sadržaj - andragog.hr · stranica 5 | proteinske ag. u limfnim se čvorovima zbiva imunološka...

S t r a n i c a 1 |

Sadržaj

HEMATOPOEZA................................................................................................................... 4

HEMATOPOETSKI ORGANI ............................................................................................. 4

HEMATOPOEZNE MATIČNE STANICE............................................................................ 5

KONTROLA HEMATOPOEZE – HEMATOPOETSKI FAKTORI RASTA............................ 7

ERITROCITI.......................................................................................................................... 8

HEMOGLOBIN .................................................................................................................10

ŽELJEZO (BM 2012;22:311-28)........................................................................................13

VITAMIN B12 I FOLNA KISELINA ....................................................................................17

LEUKOCITI ..........................................................................................................................20

GRANULOCITI..............................................................................................................20

MONOCITI ....................................................................................................................21

LIMFOCITI ....................................................................................................................23

ANTIGENI I ANTITIJELA ..................................................................................................28

Sustav komplementa.....................................................................................................29

TROMBOCITI.......................................................................................................................31

POREMEĆAJI TROMBOCITA..........................................................................................32

KVANTITATIVNI POREMEĆAJI TROMBOCITA...............................................................32

KVALITATIVNI (FUNKCIONALNI) POREMEĆAJI TROMBOCITA....................................35

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA NASLJEDNIH POREMEĆAJA TROMBOCITA ......39

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA TROMBOCITA (članak)................41

ANEMIJE..............................................................................................................................48

KLASIFIKACIJA ANEMIJA................................................................................................48

Smanjeno stvaranje eritrocita (poremećaj proliferacije i maturacije) ..............................48

Ubrzano propadanje eritrocita (poremećaj preživljenja) .................................................49

Gubitak eritrocita (poremećaj preživljenja).....................................................................49

Makrocitna anemija .......................................................................................................49

Normocitna anemija ......................................................................................................50

Mikrocitna anemija ........................................................................................................50

S t r a n i c a 2 |

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA ANEMIJA...............................................................50

1. HIPOPROLIFERACIJSKE ANEMIJE ........................................................................54

Aplastična anemija ........................................................................................................55

2. ANEMIJE ZBOG POREMEĆAJA SAZRIJEVANJA...................................................58

Hemoglobinopatije.........................................................................................................63

Talasemije.....................................................................................................................65

Poremećaji u sazrijevanju jezgre ...................................................................................69

3. ANEMIJE ZBOG SKRAĆENOG ŽIVOTNOG VIJEKA ERITROCITA U KRVOTOKU ....72

Hemolitičke anemije ......................................................................................................72

Hereditarna sferocitoza (HS) .........................................................................................76

Hereditarna eliptocitoza (HE).........................................................................................79

Hereditarna piropoikilocitoza .........................................................................................80

Hereditarna stomatocitoza.............................................................................................80

Akantocitoza..................................................................................................................81

Deficit enzima glukoza-6-fosfat dehidrogenaze (G6P-DH) .............................................81

Deficit enzima piruvat kinaze.........................................................................................82

Imunosne hemolitičke anemije ......................................................................................82

HEMOLITIČKA BOLEST FETUSA I NOVOROĐENČETA.............................................83

AUTOMATSKI HEMATOLOŠKI ANALIZATORI ...................................................................84

Principi analize..................................................................................................................84

SUMNJIVI REZULTATI DOBIVENI AUTOMATSKIM HEMATOLOŠKIM ANALIZATORIMA.........................................................................................................................................87

1. Leukociti ....................................................................................................................87

2. Hemoglobin, eritrociti, eritrocitne konstante ...............................................................88

3. Trombociti .................................................................................................................89

BENIGNE BOLESTI LEUKOCITA ........................................................................................91

LEUKEMIJE .........................................................................................................................92

Laboratorijske tehnike u dijagnozi i klasifikaciji neoplazmi ................................................93

MIJELOPROLIFERATIVNE NEOPLAZME (MPD).........................................................94

AKUTNE MIJELOIČNE LEUKEMIJE...........................................................................100

S t r a n i c a 3 |

AKUTNE LIMFATIČNE LEUKEMIJE...........................................................................103

LIMFOIDNE NEOPLAZME..........................................................................................103

WHO klasifikacija mijeloidnih neoplazmi i akutnih leukemija ...........................................108

WHO klasifikacija limfoidnih neoplazmi ...........................................................................110

KOAGULACIJA ..................................................................................................................114

Modeli zgrušavanja: ....................................................................................................114

STANIČNI MODEL HEMOSTAZE...............................................................................116

ULOGA ENDOTELNIH STANICA ...............................................................................121

FIBRINOLIZA (ELIMINACIJSKA FAZA) ......................................................................123

UNUTRAŠNJI PUT KOAGULACIJE............................................................................124

VANJSKI PUT KOAGULACIJE ...................................................................................125

ZAJEDNIČKI PUT KOAGULACIJE..............................................................................126

FIBRINOLIZA ..............................................................................................................127

FIZIOLOŠKA KONTROLA HEMOSTAZE....................................................................130

METODE U LABORATORIJSKOJ KOAGULACIJI..........................................................132

PREDANALITIKA U LABORATORIJSKOJ KOAGULACIJI .........................................132

METODE U LABORATORIJSKOJ KOAGULACIJI ......................................................136

DIJAGNOSTIČKA HEMOSTAZA ................................................................................139

NASLJEDNI I STEČENI ČIMBENICI TROMBOFILIJE....................................................143

NASLJEDNA TROMBOFILIJA ....................................................................................144

S t r a n i c a 4 |

HEMATOPOEZA

Hematopoeza je proces sinteze krvnih stanica iz prekursorskih stanica koje su prisutne u koštanoj srži. Regulirana je nizom citokina (stimulirajući i inhibirajući čimbenici rasta) i događa se u specijaliziranom mikrookolišu koji dodatno regulira proces hematopoeze.

HEMATOPOETSKI ORGANI Hematopoeza započinje 18. dana nakon oplodnje u žumanjčanoj vrečici. U trećem mjesecu fetalnog života jetra preuzima glavnu ulogu u hematopoezi (sinteza eritroidnih, mijeloidnih i limfoidnih stanica). Oko 6. gestacijskog mjeseca hematopoeza se premješta u koštanu srž, koja postaje primarnim hematopoetskim organom. Od kasnog fetalnog razdoblja pa do kraja djetinjstva se u timusu zadržava sinteza T limfocita. Hematopoetski organi su oni u kojima se događaju procesi proliferacije, sazrijevanja i destrukcije krvnih stanica. To su koštana srž (KS), timus, slezena i limfni čvorovi. U KS se razvijaju mijeloidna, eritroidna, megakariocitna i limfoidna linija. Timus, slezena i limfni čvorovi su mjesta razvoja stanica prvenstveno limfoidne linije. Limfoidna se tkiva dodatno dijele na primarna (KS i timus; sazrijevanje T i B stanica do imunokompetentnih stanica) i sekundarna limfoidna tkiva (slezena i limfni čvorovi; imunokompetentne T i B stanice dalje sazrijevaju i dijele se kao odgovor na antigene). U odrasle osobe se KS sastoji od masnog tkiva („žute srži“) i hematopoetskog tkiva („crvene srži“). Crvena se srž zadržava u kralješcima, lubanji, prsnoj kosti, zdjeličnim kostima i u epifizama dugih kostiju. Mikrookoliš KS u kostima čine venski sinusi i stanice strome smještene u koštanim lamelama (supstantia spongiosa). Stanice mikrookoliša (strome) sudjeluju u hematopoezi na 2 načina: potiču matične hematopoetske stanice na diferencijaciju i proliferaciju, te luče hematopoetske faktore rasta. Diferencijacija je proces kojim se stvaraju različite stanične populacije sa specifičnim funkcijama u organizmu. U procesu diferencijacije se iz inicijalno ekvivalentnih stanica stvaraju stanice sa različitim svojstvima – usmjeravaju se u različite razvojne putove. Organ u kojem sazrijevaju limfociti T je timus. Iz nezrelih T limfocita koji se nalaze u korteksu timusa, putujući prema meduli sazrijevaju pomočnički (CD4) i supresorsko-citotoksični limfociti T (CD8). Slezena je sposobna stvarati eritroidne, megakariocitne, monocitno-makrofagne i limfoidne stanice. Važan je organ u kojem se odstranjuju manje vrijedni i ostajeli eritrociti, bakterije i druge čestice iz cirkulacije. Pojačana funkcija slezene (hipersplenizam) praćena je citopenijom. Služi kao skladište krvnih stanica (1/3 trombocita se nalazi u slezeni). Limfni čvorovi djeluju kao filtri i ima ih po cijelom tijelu uzduž limfnih žila. Dendritične stanice predočuju antigen limfocitima B koji onda proliferiraju i sazrijevaju u plazma stanice i izlučuju specifična At. Limfociti T omogućuju imunološku reakciju na

S t r a n i c a 5 |

proteinske Ag. U limfnim se čvorovima zbiva imunološka reakcija na Ag iz limfne cirkulacije.

HEMATOPOEZNE MATIČNE STANICE Stanice koje cirkuliraju u perifernoj krvi su krajnje (terminalno) diferencirane, nemaju sposobnost umnažanja (mitoze) i imaju ograničen životni vijek. Konstantno uklanjanje cirkulirajućih stanica apoptozom znači da se one moraju zamijeniti novim stanicama, i to iz prekursorskih stanica smještenih pretežno u koštanoj srži. Te prekursorske stanice su organizirane hijerarhijski i imaju ogroman proliferativni potencijal. Hematopoetske matične stanice su najnezrelije (najnediferenciranije) prekursorske stanice, predstavljaju 0.5% stanica s jezgrom u koštanoj srži, njihovom proliferacijom i diferencijacijom mogu nastati sve hematopoetske stanice. Nazivaju se i multipotentne (pluripotentne) matične stanice jer iz njih mogu nastati sve loze krvnih stanica (mijeloidna i limfoidna). Osim toga, imaju sposobnost samoobnavljati se (replicirati). Većina ih se nalazi u G0 fazi (mirovanju). Nisu morfološki prepoznatljive. Iz ishodišne pluripotentne matične stanice nastaje diferencijacijom multipotentna mijeloidna i limfoidna matična stanica, a iz njih daljnjom diferencijacijom i sazrijevanjem nastaju usmjerene prethodne nezrele stanice: CFU-GEMM (granulocyte, erytrocyte, macrophage and megakaryocyte) i CFU-TNK odnosno CFU-B, stanice koje postupno gube multipotentnost i usmjeravaju se na jedinstvenu staničnu liniju (granulociti, eritrociti, monociti, trombociti, limfociti). Nemaju sposobnost samoobnavljanja već njihovo sazrijevanje završava terminalno diferenciranim krvnim stanicama sa ograničenim životnim vijekom. Nisu morfološki prepoznatljive, ali su mitotički vrlo aktivne stanice.

S t r a n i c a 6 |

Matičnu je stanicu moguće odrediti funkcionalnim testovima ili određivanjem površinskih biljega (fenotipa, i to protočnom citometrijom). U točno određenim uvjetima se in vitro uz dodatak faktora rasta iz matične stanice mogu stvoriti kolonije zrelih stanica različitih hematopoetskih loza (CFU-GEMM test). Na površini ishodišnih matičnih stanica prisutan je biljeg CD34 i receptor SCF (stem cell factor, faktor rasta matičnih stanica), dok su one CD38 negativne (to je biljeg nezrelih limfoidnih stanica). Matične stanice se danas upotrebljavaju u liječenju transplantacijom, i to kod zloćudnih tumorskih bolesti koštane srži ili slabosti njezine funkcije, te kod nasljednih bolesti hematopoetskog sustava. Kao izvorište matičnih stanica koristi se KS,

S t r a n i c a 7 |

određenim se postupcima potiče njihov izlazak u krv te se onda leukoferezom prikuplja dovoljan broj matičnih stanica za liječenje. Krv iz pupkovine je dodatan izvor matičnih stanica. Najranija stanica iz pojedine loze koja se može morfološki prepoznati označava se sufiksom –blast (limfoblast, mijeloblast, megakarioblast).

KONTROLA HEMATOPOEZE – HEMATOPOETSKI FAKTORI RASTA Hematopoetski čimbenici rasta ili citokini su glikoproteini koji specifično i učinkovito upravljaju hematopoezom (preživljenjem prekursorskih stanica, samoobnavljanjem, proliferacijom, diferencijacijom). Radi se o glikoproteinima čija je uloga kompleksna međustanična komunikacija. Prvi prepoznati čimbenici rasta bili su CSFs (colony stimulating factors) jer su podržavali rast kolonija hematopoetskih stanica in vitro. Naknadno, kako ih se sve više otkrivalo, nomenklatura im je promijenjena u interleukine, pa tako danas imamo oko 30 ILs, koji imaju neurednu nomenklaturu (GM-CSF, G-CSF, EPO, TPO, kit-ligand/SCF, Flt3 ligand/FL itd.). Uloga čimbenika rasta je višestruka: potiču preživljavanje stanice supresijom apoptoze, potiču proliferaciju stanice, kontroliraju i reguliraju proces diferencijacije, kojim u konačnici nastaju zrele funkcionalne stanice iz multipotentnih progenitornih prekursorskih stanica. Karakteristike čimbenika rasta

1. Sintetiziraju ih različite stanice (monociti, makrofagi, aktivirani T limfociti, fibroblasti, endotelne stanice, osteoblasti, adipociti); jedina je iznimka eritropoetin (Epo) koji se sintetizira u bubregu i krvlju prenosi do koštane srži gdje potiče eritropoezu, on se smatra pravim hormonom (endokrini citokin)

2. Većina citokina djeluje lokalno (osim Epo), mogu djelovati autokrino, parakrino, endokrino

3. Pleiotropni su: jedan čimbenik rasta može imati višestruke biološke funkcije ovisno o ciljnoj stanici na koju djeluje

4. Redundantni su; nisu specifični za staničnu liniju, različiti citokini mogu djelovati slično ili isto

5. Kako bi ostvarili svoju funkciju moraju se vezati za receptore na površini ciljne stanice, obično je potrebno usklađeno djelovanje više citokina odjednom, čime se postiže amplifikacija signala.

Rani čimbenici rasta djeluju na multipotentne prekursorske stanice, stoga potiču proliferaciju stanica iz više linija. Kasniji čimbenici rasta potiču sazrijevanje unutar specifične stanične linije. Nisu specifični za staničnu liniju, ali pokazuju svoj učinak pretežno samo na prekursorskoj stanici jedne linije. Treba spomenuti i negativne regulatore hematopoeze koji inhibiraju staničnu proliferaciju. U tu skupinu se ubrajaju interferoni, TGF-ß, TNF-α, prostaglandini E i dr.

S t r a n i c a 8 |

ERITROCITI

Eritrocitopoeza je proces kojim se sintetiziraju eritrociti kako bi se njihov broj održao stalnim u perifernoj krvi. Životni vijek eritrocita je 120 dana, njihovu sintezu stimulira EPO. Stari se eritrociti uklanjaju fagocitozom u mononuklearnim stanicama jetre, slezene i KS. Stvaranje eritrocita započinje iz pluripotentne matične stanice. Njenom diferencijacijom nastaje unipotentna eritroidna progenitorna stanica, koja se sastoji od dvije populacije stanica (koje se ne mogu prepoznati pod mikroskopom, ali se prepoznaju po svojstvima u staničnim kulturama):

1. BFU-E (burst forming unit - erythroid ) i 2. CFU-E (colony forming unit - erythroid).

Sazrijevanjem BFU-E nastaju CFU-E progenitorne stanice. Najznačajnija je razlika među njima ta što CFU-E imaju visoku razinu receptora za EPO na površini stanice, te se upravo one smatraju najranijim eritroidnim prekursorom proeritroblasta (prvi koji se može morfološki prepoznati). BFU-E stanice su CD34+, dok CFU-E gube tu pozitivnost, a ispoljavaju površinske biljege eritroidne loze: glikoforin A, Rh antigene i ABH antigene.

U KS se mogu morfološki prepoznati eritroidne stanice u procesu sazrijevanja: nukleirani eritrocitni prekursori koji se skupno nazivaju eritroblasti. 6 je morfološki prepoznatljivih stadija sazrijevanja u KS:

1. Proeritroblast – najraniji prekursor eritrocita koji je morfološki prepoznatljiv, velika stanica sa velikom jezgrom koja sadrži nukleole (zauzima oko 80% stanice), rijedak je u KS; citoplazma mu je izrazito bazofilna sa ponekad prisutnom blijedom zonom uz jezgru (perinuklearni halo).

2. Bazofilni eritroblast – sličan proeritroblastu, manji je veličinom i sadrži manju jezgru; citoplazma je nešto svjetlija zbog manjeg sadržaja hemoglobina, može se vidjeti perinuklearni halo; kromatin je nešto grublji i izrazito ljubičast. Počinje se stvarati hemoglobin.

3. Polikromatofilni eritroblast – opet manja stanica od bazofilnog eritroblasta, sa smanjenom jezgrom i obilnijom sivo-plavom citoplazmom (velike količine hemoglobina, manje je RNA).

S t r a n i c a 9 |

4. Acidofilni eritroblast – mala stanica sa malim omjerom jezgra/citoplazma (to je onaj kojeg najčešće vidimo u razmazu), citoplazma je ružičasta, s malo plavičastih zona zaostale RNA; kromatin u jezgri je kondenziran, jezgra piknotična (ne vide se strukture u njoj) ili fragmentirana, priprema se da bude izbačena iz stanice.

5. Retikulocit – mladi RBC sa ostacima RNA u obliku mrežice, ali bez jezgre; oko 80% hemoglobina se sintetizira u fazi eritroblasta, a samo 20% u fazi retikulocita; otpušta se iz KS u perifernu krv gdje sazrijeva još 1-2 dana (bojenje briljant krezilnim modrilom, dolazi do precipitacije RNA i mitohondrija); do 3% retikulocita u zdrave odrasle osobe.

6. Zreli RBC – bikonkavna pločica, volumena 80-100 fL, boji se ružičasto zbog sadržaja hemoglobina.

Proces sazrijevanja uključuje postepeno smanjivanje veličine stanice sa progresivnom kondenzacijom kromatina u jezgri i konačnim izbacivanjem piknotične jezgre. Citoplazma se u mlađih stanica boji bazofilno (ljubičasto) zbog prevladavanja RNA. Sazrijevanjem se povećava sinteza hemoglobina koji uvjetuje acidofilno (ružičasto) bojenje citoplazme. Generacijsko vrijeme eritrocitopoeze je 3-5 dana. Epo je jedini bitni citokin u regulaciji posljednjih faza sazrijevanja eritrocita. To je glikoprotein koji se stvara u bubrezima, a najjači poticaj za njegovu sintezu je hipoksija u bubrežnom tkivu. Epo povećava broj BFU-E i CFU-E. Određuje se rutinski, T1/2 mu je 6-9 sati. Za normalnu eritrocitopoezu potrebni su i metali (želježo, kobalt), vitamini (B12, folat, vitamin C), ak te drugi faktori rasta. Njihov manjak obično dovodi do anemije. Eritrociti su bikonkavne pločice koje lako polaze kroz perifernu mikrocirkulaciju, fenestracije u venskim sinusima koštane srži i slezene. Eritrocit se sastoji od membrane, metaboličkih ciklusa, vode i hemoglobina. Sastav eritrocitne membrane Po sastavu je kompleks bipolarnog fosfolipidnog dvosloja i (gliko)proteina. Promjene u strukturi ili sastavu membrane mogu dovesti do gubitka njene funkcije i prerane smrti stanice (obzirom da zreli RBC nemaju organele i enzime za sintezu novih lipida i proteina). Lipidni se dio sastoji od fosfolipida, kolesterola i glikolipida. Glavni su fosfolipidi: fosfatidilkolin (PC), fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilserin (PS) i sfingomijelin (SM). Proteini su integralni (transportni – Band 3 i glikoforini) ili periferni (sa citoplazmatske strane, spektrin, ankirin, aktin, odgovorni za bikonkavan oblik Erc). Najvažniji metabolički putovi u RBC-u su:

1. anaerobna glikoliza (stvara se ATP za održavanje oblika i fleksibilnosti Erc; te NADH – sudjeluje u redukciji metHb uz methemoglobin reduktazu u reducirani Hb - održava hem u reduciranom obliku, Fe2+; i 2,3-DPG koji regulira afinitet Hb za kisik),

2. heksoza-monofosfatni shunt (stvara se reducirajući spojev NADPH – koenzim glutation reduktaze, održava glutation u reduciranom obliku GSH, a on održava SH skupine na Hb i enzimima na membrani u aktivnom reduciranom obliku).

Eritrocitna membrana je ključna za razvoj i funkciju eritrocita. Ključna su njena osmotska svojstva (Erc bubre u hipotoničnim otopinama) i selektivna permeabilnost membrane, njena antigena svojstva, receptori za EPO i transferin tijekom sazrijevanja eritroblasta, izmjena bikarbonata i kloridnih iona – pufersko djelovanje.

S t r a n i c a 10 |

Odgovorna je i za fleksibilnost RBC koja je potrebna za preživljavanje u cirkulaciji 120 dana. Eritrocitna je membrana propusna za vodu i anione, ali nije propusna za mono- i divalentne katione (niska koncentracija Ca2+ i Na+, te visoka K+ u RBC-u se održava preko kationskih pumpi). Glukoza se preko transportera olakšanom difuzijom prenosi u stanicu.

HEMOGLOBIN Tetramer sastavljen od 4 globularne podjedinice. Svaka od tih podjedinica se sastoji od prostetičke skupine hema i globinskog lanca. Hem je tetrapirolni prsten sa ugrađenim željezom. Svaka podjedinica hema može prenositi jednu molekulu kisika. SINTEZA HEMOGLOBINA Sinteza hema Građen od prstena protoporfirina IX u koji je ugrađeno Fe2+. Sinteza hema započinje u mitohondrijima eritroblasta. ALA sintetaza katalizira kondenzaciju glicina i sukcinil-CoA čime nastaje delta-aminolevulinsku kiselinu (ALA). Ova je reakcija ograničavajuća (rate limiting), sinteza hema se događa samo u prisutnosti dovoljnih rezervi željeza u stanici. Dvije ALA molekule u prisutnosti ALA dehidrataze stvaraju porfobilinogen. Četiri molekule porfobilinogena, uz porfobilinogen deaminazu i uroporfirinogen-kosintetazu, stvaraju uropofirinogen III, pa dalje pod utjecajem uroporfirinogen-dekarboksilaze koproporfirinogen III. U prisutnosti koproporfirinogen-oksidaze koproporfirinogen III prelazi u protoporfirinogen IX, te uz protoporfirinogen-oksidazu nastaje protoporfirin IX koji se djelovanjem hem sintaze veže sa 4 atoma željeza čime nastaje hem.

Svi stadiji eritrocitopoeze koji sadrže mitohondrije mogu stvarati hem (do stadija retikulocita). Ali, u eritrocitu se više ne sintetizira hem!. Vidi biokemiju Hemoglobin (i porfirije). Sinteza globina Odigrava se na poliribosomima u citoplazmi ranih eritroblasta. Stvara se u prisutnosti mRNA, koja se potpuno gubi tijekom razvoja stanice, pa se kao ostatak vidi u retikulocitima: (substantia granulofilamentosa) ili polikromatofilija Erc. Globin se sastoji od 4 polipeptidna lanca, međusobno spojena peptidnom vezom. Ukupno 8 genetskih lokusa stvara 6 polipeptidnih globinskih lanaca:

• dva se nalaze samo tijekom embrionalnog razvoja (zeta i epsilon) • četiri tijekom fetalnog razvoja i nakon rođenja (alfa, beta, gama, delta).


Odrasla osoba ima 95% HbA (2α2β), 2% HbF(2α2γ) i HbA2 (2α2δ). Kod rođenja novorođenče ima najviše HbF, ovaj opada u korist HbA koji doseže vrijednosti odraslih do prve godine života.

Stadij Hemoglobin Lanci Postotak Gower 1 Zeta + epsilon Gower 2 Alfa + epsilon

Embrij

Portland Zeta + gama Fetalni, HbF Alfa + gama 60 – 90 Fetus Adultni, HbA Alfa + beta 10 – 40 Adultni, HbA Alfa + beta 95 Adultni, HbA2 Alfa + delta 3,5

Odrasli

Fetalni, HbF Alfa + gama 1 – 2 FUNKCIJA HEMOGLOBINA Omogućuje unutarnje disanje, prenosi kisik iz pluća u tkiva i CO2 iz tkiva u pluća. Normalan afinitet prema kisiku uvjetovan je prisutnošću nejednakih globinskih lanaca u Hb. Hemoglobini sa istim lancima (Hb Barth – 4gama, HbH – beta4) imaju visok afinitet prema kisiku, pa su stoga funcionalno neupotrebljivi. Oksigenacija i deosigenacija hemoglobina mogu se prikazati krivuljom disocijacije kisika. KRIVULJA DISOCIJACIJE KISIKA Disocijacija kisika ovisi o pH krvi, koncentraciji 2,3-DPG i temperaturi.

Ako je pH snižen (acidoza) ili je povećana koncentracija 2,3-DPG, smanjuje se afinitet Hb za kisik, krivulja je pomaknuta udesno i više se kisika predaje tkivima. Obratno, ako je prisutna alkaloza (povećan je pH) i snižena koncentracije 2,3-DPG, povećava se afinitet Hb za kisik, pa se manje kisika predaje tkivma kod istog pO2. Promjena disocijacijske krivulje pod utjecajem pH naziva se Bohrov efekt. 2,3-DPG podupire deoksigenaciju, veže među lance deoksiHb i stabilizira ovaj konformacijski oblik. Razgradnja Hb se odigrava u stanicama monocitno-makrofagnog sustava. Prvo se Hb razgrađuje na hem i globin, iz hema se oslobađa željezo, a onda se


protoporfirinski prsten uz hem oksidazu oksidira u biliverdin, a ovaj reducira u bilirubin uz pomoć biliverdin reduktaze.

Oslobođeno se željezo reciklira i pohranjuje kao rezervno (feritin, hemosiderin). Za metabolizam bilirubina vidi Jetru. Prijenos CO2 Nakon što se storio u metaboličkim procesima u tkivima, CO2 se trima mehanizmima prenosi do pluća:

1. jedan dio kao otopljeni CO2 u plazmi 2. jedan dio kao karbamino-hemoglobin, vezujući se za N-terminalne amino

skupine 4 globinska lanca 3. a najveći dio u obliku bikarbonata.

Ulaskom CO2 u eritrocite, a u pristunosti eritrocitne karboanhidraze, CO2 reagira sa H2O stvarajući bikarbonatni anion i H+. Stvoreni se proton puferira vezanjem za deoksiHb, dok bikarbonati difundiraju iz Erc u plazmu. Na njihovo mjesto, kako bi se održala elektroneutralnost, u Erc ulaze kloridni ioni – taj se fenomen naziva pomakom klorida. Stečeni oblici nefunkcionalnog Hb Methemoglobin nastaje oksidacijom Fe2+ iz hema u Fe3+. Ne može vezati kisik, stoga dolazi do smanjenog kapaciteta vezanja kisika, ali uzrokuje i povećan afinitet vezanja kisika preostalih hema u Hb. Normalno se autoksidacijom stvara manje od 1.5% metHb dnevno. Za redukciju tako stvorenog metHb odgovorni su prvenstveno NADH metHb reduktaza, askorbinska kiselina, glutation i NADPH metHb reduktaza. Koncentracije se metHb povećavaju kada je organizam izložen oksidirajućim kemijskim supstancama i lijekovima. Cijanoza se razvija kod koncentracija metHb oko 10%, dok hipoksija nastupa kada su koncentracije metHb oko 40%. Antidot: metilensko plavilo ili askorbinska kiselina. Određuje se spektrofotometrijski, maksimum apsorpcije na 630 nm. Sulfhemoglobin Karboksihemoglobin nastaje prilikom izloženosti organizma CO. Afinitet vezanja CO za Hb je oko 200 puta veći od afiniteta vezanja kisika. Smanjen je prijenos kisika, ali i


otpuštanje O2 iz normalnog hema. Normalno se u krvi nalaze manje koncentracije karboksiHb koje nastaju prilikom razgradnje hema, a koncentracije karboksiHb su povećane i kod pušanja u odnosu na nepušače (do 10%). Akutna karboksiHb-emija uzrokuje nepovratno oštećenja tkiva i smrt od anoksije. Kronična izloženost dovodi do policitemije. Određuje se spektrofotometrijski, apsorpcijski maskimum na 541 nm.

ŽELJEZO (BM 2012;22:311-28) RASPODJELA Fe U ORGANIZMU Oko dvije trećine željeza pohranjuje se u Hb. Gotovo trećina željeza nalazi se u rezervama u skladištima u monocitno-makrofagnom sustavu prvenstveno jetre, koštane srži i slezene (u obliku feritina i hemosiderina). Mali dio željeza (oko 4%) nalazi se u mišićima ugrađeno u mioglobin, a ostatak u raznim enzimima (katalazama, perkosidazama, citokromima, ksantin-oksidazi i sl. ). Suvišak Fe može u organizmu biti potencijalno toksičan, jer višak Fe uzrokuje stvaranje oksidativnog stresa. Dakle, Fe je u organizmu pohranjeno u jetri u hepatocitima i Kupfferovim stanicama u obliku feritina i hemosiderina. Kada stanično Fe prelazi potrebe stanice, ono se pohranjuje u obliku feritina (bioraspoloživ oblik), i tako se stanice štite od potencijalno toksičnih reakcija kataliziranih Fe-om. Feritin ima skladišnu i detoksifikacijsku funkciju. Fe uskladišteno u feritinu koristi se kod povećane potrebe stanice za Fe-om. Iako se većina feritina nalazi unutar stanice, mala koncentracija feritina ulazi u cirkulaciju aktivnim izlučivanjem kroz lizosomalni put. Plazmatski feritin gotovo ne sadrži Fe i smatra se da je njegova biološka funkcija uklanajnje slobodnog Fe-a iz cirkulacije ili kao medijator upale. Koncentracija plazmatskog feritina koristi se kao koristan pokazatelj rezervi Fe-a. Hemosiderin je netopljivi degradacijski produkt nepotpune razgradnje feritina u lizosomima. Kod preopterećenja Fe-om, hemosiderin postaje dominantno skladište Fe-a. u fiziološkim uvjetima hemosiderin nije efektivan donor Fe-a, ali ima protektivnu ulogu. U uvjetima hipoksije i upale može postati donorom Fe-a i tako promovirati stvaranje ROS i oštećenje tkiva u kojima se Fe nakuplja. APSORPCIJA Fe-a Organizam ne stvara željezo i zato ga je potrebno unositi hranom. Nema poznatog reguliranog puta izlučivanja Fe-a, stoga je sadržaj željeza u organizmu reguliran precizno kontroliranom crijevnom apsorpcijom. Crijevna mukoza reagira na promjene u tjelesnim rezervama željeza, na tkivnu hipoksiju i na potražnju za Fe, te je prema tome odgovorna za regulaciju apsorpcije. U stanjima manjka Fe apsorpcija je povećana, i obratno. Gubici željeza se javljaju u epitelu kože, stanicama crijeva i crijevnim izlučevinama. Žena u reproduktivnoj dobi gubi dvostruko više Fe od muškarca zbog menstrualnih krvarenja prilikom trudnoće i poroda. Gubitak Fe je kod zdravih osoba kompenziran apsorpcijom iz hrane. Potrebe za željezom se povećavaju tijekom adolescencije (rast) i trudnoće (povećanje volumena krvi i rast fetusa). Prehranom čovjek unosi željezo u dva oblika: kao anorgansko Fe (90%) i kao hemsko Fe. Iako je hemsko Fe manje zastupljeno u hrani, ono je bioraspoloživi oblik Fe-a, a njegova je apsorpcija učinkovitija u odnosu na anorgansko Fe koje je pod utjecajem ostalih sastojaka hrane. Apsorpcija Fe je složen proces koji se odvija u dvanaesniku i gornjem dijelu jejunuma. Uključuje:


� proteine koji transportiraju Fe kroz apikalnu membranu (importeri) � proteine koji transportiraju Fe kroz bazolateralnu membranu enterocita

(eksporteri) � proteine koji mijenjaju redoks-status Fe i time pospješuju njegov transport.

