biocel- subiecte rezolvate

94
1 BIOLOGIE CELULARA ANUL I, SEMESTRUL I 1.Conceptul actual despre organizarea membranelor celulare Conceptul actual despre organizarea membranelor celulare este practic cumulul efectelor a numeroase cercetari si descoperiri biologice si biochimice anterioare, pornind de la intuirea unei structuri menite a asigura celulei o oarecare independenta relativa fara de mediul inconjurator in sensul desfasurii unei activitati eficiente, si ajungand la deslusirea organizarii sistemului membranar celular, strans legata de numele lui Singer si Nicolson. Acestia au elaborat modelul mozaic fluid de organizare a membranelor celulare (1972), care ramane valabil si pentru endomembrane, in fapt pentru toate tipurile de biomembrane. Baza articolului in care au definit acest model reprezinta o alta lucrare a celor doi cercetatori, datand din noiembrie 1971, in care s- au postulat principiile organizarii moleculare a unei membrane celulare, si anume: structura de baza este un bistrat lipidic cu proprietati fluide manifestate bidimensional, axul intregului edificiu molecular bistratul lipidic este mozaicat cu proteine, care pot fi atasate fie la exterioriul bistratului, fie la interior, fie cufundate in acesta, putandu-l strabate atat complet, cat si partial de asemenea, trebuie mentionata si prezenta componentei glucidice Cand vorbim despre membrana celulara, vorbim despre o ultrastructura alcatuita majoritar din lipide polare si proteine, care separa, dar si uneste celula cu mediul. Denumim ultrastructura orice componenta supramoleculara din structurile vii care nu paoate fi observata la MO, ci doar la ME. Biomembranele au o grosime de 7-10 nm, adica sunt de aproximativ 20 de ori mai subtiri decat o structura observabila la MO. Astfel, la baza conceptului de organizare sub forma de mozaic fluid au contribuit majoritar observatiile din preparatele de microscopie electronica obtinute prin tehnica de inghetare-fracturare, care dovedeau prezenta in membrana a unor structuri globulare ce se repartizau fie pe o fata, fie pe cealalta a suprafetei de fractura, cand aceasta trecea pe la nivelul membranei printre cele doua foite ale bistratului, unde se gaseste linia de minima rezistenta la fractura. Membrana celulara este alcatuita din 3 componente principale: 1. Plasmalema=complexul lipoproteic, structura trilaminara, grosime de aprox. 7,5 nm 2. Glicolema= complex glicoproteic, atasata superficial, pe versantul extern al plasmalemei, grosime de cca 50 nm 3. Citoscheletul membrana= retea de proteine ancorata versantului intern al plasmalemei, ce se continua spre interiorul celulei cu citoscheletul asociat matricei 2. Compozitia moleculara globala si functiile membranelor celulare Membrana celulara contine 20-30 % apa , restul de 70-80% reziduu uscat. Reziduul uscat: 1% substante minerale 99% substante organice * : lipide 40-50% / proteine 50-60% /glucide pana in 10%

Upload: victorvasile

Post on 17-Sep-2015

417 views

Category:

Documents


37 download

DESCRIPTION

Subiecte rezolvate Biologie Celulara, UMF Carol Davila.

TRANSCRIPT

  • 1

    BIOLOGIE CELULARA ANUL I, SEMESTRUL I

    1.Conceptul actual despre organizarea membranelor celulare

    Conceptul actual despre organizarea membranelor celulare este practic cumulul efectelor a numeroase

    cercetari si descoperiri biologice si biochimice anterioare, pornind de la intuirea unei structuri menite a

    asigura celulei o oarecare independenta relativa fara de mediul inconjurator in sensul desfasurii unei

    activitati eficiente, si ajungand la deslusirea organizarii sistemului membranar celular, strans legata de

    numele lui Singer si Nicolson.

    Acestia au elaborat modelul mozaic fluid de organizare a membranelor celulare (1972), care ramane

    valabil si pentru endomembrane, in fapt pentru toate tipurile de biomembrane. Baza articolului in care au

    definit acest model reprezinta o alta lucrare a celor doi cercetatori, datand din noiembrie 1971, in care s-

    au postulat principiile organizarii moleculare a unei membrane celulare, si anume:

    structura de baza este un bistrat lipidic cu proprietati fluide manifestate bidimensional, axul

    intregului edificiu molecular

    bistratul lipidic este mozaicat cu proteine, care pot fi atasate fie la exterioriul bistratului, fie la

    interior, fie cufundate in acesta, putandu-l strabate atat complet, cat si partial

    de asemenea, trebuie mentionata si prezenta componentei glucidice

    Cand vorbim despre membrana celulara, vorbim despre o ultrastructura alcatuita majoritar din lipide

    polare si proteine, care separa, dar si uneste celula cu mediul. Denumim ultrastructura orice componenta

    supramoleculara din structurile vii care nu paoate fi observata la MO, ci doar la ME. Biomembranele au o

    grosime de 7-10 nm, adica sunt de aproximativ 20 de ori mai subtiri decat o structura observabila la MO.

    Astfel, la baza conceptului de organizare sub forma de mozaic fluid au contribuit majoritar observatiile

    din preparatele de microscopie electronica obtinute prin tehnica de inghetare-fracturare, care dovedeau

    prezenta in membrana a unor structuri globulare ce se repartizau fie pe o fata, fie pe cealalta a suprafetei

    de fractura, cand aceasta trecea pe la nivelul membranei printre cele doua foite ale bistratului, unde se

    gaseste linia de minima rezistenta la fractura.

    Membrana celulara este alcatuita din 3 componente principale:

    1. Plasmalema=complexul lipoproteic, structura trilaminara, grosime de aprox. 7,5 nm

    2. Glicolema= complex glicoproteic, atasata superficial, pe versantul extern al plasmalemei, grosime

    de cca 50 nm

    3. Citoscheletul membrana= retea de proteine ancorata versantului intern al plasmalemei, ce se

    continua spre interiorul celulei cu citoscheletul asociat matricei

    2. Compozitia moleculara globala si functiile membranelor celulare

    Membrana celulara contine 20-30 % apa , restul de 70-80% reziduu uscat.

    Reziduul uscat:

    1% substante minerale

    99% substante organice*: lipide 40-50% / proteine 50-60% /glucide pana in 10%

  • 2

    *Exceptie: la nivelul tecii de mielina, unde functia de bariera este esentiala rolului membranei celulelor

    Scwann, procentul de masa pt lipide este de 80%

    Desi in majoritatea sistemelor biologice apa reprezinta aproximativ 70-80%, in membrana situatia sta

    exact invers, explicatia gasindu-se tocmai din rolul membranei: separarea a doua medii hidrofile, astfel

    explicandu-se un procent redus de apa, precum si continutul in lipide al structurii de baza a membranei,

    bistratul, asigurandu-se astfel caracterul hidrofob.

    Lipidele sunt prezente exclusiv in plasmalema, proteinele sunt anexate ca un mozaic plasmalemei, putand

    fi atasate atat la exterior, cat si la interiorul acesteia, dar o pot si strabate, cufundandu-se fie complet, fie

    partial. Componenta glucidica este atasata exclusiv versantului extern al plasmalemei.

    Legat de functiile membranei celulare, aceasta trebuie sa se comporte ca o barire selectiva, si nu absoluta,

    intre mediile extracelular si intracelular, permitand interactiunea celulei cu mediul. De aceea, putem

    afirma ca membrana celulara trebuie sa indeplineasca doua mari categorii de functii:

    functie de bariera (selectiva)

    functie metabolica( adica sa asigure celulei schimburi de informatie si substanta cu mediul, in

    ambele sensuri)

    3. Lipidele membranare: definitie, clasificari

    Lipidele reprezinta 40-50% din procentul de 99% de substante organice al membranelor celulare. Sub

    aspect molecular , constituie componenta structurala de baza a membranelor celulare(raportul molecular

    lipide/proteine fiind de 50/1).

    DEF: Lipidele membranare reprezinta o categorie larga de substante organice relativ insolubile in apa,

    dar solubile in cei mai multi solventi organici, cu caracter amfifil, multe dintre ele fiind esteri ai unor

    alcooli polihidroxilici cu acizi grasi.

    Sunt molecule mici cu grade mari de libertate in a se misca intre ele la niveul structurii, determinand o

    anume dinamicitate. Cu cat componentele sunt mai mici, cu atat miscarea este mai frenetica. Au tendinta

    spontana de asociere, corectand usor eventualele defecte sau reparand leziuni ale bistratului.

    Biochimia descrie o mare diversitate de clase de lipide, grupate-n doua mari categorii:

    lipide complexe(ce contin in structura lor acizi grasi , ex: acilgliceroli, fosfogliceride,

    sfingolipide, ceruri)

    lipide simple(steroizi, prostaglandine, terpene)

    Cu toate acestea, in membranele celulare intalnim doar 3 tipuri de lipide:

    1. Fosfolipide(70-75%)

    2. Colesterol(20-25%)

    3. Glicolipide(1-10%)

    Fosfolipidele, in functie de poliolul din structura, pot fi:

    fosfogliceride=glicerofosfatide , in cazul in care poliolul este glicerina

    fosfosfingozide, in cazul in care poliolul este sfingozina

  • 3

    In functie de molecula X a capului hidrofil, fosfogliceridele pot fi:

    X=colina => fosfatidilcoline(PC)

    X=etanolamina => fosfatidiletanolamine (PE)

    X= serina => fosfatidilserine(PS)

    X=inozitol => fosfatidilinozitoli (PI)

    X= hidrogen => acid fosfatidic (PA)

    4. Fosfolipide membranare. Distributie, mobilitate

    Fosfolipidele ilustreaza categoria lipidelor complexe si formeaza majoritatea continutului lipidic din

    endomembrane , iar in membrana celulara se gasesc in proportie de 75% din continutul lipidic. In functie

    de poliolul din structura, fosfolipidele pot fi fosfogliceride sau fosfosfingozide.

    Pe scheletul polialcoolului component=glicerina, in acest caz, se afla grefate pe de o parte , la gruparile

    oxidrilice din pozitiile 1 si 2, doua lanturi alifatice provenind de la acizii grasi esterificati cu respectivele

    grupari=> coada hidrofoba a lipidului membranar, iar, pe de alta parte, la oxidrilul din pozitia 3 a

    glicerinei, se ataseaza o componenta X .

    In functie de molecula X a capului hidrofil, fosfogliceridele pot fi:

    X=colina => fosfatidilcoline(PC)

    X=etanolamina => fosfatidiletanolamine (PE)

    X= serina => fosfatidilserine(PS)

    X=inozitol => fosfatidilinozitoli (PI)

    X= hidrogen => acid fosfatidic (PA)

    Deoarece fosfolipidele concentreaza la un capat radicalii hidrofil si la celalalt capat radicalii hidrofobi,ele

    sunt denumite molecule amfipate sau bimodale. Fosfolipidele au astfel tendinta de orientare in monostrat,

    iar, atunci cand concentratia fosfolipidelor este mai mare decat cea necesara, ele se organizeaza in micelii.

    Alte tipuri de fosfolipide: cardiolipide (difosfatidil gliceroli), plasmalogene (reprezinta 10% dintre

    fosfolipidele creierului, iar in muschiul cardiac procentul lor ajunge pana la 50%, avand rol in protectia

    miocardului fata de actiuntea radicalilor liberi de oxigen).

