Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Sanja Soviček

Ispitivanje citotoksičnosti novih spojeva

diazendikarboksamida kao potencijalnih citostatika

Diplomski rad

Zagreb, 2013.

Ovaj diplomski rad izrađen je u Laboratoriju za genotoksične agense Instituta „Ruđer

Bošković“ pod vodstvom dr. sc. Maje Osmak, predan na ocjenu Biološkom odsjeku

Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistra

Eksperimentalne biologije.

Zahvala:

Zahvaljujem mentorici dr.sc. Maji Osmak iz Laboratorija za genotoksične agense, Zavoda za

molekularnu biologiju sa Instituta Ruđer Boškovića na velikodušnoj pomoći i trudu, stručnim

savjetima i velikom strpljenju pri izradi ovog rada. Zahvaljujem i ostalim članovima

Laboratorija za genotoksične agense na pomoći i savjetima: dipl.ing. Nikolini Stojanović, dr.

sc. Andreji Ambriović Ristov i Ani Tupek, te kolegici Petri Kureljak sa Farmaceutsko-

biokemijskog fakulteta.

Također hvala pomoćnom mentoru doc.dr. sc. Domagoju Đikiću sa Zavoda za animalnu

fiziologiju na Prirodoslovno-matematičkom fakultetu Sveučilišta na korisnim savjetima oko

pisanja rada.

Zahvaljujem profesorima Slovenku Polancu i Janezu Košmrlj sa Fakulteta za kemiju i kemijsku

tehnologiju Sveučilišta u Ljubljani (Ljubljana, Slovenija) koji su sintetizirali

diazendikarboksamide.

Veliko hvala i mojim roditeljima koji su mi bili velika podrška tokom studiranja i što su mi

omogućili školovanje.

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek Diplomski rad

ISPITIVANJE CITOTOKSIČNOSTI NOVIH SPOJEVA

DIAZENDIKARBOKSAMIDA KAO POTENCIJALNIH CITOSTATIKA

SANJA SOVIČEK

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb

Nedovoljna učinkovitost postojećih terapija potiče traganje za novim, učinkovitijim

lijekovima za pacijente oboljele od tumora, uključivši nove citotoksične spojeve. Kako bi se

poboljšala svojstva diazenkarboksamida, sintetizirani su novi spojevi, diazendikarboksamidi.

Tema ovog diplomskog rada bila je ispitati njihovu biološku aktivnost. Prema rezultatima

MTT testa dobivenih na stanicama karcinoma vrata maternice HeLa, najučinkovitiji je bio

spoj JV-158. Njegova citotoksičnost ispitana je na više različitih linija tumorskih stanica, te

pokazala da su najosjetljivije HeLa stanice, a najmanje osjetljive stanice karcinoma debelog

crijeva HCT-116. Iscrpljivanje unutarstanične koncentracije glutationa nije utjecalo na

preživljenje stanica obrađenih sa spojem JV-158, što ukazuje da glutation ne sudjeluje u

staničnom odgovoru. Ispitivanje vrste stanične smrti koju potiče JV-158 je pokazalo da se radi

o nekrozi. Na temelju dobivenih rezultata možemo pretpostaviti kako bi spoj JV-158 mogao

biti novi potencijalni protutumorski lijek.

(46 stranica, 10 slika, 2 tablice, 55 literaturnih navoda , jezik izvornika: hrvatski)

Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici

Ključne riječi: diazendikarboskamidi, citotoksičnost, protutumorski spojevi

Mentor: Dr. sc. Maja Osmak, znanstveni savjetnik, Institut Ruđer Bošković, Zagreb

Pomoćni mentor: dr.sc. Domagoj Đikić, doc., Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb

Ocjenjivači: Dr.sc. Domagoj Đikić, doc., Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb

Dr.sc. Maja Osmak, znanstveni savjetnik, Institut Ruđer Bošković, Zagreb

Prof.dr.sc. Božena Mitić, Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb

Rad prihvaćen:17.09.2013.

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb

Faculty of Science

Department of Biology Graduation Thesis

CYTOTOXICITY TESTING OF NEW COMPOUNDS DIAZENDICARBOXAMIDES

AS POTENTIAL CYTOSTATICS

SANJA SOVIČEK

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Croatia

Insufficient effectiveness of current therapy of cancer patients has stimulated the search for

new, more effective tretament, including the screening of new compounds. To increasae the

beneficial characteristics of diazencarboxamides, new compounds, diazendicarboxamides

have been synthesised. The theme of this graduation thesis was to investigate their biological

activity. The most effective among them was JV-158, as determined by MTT assay on

cervical carcinoma HeLa cells. Its cytotoxicity was tested further on several tumor cells lines

showing that Hela cells were the most sensitive, while colon carcinoma HCT-116 cells were

most resistant. Depletion of intracellular glutathione level did not change the sensitivity of

HeLa cells to JV-158, indicating that GSH was not involved in cell response to this

compound. Regarding the type of induced cell death, JV-158 triggers necrosis. Based on these

results we can assume that the compound JV-158 could be a new potential anti-cancer drug.

(46 pages, 10 figures, 2 tables, 55 references, original in: Croatian)

Thesis deposited in Central Biological Library

Key words: diazenedicarboxamides, cytotoxicity, anti-cancer compounds

Supervisor: Ph.D., Maja Osmak, Senior Scientist Ruđer Bošković Institite, Zagreb

Assistant Supervisor: Ph.D., Domagoj Đikić, Assistant Professor, Faculty of Natural Science,

Zagreb

Reviewers: : Ph.D., Domagoj Đikić, Assistant Professor, Faculty of Natural Science, Zagreb

Ph.D., Maja Osmak, Senior Scientist Ruđer Bošković Institite, Zagreb

Ph.D., Božena Mitić, Associate Professor, Faculty of Natural Science, Zagreb

Thesis accepted: 17.09.2013.

SADRŽAJ

1. UVOD ................................................................................................................................. 1

1.1. Tumori ............................................................................................................................. 2

1.2. Kemoterapija ................................................................................................................... 4

1.3. Spojevi diazenkarboksamidi ............................................................................................ 5

1.4. Glutation .......................................................................................................................... 6

1.5. Stanična smrt ................................................................................................................... 7

1.5.1. Nekroza ..................................................................................................................... 8

1.6. Novi spojevi diazendikarboksamidi ................................................................................ 9

2. CILJ RADA .................................................................................................................... 12

3. MATERIJALI I METODE ...................................................................................... 14

3.1. Kemikalije ..................................................................................................................... 15

3.2. Stanične linije ................................................................................................................ 15

3.3. Određivanje preživljenja stanica spektorfotometrijskom MTT metodom .................... 16

3.4. Ispitivaje uloge glutationa u staničnom odgovoru na spoj JV-158 ............................... 17

3.5. Određivanje vrste staničme smrti potaknute sa JV-158 ............................................... 17

4. REZULTATI .................................................................................................................. 18

4.1. Preživljenje stanica nakon djelovanja diazendikarboksamida ....................................... 18

4.2. Učinak diazendikarbokasmida JV-158 na različite vrste tumorskih stanica ................. 22

4.3. Uloga glutationa u staničnom odgovoru na JV-158 ...................................................... 23

4.4. Vrsta stanične smrti potaknata sa spojem JV-158 ........................................................ 24

5. RASPRAVA .................................................................................................................... 26

6. ZAKLJUČCI .................................................................................................................. 31

7. LITERATURA .............................................................................................................. 33

Kratice

BSO - L-butionin sulfoksimin

DMSO – dimetil sulfoksid

DMEM - Dulbeccov minimalni Eaglov medij

GSH - glutation

MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid

NSB - N-bromosukcinimid

PBS -fosfatni pufer (engl. phosphate buffered saline)

1.UVOD

2

1.1. Tumori

U današnje vrijeme rak je nakon krvožilnih bolesti najćešći uzrok smrti u srednje i

visoko razvijenim zemljama. Uzrok nastanka tumora već se godinama intenzivno proučava.

Danas je poznato da tijekom zloćudne preobrazbe u ljudskim stanicama dolazi do poremećaja

aktivnosti većeg broja gena. U tom procesu najodgovornije su promjene u aktivnosti tri

ključnih skupina gena: a) onkogena, b) tumor-supresorskih gena i c) gena koji omogućuju

popravak oštećenja u genomu. Aktivacija onkogena i/ili inaktivacija tumor-supresorskih gena

rezultira zloćudnom preobrazbom. Onkogeni se mogu aktivirati točkastom mutacijom,

translokacijom ili amplifikacijom gena. Geni iz treće skupine sprječavaju pojavu genomske

nestabilnosti. Genomska nestabilnost se može definirati kao povećanje učestalosti gubitka ili

preuređenja DNA. Zbog složenosti genskih promjena u stanicama tijekom prelaska iz

normanih stanica u zloćudno izmjenjene stanice, i njihova međuodnosa s normalnim

stanicama, zloćudna preobrazba ponekad traje desetak ili više godina.