Većina anorganskog Fe u hrani je u feri obliku (3+). Takvo, oksidirano željezo, se ne može apsorbirati, već se prvo mora reducirati u dvovalentno, fero-željezo. To se postiže djelovanjem feri-reduktaze iz četkaste prevlake dvanaesnika (citokroma D). Fero željezo se zatim veže za transporter DMT1 (divalent metal transporter) i transportira u stanicu. DMT1 nije specifičan transporter za Fe, već regulia transport i ostalih dvovalentnih metalnih kationa kao Zn, Mn, Cu, iako mu je transport Fe primarna fiziološka uloga. Hemsko željezo apsorbira se u enterocite ugrađeno u hem preko proteina HCP1 – transportnog proteina izraženog u velikim količinama u dvanaesniku. Unutar stanice se Fe otpušta iz protoporfirinskog prstena djelovanjem hem-oksigenaze (HOX1) i utapa u citosolni pool Fe u enterocitima. Čini se da je katalitičko djelovanje HOX1 ograničavajući faktor u apsorpciji hemskog Fe-a. Nakon ulaska Fe-a u enterocite kroz apikalnu membranu, željezo se može:

� odlagati u obliku feritina � trasportirati u cirkulaciju preko bazolateralne membrane.

Željezo koje se iz enterocita ne prenese u plazmu, gubi se ljuštenjem crijevnog epitela. Stoga, transportom Fe-a preko proteina feroportina I kroz bazolateralnu membranu utvrđuje se hoće li se Fe dopremiti u cirkulaciju ili eliminirati iz organizma. Funkcija ovg proteina je usko povezana sa funkcijom hefestina. Fe se kroz citoplazmu enterocita transportira na dva načina: povezan sa proteinima šaperonima ili transcitozom. O ovom se koraku u apsorpciji Fe-a najmanje zna. Feroportin I na bazolateralnoj membrani enterocita je jedini poznati izvoznik Fe-a. Ovaj je protein prisutan u svim tkivima koja izvoze Fe u plazmu:

� bazolateralne membrane enterocita dvanaesnika � membrane makrofaga RES-a � hepatociti � placentarne stanice.

Bazolateralni transport Fe iz enterocita zahtjeva promjenu redoks statusa Fe uz fero-oksidazu hefestin u dvanaesniku ili ceruloplazmin u drugim djelovima tijela. Oni su


odgovorni za oksidaciju Fe iz unutarstaničnog Fe2+ u izvanstanični Fe3+. Eritroblasti na svojoj membrani izražavaju značajnu razinu feroportina I. Transferin (ili siderofilin) je plazmatski protein koji je zadužen za prijenos željeza. (samo se Fe3+ može vezati za transferin). Vezanje Fe za transferin osigurava kontrolirani transport Fe-a do svih stanica u tijelu. Transferin je serumski glikoprotein koji ima specifična vezna mjesta za Fe3+. Afinitet transferina za Fe je pri fiziološkom pH ekstremno visok, tako da je gotovo sve ne-hemsko Fe u cirkulaciji vezano za transferin. Željezo tako vezano na transferin u prvom redu odlazi u koštanu srž, gdje je potreba za njim najveća. Transferin ga predaje eritroblastima. Internalizacija Fe u stanice događa se transferinom posredovanom endocitozom u tzv. transferinskom ciklusu. Ovaj ciklus omogućuje kontrolirani ulazak Fe u stanicu, jer pojedine stanice učinkovito reguliraju unos Fe reguliranjem ekspresije TfR1 na njihovoj površini u skladu sa potrebama za Fe-om. Transferinski receptori su TfR1 i TfR2. TfR1 je izražen na nezrelima eritroidnim stanicama, stanicama koje se brzo dijele (normalne i maligne) i placentarnom tkivu. Transferin za koji je vezano Fe ima veći afinitet vezanja za TfR1 od mono- ili apo transferina. Osim TfR1 vezanih za membranu, u serumu se nalazi i topljiva forma TfR1, a ona predstavlja topljivi fragment izvanstanične domene receptora. Razina sTfR odražava dostupnost funkcionalnog Fe-a. TRANSFERINSKI CIKLUS Prilikom vezanja diferi-transferina za TfR1 na površini stanice, aktivira se klatrinom posredovano stvaranje endosoma i započinje transferinski ciklus.

Protonska pumpa na endosomu zakiseljava endosomski sadržaj i dovodi do konformacijske promjene transferina i transferinskog receptora što rezultira otpuštanjem Fe. Zatim se Fe3+ reducira u Fe2+, a ovaj se transportira kroz membranu endosoma u citoplazmu preko DMT1 transportera. Endosom putuje na površinu stanice, spaja se sa membranom i tako se TfR vraćaju na površinu membrane, a iz endosoma otpušta apotransferin. Oslobođeno željezo u eritroblastu se prenosi do mitohondrija gdje ga koristi fero-kelataza i ugrađuje u hem. U ostalim, neeritroidnim stanicama, željezo se koristi za ugradnju u ostale enzime kojima je za aktivnost potrebno ili se u rezervama (slezena, jetra) čuva vezano kao feritin ili hemosiderin.


U normalnim okolnostima ulazak transferinski vezanog Fe je glavni put ulaska Fe u stanice, ali patološko nakupljanje Fe dovodi do zasićenja transferina i pojavljivanja Fe koje nije vezano za transferin, a ono može ući u stanice preko putova neovisnih o transferinu. Sistemska homeostaza Fe regulira:

1. crijevnu apsorpciju Fe 2. ulazak i mobilizaciju Fe iz rezervi kako bi se zadovoljile potrebe eritropoeze 3. osigurava stabilan okoliš u kojem svaka stanica regulira unos Fe prema

vlastitim potrebama. Ključni regulator homeostaze Fe je jetreni hormon hepcidin, a jetra je centralni organ sistemske homeostaze Fe. Jetra sintetizira hepcidin, sintetizira transferin te pohranjuje većinu željeza. HEPCIDIN je negativni regulator metabolizma Fe. On se veže za feroportin, i na taj način potiče njegovu internalizaciju, te u konačnici i lizosomsku razgradnju ovog izvoznika Fe. Gubitak feroportina sa stanične membrane uzrokuje zadržavanje Fe u stanicama te potiskuje otpuštanje Fe s mjesta njegovog glavnog toka (makrofagi, hepatociti i enterociti → krv), smanjuje na taj način saturaciju transferina i smanjuje dostupnost Fe. Disregulacija lučenja hepcidina uzrokuje poremećaj Fe. Kod zdravih osoba povećanje rezervi Fe u organizmu dovodi do povećane ekspresije hepcidina i posljedično smanjene apsorpcije Fe. Kod bolesnika s hereditarnom hemokromatozom, zbog neadekvatne i neučinkovite hepcidinom posredovane smanjenje regulacije feroportina, apsorpcija Fe se nastavlja odvijati unatoč visokom opterećenju organizma s Fe. Najmanje je 4 mehanizma regulacije lučenja hepcidina:

1. statusom Fe – Fe u hrani i Fe iz rezervi; mehanizmi nisu sasvim razjašnjeni 2. upala – sinteza hepcidina značajno je potaknuta infekcijom i upalom, IL-6 se

smatra ključnim pokretačem sinteze hepcidina tijekom upale; rezultat je zadržavanje Fe u stanicama i hipoferemija – čime se patogenima ograničava dostupnost Fe (komponenta urođenog imuniteta); ograničena dostupnost Fe je limitirajući faktor u sintezi Hb i rezultira nastankom anemije, u tom je smislu hepcidin povenica između imuniteta i metabolizma Fe i ključni medijator anemije kronične bolesti

3. hipoksija/anemija – povećana ekspresija Epo dovodi do stimulacije eritropoeze, paralelno s tim smanjuje se sinteza hepcidina, čime se omogućuje mobilizacija Fe iz RES i više se Fe apsorbira iz enterocita za daljnje prekursore eritroidnih stanica

4. eritrocitni faktori. Stanični unos i pohrana Fe u stanici regulirani su na posttraskripcijskoj razini IRE/IRP sustavom (iron responsive elements/iron regulatory protein). IRP1 i 2 su citoplazmatski proteini koji imaju sposobnost osjetiti razinu Fe u tranzitnom pool-u. Specifično se vežu za mRNA petlje IRE i posttranskripcijski modificiraju ekspresiju proteina uključenih u metabolizam Fe.


Određivanje statusa Fe Fe se određuje spektrofotometrijski: Fe se oslobađa iz veze sa transferinom te Fe2+ i kromogen (ferene, ferozin) stvaraju obojeni produkt. TIBC – dodatkom Fe u suvišku se transferin potpuno zasiti Fe-om, a nevezano Fe ukloni adsorpcijom na Mg-karbonat. Vezano se željezo određuje kromogenom metodom. Indirektno ukazuje na transferin. Transferin se može određivati imunokemijskim metodama. Općenito, promjene u uskladištenom Fe se očutuju i na koncentracije Fe i transferina u cirkulaciji. Ako se skladišni oblik Fe poveća, povećat će se koncentracija Fe u krvi, a sniziti koncentracija transferina, i obratno. Koncentracije feritina u serumu su izravno proporcionalne zalihama u organizmu. Feritin se određuje imunokemijskom metodom. Osjetljivim imunokemisjkim metodama mogu se određivati i sTfR, koji zrcale TfR na membranama stanica, a obrnuto su proporcionalne količini Fe u organizmu

VITAMIN B12 I FOLNA KISELINA Potrebni su za normalno sazrijevanje jezgre (DNA) eritroidnih nezrelih stanica. Njihov manjak uzrokuje nastanak megaloblastičnih anemija. U organizam vitamin B12 se unosi hranom. Građa vitamina B12 slična je građi hema – i njegovu osnovu čine četiri pirolska prstena, ali s kobaltom u središtu. Takav se prsten naziva korinskim prstenom, za razliku od protoporfirinskog u hemu. Spojevi koji sadrže korinski prsten zovu se korinoidi. Glavni je korinoid kobalamin, tj. vitamin B12 koji u svojoj strukturi sadrži CN skupinu – on je u stvari cijanokobalamin. Tri su temeljna strukturna elementa cijanokobalamina (B12): (1) korinski prsten, (2) nukleotid vezan na prsten i kobalt i (3) cijanid vezan za suprotnu stranu prstena.

Za apsorpciju vitamina B12 iz probavnog trakta potreban je unutrašnji faktor (IF) – glikoprotein koji veže vitamin B12 u omjeru 1:1. IF stvaraju parijetalne stanice želučane sluznice. Spoj IF-B12 do terminalnog ileuma gdje se IF, u prisutnosti kalcija, veže za intestinalni receptor mikrovila enterocita, što omogućuje apsorpciju vitamina B12 kroz sluznicu. Nakon apsorpcije, vitamin B12 se transportira krvlju vezan za transkobalamin II (TCII), beta-globulin koji se stvara u jetri, makrofagima i ileumu. TCII prenosi vitamin B12 do koštane srži i drugih tkiva. Ondje vitamin B12 ulazi receptorom potpomognutom endocitozom. TCII je glavni protein plazme koji prenosi vitamin B12, međutim količina vitamina vezana na TCII je mala i manjak TCII uzrokuje megaloblastičnu anemiju zbog nedostatnog unosa vitamina u eritroidne stanice. No, u takvih je bolesnika razina vitamina B12 u normalnim granicama jer je


većina vezana na transkobalamin I (TCI). Transkobalamin I je glikoprotein kojega stvaraju granulociti, pa je TCI iznimno povišen kod hiperplazije granulocitne loze, posebno kod mijeloproliferativnih bolesti. Vitamin B12 vezan na TCI ne prenosi se u stanice koštane srži, već se prenosi do do jetre, odakle se izlučuje u žuč. Vitamin B12 je kofaktor u reakciji metilacije homocisteina u metionin, pri čemu je davatelj metilne skupine metil-tetrahidrofolat (metil-THF). NastajeTHF koja se koristi u sintezi DNA (sinteza purina i timidilata). Uzroci nedostatka B12 su manjak IF (perniciona anemija), malapsorpcija, nedostatan unos hranom, poremećena mobilizacija iz tkiva. B12 je i kofaktor u konverziji metilmalonil-CoA u sukcinil-CoA, stoga kod nedostatka B12 postoji poremećaj u degradaciji proponil-CoA u sukcinil-CoA. Dolazi do akumulacije proponil-CoA, a on se koristi u sintezi MK umjesto acetil-CoA (MK sa neparnim brojem C atoma). Homocistein → propionil-CoA → MMA (metil-malonska kiselina) → metilmalonil-CoA (uz B12) → sukcinil-CoA Povećano izlučivanje MMA mokraćom, te povećana koncentracija homocisteina u plazmi su testovi koji vrlo rano mogu ukazivati na nedostatak vitamina B12 u organizmu (čak i kada su koncentracije B12 normalne u plazmi). Folna kiselina dolazi u prirodi u obliku svojih konjugata poliglutamata. Po kemijskoj je strukturi pteroilglutaminska kiselina. Strukturno je folna kiselina spoj pteridina, p-aminobenzojeve kiseline i lanca glutaminske kiseline. Tetrahidrofolat (THF) je aktivni oblik folata u organizmu, a nastaje redukcijom pteridinskog prstena. Dnevne potrebe za folnom kiselinom su male, dok trudnice trebaju uzimati veće količine folne kiseline jer je ona potrebna za razvoj neuralne tube fetusa. Folna se kiselina apsorbira duž čitavog tankog crijeva, ali najviše u gornjoj trećini jejunuma. Nakon prolaska kroz crijevnu sluznicu, svi se folati dekonjugiraju, reduciraju i metiliraju do (N5)metil-THF, koji predstavlja cirkulirajući oblik folne kiseline. Metil-THF dolazi cirkulacijom do stanica, a nakon ulaska u stanicu se mora demetilirati (u THF) i ponovo konjugirati kako bi se onemogućio njen izlazak iz stanice i dostupnost za transfer ostalih monokarbonskih jedinica (metilen za sintezu timina). Ključnu ulogu u toj demetilaciji ima B12 uz metionin sintazu (veza B12, metil-THF i homocisteina). Rezerve folne kiseline nalaze se u jetri. Metil-THF, zajedno s vitaminom B12, sudjeluje u sintezi DNA, tj. stvaranju purina i pirimidina (prvenstveno timina). Funkcija THF je prijenos monokarbonskih jedinica (formil, hidroksimetil, metilen, metil) sa molekula donora na molekulu akceptora. Pri tome ima važnu ulogu u de novo sintezi nukleotida, jer predaje monokarbonsku jedinicu dUMP-u pričem nastaje dTMP, koji se kasnije ugrađuje u DNA.


Sudjeluje i u sintezi metionina iz homocisteina (metil-THF je donor metilne skupine, a B12 djeluje kao kofaktor). Nedostatak folata ili B12 blokira ovu reakciju, što rezultira povećanjem homocisteina u plazmi. Uzroci nedostatka folata su neadekvatan unos hranom, povećane potrebe organizma, malapsorpcija ili inhibicija lijekovima. Makrocitoza (MCV ↑) koja se povezuje sa kroničnom konzumacijom alkohola posljedica je nedostatnog unosa folata hranom, retikulocitoze koja se pojavljuje zbog GI krvarenja i hemolize, prisutne jetrene bolesti i toskičnosti alkohola (interferencija sa metabolizmom folata).


LEUKOCITI

Leukociti su sve stanice sa jezgrom u perifernoj krvi. Po funkciji leukocite možemo podijeliti na fagocite i stanice imunosnog sustava. Fagociti su granulociti i monociti, a stanice imunosnog sustava su limfociti T i B, te NK stanice.

GRANULOCITI

Iz pluripotentne hematopoetske matične stanice nastaje mijeloidna matična stanica (pod kontrolom faktora rasta, IL-1, IL-3 i IL-6). Iz nje nastaje usmjerena matična stanica granulocitne loze. Granulociti uključuju tri tipa stanica: neutrofilne, eozinofilne i bazofilne granulocite. Sazrijevaju u koštanoj srži. Najnezreliji morfološki prepoznatljivi oblik granulocitne loze je mijeloblast. Ima veliku okruglu ili ovalnu jezgru s 3–5 nukleola i nezrelim, fino raspršenim kromatinom. Citoplazma je oskudna, agranulirana i tamnije plave boje. Nukleocitoplazmatski (N/C) omjer je visok. Mijeloblasti su pozitivni na mijeloperoksidazu i esterazu, iako nemaju granula! (MPO+ ih razlikuje od limfoblasta.) Pojava azurofilnih, primarnih granula određuje promijelocite. Oni su nešto veći od mi-jeloblasta i u citoplazmi se jasno vide azurofilne granule (tamnoplave i crvenkaste). Jezgra je okrugla, N/C omjer je visok. Stadij mijelocita počinje stvaranjem sekundarnih, specifičnih granula, koje su manje od primarnih azurofilnih i pod mikroskopom svjetlije (svijetlosmeđe). Jezgra mijelocita je manja i ovalna, kromatin je kondenziraniji, a jezgrice se više ne vide. U stadiju mijelocita mogu se, prema specifičnim granulama, razlikovati neutrofilna, eozinofilna i bazofilna loza. N/C omjer je manji. Metamijelocit ima ekscentrično smještenu bubrežastu jezgru. Kromatin je kondenziran, a u citoplazmi vidljive su sekundarne i sekretorne granule. Nesegmentirani granulocit ima jezgru u obliku kifle, vrlo zgusnutog kromatina. Stani-cu ubrajamo u nesegmentirani granulocit ako je jezgra na sredini debljine manje od polovice promjera hipotetske okrugle jezgre.

Segmentirani granulocit je zreli oblik koji u prosjeku sadrži 3–5 segmenata jezgre. Kod žena se uz krajnji segment nalazi Barrovo tjelešce, inaktivirani X kromosom. Eozinofilni granulociti sadrže grublje, crvene granule, a jezgra nema više od 3 segmenta (najčešće 2). Kao najraniji stadij prepoznaje se eozinofilni mijelocit, a


nezreliji se oblici ne mogu razlikovati od neutrofilnih prethodnih stanica. Eozinofilne granule sadrže uglavnom peroksidazu i lizozim. Najveći dio granula eozinofila sadrži glavni bazični protein, koji je citotoksičan za parazite, te inducira oslobađanje histamina iz bazofilnih granulocita i mastocita. Eozinofili se često nađu u upalnim eksudatima i kroničnim upalama, a imaju i važnu ulogu u alergijskim reakcijama, u obrani od parazita i bakterija koje fagocitiraju, te pri odstranjenju fibrina stvorenog u upali. Bazofilni granulociti imaju izrazito velike, tamno plave granule u citoplazmi, koje pre-krivaju jezgru. Granule sadrže heparin i histamin, koji se pri degranulaciji oslobađaju. Na membrani imaju receptore za IgE. Vezanjem IgE na njegov receptor dolazi do degranulacije i otpuštanja raznih vazoaktivnih, kemotaktičnih i bronhokonstriktivnih tvari. Bazofili su česti u upalnim reakcijama, posebno reakcijama hiperosjetljivosti - astmi, alergijskom rinitisu i anafilaktičkoj reakciji. Bazofil koji se nalazi u tkivu naziva se mastocit. Mastociti se ne pojavljuju u perifernoj krvi. Koštana srž je rezervoar zrelih, segmentiranih granulocita – u normalnim je uvjetima u koštanoj srži pohranjeno 10–15 puta više granulocita nego što se nalazi u perifernoj krvi. Nakon ulaska u krv, granulociti provode oko 10 sati u cirkulaciji, a potom prelaze u tkiva, gdje obavljaju svoju funkciju – fagocitozu.

MONOCITI

Monociti se ubrajaju u bijele krvne stanice i glavni su sastavni dio mononuklearno-fagocitnog sustava čija je glavna funkcija fagocitoza. Monociti nastaju u koštanoj srži iz matičnih hematopoetskih stanica. Prethodne nezrele stanice monocitne loze na svojoj površini imaju biljege. Određivanjem tih biljega moguće je utvrditi zrelost stanica monocitne loze. Nezrele monocitne stanice eksprimiraju M-CSF receptor, lizozim, Fc-gama receptor, dok zreli monociti eksprimiraju u velikoj količini CD11b/CD18 Ag. Najvažniji površinski biljeg monocitno-makrofagne loze je CD14 – receptor na koji se vežu liposaharidi, koji uzrokuju aktivaciju tih stanica. Iz monoblasta, koji se morfološki ne može točno odrediti, nastaje promonocit, stanica s izrazito bazofilnom citoplazmom, koja pokazuje bljeđu perinuklearnu zonu te pojavu granula. Monocit je nešto manji od svojih prethodnik stanica, ali mu veličina isto izrazito varira (10 –18 µm). Citoplazma je sivkastomodra s rijetkim granulama i jezgrom bubrežasta izgleda ili poput potkove. Granule se dijele na primarne (MPOpoz) i sekundarne (MPOneg). Primarne granule sadrže mijeloperoksidazu, a sekundarne tvari koje posreduju u procesima adhezije i dijapedeze. Monociti cirkuliraju u perifernoj krvi 8-72 sata, a potom prelaze u tkiva, gdje sazrijevaju u tkivne makrofage (histiocite). Dužina života makrofaga je nekoliko mjeseci. Histiociti u određenim tkivima imaju i poseban naziv: jetra – Kupfferove stanice, pluća – alveolarni makrofagi, koža – Langerhansove stanice i dendritičke stanice, mozak – mikroglija.


FAGOCITOZA Osnovna funkcija granulocita i monocita (makrofaga) je fagocitoza. Odvija se u nekoliko faza: kemotaksija, neposredna fagocitoza, digestija i uništavanje fagocitiranih čestica Kemotaksija je mobilizacija i migracija fagocita na mjesto upale ili invazije bakterija posredovanjem kemokina koji se oslobađaju iz oštećenog tkiva ili aktiviranog komplementa. Kemokine stvaraju endotelne stanice, neutrofili, monociti, trombociti i limfociti T. Fagociti se kreću prema rastućoj koncentraciji kemokina, kojega detektiraju preko receptora na svojoj membrani. Adhezijske molekule Adhezijske molekule su glikoproteini koji posreduju u međustaničnim reakcijama i interakcijama. Adhezijske molekule na površini leukocita nazivaju se receptorima i vežu se za molekule zvane ligandi koje se nalaze na površini ciljnih stanica. Važne su u posredovanju i podržavanju imunog i upalnog odgovora, kao i u reakciji između trombocita, leukocita i endotela krvnih žila. Adhezijske molekule čine:

� Selektini – površinski receptori koji se nalaze na leukocitima (L-selektini), na endotelu postkapilarnih venula (E-selektini), na trombocitima i endotelnim stanicama (P-selektini).

� Integrini – ekspresija integrina na membrani granulocita povećava se utjecajem kemokina – oni izazivaju zamjenu granulocitnih selektina s integrinima na površini membrane

� Unutarstanične adhezijske molekule (ICAM). ICAM-1 prisutan je na endotelnim stanicama i u stanju upale mu se povećava ekspresija. ICAM-2 također se nalazi na endotelnim stanicama, ali ne pokazuje odgovor na upalne citokine (IL-1, TNF-alfa, IFN-gama). ICAM-3 nalazi se na granulocitima, monocitima i limfocitima.

Kemokini uzrokuju zamjenu granulocitnih selektina s integrinima, a isto tako zamjenu ICAM-2 na endotelnim stanicama (koji ne veže leukocite) s E-selektinom koji privlači leukocite, a potom i s ICAM-1, koji jače veže leukocite. L-selektini leukocita omogućuju blago prijanjanje na površinu endotela krvnih žila, dok ICAM-1 čvrsto veže integrine leukocita i omogućuje mu kotrljanje po stijenci krvne žile. Sekrecijom enzima (želatinaze B i elastaze) leukocit razara subendotelnu bazalnu membranu na maloj površini i leukocit ulazi u tkivo na mjestu upale.


I monociti i granulociti na svojoj površini imaju Fc receptor koji može vezati Ig (IgG) i C3b komponentu komplementa. Prisutnost tih receptora uvelike povećava sposobnost vezanja fagocita za strane tvari (bakterije ili stanice obložene s IgG ili C3). Fagocitoza Vezanje kemokina na transmembranski receptor aktivira G-protein koji kaskadnom reakcijom prenosi signal u stanicu. Posljedica je promjena oblika uz povećanu sklonost priljubljivanju i fagocitozi, te sekreciju sadržaja granula. Proces internalizacije stranih tvari (bakterije, gljivice i sl.) ili stanica domaćina koje su oštetili fagociti naziva se fagocitozom. Taj proces znatno olakšava opsonizacija, proces koji dovodi do oštećenja površine npr. bakterije imunoglobulinom ili komponentama komplementa (opsonini). Time receptori fagocita mnogo lakše prepoznaju strane tvari. Glavni su opsonini IgG, a u respiratornom sustavu to je IgA. Proces opsonizacije strane čestice završava fagocitozom. Proces fagocitoze zbiva se tako da fagocit okruži česticu izdancima svoje citoplazme, koji se potom spoje. Pseudopod je bogat aktinom. Tako nastaje fagocitna vakuola ili fagosom. Fagosom se nakon internalizacije pomiče prema jezgri. Vrlo brzo dolazi do fuzije granula s fagosomom, tj. dolazi do degranulacije.

LIMFOCITI

IMUNI SISTEM Definicija imunosti podrazumijeva otpornost na strane tvari, ne samo mikroorganizme, već i makromolekule. Stanice, tkiva i organi koji omogućavaju tu otpornost nazivaju se imunim sistemom. Reakcija organizma na ulazak patogena je imunosna reakcija. Mehanizmi imunosti uobičajeno se dijele na:

1. urođenu imunost (koža, sluznice, komplement, fagociti, NK-stanice, makrofagi i makrofagni citokini)

2. stečenu imunost (kožni i sluznični imunosni sustav, At, limfociti i limfocitni citokini).

Reakcije imunog sustava mogu biti: � Nespecifične – vezane pretežno uz urođenu imunost


� Specifične – koje se dijele se na (a) humoralnu imunost - posredovanu limfocitima B i (b) staničnu imunost - posredovanu limfocitima T

Nekoliko je karakteristika specifične imunosti: � specifičnost za antigen (antigen potakne specifični klon limfocita – teorija

klonske selekcije) � različitost – može prepoznati oko 109 Ag � imunološka memorija prvog susreta s antigenom (primarna imunoreakcija) i

pojačana reakcija nakon ponovnog susreta s istim antigenom (sekundarna imunoreakcija)

� samoograničavajuća reakcija – imuno reakcija postupno slabi nakon antigenske stimulacije

� razlikovanje vlastitog od stranog. Specifična se imunoreakcija razvija u tri faze :

1. Aferentna (spoznajna, kognitivna) – vezanje antigena za antigen specifičan receptor na limfocitu T i B.

2. Centralna (aktivacijska) – proliferacija i diferencijacija limfocita u specifičan klon. U toj fazi sudjeluju i druge stanice.

3. Eferentna (efektorska) – djelovanje diferenciranih efektorskih stanica i njihovih produkata, citokina i At.

Limfociti su stanice koje specifično prepoznaju imunogen i na njega reagiraju specifičnom imunoreakcijom. Potiču od matičnih stanica u koštanoj srži, a u zrele imunokompetentne stanice sazrijevaju primarnim limfopoetskim organima (timus i koštana srž). Limfoidna matična stanica diferencira se u B nezrele prethodne stanice i zajedničku prethodnu nezrelu T/NK stanicu, koja se zatim diferencira u nezrele stanice T loze i nezrele NK stanice. Limfoblast je prva stanica limfoidne loze koju je moguće prepoznati. Limfoblast ima veliki N/C omjer, raspleten i fini kromatin i vidljive nukleole. Citoplazma je vrlo oskudna, a ukoliko je vidljiva, boji se tamnije plavo. Limfoblaste i mijeloblaste je teško razlikovati (limfoblast ima manje citoplazme, koja je tamnija; nikada nema granule) – razlikuju se protočnom citometrijom i specifičnim bojanjima. Limfoblast je MPO i EST negativan, te Sudan black negativan (lipidi). Prolimfocit je malo veća stanica sa zrnatijom strukturom kromatina. Djeca dojenačke dobi često imaju limfocitozu, sa 70–80% limfocita, uz pojavu nezrelijih limfoidnih stanica, većinom tipa prolimfocita. Limfociti se na klasičnim krvnim razmazima međusobno razlikuju veličinom (8 – 10 µm) i morfološkim izgledom. Tipični mali limfocit ima veliku, bubrežastu jezgru, uski obodni sloj citoplazme s nešto mitohondrija, ribosoma i lizosoma, ali nema specifičnih granula. Citoplazma je modre boje. Veličina limfocita uspoređuje se s eritrocitima – mali limfocit je približno 1.5 puta veći od normalnog eritrocita.