    Legat de distributia in bistrat:

    o pe foita interna: PE, PS, PI (cu mentiunea ca aparitia PS in foita externa reprezinta un semn

    timpuriu al fenomenului de apoptoza celulara)

    o pe foita externa: PC, sfingomieline (echivalentul PC pentru fosfosfingozide)

    o intre foite: colesterol

    Legat de mobilitate, putem afirma ca , fosfolipidele, ca orice lipide membranare, pot executa urmatoarele

    tipuri de miscari:

    1. Miscari intramoleculare ( realizate in raport cu propria lor axa si geometrie)

    - de rotatie (109 rotatii/secunda)

    -de flexie a cozilor hidrofobe( 108 flexii/secunda)

  • 4

    2. Miscari intermoleculare

    -de translatie(difuzie laterala) = miscarile ale lipidelor in planul membranei, unele pe langa altele, cu o

    frecventa de schimbari de directie de 107 schimbari/secunda. Prezenta colesterolului in bistrat

    determina o diminuare a mobilitatii laterale !!!

    -de flip flop = miscari de trecere a lipidelor dintr-o foita a bistratului in cealalta, cu o frecventa extrem de

    mica, practic nula, cu exceptia cazului membranei R.E

    5. Rolul lipidelor membranare

    Lipidele membranare reprezinta componenta structurala de baza a membranelor ceulare , le confera

    proprietatea de bariere selective si asigura caracterul hidrofob necesar pentru rolul lor de separare a doua

    medii hidrofile.

    Lipidele nu prezinta doar rolulri structurale, ci sunt implicate si in importante functii metabolice, unind

    celula cu mediul inconjurator si integrand-o in ambianta biosociala. Echilibrul dintre diferitele tipuri de

    lipide din membrane influenteaza comportamentul normal al celulei, iar modificarea lui poate atrage

    deviatii patologice( ex: aparitia fosfatidilserinelor in foita externa a bistratului lipidic este un semn

    timpuriu al fenomenului de apoptoza celulara). Astfel, lipidele membranare pot reprezenta tinte

    terapeutice.

    Glicolipidele sunt implicate in fenomene de recunoastere si semnalizare intercelulara.

    Detalii referitoare la rolurile metabolice ale lipidelor sunt cunoscute pentru fosfolipide. Acestea pot fi

    modificate de enzime specifice numite fosfolipaze. De regula, acesta modificari se petrec ca urmare a

    unor procese de semnalizare, parte dintre metabolitii rezultati actionand ca mesageri secunzi si facilitand

    numerioase procese prin care celulele raspund semnalelor receptate.

    Exista mai multe tipuri de fosfolipaze, care au proprietatea de a elibera diverse molecule din complexa

    structura biochimica a fosfolipidelor:

    fosfolipaza A1( PLA1) -elibereaza acidul gras din pozitia 1 a glicerinei

    fosfolipaza A2(PLA2)- elibereaza acidul gras din pozitia 2 a glicerinei => lizofosfatide

    fosfolipaza B( PLB) , care poate scoate acizi grasi din ambele poitii ale glicerolului din structura

    fosfolipidelor, completand de regula activitatea PLA1 si PLA2; in general, actioneaza asupra

    lizofosfatidelor, eliminand din bistrat fosfolipidul afectat

    fosfolipaza C - desface legatura dintre glicerina si fosfat, cu eliberare de diacilgliceroli(DAG), ce

    raman in bistrat si , de asemenea, cu eliberarea unui compus hidrofil, ce difuzeaza in citosol

    fosfolipaza D - elimina restul hidrofil X, cu formarea de acizi fosfatidici(legare de hidrogen la

    legatura ramasa libera)

    Notam de asemenea si ca fosfolipaza A2, prin actiunea sa, poate elibera acidul arahidonic, care este

    precursor pentru 4 clase de substante :

    1. Prostaglandine

    2. Tromboxani

    3. Prostacicline

    4. Leucotriene

  • 5

    Toate aceste 4 clase de substante sunt obtinute prin complexe procese de metabolizare a acidului

    arahidonic proaspat eliberat de fosfolipaza A2. Primele 3 tipuri rezulta pe calea ciclo-oxigenazei, iar cea

    de-a patra pe calea lipo-oxigenazei.

    6. Proteinele membranare: generalitati si clasificari

    Modelul mozaicului fluid de organizare a membranelor biologice ne arata ca, alaturi de lipidele

    structurate sub forma de bistrat, la constructia acestor componente celulare participa si proteinele.

    Raportul molecular intre lipide si proteine este de 50/1, unul usor de inteles avand in vedere ca , de regula,

    compozitia sub aspectul masei de material organic la nivelul membranelor este de aprox. 40% lipide si

    50% proteine, lipidele fiind molecule cu greutate moleculara mica, iar proteinele fiind macromolecule.

    Cu cat functiile metabolice ale unei membrane(sau anumite portiuni definite drept domenii/microdomenii

    membranare) sunt mai pregnante, cu atat continutul de proteine al acelei membrane/portiuni de membrana

    este mai ridicat.

    Cu cat rolul de bariera al unei membrane trebuie sa se manifeste mai pregnant, cu atat continutul in

    proteine este mai scazut, fiind crescut cel in lipide.

    Mozaicarea bistratului lipidic cu proteine nu anuleaza, ci amplifica si nuanteaza eterogenitatea, asimetria

    si comportamentul de fluid bidimensional al structurii.

    In functie de pozitia lor fata de bistratul lipidic:

    o proteine periferice=extrinseci (atasate de o parte sau de alta a bistratului lipidic, interactionand cu

    capetele hidrofile ale lipidelor)

    o ectoproteine(la exteriorul foitei externe)

    o endoproteine(pe foita interna, expuse pe fata citoplasmatica)

    o proteine integrale= intrinseci(cufundate in bistratul lipidic)

    o proteine care traverseaza complet bistratul lipidic= proteine transmembranare

    o proteine partial cufundate in bistratul lipidic(ex: citocromul b5 si caveolina)

    De notat de asemenea ca proteinele periferice reprezinta aprox. 25% din proteinele unei membrane, se

    extrag din mb cu solutii saline sau agenti chelatori, au caracter hidrofil , iar dupa extragere, isi pastreaza

    solubilitatea in apa.

    Proteinele integrale reprezinta de regula 75% din proteinele unei membrane, se extrag din membrane

    prin folosirea de detergenti, cu distrugerea bistratului, iar dupa extragere, raman asociate cu lipide. Aceste

    proteine sunt insolubile in apa si au caracter amfifil, cu portiune hidrofoba reprezentata de zona imersata

    in bistrat, si zona/zone hidrofile, reprezentata/e de domeniile lantului polipeptidic expuse in afara

    bistratului.

    Proteinelor transmembranare li se definesc 3 domenii structurale:

    1. Ectodomeniu(portiunea expusa pe fata externa a membranei)

    2. Domeniu transmembranar(portiunea ce strabate bistratul lipidic)

    3. Endodomeniu(portiunea expusa pe fata interna a membranei)

    De asemenea, proteinele transmembranare sufera si ele doua clasificari, si anume:

    In functie de nr. de treceri ale lantului polipeptidic prin planul membranei:

  • 6

    unipas

    multipas

    In functie de pozitia capatului amino:

    prot. transmembranare de tip I ( cu capatul amino in ectodomeniu)

    prot. transmembranare de tip II ( cu capatul amino in endodomeniu)

    7.Exemple de proteine membranare: descriere si mobilitate

    Inainte de exemplificare, trebuie mentionat ca primele si cele mai detaliate informatii asupra proteinelor

    membranare au fost obtinute din studiul membranelor eritrocitare, din urmatoarele considerente:

    material biologic usor de obtinut si in cantitate suficienta

    populatia celulara omogena este usor de asigurat

    membranele se obtin fara dificultate printr-un simplu soc hipoton urmat de centrifugare, iar

    membranele obtinute(numite si fantome eritrocitare) nu sunt impurificate cu

    endomembrane=membrane ale organitelor celulare, inexistente in acest caz

    GLICOFORINA

    Este o proteina prezenta din abundenta in membrana eritrocitului, care are caracteristic faptul ca migreaza

    atipic la electroforeza( se dispune undeva la 90 kDa, desi masa ei moleculara este de numai 30 kDa) .

    Prezinta 131 AA si este o proteina transmembranara unipas de tip I ( cu capatul amino in ectodomeniu).

    Ectodomeniul prezinta 16 lanturi glucidice ce practic dubleaza gabaritul acestei molecule, explicandu-se

    astfel migrarea electroforetica atipica. Endodomeniul este mic, domeniul transmembranar este structurat

    in alfa helix si contine 23 AA. Toti AA componenti sunt cunoscuti, structura este cunoscuta.

    Exista mai multe izoforme de glicoforina identificate pana in prezent: A,B,C,D,E. Functia glicoforinei

    NU este cunoscuta, iar "misterul" este adancit de faptul ca exista eritrocite din a caror membrane

    glicoforina lipseste , iar functionalitatea nu le este afectata.

    BANDA 3 = AE1 (Anion Exchanger 1)

    Este proteina care structureaza canalul anionic de schimb intre bicarbonat (HCO3-) si clor( Cl-), cu rol in

    fenomenul de mb Hamburger.

    Prezinta 911 AA si este o proteina transmembranara multipas cu masa moleculara de 100 kDa.

    Exact opus glicoforinei, in cazul AE1 , deslusirea detaliilor structurale a evoluat mai anevoios, iar functia

    a fost rapid si clar stabilita.

    O alta particularitate in contradictie cu glicoforina este faptul ca , in cazul AE1, endodomeniul este mare,

    purtand atat partea N- terminala, act si pe cea C-terminala( 359+33 => aprox. 400 AA in endodomeniu),

    ectodomeniul este mic si poarta o incarcatura glucidica mica(un singur lant), iar domeniul

    transmembranar prezinta 12-14 treceri in alfa-helix prin bistratul lipidic.

  • 7

    In portiunea C terminala(aflata in endodomeniu), AE1 leaga anhidraza carbonica II, importanta pentru

    fucntia transportorului prin furnizarea anionului bicarbonat. Au fost identificate forme mutante pentru

    aceasta proteina=> patologii specifice eritrocitelor, iar glicoforina A pare a fi de ajutor in acest caz pentru

    restabilirea functiei de transport.

    SPECTRINA

    Impreuna cu glicoforina si cu AE1 reprezinta peste 60% (in procente de masa) din proteinele membranei

    eritrocitare.

    Spectrian este o proteina periferica situata pe fata interna a membranei => este o endoproteina,

    reprezentand componenta de baza a citoscheletului membranar eritrocitar.

    Spectrina este un heterodimer format dintr-o subunitate alfa(alfa-spectrina, 280 kDa) si o subunitate

    beta(beta-spectrina, 246 kDa). Ambele subunitati sunt formate predominant din multiple unitati repetitive

    de 106 AA.

    Cele doua subunitati se rasucesc usor una in jurul alteia intr-o structura elicoidala=> bastonase flexibile

    cu lungimea de 100 nm. Rasucirea este in contrasens, fiecare bastonas avand la capate gruparea N-

    termina a unei subunitati si gruparea C- terminala a celeilalte. Capatul ce contine gruparea N-terminala a

    subunitatii alfa este numit capul bastonasului, iar cel ce contine gruparea N-terminala a subunitatii beta

    este numit coada bastonasului.

    Bastonasele au capacitatea de a interactiona cate doua, cap la cap => tetrameri lungi de 200 nm, iar

    capetele tetramerilor se pot asocia cu oligomeri de actina, formand nodurile retelei citoscheletale.

    ACTINA

    Este o alta proteina care participa la structurarea citoscheletului membranei, asigurand solidarizarea

    componentelor acestuia la nivelul nodurilor.

    In forma sa monomerica, actina este o proteina globulara cu masa de 43 kD si diametru de 5 nm. La

    nivelul citoscheletului membranar formeaza fragmente mici, de 8-12 monomeri, cu rolul de a asigura

    asocierea cozilor tetramerilor de spectrina in nodurile retelei citoscheletale.