Hanahan i Weinberg prepoznali su deset ključnih promjena koje nastaju u stanicama

tijekom zloćudne probrazbe (Hanahan i Weinberg, 2011). To su: održavanje signala za diobu

stanica, izbjegavanje supresije rasta, izbjegavanje stanične smrti, replikacijska besmrtnost,

poticanje angiogeneze i poticanje invazije i metastaziranja, promjenjena regulacija staničnog

metabolizma, nestabilnost genoma i mutacije, izbjegavanje destrukcije imunološkim aparatom

i upala koja potiče tumorigenezu (Slika 1). Temelj svih ovih odlika je nestabilnost genoma

tumorskih stanica, koja rezultira genetičkom raznolikošću zloćudnih stanica unutar tumora.

Nedvojbeno, glavno svojstvo stanice raka je njihova sposobnost za trajnu diobu, dok

normalno tkivo precizno kontrolira staničnu diobu, čime se osigurava homeostaza broja

stanica i osigurava normalnu funkciju tkiva.

Signal za diobu stanice započinje vezanjem čimbenika rasta na odgovarajući receptor,

prenosi se dalje putem aktivacije niza kinaza do jezgre, gdje potiče aktivnost transkripcijskih

čimbenika, što ima za posljedicu diobu stanice. Stanice raka mogu na različite načine poticati

trajnu diobu stanica: da same stvaraju čimbenike rasta, da je receptor za čimbenike rasta

trajno aktivan ili da je trajno aktivirana neka od kinaza kojoj se kroz stanicu prenosi mitotski

signal, da je zbog više razloga produženo djelovanje transkripcijskih čimbenika, ili da se oni

aktiviraju u krivo vrijeme (Hanahan i Weinberg, 2011). Promjene mogu mijenjati i druga

biološka svojstva stanice kao što je preživljenje stanica i njihov energetski metabolizam.

3

Slika 1.1. Shema glavnih svojstava stanica raka: shema iz 2000. (gornja slika- prema Hanahan

i Weinberg, 2000), nadopunjena 2011. (donja slika, prema Hanahan i Weinberg, 2011)

beskonačna

replikacija

poticanje angiogeneze aktivacija invazije i

metastaziranja

stanični signal za

diobu stanice

izbjegavanje supresora

rasta

otpornost na staničnu

smrt

izbjegavanje destrukcije

imunološkim aparatom

promjenjena regulacija

staničnog metabolizma

nestabilnost genoma i

mutacije

upala koja potiče

tumorigenezu

4

1.2. Kemoterapija

Oboljeli od raka mogu se liječiti kemoterapijom, zračenjem, uklanjanjem zloćudnog

tkiva kirurškim zahvatom, imunoterapijom ili, najnovije, ciljanim liječenjem sa tzv. pametnim

lijekovima. Između njih, glavni pristup u liječenju tumora je kemoterapija (Mršić-Krmpotić i

sur., 2004). Kemoterapija je najnoviji način liječenja zloćudnih bolesti koji se svojim

sistemskim antitumorskim učinkom razlikuje od lokalnog liječenja kiruškim zahvatom i

zračenjem (Saini i sur., 2012). Naziv kemoterapija nalazi svoje korijene u radu Paula Erlicha s

početka 20. stoljeća koji ga je primijenio u liječenju zaraznih bolesti kemijskim spojevima.

Naznaka mogućnosti liječenja zloćudnih bolesti kemijskim spojevima potaknula je intenzivna

istraživanja kako bi se našli učinkoviti lijekovi protiv raka.

Lijekovi koji se primjenjuju u kemoterapiji nazivaju se citostatici. Citostatici ulaze u

tijelo putem krvotoka i na taj način se raspodjeljuju po čitavom tijelu. Prema mehanizmima

djelovanja, citostatici se dijele u nekoliko grupa: a) alkilirajuće spojeve (kao ciklofosfamid,

temozolomid, cisplatina), b) antimetabolite (kao metotreksat i 5-fluorouracil), c) biljne

alkaliode koji utječu na diobeno vreteno (vinkristin i paklitaksel), d) citotoksične antibiotike

(kao doksorubicin i bleomicin), i e) ostale (kao inhibitor topoizomeraze topotekan). Zbog

povećanja učinkovitosti kemoterapije, u liječenju tumora se obično primjenjuju kombinacije

nekoliko citostatika sa različitim mehanizmima djelovanja.

Glavno negativno svojstvo klasične kemoterapije je neselektivnost citostatika zbog

čega takvi spojevi ubijaju zloćudne, ali i zdrave, normalne stanice. Posljedica toga su brojne

nepovoljne popratne pojave (mučnina, povraćanje, proljevi, anemije, oštećenje bubrega,

ispadanje kose). No glavni problem liječenja oboljelih klasičnom kemoterapijom je otpornost

tumorskih stanica na citostatike, koja nakon određenog vremena čini kemoterapiju

neuspješnom. Taj fenomen prvi je zamijetio Sidney Farber 1948. god. koji je i uveo

kemoterapiju u liječenje tumora (Farber i sur., 1948). Otpornost stanica tumora na terapiju

koja se može pojavit u vrijeme kada se normalna stanica mijenja u zloćudnu (urođena

otpornost) ili tijekom same terapije, uslijed indukcije i selekcije otpornih stanica (tzv. stečena

otpornost). Otpornost se temelji na nizu različitih promjena u stanicama tumora. Najpoznatiji i

najbolje proučeni uzroci otpornosti su: a) izmjenjenja aktivnost membranskih transportera,

zbog čega se u stanicama nakuplja manje citostatika, b) povećana aktivnost sustava za

detoksifikaciju čime se smanjuje količina slobodnog citostatika u stanicama ( najčešće kao

posljedica povećane koncentracije glutationa i sa njime povezanih enzima glutation

transferaza i glutation peroksidaza), c) uspješniji popravak oštećenja u DNA i/ili njhovo

5

toleriranje, d) promjene u elementima signalnog puta programirane stanične smrti (zbog čega

stanice koji bi trebale uginuti prežive), te najnoviji prepoznat uzrok, adhezija stanica na

vanstanični matriks ili međustanična adhezija (koja štiti stanice prije nego li je citostatik

uopće ušao u stanice) (Ambriović Ristov i Osmak, 2006; Rodriguez-Nieto i Zhivotovsky,

2006; Stewart , 2007; Brozovic i sur., 2010; Dey i sur., 2010; Köberle i sur., 2010; Kelly i

Strasser, 2011).

Nedovoljna učinkovitost postojećih terapija, kao posljedica brojnih promjena koje se

događaju u stanicama tumora (Hanahan i Weinberg, 2011), nužno potiče traganje za novim,

učinkovitijim strategijama liječenja. Ciljana terapija se temelji na tzv. „pametnim lijekovima“

koji su usmjereni na karakteristične molekule specifične za zloćudne tumore, prvenstveno one

koje sudjeluju u prijenosu mitotskog signala. Zbog toga „pametni“ lijekovi selektivno djeluju

na stanice tumora i to je ključna razlika između ciljane terapije i standardne klasične

kemoterapije. No unatoč velikom početnom entuzijazmu, ciljani lijekovi nisu pokazali

dovoljan napredak u liječenju oboljelih od tumora (Katzung, Masters, Trevor; 2011).

Danas je klasična kemoterapija ipak ona vrsta terapije koje se najčešće koristi za

liječenje oboljelih od raka. Kako bi se povećala učinkovitost, kao jedna od obećavajućih

strategija, sintetiziraju se novi spojevi, potencijalni citostatici. Među njih spadaju i diazeni, te

među njima uža grupa, diazenkarboksamidi.

1.3. Spojevi diazenkarboksamidi

Tijekom posljednjih desetak godina razvila se uspješna suradnja između grupe dr. sc.