Drugi morfološki oblik limfocita je veliki granulirani limfocit (LGL), koji ima obilniju citoplazmu i brojne specifične granule. Na temelju navedenih morfoloških svojstava nije moguće prepoznati subpopulacije limfocita: T, B i NK stanice. Te se stanice točno mogu odrediti pomoću monoklonskih protutijela metodom protočne citometrije. Morfologija normalnih, reaktivnih i malignih limfocitnih stanica U perifernoj krvi moguće je pronaći različite oblike limfocitnih stanica, od kojih nisu sve patološke, ali nam ukazuju na specifične imunosne procese koji se zbivaju u organizmu. Normalan razvoj: limfoblast – prolimfocit – limfocit – centrocit – centroblast – imunoblast – plazmoblast – proplazmocit – plazma stanica

Razvoj plazma stanice

Plazma stanica je potpuno diferencirani B-limfocit. Jezgra ima vrlo gusti kromatin poput žbica na kotaču, smještena je potpuno ekscentrično. Oko jezgre uočava se perinuklearno područje (perinuklearni halo). Citoplazma je izrazito bazofilna. Plazma stanica sintetizira i pohranjuje specifične imunoglobuline. U nekim patološkim stanjima moguće je pronaći plazma stanice drugačije morfologije: Reaktivne limfocitne stanice Limfoplazmociti – rijetko ih se nađe u perifernoj krvi. Oni su veće stanice sa ekscentrično položenom jezgrom, grudastim kromatinom, obilnijom, tamnoplavom citoplazmom, koja ponekad ima pojedinačne vakuole. Javljaju se u infektivnim bolestima, posebice rubeoli. Reaktivni, atipični limfociti se lako mogu zamijeniti za leukemijske limfoblaste ili monocite. Zovu se i virociti, Pffeiferove stanice, atipični ili podraženi limfociti. Izrazito su polimorfni, javljaju se u virusnim bolestima kao što je infektivna mononukleoza. Imaju nepravilnu ili poligonalnu jezgru, manje gust kromatin i obilniju svijetloplavu citoplazmu koja je uz rubove tamnije plava, često izvučena u obliku citoplazmatskih pseudopodija. U drugim tipovima reaktivnih limfocita citoplazma je bazofilnija, dok se kod nekih često vide azurofilna zrnca i vakuole. (Razlika od monocita: monocit ima


jednoličnije obojenu citoplazmu i često potkovastu ili sličnu jezgru, za razliku od reaktivnog limfocita. )

Maligne limfoidne stanice Limfociti kod CLL – javljaju se mali limfociti koji zapravo predstavljaju patološki klon limfocita. Odlikuju se okruglom ili ovalnom jezgrom, gustom strukturom kromatina i oskudnom svijetloplavom citoplazmom bez granulacije. Ovi limfociti su bogati glikogenom koji se citokemijski prikazuje PAS bojenjem. Vrlo su fragilni i u razmazu periferne krvi nalazimo puno zgnječenih, golih jezgara – Gumprechtove sjene.

SAZRIJEVANJE I PROLIFERACIJA LIMFOCITA Prethodne nezrele B-limfoidne stanice sazrijevaju u koštanoj srži, a nezreli prethodnici limfocita T sazrijevaju u timusu. Ovi procesi su pod kontrolom nespecifičnih citokina. Prethodnici limfocita T (pre-T) iz koštane srži odlaze u timus koji im pruža prikladan okoliš za vrlo složeni proces sazrijevanja u zrele imunokompetentne limfocite. Kompleksnim procesom proliferacije i diferencijacije timocita (nezrelih limfocita) uklanjaju se (negativna selekcija) one stanice koje specifično prepoznaju vlastite antigene glavnog sustava tkivne podnošljivosti (MHC, major histocompatibility complex), a očuvaju (pozitivna selekcija) one koje će omogućiti spregnuto prepoznavanje stranih antigena u kontekstu vlastitih MHC molekula. U tijeku tog procesa dolazi i do ekspresije gena čiji proteini tvore antigenski receptor – T-stanični receptor (TCR) limfocita T. U trenutku napuštanja timusa zreli limfociti T imaju nekoliko važnih razlikovnih biljega koji karakteriziraju različite funkcijske subpopulacije :

1. Pomagački limfociti T (Th) izražavaju specifičan fenotip – CD3+ CD4+ CD8-TCRa/b+. Oni prepoznaju tuđi antigen, tj. epitop vezan za molekulu MCH-klase II na membrani antigen predočujućih stanica – APC stanice. Ta antigen specifična aktivacija naivnih (djevičanskih) Th potakne njihovu proliferaciju i sekreciju citokina. Na temelju razlike u sekreciji pojedinih citokina razlikujemo dvije Th subpopulacije: Th1 (upalna subpopulacija) i Th2 (pomagačka subpopulacija).


Glavna funkcija Th1 subpopulacije je razvoj specifične stanične imunosti, tj. aktivacija citotoksičnih limfocita, makrofaga, NK stanica te reakcija kasne (odgođene) preosjetljivosti. Pomagačka Th2 subpopulacija pomaže diferencijaciju limfocita B i proizvodnju pro-tutijela, stimulira sekreciju IgE, te aktivira bazofile i mastocite. Nakon uklanjanja antigena imunoreakcija se obuzdava, a neki limfociti T, koji izlučuju male količine IL-2, preostaju kao dugotrajne memorijske stanice (ThM) koje pamte dodir s antigenom pa pri ponovnom dodiru razvijaju sekundarnu imunoreakciju.

2. Citotoksični limfociti T (CTL) izražavaju specifičan fenotip – CD3+CD4-CD8+TCRa/b+. Oni prepoznaju tuđi antigen (epitop) u sklopu MHC klase I. nakon što ih aktivira antigen, proliferiraju i diferenciraju se u efektorske CTL (pod djelovanjem IL-2 iz pomagačkih T limfocita) koji u izravnom kontaktu ubijaju ciljne stanice (stanice alotransplantata, tumora, vlastite stanice zaražene virusom).Osim toga, izlučuju i citokine IFN-γ i TNF-α koji aktiviraju makrofage.

3. Regulacijski limfociti T (Treg) pripadaju skupini CD4+CD25+. Oni koče imunoreakciju na vlastite i tuđe antigene djelujući na Th pomagačke limfocite ili izravno na limfocite B. Važni su za održavanje tolerancije na autoantigene, aloantigene, tumorske antigene te održavanje normalne trudnoće. Smatra se i da sprečavaju neželjene imunoreakcije na tuđe antigene (npr. alergije).

4. Limfociti NK-T podskupina su CD4+TCRalfa/beta+ limfocita. One prepoznaju glikolipidne antigene vezane na MHC molekule na predočujućim stanicama. Zbog nemogućnosti stvaranja imunološke memorije svrstavamo ih u urođenu imunost. Ovisno o aktivacijskom podražaju, mogu izlučivati proupalne (Th1 ) citokine (IFN-γ, TNF) ili protuupalne (Th2) citokine (IL-4, IL-10, IL-13). Koji imaju imunoregulacijsko djelovanje. Zato se smatra da su vrlo važni u diferencijaciji pomagačkih T limfocita, održavanju tolerancije na vlastite i tuđe antigene i kontroli tumorskog rasta.

Prethodnici limfocita B sazrijevaju u koštanoj srži. Nakon aktivacije antigenom, limfociti B počinju proliferirati i diferenciraju do plazma stanica koje izlučuju specifična protutijela. Ta se diferencijacija zbiva pod utjecajem različitih citokina koje izlučuju pomagački T limfociti. Stanice koje predočuju antigen (APC) su heterogena skupina stanica čije je zajedničko svojstvo predočavanje antigena pomagačkim limfocitima T. To svojstvo imaju mononuklearni fagociti, limfociti B, dendritičke stanice, folikularne dendritičke stanice i endotelne stanice krvnih žila. Dva su temeljna svojstva APC stanica :

1. ekspresija MHC molekula klase II 2. preradba proteinskih antigena u prikladne determinante koje se mogu vezati

za MHC i predočiti limfocitima Th.


Limfociti B prepoznaju antigen bez obzira na to je li predočen u kontekstu sustava MHC predočnih stanica. On prepozna je i neprerađeni antigen na površini APC, aktivira se i prelazi u plazma stanicu, koja producira i izlučuje specifična antitijela. Dio limfocita B ostaje kao memorijske stanice, specifične za taj antigen.

ANTIGENI I ANTITIJELA Antigen je tvar koju sa svojim antigen specifičnim receptorima mogu prepoznati limfo-citi T i B. Antigeni mogu uzrokovati i različite oblike alergijskih reakcija pa ih u tom slučaju nazivamo alergenima. Imunogen je tvar koja može nakon imunizacije potaknuti imunoreakciju (antigeni i superantigeni). Hapten je tvar male Mr koja se veže na specifična protutijela, iako nije imunogen i u pravilu ne može potaknuti imunoreakciju. Oni postaju imunogenični nakon vezanja za veliku molekulu-nosač (obično protein). Iz svega navedenog slijedi da je antigen tvar koja aktivira limfocite vezanjem za antigen specifične receptore limfocita T i B. Pozitivna aktivacija znači umnožavanje potaknutoga klona limfocita s posljedičnom produkcijom protutijela i sazrijevanjem efektorskih limfocita (imunološka reaktivnost). Potaknuti klon limfocita može imati kao posljedicu i imunološku nereaktivnost (toleranciju). Prema kemijskoj strukturi antigeni su proteini, polisaharidi, lipidi, nukleinske kiseline i spojevi kao što je trinitrofenil (TNP). Proteini su najmoćniji antigeni među organskim makromolekulama. Ugljikohidrati su slabiji imunogeni od proteina. Nalazimo ih u obliku glikolipida i glikoproteina. Npr. glikolipidi su antigeni bakterijskih stijenki i glavni krvnogrupni antigeni, a glikoproteini su slabiji antigeni, kao primjerice Rh antigen. Reakciju jedinke protiv antigena ponajprije određuju geni glavnog sustava tkivne podudarnosti (MHC), koji se zovu i geni imunosnog sustava. Interakcija antigena s produktima tih gena nužna je za prepoznavanje i aktivaciju specifične imunoreakcije na njega. Stoga jaka interakcija povećava imunogeničnost i pojačava imunoreakciju. Da bi neka tvar bila imunogenična, u pravilu mora imati Mr veću od 10 kDa. Treba naglasiti da imunogenična tvar, mora organizmu biti tuđa. Razlikujemo aloantigene (razlike između jedinki iste vrste), ksenoantigene (razlike između antigena jedinki različite vrste) i autoantigene (vlastite molekule na koje organizam reagira u iznimnim okolnostima). Antigenska determinanta – epitop – dio je antigenske molekule koji se veže za vezna mjesta (paratop) antigen specifičnih receptora limfocita T i B i specifičnih protutijela. Veće molekule, prema tome, mogu imati i više epitopa.


Protutijela su glikoproteini specifični za određeni antigen, a produciraju ih limfociti B. Nalazimo ih u serumu i ekstracelularnim tekućinama. Serum koji sadrži specifična antitijela zovemo antiserum. Imunost izazvanu protutijelima nazivamo humoralnom imunosti. Sva su protutijela građena od četiri polipeptidna lanca – dva laka lanca, L i dva teška lanca, H; međusobno povezana disulfidnim mostovima. U čovjeka nalazimo dva tipa lakih lanaca: kapa i lambda. Disulfidni mostovi povezuju lake lance s teškim, te međusobno dva laka, te dva teška lanca. Primarnu aminokiselinski strukturu lakih i teških polipeptidnih lanaca tvore ponavljajuće homologne jedinice sastavljene od oko 110 aminokiselina. Te se jedinice višekratno ponavljaju i zbog disulfidnih veza na kraju tvore kuglaste tvorbe nazvane imunoglobulinskim domenama. Laki lanci imaju dvije, a teški lanci četiri takve domene. Razlikujemo 5 razreda imunoglobulina: IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. Kod čovjeka IgG ima četiri podklase IgG1-4, a IgA dvije IgA1-2. Protutijela se međusobno razlikuju aminokiselinskim sastavom domene na N-krajevima lakih i teških lanaca. Zato se ta domena naziva varijabilnom (V) domenom. U ostatku lakih i teških lanaca aminokiselinski sastav neznatno varira pa se te regije nazivaju konstantnim (C) domenama. U intaktnom imunoglobulinu regije lakih i teških lanaca prostorno su tako povezane da tvore mjesto vezanja antigena – paratop, koji određuje antigensku specifičnost protutijela. Za biološke efektorske funkcije protutijela odgovorne su konstantne domene teških lanaca. Razlike u konstantnim regijama imunoglobulina nazvane su izotipovima. Razlike u varijabilnim regijama imunoglobulinskih lanaca nazvane su idiotipovima. Proteolitička razgradnja imunoglobulina, ovisno o proteolitičkom enzimu, daje različite proteolitičke fragmente. Papain razgradi molekulu na tri fragmenta. Dva su identične i građena su od lakog lanca i VH-CH1 fragmenta teškog lanca. Oba fragmenta zadržavaju sposobnost vezanja antigena pa su nazvani Fab fragmentima. Treći je fragment građen od CH2 i CH3 domene teškog lanca i nazvan je Fc fragment. Efektorske funkcije protutijela Protutijela, vežući se za antigenske determinante bakterija, virusa, parazita i njihovih toksina, kao i lijekova, nautraliziraju njihove toksične i infekcijske mogućnosti. Dalje, protutijela aktiviraju komplement klasičnim putem, pri čemu nastaju efektorske molekule odgovorne za većinu citotoksičnih i upalnih učinaka humoralne imunoreakcije. Protutijela procesom opsonizacije značajno olakšavaju fagocitozu.

Sustav komplementa

Kompleks komplementa je sustav membranskih i serumskih proteina koji su međusobno funkcionalno povezani i čija aktivacija pokreće kaskadu međusobno precizno reguliranih međureakcija. Tri su načina kojima se može aktivirati sustav komplementa :


1. Klasični put aktivacije počinje prepoznavanjem i reagiranjem komponente C1 komplementa i protutijela. Protutijelo stječe sposobnost prepoznavanja C1 tek nakon vezanja sa specifičnim antigenom. Ta interakcija mijenja prostornu konfiguraciju protutijela pa se na Fc fragmentu otkriva vezno mjesto za C1. Tako komponenta C1 postaje enzim koji cijepa C4 i C2 čiji fragment tvore C3-konvertazu klasičnog puta. Najveću sposobnost aktiviranja komplementa imaju IgM. Aktivirati komplement klasičnim putem mogu i apoptotične stanice, neki virusi i bakterije, te CRP vezan za ligand.

2. Lektinski put aktivacije komplementa sličan je klasičnom putu. Za njegovu aktivaciju nisu potrebna protutijela pa ga smatramo jednim od nespecifičnih mehanizama imunosne obrane. Aktivacija tog puta počinje vezanjem serumskih lektina s manozom i drugim šećerima na površini mnogih mikroorganizama.

3. Alternativni put aktivacije također pripada nespecifičnim mehanizmima imunosne obrane jer za njegovu aktivaciju nije potreban kompleks antigena i antitijela. Aktivacija tog puta osniva se na neprekidnoj spontanoj hidrolizi C3 komponente.

Jedan od najvažnijih učinaka aktivacije komplementa je poticanje fagocitoze. Druga funkcija komplementa je i poticanje upalne reakcije. C3a, C4a i C5a mogu izravno uzrokovati povećanu propusnost kapilara, vazodilataciju i kontrakciju glatkih mišića. Osim toga, C3a i C5a vežu se za specifične receptore na mastocitima i bazofilima uzrokujući njihovu degranulaciju i oslobađanje tvari s vazoaktivnim djelovanjem kao što su histamin i TNF-α. Fragment C5a pokazuje i kemotaktičnu aktivnost.


TROMBOCITI

Proces diferencijacije matične stanice u megakariocite i njihovo sazrijevanje, te stvaranje trombocita naziva se trombocitopoezom. Megakariociti potječu iz pluripotentne matične stanice iz koštane srži, procesom endomitoze se višestruko umnožava DNA ali bez dijeljenja citoplazme i jezgre čime nastaju poliploidni megakariociti. Zatim u megakariocitima započinje citoplazmatska ekspanzija, uz akumulaciju citoplazmatskih proteina i granula esencijalnih za funkciju trombocita. Na kraju nastaju citoplazmatske ekstenzije nazvane protrombociti.

Trombociti su pločice, sadrže granule (α-granule, guste granule i lizosome), te

mitohondrije i ER. Tamne (guste) granule sadrže ADP/ATP, serotonin i kalcij; α-granule sadrže fibrinogen, PGDF, fibronektin, TF4, vWF, TGF, trombospondin, FV,

FXI, PAI-1, HMWK, β tromboglobulin; u citoplazmi se nalazi otopljeni FXIII. Na površini neaktiviranih trombocita postoji niz glikoproteina i glikoproteinskih kompleksa (možda najvažniji GP IIb/IIIa, GP Ib/IX/V). Najvažniji faktor rasta megakariocitopoeze je trombopoetin. TPO stvaraju četiri organa: jetra, bubreg, koštana srž i slezena. Najveći dio se, ipak, stvara u jetri i bubregu. Megakarioblast je najnezrelija morfološki prepoznatljiva prethodna stanica trombocitne loze, veličine od oko 15 µm. Ova stanica podsjeća na mijeloblast. Citoplazma ima izdanke. Promegakariocit je veća stanica od megakarioblasta s velikom jezgrom koja je režnjata, gušćeg kromatina i izrazito modre citoplazme. Promegakariocit je velika stanica – 80 µm. Megakariocit je jednako velika stanica kao i promegakariocit. Jezgra mu je multilobulirana, gustog kromatina, a citoplazma je ružičasta zbog stvaranja trombocita. Uz tipične vrlo nezrele biljege (CD34, HLA-DR), najvažniji biljeg megakariocitne loze je trombocitni GPIIb/IIIa (CD41). Zreli megakariociti očituju i trombocitni faktor 4, von Willebrandov faktor, trombospondin i trombomodulin. Zreli megakariociti gube sposobnost proliferacije, ali posjeduju sposobnost povećane sinteze DNA. Zbog toga zreli megakariociti imaju veći volumen, nego druge stanice u koštanoj srži. Krajnji ishod razvoja megakariocita je otpuštanje trombocita u krvi opticaj. Trombociti nastaju iz citoplazme megakariocita stvaranjem izduženih tankih protruzija nazvanih protrombociti, koji se obično nalaze na dijelu membrane megakariocita u blizini endotelnih stanica koje oblažu sinusoide. Trombociti u perifernoj krvi žive 9–11 dana. Mladi trombocit iz koštane srži odlazi u slezenu, koja sadrži oko trećine trombocita. Trombociti su diskoidnog oblika, ne sadrže jezgru, ER ili Golgijevo tjelešce. Za obavljanje svoje funkcije ovise o proteinima sintetiziranim u megakariocitima.


POREMEĆAJI TROMBOCITA Hemostatski odgovor obuhvaća vazokonstrikciju krvne žile, stvaranje primarnog hemostatskog ugruška aktivacijom trombocita, stvaranje fibrina nakon aktivacije faktora koagulacije i fiziološku funkciju inhibitora hemostaze koji ograničavaju aktivaciju hemostaze na mjesto ozljede krvne žile i reguliraju sistem hemostaze kako bi se ovaj aktivirao samo kada je to potrebno. Poremećaji bilo koje od komponenti u procesu stvaranja ugruška može dovesti do krvarenja, a poremećaj regulacije dovodi do tromboze. KLINIČKE MANIFESTACIJE Poremećaji u komponenti primarne hemostaze (vaskulatura, trombocit) obično se očituju kao krvarenje iz kože (petehije, ehimoze, hematomi) ili mukoze (krvarenje iz nosa - epistakse, zubnog mesa ili menoragija – abnormalno krvarenje tijekom menstruacije). Ako se radi o poremećajima faktora koagulacije, obično se pojavljuju unutrašnja krvarenja, najčešće u duboka tkiva i zglobove. POREMEĆAJI TROMBOCITA Ulog trombocita je stvaranje primarnog hemostatskog ugruška. Za to je potreban adekvatan broj cirkulirajućih trombocita sa očuvanom funkcijom. Stoga se poremećaji trombocita dijele na

1. kvantitativne (brojčane) – trombocitopenija i trombocitoza 2. kvalitativne (funkcionalne) – obuhvaćaju poremećaje funkcije trombocita.

KVANTITATIVNI POREMEĆAJI TROMBOCITA Broj trombocita (Trc) se određuje na automatskom analizatoru i rjeđe brojenjem pod mikroskopom, kada se može vidjeti i njihova morfologija i veličina. Trombocitopenijom se smatra broj trombocita manji od 150x109/L, međutim klinički simptomi (po život opasna krvarenja) se pojavljuju kada broj trombocita padne ispod 50. Kod bolesnika sa trombocitopenijom je vrijeme krvarenja produženo (ova se pretraga više ne radi). Trombocitopenija sama po sebi nije bolest, već je simptom neke bolesti u podlozi. Ovisno o patofiziološkom mehanizmu nastanka, trombocitopenija se može podijeliti na 5 kategorija:

� Trombocitopenija zbog povećane destrukcije - najčešća, obilježena smanjenim životnim vijekom trombocita; trombociti se eliminiraju iz krvi brže nego ih koštana srž može stvarati; uzroci mogu biti imune i neimune etiologije.

� Trombocitopenija zbog smanjene sinteze (slabost koštane srži u sintezi trombocita)

� Povećana sekvestracija u slezeni � Dilucijska trombocitopenija � Stanja sa višestrukim uzrocima trombocitopenije.


A. Trombocitopenija zbog povećane destrukcije Imunološki posredovana destrukcija trombocita uzrokovana je pojavom antitijela na trombocite (analogno antitijelima u imunim hemolitičnim anemijama). Antitijela se vežu na trombocite, a ovi se posljedično uklanjaju djelovanjem mononuklearno-

makrofagnog sistema u slezeni (i jetri). Monociti i makrofagi imaju Fcγ-receptore kojima prepoznaju i vežu antitijelima obložene trombocite. Antitijela (IgG, IgA) se vežu na trombocite Fab fragmentom za GP IIb/IIIa ili Ib/IX ili nespecifičnim vezanjem imunih kompleksa za trombocitne Fc receptore. Broj megakariocita u koštanoj srži je povećan kao rezultat stimulacije TPO-om. MPV je kod imunih trombocitopenija povećan, što može ukazivati na dijagnozu. Najčešći oblik je imuna trombocitopenična purpura ITP, autoimuni poremećaj sa autoreaktivnim antitijelima na trombocite.

HEPARINOM INDUCIRANA TROMBOCITOPENIJA (HIT) Može biti uzrokovana imunim i neimunim mehanizmom. Heparin se koristi u prevenciji i liječenju tromboza. Kod nekih bolesnika heparin uzrokuje izravnu aktivaciju Trc (neimuni mehanizam). HIT je termin rezerviran za imuni mehanizam nastanka trombocitopenije. Radi se o imuno destrukciji Trc posredovanoj IgG antitijelima, a u ovisnosti o prisutnosti heparina. Trc-aktivirajuća IgG prepoznaju kompleske PF4 sa heparinom u cirkulaciji. Naime, PF4 se oslobađa iz Trc tijekom aktivacije, veže se za heparin u cirkulaciji, i taj kompleks inducira stvaranje At. Kompleks PF4-heparin-At se zatim veže za površinu Trc, uzrokujući destrukciju Trc i trombocitopeniju. U rijetkim slučajevima kompleks PF4-heparin-At može aktivirati sistem zgrušavanja i dovesti do tromboze. Povećana destrukcija trombocita može biti uzrokovana i neimunim mehanizmima. Trombociti se aktiviraju i troše agregacijom u cirkulaciji u poremećajima kao što su DIK, TTP (trombotska trombocitopenična purpura) i HUS (hemolitično uremični sindrom), HELLP sindrom. Mehanička destrukcija trombocita može se dogoditi u pacijenata sa umjetnim zaliscima ili vaskularnim presadcima.


B. Trombocitopenija zbog smanjene sinteze Poremećaji koštane srži u sintezi adekvatnog broja Trc za periferiju. Primarni se poremećaj utvrđuje pregledom koštane srži. Smanjeni broj Trc na periferiji posljedica je hipoplazije megakariocita u koštanoj srži, neučinkovite trombocitopoeze, ili nasljednog poremećaja u sintezi megakariocita. Nasljedne trombocitopenije su rijetke bolesti, nepoznate frekvencije jer postoji problem dijagnosticiranja. Uglavnom se nasljeđuju autosomno dominantno. Klasifikacija se obično temelji na veličini trombocita te prisutnosti/odsutnosti kliničkih značajki uz trombocitopeniju (sindromske ili nesindromske). Nasljedne trombocitopenije prema veličini Trc: � Mikrotrombociti (MPV do 7 fL) - sindrom Wiskott-Aldrich (WAS gena) i X-vezana

trombocitopenija (XLT); oba su poremećaja spolno vezana i nastaju zbog mutacije WAS gena; obilježene su trombocitopenija (<70x109/L) i mikrotrombociti (MPV<5 fL) odmah nakon rođenja

� Trombociti normalne veličine (MPV 7 –11 fL) - 1. Autosomno dominantne trombocitopenije - Familijarni poremećaj trombocita s

predispozicijom za akutnu mijeloidnu leukemiju i trombocitopenija povezana sa kromosomom 10

2. Autosomno recesivne trombocitopenije - nasljedna amegakariocitna trombocitopenija i trombocitopenija udružena s nedostatkom palčanih kostiju (TAR sindrom)

� Makrotrombociti (MPV>11fL) - May-Hegglinova anomalija, BSS, velokardiofacijalni sindrom, sindrom Fechtner, Paris-Trousseau trombocitopenija.

Nasljedna amegakariocitna trombocitopenija (CAMT) Utvrđena u više od 50 obitelji. Novorođenčad ima izraženu trombocitopeniju (Trb <10x109/L) uz nedostatak megakariocita u koštanoj srži. Bolest se prepoznaje nekoliko dana ili tjedana nakon rođenja zbog krvarenja. Progredira u aplastičnu anemiju i zatajenje koštane srži. Utvrđena je molekularna etiologija bolesti – mutacije oba alela u genu za trombopoetinski receptor TPO-R (15 mutacija). MYH9-pridružene trombocitopenije Nastaju zbog mutacije istog gena MYH9 koji je odgovoran za sintezu TEŠKOG LANCA NEMIŠIĆNOG MIOZINA IIA (NMMHC-IIA). Nasljeđuju se autosomno dominantno. Podjela: � May-Hegglinova anomalija � Sindrom Fechtner � Sindrom Sebastian � Sindrom Epstein. May-Hegglinovu anomaliju karakterizira familijarna trombocitopenija s Dohleovim tjelešcima u citoplazmi leukocita. Broj trombocita je blago ili umjereno snižen, a prisutni su makrotrombociti.


C. Povećana sekvestracija u slezeni Obično se u slezeni pohranjuje oko 1/3 Trc, taj je pool u ravnoteži sa cirkulirajućim Trc. U stanjima kongestivne splenomegalije, reaktivne splenomegalije ili hipesplenizma, kada je slezena povećana, u njoj se skladišti veći broj Trc (čak i do 90% od ukupne populacije), što rezultira trombocitopenijom. Splenomegalija se pojavljuje kod ciroze jetre, hemolitičke anemije, leukemijama, limfomima. I drugim poremećajima.

D. Dilucijska trombocitopenija Nakon davanja velikih volumena suptituenata plazme, nakon obilnih krvarenja.

E. Pseudotrombocitopenija In vitro artefakt koji se odnosi se na lažno sniženi broj trombocita kod određivanja na automatskom brojaču. Najčešće je EDTA posredovana. Vidi pogreške analizatora. Trombocitozom se smatra broj trombocita iznad gornje granice referentnog raspona. Uzroci su trombocitozi slijedeći:

1. primarna trombocitoza - obuhvaća esencijalnu trombocitozu, CML, policitemiju veru i dr. (Trc iznad 1000, u koštanoj srži hiperplazija megakariocita)

2. sekundarna (reaktivna) trombocitoza - kao posljedica akutnog krvarenja, operacije, nakon splenektomije, tijekom oporavka od alkoholom inducirane trombocitopenije i kemoterapije, zbog malignih bolesti, kroničnih upalnih procesa, anemije zbog nedostatka željeza i hemolitičke anemije

3. prolazna trombocitoza - nakon tjelovježbe, adrenalina, poroda.

KVALITATIVNI (FUNKCIONALNI) POREMEĆAJI TROMBOCITA Poremećaji mogu zahvatiti adheziju, agregaciju, prokoagulantne funkcije trombocita te izlučivanje sadržaja iz granula (ADP, TxA2). Nakon ozljede krvne žile trombociti adheriraju na subendotel izložen struji krvi (adhezija), zatim se aktiviraju (aktivacija) i secerniraju sadržaj iz granula (sekrecija) kao ADP i serotonin, koji interakcijom sa drugim trombocitnim receptorima u područje ozljede privlače dodatne trombocite (agregacija). Klasifikacija nasljednih poremećaja trombocita prema patološkoj funkciji (ili strukturi):

1. primarni poremećaji interakcije trombocita i stijenke krvne žile (poremećaji adhezije) - vWB i Bernard-Soulierov sindrom

2. primarni poremećaji interakcije između trombocita (poremećaji agregacije) - kongenitalna afibrinogenemija i Glanzmannova trombastenija

3. poremećaji trombocitnih granula, izlučivanja i prijenosa signala - storage pool diseases, poremećaji izlučivanja i prijenosa signala

4. poremećaji prokoagulacijske funkcije trombocita - poremećaji fosfolipidne mebrane Scottov sindrom, abnormalni trombocitni FV (FV New York)


5. poremećaji strukturnih ili citoskeletnih komponenti u trombocitima - MYH9 udruženi poremećaji, Wiskott-Aldrichov sindrom, trombocitna sferocitoza

1. Poremećaji adhezije (poremećaji trombocitnih receptora za adhezijske proteine) Adhezija na kolagen zahtjeva prisutnost adekvatne količine funkcionalnog vWF i prisutnost funkcionalnog receptora GP Ib/IX na trombocitnoj membrani. Obzirom da je adhezija na kolagen poremećena, agregacija i stvaranje primarnog hemostatskog ugruška su također poremećeni.

� Poremećaji glikoproteinskog kompleksa GP Ib-IX-V: o Bernard-Soulierov sindrom (BSS) o Trombocitni tip VWB ili pseudo VWB.

Dijagnostički test za gore navedene bolesti je test agregacije trombocita. BERNARD-SOULIEROV SINDROM (BSS) Obilježen umjerenom do izraženom trombocitopenijom i poremećenom funkcijom trombocita. Homozigoti imaju povećanu tendenciju krvareanju, dok heterozigoti nemaju značajne simptome krvarenja. Broj trombocita iznosi od 40x109/L do gotovo normalnih vrijednosti, prisutni su i

makrotrombociti u 60-80% (giant platelet syndrome), veličina Trc i do 20 µm (izrazito veliki) što se vidi u razmazu periferne krvi. Kao posljedica mutacije u genu dolazi do smanjene/izostale ekspresije kompleksa GPIb-IX na površini trombocita (receptor za vWF). Zbog nedostatka funkcionalnog receptora za vWF, nema vezanja trombocita za vWF i stoga izostaje adhezija trombocita na kolagen. Nasljeđuje se autosomno recesivno, učestalost je 1 na milijun. Uloga laboratorijske dijagnostike Za diferencijalnu dijagnozu drugih funkcionalnih poremećaja Trc i ostalih trombocitopenija. Pregledom periferne krvi nalaze se povećani trombociti i trombocitopenija. Vrijeme krvarenja (po Ivy-u) je produženo što ukazuje na poremećaj funkcije trombocita. Agregacija trombocita sa ADp-om, kolagenom i adrenalinom je normalna. Ali, izostaje aglutinacija Trc s ristocetinom, koja zahtjeva prisutnost vWF i GPIb/IX. Slični agregacijski odgovor dobiva se u slučaju vWB. Kako bi se one razlikovale, koristi se modifikacija ristocetinskog aglutinacijskog testa. Pacijentovim se trombocitima dodaje normalna plazma (dakle vWF), ako nema korekcije ristocetinskog testa radi se o BSS-u. Liječi se transfuzijama koncentrata trombocita. Trombocitni tip vWB (pseudo vWB) Posljedica je poremećene funkcije receptora GPIbα, koji pokazuje povećanu avidnost spram vWF i na taj način veže veće multimere te trombocite u stanju mirovanja, što rezultira njihovim uklanjanjem iz cirkulacije.


