
+. Também o
transporte de Ca2+
(que tem de ser mantido a concentrações baixíssimas) e H+ é feito à conta do
gradiente de Na+.
Tipos de canais iónicos
Comum a todos os canais iónicos é a presença de filtros selectivos para iões, nomeadamente o Na+, o
K+, o Ca
2+ e o Cl
-, sendo que alguns são activados por um estímulo específico e outros se encontram
permanentemente num estado “intermitente” (alternando entre aberto e fechado).
Os canais iónicos de fuga são canais de K+, que não são activados por nenhum estímulo específico,
estando a sua função relacionada com a génese do potencial de repouso (-70 mV) na membrana,
através da saída dos iões K+ do meio intracelular.
Existem ainda canais iónicos activados por voltagem, cujo funcionamento se baseia em alterações da
polarização da membrana. Os canais de Na+
são essenciais para gerar o potencial de acção e são
activados por despolarização da membrana, mais propriamente por um potencial de -50 mV. Já os
canais de K+ delayed-rectifier são activados novamente por despolarização da membrana, mas desta
vez, por um potencial de -20 mV, permitindo a saída do K+ das células e a repolarização (regresso ao
potencial de repouso).
Os canais iónicos activados por transmissor podem ser de dois tipos – canais iónicos activados por
transmissor (extracelulares), ou canais iónicos activados por ligandos intracelulares. Os primeiros
envolvem a ligação de moléculas extracelulares ao transportador, permitindo a sua abertura. A título de
exemplo, podemos citar o estímulo feito pelo glutamato aos canais de Na+ e K
+ e que será essencial para
se realizar a sinapse, pois permite alterar o potencial de repouso do neurónio pós-sináptico. Também o
GABA (ácido γ-aminobutírico) pode se ligar a canais de Cl-, funcionando como um potencial inibitório
pós-sináptico.
Relativamente aos canais iónicos activados por ligandos intracelulares, o mecanismo é idêntico. A
ligação de moléculas ou iões intracelulares ao receptor permite a sua activação. O Ca2+
intra-celular, por
exemplo, pode-se ligar a canais de K+
Ca, permitindo a regulação do disparo neuronal.
Os canais iónicos activados por estímulo mecânico são canais de catiões, cuja função é a transformação
do estímulo mecânico em resposta eléctrica.
As junções de hiato, também designadas por canais gap-junction, são canais de pequenos iões que
existem no epitélio, no endotélio e em células cardíacas. Estas permitem fazer junções entre
membranas, permitindo a comunicação e sincronização celular. Não são estimuladas, mas podem ser
Canal Estímulo Tipo de canal Função
Canal iónico de fuga Não apresenta Canal de K+ Génese do potencial de repouso
Canal iónico activado por voltagem
Despolarização (-50 mV) Canal de Na+ Despolarização no potencial de acção
Despolarização (-20 mV) Canal de K+ Repolarização no potencial de acção
Canal iónico activado por transmissor
Transmissor extracelular
Canais de iões vários
Funções ao nível da transmissão do impulso nervoso
Ligando intracelular
Canal iónico activado por estímulo mecânico
Mecânico/ pressão Canal de catiões
Transformação do estímulo mecânico em resposta eléctrica
Junções de hiato Não apresenta (só modulação)
Canal de iões pequenos
Ligação intercelular e sincronziação da actividade celular
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moduladas, isto é, quando a célula entra num estado indesejado (por exemplo, a sua concentração de
Ca2+
aumenta muito), o transportador “fecha”.
Canal de Na+ dependente de voltagem
Este canal é importante na génese de
um potencial de acção, sendo que o
potencial de -50 mV contribui para a
sua activação. O seu estado activado
é estado aberto, permitindo a
entrada de Na+ na célula. Contudo,
1ms depois, este transportador fecha,
pois na região voltada para o citosol,
liga-se uma bola de inactivação, que
forma à espécie de um “tampão”. Quando ocorre repolarização da membrana, o canal volta à sua
conformação inicial.
O canal de Na+ é constituído por quatro subunidades que se repetem, sendo que cada repetição é
constituída por seis segmentos transmembranares, sendo que a sensibilidade a alterações de polaridade
da membrana é feita por um sensor de voltagem presente no segmento 4. Entre o quinto e o sexto
segmento existe um fortíssimo
loop, correspondente ao poro do
canal, sendo por isso formado
por aminoácidos hidrofílicos.
Funcionamento dos canais de Na+ e K+
O Na+ apenas atravessa o canal de Na
+, se estiver ligado a uma molécula de água. Caso contrário, o K
+,
como tinha carga igual ao Na+ também poderia atravessar esse canal. A entrada de K
+ associado a uma
molécula de água é
impossível, porque as
dimensões da abertura do
canal são menores que as
da H2O + K+. O K
+ também
não atravessa sozinho o
canal iónico, porque a
energia necessária para o
K+ se dissociar da
molécula de água não
compensa a energia
ganha associada à
passagem do
transportador.
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Por outro lado, o K+ para atravessar o seu canal iónico, realiza sozinho essa passagem, dissociado da
molécula de H2O. De seguida, o K+ liga-se a oxigénios de grupos carbonilo existentes no canal,
atravessando-o. Já o Na+ não consegue atravessar o canal, visto que, dissociado da molécula de água é
demasiado pequeno e não se consegue ligar aos oxigénios dos grupos carbonilo (e dessa forma a
energia necessária para dissociar o Na+ à molécula de água não compensa a energia associada à
passagem do canal). O Na+ também não consegue atravessar o canal iónico associado a uma molécula
de água dado as dimensões serem superiores às da abertura do canal.
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Tradução eléctrica de estímulos: Membrana Neuronal
O elemento básico do sistema nervoso central é o neurónio, uma célula especializada na recepção,
condução e transmissão de sinais. Os neurónios podem ser de vários tipos – motoneurónios (neurónios
longos com um axónio mielínico e muitas dendrites), interneurónios (neurónios de menor comprimento
e sem o axónio mielínico) e neurónios sensoriais. Comum a todos os tipos de neurónios supracitados é a
presença de um axónio, de um corpo, de dendrites e de botões sinápticos, permitindo estas duas
últimas componentes, a transmissão de um estímulo nervoso para outro neurónio, através de uma
sinapse.
A membrana neuronal, para além da bicamada lipídica, apresenta vários tipos de canais iónicos,
nomeadamente bombas de sódio e potássio, canais de fuga de K+, canais activados por glutamato
(transmissor excitatório), canais de Na+
dependentes de voltagem e canais de K+ delayed-rectifier.