M. Osmak iz Instituta Ruđer Bošković koja istražuje stanični odgovor na citotoksične spojeve

i grupe prof. dr. sc. S. Polanca sa Fakulteta za kemiju i kemijsku tehnologiju Sveučilišta u

Ljubljani (Slovenija) koji sintetiziraju nove spojeve. U tom periodu sintetizirano je preko 250

novih spojeva te ispitano njihovo biološko djelovanje. Posebnu grupu novosintetiziranih

spojeva čine diazeni, odnosno uža grupa, diazenkarboksamidi.

Dosadašnji rezultati vezani uz istraživanje biološke aktivnosti diazenkarboksamida su

pokazali da su to spojevi toksični za različite tumorske stanične linije (Osmak i sur., 1999;

Osmak i sur.,- 1999,a; Osmak i sur., 2000; Moskatelo i sur., 2002; Moskatelo i sur., 2002,a;

Čimbora i sur., 2003; Jakopec i sur., 2006; Martin-Kleiner i sur., 2007). Ukoliko se stanice

obrađuju sa diazenkarboksamidima u kombinaciji sa cisplatinom, jednim od najčešće

korištenih i najučinkovitijih citostatika u kemoterapiji tumora (Boulikas i Vougiouka, 2003),

6

opažen je sinergistički učinak na nekoliko linija tumorskih stanica, kao i smanjivanje

otpornosti stanica na cisplatinu i vinkristin (Osmak i sur., 1999,a; Osmak i sur., 2000;

Moskatelo i sur., 2002; Jakopec i sur., 2006,a). Usporedba citotoksičnosti

diazenkarboksamida za ljudske tumorske stanice (više linija leukemijskih stanica) i normalne

stanice (limfociti periferne krvi), pokazala je selektivnu citotoksičnost za tumorske stanice

(Martin-Kleiner i sur., 2007), što izabrane spojeve ove grupe čini potencijalnim citostaticima.

Nažalost, topivost ovih spojeva relativno je mala, pa je to bio poticaj za sintezu novih spojeva

diazendikarboskamida, koji bi zadržali ili povećali citotoksičnu aktivnost, no ujedno bili više

topivi.

1.4. Glutation

Pojedini novosintetizirani diazenkarboksamidi (JK-279, JK-835, JK-925, UP-91, MG-

19, JK-802) mogu značajno smanjiti unutarstaničnu koncentraciju glavnog staničnog

antioksidansa, glutationa (Osmak i sur., 1999,a; Osmak i sur., 2000; Moskatelo i sur., 2002).

U „kvazifiziološkim uvjetima“ mogu trasformirati različite tiole na odgovarajuće disulfide, a

u normalnim fiziološkim uvjetima djeluju selektivno s prirodnim tiolima, posebice s

glutationom, glavnim antioksidansom u stanicama (Moskatelo i sur., 2002).

Glutation (L-γ-glutamil-L-cistein-glicin, GSH) najčešći je neproteinski tiol u

stanicama sisavaca, male molekularne mase, prisutan u eukariotskim stanicama. U GSH

glutamat je vezan na cistein preko svog aminokiselinskog ostatka, što ga štiti od razgradnje -

aminopeptidazama. Sintetizira se u citosolu u dva koraka pomoću enzima i energije iz ATP-a:

1. Glu + Cys -glutamilcistein sintetaza_

-Glu-Cys

2. -Glu-Cys + Gly glutation sintetaza _

-Glu-Cys-Gly

Sve eukariotske stanice mogu sintetizirati glutation, ali najviše ga ima u jetri i bubrezima

(glavni organi za detoksifikaciju organizama). Od tamo se izlučuje u krvnu plazmu, gdje ga

preuzimaju druge stanice u organizmu. U samoj stanici 90 % GSH nalazi se u citosolu, a 10%

u mitohondrijima, koji ga ne mogu sintetizirati, no prijeko je potreban za njihovu funkciju

(White i sur., 1994).

7

Glutation djeluje kao antioksidans. Osim toga, vezajući na sebe štetne spojeve, smanjuje

njihovu biološku aktivnost (Meister,1995; Estrela i sur., 2006). Ova svojstva GSH poznata su

već desetljećima. No posljednjih desetak godina prepoznata je nova, izrazito važna uloga

GSH, a to je održavanje redoks statusa stanice, koji je nužan za normalno odvijanje niza

fizioloških procesa u stanicama. (Filomeni i sur., 2002; Estrela i sur., 2006, Giles, 2006).

Stoga GSH osim detoksifikacijske uloge ima ključnu ulogu u nizu fizioloških procesa u

stanicama kao što je transport aminokiselina, primarni imunološki odgovor preko protutijela,

regulacija proliferacije T-limfocita, proliferacija stanica, sinteza DNA, aktivacija enzima,

regulacija stvaranja mikrotubula i blokiranje nuklearnog faktora B (NF-B), kao i u

staničnoj smrti. Ove brojne funkcije GSH temelje se na njegovom svojstvu da održava redoks

status stanice (Filomeni i sur., 2002, Estrela i sur., 2006; Giles, 2006; Circu i Aw, 2010).

Budući da glutation ima veliku ulogu u zaštiti stanica od toksičnih spojeva, ne

iznenađuje činjenica da je njegova koncentracija povišena u nekim tumorskim stanicama

otpornim na citostatike (Zhang i sur., 1998). Zbog toga se istražuju spojevi koji bi smanjili

količinu glutationa i time pospješili konvencionalnu kemoterapiju, odnosno sami bili

citotoksični za stanice.

1.5. Stanična smrt

Oštećene stanice mogu ugibati na više načina. Glavni su nekroza, apoptoza i

autofagija. Nekroza je najstariji poznati mehanizam stanične smrti u kojoj dolazi do

razgradnje stanice uz upalu. Najčešće, citotoksični spojevi aktiviraju apoptozu (Taylor i sur.,

2008). Apoptoza obuhvaća dva signalna puta. Jedan započinje u mitohondrijima (tvz.

mitohondrijski put), na poticaj različitih stimulusa (Fulda i sur., 2010) i precizno je reguliran

(Fulda i sur., 2010; Fulda i sur., 2012; Kelly i Strasser , 2011). Drugi put potiče vezivanje

liganda na receptore smrti što dovodi do aktiviranja kaspaza (Ashkenazi, 2008). Autofagija je

najnoviji prepoznati put staničnog umiranja, koji održava stabilnost genoma, ali koji može

poticati otpornost na protutumorske lijekove (Zhou i sur.,2012).

Ispitujući vrstu stanične smrti koju induciraju novosintetizirani spojevi,

diazenkarboksamidi, vidjeli smo da ona može biti različita, te da na nju utječu i vrlo male

promjene u strukturi. Primjer su spojevi N-fenil-2-(2-piridinil)diazenkarboksamid (JK-279), i

njegov derivat N1-fenil-N

2-(2-piridinilmetil) diazendikarboksamida (RL-337), koji se

razlikuju samo u u dvije skupine (amidna i metilna skupina dodane su diazenu JK-279, dajući

8

diazen RL-337). Ta mala promjena strukture izaziva umjesto kaspaza-neovisnog oblika

programirane stanične smrti koji je u nekim segmentima "apoptozi-sličan" za spoj JK-274

(Jakopec i sur., 2006), nekrozu za spoj RL-337 (Jakopec i sur., 2006,a).

1.5.1. Nekroza

Nekroza je odavno opisana kao posljedica slučajnog i nekontroliranog fizikalno-

kemijskog stresa u stanici. Nekrotična stanična smrt nije posljedica dobro opisane signalne

kaskade, već je rezultat interakcije nekoliko signalnih puteva. Nekroza je morfološki

obilježena povećanjem volumena stanice, bubrenjem organela, puknućem plazmatske

membrane i gubitak unutarstaničnog sadržaja (Kromer i sur., 2009). Stanične signalne puteve

nekroze obilježavaju tri uzastopne faze: faza inicijacije, faza umnožavanja i izvršenja.

Dosadašnja istraživanja nekroze stanica ne omogućuju prepoznavanje jasnih razlika između

tih faza, jer se mnogi stanični događaji pojavljuju u isto vrijeme. Najčešći uzrok nekroze

tumora tijekom njegova razvoja je nedovoljna opskrbljenost kisikom i hranjivim tvarima zbog

nedovoljne prokrvljenosti. Dakle, aktivacija nekroze javlja se u uvjetima ishemije ili hipoksije

koja se može simulirati i u in vitro uvjetima smanjenjem kisika, glukoze i ostalih hranjivih

tvari. Glavni uzrok nekroze je nalgo i opsežno smanjenje energije i izraziti stres.