    BANDA 4.1

    Tot in noduri se localizeaza si banda 4.1, cu masa de 80kD si conformatie globulara.

    Banda 4.1 interactioneaza dinamic cu spectrina si actina in nodurile retelei citoscheletale si, pe de alta

    parte, cu endodomeniul glicoforinei C, contribuind la atasarea citoscheletului pe versantul intern al

    membranei, de aici rezultand un rol structural al unei izoforme a glicoforinei.

    Atasarea citoscheletului asociat la membrana este datorata si unei alte proteine globulare=ankirina.

    Rezumand, citoscheletul membranei este format din tetrameri de spectrina ce organizeaza lanturile

    ochiurilor retelei, unde, prin intermediul ankirinei se leaga de banda 3 si din mici filamente de actina care

    leaga cozile tetramerilor de spectrina la nivelul nodurilor retelei, unde, prin intermedierea benzii 4.1,

  • 8

    reteaua se ataseaza suplimentar la endodomeniul benzii 3. Aceste interactiuni sunt intr-o dinamica

    permanenta, aceasta structura nefiind rigida, ci intr-o continua modelare care sa satisfaca nevoile celulei.

    8. Mobilitatea proteinelor membranare si semnificatia biologica a acesteia

    Mobilitatea proteinelor membranare consta in :

    miscari de rotatie

    miscari de translatie

    Miscarea de rotatie a proteinelor membranare in jurul propriei axe= difuzie rotationala este de cel putin

    1000 de ori mai lenta decat cea a lipidelor, avand in vedere si diferentele de gabarit.

    Miscarea de translatie=difuzie laterala, este si ea mult mai lenta decat cea a lipidelor , iar aceasta

    lentoare nu trebuie inteleasa numai prin diferentele de marime intre proteine si lipide, ci si prin

    interactiunile pe care proteinele le stabilesc in mod dinamic intre ele, sau cu alte structuri dinauntrul sau

    din afara celulei. Astfel, aceeasi proteina, in aceleasi conditii de fluiditate a bistratului lipidic, se poate

    misca mai repede sau mai incet, mai mult sau mai putin, in functie de starea ei functionala de moment.

    9.Citoscheletul asociat membranei: descriere si functii

    Citoscheletul asociat membranei este una din cele 3 componente principale ale unei membrane celulare,

    alaturi de glicolema si plasmalema, si este o structura aflata pe versantul intern al bistratului lipidic.

    Citoscheletul este o retea de endoproteine cu ochiuri si noduri, solidara atat membranei ,prin atasarea la

    endodomeniul unor proteine transmembranare, cat si citoscheletui citosolic, cu care se continua , sub

    forma unei retele structurale continue responsabile de mentinerea/modificarea formei celulelor , precum si

    a geometriei membranelor.

    In continuare vom descrie citoscheletul membranar eritrocitar, cu notiunea ca detaliile structurale se

    pastreaza in cazul tuturor membranelor:

    Componenta de baza a retelei citoscheletale este reprezentata de spectrina , ale carei subunitati alfa si

    beta se rasucesc in contrasens una in jurul celeilalte=> bastonase, care se lipesc la capete cate 2=>

    tetrameri lungi de 200 nm, iar capetele acestor tetrameri se pot asocia cu oligomeri de actina, formand

    nodurile retelei citoscheletale.Astfel, actina este o alta proteina care participa la structurarea

    citoscheletului membranei, asigurand solidarizarea componentelor acestuia la nivelul nodurilor.

    Banda 4.1 interactioneaza dinamic cu spectrina si actina in nodurile retelei citoscheletale si, pe de alta

    parte, cu endodomeniul glicoforinei C, contribuind la atasarea citoscheletului pe versantul intern al

    membranei, de aici rezultand un rol structural al unei izoforme a glicoforinei.

    Atasarea citoscheletului asociat la membrana este datorata si unei alte proteine globulare=ankirina.

    Toate aceste interactiuni anterior prezentate sunt intr-o dinamica permanenta, citoscheletul nefiind o

    structura rigida, ci una intr-o continua modelare , pentru satisfacerea nevoilor celulare, fenomen la care

    participa si miscarile proteinelor, de difuzie rotationala, respectiv laterala. Citoscheletul este de asemenea

    o structura asimetrica.

  • 9

    Nodurile citoscheletului membranar au o anumita dinamica si permit membranei sa isi schimbe curbura.

    Prin aceasta organizare citoscheletala de la nivelul eritrocitului i se poate explica acestuia capacitatea de

    a-si modifica forma cand trece prin capilare.

    10. Rolul proteinelor membranare

    Ca si in cazul lipidelor membranare, proteinele au atat rol structural ( de ex in structura citoscheletului)

    cat si rol metabolic.

    Rolurile metabolice ale proteinelor membranare se manifesta in ceea ce priveste schimburile de informatii

    si substanta dintre celule, sau dintre acestea si mediu. Astfel, proteinele membranare pot fi

    receptori(pentru hormoni, factori de crestere etc.), transportori prin membrana(canale ionice, pompe

    ionice, aquaporine) sau transportori cu membrana(clatrina, caveolina).

    Proteinele membranare mai pot functiona ca enzime(fosfolipaze, kinaze) sau ca proteine implicate in

    semnalizare(de ex: proteine G).

    In toate aceste roluri, asimetria structurarii membranei este deosebit de importante. Astfel, receptorii, dar

    si proteinele de adeziune, prin asimetria lor structurala, permit interactiunea prin ectodomenii cu liganzii

    specifici, iar prin endodomenii asigura transmiterea informatiei catre interiorul celului si declansarea unor

    procese celulare care se constituie ca un raspuns celular la semnalele receptate.

    De remarcat ca in transmiterea semnalelor prin receptori un rol important revine domeniului

    transmembranar al acestor proteine integrale. Domeniile transmembranare au capacitatea de a suferi

    rearanjari conformationale, induse de legarea ligandului, rearanjari conformationale ce asigura

    transmiterea, din afara celulei in citoplasma, a informatiei purtate de ligand si predate prin interactiunea

    cu receptorul specific, fenomen numit si transductie a semnalului.

    Odata ajunsa la nivelul endodomeniului receptorului, informatia este preluata, prelucrata, si, de regula,

    amplificata de participantii la diverse procese de semnalizare(mesageri secunzi sau direct efectori

    intracelulari). De mentionat aici ca efectele asupra conformatiei domeniilor transmembranare sutn

    dependente si de fluiditatea membranei din acel moment.

    Deci, proteinele membranare sporesc eterogenitatea compozitionala si asimetria membranelor si

    moduleaza proprietatile fluide ale acesteia, adica, accentueaza si modeleaza caracteristicile induse de

    bistratul lipidic. Altfel spus, proteinele membranare coopereaza cu lipidele atat in structurarea membranei

    cat si in perfectarea functionalitatii acesteia, prin rolul lor metabolic, cel care asigura integrarea celulei cu

    mediul.

    Principalul rol al proteinelor este cel metabolic. Cu cat functiile metabolice ale unei membrane(sau

    anumite portiuni definite drept domenii/microdomenii membranare) sunt mai pregnante, cu atat continutul

    de proteine al acelei membrane/portiuni de membrana este mai ridicat.

    In exercitarea rolurilor metabolice, proteinele membranare pot antrena atat lipidele membranare, cat si

    componente citosolice sau extracelulare.

  • 10

    11. Glicocalixul: definitie, caracterizare generala

    Glicocalixul reprezinta invelisul glucidic al celulelor, constituit din structuri oligozaharidice sau

    polizaharidice inserate pe lipide ale foitei externe a bistratului sau pe ectoproteine sau pe ectodomeniile

    proteinelor transmembranare. Deci, glicocalixul reprezinta o parte componenta a membranei celulare,

    alaturi de plasmalema si de citoscheletul membranar, si este ancorat intotdeauna versantului extern al

    bistratului lipidic. Glicolipidele poarta doar structuri oligozaharidice, iar proteinele pot purta atat

    structura oligozaharidice, cat si polizaharidice.

    Din punct de vedere al structurii biochimice globale, trei sunt componentele membranare ce participa la

    structurarea glicocalixului prin partile glucidice din structura lor:

    glicolipidele

    glicoproteinele

    proteoglicanii

    Toate aceste trei categorii de componente sunt denumite generic, glicoconjugate.

    Grosimea glicocalixului este in medie intre 20 si 50 nm, cu variatii de la un tip de celula la altul, dar si

    pentru aceeasi celula de la un domeniu membranar la altul(spre ex la celulele epiteliilor unistratificate,

    intre polul apical si cel latero-bazal). O regula pe care o aplicam in intelegerea grosimii glicocalixului este

    ca acesta are o grosime cu atat mai mare, cu cat celulele sunt mai putin implicate in interactiuni

    intercelulare sau cu substrate din matricea extracelulara. In mediile deosebit de agresive(stomac,

    intestin), glicocalixul celulelor epiteliale unistratificate este ingrosat de secretii glicoproteice de tip

    mucinic.

    In structurarea glicocalixului nu participa toate monozaharidele existente in natura, ci doar 7:

    o glucoza(Glc)

    o galactoza(Gal)

    o manoza(Man)

    o fucoza(Fuc) (!! sg zaharida din seria L, restul apartin seriei D)

    o N-acetil glucozamina(GlcNAc)

    o N-acetil galactozamina(GalNAc)

    o acizii sialici (SA)

    Spunem acizi sialici(la plural) deoarece ne referim la o intreaga clasa de compusi derivati din acidul

    neuaraminic(precum acidul N-acetil neuraminic sau N-glicolil neuraminic). Diversitatea SA este vasta,

    intrucat reprezentantii de baza pot fi O-acetilati la hidroxilii de la carbonii 4,7,8 si 9, iar, mai departe, pot

    fi mono/di/tri acetilati.

    In afara de aceste sapte componente, in proteoglicani intalnim si monozaharidul xiloza(necesar pentru a

    lega structura glucidica de o serina din partea proteica), precum si acizi uronici(glucuronic si iduronic).

    Dupa aceasta enumerare de componente, putem accentua putin ideea eterogenitatii structurarii

    membranelor(indusa de lipide, si amplificat de proteine si de structurile glucidice), prin faptul ca

    insiruirea glucidelor din lanturi oligozaharidice nu este aceeasi, ea diferind intre diversele glicolipide si

    glicoproteine. Mai mult, legarea monozaharidelor intre ele se poate face in mai multe moduri, intrucat

    exista mai multe grupari hidroxil disponibile. Totusi, nu toata aceasta gama larga de posibilitati este

    exploatata de celula, lucrurile fiind limitate de tipurile de ezine numite glicoziltransferaze.

  • 11

    In legatura cu succesiunea monozaharida a lanturilor oligozaharide, se pot face urmatoarele afirmatii cu

    caracter de regula:

    o glucoza nu se gaseste NICIODATA in pozitia termina a lantului

    o acizii sialici se gasesc aproape intotdeauna in pozitia terminala a lantului

    Glicocalixul protejeaza structura membranei celulare impotriva agresiunilor fizico-chimice din mediu.

    11*. Metodologia de studiu a glicocalixului

    Prezenta glicocalixului la suprafata celulelor a fost evidentiata la ME prin metode de citochimie

    ultrastructurala:

    nespecifice( evidentiaza structura, fara indicii referitoare la compozitia ei biochimica)

    specifice ( metode ce permit descrierea, cel putin partiala, a biochimiei structurii)

    Ca exemplu de metoda nespecifica, amintim folosirea rosului de ruteniu. Acest compus interactioneaza

    cu sarcinile negative de la nivelul glicocalixului, impregnandu-i gromsimea cu nucleii grei ai ruteniului,

    conferind structurii electrono-opacitate. Putem caracteriza astfel glicocalixul sub aspectul grosimii sale si

    a densitatii lanturilor glucidice care il compun.