2. Poremećaji agregacije (receptora IIb-IIIa) Ključni protein u agregaciji je fibrinogen i njegov receptor na trombocitu GPIIb/IIIa. Ako se radi o nedostatku bilo koje od ovih komponenata, izostaje međusobna interakcija trombocita i nema primarne i sekundarne agregacije.

� Poremećaji glikoproteinskog kompleksa GPIIb-IIIa (ααααIIb-ββββ3) o Glanzmannova trombastenija.

GLANZMANNOVA TROMBASTENIJA (GT) Urođeni poremećaj u kojem je smanjena ili nema ekspresije kompleksa GPIIb/IIIa koji je receptor za Fbg. Fibrinogen je, uz kalcij, odgovoran za premošćivanje dva trombocita prilikom agregacije. Agregacija trombocita u ovom poremećaju izostaje jer trombociti nemaju mjesto za vezanje fibrinogena. Klinički se simptomi očituju samo u homozigota. Poremećaj nastaje zbog mutacija ili delecija u genima za GPIIb i GPIIIa (na kromosomu 17). Nasljeđuje se autosomno recesivno. Simptomi krvarenja su blagi: purpura, epistaksa, menoragija, krvarenja iz desni. Uloga laboratorijske dijagnostike Broj trombocita, njiohova veličina i oblik su normalni. Vrijeme krvarenja je izrazito produženo. Izostaje retrakcija ugruška što ukazuje na poremećaj funkcije Trc. Poremećaj je obilježen izostalom agregacijom trombocita sa svim agonistima (ADP, adrenalin, kolagen) zbog toga što na Trc nema mjesta za vezanje fibrinogena (nema agregacije). Normalna je aglutinacjia prisutna samo uz ristocetin. Nedostatak GPIb ili GPIIIa može se identificirati protočnom citometrijom. Terapija je suportivna, učestale transfuzije kada su potrebne. 3. Poremećaji trombocitnih granula (storage pool diseases) Nedostaju same granule ili je nedovoljno njihovog sadržaja u trombocitima i megakariocitima.

� Poremećaji zbog nedostatka δ (gustih) granula (sindrom tamnih granula, δ SPD - storage pool deficiency), obilježeni abnormalnom agregacijom sa ADP-om, adrenalinom i niskim koncentracijama kolagena; poremećaji agregacije posljedica su nedostatnog lučenja ADP-a iz gustih granula.

� Poremećaji zbog nedostatka α granula (sindrom sivih trombocita, α - SPD), u razmazu su trombociti bez granula i zato izgledaju sivkasto, testovi agregacije su normalni; simptomi krvarenja su blagi, blago produženo vrijeme krvarenja.

� Poremećaji zbog nedostatka α - i δ - granula (α, δ - SPD) � Trombocitopatija Quebec � Sindrom Paris-Trousseau ili sindrom Jacobsen.

Za dijagnozu se koriste agregacija Trc i lumiagregometrija. TROMBOCITOPATIJA QUEBEC Nasljeđuje se autosomno dominantno. Obilježena je teškim post-traumatskim krvarenjima koja se ne korigiraju transfuzijom trombocita. Broj trombocita je normalan


ili snižen. Prisutna je abnormalna proteoliza proteina u α-granulama, zbog

povećanog sadržaja u-PA u α-granulama (unutarstanična aktivacija fibrinolize).

Smanjen je trombocitni FV, multimerin (veliki protein koji veže FVa u α-granulama), VWF, fibrinogen, trombospondin, fibronektin, osteonektin i selektin P. Agregacija s adrenalinom je snižena, agregacija sa ADP-om i kolagenom je normalna ili snižena. Terapija: inhibitori fibrinolize. 4. Poremećaji izlučivanja i prijenosa signala Trombociti se aktiviraju djelovanjem velikog broja agonista preko GPCRs (receptora vezanih za G proteine) na površini Trc. Nakon podražaja, Gq podjedinica receptora aktivira fosfolipazu C, čime se povećava intracelularna koncentracija kalcija, te aktivira fosfolipaza A2 i protein kinaza C. Krajnji je učinak reaorganizacija citoskeleta u Trc što rezultira promjenom oblika trombocita, agregacija i sekrecija iz granula.

� Poremećaji interakcije trombocita i agonista (zbog poremećaja receptora za TXA2, ADP ili kolagen)

� Poremećaji u metabolizmu arahidonske kiseline i sinteze TxA2 5. Poremećaj trombocitnih receptora za topljive agoniste Poremećaji receptora za tromboksan A2 (za TxA2)

Poremećaji α2 – adrenergičnog receptora (za adrenalin) Poremećaji P2 receptora (za ADP) - receptori P2 (ADP) su P2X1, P2Y1, P2Y12.


NASLJEDNE BOLESTI TROMBOCITA - osnovne karakteristike

FUNKCIJA TROMBOCITA

POREMEĆAJ VK BROJ TRC

MORFOLOGIJA TRC, VELIČINA-

VOLUMEN

RETRAKCIJA UGRUŠKA

AGREGACIJA

Glanzmannova trombastenija,

GPIIb/IIIa ↓ ↑↑ norm norm Nema ili ↓

ADHEZIJA BSS, GPIbIXV ↓ ↑ ↓

Norm

±

Veličina ↑↑↑ makrotrombociti

Norm

SEKRECIJA Adhezija ↓

Agregacija ↓

Storage pool disease

(δ granule ↓) Sindrom sivih trombocita

(α granule ↓)

↑ ili norm

↑

Norm

ili ↓

Norm

ili ↓

Veličina norm

Norm, granule ↓

Norm

Norm

AKTIVACIJA Otpuštanje ↓

Agregacija ↓

Abnormalno lučenje kalcija

Snižena sinteza

prostaglandina (↓ COX

↓ Tx sintaza)

↑ ±

norm

norm

?

KOAGULACIJSKA AKTIVNOST

Scott-ov sindrom norm norm norm ?

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA NASLJEDNIH POREMEĆAJA TROMBOCITA Dijagnostička evaluacija poremećaja trombocita obuhvaća prvo pažljivu individualnu procjenu krvarenja (klinička slika, obiteljska anamneza), određivanje broja trombocita i određivanje njihove funkcije. Simptomi krvarenja ovise o ozbiljnosti i prirodi poremećaja trombocita. Smatra se da urođeni poremećaji trombocita povećavaju rizik za masivno krvarenje nakon operacija, velikih zahvata na zubima ili trauma, te da se abnormalno krvarenje obično manifestira naglo. Simptomi su obično olakšano stvaranje ožiljaka i produljeni period menstruacije, ali nikako nisu specifični. Ti se poremećaji lakše i češće dijagnosticiraju u žena (obzirom na menstruaciju i porod). Naravno u dijagnostici ne treba zaboraviti na pozitivnu obiteljsku anamnezu. Laboratorijska dijagnostika suspektnog poremećaja trombocita je kompleksna. Uključuje krvnu sliku i diferencijalnu krvnu sliku, određivanje veličine trombocita (MPV). U većini je slučajeva laboratorijska dijagnostika nasljednih trombocitopenija mukotrpna i ne može se izvršiti samo u jednom kliničkom centru. Uključuje jednostavne laboratorijske metode za screeening (probir) te specijalne metode za potvrdu dijagnoze.


Probir BROJ TROMBOCITA - određuje se automatskim analizatorom (veličina stanica od 2-20 fL); broj trc kod pacijenata sa veličinom trombocita izvan ovih granica je podcijenjen - lažno snižen (makrotrombociti, BSS ili MYH9 poremećaji), stoga valja trombocite odrediti i pod mikroskopom u razmazu (mikroskopija ili u komorici). VELIČINA TROMBOCITA - određuje se pomoću analizatora MPV (7-11 fL), imati na umu lažno sniženi MPV kod makrotrombocitopenije i obratno; pogledati razmaz. MORFOLOGIJA STANICA U DKS - mogu se uočiti sivi trombociti (sindrom sivih trc) ili Dohleova tjelešca u citoplazmi PMN kod May-Hegglinove anomalije. TESTOVI ZA PROCJENU FUNKCIJE TROMBOCITA - poremećaji funkcije trombocita nađeni u urođenim trombocitopenijama su česti ali i nespecifični, osim nekoliko iznimaka; izostanak in vitro aglutinacije trombocita inducirane ristocetinom pokazatelj je BSS; metoda za procjenu funkcije trombocita je agregacija trombocita u plazmi bogatoj trombocitima (PRP) denzitometrijom (optička agregometrija); jeftina je i tehnički jednostavna, iako brojne varijable utječu na rezultat: vrijeme analize, metode za odvajanje PRP od PPP, koncentracija trombocita, temperatura i izbor agonista; stoga svaki laboratorij standardizira svoju metodologiju i određuje referentne intervale; tu je i PFA-100 koji in vitro procjenjuje primarnu hemostazu (screening) kod pacijenata sa potencijalnim rizikom od krvarenja. Potvrdni testovi ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA - za promatranje ultrastrukture trombocita, potvrda

nedostatka α-granula npr. SASTAV TROMBOCITA - nasljedne trombocitopenije mogu imati poremećaje proteina u trombocitu, kod BSS postoji kvalitativni ili kvantitativni poremećaj GP Ib-IX-V. Potvrdni testovi su slijedeći:

� PROTOČNA CITOMETRIJA - određuju se površinski trombocitni proteini antitijelima obojenim fluorescentnim bojama.

� SDS-PAGE I IMUNOBLOTTING - određuju se proteini semikvantitativno, preferira se kod određivanja intracelularnih molekula

� IMUNOKEMIJSKE I IMUNOFLUORESCENTNE METODE. Ukoliko je gen koji uzrokuje poremećaj poznat, mogu se rabiti i metode molekularne dijagnostike. Ako pojava krvarenja ili pak preoperacijski screening (prije kirurškog zahvata ili zbog osobne/obiteljske ananmneze krvarenja) ukaže na produženo vrijeme krvarenja te normalni ili snižen broj trombocita, u daljnoj dijagnostici može pomoći određivanje APTV-a. Ako je APTV produžen, pretpostavka je da se radi o vWB i radi se test potvrde. Ukoliko je APTV normalan pretpostavka je da se radi o nasljednom poremećaju trombocita, te se pristupa specifičnom ispitivanju funkcije trombocita. Specifično ispitivanje funkcije trombocita obuhvaća:

� Volumen Trb (MPV) � Morfološka analiza razmaza periferne krvi (morfologija Trb) � Kapacitet primarne hemostaze (PFA-100, analizator adhezije) � Agregacija trombocita


� Potvrda, identifikacija i karakterizacija koristeći elektronsku mikroskopiju, imunofenotipizaciju, analizu proteina u Trb, molekularne analize.

PFA-100 u dijagnostici nasljednih poremećaja trombocita

Poremećaj COL/EPI (s) COL/ADP (s)

VWB (osim tipa 2N) P P

Glanzmannova trombastenija P P

Bernard-Soulierov sindrom P P

Trombocitni tip VWB P P

Hermansky-Pudlakov sindrom P N

Storage pool disease P N

Poremećaji izlučivanja P N

U nekim poremećajima trombocita su PFA-100 CTs patološka (produžena), ali test nije dovoljno osjetljiv niti specifičan da bi se rabio kao test probiranja za poremećaje funkcije Trc. Potrebno je još utvrditi ulogu PFA-100 CT u terapijskom praćenju funkcije Trc. Zaključak: PFA-100 je jedan od testova za ispitivanje poremećaja Trc i njihove funkcije. Za PFA-100 je ograničenje niski broj trombocita, odnosno niski hematokrit; najosjetljiviji je na vWF (osim tipa 2N).

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA TROMBOCITA (članak) Trombociti su krvne stanice bez jezgre koje se stvaraju u koštanoj srži iz megakariocita. Brzo se aktiviraju nakon ozljede krvne žile, te su ključna sastavnica primarne hemostaze. U inaktivnom obliku imaju oblik diska i sadrže citoplazmatske organele, citoskelet, OPS (open canalicular membrane system) i specifične granule. Imaju također mnoštvo glikproteina uronjenih u membranu koji djeluju kao receptori za ligande kao što su fibrinogen, kolagen, trombin, trombospondin, vWF i fibronektin. Potiču hemostazu podržavajući 4 osnovna procesa: adheziju trombocita na vaskularnu ozljedu, oslobađanje sadržaja iz granula, agregacija trombocita u primarni hemostatski ugrušak, predstavljaju prokoagulantnu površinu za rekcije sekundarne hemostaze.


Prvi korak u aktivaciji trombocita je adhezija trombocita na subendotelne strukture (proteini EC matriksa kao što su kolagen, fibronektin vWF, trombospondin i laminin). vWF je veliki multimerni protein koji se luči iz endotelnih stanica, a olakšava adheziju trombocita vežući se za trombocitni GP Ib/IX/V. Nakon adhezije nastupa aktivacija trombocita što se očituje promjenom oblika Trc i razvojem pseudopodija. Unutarstanične signalne kaskade rezultiraju povećanjem unutarstaničnog kalcija čime se pokreće oslobađanje sadržaja iz sekretornih granula;

iz α-granula PF4, tromboglobulin, trombospondin, PDGF, fibrinogen, vWF, a iz gustih granula ADP i serotonin. Taj izlučeni ADP uz kalcij uzrokuje konformacijsku promjenu GP IIb/IIIa koji je receptor za fibrinogen, on se aktivira i započinje proces agregacije (dva se susjedna trombocita vežu fibrinogenskim mostom). Agregacija završava stvaranjem primarnog hemostatskog ugruška. Prokoagulatna se površina na trombocitu stvara prilikom reorganizacije membranskih fosfolipida - premještaj fosfatidilserina na vanjsku stranu membrane trombocita, što omogućuje vezanje koagulacijskih kompleksa za trombocit.


Klinička anamneza Podrobna individualna i obiteljska klinička anamneza treba prethoditi laboratorijskim testovima za procjenu funkcije trombocita. Potrebno je uključiti podatke o vrsti i trajanju krvarenja, te da li je krvarenje spontano ili uzrokovano traumom. Obično su poremećaji trombocita obilježeni mukoznim krvarenjima, najčešće u obliku ehimoza, petehija, purpure, epistaksi i krvarenja iz desni. U slučaju poremećaja sekundarne hemostaze najčešće je riječ o krvarenjima u duboka tkiva i hemartrozama. Mnogi lijekovi i hrana mogu utjecati na funkciju trombocita, pogotovo aspirin i drugi NSAID-i inhibitori COX-2. Broj trombocita i krvni razmaz Početna evaluacija broja trombocita mora uzeti u obzir i pseudotrombocitopeniju. Pseudotrombocitopenija je najčešće uzrokovana hladnim aglutininima ili satelitizmom, i to uz EDTA kao antikoagulansom. Pseudotrombocitopenija se može lako prepoznati koristeći razmaz periferne krvi i uzorak uzet na citratu za određivanje broja trombocita. Gigantski trombociti koji se pojavljuju u nekim trombocitopenijama mogu uzrokovati lažno snižene vrijednosti trombocita, jer ih analizatori broje kao leukocite. MPV je indikator veličine trombocita. Može ukazivati i na aktivnost koštane srži, jer obično trombociti koji su tek otpušteni iz koštane srži su veći. Razmaz može ukazati na specifičnosti u morfologiji trombocita koje su svojstvene pojedinim poremećajima trombocita. Testovi za screening funkcije trombocita ili vrijeme krvarenja Nakada se za screeening funkcije trombocita koristilo vrijeme krvarenja, najčešće po Ivy-u, međutim taj je test danas napušten jer na njega utječe mnoštvo varijabli, rezultati nisu reproducibilni i ne korelira sa intraoperativnim krvarenjem. Rezultat VK ovisi o broju trombocita i funkciji trombocita, ali i koncentraciji fibrinogena, adekvatnoj funkciji krvni žila, orijentaciji i veličini incizije, mjestu incizije, kvaliteti kože, temperaturi kože, spretnosti izvođača i suradnji pacijenta. Novije automatizirane metode za screeening funkcije trombocita uključuju analize iz pune krvi, vidi PFA-100 analizator. Agregacija trombocita Testovi za agregaciju trombocita određuju sposobnost agonista da uzrokuju aktivaciju i agregaciju trombocita u in vitro uvjetima. Mogu se izvoditi iz pune krvi tehnikama impendancije ili turbidimetrijski iz plzme bogate trombocitima (PRP). Na rezultate agregacije trombocita utječu broj trombocita u uzorku, temperatura analize, intenzitet miješanja i vrijeme analize (unutar 4 sata od flebotomije), lijekovi koji utječu na funkciju trombocita. U turbidimetrijskim analizama agregacije određuje se agregacija spektrofotometrijski nakon dodatka agonista (dolazi do povećanja transmisije svijetla). Tipično se kao agonisti koriste ADP, adrenalin, kolagen i arahidonska kiselina. Oprimalna se agregacija pokazuje kao bifazična krivulja nakon dodatka ADP i adrenalina; prvo je povećanje uzrokovano primarnom agregacijom zbog aktivacije GP IIb/IIIa, dok je drugi val povećanja agregacije rezultat degranulacije trombocita sa agregacijom


dodatnih trombocita. Agonisti trombinskog receptora kao arahidonska kiselina i kolagen ne pokazuju bifazičnost agregacije. Dodatno se u agregaciji koristi i antibiotik ristocetin koji olakšava vezanje vWF za kompleks GPIb/IX/V. Normalni rezultat ovisi o funkcionalnom vWF i funkcionalnom receptoru GPIb/IX/V, tako da agregacija sa ristocetinom može ukazati na vWB i BSS. Testovi koagulacije i von Willebrandova bolest Poremećaji trombocita ne utječu izravno proteine koagulacije, međutim laboratorijska procjena poremećaja trombocita može uključivati i određivanje globalnih tetsova kao što su PV i APTV, kako bi se kao uzrok krvarenja isključila koagulopatija. vWB se ne smatra poremećajem trombocita, ali se diferencijalno dijagnostički uzima u obzir kod poremećaja trombocita jer su joj simptomi dugotrajna krvarenja mukoznog oblika. Novije metode za procjenu trombocita Noviji sistemi su PFA-100, Ultegra i Plateletworks. Mali analizatori, pogodni za POCT ili laboratorijske uvjete. PFA-100 određuje o trombocitima ovisnu primarnu hemostazu u uzorku citratne pune krvi. Koristi 2 jednokratne kazete koje sadrže membranusa središnjom aperturom obloženom agonistom agregacije (kolagen/adrenalin ili kolagen/ADP). Kroz tu aperturu prolaze trombociti velikom brzinom protoka. Analizator određuje closure time CT, vrijeme potrebno da trombociti adheriraju na membranu, agregiraju i zatvore aperturu. COL/EPI kazeta je primarna kazeta za screening, prepoznaje poremećaje trombocita uzrokovane unutarstaničnim poremećajima trombocita, vW bolest ili lijekove za inhibiciju trombocita. Nakon nje slijedi COL/ADP kazeta, čije se abnormalne vrijednosti očituju kod poremećaja trombocita i VWB, ali su vrijednosti normalne uslijed korištenja aspirina i njemu sličnih lijekova. Na rezultate dobivene sa PFA-100 utječu nizak broj trombocita i nizak hematokrit, ali ne i heparin. Za analizu strukture i funkcije trombocita može se koristiti protočna citometrija, ali je ona dostupna samo u pojedinim centrima. Detektira površinske proteine fluorescentno obilježenim antitijelima. Elektronska se mikroskopija može koristiti za procjenu ultrastrukture trombocita u pojedinim poremećajima trombocita. Dijagnostičke kategorije poremećaja trombocita 3 su kategorije:

1. poremećaji trombocita sa povećanim brojem trombocita 2. poremećaji trombocira sa normalnim brojem trombocita 3. poremećaji trombocita sa smanjenim brojem trombocita.

Sve tri kategorije su obilježene normalnim vrijednostima PV i APTV.


Algoritam za procjenu poremećaja trombocita povezanih sa krvarenjima sa normalnim ili povećanim brojem trombocita


Agregacijske karakteristike pojedinih poremećaja trombocita


Algoritam za procjenu poremećaja trombocita povezanih sa krvarenjima sa sniženim brojem trombocita (mali ili veliki trombociti)


ANEMIJE

Definicija anemije: poremećaji obilježeni smanjenim brojem eritrocita u perifernoj krvi. Može se pojaviti ili kao bolest ili, što je češće, kao znak ili simptom brojnih bolesti. S kliničkog stajališta anemija se može definirati kao smanjena sposobnost krvi za prijenos kisika, što rezultira hipoksijom i manjkom kisika u tkivima. Manjak eritrocita i anemija se procjenjuje koristeći:

A. određivanje koncentracije hemoglobina (g/L), B. hematokrita (volumni udio pune krvi koji zauzimaju Erc) i C. broj eritrocita (x1012/L).

Prema WHO anemija je određena koncentracijom hemoglobina. Kod muškaraca je anemija prisutna ako je koncentracija hemoglobina <130 g/L, a kod žena je ta granica 120 g/L. Koncentracija svih triju mjerenih eritrocitnih parametara ovisi o odnosu mase eritrocita i plazme. To znači da će parametri biti niži ako je eritrocitna masa smanjena u odnosu na plazmu (nedostatak eritrocita) ili ako je plazma povećana s obzirom na eritrocitnu masu (hiperhidracija). Primjerice kod trudnica se eritrocitna masa pri kraju trudnoće povećava oko 25%, a plazma za oko 50%, što ima za posljedicu smanjenje koncentracije hemoglobina, hematokrita i broja eritrocita, iako je apsolutna masa eritrocita povećana. Isto tako, parametri će biti veći ako je povećana masa eritrocita (povećano stvaranje i otpuštanje) ili ako je smanjen volumen plazme (dehidracija). Tako kod dehidriranih pacijenata anemiju možemo uočiti tek nakon rehidracije.

KLASIFIKACIJA ANEMIJA Dva su temeljna pristupa dijagnostici anemija, iz čega proizlazi i podjela :

1. Podjela anemija prema mehanizmu nastanka (patofiziološki pristup) 2. Podjela anemija prema MCV i retikulocitnom odgovoru (morfološki pristup).

Podjela anemija prema mehanizmu nastanka:

1. poremećeno/smanjeno stvaranje eritrocita 2. ubrzano propadanje eritrocita i 3. povećani gubitak eritrocita.

Patofiziološka (funkcionalna) klasifikacija koristi apsolutni broj retikulocita, korigirani broj retikulocita, IRF ili RPI, te određivanje metabolizma Fe kao prametre u klasifikaciji anemije.

Smanjeno stvaranje eritrocita (poremećaj proliferacije i maturacije)

Smanjeno stvaranje Erc posljedica je hipoproliferacijske anemije bilo zbog primarne bolesti koštane srži (aplastična anemija, izolirana aplazija crvene loze, sindrom mijelodisplazije i infiltracija tumorom, upala), bilo zbog niske razine eritropoetina


(smanjena stimulacija) ili drugih medijatora potrebnih za proliferaciju eritrocita (kronično bubrežno zatajenje, poremećaj rada štitnjače, manjak androgena). Smanjeno stvaranje eritrocita obilježje je i anemija zbog poremećaja u sazrijevanju eritrocita, kod nedostatka B12, folne kiseline ili željeza.

Ubrzano propadanje eritrocita (poremećaj preživljenja)

Eritrociti u prosjeku žive oko 120 dana. Život eritrocita kraći od 100 dana upućuje na ubrzano propadanje ili hemolizu eritrocita. Anemija će se javiti kada koštana srž više ne bude u stanju nadomjestiti propale eritrocite. U tom trenutku duljina života eritrocita iznosi oko 20 dana, iako koštana srž stvara 5 puta više eritrocita nego u bazalnim uvjetima (neučnkovita eritropoeza). Ovaj tip anemije naziva se hemolitička anemija. Hemoliza može biti intravaskularna (endotoksin, lijekovi, toplina, DIK, anemija srpastih stanica) i ekstravaskularna (autoimune enzimopatije, membranopatije).

Gubitak eritrocita (poremećaj preživljenja)

Gubitak krvi, odnosno eritrocita najčešći je uzrok anemije. Krvarenje se može javiti kao klinički jasno krvarenje zbog traume, obilno krvarenje iz GIT ili obilno ginekološko krvarenje. Međutim, krvarenje može biti i okultno, zbog raka ili polipa debelog crijeva, ili može biti jatrogeno zbog čestih venepunkcija, nakon ponavljanih dijaliza ili prečestih darivanja krvi ili krvnih pripravaka. Krvarenje može biti akutno ili kronično. Podjela anemija prema MCV i retikulocitnom odgovoru

1. makrocitne anemije, MCV >100 fL 2. normocitne anemije, MCV 80 – 100 fL 3. mikrocitne anemije, MCV <80 fL

Hematološkim brojačima dobije se podatak o MCV-u, uz tu srednju vrijednost brojači pokazuju i odstupanje – koeficijent varijacije eritrocitnog volumena, a dobije se iz SD krivulje raspodjele eritrocitnog volumena. Taj se parametar naziva RDW (red cell distribution width) i izražava se kao postotak. Povećanje ovog parametra upućuje na prisutnost stanica različitih veličina (anizocitozu).

Makrocitna anemija

Temeljna značajka makrocitnih anemija je MCV>100 fL. Makrocitne anemije nastaju zbog nekoliko različitih uzroka. "Stres eritrocitoze", odnosno pomak prema nezrelim oblicima eritrocita dovodi do povećanog otpuštanja retikulocita koji imaju povećani MCV. Tako se makrocitoza javlja kod hemolitičkih anemija, hemoragija, retikulocitoza, zbog djelovanja eritropoetina, kod aplastične anemije i eritroleukemija. Poremećaj sinteze i metabolizma DNA također ima za posljedicu makrocitnu anemiju. Ovaj poremećaj karakteriziran je nedostatkom vitamina B12 i folne kiseline (megaloblastična anemija) ili nakon primjene antimetabolita koji interferiraju sa sintezom DNA kao što su hidroksiureja, zidovudin, citarabin, metotreksat i sl. Makrocitna anemija javlja se kod nekih bolesti koštane srži kao što su mijelodisplazija, kongenitalna diseritropoetska anemija, leukemija velikih granuliranih limfocita i multiplog mijeloma. Osim toga, javlja se i kod poremećaja lipida (bolesti jetre, hipotireoza, hiperlipidemija) i kod alkoholizma.


Normocitna anemija

Kod normocitnih anemija vrijednost MCV je u normalnim granicama od 80 – 100 fL. U ovu skupinu ubraja se veliki broj anemija različitih uzroka (akutni gubitak krvi, anemija kronične bolesti, kronično zatajenje bubrega).

Mikrocitna anemija

Kod mikrocitnih anemija MCV je snižen i obično ispod 80 fL. Mikrocitoza u biti predstavlja sniženu količinu hemoglobina u eritrocitu (hipokromiju) i praćena je sniženim MCH i MCHC. Mikrocitna anemija je najčešće uzrokovana nedostatkom željeza (sideropenična anemija, anemija kroničnih infekcija), rijetko nedostatkom bakra, poremećajem sinteze hema (otrovanje olovom, kongenitalna i stečena sideroblastična anemija) i smanjenom sintezom globina (talasemija i druge hemoglobinopatije). Dva su tipa promjena u anemijama. Prve se odvijaju u koštanoj srži, dok su druge degenerativne i opažaju se u mnogim organskim sustavima. Većina anemija pokazuje kompenzatornu hiperplaziju eritroidne loze (posebice hemolitičke anemije). Kompenzatorni odgovor i pojava eritroblasta izvan koštane srži (u slezeni, rjeđe u jetri i limfnim čvorovima) naziva se ekstramedularna hematopoeza. U tim se organima hematopoeza odvija tijekom fetalnog života, i zato se ekstramedularna hematopoeza češće opaža kod djece, posebice dojenčadi. Zbog anemične hipoksije, posebice u kroničnih anemija, može nastati masna i parenhimatozna degeneracija ostalih organa.

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA ANEMIJA Dijagnostika anemija započinje anamnezom i kliničkim pegledom. U bolesnika s blagom anemijom obično nema nikakvih simptoma, tek kada hemoglobin padne ispod 90 g/L zapažaju se tipični simptomi. Zbog anemije povećava se minutni volumen srca na račun porasta frekvencije i manjeg udarnog volumena. Zbog anemije raste 2,3-DPG u eritrocitima, pa se disocijacijska krivulja hemoglobina pomiče desno, tako da se kisik brže i lakše otpušta iz hemoglobina u tkiva. Težina i uzrok (tip) anemije mogu se utvrditi dijagnostičkom laboratorijskom obradom. Laboratorijski probir započinje pretragama krvne slike (određivanje broja eritrocita, hemoglobina, hematokrita, eritrocitne konstante), DKS i broja retikulocita. Dodatno se mogu odrediti bilirubin, prisutnost krvi u mokraći i stolici. Rezultati testova probira zajedno sa anamnestičkim podacima mogu ukazivati na mogući uzrok anemije. Testove probira slijede specifični dijagnostički testovi kojima se dokazuje etiologija i patofiziologija anemije (npr. kod hemolitičkih anemija Coombsov test, elektroforeza hemoglobina, aktivnost enzima u eritrocitu i dr.). Prekretnica u laboratorijskoj dijagnostici anemija je uvođenje automatskih brojača stanica u laboratorijsku hematologiju. Najviše vrijednosti hemoglobina, hematokrita i eritrocita koje se smatraju normalnima nalaze se kod novorođenčeta. U novorođenčkoj su dobi Erc makrocitni, a retikulociti do 6%. Na 100 leukocita može se naći do 10 eritroblasta i to tijekom prvog tjedna života. Te se vrijednosti približavaju vrijednostima odraslih do 14 godine.