Razni lijekovi koji se koriste u antitumorskoj terapiji, također mogu uzrokovati

nekrozu tumorskih stanica. Kod nekih solidnih tumora vrlo često se nekroza može primijetiti

nakon antitumorske terapije ili tijekom razvoja tumora. Budući da konvencionalni

antitumorski lijekovi ili zračenja najčešće ne mogu izravno izazvati nekrozu stanica, može se

pretpostaviti da je u takvim slučajevima nekroza sekundarna pojava, koja nastaje kao

posljedica mitotske pogreške (smrt stanica nakon diobe s nepopravljivom greškom u DNA).

9

Slika 1.2. Elektronsko-mikroskopska slika (A) normalne HeLa stanice (B) nekroza

stanice (iz Golstein i Kroemer, 2007.)

1.6. Novi spojevi diazendikarboksamidi

Kako je spomenuto u poglavlju 1.3. do sada sintetizirani spojevi, diazenkarboksamidi,

(Osmak i sur., 1999; Osmak i sur., 1999,a; Osmak i sur., 2000) iako relativno citotokisčni,

slabo su se otapali. Zbog toga je sintetiziran niz novih spojeva, diazendikarboksamida s ciljem

da se zadrži ili poveća njihova citotoksičnost, ali da se poveća njihova topivost.

U ovom radu ispitivana je njihova biološka aktivnost. Diazendiakarboksamidi

sintetizirani su, ukratko, na slijedeći način. Reakcije odabranih izocijanata sa metil

karbazatom rezultirale su 1,4-disupstituiranim semikarbazidima, koji su oksidirani do

odgovarajućih diazena i konačno transformirani u željene diazendikarboksiamide, sa

odgovarajućim pikolilaminom kao nukleofilom (Slika 1.3.).

10

Slika 1.3. Sinteza diazendikarboksamida

NSB=N-bromosukcinimid, st= sobna temperatura,

11

Strukture diazendikarboksamida čiju smo citototoksičnost ispitivali u ovom radu

prikazane su na Slici 1.4.

Slika 1.4. Struktura diazenedikarboksamida čija je citotoksičnost ispitivana u ovom

radu

12

2.CILJ RADA

13

Rak je jedan od glavnih uzroka smrti u razvijenom svijetu, jer postojeća terapija za

velik broj tumora nije dovoljno učinkovita. Zbog toga se traže nove, učinkovitije strategije

liječenja, odnosno novi spojevi sa povoljnijim karakteristikama kao potencijalni, više

učinkoviti protutumorski lijekovi.

Ciljevi ovog diplomskog rada su:

1. Ispitati citotoksičnost novih spojeva diazendikarboksamida na stanicama karcinoma

vrata maternice HeLa stanice. Osjetljivost stanica na diazendikarboksamide odrediti će

se kolorimetrijskom MTT metodom.

2. Nakon što se ispita osjetljivost HeLa stanica na novosintetizirane

diazendikarboksamide, odrabrat će se najcitotoksičniji spoj te ispitati njegovu

citotoksičnost na više staničnih linija različitog porijekla.

3. Budući da je dokazano da GSH djeluje kao antioksidans i ima veliku ulogu u zaštiti

stanica od toskičnih spojeva, ispitat će se uloga GSH u odgovoru HeLa stanica na

najcitotoksičniji spoj. Pri tome će se koristit iscrpljivanje unutarstaničnog GSH

pomoću butionin sulfoksimina (BSO), specifičnog inhibitora sinteze GSH.

4. Posljednji cilj ovoga rada je ispitati koju vrstu stanične smrti izaziva odabrani spoj.

14

3. MATERIJALI I METODE

15

3.1. Kemikalije

U pokusima su korištene sljedeće kemikalije: diazenkarboksamidi (detaljno opisani u

slijedećem stavku; otopljeni su u dimetil sulfoksidu i čuvani kao štok otopina na -200C,

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid (MTT; Sigma-Aldrich), 2 dimetil-

sulfoksid (DMSO; Kemika), Dulbeccov minimalni Eaglov medij (DMEM, Gibco BRL,

Invitrogen, USA) uz dodatak 26,2 mM NaHCO3 i 0,01% w/v streptomicin/kristacilina, pH 7

te 10% fetalnog seruma (Gibco), 0,25 % tripansko modrilo u fosfatnom puferu (engl.

phosphate buffered saline, PBS). Standardne kemikalije poput onih za PBS-a (37 mM

natijevog klorida + 2,7 mM kalijeva klorida + 4,3 mM natrijeva hidrogenfosfata heptahidrata

+ 1,4 mM kalijeva hidrogenfosfata) nabavljene su od Kemike. Kemikalije su otopljene i

čuvane kao štok otopine prema uputama proizvođača.

3.2. Stanične linije

U pokusima su korištene slijedeće ljudske stanične linije: stanice karcinoma vrata

maternice (HeLa stanice), stanice karcinoma grkljana (HEp-2 stanice), stanice karcinoma

debelog crijeva (HCT-116 stanice), stanice karcinoma pluća ( H460 stanice) i embrionalne

stanice bubrega (HEK-293 stanice). U pokusima je korištena i sublinija HEp-2 stanica

otporna na citostatik karboplatinu (Osmak i sur., 1995) i prirodni spoj kurkumin (7T

stanice)(Rak i sur., 2013). 7T stanice dobivene su kontinuiranom obradom HEp-2 stanica s

rastućim koncentracijama karboplatine (od 2.5 μM do 25 μM, tj. do klinički relevantne

koncentracije) kroz pet uzastopnih dana tako da je medij s citostatikom promijenjen svaki

dan. Nakon svake petodnevne obrade, stanice su se oporavljale u mediju sve dok preživjele

stanice nisu počele normalno rasti (Osmak i sur., 1995). Sve stanične linije rasle su kao

jednoslojna kultura u DMEM-u (Gibco) uz dodatak 26,2 mM NaHCO3 i 0,01% w/v

streptomicin/kristacilina, pH 7 te 10% fetalnog seruma (Gibco) u vlažnoj atmosferi pri 37ºC i

5% CO2.

Za rasađivanje stanica korišten je 0,25%-tni tripsin (Gibco) (2,5g tripsina+ 0,01g

streptomicina + 0,006g penicilina+ 0,02g fenol crvenog otopi se u otopini T, nadopuni do 1L i

podesi pH na 7 - 7,2 te sterilizira filtriranjem kroz filtar veličine pora 0,22 µM; otopina T

sadrži 0,017 M natrijeva citrata, 0,134 M kalijeva klorida i 0,0055 M glukoze). Tripsin se

16

koristi zbog njegove proteazne aktivnosti koja omogućuje odvajanje stanica od stanica i

odvajanje stanica od podloge na kojoj rastu. Nakon uklanjanja medija iznad stanica, stanice se

1-2 puta isperu tripsinom (1 ml). Nakon toga doda se tripsin (1 ml) i ostavi da djeluje par

minuta, čime se dobiju pojedinačne stanice u suspenziji. Uspješnost odvajanja provjeri se pod

svjetlosnim mikroskopom. Zatim se stanice dobro resuspendiraju u mediju zagrijanom na 37

ºC (5 ml), razrijede u 9800 µl Isoton

II otopine (Beckman Coulter, Njemačka), izbroje na

automatskom brojaču stanica ( Z2, verzija 1.02.; Beckman Coulter Inc, SAD), te podese na

koncentraciju koja je potrebna za nasađivanje stanica za pokuse. Za održavanje staničnih

linija stanice se rasađuju 2-3 puta tjedno, te ovisno o vrsti stanica razrijeđuju 3-5 puta.

3.3. Određivanje preživljenja stanica spektorfotometrijskom MTT metodom

Preživljenje stanica nakon obrade stanica sa novosintetiziranim spojevima određeno je

kolorimetrijskom MTT metodom. MTT test se temelji na svojstvu staničnih dehidrogenaza da

reduciraju žuti 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid (MTT) u ljubičasti

formazan (Mickisch i sur., 1990). Dvadeset četiri sata nakon nasađivanja, dodani su novi

spojevi (20 μl/bunariću), u različitim razrijeđenjima a svako je razrijeđenje dodano u

kvadriplikatu. Nakon 72 sati uklonjen je medij i u svaki bunarić dodano 20 μg MTT boje/40

μl medija. Medij se mora ukloniti jer mrtve stanice zbog oštećenja plazmatske membrane

otpuštaju laktat-dehidrogenazu koja također može reducirati MTT boju i pridonijeti

ljubičastom obojenju. Nakon inkubacije od 3 h na 37 ˚C, nastali kristali formazana otapaju se

u dimetil sulfoksidu (170 μl/bunariću) uz protresanje pločica 5 min na Vibromix 301EVT

tresilici (Tehtnica, Slovenija) pri 600 rpm. Nakon toga izmjeri se apsorbancija pri 600 nm na

spektrofotometrijskom čitaču pločica StatFax 2100 (Awareness Technology INC, SAD).