    Ca metoda specifica, prezentam citochimia ultrastructurala cu lectine.

    Lectinele = proteine sau glicoproteine ce leaga specific structuri glucidice, au cel putin doua situri de

    legare identice, si NU sunt de origine imuna, adica nu sunt anticorpi. Lectinele mai sunt cunoscute si sub

    denumriea de aglutinine, deoarece pot aglutina celulele sanguine. Lectinele au fost initial identificate in si

    extrase din plante. Ulterior, activitati de tip lectinic au fost evidentiate si in organismele animale.

    In citochimia ultrastructurala, lectinele pot fi folosite fie sub forma nativa, fie cuplate cu trasori electrono-

    opaci ( ex: feritina, hempeptizi, aur coloidal).

    Folosirea in forma nativa a lectinelor implica utilizarea unor metode-n doi pasi, numite metode Sandwich.

    La primul pas, suprafata celulelor este incubata cu lectina aflata-n exces in solutie. Excesul este apoi

    indepartat, iar lectinele ramase sunt deci atasate specific prin unul din siturile de legare de componentele

    glucidice ale membrane. Acest lectine vor fi vizualizate prin legarea lor de glicoproteine corespunzatoare,

    cuplate cu trasori electrono-opaci. Deci, aceste glicoproteine marcate cu trasori electrono-opaci se fixeaza

    pe siturile de interactiune ale lectinelor ramase disponisibile dupa legarea cu celalalt sit la glicocalix (

    deci, la al doilea sit al lectinelor folosite initial, primul sit fiind folosit pentru atasarea la glicocalix ce a

    avut loc in primul pas).

    Avantajul acestor metode este ca lectinele sunt folosite cu capacitatile de legare (afinitatea si

    specificitatea) nealterate. Afinitatea si specificitatea acestor unelte de studiu pot fi afectate-n cazul

    folosirii directe a unor conjugate lectina-trasor electrono-opac, din cauza reactiilor chimice petrecute-n

    cadrul cuplarii, sau a posibilelor impiedicari sterice care pot aparea-n conjugat.

    In caracterizarea partiala a glicocalixului, a fost folosita o gama larga de lectina, precum:

    1. Concanavalina A : leaga alfa-Manoza din miezul trimanozidic al structurilor N-glicozidice, sau leaga

    alfa-Glucoza din pozitie terminala ( deci, la nivelul glicocalixului, Concanavalina A nu se leaga de

    Glucoza, aceasta nefiind niciodata gasita la nivel terminal)

  • 12

    2. Lectina I , izolata din Ulex europaeus (UEA I) recunoaste alfa-Fucoza aflata-n pozitia terminala a

    lantului glucidic

    3. DBA leaga structuri ce contin alfa-GalNAc legata de o alta GalNAc

    4. WGA/LPA : leaga acizi sialici si pot recunoaste si beta-GlcNAc

    5. PNA si RCA I : pentru beta-Galactoza( PNA se leaga exclusiv de Gal aflata-n pozitie terminala, in

    timp ce RCA I poate recunoaste si Gal aflata-n pozitie subterminala, doar daca acidul sialic terminal e

    inserat la hidroxilul carbonului 6 al acesteia)

    Cu cat spectrul lectinelor folosite este mai larg, cu atat imaginea asupra glicocalixului este mai detaliata.

    In plus, combinarea acestor metode cu folosirea exo- sau endo-glicozidazelor pentru degradarea specifica

    secventiala sau globala a lanturilor glucidice, completeaza fericit caracterizarea citochimica a

    glicocalixului.

    12. Functiile glucidelor membranare

    Glicocaliaxul protejaza structura membranei celulare impotriva agresiunilor fizico-bio-chimice. Modul in

    care glicocalixul este strucutrat confera membranei rezistenta mecanica, controland accesul catre straturile

    profunde ale sale, deci, catre bistratul lipidic si catre componentele proteice ale acesteia. Rolul acesta este

    cu atat mai important cu cat accesibilitatea factorilor agresivi este mai mare. Aceasta este o motivatie

    pentru care celulele sanguine, sau polii apicali ai celulelor epiteliale dispuse in monostrat au glicocalixul

    abundent. Mai mult, in anumite situatii in care agresiunile pot fi mai accentuate, membranele sunt

    protejate de secretii glicoproteice abundente(precum mucinele).

    Prin componentele acide din structura lor (acizi sialici, acizi uronici, grupari sulfat), lanturile

    oligo/polizaharidice ale glicocalixului participa la sarcina negativa a suprafetei celulare, o caracteristica

    general valabila tuturor celular, care face ca interactiunile dintre celule sa nu se poata realiza decat sub

    control celularl, in microdomenii membranare inalt specializate in realizarea acestei functii.

    Asadar, componentele structurale ale glicocalixului sunt implicate in fenomene de recunoastere celulara,

    cu rol in organizarea de tesuturi si organe, atat prin interactiuni ale celulelor intre ele, cat si prin aderarea

    acestora la substrate extracelulare.

    De asemenea, exista si fenomene fiziologice care se desfasoara pe baza unor modificari ale structurilor

    glucidice ale suprafetei celulare. De exemplu, eritrocitele de mamifer , dupa desialilarea structurilor din

    glicocalix, sunt eliminate din circulatie la nivelul ficatului si splinei. Pierderea de acid sialic din pozitia

    terminala a structurilor glucidice din glicocalix reprezinta semnal de imbatranire a acestor celule. La fel si

    in cazul plachetelor sanguine: cele desialilate isi micsoreaza timpul de viata in circulatie si se determina

    astfel sporirea trombocitopoiezei. Eliminarea din circulatie a celulelor cu structurile glucidice desialilate

    implica receptori cu activitate lectinica indreptata impotriva galactozei ajunsa in pozitie terminala,

    receptori aflati pe suprafata celulelor cu rol de macrofage din organele curatitoare.

    Alte exemple de fenomene de recunoastere celulara care implica structuri glucidice sunt:

    extravazarea leucocitelor si monocitelor in zonele de inflamare tisulara

    fertilizarea si fenomenul de capacitare a spermiilor

    compatibilatile de grup sanguin ale sistemului AB0 (purtatoarele antigenelor de grup sanguin sunt

    glicolipide si glicoproteine din membranele celulelor sanguine)

  • 13

    In final, putem afirma ca implicarea glicocalixului in fiziologia si patologia celulara a facut ca acesta sa

    fie considerat tinta terapeutica in tratamentele multor boli.

    13. Conceptul de microdomenii de membrana; exemple. Semnificatia biologica a

    organizarii microdomeniilor de membrana

    Manifestarea bidimensionala a fluiditatii bistratului lipidic da membranei celulare caracterul de structura

    cu proprietati mezomorfe, proprietati specifice cristalelor lichide.

    Acest comportament mezomorf este accentuat de capacitatea lipidelor de a organiza microdomenii

    bogate in sfingolipide, colesterol si anumite proteine membranare. Aceste microdomenii sunt

    denumite plute lipide(lipid rafts) si au importanta atat structurala(organizeaza ultrastructuri specializate

    ale membranei, precum caveolele), cat si metabolica, tinand laolalta molecule si macromolecule destine a

    functiona impreuna in complexe supramoleculare.

    Pentru a intelege mai bine structurarea microdomeniilor de membrana, sa mentionam ca lipidele, asa cum

    nu sunt echilibrat repartizate intre cele doua foite ale bistratului, nu sunt omogen amestecate nici in cadrul

    fiecarei foite a bistratului, ci se asociaza in mod neomogen pe considerente fizice. Plutele lipide fie

    planare, fie invaginate sub forma caveolelor, se caracterizeaza printr-o fluiditate mai mica in comparatie

    cu restul bistratului.

    Prezenta plutelor lipidice si eterogenitatea lor sustin si nuanteaza ideea de organizare a membranelor ca

    un mozaic fluid. Plutele lipide pot fi asemuite unor sloiuri de forme, dimensiuni si compozitie biochimica

    variate, ce plutesc in oceanul lipidic mai putin specific organizat. Caveolele reprezinta o forma de plute

    lipidice, ce se dispun individual, sau in ciorchini la nivelul membranei.

    Eterogenitatea plutelor lipidice a fost evidentiata prin interpretarea rezultatelor diferitelor metode:

    diversi detergenti neionici utilizati , ce duc la fractiuni cu compozitie diferita

    sonicarea preparatelor de membrane si analizarea fractiunii usoare, cu rezultate diferite

    analize imunocitochimice(diferite incarcaturi proteice la nivelul diverselor microdomenii)

    Astfel, putem extrage cateva caracteristici generale ale plutelor lipidice:

    Colesterolul este de 3-5 ori mai abundent decat in restul membranei si reprezinta 33-50% din

    totalul lipidelor la acest nivel

    sfingolipidele si glicolipidele sunt imbogatite

    glicerofosfolipidele sunt sarac reprezentate

    lipidele specifice foitei interne a bistratului (PS,PI) sunt slab reprezentate la nivelul plutelor

    lipidice

    in foita interna de la nivelul plutelor, lipidele contin preferential acizi grasi saturati, lucru ce

    realizeaza necesarul de rigiditate corespunzator celei a foitei externe, unde sfingolipidele sunt

    bogat reprezentate

    Plutele lipidice se caracterizeaza si prin capacitatea de a aglomera anumite tipuri de proteine membranare.

    Organizarea lipidelor membranare in microdomenii accentueaza aspectul de mozaic fluid al membranelor.

  • 14

    14. Caile de semnalizare: definitie, criterii de clasificare

    Semnalizarea celulara reprezinta modalitatea esentiala prin care celulele pot comunca intre ele indiferent

    de distanta la care se afla. Asadar, semnalizarea celulara presupune, de regula, cooperarea intre doua

    celule: una care trimite semnalul, cealalta, care il recepteaza.

    In functie de distanta la care se afla celulele care semnalizeaza intre ele, caile pot fi:

    endocrine, atunci cand celulele se afla la distanta, iar molecula semnal trebuie sa fie transportata

    de umorile organismului( de regula, de sange)

    paracrine, atunci cand celulele se afla in imediata vecinatate

    autocrine, atunci cand semnalul este transmis si receptat de aceeasi celula

    juxtacrine, cand celulele sunt jonctionate( semnalizarea juxtacrina presupune interactiunea unor

    molecule din structura membranelor celor doua celule: semnalizatoare, respectiv tinta, spre

    deosebire de primele 3 cai , unde semnalizarea se face prin molecule secretate de celula

    semnalizatoare)

    Raspunsul celular in urma fenomenului de semnalizare determina unul din trei efecte:

    1. Supravietuire

    2. Proliferare

    3. Moarte celulara programata=apoptoza(apare fie in lipsa oricarui semnal, fie in prezenta unor

    semnale specifice)

    Indiferent de raspunsul celular determinat, se definesc patru etape ale procesului de semnalizare celulara:

    1. Initierea semnalizarii prin legarea ligandului de receptor ( prin interactiuni specifice de o mare

    afinitate)

    2. Transductia semnalului si activarea receptorului( aceasta etapa presupune modificari

    conformationale la nivelul moleculei receptorului, datorate interactiunii cu ligandul)

    3. Activarea efectorului si amplificarea semnalului

    4. Atenuarea semnalului si desensibilizarea celulei ( aceasta etapa presupune inactivarea efectorilor

    si desfacerea ligandului de receptor, prin degradarea ligandului sau prin lizarea moleculelor

    activatoare, de ex scindarea GTP la GDP)

    15. Receptorii pentru hormoni si neurotransmitatori:definitie, criterii de clasificare

    In functie de proprietatile fizico-chimice ale moleculei semnal, receptorii se impart in:

    1. Receptori pentru molecule semnal lipofile (hidrofobe)

    2. Receptori pentru molecule semnal hidrofile

    Receptorii pentru liganzi lipofili sunt proteine citosolice care preiau hormonul dupa difuzia acestuia prin

    membrana si dupa formarea complexului ligand-receptor acesta este transportat in nucleu, unde isi

    indeplineste functia, aceea de a modula exprimarea genica.