ERITROCITNI INDEKSI (MCV, MCH i MCHC) Procjenu veličine Erc i sadržaja Hb u njima omogućuju tzv. eritrocitni indeksi. Oni se izračunavaju koristeći vijednosti hemoglobina, Htc i Erc. Hematokrit (Htc) je omjer volumena krvnih stanica i krvi, govori koliki je volumen stanica u jednoj litri krvi (L/L). Hematokrit jako ovisi o predanalitici: kod hipohidracije je povišen (zajedno s Hb, dok su konstante niže), kod hiperhidracije je snižen (zajedno s Hb, dok su konstante povišene). Na to treba paziti i uzorkovanje izvršiti 12h nakon jela i spavanja. Hematološki analizatori, koji se danas rabe, izračunavaju hematokrit iz broja eritrocita i srednjeg staničnog volumena, MCV. MCV (mean cell volume) je prosječni volumen eritrocita (u fL) i klasificira eritrocite prema volumenu. Klasično se izračunavao dijeljenjem brojem eritrocita sa hematokritom. Moderni brojači mjere MCV direktno, optički – raspršenjem zrake kod 0° i impendancijom. Ovaj je indeks najvažniji za podjelu anemija. MCV (fL) = Hct / Erc MCV se rabi za razvrstavanje eritrocita na normocite (80–100 fL), mikrocite (<80 fL) i makrocite (>100 fL). U razmazu periferne krvi teško je procjeniti MCV (on je mjera volumena, dok u razmazu mi gledamo promjer stanica). Npr. sferociti izgledaju manji od normalnih eritrocita, a zapravo imaju normalan MCV, dok target stanice izgledaju veće, a i one imaju normalan MCV. Razlog tome je što mikroskop daje 2D sliku i mjeri promjer eritrocita, dok MCV govori o volumenu – to nisu iste informacije! MCV >115 fL sumnja su na prisutnost megaloblastične anemije. MCH (mean corpuscular hemoglobin) nam govori kolika je prosječna količina hemo-globina u eritrocitu. MCH (pg) = Hb / Erc MCH dobro korelira s MCV, MCHC i Hb – manji eritrociti sadrže manje hemoglobina, dok veći eritrociti sadrže više hemoglobina. Ponekad, kada je smanjena koncentracija hemoglobina i smanjen broj eritrocita, ipak MCH ostaje normalan. Razlog tome leži u njegovoj definiciji kao konstante - omjer koncentracije hemoglobina i broja eritrocita. Kada dolazi do disproporcionalne promjene broja eritrocita i hemoglobina, mjenja se i MCH. MCH, zajedno s MCHC, je snižen kod sideropenije i talasemije. MCHC (Mean corpuscular hemoglobin concetration) govori nam o prosječnoj koncentraciji hemoglobina u eritrocitu. MCHC (g/L) = Hb / Hct = MCH / MCV I MCHC dobro korelira s ostalim eritrocitnim konstantama. Ovaj indeks pokazuje je li populacija eritrocita normokromna, hipokromna ili hiperkromna. Puno bolje se određuje hidrodinamičkim fokusiranjem, nego impendancijom jer se kod nje ponekad zna mijenjati. Lažno povišeni rezultati znaju se javiti kod:

� hemolize – jer se poveća koncentracija hemoglobina u krvi � lipemije - tako se može prepoznati lipemija u punoj krvi. Potrebna je

korekcija!


� hladnih aglutinina – dolazi do aglutinacije eritrocita i smanji se ukupan broj eritrocita. MCHC kod ponovljenih mjerenja zna jako varirati: 450, pa 500, pa 700 g/L i sl.

� krivi omjer krvi i EDTA – premalo krvi u epruveti i koaguliraju se eritrociti. Vrijednosti MCHC iznad 360 g/L treba provjeriti !!! MCHC je, zajedno s MCH, snižen kod sideropenije i talasemije. Povećane vrijednosti MCHC javljaju se kod sferocitoze i dehidriranih eritrocita. Muškarci od 12.–17. godine imaju veći MCHC, a manji MCV i MCH nego žene. RDW (red cell distribution width) je koeficijent varijacije u volumenu eritrocita, odnosno konstanta koja nam govori o distribuciji eritrocita prema volumenu (anizocitozi). Ukoliko je RDW veći od 16% govorimo o anizocitozi – eritrociti su različitih veličina. Povišene vrijednosti RDW-a tijekom liječenja deficitarnih anemija pouzdan je i koristan pokazatelj učinkovitosti terapije. Kod interpretacije RDW-a treba pripaziti: kod povećane SD MCV (heterogena stanična populacija) i povećanog MCV-a, vrijednosti RDW-a su normalne. Obratno, normalna SD MCV i mali MCV daju povećani RDW. Pojašnjenje se može naći u histogramu odnosno DKS-u. RETIKULOCITI I RETIKULOCITNI INDEKSI Broj retikulocita (nezrelih eritrocita s ostacima RNA) u perifernoj krvi označava stupanj aktivnosti koštane srži i jedan je od najkorisnijih laboratorijskih testova u patofiziološkoj klasifikaciji anemija. Retikulociti se mogu brojati ručno ili određivati na automatskom analizatoru. Retikulociti se mogu izraziti na nekoliko načina :

1. broj Rtc na 1000 Erc (promili) – relativni broj 2. apsolutni broj retikulocita (xErc, u jedinicama x109/L) – preporuča se ovaj

način izvještavanja jer predstavlja učinkovitiju procjenu broja retikulocita u odnosu na broj Erc u cirkulaciji

3. preko indeksa stvaranja retikulocita (RPI - reticulocyte production index) – normalno se retikulociti zadržavaju u perifernoj cirkulaciji do jedan dan, a ona sazrijevaju u Erc; kada potrebe za Erc rastu u cirkulaciji – pojačano izlučivanje eritropoetina kao odgovor na anemiju ubrzava sazrijevanje eritrocita, dolazi do mnogo bržeg pomaka retikulocita iz koštane srži u perifernu krvi, KS otpušta retikulocite ranije od uobičajenog, stoga su oni nezreliji (stres retikulociti) i duže se zadržavaju na periferiji.

Referentna vrijednost broja retikulocita kreće se od 5–15‰. No, tako iskazani retikulociti samo su test probiranja jer nas taj rezultat može zavarati. Tek apsolutni broj retikulocita (60 000 unutar normalnih referentnih granica) pokazuje da je broj retikulocita normalan, a ne povećan. Da bi se što objektivnije utvrdila veličina odjeljka retikulocita kao mjera veličine eritropoeze često se rabi korigirani apsolutni broj retikulocita koji je jednak apsolutnom broju retikulocita podijeljenom s vremenom sazrijevanja retikulocita (u danima). RPI govori o prikladnosti odgovora koštane srži na anemiju. Ovim indeksom istovremeno se korigiraju dva problema broja retikulocita: prvi je stupanj prisutne


anemije (izražava se na Hct od 45), a drugi je život retikulocita u perifernoj krvi (umjesto jedan uzima se dva dana). Jednadžba glasi : RPI = (Hct (pacijent) / 0,45L/L ) x (Rtc% / 2) RPI>2 upućuje na adekvatan odgovor koštane srži stvaranjem retikulocita. Ako se dokaže izraziti porast broj retikulocita, bez znakova gubitaka krvi, treba svakako isključiti hemolitičku anemiju. RPI<2 upućuje na neadekvatan odgovor koštane srži (hipoproliferaciju). IRF (immature reticulocyte fraction) je parametar sa hematoloških brojača koji govori o stupnju zrelosti retikulocita – mlađi retikulociti imaju više RNA, a stariji/zreliji manje RNA. Određuje se koristeći intenzitet bojenja retikulocita. Povećani IRF u slučaju anemije ukazuje na adekvatan odgovor koštane srži, i obratno. CLSI preporuča da IRF zamjeni RPI indeks, zato jer se taj parametar smatra prediktivnim za dobar ishod nakon primjene rHuEpo – vrijendosti mu rastu prije porasta retikulocita i hemoglobina. RAZMAZ PERIFERNE KRVI Razmaz periferne krvi može otkriti vrlo vrijedne pokazatelje koji su važni u dijagnostici pojedinih anemija, posebice hemolitičkih. Anizocitoza označava varijacije u veličini eritrocita. Svi eritrociti su sličnog oblika, ali različite veličine. Gaussova krivulja za MCV ima oblik tupog zvona. RDW je povećan. Poikilocitoza označava varijaciju u obliku eritrocita. Javlja se kod diseritropoeza. Dismorfična populacija Erc označava prisutnost dvije različite populacije eritrocita. Dismorfične populacije moguće je primjetiti i na RBC histogramu koji pokazuje dva pika – jedan od jedne, drugi od druge populacije. Javlja se kod: transfuzija eritrocita, mikrocitne anemije s povećanim brojem retikulocita (terapija željezom) i kod nekih mijelodisplazija (jedna populacija je mikrocitna, a druga makrocitna). Neki od eritrocita javljaju se s plavkastim i sivkastim obojenjem i veći su od običnih eritrocita. To su retikulociti. Polikromazija se javlja kod: normalno kod novorođenčadi, ekstramedularne eritropoeze, diseritropoeze i regenerativnih anemija. Kod hipokromije su eritrociti su blijedi, a hemoglobin se rapodjeljuje uz rub membrane (leptociti). Javlja se kod: IDA (uz anizocitozu i anizokromiju) i ostalih poremećaja sinteze hemoglobina. Akantociti imaju 3–12 izbočina na membrani. Nastaju zbog promjena u sastavu lipida u membrani, povećana je količina kolesterola u membrani. Javljaju se kod: poremećaja u metabolizmu lipida, nasljedna akantocitoza (abetalipoproteinemija), bolesti jetre (ciroza, alkohol), nakon splenektomije. Dakriociti (teardrops) nastaju u slezeni. Zbog promjena u membrani i inkluzija u eritrocitu, provlačeći se kroz uske kapilare u slezeni, eritrocitima se mijenja oblik u dakriocite. Oni su puno rigidniji. Dakriocit je ireverzibilan oblik. Javljaju se kod: splenomegalije, talasemije, mijelofibrozama s mijeloičnim metaplazijama. Drepanociti (sickle cell) - pri niskom pO2 ili niskom pH, HbS polimerizira i precipitira unutar eritrocita. Drepanociti su iznimno fragilni i u slezeni puknu. Smanjena im je


sposobnost stvaranja rouleax formacija i zato ovi pacijenti imaju sniženu sedimentaciju. Javljaju se kod HbS bolesti (sickle cell anemija). Ehinociti imaju preko 50 izbočina na membrani i reverzibilni su (osim ako odu do forme sferocita). Najčešće nastaju zbog predanalitičke greške: uzorak predugo stoji, zbog kontakta sa staklom ili prekoncentriranih otopina. Tekućina izlazi iz eritrocita i mijenja im se oblik. Da bismo provjerili nastaju li in vivo, razmaz treba napraviti između dva plastična stakla i pogledati neobojene eritrocite (mokri preparat). Patološki se javljaju kod: akutnog zatajenja bubrega, bolesti jetre, uremije, deficita piruvat kinaze, tumora želuca, nasljednih hemoglobinopatija i kod terapije heparinom. U svim stanjima u kojima je membrana eritrocita osjetljiva na osmolarnost okolnih tekućina mogu se naći ehinociti. Sferociti su stanice koje su izgubile bikonkavnost. Izgledaju tamnije, hiperkromno, zbog smanjenog omjera volumena i površine. Sferociti imaju povećanu osmotsku osjetljivost (↓ORE - počinje pri 0,6%, završi pri 0,4%). Ako je prisutan manji, do srednje velik broj sferocita, možemo posumnjati na nasljednu sferocitozu. Nakon splenektomije, broj sferocita će se još povećati. Ako je prisutno puno sferocita, čak do 100%, radi se o autoimunoj hemolitičkoj anemiji. (Sferociti upućuju na autoimuni uzrok). Sferociti se javljaju i kod: teških upala i ABO inkompatibilnosti. Stomatociti nastaju zbog poremećaja u lipidnom dvosloju – nedostatak stomatina. Uzrokuju ih sniženi pH i kationski lijekovi. ↓ ORE. Javljaju se kod: nasljedne stomatocitoze, hemolitičkih anemija, alkoholne ciroze, trovanja, tumora. Target stanice imaju rubni dio uz membranu i središnji dio bogat hemoglobinom, dok je sredina svjetlija, Javljaju se kod: talasemija, hemoglobinopatija (HbS i HbC), splenektomije, opstruktivnih bolesti jetre, IDA, bolesti bubrega. ↑ ORE. Mogu se pojaviti i kao artefakti kada se razmazi priređuju u okolišu sa visokom vlagom ili brzo suše. Normalno se eritrociti ne lijepe jedan za drugoga jer im je površina membrane negativno nabijena. Ako se poremeti površinski naboj ili se na njih vežu protutijela, eritrociti će se međusobno poljepiti. Rouleaux formacije se javljaju kod: teških upala, monoklonskih gamapatija (osim kod mijeloma lakih lanaca ), povećane količine fibrina i globulina. Ponekad, ako krv duže stoji u epruveti, mogu nastati rouleaux formacije.

1. HIPOPROLIFERACIJSKE ANEMIJE Nastaju zbog urođenog ili stečenog oštećenja hematopoetske matične stanice i/ili usmjerene matične stanice ili disfunkcije hematopoetskog mikrookoliša. Dijelovi koštane srži u kojima se inače odvija hematopoeza zamijenjeni su masnim ili fibroznim tkivom. Obilježene su hipocelularnošću i normocitno normokromnom anemijom. APLAZIJA – izraženo smanjeno stvaranje svih vrsta stanica HIPOPLAZIJA – smanjeno stvaranje stanica određenog reda – eritrocitna, mijeloidna ili megakariocitna hipoplazija.


Ako je zahvaćena matična stanica razvija se PANCITOPENIJA (nedostatak stanica sve tri loze) i dijagnoza je aplastična anemija. Ako je zahvaćena neka od matičnih stanica niža u redu, razvija se hipolazija određenog reda stanica.

Aplastična anemija

Aplastična anemija je određena pancitopenijom i nalazom hipocelularne koštane srži, iako je struktura i izgled stanica, te njihovo vrijeme preživljavanja normalno. Vrlo je rijetka. Kriteriji za dijagnozu aplastične anemije je hipocelularnost koštane srži <25% (biopsija), uz dodatno dva od sljedećih kriterija:

− broj granulocita <0,5 x109/L

− broj trombocita <20 x109/L

− anemija s korigiranim brojem retikulocita <1% (<40 x109/L). Točan uzrok nastanka aplastične još nije utvrđen. Nekoliko je teorija o mogućim uzrocima: imunološka supresija hematopoeze (autoimuna bolest), defekt matične stanice, defekt matriksa koštane srži, deficit faktora rasta. Aplastične se anemije obično dijele na stečene i kongenitalne (Fanconijeva anemija). Kongenitalne aplastične anemije dijagnosticiraju pedijatri, dok su najučestalije stečene aplastične anemije: anemija kronične bolesti, anemija u kroničnoj bubrežnoj insuficijenciji, mijeloftizična anemija i anemija u endokrinim bolestima. Fanconijeva anemija Fanconijeva anemija je poremećaj uzrokovan abnormalnom fragilnošću kromosoma. Uz progresivnu pancitopeniju, pacijenti imaju i razne kongenitalne anomalije (displazija kosti, poremećaji bubrega, malformacije drugih organa te mentalna retardacija). Fanconijeva se anemija obično očituje od 5. do 10. godine života, te se u oko 10% oboljelih razvija akutna mijeloična leukemija. Na Fanconijevu anemiju treba posumnjati kod djece s kongenitalnim malformacijama kod kojih se razvija pancitopenija. Oni imaju znatno povišene vrijednosti α-fetoproteina. U perifernoj krvi je za dijagnozu tipična pancitopenija. Eritrociti su normokromni i normocitni, ali mogu biti i makrocitni. Javlja se blaga do srednje jaka poikilocitoza i anizocitoza. Broj retikulocita može ponekad zbuniti, posebno ako dodatno postoji i teška anemija. Zato uvijek treba odrediti apsolutni broj retilukocita ili ih korigirati za stupanj anemije prije interpretacije. Apsolutni broj retikulocita kod ovih pacijenata manji je od 25x109/L. Javlja se i trombocitopenija, te leukopenija u kojoj je vodeća neutropenija, dok početni broj limfocita i monocita može biti normalan. Fanconijeva se anemija liječi primjenom androgena, faktora rasta i presađivanjem alogene koštane srži. Stečene aplastične anemije Oko 50–70% slučajeva su idiopatske aplastične anemije. Mogu biti uzrokovane lijekovima (najčešći lijekovi koji uzrokuju aplastičnu anemiju su kloramfenikol, citostatici, sulfonamidi, nesteroidni antireumatici – fenilbutazon i indometacin –


antiepileptici i soli zlata). Neki od tih lijekova se teško metaboliziraju i nakupljaju se u koštanoj srži, gdje oštećuju matriks koštane srži, metabolizam i preživljavanje stanica, ali, smatra se i da mogu pokrenuti imunološki posredovanu supresiju koštane srži. Prvo se razvija neutropenija, prije anemije i trombocitopenije zbog relativno kratkog poluživota neutrofila. Oštećenja KS mogu nastati i djelovanjem kemijskih agensa, ionizacijskim zračenjem, infekivnim agensima. Danas se pretpostavlja da toksični učinak (kemijske tvari, lijekovi, virusi ili antigeni) mogu uzrokovati aktivaciju imunosnog sustava, tj. aktivaciju limfocita T, posljedica čega je apoptoza matičnih stanica u koštanoj srži. Aktivacijom limfocita (Th1) dolazi do pojačanog izlučivanja IFN-γ, koji dovodi do pojačane ekspresije Fas liganda na površini matičnih stanica i one ulaze u apoptozu. Naknadno ih uništavaju citotoksični limfociti T. Klinički simptomi posljedica su smanjenog broja krvnih stanica. Prognoza isključivo ovisi o stupnju pancitopenije. Laboratorijski nalazi pokazuju normocitnu, normokromnu anemiju ili makrocitozu, uz manjak ili nedostatak retikulocita. Leukopenija je posljedica granulocitopenije. Izgled granulocita je normalan, a ALP je povišen. Trombocitopenija je uvijek prisutna. Punkcija koštane srži može upozoriti na praznu koštanu srž, ali je temeljna dijagnostička pretraga biopsija koštane srži. Ona pokazuje izrazitu hipoplaziju, te zamjenu hematopoetskog tkiva masnim tkivom, pri čemu ono čini oko 50 – 70%, pa i više, koštane srži.

Početna terapija je pretežno potporna – transfuzije eritrocita i koncentrata trombocita, uz liječenje infekcija. Ciljano liječenje, tj. ponovna uspostava funkcije koštane srži, pokušava se provesti primjenom transplantacije alogene koštane srži ili imunosupresivnom terapijom.

Paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH) PNH je klonalna bolest matične stanice zbog stečenog somatskog poremećaja koji vodi do sinteze abnormalnog klona diferenciranih hematopoetskih stanica. Eitrociti, trombociti i neutrofili koji tako nastaju vežu povećane količine komplementa i bitno im povećana osjetljivost lizu koju posreduje komplement. Bolest se očituje s tri glavne kliničke slike: hemolizom, sklonošću trombozama i slikom aplastične anemije. Bolest je posljedica somatske mutacije gena pig-A koji kodira enzim za sintezu GIP sidra. Dakle, poremećaj gena uzrokuje poremećaj u sintezi glikozil-fosfatidil-inozitolnog sidra (GIP). Taj lipidni spoj se nalazi u membrani stanica i važan je za vezanje regulatornih proteina koji spriječavaju amplifikaciju aktivacije komplementa (DAF i MIRL i drugih). Temeljna značajka PNH je kronična intravaskularna hemoliza s akutnim egzacerbacijama koje uzrokuju hemoglobinuriju. Akutnoj hemolizi često prethodi napadaj boli u trbuhu (zbog privremene okluzije vena u digestivnom traktu). Bolest se razvija postupno i ima kroničan tijek. Jednako zahvaća žene i muškarce, a kao najčešći uzroci smrti navode se venska tromboza i komplikacije zbog aplazije koštane srži.


Laboratorijske značajke: anemija, retikulocitoza, povećana aktivnost LDH (raspadaju se stanice), smanjen haptoglobin, hemoglobinurija, hemosiderinurija, aplazija (pancitopenija, aplazija koštane srži), manjak željeza. Dijagnoza se postavlja Hamovim testom – povećana osjetljivost eritrocita na komplement aktiviran acidifikacijom seruma. Ali, danas je Hamov test zamjenilo određivanje stanica s manjkom GPI sidra pomoću protočne citometrije. Protočna citometrija je puno osjetljiviji test i pokazuje prisutnost i do 1% PNH stanica i to i na granulocitima, i na monocitima i na limfocitima. Protočna citometrija koristi monoklonalna At na GPI vezane molekule. Izolirana aplazija crvene krvne loze Izolirana aplazija crvene krvne loze iznimno je rijetko stanje karakterizirano izoliranom anemijom bez retikulocita i nedostatkom prethodnih nezrelih eritroidnih stanica u koštanoj srži. Ostale stanice su prisutne i morfološki normalne. Bolest može biti urođena i stečena. U koštanoj srži bolesnika sa izoliranom aplazijom crvene krvne loze nema proeritroblasta, prve prethodne nezrele stanice crvene loze koja je morfološki prepoznatljiva. Anemija u kroničnoj bubrežnoj insuficijenciji U kroničnoj bubrežnoj insuficijenciji javlja se normocitna i normokromna anemija. Ona se može ocijeniti kao hipoproliferacijska, a posljedica je poremećaja ekskretorne i endokrine funkcije bubrega. Težina anemije obično odgovara težini bubrežne insuficijencije. Uzroci pojave anemije kod kroničnih bubrežnih bolesti su: 1) smanjeno stvaranje eritropoetina. Koštana srž je hipoproliferativna i smanjeno je stvaranje eritrocita. 2) toksični učinak uremičnih toksina na koštanu srž (inhibicija koštane srži toksičnim metabolitima koji se ne eliminiraju iz organizma zbog poremećene ekskretorne funkcije bubrega). Hemodijalizom se može popraviti, ali često ne i u potpunosti korigirati anemija, jer nedostaje eritropoetin. 3) razvoj sekundarnog hiperparatireoidizma 4) pravi nedostatak željeza zbog gubitka krvi iz probavog i genitalnog sustava, te gubitak željeza i folne kiseline tijekom dijalize (folna kiselina je dijalizabilna!!!). U kroničnoj bubrežnoj insuficijenciji postoji blaga hemoliza, tj. skraćen vijek života eritrocita. Anemija je normocitna i normokromna, a ovisno o dodatnim uzročnim faktorima, može biti makrocitna ili s obilježjima sideropenične anemije. U razmazu se mogu naći fragmentirani eritrociti (ehinociti i shistociti). Broj retikulocita je normalan ili blago smanjen, a očitih znakova hemolize nema. Hematokrit je lažno snižen zbog hiperhidracije koja je vrlo česta u kroničnim bubrežnim bolestima. Vrijednosti serumskog željeza variraju. Definitivnu potvrdu manjka Fe dobivamo mjerenjem feritina koji je snižen, te cirkulirajućih transferinskih receptora koji su povišeni. Funkcija trombocita je poremećena razmjerno stupnju uremije i djelotvornosti dijalize.


Nadomjesna terapija eritropoetinom kod većine pacijenata će korigirati anemiju te znatno poboljšati kvalitetu života. Uz terapiju eritropoetinom, uvijek treba davati i željezo, najbolje intravenozno. Anemija u endokrinim bolestima Osim eritropoetina i drugi hormoni sudjeluju u regulaciji eritrocitopoeze. Hormoni koji utječu na eritrocitopoezu su hormoni hipofize, štitnjače, kore nadbubrežne žlijezde i gonada. U pravilu su sve ove anemije blage i korigiraju se supstitucijskom terapijom osnovne bolesti. Riječ je o prilagodbi eritrocitopoeze na smanjenu potrebu tkiva za kisikom. Anemija zbog infiltracije koštane srži stranim tkivom (mijeloftizična anemija) Ovaj oblik anemije najčešće nastaje zbog infiltracije koštane srži malignim stanicama (metastazama), rjeđe granulomatoznim tkivom, fibrozom ili tvarima (metabolitima) koji se odlažu u koštanoj srži zbog urođenog metaboličkog poremećaja. Zbog poremećene strukture koštane srži u krvi se pojavljuju mlađi oblici stanica granulocitne i eritrocitne loze (leukoeritroblastoza), šistociti i dakriociti. Metastatski tumori su najčešći uzrok infiltracije i posljedičnog oštećenja hematopoetskog mikrookoliša koštane srži. U koštanu srž najčešće metastazira tumor dojke, prostate, pluća. Infiltracija koštane srži remeti mikrookoliš koštane srži stvaranjem fibroze. Zbog oštećenja barijere prema krvi, mladim je stanicama omogućen ulazak u krv. Do takvih oštećenja dolazi jer strano tkivo ispušta u mikrookoliš koštane srži otpadne produkte svog metabolizma, izlučuje razne humoralne činitelje i citokine, izaziva direktnu inhibiciju i lizu stanica koštane srži, te kompetira za hranjive tvari. Anemija je obično normocitna i normokromna, različitog intenziteta. Česte morfološke promjene eritrocita su poikilocitoza, anizocitoza, prisutnost dakriocita ili šistocita. Karakteristična je leukoeritroblastoza i pomak u lijevo. Za postavljanje dijagnoze mijeloftizične anemije potrebno je dokazati infiltraciju koštane srži stranim tkivom pretragom biopsije koštane srži, često uzetom na više mjesta. Citološki nalaz često nije dovoljan jer su promjene žarišne distribucije. Scintigrafske i radiološke pretrage mogu otkriti patološku pregradnju kostiju, odnosno osteolitička ili osteoplastična žarišta. Isto tako ni leukoeritroblastoza nije specifična, jer se može pojaviti i kod akutnog gubitka krvi, u stanjima hipoksije, u težim infekcijama i hemolitičkoj krizi.

2. ANEMIJE ZBOG POREMEĆAJA SAZRIJEVANJA Sideropenična anemija (manjak Fe, poremećena sinteza hema) Sideropenična anemija (IDA – iron deficiency anemia) je najčešći oblik anemije, a posljedica je manjka željeza u organizmu. Uzroci manjka željeza:

� Prehrana siromašna željezom � Poremećaj apsorpcije željeza (gastrektomija, celijakija, malapsorpcija) � Kronična krvarenja (iz maternice, GIT - ulcerozni kolitis, iz mokraćnog sustava � Povećane potrebe za željezom (ubrzani rast, trudnoća, dojenje)


� Ostalo - intravaskularna hemoliza i gubitak željeza urinom. Nedovoljna količina željeza u prehrani vrlo rijetko uzrokuje sideropeničnu anemiju. Glavni i najčešći uzrok sideropenične anemije je kronično krvarenje. Najčešće se viđa kod žena generativne dobi s obilnim mjesečnicama, što većina žena smatra normalnom pojavom. Pojava sideropenične anemije kod muškaraca odmah upućuje na krvarenje, i to najčešće iz GIT. Sideropenična anemija razvija se kronično i može se podijeliti u 4 faze: 1. latentna sideropenija, ID (iron depletion) - Troše se zalihe željeza iz skladišta, na

što organizam reagira povećanjem sinteze transferina. Željezo u serumu je još uvijek normalno, nema anemije, morfologija eritrocita je normalna, ali raste RDW, dok je snižen feritin. RDW je prvi hematološki znak razvoja latentne sideropenije kod neanemičnih pacijenata. (To se ne odnosi na hospitalizirane pacijente kod kojih na RDW i feritin utječe prisutnost drugih bolesti.)

2. manifestna sideropenija, IDE (iron deficient erythropoiesis) - rezerve željeza su potpuno iscrpljene i nema ga dovoljno za ugradnju u protoporfirinski prsten i za sintezu hema. Zato se protoporfirin akumulira u stanici i kompleksira s cinkom, te stvara kompleks cink-protoporfirin (ZPP), koji se može mjeriti spektrofotometrijski ili HPLC-om. Serumsko željezo je nisko, ali još se ne može vidjeti anemija i hipokromija, ali mikrocitoza da.

3. sideropenična anemija, IDA (iron deficiency anemia) - razvija se hematološka slika sideropenične anemije s mikrocitnom, hipokromnom anemijom. Svi laboratorijski testovi za status željeza su značajno abnormalni: serumsko željezo je sniženo, zajedno s feritinom. A TIBC i UIBC su povećani.

PARAMETAR NORM ID IDE IDA

Feritin (µg/L) 30 – 400 ↓ ↓ ↓ sTfR (µg/L) 1,15 – 2,75 N ↑ ↑ TfR-F indeks 0,63 – 1,8 ↑ ↑ ↑

Serum Fe (µmol/L) 11 – 32 N ↓ ↓ TIBC (µmol/L) 49 – 72 N, blago ↑ ↑ ↑

% saturacije 30 N ↓ ↓ Hb muškarci (g/L) 138 – 175 N N ↓

Hb žene (g/L) 119 – 157 N N ↓ Morfologija Erc normocitna normocitna normocitna mikrocitna

normokromna normokromna normokromna hipokromna

Simptomi bolesti:

- umor, slabost, nemogućnost koncentracije - disfunkcija mišića - nemogućnost regulacije tjelesne temperature kad je hladno ili prilikom stresa - atrofični gastritis sa smanjenom želučanom sekrecijom.


Anemija pokazuje tipičnu mikrocitnu, hipokromnu sliku u perifernoj krvi s nalazom leptocita, a eritrocitni indeksi MCV i MCH su sniženi. U serumu je izrazito sniženo željezo, dok su TIBC i UIBC povišeni. Transferin je saturiran željezom <10%. Feritin, kao najosjetljiviji pokazatelj stanja željeza u rezervama, izrazito je snižen. Manjak željeza može se odrediti i mjerenjem transferinskih receptora (TfR) u serumu. Oni su porijeklom iz eritroidnih prethodnih stanica koštane srži, te su dobar kvantitativni pokazatelj ukupne eritrocitopoeze. Njihova je koncentracija u serumu direktno proporcionalna eritrocitopoezi, a obrnuto proporcionalna sadržaju željeza u rezervama. Stoga bolesnici sa smanjenom količinom željeza u rezervama imaju povećanu razinu TfR u serumu. U bolesnika s manjkom željeza nije moguća sinteza hema (hem sintetaza ili fero kelataza ne može ugraditi željezo u protoporfirin IX i ne sintetizira se hem). U tim se slučajevima umjesto željeza u protoporfirin IX ugrađuje cink. Određivanjem cink-protoporfirina može se mjeriti manjak željeza. Međutim, ovaj metabolit ne otkriva razlog manjka željeza pa je, osim u sideropeničnoj anemiji, cink-protoporfirin povišen i u anemiji kronične bolesti u kojoj ima željeza, ali se ono ne oslobađa iz rezervi, te kod otrovanja olovom koje inhibira hem sintetazu. Željezo se najčešće primjenjuje per os u obliku fero-sulfata ili fero-glukonata, koji ima manje nuspojava (mučnina, bol u žličici, opstipacija ili proljev). Željezo je najbolje primijeniti na prazan želudac zajedno s vitaminom C jer je apsorpcija tada najveća. Terapiju treba primjenjivati najmanje 4–6 mjeseci, ponajprije da bi se popunile rezerve. Kod parenteralne terapije koristi se fero-dekstran ili fero-sorbitol-citrat. Anemija kronične bolesti Anemija koja prati kronične bolesti (AKB), uz sideropeničnu, je najčešći oblik anemije u kliničkoj praksi. Sastavnica je obrambene reakcije organizma u reakciji akutne faze. Pojavljuje se u: 1. svim kroničnim infektivnim stanjima (kronične plućne ili urinarne infekcije,

osteomijelitis) 2. upalnim neinfektivnim bolestima (reumatoidni artritis, SLE, reumatska vrućica) 3. zloćudnim bolestima 4. traumatskom oštećenju tkiva. AKB treba razlikovati od sideropenične i ostalih anemija zbog deficita željeza, jer se ona ne liječi preparatima za nadomjestak željeza. Od drugih vrsta anemija razlikuje ju karakterističan poremećaj metabolizma željeza. Sama po sebi ne treba terapiju, a korigira se uspješnim liječenjem osnovne bolesti. Anemija kod kronične bubrežne insuficijencije, jetrene ili endokrine bolesti, te zbog infiltracije koštane srži stranim tijelom zbog svojih specifičnih patogenetskih i kliničkih svojstava ne ubraja se u ovaj oblik anemije. Kako nastaje AKB? U reakciji akune faze se sintetiziraju pozitivni i negativni reaktanti akutne faze u jetri, i to pod utjecajem citokina oslobođenih na mjestu upale. Upalni citokini dodatno aktiviraju makrofage koji povećavaju broj transferinskih i laktoferinskih receptora i skladište željezo u obliku feritina, a ne otpuštaju ga u koštanoj srži normoblastima!