Apsorbancija je proporcionalna broju vijabilnih stanica. Preživljenje stanica nakon obrade

pojedinim spojem izračunava se u odnosu na neobrađene kontrolne stanice. Pri tome se od

dobivenih apsorbancija prethodno oduzima apsorbancija «slijepe probe» (bunarić bez

stanica).

Ovom metodom je određeno da je diazenkarboksimid JV-158 najtoksičniji, pa je

upravo taj novi spoj korišten u daljnjim pokusima.

17

3.4. Ispitivaje uloge glutationa u staničnom odgovoru na spoj JV-158

Kako bi se odredila moguća uloga GSH u staničnom odgovoru na izabrani

diazendikarboksamid, stanice su ujutro nasađene kako je opisano u točki 3.3. Popodne je u

uzorke dodan butionin sulfoksimin (BSO), specifičan inhibitor sinteze GSH (Griffith i

Meister, 1979) u koncentraciji 0.01 mM. Drugi dan u bunariće je dodan spoj JV-158 u

različitim razrijeđenjima (2, 5, 20, 50 i 200 μM), te nakon 72 sata određeno preživjenje

stanica.

3.5. Određivanje vrste staničme smrti potaknute sa JV-158

Glavne vrste stanične smrti koje izazivaju citostatici su nekroza i apoptoza. Nastanak

nekroze dokazuje se bojanjem mrtvih stanica tripan modrilom. Stanice se nasade u petrijeve

zdjelice i drugi dan obrađuju sa diazendikarboksamidom JV-158 1 sat. Nakon toga se stanice

2 puta isperu sa PBSom, na njih se doda 40 μl 0.25 % tripanskog modrila (u PBS-u) i inkubira

15 minuta. Nakon toga stanice se dva puta isperu PBS-om i na njih doda 100 μl PBSa. Žive

stanice ostaju neobojane, dok u mrtve stanice, zbog promjenjene permeabilnosti membrana,

boja ulazi u stanice i boji ih plavo. Budući da smo pokazali da JV-158 izaziva nekrozu, dalje

ispitivanje indukcije apoptoze postalo je bespotrebno.

18

4. REZULTATI

4.1. Preživljenje stanica nakon djelovanja diazendikarboksamida

19

Prvi cilj ovog rada bio je ispitati citotoksičnost novosintetiziranih spojeva

diazendikarboksamida. Njihova citotoksičnost je ispitivana na stanicama nakon 72 sata

inkubacije u vlažnoj atmosferi pri 37ºC i 5% CO2. Za ispitivanje citotoksičnosti korištene su

stanice karcinoma vrata maternice HeLa stanice, jer su se te stanice pokazale kao dobar

stanični model, osjetljiv na različite spojeve. Preživljenje stanica nakon obrade s

diazendikarboksamidima određeno je pomoću MTT testa. Dobiveni rezultati prikazani su na

Slikama 4.1.- 4.3.

Slika 4.1. Osjetljivost HeLa stanica na diazendikarboksamide. Stanice su obrađene s

diazendikarboksamidima 24 sata nakon nasađivanja. Nakon 72 sata inkubacije određeno je

njihovo preživeljnje pomoću MTT testa. Svaka točka predstavlja srednju vrijednost i

standardnu pogrešku iz tri pokusa.

-20

0

20

40

60

80

100

120

0,02 0,05 0,2 0,5 2

% p

reži

vlje

nja

c (μM)

JV-157

JV-158

JV-159

JV-147

JV-154

JV-153

20

Slika 4.2. Osjetljivost HeLa stanica na diazendikarboksamide. Stanice su obrađene s

diazendikarboksamidima 24 sata nakon nasađivanja. Nakon 72 sata inkubacije određeno je

njihovo preživeljnje pomoću MTT testa. Svaka točka predstavlja srednju vrijednost i

standardnu pogrešku iz tri pokusa.

Slika 4.3. Osjetljivost HeLa stanica na diazendikarboksamide. Stanice su obrađene s

diazendikarboksamidima 24 sata nakon nasađivanja. Nakon 72 sata inkubacije određeno je

njihovo preživeljnje pomoću MTT testa. Svaka točka predstavlja srednju vrijednost i

standardnu pogrešku iz tri pokusa.

-20

0

20

40

60

80

100

120

4 10 40 100 400

% p

reži

vlje

nja

c (μM)

JV-313

JV-324

JV-323

JV-330

JV-331

JV-332

-20

0

20

40

60

80

100

120

3,33 8,35 33,3 83,25 333

% p

reži

vlje

nja

c(μM)

JV-315

JV-309

JV-311

21

Radi lakše usporedbe citotoksičnosti novosintetiziranih spojeva diazendikarboksamida

na HeLa stanice, u Tablici 4.1. su navedene vrijednosti IC50 (koncentracija spoja koja ubija 50

% stanica).

Tablica 4.1. Citotoksična aktivnost različitih diazendikarboksamida ispitana na

stanicama karcinoma vrata maternice HeLa stanicama

Naziv spoja IC50 (µM)

SB-411 155

SB-409 86

JV-154 141.68 + 0.09

JV-159 88.89 + 33.33

JV-324 28.20 + 4.12

JV-332 23.95 + 3.09*

JV-315 56.61 + 14.46

JV-323 61.31 + 24.28

JV-153 46.11 + 0.98

JV-158 34.51 + 4.09

JV-331 12.37 + 5.96*

JV-147 92.5 + 15.89

JV-157 233.9 + 69.1

JV-309 25.82 + 5.71

JV-330 14.09 + 4.27*

JV-313 57.40 + 2.63

JV-311 256.97 + 2.30

* Nakon dodatka u medij, ovi su se spojevi brzo taložili, pa je teško odredit njihovu

točnu citotoksičnost

22

4. 2. Učinak diazendikarbokasmida JV-158 na različite vrste tumorskih stanica

Spoj JV-158, koji se pokazao kao najviše citotoksičan (Tablica 4.1.), koristili smo u

daljim pokusima. Slijedeći korak bio je ispitati njegovu citotoksičnost na različitim staničnim

linijama: stanicama karcinoma pluća H460, stanicama karcinoma debelog crijeva HCT-116,

stanicama karcinoma grkljana HEp-2, na subliniji HEp-2 stanica otpornoj na karboplatinu i

kurkumin 7T, kao i na embrionalnim stanicama bubrega HEK-293 (Tablica 4. 2).

Tablica 4.2. Citotoksična aktivnost JV-158 spoja na različitim staničnim linijama

Stanična linija IC 50 (μM)

HeLa 34.51 +4.09

HEp-2 40.15 +2.27

7T 88.80 +8.41

HCT-116 164.00 +11.31

H460 148.63 +4.59

HEK-293 116.72 +11.31

HeLa = stanice karcinoma vrata maternice, HEp-2 = stanice karcinoma grkljana, 7T =

sublinija HEp-2 stanica otporna na karboplatinu i kurkumin, HCT-116 = stanice karcinoma

debelog crijeva, H460 = stanice karcinoma pluća, HEK-293 = embrionalne stanice bubrega

Rezultati prikazani u Tablici 4.2. pokazuju da najveću otpornost na JV-158 spoj

pokazuju stanice karcinoma debelog crijeva HCT-116, zatim slijede stanice karcinoma pluća

H460. Slijedeće otporne stanice na JV-158 su embrionalne stanice bubrega HEK-293, što je

vrlo povoljno, jer to nisu tumorske stanice nego normalne stanice. Nažalost, slijedeće

najotpornije bile su stanice 7T, sublinija HEp-2 stanica otporna na karboplatinu i kurkumin .

Ako se ima u vidu moguću kliničku primjenu spoja JV-158 , ovaj rezultat je vrlo nepovoljan,

23

jer pokazuje da su 7T stanice, osim na različite citostatike i prirodni spoj kurkumin otporne i

na JV-158, kao potencijalni citostatik. Najosjetljivije od svih bile su stanice vrata maternice

stanice HeLa, te nešto malo manje stanice karcinoma grkljana HEp-2.