Potencial de repouso – caracterização e génese
Os valores de potencial de acção e potencial de repouso (-70 mV) não são atribuídos arbitrariamente,
mas calculados através da equação de Nernst, que é dada pela fórmula
, sendo F a constante
de Faraday, T, a temperatura, [X]E, a concentração extracelular de um dado ião e [X]I, a concentração
intracelular de um dado ião. Considerando que T = 36ºC, temos que
. Dessa forma, podemos
calcular o potencial de potássio (VK), que nos pode dar uma aproximação ao valor de potencial de
repouso:
Ora, sabemos que VR (valor de repouso) não é igual a VK, como seria de esperar, mas assume o valor de
-70 mV. Isto porque a membrana é também permeável a outras cargas. Como [Na+]E + [K
+]E = 150 mM e
[Na+]I + [K
+]I = 150 mM, fazendo as contas temos que o valor de equilíbrio para o total das cargas de
sódio e potássio é de 0 mV.
A partir do valor de -70 mV, dizemos que ocorre despolarização, se o valor de VR se torna cada vez
menos negativo ou mais positivo (e portanto diminui a polarização da membrana), ou hiperpolarização,
quando o seu valor se torna cada vez mais negativo, (ou seja, aumenta a polarização da membrana). De
referir que o potencial da membrana nunca chega a ser zero, porque o número de iões envolvidos,
aquando de um estímulo, nunca é suficiente para tal.
No fluido extracelular, a concentração de Na+ é de 145 mM fora da célula e a de K
+ é de 5 mM. Ora, se
não existisse a bomba de sódio e potássio, a concentração destes iões seria igual quer no exterior, quer
no interior nas células. Dessa forma, o sódio é expulso da célula e o potássio entra para esta, pela
bomba de sódio e potássio.
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Contudo, a bomba de sódio e potássio não é suficiente para gerar um potencial de membrana. O
potencial de repouso (polarização da membrana) é gerado ainda pelos canais de fuga, através dos quais
o K+ sai a favor do gradiente de concentração (arrastando consigo uma carga positiva para fora da
célula), atingindo-se o equilíbrio quando o gradiente electroquímico é zero (ou seja, quando o gradiente
químico é igual ao gradiente eléctrico, isto é, o número de iões que sai a favor do gradiente químico é
igual ao número de cargas que entra por potencial eléctrico).
Potencial de acção
A presença de canais de Na+ e K
+ activados por glutamato são essenciais para se dar a estimulação
sináptica, ou seja, para a génese de um potencial pós-sináptico excitatório (EPSP), que vai despoletar a
despolarização da membrana. Quando se atinge -50 mV, ou seja, quando a entrada de Na+ para a célula
excede a saída de K+, diz-se que é atingido o limiar do potencial de acção.
Quando se atinge o limiar do potencial da acção, são activados os canais de Na+
dependentes de
voltagem. Estes canais existem quase em exclusivo no axónio, pois nos restantes locais do neurónio, a
densidade deste tipo de canais é muito baixa. A activação dos canais de Na+
dependentes de voltagem,
leva a que os iões de Na+ entrem no meio intracelular, permitindo à membrana atingir o potencial de
equilíbrio para o Na+ (o que significa que a quantidade destes canais no axónio é muito grande). Ao fim
de 1 ms, os canais de Na+ são inactivados pelas bolas de inactivação, impedindo a passagem de mais
iões Na+.
Segue-se o processo de repolarização. Se apenas tivéssemos canais de fuga de K+, a repolarização
demoraria centenas de milissegundos, daí a existência de canais de K+ dependentes de voltagem. Estes
canais demoram 1 ms a abrir (e daí também serem chamados de “delayed-rectifier”), por isso a sua
activação ocorre, quando a polarização da membrana atinge os -20 mV. Dessa forma, os canais K+
dependentes de voltagem apenas abrem, quando os de Na+ fecham. A densidade dos canais de K
+
dependentes de voltagem é muito elevada e permitem, juntamente com os canais de fuga, que a
polarização da membrana
chegue ao valor de
equilíbrio para o potássio.
Contudo, no final, vão ser
esses mesmos canais de
fuga, que vão levar ao
regresso da membrana ao
valor do potencial do
repouso (-70 mV). É
importante mencionar que
a quantidade de iões que
atravessa os canais é
reduzida e que, portanto, as
concentrações de sódio e
potássio, quer no interior da
célula, quer no meio
extracelular, praticamente
não sofrem alterações. Isto
constitui uma vantagem, na
medida em que os gastos de
energia sob a forma de ATP
necessários para a bomba
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de sódio e potássio restabelecer as concentrações “normais” de sódio e potássio são, deste modo,
muito reduzidos.
De referir que o potencial de acção inicia-se no cone axonal (zona mais proximal do axónio, em que este
contacta com o corpo do neurónio), visto que é lá que a densidade dos canais de Na+ activados por
voltagem é maior. Depois, a propagação do potencial de acção é feita num sentido unidireccional, pois
concomitantemente aos circuitos eléctricos associados à transmissão do potencial de acção, ocorrem
pequenas despolarizações da membrana nos canais adjacentes ao canal de Na+ em que está a haver
passagem de iões (ou seja, que está aberto e activado). O canal que está imediatamente depois é então
activado e o que está imediatamente antes não é afectado, porque já está inactivado (daí a importância
dos canais de Na+ activados por voltagem ficarem inactivos após 1 ms).
A bainha de mielina funciona como um isolante e baixa a capacidade da membrana do axónio, porque a
torna mais espessa. Os nódulos (ou nós) de Ranvier interrompem a bainha de Mielina e permitem uma
propagação saltatória do potencial de acção, pois neles estão presentes canais de Na+ activados por
voltagem em elevadas concentrações.
Sinapse química
O processo de sinapse química permite que o estímulo
propagado num neurónio, designado por pré -sináptico,
continue a ser propagado num outro neurónio, designado
por pós sináptico. Durante a sinapse ocorre a libertação de
neurotransmissores na fenda sináptica, estando estes
transmissores inicialmente envoltos por vesículas sinápticas,
que depois se fundem com a membrana do neurónio pré-
sináptico. Este processo ocorre devido à entrada de Ca2+
na
membrana pré-sináptica, através de canais de Ca2+
dependentes de voltagem, pois o Ca2+
permite a fusão das
vesículas sinápticas com a membrana pré-sináptica.
O transmissor libertado vai então activar o transmissor dos
canais iónicos na membrana pós sináptica, sendo depois
removido da fenda sináptica pelos processos de reuptake
(reentrada do neurotransmissor para o neurónio pré-
sináptico, algo que permite a “reciclagem” dos neurotransmissores) e de difusão para o meio.
Potencial pós-sináptico inibitório
O potencial pós-sináptico não é sempre excitatório (EPSP), este também pode ser inibitório (IPSP) e,
nesse caso, o potencial é activado por GABA (ácido aminobútrico gama) ou por glicina, sendo abertos
os canais destas substâncias, que são canais de cloro. Isto leva à entrada de cloro na célula, que, dado
ser um anião, vai levar a que ocorra uma hiperpolarização da membrana. Podem ser transmitidos
simultaneamente, um potencial inibitório e um excitatório, levando à anulação dos efeitos.