    Sunt cunoscute 6 tipuri de receptori pentru liganzi lipofili:

    receptor la cortizol

    receptor la estrogeni

    receptor la progesteron

    receptor la vitamina D

  • 15

    receptor la hormoni tiroidieni

    receptor la acid retinoic

    Oricare ar fi tipul de receptor, ei prezinta unele caracteristici comune, precum:

    sit de legare a hormonului

    sit de legare la molecula de ADN

    domeniu de activare a transcrierii

    In stare inactiva, in citosol, inainte de a interactiona cu ligandul, receptorul este cuplat la un complex

    proteic inhibitor. In aceasta stare complexata, inactiva, receptorul are mascate situl de legare la ADN si

    domeniul de activare a transcrierii. Dupa legarea ligandului, receptorul se desprinde de complexul de

    inactivare si este translocat in nucleu unde, datorita expunerii locului de legare la ADN, se atasaza in zone

    favorabile activarii genei a carei transcriere este determinata , iar procesul de transcriere este declansat.

    16. Explicati modularea activitatii adenilatciclazei membranare de catre receptorii

    cuplati cu proteinele G heterotrimerice

    *Inainte de a citi, a se urmari cu atentie urmatorul filmulet , care explica totul (textul e practic

    explicatia din video) :http://www.youtube.com/watch?v=3RHQ2Kol1ac

    Sunt proteine atasate versantului intern al bistratului lipidic, alcatuite din 3 subunitati : alfa, beta si gama.

    Se gasesc cuplate cu receptori -proteine transmembranare-, subunitatea alfa urmand a functiona drept

    mesager prim in diverse tipuri de semnalizare mediate pe calea proteinelor G heterotrimerice.

    Receptorii cuplati cu proteine G heterotrimerice sunt proteine transmembranare multipas tip I cu 7 treceri

    prin planul membranei, cu ectodomeniu mare, structurand situl de legare a ligandului, si cu endodomeniu

    continand situl de interactiune cu proteinele G heterotrimerice, cat si locuri de fosforilare necesare

    desensibilizarii.

    Succint, mecanismul de actiune al acestor receptori implica urmatoarele etape:

    1. Legarea ligandului si activarea receptorului

    2. Interactiunea receptorului activat cu proteinele G heterotrimerice si activarea acestora prin

    eliberarea GDP, legarea GTP si disocierea trimerului in subunitate alfa plus heterodimer beta-

    gama

    3. Transmiterea semnalului la efectorul din aval (activand sau inhiband adenilat-ciclaza)

    Receptorii cuplati cu proteine G heterotrimerice au mecanisme diferite, actionand asupra unor efectori

    diferiti si inducand raspunsuri diferite in functie de tipul de proteina G heterotrimerica asociata.

    Au fost identificate mai multe tipuri de proteine G heterotrimerice: Gs, Gi, Gq(activeaza fosfolipaza C-

    Beta),G0,proteine G olfactorii (activeaza adenilat ciclaza in neuronii olfactorii, proteine Gt(transducine).

    Ca mecanism: legarea ligandului pe ectodomeniul receptorului cuplat cu proteina G heterotrimerica

    determina modificari conformationale ce se transmit proteinei G, a carei subunitate alfa, initial continand

    GDP, inlocuieste intreaga molecula de GDP cu, una de GTP din citosol.

    Odata inlocuit GDP cu GTP, subunitatea alfa se detaseaza de complexul receptor-proteina G

    heterotrimerica si se ataseaza unei proteine efector, avand deci rol de mesager prim. Tipurile de proteine

  • 16

    efector sunt variate, si depind de tipul de ligand, tipul de receptor , si mai ales de tipul de proteina G

    heterotrimerica asociata.

    Mesagerul prim , adica, subunitate alfa cu GTP, poate determina din partea efectorului, in functie de tipul

    ligandului, un raspuns inhibat sau excitat. Dupa terminarea rolului de mesager prim, subunitatea alfa

    hidrolizeaza GTP-ul inapoi la GDP, se dezataseaza de efector, si se reataseaza proteinei G heterotrimerice

    de care apartine.

    Un exemplu de receptor ce functioneaza cuplat cu proteine G heterotrimerice ar fi cel al receptorilor

    adrenergici. Adrenalina este ligandul, se leaga la receptor-> modificari conformationale-> fosforilarea

    GDP la GTP , detasarea subunitatii alfa, care se leaga de efectorul ADENILAT CICLAZA ,o enzima

    proteica ce catalizeaza reactia de formare a mesagerului secund AMP ciclic, din ATP.

    Hormonii care activeaza adenilat ciclaza sunt reprezentati de glucagon, adrenalina(prin receptorii beta1 si

    beta2), ACTH, parathormon , acestia legandu-se de receptorii legati de proteine G heterotrimerice de tip

    stimulator.

    Hormonii care inhiba adenilat ciclaza sunt adrenalina(legata prin receptori alfa2) si somatostatina.

    Presupunand o activare a adenilat ciclazei A , aceasta va sintetiza AMP ciclic, mesager secund ce va

    migra mai departe si va interactiona cu o alta proteina, numita protein-kinaza A.

    Toate protein-kinaza au o structura ce contine un cap si 2 cozi. Fiecare coada are cate o subunitate

    reglatoare si cate o subunitate catalitica.Atata timp cat subunitatea reglatoare si cea catalitica sunt

    amandoua anexate cozii, protein-kinaza A este inactiva.

    In schimb, la interactiunea cu AMP ciclic, subunitatile catalitice disociaza in citosol, ele fiind

    responsabile de efectele adrenalinei, in acest caz.

    Regulatori negativi ai proteinelor G

    1) Presupunand o proteina G heterotrimerica ramasa activa in mod anormal, ramasa deci fara subunitate

    alfa pentru o perioada mare de timp, si deci aflata in plin proces de semnalizare, rezulta ca , receptorul va

    avea atasate doar subunitatile beta si gama. Acestea, in lipsa subunitatii alfa, ataseaza o alta proteina

    numita beta-adrenergic receptor kinase(BARK), care va fosforila proteina G.

    Regiunile fosforilate anterior de BARK vor atrage alte proteine, numite BETA-ARRESTINS , care vor

    trage intreg complexul receptor-subunitati beta-gama in interiorul celulei, astfel inactivandu-l, prin

    scoaterea din contact cu moleculele ligand, care se gasesc in afara celulei.

    2) Un alt regulator negativ este proteina fosfodiesteraza, care are o abordare ceva mai putin radicala decat

    beta-arrestins, contracarand practic actiunea adenilat ciclazei, adica, transformand AMPciclic, aflat in

    cantitati mari in celula in urma activitatii prelungite a lantului de semnalizare pornti de la proteina G,

    inapoi in AMP aciclic.

    Cofeina este un inhibitor al fosfodiesterazei, ducand deci la prezenta in organism a cantitati crescute de

    AMP-ciclic, lucru ce confera senzatia specifica de energie.

  • 17

    17. Mesagerii secunzi: definitie, exemple, efectori intracelulari

    Mesagerii secunzi sunt componente ale cailor (cascadelor) de semnalizare si reprezinta molecule

    sintetizate-n urma activarii receptorului de catre ligand= mesagerul prim.

    Mesagerii secunzi activeaza diverse sisteme enzimatice cu rol in raspunsul celular, avand rol in

    amplificarea semnalului.

    In continuare, vom descrie cateva cai de semnalizare, folosind mesagerii secunzi si efectorii lor drept

    exemple pentru rezolvarea acestui subiect :

    1. Modularea activitatii adenilat-ciclazei de catre GPCR ( G-protein coupled receptors) , unde:

    Efectorul intracelular = ADENILAT CICLAZA

    Mesagerul secund = AMP c

    *pt abordarea completa a acestui exemplu, a se vedea subiectul 16

    2. Calea fosfolipazei C

    *Inainte de a citi, a se urmari cu atentie urmatorul filmulet , care explica totul (textul e practic

    explicatia din video) : http://www.youtube.com/watch?v=FvPKbogo2pk

    Aceasta cale cuprinde : un receptor transmembranar multipas, cu 7 treceri prin bistrat, cu situs de legare

    pentru ligand in ectodomeniu si endodomeniu "cuplat" cu o proteine G heterotrimerica.

    Efector intracelular 1: PLC (fosfolipaza C)

    Sub actiunea PLC, din PIP2 =>mesagerii secunzi: DAG ( diacilglicerol ) si IP3 (Inozitol trisfosfat) .

    Cunoscand structura amfipata a glicerofosfatidelor, stim deci ca :

    DAG va avea caracter hidrofob si deci va ramane in membrana, actionand ca mesager secund si activand

    PKC(protein kinaza C). Acesta fosforileaza diverse enzime, pe unele activandu-le, pe altele inhibandu-le.

    IP3 va avea caracter hidrofil si va intra in citosol, unde va patrunde-n RE si va actiona ca mesager secund,

    determinand RE sa elibereze Ca2+ in citoplasma, iar Ca2+ va activa PKC ( protein kinaza C).

    Nota (de impresie pt examen): Ca2+ functioneaza drept mesager intracelular ubicuitar.

    3. Oxidul nitric gazos (NO)

    Cand acetilcolina este eliberata de nervii autonomi ai vaselor sanguine in peretii acestora, ea va determina

    relaxarea muschilor din peretii vasului.

    Acetilcolina actioneaza indirect, determinand celulele endoteliale sa elibereze NO(=mesager secund !! ),

    care semnalizeaza apoi celulelor muschiului neted sa se relaxeze.

    NO este suficient de hidrofobic si de mic pentru a trece prin membrana plasmatica a celulei tinta,

    determinand procese de reglare intracelulare.

  • 18

    Acest efect al NO asupra vaselor sanguine explica mecanismul de actiune al ntiroglicerinei, utilizata de

    peste 100 de ani in tratamentul anginei pectorale, fiind convertita la NO pentru a relaxa vasele sanguine

    din inima, asigurand cresterea fluxului sangvin spre muschiul cardiac.

    Alte roluri ale NO:

    este produs ca mediator local de catre neutrofilele si macrofagele activate pentru a ucide

    microorganismele invadatoare

    eliberat de nervii autonomi din penis, determinand dilatarea locala a vaselor sanguine

    responsabile pentru erectie

    Clasificari ale transportului membranar

    A se vedea cursul doctorului Leabu despre transportul membranar, unde se va gasi clasificarea ca atare.

    18. Transportul pasiv: clasificare, exemple

    Transportul pasiv este un tip de transport prin membrana, acesta din urma fiind specific ionilor si

    moleculelor mici(sub 10 angstromi, sub 800 Da).

    In functie de necesarul de energie , transportul prin membrana se clasifica in:

    transport pasiv

    transport activ

    Transportul pasiv este numit si transport disipativ, de la procesul de difuziune= trecerea de substanta de la

    concentratie mare la concentratie mica.

    Unele molecule mici pot strabate membrana celulara strecurandu-se printre lipidele membranare. Astfel

    de molecule sunt moleculele nepolare=hidrofobe(O2, N2, CO2, NO, CO, eter etilic, benzen), dar si

    moleculele polare mici(sub 100 Da), precum apa, etanol, uree, glicerina. Acest tip de transport este numit

    difuzie simpla.