4.3. Uloga glutationa u staničnom odgovoru na JV-158

Budući da glutation ima značajnu ulogu u zaštiti stanica od toksičnih spojeva i da je

njegova koncentracija povišena u brojnim tumorskim stanicam, željeli smo ispitati, da li GSH

ima neku ulogu u odgovoru HeLa stanica na JV- 158. Kako bismo odgovorili na to pitanje,

nakon što su se Hela stanice zalijepile za podlogu, obradili smo ih sa specifičnim inhibitorom

sinteze GSH, BSO, te drugi dan ujutro obradili sa različitim koncentracijama JV-158.

Preživljenje stanica određeno je nakon 72 sata MTT testom. Rezultati prikazani na Slici 4.4.

jasno pokazuju da predobrada sa BSO nije imala utjecaja na preživljenje stanica, odnosno da

GSH ne sudjeluje u staničnom odgovoru na JV-158.

Slika 4.4. Preživljenje stanica karcinom vrata maternice, HeLa stanica, obrađenih sa

spojem JV-158 sa ili bez prethodne obrade sa BSO. 24 sata nakon dodatka BSO, kontrolne

ili prethodno sa BSO obrađene stanice tretiraju se sa spojem JV-158. Nakon 72 sata odredi se

njihovo preživljenje korištenjem MTT testa.

-20

0

20

40

60

80

100

120

2 5 20 50 200

% p

reži

vlje

nja

koncentracija (μM)

HeLa

HeLa+BSO

24

4.4. Vrsta stanične smrti potaknuta sa spojem JV-158

HeLa stanice koje su pokazaje najveću osjetljivost na spoj JV-158, poslužile su kao

test sistem za utvrđivanje vrste stanične smrti koju izaziva diazendikarboksamid JV-158.

Kako bismo ispitali koju vrstu stanične smrti potiče taj spoj, prvo smo istražili da li taj spoj

može izazvati nekrozu. Za to smo koristili test sa tripan modrilom: uslijed stanične smrti

mijenja se permeabilnost membarne, pa plava boja ulazi u mrtve stanice. Na Slici 4.5.

prikazane su kontrolne stanice. Slika 4.6. pokazuje, da već 1 sat nakon tretmana sa JV-158 dio

stanica ugiba, pa boja ulazi u stanice. Prema tome možemo zaključiti da diazendikarboksamid

JV-158 izaziva nerkozu.

Slika 4.5. Kontrolne stanice obrađene sa tripanskim modrilom. Stanice se isperu sa PBS-

om, boje 15 minuta sa 0.25 % tripanskog modrila (u PBS-u). Nakon toga ponovno se isperu,

doda na njih PBS, te se stanice snime pomoću fluorescentnog mikroskopa.

25

Slika 4.6. Stanice obrađene sa JV-158, a zatim sa tripanskim modrilom. Dvadeset četiri

sata nakon nasađivanja stanica, stanice se obrađuju sa 34 µM JV-158 kroz 1 sat. Nakon toga

isperu se sa PBS-om, boje 15 minuta sa 0.25 % tripanskog modrila (u PBS-u). Nakon toga

ponovno se isperu, doda na njih PBS, te se stanice snime pomoću fluorescentnog mikroskopa.

26

5. RASPRAVA

27

5. Rasprava

Danas je rak jedan od glavnih uzroka smrti u svijetu. Postojeća kemoterapija nije

dovoljno učinkovita za veliki broj tumora, zbog brojnih promjena koje nastaju u tumorima.

Tumorske se stanice po brojnim karakteristikama razlikuju od normalnih (Hanahan i

Weinberg, 2011). Najpoznatije su promjene koje dovode do nekontrolirane aktivosti

elemenata mitotskog signalnog puta, a to su aktivacija onkogena ili inaktivacija tumor

supresor gena. Tumori mogu sami stvarat čimbenike rasta, imat trajno aktivne receptore,

trajno provodit mitotski signal do jezgre, te aktivnost transkripcijskih čimbenika može biti

veća (Perona, 2006; Cheng i sur., 2008; Cascón i Robledo, 2012). Uzrok nastanka tumora

može biti i smanjena aktivnost tumor supresorskih gena, od kojih su najpoznatiji Rb

(Weinberg, 1995; Burkhart i Sage, 2008) i p53 (Vousden, 2000; Harris i Levine, 2005; Prives

i Vousden, 2009). Rastu tumora doprinose i promjene u putevima programirane stanične

smrti, čime tumorske stanice mogu izbjeći staničnu smrt (Rodriguez-Nieto i Zhivotovsky,

2006), trajna aktivnost telomeraze (Blasco, 2005; Shay i Wright, 2000), kao i promjene u

metaboličkim putevima tumorskih stanica (Carew i Huang, 2002).

Iako je standardna kemoteparija na početku primjene dosta učinkovita, zbog različitih

molekularnih mehanizama koji se aktiviraju u tumorskim stanicama (Stewart , 2007; Köberle

i sur., 2010), uspješnost sa vremenom postaje sve manja, pa je upravo otpornost stanica na

standardnu terapiju glavni razlog njene nedovoljne učinkovitosti. Kako bi se povećala

učinkovitost terapije, intenzivno se traže novi lijekovi i razvijaju nove strategije liječenja.

Iako je posljednjih godina interes usmjeren u pronalaženju lijekova koji će biti specifični za

tumorske stanice, jer će im cilj biti upravo molekule u kojima se tumorske stanice razlikuju od

normalnih, uspjesi takve terapije nisu u skladu sa očekivanjima, pa se i dalje traga za novim

lijekovima.

Cilj ovoga rada je bio ispitati citotoksičnost novosintetiziranih spojeva,

diazendikarboksamida, koji bi se mogli koristiti kao potencijalni citostatici. Dosadašnji

rezultati istraživanja pokazali da bi diazeni, odnosno diazenkarboksamidi mogli biti

potencijalni citostatici, jer su citotoksični za različite tumorske linije (Osmak i sur., 1999;

Osmak i sur., 1999,a; Osmak i sur., 2000; Moskatelo i sur., 2002; Moskatelo i sur., 2002;

Čimbora i sur., 2003; Jakopec i sur., 2006; Martin-Kleiner i sur., 2007), da imaju sinergistički

učinak sa cisplatinom i vinkristinom i da izazivaju povrat otpornosti na ta dva citostatika

(Osmak i sur., 1999,a; Osmak i sur., 2000; Moskatelo i sur., 2002; Jakopec i sur., 2006), da

mogu značajno smanjivati unutarstaničnu koncentraciju glavnog staničnog antioksidansa,

28

glutationa (Osmak i sur., 1999,a; Osmak i sur., 2000; Moskatelo i sur., 2002), te da su

selektivno više toksični za tumorske stanice nego li za normalne stanice (Martin-Kleiner i

sur., 2007). Glavni problem diazenkarboksamida je relativno slaba topljivost, što bi bila

gotovo nepremostiva prepreka za moguću kliničku primjenu u liječenju tumora. Stoga su

sintetizirani novi spojevi, diazendikarboksamidi. U ovom radu ispitana je citotoksičnost 15

novosintetiziranih spojeva iz te grupe.

Sve diazendikarboksamide korištene u ovom radu možemo podijeliti u tri grupe prema

položaju pikolila kao supstituenta. Unutar svake od tih grupa se pojedini spojevi razlikuju po

svojim funkcionalnim grupama. Prethodna istraživanja su pokazala da su

diazendikarbokasamidi SB-411 i SB-409 dosta citotoksični (Čimbora-Zovko i sur., 2004).

Spoj SB-409 koji sadrži 3-pikolilnu skupinu vezanu na dušik amida pokazao se aktivniji od

spoja SB-411 koji na istom tom mjestu ima 2-pikolnu skupinu. Zbog toga smo odlučili ispitati

citotoksičnost nesimetričnih diazendikarboksamida koji imaju 2- pikolil, 3-pikolil ili 4-pikolil

kao supstituent vezan na dušik amida i 4-suptituiranu fenilnu grupu na drugom amidnom

dijelu molekule. Njihova citotoksičnost je ispitivana na stanicama karcinoma vrata maternice

HeLa stanicama. Ovu staničnu liniju izabrali smo kao modelni sistem za testiranje novih

spojeva, jer je naše prethodno istraživanje pokazalo da je ta stanična linija dosta osjetljiva na

nove spojeve.