Transferin je negativni reaktant akutne faze, dok je laktoferin pozitivni; laktoferin čvršće veže željezo od transferina, što dodatno doprinosi sniženju koncentracije Fe u serumu. Glavno je obilježje AKB-a snižena koncentracija serumskog željeza, no uz povećanu količinu pričuvnog željeza. Razlog tomu je nemogućnost oslobađanja željeza iz tkivnih skladišta u plazmu. Glavnina željeza se metabolizira u RES sustavu, manje u stanicama crijevnog epitela i hepatocitima. Tu se razgrađuju svi raspadnuti eritrociti, stoga je nemogućnost oslobađanja željeza iz makrofaga najvažniji čimbenik poremećaja željeza u anemiji kronične bolesti. Makrofagi ne vraćaju reciklirano željezo u cirkulaciju, a poremećena je i crijevna apsorpcija željeza. Život eritrocita smanjen je na 80 dana. Smatra se da sniženje koncentracije Fe, vitalnog nutrienta za bakterije i vlastite Erc, u krvi usporava rast infektivnih uzročnika i napadnutom organizmu povećava preživljenje (evolucijski očuvan mehanizam preživljenja). Najnovije spoznaje upućuju na to da bi važnu ulogu mogao imati hepcidin – peptidni hormon za koji se čini da je glavni regulator homeostaze željeza u organizmu. Njegovu sintezu u jetri potiče IL-6 tijekom upalne reakcije. Hepcidin blokira otpuštanje željeza iz makrofaga te smanjuje apsorpciju željeza u crijevima, što rezultira hipoferemijom. Hepcidin se veže na feroportin, što rezultira njegovon internalizacijom i razgradnjom u enterocitu. Željezo tako ostaje unutar enterocita, koji pojačava sintezu feritina da bi vezao željezo. Kako enterociti umiru, tako se gubi i željezo. Laboratorijske značajke Anemija je blaga ili umjerena (težina je proporcionalna težini bolesti, Hb oko 90 i Hct oko 0.27). Obično se razvija unutar jednog do dva mjeseca od početka bolesti, nema tendenciju pogoršanja i ponekad je prvi znak kronične bolesti. Anemija je normokromna i normocitna (može hipokromna, mikrocitna) s retikulocitopenijom. Karakterističan je nalaz smanjene koncentracije željeza u serumu uz snižen transferin (TIBC). Koncentracija feritina u krvi je povećana i najjednostavniji je način procjene količine uskladištenog željeza (u sideropeničnoj anemiji feritin je snižen!!!). U makrofagima je povećana količina željeza. Povećani su reaktanti akutne faze (fibrinogen, ceruloplazmin, haptoglobin, CRP), a smanjena je koncentracija albumina. Obilježja osnovnih tipova anemija s poremećajem metabolizma željeza

Anemija kronične bolesti

Sideropenična anemija

Sideroblastična anemija

Željezo u serumu ↓ ↓ ili ↓↓ ↑↑ Kapacitet vezanja željeza ↓ ↑ norm

TIBC ↓ ↓↓ ↑↑ Sideroblasti u koštanoj srži

↓ ↓↓ ↑ ( s "prstenom" )

Feritin u serumu ↑ ↓↓ ↑ MCV norm ili ↓ ↓ bimorfija


MCHC norm ili ↓ ↓ norm ili ↓ TfR Norm ↑

AKB najčešće ne zahtjeva liječenje. Korigira se liječenjem osnovne bolesti. Primjena rekombinantnog humanog eritropoetina, rhu-Epo, kod bolesnika kod kojih je smanjena endogena produkcija i snižena serumska koncentracija eritropoetina, može biti korisna. Sideroblastična anemija Sideroblastična anemija posljedica je nasljednog ili stečenog poremećaja biosinteze hema u prethodnim nezrelim stanicama eritrocitne loze. Uzroci: nasljedni, stečeni i reverzibilni (alkohol). Poremećaj sinteze hema u razvojnim prethodnim stanicama eritrocitne loze dovodi do manjkave sinteze hemoglobina pa nastaju mikrocitni i hipokromni eritrociti. Svi oblici sideroblastične anemije karakterizirani su s:

a. ↑ ukupnim željezom b. Prisutnošću prstenastih sideroblasta u koštanoj srži c. Hipokromnom anemijom.

Prstenasti sideroblasti nastaju zbog akumulacije neferitinskog željeza u mitohondrijima koji okružuju jezgru normoblasta. Prstenaste sideroblaste moguće je dokazati bojenjem berlinskim modrilom razmaza koštane srži. Urođeni oblik sideroblastične anemije nastaje uz disfunkciju enzima δ-ALA ili hem sintetaze. Stečeni oblici su refraktorna anemija sa prstenastim sideroblastima u mijelodisplastičnom sindromu, a mogu nastati iz uz zloćudne bolesti, te kao nuspojava lijeka i trovanje olovom i alkoholom. Stečene sideroblastične anemije su češće od nasljednih. Otrovanje olovom – PLUMBIZAM. Olovo inhibira sitezu hema i globina i enzim pirimidin-5-nukleotidazu tako da osim prstenastih sideroblasta postoje i bazofilne punktacije u eritrocitima i povišena koncentracija protoporfirina. Nakon ingestije, olovo prolazi do koštane srži i akumulira se u mitohondrijima normoblasta, te inhibira enzime koji služe za sintezu hema. Najosjetljivije su ALAδ2 sintetaza i ferokelataza. Olovo je kompetitivni inhibitor. U organizmu se nakuplja δ-ALA koja se pojačano izlučuje urinom. Simptomi vidljivi kod djece su: hiperaktivnost, smanjen IQ, poremećaj koncentracije i rasta. RARS (refractory anemia with ringed sideroblasts) pogađa oba spola. Alkoholičari često razviju megaloblastičnu i sideroblastičnu anemiju, ali imaju i IDA, akutni gubitak krvi i kroničnu hemolizu. Anemija je srednje teška do teška. Često se javi dimorfična slika normokromne i hipokromne loze stanica. Prevladava anizocitoza sa makrocitima, normocitima i mikrocitima. Zbog toga eritrocitne konstante mogu biti normalne, dok je RDW povećan. Mogu se javiti i polikromazija, target stanice, Pappenheimerova tjelešca (istaloženo željezo) i BPE (agregati ribosoma i degeneriranih mitohondrija u eritrocitima – posebno kod trovanja). Broj leukocita i trombocita je pretežno


normalan, može biti i snižen. Ukupni bilirubin može biti blago povišen, kao i željezo i TIBC, dok feritin može i ne mora biti povišen.

Hemoglobinopatije

Hemoglobinopatije su genetski uzrokovane abnormalnosti u sintezi globinskog lanca hemoglobina (hem je normalne strukture). Do danas je opisano 1200 prirodnih mutacija globina, i to na α, β, γ i δ lancu. Većina tih mutacija nije klinički značajna. Promjene u slijedu ak za globinski lanaca mogu uzrokovati:

a) kvalitativni poremećaj globinskog lanca (abnormalna struktura), b) kvantitativni poremećaj u sintezi globinskog lanca (talasemije),

Kvalitativni poremećaji su posljedica delecija ili supstitucija u genima koji kodiraju globinske lance. Posljedično se pojavljuju strukturne hemoglobiske varijante, a najčešća je anemija srpastih stanica (HbS). Kvantitativni poremećaji globinskih lanaca su posljedica različitih genetskih poremećaja koji smanjuju sintezu strukturno normalnih globinskih lanaca. Promjene u slijedu ak u globinskom lancu mijenjaju svojstva hemoglobina:

a) Promjenjena topljivost - HbS i HbC. b) Promjenjena funkcija - utjecaj na afinitet vezanja kisika c) Promjenjena stabilnost - supstitucija ak može utjecati na smatanje globinskih

lanaca u normalnu, fiziološku konformaciju. Normalno, kvarterna struktura hemoglobina ima hidrofilne aminokiseline na površini, a hidrofobne u unutrašnjosti. Supstitucije mjenjaju strukturu α-heliksa, interakcije između dijelova lanca i stabilnost hema u globinskom lancu. Nestabilne varijante očituju se kao kongenitalne hemolitičke anemije s Heinzovim tjelešcima. Nestabilni hemoglobin se denaturira u formu Heinzovih tjelešaca, koja se vežu na unutrašnju površinu membrane i uzrokuju oštećenje i preranu destrukciju eritrocita. Nestabilni hemoglobin spontano oksidira u methemoglobin.

Anemija srpastih stanica (HbS) Anemija srpastih stanica (drepanocitoza, hemoglobinopatija S, sickle cell anemia) karakterizirana je pojavom hemoglobina S. Poremećaj je posljedica zamjene ak u β-globinskom lancu (polarni Glu→nepolarni Val). Ta zamjena mijenja se ukupan naboj molekule te stoga i elektroforetsku pokretljivost. Topljivost HbS je smanjena u deoksigeniranom stanju, stoga je povećana njegova tendencija da polimerizira u rigidne agregate zbog čega se oštećuje membrana eritrocita, a akve stanice imaju karakterističan srpasti oblik. Polimerizacija je reverzibilna, ovisno o oksigenaciji HbS. Učestalost HbS se poklapa s geografskim područjima gdje je učestala infekcija parazitom malarije (plasmodium falciparum). Ta korelacija ukazuje da je heterozigotnost za HbS zaštitni mehanizam organizma na infekciju. Proces polimerizacije se često odvija u mikrocirkulaciji, a posljedica je začepljenje malih krvnih žila. Srpaste stanice se teško oblikom prilagođavaju malim kapilarama i agregiraju se u njima.


Srpaste stanice mogu se vratiti u normalan bikonkavan oblik reoksigenacijom hemoglobina. Ako se proces agregacije ponavlja dolazi do disrupcije membrane Erc. Takvi se Erc uklanjaju iz cirkulacije fagocitozom u slezeni, jetri ili koštanoj srži. Osim toga, HbS ima manji afinitet prema kisiku od HbA, što rezultira olakšanim oslobađanjem O2 u tkivima, ali i povećava koncentraciju deoksiHbS promovirajući stvaranje srpastih stanica. Primarni uzrok anemije kod HbS je ekstravaskularna hemoliza. Poluvrijeme života eritrocita se skraćuje (povećana fragilnost membrane u sprezi sa nastankom Heinzovih tjelešaca) i iznosi samo 14 dana. Javlja se srednje do teška kronična anemija. Pacijenti su skloni žučnim kamencima zbog kolestaze i povišenog bilirubina. Gibutak folata zbog povećanog propdanja Erc može egzacerbirati anemiju, i dovesti do megaloblastoze. Koštana srž je hiperplastična u nastojanju da kompenzira hemolitičku anemiju Male krvne žile su blokirane rigidnim i nakupljenim drepanocitima. Blokade mikrovaskulature javljaju se spontano i uzrokuju akutne distres simptome zvane vazookluzivne krize i najčešći su uzrok hospitalizacije. Manifestiraju se bolovima, blago povišenom temperaturom, infarktima i disfunkcijom organa te nekrozom tkiva. Traju do tjedan dana i spontano prolaze. Može doći i do tromboze (cerebralne arterije). Pacijenti su skloni bakterijskim infekcijama. Najčešće koinfekcije su pneumonija i meningitis. LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA Bolest se očituje normocitnom, normokromnom anemijom i retikulocitozom. Vrijendosti hemoglobina su od 60-100 g/L, Htc do 0.30 L/L. Leukociti su blago povišeni, kao i trombociti kod djece. Pacijenti stariji od 40 godina češće imaju leukopeniju i trombocitopeniju. U razmazu periferne krvi vidljiva je anizocitoza s polikromatofilnim makrocitima i varijabilna poikilocitoza s target stanicama i drepanocitima. RDW je povišen. Mogući su i NRBC. Prisutnost HbS se dokazuje elekroforezom hemoglobina (HbS je 85-100%, dok je HbF do 15%). Ostali nalazi: povećane koncentracije nekonjugiranog bilirubina, haptoglobin nizak, povećana LDH i mokraćna kiselina. Ostale vrste hemoglobina Hemoglobinopatija C, HbC Kod hemoglobinopatije C lizin je zamijenjen s glutaminskom kiselinom u β-globinskom lancu na istome mjestu gdje je valin zamjenjen glutaminskom kiselinom u anemiji srpastih stanica. Smanjena je topivost hemoglobina jer je polarna aminokiselina zamjenjena nepolarnom. Eritrociti sadrže agregate HbC, membrana im je rigidna i zapinju u slezeni koja ih uništava. Poluvijek života eritrocita je 30–55 dana. Prisutna je blaga hemolitička anemija uz nalaz target stanica i mikrosferocita. Prisutna je i blaga retikulocitoza. Smanjena je osmotska fragilnost eritrocita, tj. povećana je osmotska rezistencija eritrocita (ORE).


Hemoglobinopatija S/C, HbS/C Kod hemoglobinopatije S/C oba β-lanca su promijenjena. Jedan je β(s), a drugi je β(c). Nema HbA. Povišen je MCHC, koncentracije HbS su višlje nego kod anemije srpastih stanica. Javljaju se vazookluzivne krize s povišenim target stanicama. Hemoglobinopatija D, HbD Kod hemoglobinopatije D glutamin je zamijenjen glicinom na β-globinskom lancu. Postoji više varijanti HbD – Punjab HbD, Los Angeles HbD (Gln →Gly) koji se javlja kod američkih crnaca. Hemoglobinopatija D je najčešće asimptomatska, ali homozigoti imaju u razmazu periferne krvi prisutne tagret stanice i smanjenu osmotsku rezistenciju eritrocita. Ponekada se istovremeno javljaju i HbD i HbS. Oni stvaraju agregate deoksihemoglobina. Radi se o rijetkom obliku anemije srpastih stanica. Hemoglobinopatija E, HbE Treća po učestalosti od hemoglobinopatija. Nastaje supstitucijom glutamina s lizinom na β-lancu na poziciji 26. HbE nije postojan u stanjima povećanog oksidativnog stresa. Krivulja disocijacije pomaknuta je desno, što znači da HbE ima manji afinitet za kisik. Homozigoti imaju blage simptome, mikrocitne anemije sa smanjenim preživljavanjem eritrocita. Prisutne su target stanice i smanjena osmotska fragilnost. Nestabilne varijante hemoglobina Javljaju se mutacije koje utječu na stabilnost hemoglobina. Mutirane varijante Hb precipitiraju u obliku Heinzovih tjelešaca što uzrokuje rigidnost membrane eritrocita i njihovu hemolizu. Homozigotne varijante nisu spojive sa životom.

Talasemije

To je heterogena skupina nasljednih poremećaja u kojima dolazi do mutacije u jednom ili više globinskih lanaca, što uzrokuje smanjenu ili odsutnu sintezu pripadajućih globinskih lanaca. Pacijenti s blažim simptomima često su asimptomatski, dok se kod pacijenata s težim simptomima javlja abnormalna sinteza hemoglobina, neefikasna eritropoeza i disproporcionalna sinteza neefikasnih globinskih lanaca. Simptomi bolesti su anemija, hepatosplenomegalija, sklonost infekcijama, kamencima u žućnom mjehuru i bubregu, poremećajima u kostima što rezultira patološkim frakturama. RAZLIKE IZMEĐU TALASEMIJA I HEMOGLOBINOPATIJA Bolest Broj RBC Anemija Morfologija RBC Abnormalni Hb Broj Retic

Hemoglobinopatija ↓ Normocitna Target stanice HbS ↑↑ Normokromna Srpaste stanice HbC Heinzova tjelešca HbD, Talasemije ↑ Hipokromna Target stanice HbH ↑

Mikrocitna BPE HbBarts


Najčešće mutacije u talasemijama su delecije, mutacije promotorskog mjesta, nonsense mutacije, mutacija u stop kodonu ili splice mjestu. Najčešći su poremećaji u sintezi α i β globinskih lanaca. Tipovi talasemija: 1. α talasemija – poremećaj u sintezi alfa lanca (suvišak beta lanaca) 2. β talasemija - poremećaj u sintezi beta lanca (suvišak alfa lanaca) 3. Hb Lepore – hemoglobinska varijanta koja zahvaća α lanac, on je i strukturno

promijenjen i manje ga se sintetizira U α ili β talasemiji sinteza jednog od tih lanaca je smanjena ili se uopće ne sintetizira, što rezultira suvišnom sintezom drugog lanca. Neravnomjerna sinteza globinski lanaca uzrokuje smanjenu sintezu hemoglobina, kroničnu hemolizu i neučinkovitu eritropoezu. Višak α-lanca precipitira jer je nestabilan. Precipitati se vežu na staničnu membranu i oštećuju je, te smanjuju deformabilnost stanice. Podložniji s fagocitozi od strane makrofaga, uklanjaju se u slezeni – kronična ekstravaskularna hemoliza. Višak β-lanca stvara HbH (β4) koji ima povećan afinitet za kisik i nestabilan je. Kod novorođenčadi, kada je smanjena sinteza alfa lanaca, suvišak gama lanca se kombibnira u HbBart's (γ4). Ta varijanta ima visoki afinitet za O2. Klinički simptomi su u skladu sa anemijom, kroničnom hemolizom i neučinkovitom eritropoezom. Anemija uzrokuje hipoksiju, hemoliza splenomegaliju, a neučinkovita eritropoeza intenzivnu hiperplaziju koštane srži i hipertrofiju koštanog sustava s karakterističnim facies thalassemica (izbočene kosti). Usto se korteks većine kostiju stanjuje pa su bolesnici skloni frakturama. Zbog brojnih transfuzija razvija se sekundarna hemosideroza s oštećenjem jetre, endokrinih žlijezda (poremećaj u rastu, zakašnjeli pubertet, dijabetes, hipotireoidizam, hipoparatireoidizam) i srčanog mišića. Taloženje željeza u kožu uz povećanu količinu melanina bolesnicima daje karakterističan sivkast izgled. Bolesnici su osjetljivi na infekcije, posebice nakon splenektomije. Talasemije su karakterizirane mikrocitnom, hipokromnom anemijom sa sniženim MCV, MCH i MCHC. Broj eritrocita je normalan ili povišen. U razmazu periferne krvi vidljive su target stanice, bazofilno punktirani eritrociti i ponekad eritroblasti. Prisutna je anizocitoza i poikilocitoza. Zbog kronične hemolize povećan je broj retikulocita i bilirubin. Haptoglobin može biti snižen, ovisno o stupnju hemolize. Elektroforezom se nađe gotovo potpuni nedostatak HbA, a cirkulirajući hemoglobin je HbF. HbA2 je normalan ili blago povećan. Vrlo je važno odrediti količinu željeza u organizmu. Test koji objektivno određuje količinu željeza u rezervama je feritin. Usto je nužno odrediti stupanj tkivnog oštećenja ispitivanjem kardijalnog, jetrenog i endokrinog statusa. Tip talasemije, a posebno podtip, utvrđuje se PCR-om. α – talasemija α-talasemije nastaju delecijom α-gena. Budući da postoje 2 gena na kromosomu 15 potrebna je delecija sva 4 gena da se u potpunosti suprimira sinteza α-lanca.


Prema fenotipu razlikujemo 4 klinička stanja: HbH bolest, α-talasemiju minor, α-talasemiju major i silent carrier.

Tipovi i nasljeđivanje α-talasemije

1. α-talasemija major ( α0-thal-1/α0-thal-1 ); hydrops fetalis

Javlja se delecija sva četiri α-gena što uzrokuje teški poremećaj sinteze fetalnog hemoglobina kod novorođenčadi i potpunim izostankom sinteze HbA. γ-lanci stvaraju tetramere, γ4 koji se nazivaju HbBart's. Poremećaj je nespojiv sa životom i završava intrauterinim letalnim završetkom (hydrops fetalis).

2. HbH bolest ( α0-thal-1/α+-thal-2 ) Delecija tri α-gena očituje se fenotipski i simptomima kao α-talasemija. Pacijent pati od hipokromne anemije i splenomegalije. Smanjena je količina HbA, a stvara se u suvišku β-lanac, koji stvara tetramere (β4), tj. HbH. HbH je termolabilan i nestabilan, precipitira u citoplazmi eritrocita i oštećuje membranu. Tako se razvija kronična hemolitička anemija. HbH ima povećan afinitet za kisik, 10x veći od HbA, i slab je transporeter kisika. Kod pacijenata s HbH bolesti velika je varijacija u anemijama – one mogu biti vrlo teškog, do blažeg oblika. Anemija je mikrocitna i hipokromna s koncentracijama hemoglobina 80-100 g/L. Povećan je broj retikulocita i eritroblasta u perifernoj krvi.

3. α-talasemija minor ( α+-thal-2/α+thal-2 ili α0-thal-1/norm ) Kod α-talasemije minor javlja se poremećaj na jednom ili oba kromosoma s α-genima. Kliničke posljedice su blaže, MCV i MCH mogu biti sniženi, a broj eritrocita obično je povećan. Anemija je mikrocitna, s nekoliko target stanica. Elektroforeza hemoglobina je normalna.

4. Silent carrier talasemija ( α+-thal-2/norm ) Kod silent carrier talasemije mutiran je samo jedan od četiri funkcionalna α-gena. Ovaj je oblik asimptomatski i potpuno benigan.

β – talasemija Postoje samo 2 β-gena na kromosomu 11. Mutacije se označavaju sa: β+ - parcijalni blok u sintezi β-lanca, β0 – potpuni blok u sintezi β-lanca i β – normalan β-lanac.


1. β-talasemija major (β0/β0, β0/β+ i β+/β+) Bolest se još naziva i mediteranskom ili Cooleyevom anemijom. Postoji velika redukcija u sintezi β-lanca ili ga uopće nema. To rezultira poremećenom sintezom HbA. Što je višak α-lanaca veći, to je teža anemija. Stvaranjem γ-lanca nastoji se dijelom kompenzirati višak α-lanca. Tako se pojačano stvara HbF i HbA2. (Kod ovih bolesnika koristi se hidroksiureja koja pomiče sintezu adultnog hemoglobina prema fetalnom). Slobodni α-lanci ne mogu stvarati tetramere, pa precipitiraju u eritrocitima, oštećuju membranu i uzrokuju kroničnu hemolitičku anemiju. U razmazu periferne krvi vidi se mikrocitna, hipokromna anemija, s anizocitozom i poikilocitozom, polikromazijom i bazofilno punktiranim eritrocitima. Eritrocitne konstante su snižene, a povećan je broj retikulocita i eritroblasta u perifernoj krvi. Precipitirani α-lanci mogu se vizualizirati s metil-violet bojenjem. Hemoglobin može biti u vrlo niskim koncentracijama od samo 20 – 30 g/L.

2. β-talasemija minor (β0/β ili β+/β) Mutiran je samo jedan gen, dok je drugi normalan. Ovi su pacijenti heterozigoti, kod kojih se bolest manifestira kroz blažu anemiju, koja je, također, mikrocitna i hipokromna. Međutim, iako je anemija blaža, u perifernoj krvi vidljiva je izrazita anizocitoza i poikilocitoza. Nalaz elektroforeze pokazuje povećan udio HbA2 (> 3,5%). β-talasemija minor je čest oblik β-talasemije.

3. β-talasemija intermedia (β0/β+, β+/β+ i β0/β) 4. Hereditarna perzistencija HbF 5. δβ-talasemija

Ovaj oblik talasemije uzrokovan je poremećajem u stvaranju dva različita lanca, i β i δ, pa je povećano stvaranje HbF, koji čini od 5–20% ukupnog hemoglobina. Nastaje Hb Lepore koji nastaje zbog crossing overa između β-gena i δ-gena čime nastaje polipeptid građen od δ-lanca na amino-kraju i β-lanca na karboksilnom kraju. U homozigotnom stanju bolest se očituje slikom talasemije intermedije, a u heterozigotnom talasemijom minor.

Vrste fizioloških i patoloških hemoglobina Hemoglobin Vrsta lanaca i mutacije Pojava

Gower 1 ζ + ε Embrij Gower 2 α + ε Embrij Portland ζ + γ Embrij

Fetalni Hb, HbF α2γ2 Fetus, novorođenče, β-talasemija Adultni hemoglobin, HbA α2β2 Odrasli Adultni hemoglobin, HbA2 α2δ2 Odrasli

HbC β6 Glu → Lys Mutacija HbA ( β lanac ) HbD β121 Glu → Gly Mutacija HbA ( β lanac ) HbE β26 Glu → Lys Mutacija HbA ( β lanac )

HbH β4 Α-talasemija HbM metHb HbS β6 Glu → Val Anemija srpastih stanica

HbBart's γ4 Α-talasemija HbLepore Fuzija β i δ lanca Β-talasemija HbConstant spring α Stop →Gln Mutacija HbA ( α lanac )


Poremećaji u sazrijevanju jezgre

Megaloblastična anemija Makrocitne anemije se dijele na megaloblastične i nemegaloblastične ovisno o morfološkim karakteristikama eritroidnih prekursora u koštanoj srži. Megaloblasična anemija posljedica je manjka vitamina B12 (nedostatak unutrašnjeg faktora) i folne kiseline, ali može se pojaviti i zbog poremećaja metabolizma tih dvaju vitamina, te primjene NO i lijekova antifolata (metotreksat). Posljedica manjka tih vitamina, koji služe kao koenzimi za sintezu DNA, je abnormalna sinteza DNA, zbog čega kasni sazrijevanje jezgre što koči daljnju diobu stanice. Rezultat su velike stanice sa asinhronim sazrijevanjem jezgre i citoplazme. Uzroci manjka vitamina B12 i folne kiseline Manjak vitamina B12 Manjak folne kiseline

Nutritivni Vegeterijanci Nutritivni Starije osobe, gladovanje Malapsorpcija Malapsorpcija Celijakija, Crohnova b.

Bolesti želuca Perniciozna anemija Gastrektomija

Povećana utilizacija

Trudnoća, laktacija Hemolitičke bolesti Maligne bolesti Upalne bolesti

Povećan gubitak urinom

Aktivna jetrena bolest

Lijekovi Antikonvulzivi Sulfasalazin

Bolesti crijeva Divertikuloza Crohnova bolest

Ostalo Alkoholizam

Megaloblastičnu anemiju karakterizira neučinkovita eritroidna maturacija (eritropoeza) koja se očituje pojavom megaloblasta u koštanoj srži i ovalnih makrocita u perifernoj krvi (MCV>100 fL, i do 140) s normalnim sadržajem hemoglobina. Megaloblasti su veće stanice od normoblasta i obično su ovalnog oblika. Količina RNA u tim stanicama je apsolutno povećana, dok je stvaranje DNA smanjeno. Morfološki se to prepoznaje u asinkronom sazrijevanju jezgre i citoplazme. Jezgra je uvijek nezrelija, to se stanje naziva disocijacijom u razvoju jezgre i citoplazme (nukleo-citoplazmatska disocijacija). Krajnja stanica, megalocit, razlikuje se od eritrocita time što je veći, može biti do 14 µm u promjeru i ovalna je oblika. Citoplazma je plavičasta zbog povećanog sadržaja RNA u stanicama. Eritrocitne konstante MCV i MCH povećane su pa anemija pokazuje obilježja makrocitne hiperkromne anemije. Zbog nukleo-citoplazmatske disocijacije pojavljuje se nedjelotvorna eritrocitopoeza. Obilježje te promjene izrazita je hiperplazija megaloblasta u koštanoj srži, pri čemu samo mali broj stvara zrele eritrocite. Na to upozorava broj retikulocita, koji je obično normalan ili smanjen. Željezo se smanjeno ugrađuje pa je njegova koncentracija u serumu povećana, a UIBC je normalan ili snižen. Veliki broj megaloblasta propada u koštanoj srži, zbog čega je povišena LDH i bilirubin. Poremećaj u sintezi DNA zahvaća i druge loze: leukocite i trombocite. Granulocitna loza ima tzv. divovske metamijelocite s izduženom jezgrom, može se pojaviti neutropenija. Segmentirani granulociti pokazuju hipersegmentaciju jezgre sa šest ili


više segmenata. Megakariociti su također veliki i hipersegmentirani, a broj im je povećan. Stvaranje trombocita je smanjeno pa se u teškim slučajevima stvara samo 10% od količine koja bi odgovarala povećanom broju megakariocita. U većine megaloblastičnih anemija simptomi umora i slabosti vrlo se postupno razvijaju i anemija može biti vrlo teškog stupnja, a da bolesnik nema većih tegoba. Bolesnik je blijedo-žućkast, izgleda poput slame. Javlja se glositis sa vrlo crvenim jezikom. Neuropatija u bolesnika s manjkom vitamina B12 očituje se poremećajem perifernog osjeta. Ponekada se razvije i atrofija očnog živca i znakovi psihoze. LABORATORIJSKI NALAZI I POSTAVLJANJE DIJAGNOZE Javlja se makrocitna anemija (MCV>100 fL), MCH je povećan zbog povećanog volumena stanice, ali MCHC je normalan. Ako uz megaloblastičnu anemiju postoji deficit željeza, što je karakterizirano mikrocitnom, hipokromnom anemijom, makrocitoza može biti maskirana, a MCV normalan. To se događa i ako postoji talasemija, kronična bubrežna insuficijencija ili upala. Hemoglobin ili broj eritrocita su normalni ili vrlo niski. Poremećaj u sazrijevanju jezgre zahvaća sve tri loze – eritrocitnu, leukocitnu i trombocitnu. Broj leukocita je smanjen i prisutna je apsolutna neutropenija. Smanjen je i broj trombocita. U razmazu periferne krvi vidljivi su makroovalociti, Howell-Jollyeva tjelešca i hipersegmentirani neutrofili. Hipersegmentirani eritrociti (s više od 5 segmenata) vidljivi su i ako još nema makrocita. Taj se nalaz smatra visoko osjetljivim i specifičnim za megaloblastičnu anemiju. Ovi neutrofili su veći od normalnih neutrofila. Blagi pomak u lijevo s velikim hipergranuliranim nesegmentiranim neutrofilima isto mogu biti vidljivi. I trombociti mogu biti veliki, posebno ako im je broj smanjen. Koštana srž je hipercelularna s povećanim brojem eritrocitnih prekursora i smanjenim omjerom mijelopoeza:eritropoeza. Prisutni su megaloblasti. U serumu je povišen nekonjugirani bilirubin i LDH (intramedularna destrukcija megalocita), a željezo i feritin su na gornjoj granici normale ili povišeni. Manjak folne kiseline i vitamina B12 može se utvrditi određivanjem njihove koncentracije u serumu. Ako manjka vitamin B12, serumski su folati normalni ili povišeni, a ako manjka folna kiselina, serumski je vitamin B12 obično umjereno snižen. Terapija: nadomještanje vitamina B12 i folne kiseline.