    Pentru moleculele polare mari (100-800 Da), dar si pentru ioni, transportul prin membrana se face doar

    prin implicarea de proteine transmembranare, ce poarta in acest caz denumirea de transportori(pentru

    molecule polare mari: glucoza, aminoacizi, nucleotide) sau canale ionice(pt ioni: H,Na, HCO3, K, Ca2+,

    Cl-, Mg2+). Transportul pasiv prin transportori sau prin canale ionice se numeste si difuzie facilitata.

    In functie de numarul tipurilor de substante transportate simultan, difuzia facilitata poate fi clasificata in:

    transport uniport(este transportata o singura entitate chimica)

    transport cuplat=co-transport(sunt transportate simultan doua sau mai multe entitati chimice)

    o transport simport(toate substantele sunt transportate in acelasi sens)

    o transport antiport(cel putin una din substante merge-n sens opus celorlalte)

    Ca exemplu de transport uniport, amintim transportorul de glucoza din mb eritrocitara GLUT1, o proteina

    multipas de 45 kDa, cu 12 treceri in alfa-helix prin planul membranei. In mb eritrocitara exista peste 200

    000 de molecule de transportor GLUT1 pentru o celula. GlUT1 face parte dintr-o familie de transportori

    de glucoza cu 14 membri ( GLUT1 -14), toti cu cate 12 treceri in alfa-helix prin planul membranei si cu

    capetele N- si C- terminale in endodomeniu.

  • 19

    Ca exemplu de transport simport, amintim co-transportorul de sodiu/glucoza (SGLT1) din membrana

    apicala a enterocitelor. Acest transportor foloseste disiparea gradientului De na pentru a transporta

    glucoza din lumenul intestinal in citosolul enterocitelor impotriva gradientului de concentratie a

    glucidului. Un astfel de transportor mai este numit si transport activ secundar, deoarece se bazeaza practic

    pe energia consumata anterior de celula pentru mentinerea gradientului de Na+. SGLT1 este o proteina

    transmembranara multipas cu 14 treceri in alfa-helix prin planul membranei, din care trecerile 10-14 au

    fost dovedite ca structurand calea de trecere a glucozei. Ambele capete ale lantului polipeptidic sunt in

    ectodomeniu. La om, SGLT1 face parte dintr-o familie de co-transportori sodiu/glucoza ce numara 11

    membri.

    Ca exemplu de transport antiport, amintim canalul de schimb anionic HCO3- / Cl- din mb eritrocitara,

    cunoscut si drept banda 3/ AE1 (Anion Exchanger 1).

    Legat de canalele ionice, acestea nu sunt permanent deschise, iar celula poate controla functionarea lor.

    In functie de mecanismul prin care este controlat regimul de deschidere a lor, canalele ionice se pot

    imparti in 3 categorii:

    1. Canale ionice operate electric

    2. Canale ionice operate chimic(prin liganzi)

    3. Canale ionice operate mecanic( depind de exercitarea unor tensiuni mecanice asupra mb)

    Activarea canalelor respecta un mecanism ciclic, ce asigura inactivarea lor chiar in conditiile care au

    determinat deschiderea. Canalele ionice pot prezenta trei stari:

    Stare inchisa= de repaus, in absenta stimulului

    Stare deschisa, dupa aparitia stimulului

    Stare inactiva, inchisa la prezenta prelungita a stimulului

    Trecerea apei printr-o membrana poarta denumirea de osmoza. Apa poate trece prin mb celulara atat prin

    dufuzie simpla, cat si prin difuzie facilitata, prin complexe proteice transmembranare cu numele de

    aquaporine, prin care apa poate trece in ambele sensuri, depinzand de presiunile coloid-osmotice existente

    de cele doua parti ale membranei.

    19. Calea de semnalizare JAK-STAT

    Marea familie a receptorilor cytokinici include receptori pentru multe tipuri de mediatori locali, denumiti

    colectiv cytokine, precum si receptori pentru hormoni, spre ex pentru prolactina.

    Acesti receptori cytokinici, transmembranari, sunt asociati cu tyrozin-kinaze din citoplasma ( deci, legate

    la endodomeniu), denumite Janus Kinases ( JAK's). Exista 4 tipuri de JAK's:

    JAK 1

    JAK 2

    JAK 3

    Tyk 2

    JAK's se fosforileaza intre ele, precum si fosforileaza si astfel activeaza proteine numite STATs (signal

    transducers and activators of transcription). Proteinele STAT sunt localizate in citosol si sunt gene

    regulatorii latente, deoarece ele migreaza in nucleu si induc transcriere DOAR dupa ce sunt activate.

  • 20

    Mecanismul cailor JAK-STAT ( a se urmari desenul in paralel cu cititul , pentru o completa intelegere)

    Receptorii pentru cytokine sunt dimeri sau trimeri stabil asociati cu 1 sau 2 din kinazele Janus cunoscute (

    JAK1,JAK2,JAK3, Tyk 2) .

    Legarea ligandului de tip cytokinic ( spre ex: gama interferon, alfa interferon, eritropoetina) produce

    modificari conformationale, in sensul in care apropie intre ele kinazele Janus de pe fiecare monomer al

    receptorului cytokinic. Astfel, JAK's se fosforileaza intre ele, sporindu-si reciproc activitatea. De

    asemenea, JAK's fosforileaza resturi de tyrozina din structura receptorului, creand situsuri

    fosfotyrozinice. Aici se

    vor lega STAT's.

    Dupa legarea proteinelor

    STAT in situsurile

    fosfotyrozinice, sunt si

    ele la randul lor

    fosforilate de JAK's =>

    dezatasarea fiecarei

    proteine STAT de pe

    receptorul dimeric ,

    urmand dimerizarea in

    citosol a celor 2 STAT ,

    prin intermediul

    domeniilor SH2.

    In aceasta forma,

    dimerul STAT este

    translocat in nucleu,

    unde activeaza

    transcrierea genica.

    Ca mecanisme de

    feedback/inhibitie,

    trebuie precizat faptul ca

    dimerii STAT pot activa

    transcrierea unor gene ce codifica sinteza unor proteine inhibitorii ale caii in sine, prin desfosforilari fie

    ale kinazelor Janus, fie ale dimerilor STAT.

    Nota: Legarea cytokinei la receptor fie induce dimerizarea a 2 lanturi polipeptidice(monomeri) ale (ai)

    receptorului, fie le orienteaza catre un dimer preformat. In orice sens, scopul este apropierea tyrozin-

    kinazelor Janus pentru a se fosforila intre ele si a incepe intregul proces descris anterior.

    In unele cazuri, putem vorbi si de alcatuirea unui trimer .

  • 21

    20. Aquaporinele. Semnificatie si implicatii medicale

    Prin membrana celulara, apa poate trece atat prin difuzie simpla, cat si prin difuziune facilitata, intrucat

    multe celule si-au produs complexe proteice transmembranare destinate transportului pasiv al apei.

    Aceste complexe proteice transmembranare destinate transportului pasiv al apei poarta denumirea de

    aquaporine, iar rolul lor este acela de a eficientiza trecerea apei prin membrane, astfel incat, pe de o parte,

    fenomenele fiziologice sa se petreaca dupa o dinamica adecvata, si, pe de alta parte, la aparitia unor

    dezechilibre osmotice accidentale, homeostazia celulara sa nu sufere dramatic si sa puna in pericol

    supravietuirea.

    Aquaporinele sunt proteine identificate in toate organismele(bacterii, mamifere, plante) si sunt ubicuitare

    in organismele multicelulare, fiind exprimate in diferite grade in toate tipurile de celule. La om au fost

    identificate cel putin 13 membri ai familiei proteice ai aquaporinelor.

    Aquaporinele sunt proteine transmembranare cu masa moleculara de 30 kDa, cu 6 treceri in alfa helix prin

    bistratul lipidic si cu doua segmente scurte, tot helicoidale, ce marginesc vestibulele citoplasmatic,

    respectiv extracelular ale canalului organizat de cele sase domenii transmembranare. Capetele amino si

    carboxi terminale ale lantului polipeptidic se afla pe fata citosolica.

    In membrane, monomerii astfel organizati transmembranar se asociaza cate patru, formand

    homotetrameri.In cazul AQP4, homotetramerii se pot asocia intre ei, rezultand retele octogonale.

    Apa poate trece prin canalele aquaporinelor in ambele sensuri, depinzand de presiunile coloidosmotice

    existente de cele doua parti ale membranei. Exprimarea adecvata a aquaporinelor in celule este importanta

    pentru multe fenomene fiziologice: adsorbtia adecvata la nvielul cailor urinare pentru formarea urinei,

    semnalizare neuronala, motilitate celulara, hidratarea pielii, proliferare celulara, metabolism lipidic(prin

    implicarea aquagliceroporinelor, aquaporine cu transport dual pentru apa si glicerina).

    Deficiente in exprimarea aquaporinelor pot induce sau insoti diverse patologii, precum: cataracta, diabet

    insipid, edem cerebral, obezitate.

    21. Semnificatia biologica a eterogenitatii compozitionale, a organizarii asimetrice

    si comportamentului fluid al membranelor

    Membranele celulare se caracterizeaza prin eterogenitate compozitionala, bazata pe o mare diversitate

    de tipuri de molecule(bistrat lipidic, componenta proteica, componenta glucidica).

    Lipidele din mb pot fi:

    fosfolipide 70-75%

    o fosfogliceride

    PC

    PE

    PS

    PI

    PA

    o fosfosfingozide

    colesterol 20-25%

    glicolipide 1-10%

  • 22

    Reamintim ca in poz 1 a glicerinei este de obicei esterificat un acid gras saturat(C14,C16,C18), iar in poz

    2 se afla unul nesaturat(C18:1, C18:2, C18:3, C20:4) , putand exista multiple combinatii.

    Proteinele din mb pot fi:

    periferice(extrinseci)

    o ectoproteine

    o endoproteine

    integrale(intrinseci)

    o transmembranare

    ectodomeniu

    endodomeniu

    domeniu transmembranar

    o cufundate partial

    Glucidele pot fi :

    glicolipide( comp. glucidica pe lipid)

    glicoproteine(oligozaharid pe proteina)

    proteoglicani(polizaharid pe proteina)

    Glc, GalNAc, Gal, GalNAc, Man, Fuc, SA

    Pentru substantierea caracterului eterogen al structurarii membranelor(indus de lipide, amplificat de

    proteine si structuri glucidice), trebuie sa subliniem ca insiruirea glucidelor in lanturile oligozaharidice nu

    este aceeasi, diferind intre glicolipide si glicoproteine, dar si intre diversele glicolipide si glicoproteine.

    Mai mult, legarea monozaharidelor intre ele se poate face-n mai multe moduri, intrucat exista mai multe

    grupari hidroxil disponibile.

    Ca semnificatie biologica, eterogenitatea implica prezenta unei multitudini de componente, fapt ce se

    traduce, la nivel celular, intr-o multitudine de posibilitati de actiune diversitate de functii.

    Pe langa eterogenitate compozitionala, membranele celulare se caracterizeaza prin aranjare asimetrica,

    conferita chiar de structura de baza, bistratul lipidic, la nivelul caruia foita externa cotnine preponderent

    anumite tipuri de lipide, iar foita interna, altele.

    Asimetria este sporita de proteinele ce completeaza organizarea membranelor, cele adsorbite pe fata

    externa fiind diferite de cele de pe fata interna, in timp ce proteinele cufundate in structura lipidica de

    baza expun portiuni diferite ale lantului polipeptidic de o parte sau de cealalata a bistratului.

    Pe de alta parte, componenta glucidica a mb se gaseste numai la suprafata acestora, crescand caracterul

    asimetric al organizarii lor.