Somatório dos potenciais pós-sinápticos
Dizemos que temos sinapses iguais, quando no local em que se gera EPSP, o potencial pós-sináptico é
igual. Contudo, isto não significa que num mesmo local essas duas sinapses não tenham potenciais pós-
sinápticos diferentes. Considerando que ocorreram sinapses iguais, mas que uma ocorreu mais proximal
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(ou seja, que ocorreu mais próxima
do corpo do neurónio),
relativamente a outra, temos que,
no local do cone axonal (ou noutro
qualquer ponto do axónio) a
sinapse distal vai chegar com um
potencial pós-sináptico menor que
a proximal. Daí ser feito os
somatórios espacial e temporal dos potenciais pós sinápticos, para um determinado local, sendo que o
somatório temporal tem em conta o tempo de atraso da sinapse distal.
A intensidade de um potencial pós-
sináptico pode ser traduzida em
frequência, dessa forma, quanto mais
intenso este for, maior a frequência
associada a este potencial. Esta relação
e entendida como o output do
neurónio. O patch clamp é uma técnica
que permite estudar estímulos
nervosos, nomeadamente o que se
passa ao nível dos canais iónicos,
registando-os sob a forma de gráfico e
permitindo analisar as diferenças entre
os valores teóricos calculados e os
valores que ocorrem de facto.
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Modelos experimentais de controlo da expressão genética
Ao nível da expressão genética podemos ter situações em que verificamos que houve uma perda de
função e outras em que se regista um ganho de função. Entende-se por perda de função (loss of
function – LOF), uma mutação que resulta numa função proteica reduzida ou abolida e esta pode
ocorrer por via da ablação do gene que para esta codifica, pela indução da degradação do mRNA ou pela
própria inactivação da proteína. Já o processo de ganho de função (gain of function – GOF), que ocorre
muito mais raramente, ocorre uma mutação que confere uma actividade anormal numa proteína,
podendo esta ocorrer por via da expressão ectópica de uma proteína (ou seja, em locais onde esta não é
normalmente expressa).
Em laboratório interessa induzir losses of function e gains of function, de forma a estudar as funções dos
genes, nomeadamente o seu papel em termos de patologias, e para isso recorre-se ao DNA
recombinante para introduzir ou suprimir um gene, ao RNA de interferência para silenciar o mRNA
produzido e a sequestração por anticorpos ou por proteínas recombinantes para actuação em
proteínas. Estes testes podem-se realizar in vitro, caso sejam levados a cabo em células em cultura, ou in
vivo, caso sejam realizados em modelos animais, cujos mais comuns se encontram no quadro em baixo
(de notar as semelhanças embriológicas):
Técnica de electroporação
A técnica de electroporação consiste na introdução de DNA recombinante em células, através da
aplicação de um breve choque eléctrico de milhares de volts. Isto torna as células temporariamente
permeáveis ao DNA, permitindo realizar experiências LOF, nas quais introduzimos um RNA de
interferência que silencia um determinado mRNA, ou GOF, por sobrexpressão ectópica de uma proteína.
Em muitos tecidos, nomeadamente a espinal medula, procede-se à introdução do DNA recombinante de
um dos lados, ficando o outro intacto, como região de controlo.
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Animais geneticamente modificados
A modificação genética de animais é já uma realidade e tem múltiplas aplicações, nomeadamente no
campo da saúde.
Transgénicos
Animais transgénicos são animais cujo material genético foi alterado, através de técnicas de engenharia
genética. Para produzir um animal transgénico deve-se produzir um vector (nomeadamente um
plasmídeo), contendo o gene de interesse e um gene que permita que a produção da proteína
codificada pelo gene de interesse ocorra num tecido particular (quando se utilizam cabras ou ovelhas,
por exemplo, é útil que a produção dessa proteína ocorra ao nível do leite). O vector é então introduzido
em zigotos, que, por sua vez, são colocados no útero de um indivíduo do sexo feminino (a foster
mother). Os indivíduos que se desenvolvem a partir dos zigotos são transgénicos e produzem a proteína
codificada pelo gene de interesse.
Os ratinhos são animais, cujo genoma é frequentemente modificado. Vamos tomar o exemplo dos
ratinhos fluorescentes – estes exprimem a GFP e o DNA que codifica para esta é colocado por
microinjecção num dos pronúcleos
(um núcleo de um dos gâmetas,
depois do espermatozóide ter
entrado no óvulo, mas antes de
ambos os núcleos gaméticos se
juntarem). Depois, os zigotos que
sobrevivem à manipulação (entre 10
e 30%) são transferidos para uma
foster mother, sendo que entre 10 e
30% da descendência tem o DNA
integrado no seu genoma (esta
ocorre de forma aleatória), ou seja,
neste caso, exprime a GFP. Os
indivíduos que exprimem o gene em
questão são então cruzados, de
forma a originar descendência que
também o exprima.
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Ratinhos KO
A produção de ratinhos knockout permite a produção
de indivíduos que apresentam genes que estão
inactivos no organismo. Esta faz-se à conta de gene
targeting, uma técnica na qual é levada a cabo a
introdução de genes mutados (genes com uma
determinada inserção no meio) numa célula-tronco
embrionária por electroporação (num processo, cuja
eficiência ronda os 5%). Estes passam a integrar o
conteúdo cromossómico das células-tronco, através de
recombinação homóloga, ocorrendo isto uma vez em
cada 105 células estaminais transfectadas. As células
embrionárias contendo a mutação knockout são então
introduzidas no embrião de um ratinho, sendo os
descendentes gerados, quimeras (uma quimera é um
animal que tem duas ou mais populações diferentes de
células geneticamente distintas).
As quimeras são então cruzadas com indivíduos wild-
type (“normais”), levando à formação de descendência
normal e heterozigóticos para o gene knockout. Os
indivíduos heterozigóticos são então cruzados, levando
à produção de indivíduos knockout, wild-type e
heterozigóticos. De referir que, os indivíduos
heterozigóticos são mantidos, pois os ratinhos
knockout não têm grande viabilidade reprodutiva,
contrariamente aos heterozigóticos.
A produção de indivíduos knockout é essencial para o estudo de patologias, como o piebaldismo,
malformações originadas pela deficiência no gene KIT.
Sistema Cre-Lox
O sistema Cre-Lox permite a produção de indivíduos transgénicos modificados, ou seja, que exprimem
um dado gene em apenas determinados tecidos. Dessa forma, utilizamos um indivíduo com o promotor
de um tipo específico de uma célula e com o gene que codifica a enzima Cre-recombinase (abreviada
como Cre), que é posto a cruzar com outro que apresenta o gene de interesse ladeado por dois loci Lox
P (sequências de nucleótidos, iguais de ambos os lados que flanqueiam o exão em questão).