Algoritam za razlikovanje megaloblastične od drugih makrocitnih anemija Perniciozna anemija Perniciozna anemija je jedna od najčeših megaloblastičnih anemja zbog nedostatka vitamina B12. To je autoimuna anemija koju karakterizira atrofija želučane stijenke. U atrofičnoj stijenci prisutna je infiltracija limfocita i plazma stanica. Nedostaje ili izostaje sekrecija unutrašnjeg faktora (IF), a nedostaje i HCl u želučanom soku, pa se javlja aklorhidrija. Bolest se pojavljuje kod starijih ljudi (oko 60. godine), češće kod žena i pokazuje pridruženost drugim autoimunim bolestima (miksedem, Hashimotov tireoiditis, Adisonova bolest, vitiligo, hipoparatireoidizam i hipogamaglobulinemija). Bolest pokazuje obiteljsku učestalost, najčešća je u osoba krvne grupe A, s plavim očima, koje brže sijede. U 90% bolesnika su u krvi prisutna At na parijetalne stanice želučane sluznice. Tip I ili blokirajuća protutijela sprječavaju vezanje IF za vitamin B12, a tip II ili precipitirajuća protutijela sprečavaju vezanje IF u ileumu. Uz atrofiju želuca često su prisutni i polipi. Promjene sluznice mogu se vidjeti i drugdje u probavnom sustavu. Tako je često sluznica jezika upaljena i crvena, osobito na rubovima i vrhu, a ponekada se vide i plitke ulceracije. Često je zahvaćen i živčani sustav i javljaju se neurološke promjene. Vidljive su degenerativne promjene, tzv. žarišne demijelinizacije u stražnjim i postranim snopovima leđne moždine. Mogu se javiti cerebralni poremećaji te znakovi periferne neuropatije. DIJAGNOZA Anemija je makrocitna (MCV oko 120), makrociti su ovalnog oblika. Broj retikulocita, leukocita i tombocita smanjen. Neutrofilni granulociti pokazuju hipersegmentaciju


jezgre. U serumu je povećan nekonjugirani bilirub i LDH, a Fe i feritin su na gornjoj granici normale ili povišeni. Manjak vitamina B12 i folne utvrđuje se mjerenjem njihove koncentracije u serumu. Za manjak vitamina B12, posebice za pernicioznu anemiju, koristi se Schillingov test. Testom se određuje izlučivanje radioaktivnog vitamina B12 u mokraći. Per os se prima radioaktivno obilježeni vitamin B12, uz parenteralnu primjenu vitamina B12 kako bi se popunile njegove rezerve. Zdrave će osobe u 24-satnom urinu izlučiti 5–40% primjenjene peroralne doze. Ako je poremećena apsorpcija vitamina B12, bolesnici pokazuju smanjeno izlučivanje (0 – 3% radioaktivnog vitamina B12). Dodatkom IF test se normalizira kod perniciozne anemije. U sindromu slijepe vijuge prethodnim se liječenjem antibioticima uništavaju bakterije koje prekomjerno troše vitamin B12, što uvjetuje normalizaciju Schillingovog testa. LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA Temeljni test za postavljanje dijagnoze perniciozne anemije je Schillingov test. U laboratoriju se određuje koncentracija vitamina B12 u serumu. Ta koncentracija može biti lažno snižena ako postoji istovremeno i deficit folne kiseline, u trudnoći, ako osoba uzima oralne kontraceptive ili je na terapiji antibioticima. Kod deficita vitamina B12 i folne kiseline povišen je i homocistein u plazmi.

3. ANEMIJE ZBOG SKRAĆENOG ŽIVOTNOG VIJEKA ERITROCITA U KRVOTOKU

Hemolitičke anemije

Svako stanje koje je praćeno kraćim životnim vijekom eritrocita zbog njihove pojačane razgradnje naziva se hemolitička anemija. Fiziološki mehanizam uklanjanja eritrocita nastupa nakon 120 dana. Tada dolazi do promjena na eritrocitu koje su posljedica njegova starenja: smanjena je fleksibilnost, povećana propusnost membrane, gubitak proteina, smanjena je sposobnost stvaranja ATP i sl. Eritrocite odstranjuju stanice RES sustava, osobito makrofagi u koštanoj srži, ali i u jetri i slezeni – ekstravaskularna destrukcija (hemoliza) eritrocita. Intravaskularna destrukcija pojavljuje se isključivo kao patološki mehanizam destrukcije eritrocita. Hemolitičke anemije su heterogena skupina normocitnih, normokromnih anemija u kojima se Erc prerano (prijevremeno) razaraju – taj se proces naziva hemoliza. Klasifikacije hemolitičkih su višestruke: 1. prema izvoru defekta koji uzrokuje hemolizu (unutrašnji ili vanjski čimbenici

eritrocita), 2. prema nastanku (nasljedne ili stečene) ili 3. prema lokalizaciji hemolize (intravaskularna ili ekstravaskularna) 4. prema tipu poikilocita koji se pojavljuje u razmazu (shistociti – ukazuju na

fizičku/mehaničku traumu Erc ili sferociti – dio membrane je oštećen ili uklonjen djelovanjem makrofaga).


Laboratorijska obilježja hemolitičkih anemija � Retikulocitoza u perifernoj krvi – reflektira pojačanu aktivnost koštane srži u

pokušaju da održi masu eritrocita na periferiji � Eritroidna hiperplazija u koštanoj srži � Povećana frakcija IRF � Polikromazija i pojava NRBC na periferiji � RPI>2 � Nekonjugirani je bilirubin povećan, a konjugirani normalan (ako je očuvana

funkcija jetre) � Urobilinogen u mokraći je povećan � Haptoglobin i hemopeksin su sniženi u cirkulaciji

Klinički simptomi:

1. žutica zbog povećanog stvaranja bilirubina 2. sklonost kamencima 3. mokraća tamna ili crvena (izlučivanje hemoglobina) 4. zbog ekspanzije koštae srži, kosti se stanjuju – spontane frakture i

osteoartropatija 5. zbog anemije može doći do poremećaja u radu srca.

Razaranje eritrocita u cirkulaciji, intravaskularna hemoliza, uzrokovano je traumatskim oštećenjem eritrocita u cirkulaciji, vezanjem komplementa za membranu eritrocita ili djelovanjem vanjskog toksina. Razaranjem eritrocita u makrofagima, ekstravaskularna hemoliza, posljedica je aktivacije makrofaga specifičnim imunoglobulinima vezanim za površinu eritrocita, kao i zbog fizičkih promjena u strukturi eritrocitne membrane. Intravaskularna hemoliza Do lize eritrocita dolazi u krvnim žilama. Slobodni hemoglobin otpušta se u plazmu i veže se na haptoglobin, prenosi se do jetre gdje se metabolizira do bilirubina koji se otpušta u crijeva preko žučnog mjehura. Kod teške, intravaskularne hemolize, jetra ne može sintetizirati dovoljne količine haptoglobina da se veže sav hemoglobin otpušten u plazmu. Zato je povišeno željezo u serumu jer se oslobađa s hemoglobina. Drugi plazmatski protein, hemopeksin, veže hem. I ovaj se kompleks uklanja iz plazme brže nego što se sintetizira hemopeksin. Sniženi hemopeksin nastupa sekundarno nakon sniženog haptoglobina. Hemoglobin se veže na haptoglobin, a hem na hemopeksin i nastaju kompleksi koji su preveliki da se filtriraju u bubregu. Kada nedostaju ta dva proteina, hemoglobin slobodan cirkulira u plazmi (hemoglobinemija). Dio tog hemoglobina se uklanja putem jetre, a dio disocira na dimere koji su dovoljno mali da se mogu filtrirati bubrezima (hemoglobinurija). Prisutnost hemoglobina u urinu znak je teške intravaskularne hemolize. Hemosiderin u urinu (hemosidinurija) znak je da bubrezi filtriraju značajne količine hemoglobina.


Ekstravaskularna hemoliza Ako je prerana destrukcija eritrocita rezultat ekstravaskularne hemolize, eritrociti se uklanjaju iz cirkulacije putem tkivnih makrofaga. Ovo je češći oblik hemolize. Nema hemoglobinemije, hemoglobinurije, niti hemosidinurije ako hemoglobin nije otpušten direktno u krv. U makrofagima se hemoglobin razgrađuje na hem i globin. Hem se potom katabolizira na željezo, biliverdin i CO. Biliverdin ulazi u plazmu kao bilirubin, veže se na albumin i izlučuje se u jetri. Kod ovog oblika hemolize mjere se produkti katabolizma hema. Ekstravaskularne hemoliza može se dogoditi u makrofagima jetre, slezene i koštane srži. Klasifikacija hemolitičkih anemija

Nasljedne (unutrašnje) Stečene (vanjske)

Membranopatije - hereditarna sferocitoza, hereditarna eliptocitoza, paroksizmalna noćna hemolgobinurija

Imunosne – autoimune (uzrokovane toplim ili hladnim antitijelima), aloimune (transfuzijska reakcija), uzrokovane lijekovima

Enzimopatije – deficit Glc6P-DH i deficit piruvat kinaze

Traumatska ozljeda Erc – mikrocirkulacijske lezije, toplinska ozljeda, marš hemoglobinurija

Hemoglobinopatije – HbS, HbC, nestabilni Hb

Plazmatski antagonisti – kemikalije, toksini, otrovi, mikrobiološki uzročnici, intracelularni paraziti

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA Na hemolizu upozoravaju: 1. Testovi destrukcije eritrocita 2. Testovi povećanog stvaranja eritrocita 3. Razmaz periferne krvi 4. Biokemijske pretrage Dijagnostički postupak polazi od retikulocitoze koja je jednostavan test za procjenu hemolize i diferencijalnu dijagnozu prema drugim anemijama. Za objektivnu procjenu hemolize potrebno je broj retikulocita izraziti na ukupan broj prisutnih eritrocita. Tu je korekciju moguće učiniti tako da se broj retikulocita pomnoži s vrijednosti bolesnikova hematokrita i potom podijeli s normalnom vrijednosti hematokrita. Tako se dobiju korigirani retikulociti. Korekcija broja retikulocita nije potrebna ako se izračuna apsolutni broj retikulocita. Vrijednosti korigiranog broja retikulocita <20‰ ili apsolutni broj retikulocita manji od 100 000×1011/L upućuje na hipoproliferativnu anemiju, dok više vrijednosti upozoravaju na kompenzatorni odgovor koštane srži zbog akutnog gubitka krvi ili hemolize.


Povećana destrukcija Erc povećava koncentracije nekonjugiranog bilirubina u serumu i urobilinogena u mokraći. Konjugirani bilirubin je u pravilu normalan, osim ako nije prisutna hepatička ili bilijarna opstrukcija. Pregled razmaza periferne krvi može biti koristan u dijagnostici brojnih hemolitičkih anemija. Vidljiva je:

� Polikromazija (↑RNK; pojačano stvaranje i oslobađanje Erc, povećan broj retikulocita )

� BPE (↑ RNK; hemolitičke anemije, otrovanje olovom) � Pappenheimerova tjelešca (agregati ribosoma, feritina i mitohondrija) � Heinzova tjelešca (agregati denaturiranog Hb – ox oštećenje eritrocita) � Howel-Jollyeva tjelešca (ostaci jezgre; kod splenektomija i hipofunkcija

slezene) � Shistociti (mehaničko oštećenje eritrocita; DIK, TTP, HUS) � Sferociti (promjene koje ukazuju na gubitak citoskeleta) � Dakriociti (mehanički stres).

Povećan je turn-over željeza što reflektira povećanu destrukciju eritrocita i povećanu upotrebu željeza. Laboratorijski nalazi koji ukazuju na stupanj intravaskularne hemolize su: 1. hemoglobinemiju i hemoglobinuriju, 2. ↓ haptoglobin i hemopeksin i 3. povišen LDH. Membranopatije Nastaju zbog poremećaja u:

1. membranskim proteinima 2. membran skim lipidima

Takve abnormalnosti uzrokuju promjenu stabilnosti, oblika i permeabilnosti membrane eritrocita. Općenito, poremećaj vertikalnih interakcija karakteriziran je nastankom sferocita, dok su poremećaji horizontalnih interakcija karakterizirani prisutnošću poikilocitoze, a poremećaji u sastavu lipida uzrokuju nastanak akantocita.


Nasljedne hemolitičke anemije

Poremećaj Defekt membrane Abnormalne funkcije membrane Morfologija eritrocita

Hereditarna sferocitoza

Nedostatak spektrina Poremećena interakcija vert. proteina s lipidima

Sferociti

Hereditarna eliptocitoza

Defekt spektrina ili band 4.1

Poremećaj u horizontalnim interakcijama – defekt permeabilnosti membrane

Eliptociti

Hereditarna piropoikilocitoza

Nedostatak ili mutacija α-spektrina

Poremećaj horiz. i vertik. interakcija – nestabilna membrana

Šistociti

Hereditarna stomatocitoza

Nepoznato Abnormalna propusnost za K i Na Stomatociti

Hereditarna kserocitoza

Nepoznato Abnormalna propusnost – gubi se K Kserociti

Akantocitoza (abetalipoproteinemija)

Povećan udio sfingomijelina

Porast vanjske membrane, povećana membranska viskoznost

Akantociti

Paroksizmalna noćna hemoglobinurija

Deficit DAF i C8bp Povećana osjetljivost na lizu komplementom Normociti ili mikrociti

Hereditarna sferocitoza (HS)

Hereditarna sferocitoza je najčešća nasljedna hemolitička anemija. U membrani eritrocita nedostaje spektrin, može i kombinirano sa nedostatkom ankirina, pa je membrana izrazito propusna za Na. Zbog nedostatka spektrina (i ankirina) poremećene su vertikalne membranske interakcije između proteina citoskeleta i lipidnog dvosloja. To dovodi do gubitka lipidnog dvosloja u obliku mikrovezikula, pri čemu se smanjuje omjer površina stanice/volumen i dovodi do promjene morfologije Erc i nastanka karakterističnih sferocita. Sferociti imaju smanjenu staničnu fleksibilnost. Retikulociti su u HS normalne morfologije, što ukazuje da deficit spektrina nastupa u cirkulaciji.

Denzitometrijskim određivanjem membranskih proteina koji su odvojeni SDS-PAGE elektroforezom razlikujemo 4 podtipa hereditarne sferocitoze :

1. izolirani nedostatak spektrina 2. kombinirani nedostatak spektrina i ankirina


3. nedostatak vezujućeg proteina 3 4. nedostatak proteina 4.2

Temeljno patofiziološko zbivanje kod hereditarne sferocitoze je, s jedne strane, postojanje unutarnjeg defekta eritrocita, a s druge strane, intaktna slezena koja selektivno odstranjuje poremećene eritrocite. Bolest se klinički očituje slikom kronične hemolitične anemije i splenomegalijom. U oko 50% bolesnika s vremenom se razviju žučni kamenci. Ponekad se javljaju i hemolitičke krize, obično uz infekcije. Tipična aplastična kriza udružena je najčešće s infekcijom parvovi-rusom B19. Kliničke značajke HS: 1. Anemija 2. Splenomegalija 3. Hiperbilirubinemija (hemoliza) 4. Retikulocitoza, sferociti u razmazu 5. Kolelitijaza, kolecistitis 6. Hemolitične, aplastične i megaloblastične krize

Blaga HS Umjerena HS

Teška HS Izrazito teška HS

Hgb (g/L) Unutar RR >80 60-80 <60

Rtc <60 ‰ >60 ‰ >100 ‰ >100 ‰

Bil (µmol/L) 17.1-34.2 >34.2 >34.2-51.3 >51.3

DKS Pokoji sferocit Sferociti Sferociti Mikrosferociti i poikilocitoza

ORE Normalna/ Blago snižena

Snižena Snižena Snižena

Transfuzije 0-1 0-2 >2 Redovito

Nedostatak proteina (SDS-PAGE)

Normalna Sp, Sp+Ank, Band 3,

Protein 4.2

Sp, Sp+Ank, Band 3

Sp, Sp+Ank, Band 3

Nasljeđivanje AD AD, de novo

mutacije

AD, de novo mutacije

AR

20-30% bolesnika ima blagi oblik HS koju obilježava kompenzirana hemoliza. To znači da je uravnoteženo stvaranje eritrocita i njihovo uklanjanje u slezeni. Takvi bolesnici obično nisu anemični, nemaju simptoma osim blage splenomegalije, blage retikulocitoze i sferocitoze. Vrijednosti osmotske rezistencije su snižene tek nakon preinkubacije krvi na 37°C, 24 sata. Dijagnoza se postavlja u odrasloj dobi i to na temelju komplikacija izazvanih kroničnom hemolizom. 60-70% bolesnika ima umjereni oblik bolesti. Manifestira se u djetinjstvu i to anemijom, splenomegalijom, žuticom i pozitivnom obiteljskom anamnezom. Prisutna je retikulocitoza. Žutica je najčešće povezana sa konkomitantnom virusnom infekcijom, nekonjugirana (indirektna) bilirubinemija bez bilirubinurije.


Oko 10% bolesnika ima teški oblik HS. Razlikuju se od umjerenog oblika po nižoj koncentraciji hemoglobina i povećanim potrebama za intermitetnom transfuzijom krvi. Retikulocitoza i bilirubinemija su izraženije. 3-5% bolesnika ima izrazito teški oblik bolesti, sa anemijom opasnom po život. Potrebne su im redovite transfuzije kako bi se hemoglobin održao iznad 60 g/L. U DKS-u prisutni sferociti, mikrosferociti i poikilocitoza. Laboratorijski nalazi: Dijagnoza se postavlja temeljem kliničke slike (žutica, splenomegalija) i nalaza sferocita u razmazu periferne krvi. Hemoglobin je u bolesnika sa HS može biti normalan ili snižen. Broj retikulocita je najčešće povećan. Dok su MCV i MCH normalni, sferociti su jedini oblik eritrocita s povećanim MCHC! Zbog ubrzane razgradnje eritrocita u perifernoj krvi vidljivi su i eritroblasti te Howell-Jollyeva tjelešca. Laboratorijska dijagnostika:

� Kompletna krvna slika (↓ Erc i ↓ Hb) � Eritrocitni indeksi(↓MCV,↑MCHC, ↑RDW ) � Morfologija eritrocita u razmazu (sferociti – mali, gusti, okrugli, hiperkromni),

polikromazija � Retikulocitoza � Hiperbilirubinemija � Povećana aktivnost LDH � Snižene vrijednosti haptoglobina � Diferencijalno dijagnostički isključiti autoimunu hemolitičku anemiju

Diferencijalno dijagnostički - autoimuna hemolitička anemija: direktni antiglobulinski test je negativan kod HS. Osim toga u HS su prisutni retikulociti sa malim volumenom i povećan je MCHC. Osmotic fragility test u stranoj literaturi, rezultati su suprotni našima, mi određujemo rezistenciju. Specijalistički testovi potvrde rijetko potrebni za HS. Postavljanje dijagnoze HS je otežano u populacije novorođenčadi. Naime, nema prisutne splenomegalije, retikulocitoza je blaga, sferociti se nalaze u razmazu i u odsutnosti bolesti. ORE je manje pouzdana kod novorođenčadi jer je ORE inače snižena u odnosu na odraslu populaciju. Stoga je bolje testove za HS učiniti nakon 6. mjeseca života. Ako je prijeko potrebno postaviti dijagnozu, koristi se ORE sa posebnim krivuljama prilagođenim novorođenačkoj populaciji. Razmaz mora biti visoke kvalitete, sa dobro odvojenim eritrocitima i ako je moguće sadržavati i eritrocite sa centralnom blijedom zonom, jer su sferociti učestali artefaktualan nalaz u razmazima. Temeljni potvrdni test za HS je osmotska rezistencija eritrocita (ORE), tj. određuje se osjetljivost sferocita na hemolizu uzrokovanu osmotskim stresom. (ORE je smanjena, što znači da je fragilnost/osjetljivost Erc povećana.) ORE princip: ispituje se rezistencija eritrocita/sferocita njihovom inkubacijom u hipotoničnim otopinama NaCl


različite koncentracije, u uvjetima konstantnog pH, nastala hemoliza se određuje fotometrijski. Rezultati: krivulja osmotske rezistencije ili % NaCl sa minimalnom i maksimalnom (potpunom) hemolizom. Zdravi Erc bubre u hipotoničnoj otopini do vlastite kritične hemolitične točke nakon koje započinje liza Erc. Sferociti su krhkiji, stoga hemoliza počinje kod viših koncentracija fiziološke otopine. Oko 25% bolesnika sa HS imati će normalnu ORE u svježem uzorku pune krvi. Ako u krvi ima 1-2% sferocita i radi se o blagoj hereditarnoj sferocitozi, eritrociti neće pokazati smanjenu osmotsku rezistenciju. Međutim, nakon inkubacije na 37°C u periodu od 24 sata, svi eritrociti bolesnika sa HS membranski integritet, stoga se ovaj test smatra zlatnim standardom za dijagnozu HS. Normalan nalaz ORE ne isključuje dijagnozu HS, a snižena ORE može biti prisutna i u autoimunoj hemolitičnoj anemiji. Stoga je to test niske osjetljivosti za HS.

Pomak u lijevo upućuje na smanjenu ORE (hereditarna sferocitoza). Pomak u desno upućuje na povećanu ORE (talasemija, sickle cell anemija, stanja vezana uz target stanice). Dodatne pretrage:

� SDS-PAGE membranskih proteina eritrocita – identifikacija i kvantifikacija poremećaja membranskih proteina (slaba osjetljivost)

� EIA određivanje spektrina i ankirina-1 � Molekularna dijagnostika (PCR, SSCP i HPLC)

Splenektomija je terapija izbora u liječenju sferocitoze. Kod blagih oblika terapija nije potrebna, po potrebi transfuzijsko liječenje.

Hereditarna eliptocitoza (HE)

U razmazu se nađu Erc ovalnog oblika. Hereditarna eliptocitoza je autosomno dominantna bolest. Može se klasificirati u 3 oblika : Uzrok nastanka hereditarne eliptocitoze također je poremećaj skeletnih membranskih proteina : α-spektrina, β-spektrina, proteina 4.1, glikoforina C i veznog proteina 3.


Kako su i retikulociti i eritroblasti morfološki normalni, smatra se da eliptociti nastaju u cirkulaciji zbog cirkulacijskog stresa. Temeljni defekt uključuje horizontalne poremećaje u membranskim proteinima. Ovi poremećaji uzrokuju nastanak eliptocita kod kojih dolazi do fragmentacije membrane i smanjenja stanične površine, zbog čega je i poluvrijeme preživljavanja eliptocita značajno smanjeno. Zbog nestabilnosti membrane ove su stanice abnormalno propusne za natrij, što uzrokuje povećanu potrebu za ATP-om da bi se održala osmotska ravnoteža. Bolest se klinički očituje znakovima hemolitičke anemije. Dijagnostički kriterij, uz prisutnost hemolize, je nalaz eliptocita ili ovalocita u razmazu periferne krvi. Čak oko 60% eritrocita mogu biti eliptociti. Prisutni su i mikroeliptociti, sferociti, te oko 20% retikulocita. Kao i kod hereditarne sferocitoze, moguće je dokazati kvantitativni poremećaj sastava proteina u membrani i genetsku mutaciju. Terapija izbora je splenektomija.

Hereditarna piropoikilocitoza

Hereditarna piropoikilocitoza je rijetki autosomno recesivni poremećaj. Za razliku od normalnih eritrocita, čija se membrana fragmentira na 49-50°C, HPP stanicama membrana se fragmentira na 45-46°C. HPP stanice imaju dva defekta i svaki je nasljeđen od jednog roditelja. Jedan je vezan uz deficit α-spektrina (poremećaj vertikalnih interakcija), a drugi uz prisutnost mutiranog spektrina koji ne može tvoriti tetramere (poremećaj horizontalnih interakcija). Defekt uzrokuje disrupciju i destabilizaciju membrane, što uzrokuje fragmentiranje eritrocita i poikilocitozu. U razmazu periferne krvi vidljiva je značajna poikilocitoza sa shistocitima, mikrosferocitima, eliptocitima, triangulocitima (fragmentirani eritrociti koji imaju oblik trokuta), ORE je smanjen, posebice nakon inkubacije.

Hereditarna stomatocitoza

Hereditarna stomatocitoza je rijetki nasljedni autosomno dominantni poremećaj u kojemu je membrana eritrocita pretjerano propusna za Na i K. (Veća je propusnost za Na, nego za K) Posljedica toga je povećanje koncentracije iona u eritrocitima pa u njih pojačano ulazi voda i oni izgledaju poput stomatocita (hidrocita – eritrociti u obliku usta). U membrani eritrocita manjka ili je smanjena količina stomatina. Stomatociti imaju smanjeni ORE. Bolest se klinički očituje hemolizom i nalazom 10-30% stomatocita u razmazu periferne krvi. Stečena stomatocitoza javlja se u akutnom alkoholizmu, bolestima jetre, KV bolestima. Međutim, te bolesti prati slabija hemoliza. Terapija izbora je splenektomija.


Akantocitoza

Hemolitička anemija s bizarno oblikovanim eritrocitima koji imaju produžetke različite dužine. Akantociti se javljaju kod bolesnika s teškom jetrenom lezijom, posebice cirozom jetre. Kod bolesnika s teškim poremećajem u radu jetre, u suvišku se nakuplja slobodni kolesterol u membrani eritrocita. Plazma bolesnika s teškom jetrenom bolesti sadrži abnormalne lipoproteine koji imaju visok odnos slobodnog kolesterola naspram fosfolipida. Višak slobodnog kolesterola pokazuje veliki afinitet za ulazak u eritrocitnu membranu, što potom potiče promjenu izgleda eritrocita. Akantociti su laboratorijsko obilježje i abetalipoproteinemije. Kod te nasljedne bolesti u plazmi nedostaje betalipoprotein. Manjak u plazmi nastaje zbog poremećaja u sekreciji apoproteina od jetrenih stanica bilo zbog poremećena posttranslacijskog procesa, bilo zbog manje sekrecije apoproteina. Eritrociti normalna izgleda i pri teškoj jetrenoj bolesti i pri abetalipoproteinemiji dolaze u patološku plazmu, gdje poprimaju izgled akantocita. Klinički se akantocitoza očituje anemijom i splenomegalijom, koje su izraženije nego kod pacijenata s nekompliciranom cirozom jetre. Dijagnoza akantocitoze temelji se na dokazu karakterističnih eritrocita uz hemolitičku anemiju u bolesnika s cirozom jetre. Prognoza bolesnika je vrlo loša jer se akantocitoza pojavljuje u uznapredovaloj fazi jetrene ciroze pa većina bolesnika umire unutar godine dana. Enzimopatije Hemoliza zbog deficita enzima u eritrocitima obično je kroničnog tipa. Tijekom same hemolize eritrociti su morfološki bez promjena ili pokazuju nespecifične promjene (anizocitoza i polikromazija). Međutim, kod deficita enzima koji kontroliraju metabolizam glutationa (npr. G6PDH) dolazi do oksidativne denaturacije hemoglobina, što se morfološki očituje slikom Heinzovih tjelešaca.

Deficit enzima glukoza-6-fosfat dehidrogenaze (G6P-DH)

Deficit G6PDH najčešći je nasljedni poremećaj metabolizma eritrocita. G6PDH je ključni enzim heksoza monofosfatnog shunta, metaboličkog puta koji održava potrebne količine GSH unutar stanice. G6PDH je odgovorna za redukciju NADP+ u NADPH čime nastaje 6-fosfoglukonat koji ulazi u pentoza fosfatni put. U toj reakciji stvoreni NADPH se koristi za održavanj GSH u reduciranom obliku. Aktivnost G6PDH znatno se smanjuje kako eritrocit stari. Radi se o kroničnoj normocitnoj, normokromnoj anemiji, sa retikulocitozom, hiperbilirubinemijom i neonatalnom žuticom. DAT (direktni antiglobulinski test) je negativan, što govori da nema At na površini Erc membrane. Bolest se klinički očituje hemolitičkom krizom nakon akutnih infekcija i uzimanja nekih lijekova koji djeluju kao oksidansi ( antimalarici, sulfonamidi, analgetici).


Karakteristična je hemolitička kriza nakon uzimanja boba, jer zrno te grahorice sadrži snažne prirodne oksidanse. Prema latinskom nazivu boba (Vicia fava) bolest se naziva favizam. I lijekovi i bob uzrokuju denaturaciju hemoglobina, tj. oksidacijski stres. Denaturirani hemoglobin precipitira u eritrocitu u obliku Heinzovih tjelešaca koje fagocitira slezena. Tijekom kriza nađu se fragmentirani eritrociti (šistociti) i Heinzova tjelešca bojenjem metilenskim modrilom, što je test probira za dijagnozu manjka G6PDH. Određivanje aktivnosti enzima osnovni je test za dijagnosticiranje deficita G6PDH.

Deficit enzima piruvat kinaze

Piruvat kinaza (PK) je važan enzim u anaerobnom ciklusu glikolize u eritrocitu. Deficit tog enzima najčešći je enzimski eritrocitni defekt koji uzrokuje kroničnu hemolitičnu anemiju. Deficit PK nasljeđuje se autosomno recesivno. Bolest je klinički prisutna kod homozigota, dok kod heterozigota nema znakova hemolize. Piruvat kinaza katalizira reakciju pretvorbe fosfoenolpiruvata u piruvat pri čemu nataje energijom bogat ATP. Iako se čini logičnim da je hemoliza posljedica nedostatnog stvaranja ATP-a, u eritrocitima nije sa sigurnošću dokazan manjak ATP-a. Klinička težina hemolitičke bolesti može varirati od teške hemolitičke anemije do blage hemolitičke bolesti. Bolesnici s izrazitom hemolitičkom anemijom pokazuju znakove i komplikacije kronične hemolize (žutica, nastanak žučnih kamenaca, aplastične krize bolesti, manjak folata). Stečene hemolitičke anemije Kod splenomegalije, zato što su Erc vulnerabilniji od trombocita i leukocita. Uzroci splenomegalije: hematološke bolesti (KML, KLL, lmfomi), bolesti nakupljanja (Gaucherova bolest), sistemske bolesti (SLE, RA), kod portalne hipertenzije.