Rezultati pokazuju da među diazenima koji imaju istu arilnu skupinu, spojevi s 3-

pikolilnom skupinom su toksičniji od spojeva koji sadrže 2- pikolil ili 4-pikolil kao

supstituent. Razlika citotoksičnosti između pojedinih spojeva vidi se također kada

uspoređujemo 4-klorfenil suptituirane diazene (JV-154, JV-153 i JV-147), 4-metoksifenolne

diazene (JV-159, JV-158 i JV- 157) ili analoge s 4-butilfenil supstituentom na dušiku amida

(JV-332, JV-331 i JV-330). Posljednja tri diazendikarboksamida (JV-332, JV-331 i JV-330)

vrlo brzo se talože nakon dodatka u hranjivu podlogu te stoga se ne može izmjeriti točna

citotoksičnost tih spojeva.

Od svih navedenih spojeva najbolju citotoksičnost je pokazao spoj N1-(4-

metoksifenil)-N2-(piridin-3-metil)diazen-1,2-dikarboksamid, JV-158 (Tablica 4.1.). Zbog toga

smo spoj JV-158 koristili u daljnjim ispitivanjima. Kao prvo, ispitali smo njegovu

citotoksičnost i na drugim tumorskim staničnim linijama, te i na uvjetno normalnoj staničnoj

liniji embrionalnog bubrega HEK-293. Rezultati su pokazali, da je citotoksičnost JV-158

ovisila o vrsti ispitivanih stanica: stanice karcinoma vrata maternice HeLa bile su

najosjetljivije, dok su najotpornije bile stanice karcinoma debelog crijeva HCT-116. Razlika u

osjetljivosti izražena preko vrijednosti IC50 (a to je koncentracija spoja koja smanjuje

29

preživljenje stanica na 50 %) iznosila je preko 4,6 puta. Zbog važnosti koju otporne stanice

imaju u kemoterapiji, jer bitno umanjuju njenu učinkovitost, među tumorskim staničnim

linijama čiju smo osjetljivost ispitivali, u naša ispitivanja uključili smo i 7T stanice koje su

otporne na standardne citostatike: karboplatinu i cisplatinu, te na prirodni spoj kurkumin

(Osmak i sur., 1995; Rak i sur., 2013). Nažalost, ove su stanice bile dva puta otpornije na spoj

JV-158 od roditeljskih HEp2 stanica, što ukazuje na to da u odgovoru 7T stanica na ovaj spoj

stanica aktivira neke od puteva uključenih u mehanizme stanične otpornosti na karboplatinu i

kurkumin.

U posljednja dva desetljeća dolazi do velikog napretka u razumijevanju uloge GSH u

biokemiji stanica raka. Osim osnovnih bioloških funkcija , GSH u stanicama raka je posebno

važan u regulaciji: a) procesa zloćudne preobrazbe stanica, b) osjetljivosti na citotoksične

lijekove i ionizirajuće zračenje, c) sintezi DNA, te proliferaciji. Pretpostavku da GSH može

biti zaštita od oksidacije i toksičnih spojeva prvi je postavio Barron (Barron, 1953). Hirono

(1961.) je otkrio da je kod stanica vrlo otpornih na alkilirajuće agense povećana razina ne-

proteinskih tiola u usporedbi sa stanicama koje su osjetljive na te lijekove. Ovaj i niz radova

publiciranih nakon njega je pokazao da GSH ima važnu ulogu u određivanju osjetljivosti

stanica na zračenje i citotoksične spojeve. Kao potvrda, opisano je da je otpornost stanica na

zračenje i lijekove kod mnogih tumora, u usporedbi sa normalnim tkivima, povezana sa

povišenom razinom GSH u stanicama raka (Estrela i sur., 2006).

Dosadašnji rezultati su pokazali da pojedini diazenkarboksamidi mogu smanjivati

unutarstaničnu koncentraciju glavnog staničnog oksidansa, glutationa (Osmak i sur., 1999,a;

Osmak i sur., 2000; Moskatelo i sur., 2002). Kako bismo ispitali ima li GSH ulogu u

staničnom odgovoru na diazendikarboksamid JV-158 koristili smo specifičan inhibitor sinteze

GSH, butionin sulfoksimin (BSO). Suprotno prethodnim rezultatim dobivenim sa nekim od

diazenkarboksamida, u ovom slučaju predobrada stanica sa BSO prije tretmana sa JV-158 nije

utjecala na preživljenje stanica, što pokazuje da GSH ne sudjeluje u staničnom odgovoru

HeLa stanica na diazendikarboksamid JV-158.

Većina citostatika djeluje na tumorske stanice tako što izaziva staničnu smrt.

Razlikujemo tri vrste stanične smrti: apoptoza, nekroza i autofagija. Najčešći oblik stanične

smrti koju izazivaju citotoksični spojevi je apoptoza (Taylor i sur., 2008). Prethodno

ispitivani spojevi, diazenkarboksamidi, koji su bili citotoksični za HeLa stanice izazivali su

apoptozu (Jakopec i sur., 2006), ili nekrozu (Jakopec i sur., 2006,a). Zbog toga smo u ovom

radu ispitali koju vrstu stanične smrti izazivaju diazendikarboksamidi, odnosno spoj JV-

30

158. Obrađivanjem HeLa stanica tripanskim modrilom, indikatorom nekroze, dokazali smo

da spoj JV-158 izaziva nekrozu.

Na temelju svih dobivenih rezultata možemo pretpostaviti kako bi spoj JV-158 mogao biti

novi potencijalni protutumorski lijek.

31

6. ZAKLJUČCI

32

6. Zaključci

1. Svi ispitani novi spojevi, diazendikarboksamidi, citotoksični su za stanice karcinoma

vrata maternice HeLa.

2. Spojevi s 3-pikolilnom skupinom toksičniji su od spojeva koji sadrže 2- pikolil ili 4-

pikolil kao supstituent.

3. Među testiranim spojevima, najviše citotoksičan bio je spoj N1-(4-metoksyfenil)-N

2-

(piridin-3-metil)diazen-1,2-dikarboksamid, JV-158 , pa je taj spoj korišten u daljnjim

pokusima.

4. Citotoksičnost diazendikarboksamida JV-158 ovisi o vrsti stanica: najmanje osjetljive su

stanice karcinoma debelog crijeva HCT-116, a najviše osjetljive su stanice karcinoma

vrata maternice HeLa.

5. Sublinija stanica karcinoma grkljana 7T otpornija je na diazendikarboksamid JV-158 od

roditeljske linije HEp-2.

6. GSH ne sudjeluje u odgovoru HeLa stanica na diazendikarboksamid JV-158.

7. Diazendikarboksamid JV-158 izaziva nekrozu stanica karcinoma vrata maternice HeLa.

33

7.LITERATURA

34

7. Literatura

Ambriović Ristov A., Osmak M. (2006): Integrin-mediated drug resistance. Curr. Sign.

Trans. Ther. 1: 227-237.

Ashkenazi A. (2008): Targeting the extrinsic apoptosis pathway in cancer. Cytokine Growth

Factor Rev. 19: 325–331.

Barron E.S. (1953): The importance of sulfhydryl groups in biology and medicine. Tex. Rep.

Biol. Med. 11: 653–670.

Blasco M.A. (2005): Telomeres and human disease: ageing, cancer and beyond. Nat. Rev.

Genet. 6: 611–622.

Boulikas, T., Vougiouka, M. (2003): Cisplatin and platinum drugs at the molecular level.

Oncol. Rep. 10: 1663–1682.

Brozovic A., Ambriović-Ristov A., Osmak M. (2010): The relationship between cisplatin-

induced oxygen species, glutatione and BCL-2, and resistance to cisplatin. Crit. Rev. Toxicol.

40: 347-359.

Burkhart D.L., Sage J. (2008): Cellular mechanisms of tumour suppression by the

retinoblastoma gene. Nat. Rev. Cancer. 8: 671–682.

Carew J.S., Huang P. (2002): Mitochondrial defects in cancer. Mol. Cancer. 1: 9.

Cascón A., Robledo M. (2012): MAX and MYC: a heritable breakup. Cancer Res. 72: 3119-

3124.

Cheng N., Chytil A., Shyr Y., Joly A., Moses H. L.(2008): Transforming growth factor-beta

signaling-deficient fibroblasts enhance hepatocyte growth factor signaling in mammary

carcinoma cells to promote scattering and invasion. Mol. Cancer Res. 6: 1521-1533.

35

Circu M. L., Aw T. Y. (2010): Reactive oxygen species, cellular redox systems, and

apoptosis. Free Radic. Biol. Med. 48: 749-756.