A descendência apresenta células onde se manifesta o gene de interesse (aquelas onde está presente a
proteína Cre e que correspondem às células-alvo do promotor) e células normais, onde não está
presente a proteína Cre.
Bernardo Manuel de Sousa Pinto Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Sebenta de Biologia Celular e Molecular I
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RNA de interferência
O RNA de interferência (RNAi) é um processo que consiste na indução da formação de regiões de cadeia
dupla de mRNA que são degradadas pela célula. Este pode ser levado a cabo através dos MicroRNAs e
do siRNA. Estes permitem então o silenciamento da expressão de alguns genes, algo que pode ser útil
no tratamento contra o cancro. Para além disso, o uso de siRNA em linhagens celulares é eficiente e
facilmente controlável e exequível.
MicroRNAs
Os microRNAs desempenham importantes funções nos genes humanos – estimando-se que cerca de
30% destes são controlados por miRNAs (conhecem-se actualmente mais de 400 genes humanos
regulados por miRNAs). Para além disso, 80% dos miRNAs são específicos para determinados tecidos.
Os micro-RNAs apresentam em média 22 ribonucleotídeos e são transcritos a partir de genes próprios
ou de intrões, através da RNA polimerase II ou III. Uma vez no citosol, os miRNAs ligam-se a mRNAs alvo,
formando regiões de cadeia dupla, que são degradadas, ou cuja tradução é silenciada.
In vitro é possível a síntese de small hairpin RNAs, que mimetizam os micro-RNAs endógenos.
siRNA
Para levar a cabo o mecanismo de siRNA, começa-se por se introduzir na célula uma longa cadeia de
dsRNA (double-stranded RNA - RNA em cadeia dupla). Esta é clivada em siRNAs (short interfering RNA)
pela enzima dicer, apresentando cada siRNA cerca de 20 nucleotídeos. Alternativamente, é possível a
síntese de siRNAs fora da célula e posterior introdução desta estrutura no meio intracelular.
Bernardo Manuel de Sousa Pinto Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Sebenta de Biologia Celular e Molecular I
71
A proteína Ago (Argonaute) procede então à clivagem de
uma das cadeias de cada siRNA, algo feito com gastos de
ATP. Isto activa o RISC (RNA-inducing silencing complex) e
permite a ligação do siRNA ao mRNA alvo, formando uma
estrutura de cadeia dupla, que é logo degradada.
O RNA antisense funciona de um modo similar ao siRNA,
contudo, é introduzida uma cadeia simples de RNA,
complementar a uma cadeia de mRNA, à qual ela se vai
ligar, impedindo assim que ocorra tradução.
Desafios para a medicina
Apesar das vantagens do uso de partículas recombinantes,
existe ainda um grande obstáculo à sua aplicação em
grande escala, no tratamento de doenças, em medicina e
que se prende com o como fazer as partículas
recombinantes chegar aos tecidos onde estas devem
actuar.
Não podemos aplicar choques eléctricos e introduzi-las por electroporação, nem criar linhas de seres
humanos transgénicos. Os meios de administração mais viáveis prendem-se então com a utilização de
vírus, com o conteúdo genético em causa, ou lipossomas.
Bernardo Manuel de Sousa Pinto Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Sebenta de Biologia Celular e Molecular I
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Citosqueleto - Actina
Citosqueleto
O citosqueleto permite a organização espacial das células, bem como a sua interacção mecânica com o
ambiente. Este é um sistema de filamentos, de tal forma dinâmico, que permite também que a célula
tenha uma certa mobilidade.
Dessa forma, são funções do citosqueleto:
Organização espacial da célula
Movimentar os cromossomas na mitose
“Condução” de organelos e do “tráfego” intracelular
Suporte da membrana citoplasmática
Permite mobilidade, nomeadamente que células como os espermatozóides nadem, ou células
como os leucócitos se desloquem sobre superfícies.
Permite a contracção nas células musculares
Estas variadas funções dependem da presença de três famílias de moléculas proteicas que constituem
os filamentos que formam o citosqueleto, nomeadamente a actina, os filamentos intermediários e os
microtúbulos. Apesar do nome citosqueleto, sugerir algo rígido, a verdade é que o citosqueleto não é
estático e está em permanentes modificações.
Actina
A actina é uma das proteínas constituintes do citosqueleto. Representa cerca de 10%
das proteínas totais das células musculares (percentagem em termos de massa) e
entre 1% e 5% das células não-musculares.
As subunidades individuais de microfilamentos de actina são denominadas de G-
actina (actina globular), que se organizam em polímeros filamentosos, denominados
de F-actina (actina filamentosa). As moléculas de G-actina apresentam uma fenda de
ligação ao ATP e um ião Mg2+
. A F-actina apresenta uma estrutura em dupla hélice,
sendo que cada monómero de G-actina contacta com outros quatro. Estes
microfilamentos medem aproximadamente 7nm de diâmetro e apresentam uma
sequência igual de 36 em 36 nm.
Os microfilamentos apresentam polaridade, manifestando-se essa polaridade em
termos estruturais, funcionais e de alongamento. O pólo positivo encontra-se na
extremidade barbed (“em ponta de seta”) e o pólo negativo corresponde à
extremidade pointed (estes nomes de extremidades aplicam-se sobretudo a quando
a actina se encontra associada à miosina). Na extremidade pointed, a fenda de
ligação ao ATP da molécula de actina está em contacto com o citosol, enquanto na extremidade barbed,
a fenda ligação ao ATP da molécula de actina está ligada a outro monómero.
A formação de filamentos a partir de unidades de G-actina faz-se por três fazes distintas – nucleação,
alongamento e estado estacionário. A fase de nucleação prende-se com a formação de um núcleo, um
oligómero formado por uma quantidade reduzida de monómeros de G-actina. Esta é a etapa mais lenta
do processo de formação de filamentos e também a etapa limitante, devido à instabilidade desses
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Sebenta de Biologia Celular e Molecular I
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mesmos oligómeros formados. A lentidão do processo de nucleação é vantajosa para a célula, na
medida em que lhe permite determinar em que local serão formados os novos filamentos. A
polimerização de filamentos é feita apenas se existir uma determinada concentração mínima de actina
na célula. Esta concentração é designada por critical concentration (CC) e difere nas duas extremidades.
Uma vez ultrapassada esta fase de nucleação, segue-se a fase de alongamento, na qual os monómeros
são rapidamente associados às extremidades. No final, encontramos um estado estacionário, em que a
quantidade de monómeros adicionados equivale à de monómeros que se dissociam do filamento.