    Ca semnificatie biologica, asimetria mb celulare ofera posibilitatea derularii de fenomene fizico-bio-

    chimice diferite pe fiecare din cele doua fete. Astfel, intre acestea putem asista la o disjungere sau,

    dimpotriva, la o solidaritate de actiune, in functie de contextul "biosocial" in care se gaseste celula la un

    moment dat.

  • 23

    Diversitatea de molecule care organizeaza membranele celulare prezinta o permanenta dinamicitate, ceea

    ce le confera un comportament fluid. Mai mult, miscarea componentelor lipidice si proteice se

    realizeaza numai in planul membranei, fara rasturnari ale moleculelor care sa permita trecerea lipidelor

    dintr-o foita a bistratului in cealalta, sau proteinelor sa isi treaca portiunile expuse la exterior catre

    interior, sau invers. Aceste restrictii de mobilitate determina caracterul fluid manifestat bidimensional

    al membranelor.

    Lipidele membranare executa urmatoarele tipuri de miscari:

    Intramoleculare(pe care lipidele le realizeaza in raport cu propria lor axa si greutate)

    o de rotatie(109 rotatii/s)

    o de flexie a cozilor hidrofobe(108 rotatii/s)

    Intermoleculare

    o de translatie(miscari ale lipidelor in planul membranei, unele pe langa altele- 107/s

    schimbari de directie)

    o flip-flop(miscari de trecere a lipidelor dintr-o foita a bistratului in cealalta, au o frecventa

    foarte mica, practic nula, cu exceptia cazului membranei R.E)

    Manifestarea bidimensionala a fluiditatii bistratului lipidic da mb celulare caracter de structura cu

    proprietati mezomorfe, asemeni cristalelor lichide. Acest comportament mezomorf este accentuat si de

    capacitatea lipidelor de a organiza microdomenii bogate-n sfingolipide, colesterol si anumite proteine

    membranare=plute lipidice.

    Modulatori ai fluiditatii:

    1. Fizici : temperatura (d.p) si presiunea(i.p)

    2. Chimici intrinseci : acizi grasi nesaturati(d.p) si colesterol (i.p)-->provoaca rigidizare

    3. Chimice extrinseci (pot fi fiziologici, patologici sau terapeutici)

    Fluiditatea mai este modulata si de componentele proteice si de glicocalix.

    Miscarea bidimensionala asigura mentinerea asimetriei din organizarea membranei. Semnificatia

    biologica a permanentei miscari a componentelor biochimice in membrana este aceea ce permite acestora

    sa se asocieze intr-o diversitate de modalitati, pentru a indeplini o multitudine de activitati.

    22. Proteinele G heterotrimerice

    Sunt proteine atasate versantului intern al bistratului lipidic, alcatuite din 3 subunitati : alfa, beta si gama.

    Se gasesc cuplate cu receptori -proteine transmembranare-, subunitatea alfa urmand a functiona drept

    mesager prim in diverse tipuri de semnalizare mediate pe calea proteinelor G heterotrimerice.

    Receptorii cuplati cu proteine G heterotrimerice sunt proteine transmembranare multipas tip I cu 7 treceri

    prin planul membranei, cu ectodomeniu mare, structurand situl de legare a ligandului, si cu endodomeniu

    continand situl de interactiune cu proteinele G heterotrimerice, cat si locuri de fosforilare necesare

    desensibilizarii.

    Succint, mecanismul de actiune al acestor receptori implica urmatoarele etape:

    4. Legarea ligandului si activarea receptorului

  • 24

    5. Interactiunea receptorului activat cu proteinele G heterotrimerice si activarea acestora prin

    eliberarea GDP, legarea GTP si disocierea trimerului in subunitate alfa plus heterodimer beta-

    gama

    6. Transmiterea semnalului la efectorul din aval (activand sau inhiband adenilat-ciclaza)

    Receptorii cuplati cu proteine G heterotrimerice au mecanisme diferite, actionand asupra unor efectori

    diferiti si inducand raspunsuri diferite in functie de tipul de proteina G heterotrimerica asociata.

    Au fost identificate mai multe tipuri de proteine G heterotrimerice: Gs, Gi, Gq(activeaza fosfolipaza C-

    Beta),G0,proteine G olfactorii (activeaza adenilat ciclaza in neuronii olfactorii, proteine Gt(transducine).

    Ca mecanism: legarea ligandului pe ectodomeniul receptorului cuplat cu proteina G heterotrimerica

    determina modificari conformationale ce se transmit proteinei G, a carei subunitate alfa, initial continand

    GDP, inlocuieste intreaga molecula de GDP cu, una de GTP din citosol.

    Odata inlocuit GDP cu GTP, subunitatea alfa se detaseaza de complexul receptor-proteina G

    heterotrimerica si se ataseaza unei proteine efector, avand deci rol de mesager prim. Tipurile de proteine

    efector sunt variate, si depind de tipul de ligand, tipul de receptor , si mai ales de tipul de proteina G

    heterotrimerica asociata.

    Mesagerul prim , adica, subunitate alfa cu GTP, poate determina din partea efectorului, in functie de tipul

    ligandului, un raspuns inhibat sau excitat. Dupa terminarea rolului de mesager prim, subunitatea alfa

    hidrolizeaza GTP-ul inapoi la GDP, se dezataseaza de efector, si se reataseaza proteinei G heterotrimerice

    de care apartine.

    Un exemplu de receptor ce functioneaza cuplat cu proteine G heterotrimerice ar fi cel al receptorilor

    adrenergici. Adrenalina este ligandul, se leaga la receptor-> modificari conformationale-> fosforilarea

    GDP la GTP , detasarea subunitatii alfa, care se leaga de efectorul ADENILAT CICLAZA ,o enzima

    proteica ce catalizeaza reactia de formare a mesagerului secund AMP ciclic, din ATP.

    Hormonii care activeaza adenilat ciclaza sunt reprezentati de glucagon, adrenalina(prin receptorii beta1 si

    beta2), ACTH, parathormon , acestia legandu-se de receptorii legati de proteine G heterotrimerice de tip

    stimulator.

    Hormonii care inhiba adenilat ciclaza sunt adrenalina(legata prin receptori alfa2) si somatostatina.

    Presupunand o activare a adenilat ciclazei A , aceasta va sintetiza AMP ciclic, mesager secund ce va

    migra mai departe si va interactiona cu o alta proteina, numita protein-kinaza A.

    Toate protein-kinaza au o structura ce contine un cap si 2 cozi. Fiecare coada are cate o subunitate

    reglatoare si cate o subunitate catalitica.Atata timp cat subunitatea reglatoare si cea catalitica sunt

    amandoua anexate cozii, protein-kinaza A este inactiva.

    In schimb, la interactiunea cu AMP ciclic, subunitatile catalitice disociaza in citosol, ele fiind

    responsabile de efectele adrenalinei, in acest caz.

    Regulatori negativi ai proteinelor G

    1) Presupunand o proteina G heterotrimerica ramasa activa in mod anormal, ramasa deci fara subunitate

    alfa pentru o perioada mare de timp, si deci aflata in plin proces de semnalizare, rezulta ca , receptorul va

    avea atasate doar subunitatile beta si gama. Acestea, in lipsa subunitatii alfa, ataseaza o alta proteina

    numita beta-adrenergic receptor kinase(BARK), care va fosforila proteina G.

  • 25

    Regiunile fosforilate anterior de BARK vor atrage alte proteine, numite BETA-ARRESTINS, care vor

    trage intreg complexul receptor-subunitati beta-gama in interiorul celulei, astfel inactivandu-l, prin

    scoaterea din contact cu moleculele ligand, care se gasesc in afara celulei.

    2) Un alt regulator negativ este proteina fosfodiesteraza, care are o abordare ceva mai putin radicala decat

    beta-arrestins, contracarand practic actiunea adenilat ciclazei, adica, transformand AMPciclic, aflat in

    cantitati mari in celula in urma activitatii prelungite a lantului de semnalizare pornti de la proteina G,

    inapoi in AMP aciclic.

    Cofeina este un inhibitor al fosfodiesterazei, ducand deci la prezenta in organism a cantitati crescute de

    AMP-ciclic, lucru ce confera senzatia specifica de energie.

    23.Modalitati generice de reglare a activitatii unui canal ionic membranar

    In functie de mecanismul prin care este controlat regimul de deschidere a lor, canalele ionice se pot

    imparti in trei categorii:

    1. Canale ionice operate electric(prin voltaj), adica prin modificarea potentialului de membrana. Acestea

    sunt inchise atunci cand potentialul membranei este cel normal(adica 50-70 mV, cu minus pe partea

    citosolica), si se deschis atunci cand potentialul de repaus al membranei se modifica.

    2.Canale ionice operate chimic(prin liganzi), adica, se deschid atunci cand leaga un compus

    chimic(ligandul) care schimba conformatia proteinei. Ligandul se poate lega in ectodomeniul proteinei

    care structureaza canalul fiind ligand extracelular, sau, pentru alte tipuri de canale, la endodomeniu(ligand

    intracelular=citosolic).

    3.Canale ionice controlate mecanic, adica, a caror stare deschisa/inchisa este dependenta de exercitarea

    unor tensiuni mecanice asupra membranei.

    Activarea canalelor respecta un mecanism ciclic, care asigura inactivarea lor chiar in conditiile care au

    determinat scaderea, deoarece pot prezenta trei stari:

    starea inchisa, de repaus, in absenta stimulului

    starea deschisa, care permite trecerea ionilor, dupa aparitia stimulului

    starea inactiva, inchisa la prezenta prelungita a stimulului

    Aceasta trecere intr-o stare refractara a canalelor ionice asigura mentinerea homeostaziei ionice

    intracelulare in conditiile de persistenta a semnalelor, refacerea potentialului membranar, desprinderea

    ligandului, si, eventual, metabolizarea sa, cu revenirea celulei la starea bazala=starea de neexcitatie, astfel

    incat sa devina sensibila la o noua stimulare.

    Exista si canale ionice ce functioneaza doar atata vreme cat sunt fosforilate. De asemenea, activitatea

    canalelor ionice poate fi blocata reversibil sau ireversibil de substante inhibitoare(pot fi medicamente) sau

    chiar de substante toxice, folosite de armata sau in atacuri teroriste.

    24. Transportul activ: clasificare, exemple

  • 26

    Transportul activ reprezinta transportul prin membrana de molecule mici si/sau ioni impotriva

    gradientelor de concentratie.

    Transportul activ este realizat de biostructuri proteice, cu consum de energie, provenita din scindarea unor

    molecule macroergice(de regula ATP), biostructuri proteice ce poarta denumirea de pompe.

    Exemple:

    Pompa de Na+/K+, numita de Na+/K+ ATP-aza:

    structura complexa dpdv biochimic

    tetramer(2 sub mari alfa catalitice si transportoare si 2 sub mici beta, cu rol reglator, necesare

    penru impachetarea conformationala corecta a subunitatilor alfa in reticulul endoplasmic, in

    momentele biosintezei, asamblarii in membrana si maturarii)

    uneori poate prezenta si subunitate gama, cu 7 izoforme si rol in modularea activitatii pompei, se

    exprima special la nivelul rinicihiului, avand rol in adaptarea si supravietuirea celulara in conditii

    hipertone

    apartine tipului P de ATP-aze, alaturi de pompa protonica si cea de Ca

    mai exista si tipul V(vacuolar) , E si F de ATP-aze, ultimele 2 avand rol in semnalizare, si nu in

    transport

    ciclul de pompare are 7 etape si duce la expulzarea a 3 ioni de Na+ si introducerea a 2 ioni de K+

    in celula, pe baza unor modificari de conformatie intre doua forme: E1 cu acidul aspartic din situl

    catalitic nefosforilat si E2 cu acidul aspartic fosforilat

    Etapele ciclului de pompare sunt:

    1. Legarea a 3 ioni de Na pe endodomeniul subunitatii alfa a pompei

    2. Legarea ATP pe endodomeniul subunitatii alfa a pompei

    3. Fosforilarea unui radical aspartat prin scindarea ATP la ADP=> consumul energetic necesar

    activitatii pompei, si schimbarea conformatiei proteinei care duce la expunerea celor trei ioni de

    Na pe ectodomeniul subunitatii alfa

    4. Disocierea si expulzarea in exterior a ionilor Na+ si legarea pe ectodomeniul subunitatii alfa a doi

    ioni de K+

    5. Schimbarea conformatiei subunitatii alfa si hidrolizarea aspartilfosfatului

    6. Internalizarea si expunerea ionilor K pe endodomeniul subunitatii alfa

    7. Disocierea ionilor K si eliberarea lor in citosol cu inchiderea unui ciclu de pompare

    Pompa Na+/K+ este electrogenica, adica, prin eliminarea a 3 ioni de Na+ si introducerea a numai 2 ioni

    de K+, contribuie la realizarea si/sau mentinerea potentialului membranar.