Čimbora T., Bombek S., Polanc S., Osmak M. (2003): Methyl 2-(2-

chloroethylaminocarbonyl) diazenecarboxylate SB-166 inhibits the growth of different

tumour cell lines, including drug-resistant sublines. Toxicol. in Vitro. 17: 159–164.

Čimbora-Zovko T., Bombek S., Košmrlj J., Kovačić L., Polanc S., Katalinić A., Osmak

M. (2004): Development of potential anti-cancer agents: Diazenes and derivatives. Drug

Dev. Res. 61: 95–100.

Dey A., Lane D. P., Verma C. S.(2010): Modulating the p53 pathway. Sem. Cancer Biol. 20:

3–9.

Estrela J. M., Ortega A., Obrador E. (2006): Glutathione in cancer biology and therapy. Crit.

Rev. Clin. Lab. Sci. 43: 143-81.

Farber S., Diamond L.K., Mercer R.D., Sylvester R.F., Wolff J.A. (1948): Temporary

remission in acute leukemia in children produced by folic acid antagonist, 4-aminopteroyl-

glutamic acid (aminopterin). N. Engl. J. Med. 238: 787-793.

Filomeni G., Rotilio G., Ciriolo M. R. (2002): Cell signalling and the glutathione redox

system. Biochem. Pharmacol. 64:1057–1064.

Fulda S., Galluzzi L., Kroemer G. (2010): Targeting mitochondria for cancer therapy. Nat.

Rev. Drug Discov. 9: 447–464.

Fulda S., Vucic D. (2012): Targeting IAP proteins for therapeutic intervention in cancer.

Nat. Rev. Drug Discov. 11: 109–124.

Giles G. I.(2006): The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer.

Curr. Pharm. Des. 12: 4427–4443.

36

Golstein P, Kroemer G.(2007): Cell death by necrosis: towards a molecular definition. Trends

Biochem. Sci. 32(1): 37-43

Griffith O.W., Meister A. (1979): Potent and specific inhibition of glutathione synthesis by

buthionine sulfoximine (S-n-butyl homocysteine sulfoximine). J. Biol. Chem. 254: 7558-

7560.

Hanahan D., Weinberg R. A. (2011): Hallmarks of Cancer: The next generation. Cell 144:

646-674.

Hanahan D., Weinberg, R.A. (2000): The hallmarks of cancer. Cell 100: 57–70.

Harris S.L., Levine A.J. (2005): The p53 pathway: positive and negative feedback loops.

Oncogene 24: 2899–2908.

Jakopec S., Dubravčić K., Polanc S., Košmrlj J., Osmak M. (2006): Diazene JK-279 induces

apoptosis-like cell death in human cervical carcinoma cells. Toxicol. in Vitro 20: 217–226.

Jakopec S., Dubravčić K., Brozović A., Polanc S., Osmak M.(2006,a): Structurally similar

diazenes exhibit significantly different biological activity. Cell Biol. Toxicol. 22: 61–71.

Katzung, B.G., Masters, S.B., Trevor, A.J. (2011): Temeljna i klinička farmakologija,

Jedanaesto izdanje, Zagreb, Medicinska naklada.

Kelly P.N., Strasser A. (2011): The role of Bcl-2 and its pro-survival relatives in

tumourigenesis and cancer therapy. Cell Death Differ. 18: 1414–1424.

Köberle B., Tomicic M. T., Usanova S., Kaina B. (2010): Cisplatin resistance: Preclinical

findings and clinical implications. Biochim. Biophys. Acta 1806: 172–182.

37

Kroemer G., Galluzzi L., Vandenabeele P., Abrams J., Alnemri E.S., Baehrecke

E.H., Blagosklonny M.V., El-Deiry W.S., Golstein P., Green D.R., Hengartner M., Knight

R.A.,Kumar S., Lipton S.A., Malorni W., Nuñez G., Peter M.E., Tschopp J., Yuan

J., Piacentini M., Zhivotovsky B., Melino G. (2009): Classification of cell death:

recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ. 16:

3-11.

Martin-Kleiner I., Bombek S., Košmrlj J., Čupić B., Čimbora-Zovko T., Jakopec S., Polanc

S, Osmak M, Gabrilovac J. (2007) Selective cytotoxicity of diazenecarboxamides towards

human leukemic cell lines. Toxicol. in Vitro. 8:1453-1459.

Meister A. (1995): Glutathione metabolism. Method. Enzym. 251: 3–7.

Mickisch G., Fajta S., Keilhauer G., Schlick E., Tschada R., Alken P. (1990):

Chemosensitivity testing of primary human renal cell carcinoma by a tetrazolium based

microculture assay (MTT). Urol. Res. 18: 131-136.

Moskatelo D., Polanc S., Košmrlj J., Vuković L., M. Osmak (2002): Diazenecarboxamide

UP-91, a potential anticancer agent, acts by reducing cellular glutathione content. Pharmacol.

Toxicol. 91: 258–263.

Moskatelo D., Benjak A., Laketa V., Polanc S., Košmrlj J., Osmak M. (2002,a): Cytotoxic

effects of diazenes on tumor cells in vitro. Chemother. 48: 36–41.

Mršić-Krmpotić Z., Roth A. i sur. (2004): Internistička onkologija, Medicinska naklada

Zagreb, Zagreb

Osmak M., Bizjak L., Jernej,B., Kapitanović S. (1995): Characterization of carboplatin-

resistant sublines derived from human larynx carcinoma cells. Mutat. Res. 347: 141-150.

Osmak M., Bordukalo T., Jernej B., Košmrlj J., Polanc S. (1999): Diazene JK-279: potential

anticancer drug. Anti-Cancer Drugs. 10: 853–859.

38

Osmak M., Bordukalo T., Košmrlj J., Kvajo M., Marijanović Z., Eljuga D., Polanc S.

(1999,a): Diazenes: modificators of tumor cell resistance to cisplatin. Neoplasma 46: 201–

206.

Osmak M., Bordukalo T., Ambriović Ristov A., Jernej B., Košmrlj J., Polanc S. (2000):

Diazenes as potential modificators of drug-resistance in tumor cells. Neoplasma 47: 390–395.

Perona R.(2006): Cell signalling: growth factors and tyrosine kinase receptors. Clin. Transl.

Oncol. 8: 77-82.

Polanc S., Osmak M., Gabrilovac J. (2007): Selective cytotoxicity of diazenecarboxamides

towards human leukemic cell lines. Toxicol. in Vitro. 21: 1453–1459.

Prives C., Vousden K. H. (2009): Blinded by the light: the growing complexity of p53. Cell.

137: 413–431.

Rak S., Čimbora-Zovko T., Gajski G., Dubravčić K., Domijan A., Delaš I., Garaj-Vrhovac V.,

Batinić D., Sorić J., Osmak M. (2013): Carboplatin resistant human laryngeal carcinoma cells

are cross resistant to curcumin due to reduced curcumin accumulation. Toxicol. in Vitro. 27:

523-532.

Rodriguez-Nieto S., Zhivotovsky B.(2006): Role of alterations in the apoptotic machinery in

sensitivity of cancer cells to treatment. Curr. Pharm. Des. 12: 4411-442.

Saini R. K., Chauhan R., Bagri L. P. and Bajpai A. K. (2012): Strategies of targeting tumors

and cancers. J. Cancer Res.Updates 1: 129 - 152.

Shay J.W., Wright W.E. (2000): Hayflick, his limit, and cellular ageing. Nat. Rev. Mol. Cell

Biol. 1: 72–76.

Stewart D. J. (2007): Mechanisms of resistance to cisplatin and carboplatin. Crit. Rev. Oncol.

Hematol. 63: 12–31.

39

Taylor R.C., Cullen S.P., Martin S.J. (2008): Apoptosis: controlled demolition at the cellular

level. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9: 231–241.

Vousden, K.H. (2000): P53: Death star. Cell. 103: 691–694.

Weinberg R.A. (1995). The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81:323–330.

White A.C., Thannickla V.J., Fanburg B.L. (1994): Glutathione deficiency in human disease

J. Nutr. Biochem. 5: 218-226.

Zhang K., Mack P., Wong K. P. (1998): Glutathione-related mechanisms in cellular

resistance to anticancer drugs. Int. J. Oncol. 12: 871-882.

Zhou S., Zhao L., Kuang M., Zhang B., Liang Z., Yi T., Wei Y., Zhao X. (2012): Autophagy

in tumorigenesis and cancer therapy: Dr. Jekyll or Mr. Hyde?. Cancer Lett. 323: 115–127.