A polaridade influencia também a polimerização de filamentos. A adição de G-actina aos filamentos
ocorre preferencialmente no pólo positivo e a sua remoção ocorre preferencialmente no pólo negativo.
Este processo denomina-se por treadmilling e a sua ocorrência está dependente da concentração
citosólica de subunidades de G-actina. Dessa forma:
Para valores de concentrações de ATP-G-actina entre os valores de Cc+ (concentração crítica na
extremidade positiva) e Cc- (concentração crítica na extremidade negativa), ocorre adição de G-
actina no pólo positivo e remoção no pólo negativo.
Para valores de concentrações de ATP-G-actina superiores aos valores de Cc+ e Cc
-, ocorre
adição de G-actina em ambos os pólos
Para valores de concentrações de ATP-G-actina inferiores aos valores de Cc+ e Cc
-, ocorre
remoção de G-actina em ambos os pólos.
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Proteínas de ligação à actina (actin-binding proteins)
Os microfilamentos podem sofrer capping, através do acrescento de CapZ no pólo positivo ou de
tropomodulina no pólo negativo. O capping dos microfilamentos no pólo positivo impede o seu
crescimento nesse pólo e o capping no pólo negativo estabiliza o filamento.
Para que ocorra nucleação dos microfilamentos, deve haver ligação da G-actina à formina. A ligação
desta proteína à extremidade positiva impede a ligação da CapZ, permitindo o crescimento do
filamento. A actividade das forminas é regulada pela via de sinalização da Rho-cinase.
As actin related proteins (ARP 2/3) permitem a nucleação e o crescimento no pólo positivo. Contudo,
como a sua capacidade de nucleação é baixa, este complexo precisa de filamentos formados e da
proteína WASp. Esta última altera a conformação do complexo proteico em causa, permitindo a ligação
de um filamento de actina (mais próximo do pólo positivo) ao filamento principal, existindo entre eles
um ângulo de 70º. Isto leva a uma estrutura ramificada da actina.
Cerca de metade da actina total na célula é ATP-G-
actina e a ADP-actina e a ATP-actina são convertíveis. A
profilina liga-se à ADP-G-actina, catalisando a
conversão desta em ATP-G-actina (por troca de ADP por
ATP), ligando-se depois esta última ao pólo positivo do
filamento de actina.
Já a cofilina liga-se à F-actina na região da extremidade
negativa. Essa ligação destabiliza o filamento,
precipitando a quebra deste nesta extremidade. Isto
gera subunidades ADP-actina ligadas a cofilina e mais
extremidades negativas livres.
A timosina-β4, por sua vez, liga-se à ATP-G-actina,
inibindo a adição desta a qualquer uma das
extremidades. Esta proteína está presente em grande
quantidade nas plaquetas, que apresentam grandes quantidades de actina.
De referir que é este dinamismo na polimerização da actina que torna possível movimentos
intracelulares e emissão de prolongamentos citoplasmáticos.
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Organização dos filamentos de actina
Os filamentos de actina podem apresentar uma organização em rede ou em feixe, podendo este último
tipo de organização ser em feixe contráctil, caso os filamentos se disponham em direcções opostas, ou
em feixe paralelo, caso os filamentos se disponham paralelamente.
Os feixes contrácteis estão relacionados com a ligação da actina à α-actinina, permitindo que a miosina
II se interponha no feixe. Este tipo de feixes está muito presente nas células musculares. Já os feixes
paralelos estão associados à ligação da fimbrina e a
sua disposição, com poucos espaços entre os
filamentos, impede que a miosina II se interponha no
feixe. Este tipo de feixes existe nos filopodia,
projecções citoplasmáticas presentes em células
migrantes e em microvilosidades. Já associada a uma
organização em rede, encontramos a proteína
filamina.
No que concerne a proteínas de ligação (cross-
linking), destaque ainda para a espectrina, que
permite fazer arranjos hexagonais, essenciais para a
manutenção da membrana citoplasmática (algo que é
mediado pelas anquirinas) e cujas mutações resultam
em anemia esferocítica - fragilidade da membrana do
eritrócito. Por último, a distrofina permite ligar o
citosqueleto de uma fibra muscular até à membrana
citoplasmática. A sua ausência caracteriza-se por
distrofias musculares.
Sistema actina-miosina
As miosinas são uma super-família proteica, cuja função é a de conversão de ATP em energia mecânica.
Existem cerca de 20 classes diferentes de miosinas, sendo que estas proteínas, com excepção da de
classe VI (que participa na endocitose) movimentam-se sempre do pólo negativo para o pólo positivo da
actina. Mutações nas miosinas podem causar cegueira e surdez.
De entre as proteínas motoras encontramos as miosinas de classes I, II e V. A miosina de classe I, ao
ligar-se à actina relaciona-se com a endocitose e com a associação de actina à membrana.
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A miosina de classe V está associada ao transporte de organelos. Esta
classe miosina desloca-se “passo a passo” sobre a molécula de actina, ou
seja, uma das cadeias pesadas da miosina fica fixa à actina, enquanto a
outra avança 72 nm em direcção ao pólo positivo.
Interacções entre a actina e a miosina da classe II
Os músculos esqueléticos são compostos por fibras musculares, células multinucleadas, que
apresentam várias miofibrilas dispostas em feixe. Estas são constituídas por unidades básicas, os
sarcómeros, complexos multiproteicos, situados entre dois discos Z e onde encontramos feixes de
miosina de classe II intercalados com filamentos de actina. O facto de um feixe de miosina deslocar-se
por dois filamentos de actina permite que, aquando da contracção muscular, ocorra uma aproximação
dos filamentos de actina.
A miosina de classe II apresenta uma cabeça (head), um pescoço (neck - com duas cadeias leves, uma
essencial e uma regulatória) e cadeias pesadas. Os feixes de miosina presentes num sarcómero
apresentam um total de 325 nm de comprimento.
A miosina de classe II forma complexos bipolares, através
da interacção de domínios presentes na cauda e
dispostos antiparalelamente. O seu movimento é feito
com gasto de ATP – quando esta molécula se liga à
cabeça da miosina, esta separa-se da actina,
movimentando-se. Quando ocorre a desfosforilação do
ATP em ADP+Pi, ela liga-se de novo à actina. Este
movimento necessita também da presença de cálcio, que
se liga à troponina. Esta ligação modula a actividade da
tropomiosina, impedindo-a de obstruir os locais de
ligação à miosina, na actina. Isto permite então que a miosina se ligue à actina e que se dê a contracção
muscular.