    Transportorii ABC ( ATP-Binding Casette)

    Semnificatia fiziologica si medicala a lor rezida din faptul ca acesti transportori induc rezistenta multipla

    la medicamente, fiind capabili sa elimine medicamentele din celula. Permit adaptare si rezistenta la

    antibiotice, iar celulelor canceroase rezistenta la tratamente.

    Transporta o mare varietate de substante(ioni, glucide, AA, vitamine, lipide, antibiotice, medicamente,

    oligozaharide si chiar proteine de masa moleculara mare).

    Transportorii ABC se impart in:

  • 27

    sisteme importatoare mici(fiecare element de organizare structurala e asigurat de un alt

    polipeptid)

    sisteme importatoare mari(organizarea implica doua subunitati proteice identice=homodimer, sau

    diferite=heterodimer)

    sisteme exportatoare organizate ca dimeri sau monomeri

    La om sunt identificate aproape 50 tipuri de transportori ABC.

    Elemente ale organizarii transportorilor ABC:

    -domenii transmembranare

    -domenii legare nucleotide

    -domenii legare solut

    25. Pompe - ATP-aze: clasificare, exemple

    Pompa de Na+/K+, numita de Na+/K+ ATP-aza:

    structura complexa dpdv biochimic

    tetramer(2 sub mari alfa catalitice si transportoare si 2 sub mici beta, cu rol reglator, necesare

    penru impachetarea conformationala corecta a subunitatilor alfa in reticulul endoplasmic, in

    momentele biosintezei, asamblarii in membrana si maturarii)

    uneori poate prezenta si subunitate gama, cu 7 izoforme si rol in modularea activitatii pompei, se

    exprima special la nivelul rinicihiului, avand rol in adaptarea si supravietuirea celulara in conditii

    hipertone

    apartine tipului P de ATP-aze, alaturi de pompa protonica si cea de Ca , si cea H+/K+

    ciclul de pompare are 7 etape si duce la expulzarea a 3 ioni de Na+ si introducerea a 2 ioni de K+

    in celula, pe baza unor modificari de conformatie intre doua forme: E1 cu acidul aspartic din situl

    catalitic nefosforilat si E2 cu acidul aspartic fosforilat

    Etapele ciclului de pompare sunt:

    8. Legarea a 3 ioni de Na pe endodomeniul subunitatii alfa a pompei

    9. Legarea ATP pe endodomeniul subunitatii alfa a pompei

    10. Fosforilarea unui radical aspartat prin scindarea ATP la ADP=> consumul energetic necesar

    activitatii pompei, si schimbarea conformatiei proteinei care duce la expunerea celor trei ioni de

    Na pe ectodomeniul subunitatii alfa

    11. Disocierea si expulzarea in exterior a ionilor Na+ si legarea pe ectodomeniul subunitatii alfa a doi

    ioni de K+

    12. Schimbarea conformatiei subunitatii alfa si hidrolizarea aspartilfosfatului

    13. Internalizarea si expunerea ionilor K pe endodomeniul subunitatii alfa

    14. Disocierea ionilor K si eliberarea lor in citosol cu inchiderea unui ciclu de pompare

    Pompa Na+/K+ este electrogenica, adica, prin eliminarea a 3 ioni de Na+ si introducerea a numai 2 ioni

    de K+, contribuie la realizarea si/sau mentinerea potentialului membranar.

  • 28

    La nivelul endomembranelor a fost evidentiat si tipul V de ATPaze(ATPaze de tip vacuolar), care

    pompeaza protoni in endosomi sau lizosomi. Organizarea acestora este ceva mai elaborata, avand nevoie

    de cel putin 11 subunitati ca sa isi indeplineasca functia, ceea ce duce la formarea unor complexe proteice

    de aprox 1000 kDa.

    La nivelul celulelor eucariote mai exista si tipurile F si E de ATP-aze, insa acestea nu au rol in transport,

    ci in semnalizarea celulara.

    26. Mecanismul semnalizarii transmembranare via receptori cu activitate tirozin -

    kinazica

    Receptorii pentru liganzi hidrofili sunt cei mai numerosi, dintre ei facand parte si categoria receptorilor cu

    activitate tirozin-kinazica.

    Receptorii cu activitate tirozin-kinazica se caracterizeaza printr-o mare diversitate structurala acoperind

    semnalizarea celulara prin cea mai mare parte a factorilor de crestere cunoscuti. Primul identificat a fost

    receptorul la facotrul de crestere epidermal (EGF).

    De regula, receptorii cu activitate tirozin-kinazica sunt proteine transmembranare unipas, tip I, care exista

    ca monomeri in stare libera(exceptie fiind receptorul pt insulina, care e in stare de dimeri, uniti prin punte

    sulfurica), iar dupa interactiunea cu ligandul dimerizeaza.

    Domeniul transmembranar e structurat in alfa-helix. O trasatura comuna la nivelul portiunii citosolice este

    reprezentata de o zona cu activitate tirozin-kinazica. Ectodomeniul contine capatul N-terminal si este

    glicozilat.

    Mecanismul de principiu prin care acesti receptori functioneaza ar putea fi sintetizat prin :

    1. Legarea ligandului, ce produce activarea domeniului catalitic de la nivelul portiunii

    citoplasmatice, cat si dimerizarea receptorilor datorita modificarilor conformationale pe care le

    induce

    2. Activarea si dimerizarea realizeaza conditiile unor autofosforilari incrucisate la multiple tirozine

    ale domeniilor citosolice ale receptorului

    3. Atragerea si interactiunea cu efectori ce contin domenii SH2

    4. Activarea efectorilor legati prin SH2

    Exemple de efectori care respecta mecanismul de mai sus:

    1.Fosfolipaza C-gama, cu 2 domenii SH2, iar dupa activare, declanseaza cascada fosfoinozitidelor(la fel

    ca si in cazul receptorilor cuplati cu proteine G heterotrimerice)

    2. Fosfatidilinozitol 3'-kinaza (PI3K), tot cu 2 domenii SH2, contribuie dupa activare la formarea unor

    derivati de fosfatidilinozitoli

    3.Proteine care activeaza GTP-azele mici = GAP (GTP-ase-activating protein)

    Proteinele GAP sunt proteine monomerice cu o masa moleculara in jur de 25 kDa care au proprietatea de

    a lega GTP pe care il hidrolizeaza . Proteinele GAP sunt activate cat timp contin GTP si se inactiveaza

    dupa hidroliza sa.

  • 29

    Datorita acestei capacitati de a trece ciclic din din stare activa in stare inactiva sunt cunoscute si sub

    numele de comutatori moleculari.

    Cand nu este nevoie de fucntia lor, proteinele GAP se gasesc in citosol complexate cu o proteina

    inhibitoare numita inhibitor de disociere a guanozin-nucleotidului=GDI.

    Unul din rolurile proteinelor GAP este acela de a participa la controlul corectitudinii traficului structurilor

    membranare in celula(de ex traficul dintre reticulul endoplasmic si aparatul Golgi).

    27. Endocitoza mediata de receptori- definitie si semnificatie functionala

    In functie de caracteristicile materialelor preluate de celula, endocitoza se imparte in:

    Fagocitoza ( cand sunt endocitate materiale particulate)

    Pinocitoza (cand sunt endocitate substante solubilizate in fluidul extracelular)

    Pinocitoza este divers din punct de vedere al mecanismelor prin care se realizeaza. O prima forma este

    pinocitoza constitutiva, ce presupune preluarea in vezicule de endocitoza a unor volume de lichid

    extracelular cu tot ceea ce contine acesta.

    Pinocitoza mediata de receptori, numita uzual endocitoza mediata de receptori, este un termen introdus in

    1976 de Goldstein si Brown, preocupati de metabolizarea LDL (low-density-lipoprotein).

    Prin acest proces, sunt internalizate de catre celula liganzi care mai intai sunt recunoscuti si legati de

    receptori specifici de pe suprafata celulei. Dupa interactiunea ligand-receptor, complexele receptor-ligand

    sutn adunate in adancituri ale membranei tapetate pe fata interna cu un complex de endoproteine a carui

    componenta de baza este clatrina. Aceste microdomenii adancite sunt denumite structuri cu invelis si ele

    se formeaza permanent , aglomerand fie receptorii in asteptarea liganzilor, fie complexele ligand-receptor,

    dupa formare.

    Pe masura ce receptorii expusi la suprafata celulelor sau complexele ligand-receptor se aglomereaza in

    microdomeniul corespunzator al membranei, in invelisul de clatrina se formeaza adancitura membranei,

    care creste pana la definitivarea formei sale sferice si desprinderea de membrana la nivelul careia s-a

    format, sub forma unei vezicule cu invelis.

    Deci, rolul clatrinei este acela de a aglomera complexele ligand-receptor in zona membranara destinata

    endocitarii si de a controla adancirea microdomeniului membranar, care devine structura cu invelis, si

    formarea veziculei cu invelis. Acest rol are la baza capacitatea clatrinei de a se asambla in trimeri numiti

    trischelioni, care mai departe pot forma ochiuri hexagonale si pentagonale , ducand la formarea veziculei

    propriu-zise. Trimerizarea clatrinei la trischelioni si inretelarea acestora se realizeaza prin participarea

    unor molecule proteice ajutatoare= proteine adaptor (AP).

    Invelisul de clatrina al veziculelor de endocitoza mediata se dezasambleaza imediat dupa desprinderea

    veziculei de membrana celulara, devenind endosom, care se transforma adesea in lizosom prin fuzionarea

    cu organitul preexistent in celula.

    Deci, acest tip de transport cu membrana este unul concentrativ, spre deosebire de pinocitoza

    constitutiva. Ligandul este introdus in celula la o concentratie mai mare decat cea in care el se afla in

    mediu, intrucat este acumulat si concentrat la nvielul structurii de invelis prin complexele receptor-ligand.

  • 30

    Destinatia materialului endocitat depinde de tipul de substanta. LDL se elibereaza in endozom si este

    directionat catre lizozomi, in timp ce receptorul este reciclat la suprafata cellei pentru un nou ciclu de

    endocitoza.

    Exista si o alta forma de pinocitoza mediata de receptori=potocitoza, ce serveste endocitarii moleculelor

    mici. Dupa legarea moleculelor mici, acestea sunt sechestrate in caveola care permit trecerea acestora

    direct in citoplasma prin anumite canale din membrana caveolara.

    Pinocitoza, in general, se clasifica in:

    dependenta de clatrina

    independenta de clatrina

    o dependenta de caveolina

    o independenta de caveolina

    28. Definiti urmatoarele notiuni: co-transport;simport;antiport

    In functie de numarul tipurilor de substante transportate simultan, difuzia facilitata poate fi clasificata in:

    transport unipor