O cap Z e a tropomodulina são estabilizadores do sarcómero, na medida em que, ocorrendo um capping
nos filamentos de actina, em ambas as extremidades, não ocorre crescimento nem regressão do
tamanho dos filamentos em causa. A nebulina e a titina funcionam como estabilizadores adicionais do
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sarcómero – a nebulina estende-se ao longo do
filamento de actina desde o disco Z até à
tropomodulina, onde se liga. Esta molécula
determina o comprimento dos filamentos de actina
presentes no sarcómero. A titina é outra grande
proteína ligada por um lado ao disco Z e, por outro,
à molécula contralateral. Esta é uma molécula
elástica que previne um alongamento excessivo e
que segura os filamentos de miosina.
As fibras contrácteis actina/miosina II também
funcionam em células não-musculares,
nomeadamente ao nível da citocinese, formando o anel contráctil regulado por fosforilação e que
permite a divisão das duas células e ao nível da migração celular.
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Citosqueleto – Microtúbulos e filamentos intermediários
Microtúbulos
Os microtúbulos são polímeros de dímeros de
αβ-tubulina, que se dispõe numa mesma linha,
numa estrutura de 8 nm. Este polímero dispõe-se
sob a forma de túbulos ocos com um diâmetro de
25 nm. Tal como os filamentos de actina, os
microtúbulos apresentam polaridade, sendo que
na extremidade negativa estão expostas subunidades de α-tubulina e na positiva, subunidades de β-
tubulina.
A polimerização dos microtúbulos
ocorre de modo similar ao da dos
filamentos de actina, compreendendo
uma fase de nucleação, em que a
adição de dímeros de αβ-tubulina é
mais lenta, uma de alongamento e
uma última de estado estacionário,
ocorrendo a adição de monómeros
preferencialmente na extremidade
positiva dos microtúbulos. A
temperatura revela-se como um
factor que influencia a polimerização
dos microtúbulos, pois a
temperaturas inferiores a 4º C ocorre
despolimerização destes.
Tal como acontece ao nível da polimerização de actina, também aqui se verifica a ocorrência de
treadmilling, ou seja, a concentrações de tubulina intermédias entre Cc+ e Cc
- (as que existem no citosol)
ocorre preferencialmente adição de monómeros no pólo positivo e remoção no pólo negativo. De
referir que, na célula a polimerização dos microtúbulos é favorecida à despolimerização.
Intrinsecamente associada à polimerização de microtúbulos temos o conceito de instabilidade dinâmica
ao nível da extremidade positiva. Acontece que estes se vão formando, estando presente GTP nas
subunidades β-tubulina. Quando o GTP é convertido a GDP, a conformação das subunidades é alterada,
levando a que o polímero passe
a apresentar ligações mais
fracas. Ora, isto leva a que o
proteofilamento se curve e a
que ocorra o desmembramento
de dímeros de αβ-tubulina do
microtúbulo, que entra numa
situação de catástrofe.
Contudo, um microtúbulo que
entrou em catástrofe pode
recuperar as suas dimensões,
entrando num processo de
resgate.
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A colquicina, vimblastina e colcemid impedem a polimerização dos microtúbulos. O taxol (que se extrai
da árvore Teixo do Pacífico) provoca a polimerização rígida. Todas estas substâncias têm aplicação
terapêutica como quimiostáticos.
MTOC
Os microtúbulos são organizados nos
MTOCs - Microtubule organizing centers.
Esta estrutura, da qual os microtúbulos
emergem com as extremidades positivas
voltadas perifericamente, apresenta duas
funções principais – a organização dos
flagelos e cílios nos eucariontes e do fuso
acromático que separa os cromossomas
durante os processos de divisão celular
(mitose e meiose). É também nos MTOCs que ocorre a nucleação dos microtúbulos. Entre os tipos de
MTOCs, destaque para o centrossoma e para os corpúsculos basais (associados com os cílios e certas
junções intercelulares de células epiteliais). Encontramos também MTOCs na região do cone axonal do
neurónio.
A γ-tubulina forma complexos anelares (γ-TuRCs) que facilitam a nucleação dos microtúbulos. Esta
proteína é por isso encontrada sobretudo nos centrossomas. Os centrossomas são organelos que
funcionam como reguladores da progressão do ciclo celular, permitindo o movimento cromossómico,
durante a divisão celular. Estes são compostos por dois centríolos dispostos perpendicularmente,
rodeados por uma massa amorfa de proteína (o material pericentriolar). Visto num corte transversal um
centríolo apresenta nove tripletos de microtúbulos.
Dentro dos cílios e dos flagelos, o citosqueleto de microtúbulos é denominado de axonema. O axonema
dos cílios apresenta tipicamente um anel externo com nove pares de microtúbulos e, centralmente, um
par de microtúbulos. A mobilidade do cílio ocorre à conta da dineína axonemal. Os corpúsculos basais
encontram-se na base dos cílios ou flagelos e são os locais que permitem o crescimento dos microtúbulo
no axonema. Estas estruturas derivam dos centríolos apresentando uma estrutura similar de nove
tripletos de microtúbulos.
Proteínas associadas aos microtúbulos
É possível a ligação de proteínas aos microtúbulos (Microtubule-associated proteins - MAPs). A proteína
Tau é uma MAP, na qual mutações podem levar à desintegração de microtúbulos neuronais nos doentes
de Alzheimer. Já a proteína TIP EB1 associa-se exclusivamente às extremidades positivas dos
microtúbulos, estabilizando-os. A cinesina-13 é uma proteína que desagrega os microtúbulos, a partir de
ambas as suas extremidades, através da sua ligação aos dímeros αβ-tubulina, algo que ocorre com
consumo de ATP, enquanto a estatmina desagrega os microtúbulos ligando-se a dois dímeros de αβ-
tubulina.
As dineínas e as cinesinas são as duas grandes classes de proteínas motoras dos microtúbulos. Existem
14 classes de cinesinas e estas em termos gerais e estruturais apresentam uma cauda, onde está
presente a cadeia leve, um stalk (à espécie de um corpo em dupla hélice) e uma cabeça, ligada ao stalk
por uma região de linker. Esta classe proteica movimenta-se no sentido da extremidade positiva do
microtúbulo. As cinesinas-1 e 2 permitem o transporte dos organelos, aos quais se ligam pela cauda (a
cabeça liga-se ao microtúbulo). A cinesina-5 é bipolar e permite o deslizamento de dois microtúbulos,
enquanto a cinesina-13 promove a destruição dos microtúbulos. O movimento das cinesinas é feito
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“passo a passo” e com consumo de ATP, que ao ligar-se à cabeça motora “da frente” promove o avanço
da cabeça motora “de trás”, que ao ligar-se aos microtúbulos libertam ADP, permitindo uma posterior
ligação de ATP.
Já as dineínas movimentam-se no sentido da extremidade negativa do microtúbulo, também “passo a
passo” e com consumo de ATP. A sua estrutura apresenta um domínio de ligação ao microtúbulo, um
stalk, uma cabeça com um domínio ATPase e um tronco
com o domínio de ligação à dinactina. A dinactina é uma
proteína que se liga à dineína e à cinesina II, permitindo a
ligação da dineína aos organelos e, consequentemente, o
seu transporte.
Compreendemos que são os microtúbulos, bem como as
proteínas motoras com eles relacionadas, os responsáveis
pela organização do citoplasma, pela manutenção do
correcto posicionamento dos seus organelos e pelo
transporte não só de organelos, como também de
vesículas.
Filamentos intermediários
Os filamentos intermediários são estruturas exclusivas das células animais que, apesar de
bioquimicamente heterogéneos têm como características comuns o facto de não apresentarem
polaridade, de não polimerizarem nem despolimerizarem, de poderem estar presentes no núcleo
(contrariamente à actina e aos microtúbulos) e de apresentarem grande resistência mecânica. Os
filamentos intermediários são codificados por 70 genes humanos diferentes, existindo cinco classes
destes que se encontram sintetizadas na tabela da página seguinte:
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As unidades básicas dos filamentos intermediários são dímeros. Estes, em todas as classes, apresentam
um domínio em α-hélice, constituído por 310 aminoácidos, um terminal amina (correspondente à
cabeça) e um terminal carboxilo (correspondente à cauda). Os dímeros associam-se em direcções
opostas, formando tetrâmeros simétricos (razão pelas quais os filamentos intermediários não têm
polaridade). Os tetrâmeros associam-se formando protofilamentos e quatro protofilamentos formam
uma protofibrilha. Quatro
protofibrilhas, por sua vez,
associam-se formando um
filamento de 10 nm. Dessa
forma, um filamento
intermédio apresenta 16
protofilamentos.
As percursoras da formação de todos os filamentos intermediários são as laminas nucleares, em cujas
mutações, verificamos a presença de progerias como a de de Hutchison-Gilford ou distrofias musculares
como a de Emery-Dreifuss.
Os neurofilamentos estão presentes nas células neuronais, sendo constituídos por três proteínas – a NF-
L, a NF-M e a NF-H. Já a queartina está presente na constituição do cabelo, pele e unhas e daí que a
epidermólise bulhosa seja causada por mutações na queratina K14. Esta patologia manifesta-se através
da formação de filamentos intermediários muito frágeis.
No citosqueleto há uma constante interacção entre os vários tipos de filamentos. A título de exemplo,
os fibroblastos encontramos filamentos de plectinas, ligando os microtúbulos a filamentos
intermediários. Também, os melanossomas são transportados ao longo de microtúbulos e no cortex
celular, ligam-se a miosina V, deslocando-se sobre os microfilamentos de actina.
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Atlas de Microscopia de Biologia Celular e Molecular
Tipos de células
A. Células procarióticas
ML - Bactérias Gram-positivas (Staphylococcus)
Observam-se numerosas células coradas de roxo, esféricas (cocos), isoladas ou em cacho.
ML - Bactérias Gram-negativas (Escherichia coli)
As células estão agora coradas de vermelho e são alongadas, em bastonete (bacilos).
Coloração de Gram: roxo de metilo a 0,5% + lugol, diferenciação pelo álcool-acetona e passagem pela
fucsina ácida. As bactérias Gram positivas manterão a cor do roxo de metilo; as Gram negativas perdê-
la-ão na diferenciação pelo álcool-acetona ficando apenas coradas pela fucsina (vermelho).
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ME- Bactéria Gram positiva - Bacillus subtilis
Vêem-se 4 bacilos resultantes de duas divisões sucessivas. Entre as duas células centrais, a parede
celular é completa, o que não sucede entre as células, ainda não totalmente individualizadas, das
extremidades. Observa-se o nucleóide que possui DNA filamentoso disperso e os ribossomas. A parede
celular é densa, homogénea e não estratificada. Contém peptídeoglicanos (mureína), substância em
grande parte responsável pela Gram-positividade da bactéria.
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ME - Gram-negativo. E. coli
Além das estruturas descritas na imagem anterior, notar a membrana citoplasmática e a parede celular
formada por: camada densa, delgada, contendo mureína e uma segunda membrana (membrana externa
da parede) análoga à citoplasmática.
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ME - Bactéria fotossintética. Rhodospirillium rubrum, Gram-negativo
No citoplasma em redor do nucleóide claro, numerosas vesículas, os cromatóforos, em cuja membrana
limitante existe o sistema fotossintético. Trata-se de uma célula autotrófica, capaz de sintetizar
compostos orgânicos quartenários a partir do C, H, O e N da atmosfera e da água.
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ME - Cianófita
Apresenta estrutura semelhante às bactérias Gram- mas, além disso, no citoplasma vêem-se sistemas de
membranas sobrepostas, funcionalmente semelhantes ao grana das plantas superiores, derivados de
invaginações da membrana citoplasmática. Estes organismos são incluídos nos procariontes por não
terem núcleo individualizado ou mitocôndrias, mas executam a fotossíntese como as plantas superiores,
produzindo inclusive hexoses.
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B. Células eucarióticas
ML - Levedura (Saccharomyces cerevisiae) Wright
Nesta preparação observam-se várias células, com contornos bem definidos, devido à presença de
parede celular. No seu interior existem vacúolos em número distinto, e por vezes, é possível distinguir o
núcleo.
ML - Observação de folhas vivas de Elodea em montagem aquosa
Notam-se fiadas de células rectangulares limitadas por parede celular acastanhada. No interior da célula
observa-se o núcleo ovóide, pouco distinto, e os plastos periféricos, ovalares e verdes, que se deslocam
lentamente quando iluminados.
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ME - Corte de folha jovem de alface
Característicos de uma célula vegetal são: a parede celular distinta da membrana citoplasmática, os
vacúolos (pequenos numa célula jovem) os plastos (antes de termos cloroplastos totalmente formados,
designamos estas estruturas por plastos) cujos tilacóides os permitem distinguir das mitocôndrias e a
riqueza em ribosomas livres. Notar núcleo, com regiões de heterocromatina e eucromatina, nucléolo e
invólucro nuclear, que apresenta duas membranas, uma externa e uma interna.
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ME - Corte de folha desenvolvida de beterraba
Nesta folha, quase todos os vacúolos confluíram num único enorme. Em quase todos os plastos há
massas densas de amido.
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ME- Célula de fígado de rato
Nesta célula hepática observam-se o retículo endoplásmico rugoso (RER), ao qual estão associados
ribossomas, mitocôndrias, lisossomas (que apresentam forma aproximadamente circular, sendo muito
electronodensos e tendo granulações várias, sendo, por isso, muito heterogéneos entre si) e
perixossomas, cuja função passa pela eliminação de radicais livres, resultantes de reacções celulares e
pela oxidação de lipídeos. Os peroxissomas apresentam um aspecto liso, sendo menores que os
lisossomas e tendo uma membrana mais recortada. São ainda visíveis depósitos de glicogénio, visto esta
ser uma célula hepática. Estes depósitos apresentam-se como massas escuras, podendo ser constituídas
por “pintas” agregadas (partículas alfa), ou dispersas (partículas beta). A membrana citoplasmática não
é visível no campo, mas entre o núcleo e o citoplasma vê-se o invólucro nuclear com as suas duas
membranas e complexos de poro nuclear (interrupções do invólucro).
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Núcleo
A – Morfologia do núcleo em interfase em microscopia de luz
ML - Fígado do rato. H + E
No interior dos núcleos observa-se uma
trama irregular de filamentos e grânulos
arroxeados (basófilos). Destacam-se um
ou dois grânulos maiores, que são os
nucléolos. Os restantes elementos
corados representam a cromatina
condensada ou heterocromatina estando
a eucromatina dispersa no núcleo. Pela
coloração não é possível distinguir o
nucléolo (RNA) da cromatina (DNA) dado
que ambos são basófilos.
Corpo cavernoso humano – Microscopia de fluorescência
Marcação de núcleos celulares com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), que se liga fortemente ao DNA e
emite uma radiação azul visível em microscopia de fluorescência. É largamente utilizado para corar
núcleos celulares e cromossomas em microscopia de fluorescência.
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B - ME - Cromatina expandida de um núcleo em interfase
Cromatina organizada sob a forma de nucleosomas na fibra de 10 nm, a expandir-se de um núcleo em
interfase após extracção do invólucro com detergente e tratamento com tampão hipotónico.
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C- Invólucro nuclear
Pâncreas de rato – Detecção das laminas A+C por imunocitoquímica + hematoxilina
Cortes de pâncreas de rato foram
incubados com anticorpo primário
produzido na cabra anti-laminas A+C, a
que se seguiu um secundário de ratinho
anti - cabra e um complexo de
estreptavidina-peroxídase que foi
evidenciado com DAB. Em muitos
núcleos observa-se uma circunferência
castanha a delimitar os núcleos,
correspondente à lâmina nuclear
fibrosa que integra o invólucro nuclear.
ME - Núcleo de célula do córtex supra-renal do rato
Observa-se o invólucro nuclear constituído por duas membranas perinucleares separadas por uma
cisterna. Estas são contínuas nos complexos de poro nuclear (cabeça de seta). No interior do núcleo (N)
observa-se um nucléolo (nu) e cromatina condensada - heterocromatina (hc) junto ao nucléolo e na
periferia, e cromatina dispersa - eucromatina (ec) em toda a área do nucleoplasma com organização
granular não compacta. No nucléolo distingue-se, o componente granular (3), os centros fibrilares (1)
rodeados por componente fibrilar denso (2). Observar os grânulos pericromatínicos (setas) com
diâmetro aproximado de 40 nm, e halo envolvente com 25 nm de espessura (setas).Este material foi
tratado para autorradiografia, observando-se alguns grãos de prata (círculos).
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ME - Matriz nuclear do hepatócito do rato
As matrizes nucleares foram obtidas a partir de núcleos isolados, extraídas com nucleases, detergentes
e tampões salinos. No invólucro nuclear residual, observam-se os complexos de poro nuclear (seta),
lâmina nuclear (L) e restos de membranas do invólucro (i). Observa-se grânulos intercromatínicos
(cabeça de seta). Os nucléolos apresentam-se muito compactados devido à acção química do processo
de extracção. A cromatina foi totalmente removida pela DNaseI que se utilizou.
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D - Nucléolo
Ver lâmina “Núcleo de célula do córtex supra-renal do rato”
Após a administração de 4-APP (4-aminopirazolopirimidina), o nucléolo fragmenta-se evidenciando
melhor algumas das suas estruturas: centro fibrilar (1), componente fibrilar (2), e componente granular
(3). Não se observa a cromatina condensada associada ao nucléolo. Este aspecto é devido à acção da
droga.
E - Núcleos em replicação de DNA
Supra-renal de rato. Detecção por imunocitoquímica do PCNA (Proliferating Cell
Nuclear Antigen). + hematoxilina
Cortes de glândula supra-renal de rato
foram incubados com anticorpo
primário, anti-PCNA, depois com um
secundário de cabra anti-ratinho e um
complexo de estreptavidina-peroxídase
que foi evidenciado com DAB.
Observam-se numerosos núcleos com
tonalidade castanha escura,
demonstrando a replicação do DNA, em
contraste com a coloração azul dos
restantes.
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Focos de replicação do núcleo
Observação por microscopia de fluorescência dos focos de replicação no núcleo celular em interfase de
células humanas em cultura, onde é evidente co-localização (amarelo-figura da direita) do PCNA (Red
fluorescent protein RFP-vermelho) e da DNApolimerase (green flourescent protein GFP - verde). De
modo a exprimir as duas proteínas fluorescentes, transfectaram-se as células com plasmídeos contendo
o cDNA do PCNA, e DNApolimerase em fusão com cDNA codificantes para as RFP e GFP,
respectivamente.
F - Transcrição e splicing do mRNA
Domínios de transcrição e speckles
Observação por imunofluorescência da localização da histona H3 hiperacetilada (vermelho) no núcleo
em interfase de fibroblastos humanos. O DNA está corado de azul pelo DAPI (figura A). Evidência de que
a hiperacetilação da histona H3 (vermelho) co-localiza com os focos de transcrição (figura B), onde
ocorre incorporação de bromo-uridina BrU (verde) na síntese de RNA. Na figura C observa-se os speckles
que correspondem aos grânulos intercromatínicos evidentes em TEM, e que acumulam pequenas RNP
que efectuam o splicing dos mRNAs. A sua distribuição assemelha-se à dos focos de transcrição dos
mRNAs.
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ME - Núcleos isolados a partir de células do córtex suprarrenal
A fracção de núcleos foi obtida por ultracentrifugação (90.000g). Observam-se os vários componentes
de núcleo - heterocromatina (hc), eucromatina (ec), nucléolo compactado (nu) e grânulos
intercromatínicos (speckles) em grupos, com diâmetro de 20 - 25 nm (cabeça de seta).
Corpos de Cajal
Identificação da proteína coilina por imunofluorescência, e de pequenos RNAs por hibridação in situ nos
corpos de Cajal em células HeLa (branco-resultante da sobreposição de vários fluorocromos), O DNA
está corado com DAPI azul. No painel da direita observa-se uma grande ampliação de um corpo de Cajal
após imunocitoquímica ultra-estrutural da proteína coilina, detectada com um anticorpo primário anti-
coilina, e um secundário conjugado com partículas de ouro coloidal de 5 nm (setas).