Imunosne hemolitičke anemije

Tri su tipa At: 1. stečena aloantitijela nakon transfuzije i trudnoće, a protiv transfundiranih Erc 2. At koja se aktiviraju na tjelesnoj temperaturi, protiv vlastitih Erc 3. At koja se aktiviraju na hladnoći (ispod 30°C), protiv vlastitih Erc. Autoimune hemolitičke anemije (AIHA) nastaju kao posljedica gubitka tolerancije na vlastito. Klasificiraju se prema vrsti autoAt na one uzrokovane toplim i hladnim autoAt. Temeljni laboratorijski test za dokaz imunohemolitičke anemije je Coombsov antiglobulinski test. Test se temelji na sposobnosti At dodanom uzorku (antiserum životinjskog porijekla, polispecifičan) da veže IgG i C3 komponentu komplementa koji su vezani za membranu Erc. DAT (direktni antiglobulinski test) je sposobnost anti-IgG i anti-C3 antiseruma da se vežu za Erc membranu i izazovu aglutinaciju. Idirektni Coombsov test dokazuje prisutnost tih proteina u serumu bolesnika. Temelji se na inkubaciji normalnih Erc sa bolesnikovim serumom, a nakon toga se primjeni


DAT. Pozitivni indirektni Coombsov test s negativnim DAT upućuje na prisutnost aloAt stečenih kod ranijih transfuzija ili trudnoće, a ne na autoimunu bolest. Koristi se puna krv sa EDTA.

HEMOLITIČKA BOLEST FETUSA I NOVOROĐENČETA

Aloimuna bolest povezana sa povećanom destrukcijom Erc tijekom fetalnog ili neonatalnog razdoblja, a uzrokovana inkopatibilnošću krvnih grupa majke i fetusa. Najčešće je uzrokovana antitijelima na ABO i Rh sustav antigena. Uvjeti koji trebaju biti zadovoljeni kako bi došlo do hemolitičke bolesti fetusa i novorođenčeta:

1. majka mora biti senzibilizirana na eritrocitni antigen koji ne posjeduje (prethodna trudnoća/tijekom poroda, majka Rh negativna a čedo Rh pozitivno; ili majka je grupa 0, a čedo A ili B; ili transfuzijom krvi)

2. fetus mora imati antigen na koji je majka senzibilizirana 3. majka mora stvoriti At (IgG) na taj strani Ag 4. majčino At mora moći proći placentu i ući u fetalnu cirkulaciju

ako je in utero destrukcija Erc ozbiljna, fetus će razviti simptome anemije, ekstramedularne hematopoeze (jetra, slezena) što uzrokuje njihovu hipertrofiju, povećane koncentracije indirektng bilirubina. Ovaj se poremećaj naziva i fetalna eritroblastoza, ukazuje na prisutnost velikog broja Eblasta u perifernoj cirkulaciji novorođenčeta (10-100x109/L, normalno je kod novorođenčeta do 2x109/L)! Kako je u novorođenčeta jetra nezrela (nema albumina, mehanizmi konjugacije su slabi), nekonjugirani bilirubin može dovesti do kernikterusa.


AUTOMATSKI HEMATOLOŠKI ANALIZATORI

Principi analize Temeljni principi rada brojača (VCS tehnologija i fluorescencija):

1. impendancija (Coulterov princip) 2. optičko raspršenje svijetla (light scattering) koristeći laserski izvor 3. fluorescencija (diferencijalna krvna slika).

IMPENDANCIJA – princip brojanja i volumetrijskog određivanja pojedinačne stanice suspendirane u otopini; razrijeđena suspenzija stanica prolaskom kroz strujni krug izaziva male promjene električnog otpora (konduktiviteta) prilikom prolaska stanice kroz male otvore (aperture). Te promjene se bilježe kao promjene napona na detektorima. Signali se prevode u električne impulse koji se broje, a količina volumena izotonične elektrolitne otopine (diluenta) koju stanice izbijaju svojim prolaskom analogna je veličini električnog impulsa i proporcionalna staničnom volumenu. OPTIČKO RASPRŠENJE SVIJETLA – koristi se za identifikaciju i brojanje leukocita, eritrocita i trombocita. Princip koristi i hematološki brojač i protočni citometar. Stanice u struji tekućine prolaze jedna iza druge (hidrodinamičko fokusiranje) kroz mjernu komoru, bivaju obasjane laserskim svjetlom određene valne duljine pri čemu dolazi do rasapa svjetla na stanici. Analizom rasapa dobiju se podaci o veličini (forward scatter) i unutarnjim strukturama (lobuliranost jezgre i granuliranost citoplazme) stanice (side scatter). Ako su pak strukture od interesa na stanici obilježene fluorescentnim bojama, detektira se i intenzitet fluorescencije. FLUORESCENCIJA – strukture od interesa na stanici se prethodno analizi obilježe fluorescentom bojom, kada se obasjaju laserom emitiraju fluorescenciju različitih valnih duljina koja se mjeri u fotodetektorima. ODREĐIVANJE HEMOGLOBINA Mjerenje hemoglobina izvodi se spektrofotometrijski: hemoglobin oslobođen liziranjem eritrocita prevodi se u kromogen koji absorbira svjetlo pri valnoj duljini od 544 nm (modifikacija hemiglobincijanid metode). Broj eritrocita (RBC) i broj trombocita (PLT) može se istodobno određivati optičkom (RBCo) i impedancijskom (RBCi) metodom brojanja. Optičkom metodom brojanja trombocita uklanjaju se interferencije pri brojanju trombocita koje uzrokuje prisustvo fragmenata eritrocita ili mikrociti (eritrociti smanjenog volumena), a koji interferiraju u impedancijskoj metodi brojanja. Dodatno, broj trombocita se može odrediti imunometodom, uporabom monoklonskog antitijela CD61 specifičnog za trombocite. Automatsko brojanje retikuocita je zamijenilo ručno brojanje. Brojač određuje retikulocite u perifernoj krvi fluorescencijom. Retikulocitni reagens sadrži


flourescentnu boju kojom se boji ribonukleinska kiselina u retikulocitima, a fluorescencija nastalog obojenja mjeri se na 530 nm. Rezultat se izražava u relativnim (postotnim) i apsolutnim (x109/L) vrijednostima retikulocita. Intenzitet fluorescencije razmjeran je stupnju nezrelosti retikulocita što se koristi za određivanje indeksa IRF (engl. immature reticulocyte fraction) ili frakcije nezrelih retikulocita. Određivanje broja eritroblasta u perifernoj krvi temelji se na određivanju fluorescencije DNA u eritroblastima, mjerenjem intenziteta fluorescencije na 630 nm. Rezultat se izražava u relativnom (%) i apsolutnom broju (x109/L) eritroblasta u perifernoj krvi. Dobiveni se rezultati prikazuju kao histogrami ili scattergrami, koji su onda temelj za automatsku analizu i prikaz flag-ova. Nakon analize na hematološkom analizatoru, ukoliko su nađena kvantitativna ili kvalitativna odstupanja, odabiru se uzorci za daljnju analizu – DKS. Kvantitativni poremećaji se najčešće odnose na broj leukocita i populacije leukocita koje je analizator izmjerio. Kvalitativni poremećaji podrazumijevaju poruke (flags) koje analizator daje uz analizu, a mogu ukazivati na prisutnost abnormalnih stanica ili pogreške određivanju. DKS-om se mogu identificirati lažno pozitivni, odnosno lažno negativni rezultati dobiveni automatskom analizom.


SUMNJIVI REZULTATI DOBIVENI AUTOMATSKIM HEMATOLOŠKIM ANALIZATORIMA

1. Leukociti

Analizator će svaku veliku stanicu (veću od trombocita), koja se nije lizirala sa Erc, smatrati leukocitom. Nakon brojenja, ovisno o analizatoru, za generiranje diferencijalne krvne slke se koristi: 1. impendacija sa niskofrekventnom ili visokofrekventnom strujom (koja detektira i

jezgru), ili 2. lasersko raspršenje svjetla ili 3. bojenje peroksidazom i određivanje apsorbancije. Dobiveni rezultati se prikazuju scattergramima koji omogućavaju detekciju abnormalnosti koje mogu biti povezane sa pogreškama u mjerenju. Moguće pogreške:

� agregacija polimorfonuklearnih granulocita iz uzorka sa EDTA – nije povezana sa patološkim zbivanjem, najčešće kod akutnih ili kroničnh upala te u prisutnosti hladnih aglutinina; dovodi i do klinički značajno sniženog broja granulocita, tako da se može krivo posumnjati na agranulocitozu i dovesti do nepotrebne punkcije koštane srži ili primjene antiobiotika; radi se o in vitro fenomenu uvjetovanom prisutnošću EDTA čiji je mehanizam nastanka nepoznat

� agregacija trombocita i veliki trombociti – pseudoleukocitoza zbog velikih agregata trombocita ili trombocita koji su toliko veliki da se broje kao leukociti, gotovo ih svi analizatori prepoznaju i daju poruku jer ih ne mogu razvrstati u populacije lekocita (limfocita); kod mijeloproliferativnih i mijelodisplastičnih poremećaja

� NRBC – fiziološki se nalaze u cirkulaciji novorođenčadi, ali se mogu naći i patološki kada im je broj čak veći od leukocita; NRBC dolaze u kontakt sa sredstvom za lizu Erc koji uništava njihovu membranu i ostavlja samo jezgre koje su odgovorne za pogreške u mjerenju; te slobodne jezgre se broje ili kao leukociti ili se broje posebno; analizatori novije generacije mogu ih identificirati koristeći fluorescentnu tehnologiju

� Erc rezistetni na lizu – mogu se pojaviti fiziološki kod novorođenačke populacije, ili patološki u prisutnosti abnormalnih Hb varijanti (kod HbC), jetrenih bolesti, uremije i kemoterapije; broje se kao leukociti i uzrokuju pseudoleukocitozu; analizatori daju poruku, nužno je usporediti rezultate delta check-om ili napraviti DKS, pogotovo kod bolesnika na kemoterapiji kod kojih se vjerojatno radi o leukopeniji; neki analizatori omoguću mod dulje lize (Abott CellDyn)

� Krioglobulini – utječu na pogreške u mjerenju leukocita, ali i trombocita, Erc i Hb; abnormalnosti ne koreliraju sa koncentracijom krioglobulina, ali se moraju uočiti jer mogu biti prvi znak krioglobulinemije; krioglobulini su Ig koji precipitiraju na temperaturi nižoj od 37°C, stvarajući krioprecipitate različitih veličina, koji utječu na određivanje trombocita (lažno povećan broj) ili ako su


veći, leukocita (lažna leukocitoza); grijanjem uzorka na 37°C pola sata i ponovljena analiza mogu ukloniti pogrešan rezultat, u suprotnom, ponovljeno uzorkovanje i prijenos uzorka na 37°C do analizatora osigurava pouzdan rezultat; krioglobulini mogu stvarati i gel koji dovodi do nepravilne aspiracije uzorka prilikom analize što generira alarm analizatora

� Lipidi – mogu stavarati kapljice koje interferiraju sa određivanjem Trc i Leu

2. Hemoglobin, eritrociti, eritrocitne konstante

Analizatori mjere Erc, MCV i Hb. Parametri kao Hct, MCH i MCHC se izračunavaju iz mjerenih parametara (Hct=ErcxMCV; MCH=Hb/Erc; MCHC=Hb/Hct). Stoga će pogreške u izmjerenim parametrima rezultirati i pogreškama u izračunatim. Današnje tehnologije omogućavaju i mjerenje CHCM (celular hemoglobin concentration mean), koji se uspoređuje sa MCHC i generira poruku ako rezultati nisu usporedivi. HEMOGLOBIN

� Određuje se spektrofotometrijskom metodom (modifikcija manualne cijanmethemoglobinske metode ili dodatkom SLS-a ili imidazola)

� Lipemija – uzrokuje pogrešne rezultate Trc, Leu i Hb; abnormalno povišen MCHC (>360); MCHC i CHCM nisu ekvivalentni; korekcija Hb formulama

� Visoke koncentracije leukocita – uzrokuju povećan turbiditet uzorka i interferiraju sa mjerenjem Hb (100-250x109/L)

� Imunoglobulini – lažno povisuju vrijednosti Hb (monoklonski proteini) jer reagiraju sa sredstvom za lizu; MCHC je povećan (>360); odrediti Hb u plazmi nakon centrifugiranja uzorka, oduzeti dobivenu vrijednost od vrijednosti Hb dobivene iz pune krvi (kao za lipemiju); ako se uzorak razrijeđuje prethodno analizi manje je podložan toj interferenciji

� Hemoliza – slobodni se hemoglobin mjeri zajedno sa onim iz Erc i normalno mu je koncentracija mala pa ne utječe značajno; međutim kod velikih intravaskularnih hemoliza njegove koncentracije mogu biti dovoljno visoke i značajno utjecati na određivanje Hb; dolazi do lažno smanjenog Hb, MCHC je >360, a nakon centrifugiranja plazma je crvenkasta; kod analizatora koji lazserom izravno određuju Hb u svakoj stanici (CHCM) interferencije nema

ERITROCITI Ako analizator koristi impendanciju, mali se alikvot uzorka razrijeđuje i mjere se Erc i MCV. Ako se koristi laserska tehnologija, raspršenje se mjeri iz dva kuta detektorima, a točnost povećava miješanjem Erc u otopini koja njihov bikonkavni oblik mijenja u sferični.

� Lažno povećanje broja Erc mogu izazvati velike koncentracije leukocita ili prisutnost velikih Trc

� Hladni aglutinini – uzrokuju agregaciju Erc na temperaturi nižoj od 37°C, kao Erc se broje samo agregati do 3 stanice, dok se veliki agergati uopće ne broje, što dovodi do lažno sniženih vrijednosti Erc i povećanja MCV; to utječe i na izračun Hct koji je lažno snižen, a MCHC povećan, upravo konstelacija niskih


Erc, povećanog MCV i visokog MCHC je patognomonična za hladne aglutinine; ne utječu na CHCM, pa postoji diskrepanca između MCHC i CHCM; analiza grijanog uzorka je rješenje

� Mali Erc, mikrociti – lažno smanjeni broj Erc jer se boje kao Trc � Krioglobulini – kao kod Hb � Prisutnost ugruška u uzorku – lažno sniženi broj Erc � In vitro hemoliza

3. Trombociti

Određuju se VCS tehnologijom, suspendirani su u otopini i prolaze kroz malu aperturu koja povezuje dvije komore koje sadrže pozitivnu i negativnu elektrodu. Prolaskom stanice kroz aperturu, dolazi do momentalnog povećanja otpora, koji se registrira kao impuls. Jedna impuls predstavlja jednu stanicu, a veličina impulsa je razmjerna veličini stanice. Tako se broje Erc i Trc, a diskriminiraju se prema njihovom volumenu. Za trombocite je MPV 2-20 fL (donja granica za Erc je 36 fL). Laserskom tehnologijom se dobije rasprešenje svjetlosti prolaskom stanice kroz zraku lasera, količina raspršene svjetlosti razmjerna je veličini stanice (za Trc 1-30 fL). Kod Abbotta se Trc mogu odrediti i imunološki (CD61).

� Pseudotrombocitopenija vezana za EDTA – in vitro fenomen kojeg uzrokuju specifični proteini u uzorku koji reagiraju sa Trc uz EDTA kao antikogulans; analizatori ne broje Trc iz velikih agregata (samo iz malih), što dovodi do lažnih trombocitopenija (20x109/L), a prave su vrijendosti unutar RR; i u drugi su antikoagulansi spominjani u tom kontekstu; može dovesti do nepotrebne punkcije koštane srži i transfuzije Trc; nema znakova krvarenja !!! kod pseudotrombocitopenije; mehanizama je nekoliko, danas je prihvaćeno ona koja govori da je antigen-vezujuće mjesto skriveno (kriptično) u GPIIb/IIIa kompleksu (receptor za fibrinogen na Trc), te da se djelovanjem EDTA otkriva ili modificira na neki način; At (IgG, IgM ili IgA tipa) se smatraju već prisutnima u plazmi (autoAt povezana sa fosfolipidnim sindromom), reagiraju sa otrivenim mjestom na Trc i uzrokuju aglutinaciju; aglutinacija se obično pojavljuje nekoliko minuta nakon uzorkovanja i izrazitija je kod uzoraka na sobnoj temperaturi; agregati se broje u Leu, stoga su alarmi povezani sa nemogućnošću analizatora da odredi diferencijalnu;

� Satelitizam trombocita – oblik pseudoTrcpenije koji se manifestira in vitro kao stvaranje rozeta oko polimorfonuklearnih neutrofila (ponekad i dr. stanica); rijedak fenomen i nije povezan sa specifičnim poremećajem; mehanizam: smatra se da je IgG medijator i da se veže za Fcgama receptore na površini PMN; može i ne mora doći do pseudoTrc; ponekad nema flago-va

� Prisutnost velikih Trc – broje se kao Leu � Fragmentirani Erc – u prisutnosti Erc sa izuzetno malim volumenom, kao kod

mikrocitne anemije zbog nedostatka Fe, mikroangiopatske hemolize, velikog broja shistocita,može doći do lažnog povećanja Trc i lažnih vrijednosti Erc; kod opeklina se mogu pojaviti fragmentirani Erc; potvrda broja Trc iz DKS-a

� Lipidi – interferiraju sa brojenjem Trc


� Krioglobulini – mogu uzrokovati lažno povećane Trc (ovisno o veličini krioprecipitata), ali prvenstveno interferiraju sa određivanjem Leu


BENIGNE BOLESTI LEUKOCITA MORFOLOŠKE PROMJENE GRANULOCITA

1. Pelger-Huetova anomalija – benigna, nasljedna, jezgra neutrofila izgleda kao naočale s dva segmenta; u stečenom obliku prati KML

2. hipersegmentacija jezgre – više od 5 segmenata po neutrofilnom granulocitu, rani su pokazatelj megaloblastične anemije, deficita folne kiseline i B12

3. Dohleova tjelešca – inkluzije u citoplazmi neutrofila (ljubičaste točke), agregati su grubog ER-a, nalazimo ih kod ozbiljnih infekcija, opeklina

4. toksične granule – u citoplazmi segmentiranih i nesegmentiranih neutrofilnih granulocita, kod bakterijskih infekcija

KVANTITATIVNE PROMJENE GRANULOCITA 1. neutrofilija – reaktivna (do 50x109/L) kao rezultat na fiziološki ili patološki

proces u organizmu, fiziološka je reakcija na bakterije, toksine, tkivnu nekrozu, upalu, metabolički poremećaj; pomak u lijevo sa pojavom meta i mijelo, pojava toksičnih granula; može biti akutna ili kronična; ako je broj neutrofila veći od 50 govorimo o leukemoidnoj reakciji

2. neutropenija – kada broj neutrofila padne ispod 2; agranulocitoza je povezana sa infekcijom; nastaje zbog poremećaja u matičnoj stanici, kod megaloblastične anemije, zbog kemikalija i toksina

KVANTITATIVNE PROMJENE EOZINOFILA 1. eozinofilija – invazija tkiva parazitima, alergije, poremećaji respiratornog trakta,

GI bolesti KVANTITATIVNE PROMJENE MONOCITA

1. monocitoza –upale i maligne bolesti, u fazi oporavka od akutne infekcije KVANTITATIVNE PROMJENE LIMFOCITA

1. limfocitoza – limfociti su normlano viši kod djece, nastaje kao odgovor na infekciju ili upalu, a pojavljuju se morfološki različiti oblici limfocita u DKS-u (mali, veliki sa bazofilnijom citoplazmom, sa granulama, sa vakuolama, kromatin obično bude rahliji – reaktivni ili atipični limfociti), najčešće virusne etiologije (infektivna mononukleoza, CMV)

2. limfocitopenija – smanjeno stvaranje ili povećana destrukcija limfocita; kortikosteroidi unutar 4 sata uzrokuju značajan pad u limfocitima zbog sekvestracije limfocita u koštanoj srži, zatim akutne virusne infekcije su povezane sa prolaznom limfocitopenijom, kemoterapija ili zračenje kod malignih oboljenja


LEUKEMIJE Leukemije mogu biti mijeloidne i limfoidne, ovisno o zahvaćenoj matičnoj stanici (mijeloidna ili limfoidna matična stanica). Dalje se mogu, ovisno o agresivnosti bolesti i stupnju diferencijacije stanica podijeliti ana akutne i kronične. Kod akutnih leukemija postoji poremećaj u normalnoj maturaciji stanica, javljaju se blasti i pokoja zrela stanica, to se naziva lekemijskim hiatusom. U DKS-u se nalaze nediferencirane i minimalno diferencirane stanice, što ukazuje na akutni tijek bolesti. Podtipovi leukemija (ALL, AML) se identificiraju koristeći morfološke, citokemijske, imuološke i genetičke tehnike. Kod kroničnih leukemija nakupljaju se stanice u višem stupnju diferencijacije (<20% blasta). Sve su faze maturacije prisutne, ali prevladavaju zreliji oblici. Mijeloproliferativni poremećaji su obilježeni hipercelularnošću koštane srži, a na periferiji je prisutna eritrocitoza, granulocitoza i/ili trombocitoza zbog disregulirane proliferacije stanica. Obično prevladava jedna stanična linija. Mijelodisplastični sindromi su obilježeni hipercelularnošću i displazijom koštane srži, a u perifernoj se krvi nalazi citopenija sa različitom displazijom pojedinih staničnih linija. Poremećaj zahvaća pluripotentnu matičnu stanicu. WHO klasifikacija Temelji se na morfologiji, citokemiji i imunofenotipizaciji neoplastičnih stanica kako bi se odredila stanična linija malignog klona i stupanj diferencijacije. Međutim, koristi i genetičke informacije nadopunjene kliničkim podacima (prijašnja terapija, prisutnost MDS) kako bi se entiteti svrstali u različite podgrupe. U mijeloidne neoplazme se ubrajaju 4 velike grupe ovisno o morfološkim karakteristikama, genetičkim poremećajima, imunofenotipizaciji i kliničkoj slici:

1. Mijeloproliferativne neoplazme (MPN) 2. Mijelodisplastične/Mijeloproliferativne neoplazme (MDS/MPN) 3. Mijelodisplastični sindromi (MDS) 4. Akutna mijeloična leukemija (AML)

Kriterij za diferencijaciju AML od ostalih mijeloproliferativnih neoplazmi je >20% blasta u koštanoj srži (broj blasta u svih stanica s jezgrom u koštanoj srži, osim kod eritroleukemija). Klasifikacija limfoidnih neoplazmi se temelji na morfologiji, imunofenotipizaciji stanica, genetički poremećaji i kliničkim pokazateljima. Dijele se u 3 grupe:

1. neoplazme B stanica 2. neoplazme T/NK stanica 3. Hodgkinova bolest.

Akutne T i B imfocitne lekemije se svrstavaju u mijeloidne neoplazme.


Laboratorijske tehnike u dijagnozi i klasifikaciji neoplazmi Diferencijacija blasta (pogotovo kod akutnih leukemija) se temelji na:

� Morfologiji stanica (otežano) � Citokemijskom bojenju stanica � Imunofenotipu stanica � Analizi kromosomskih promjena.

Citokemijska bojenja se temelje na inkubaciji stanica sa supstratima koji reagiraju sa specifičnim staničnim komponentama (npr. mijeloblasti su MPO i Sudan Black pozitivni, dok su limfoblasti negativni). Citokemisjka se bojenja dijele na enzimska (MPO, esteraza, ALP) i neenzimska (Sudan Black za lipide, PAS za glikogen, toluidin za mukpolisaharide). Esteraza se koristi za razlikovanje monoblasta od mijeloblasta. Imunofenotipizacija stanica se temelji na identifikaciji specifičnih površinskih biljega (antigena) koji su karakteristični za pojedine stanične linije. Danas se to radi protočnom citometrijom. Protočna citometrija Tehnika kojom se detektiraju i mjere različite karakteristike (fizikalne i kemijske) stanica radi njihove identifikacije i kvantifikacije. Protočna citometrija se trenutno koristi za imunofenotipizaciju – klasifikaciju i dijagnozu (ALL, AML, PNH, zrelih limfoidnih neoplazmi), te kvantifikaciju RNA i DNA u stanicama (praćenje infekcije HIV-om). Protočnim citometrom se mogu detektirati molekule na površini ili u unutrašnjosti stanice. Stanice su suspendirane u otopini, nakon aspiracije u mjernu komoru, stanice se hidrodinamičkim fokusiranjem svode u jednu liniju (laminarnim protokom dviju tekućina pod različitim tlakovima) i dovode do izvora laserske svjetlosti. Laser obasjava stanicu, a raspršeno se svjetlo detektira fotodetektorima. Ako su stanice obilježene fluorescentnim bojama, doći će do emisije svjetla na specifičnoj valnoj duljini, što se isto detektira. Raspršeno je svjetlo odraz fizikalnih osobitosti stanice: svjetlo raspršeno pod kutem od 90°(SSC) odražava unutarnju građu i granuliranost stanice; svjetlo raspršeno pod kutem od180° od ulazne zrake (FSC) govori o veličini stanice. Protočni citometri mogu detektirati i fluorescentu emisiju svjetla. Fluorokromima obilježena At (ili bije koje se izravno vežu za Dna ili RNA) se vežu za specifčne strukture na stanicam koje želimo identificirati. Korištenjem više različitih fluorokroma istodobno možemo detektirati više Ag na stanici. Imunofenotipizacija je identifikacija Ag koristeći detekcijska monoklonska At. Obično se identificiraju Ag na površini stanice, ili u unutrašnjosti stanice nakon permeabilizacije membrane deterđentima. Uzorak za imunofenotipizaciju je suspenzija stanica (puna krv nakon lize Erc, aspirat koštane srži, uzorci ostalih tjelesnih tekućina, homogenati tkiva). Prije analize potrebno je suspenziju stanicam obojiti fluorescentnim bojama.


Genetičke analize Citogenetičkim analizama mogu se detektirati abnormalni kariotipi u većini akutnih leukemija. Specifične kromosomske promjene karakteristične su za pojedine neoplastične bolesti:

� Promijelocitna leukemija t(15;17) � Kronična mijelocitna leukemija t(9;22), Philadelphia kromosom

Ako su prisutne prije primjene terapije, njihova prisutnost i odsutnost nakon terapije može se koristiti za identifikaciju remisije, relapsa ili minimalne ostatne bolesti. Molekularne genetičke analize su danas temelj u dijagnostici hematopoetskih neoplazmi, pogotovo AML, CML, PV i Ti B ALL. Metode koje se koriste u molekularnoj dijagnostici hematoloških neoplazmi:

1. Southern blott analiza – nakon izolaciue DNA, ona se pocijepa restrikcijskim endonukleazama na fragmente od interesa, fragmenti se prema veličini razdvoje elektroforezom, transferiraju na memebranu i detektiraju koristeći probe komplementarne sekvenci od interesa.

2. PCR – nakon izolacije se sepcifičan segment DNA umnaža višestruko, kako bi se olakšala detekcija.

3. In situ hibridizacija – DNA se hibridizira sa komplementarnim probama i vizualizira pod mikroskopom. Održana je arhitektura tkiva ili morfologija stanica, što olakšava lokalizaciju poremećaja u tkivu.

4. sekvencioniranje – za detekciju točkastih mutacija. Hematološka remisija – odsutnost neoplastičnih stanica u perifernoj krvi i koštanoj srži. Citogentička remisija – odsutnost prepoznate citogenetičke abnormalnosti. Molekularna remisija – odsutnost detektabilnog molekularnog poremećaja koristeći metode molekularne dijagnostike. Osjetljivost PCR-a je 1x106 stanica tumora. Minimalna rezidualna bolest je pojam koji se odnosi na negativne tradicionalne testove (periferna krv, koštana srž i citogentika), dok je molekularni test pozitivan (PCR/FISH).

MIJELOPROLIFERATIVNE NEOPLAZME (MPD)

Klonalni hematopoetski (mijeloproliferativni) poremećaji nastali transformacijom pluripotentne hematopoetske matične stanice. Dolazi do ekspanzije abnormalnog klona pluripotentne matične stanice u koštanoj srži, dok se normalna hematopoeza suprimira. U perifernoj krvi dolazi do proliferacije abnormalnih stanica koje potječu iz toga klona, s naglaskom da su očuvani usmjerenost, diferencijacija i sazrijevanje stanica (povećani broj zrelih stanica obično jedne stanične linije). KLASIFIKACIJA:

1. Kronična mijeloična leukemija, BCR-ABL1 pozitivna 2. Kronična neutrofilna leukemija 3. Policitemija vera 4. Primarna mijelofibroza


5. Esencijalna trombocitemija 6. Kronična eozinofilna leukemija, nije specificirana na drugi način 7. Mastocitoza – gotovo uvijek udružena s mutacijom KIT D816V (tirozin kinaza) 8. Mijeloproliferativna neoplazma, neklasificirana

� KRONIČNA MIJELOIČNA LEUKEMIJA (CML)

- pojačana proliferacija granulocitne loze u koštanoj srži (KS), perifernoj krvi (PK) i ekstramedularnim tkivima

- faze bolesti su: kronična faza traje nekoliko godina, a obilježena je pojačanom mijeloproliferacijom i akumulacijom zrelih mijeloidnih stanica; zatim slijedi akcelerirana faza koja traje 4-6 mjeseci i obilježena je pojačanom proliferacijom prekursora; te blasična kriza obilježena ekspanzijom blasta mijeloidnog ili limfoidnog reda (transformira se u AML ili ALL), praćena je pojavom dodatnih kromosomskih abnormalnosti (mutacije u p53 tumor-supresorskom genu)

- karakterističan nalaz je pozitivan Ph kromosom, nastaje recipročnom translokacijom dugih krakova kromosoma 9 i 22 – t (9;22)

- ta translokacija uzrokuje promjenu pozicije dva proto-onkogena c-abl i c-sis; abl biva prebačen na 22. kromosom čime nastaje fuzijski gen bcr/abl koji kodira novi abnormalni BCR/ABL protein

- novi protein ima pojačanu aktivnost protein kinaze, pojačano fosforilira unutar stanice i na taj način suprimira apoptozu i neprestano potiče staničnu proliferaciju

- oko 5% bolesnika sa CML nema Ph kromosom, ali se translokacija na molekularnoj razini može detektirati

- Ph kromosom može biti pozitivan i kod AML i ALL, smatra se da se zapravo radi o CML u fazi blastične krize (CML koja nije prepoznata u ranijim fazama bolesti)

- CML se pojavljuje nakon 55 godine, kliničkim pregledom se nalazi hepatosplenomegalija (nakupljanje mijeloidnih stanica ekstramedularno)

- ako se ne liječi progredira do blastične faze, a tada je prognoza loša - u perifernoj se krvi nalazi leukocitoza (preko 100x109/L) sa predominacijom

svih razvojnhi oblika granulocita u razmazu, pogotovo segmentiranih ganulocita i mijelocita; trombocitoza (u blastičnoj krizi trombocitopenija); blaga anemija

- koštana srž– hipercelularna sa predominacijom nezrelih granulocita, ali sa manje od 20% blasta (KL vs AL); nema hiatusa leukemikusa

- dijagnostički kriterij: 1. Kronična faza: detekcija BCR-ABL1 fuzijski protein (Ph+) 2. Ubrzana faza: Bazofilija u krvi ≥20%, blasti u krvi ili koštanoj srži 10-

19%, trombocitopenija (<100×109/L) koja nije povezana s terapijom, trombocitoza (>1000×109/L) otporna na terapiju; povećanje slezene i broja leukocita otporno na terapiju, pojava nove genetske promjene


koja nije bila prisutna pri dijagnozi KML-a (klonalna evolucija) npr. +8, +Ph, +19 ili i(17q)

3. Blastična faza: Blasti u krvi ili koštanoj srži ≥20%, ekstramedularna proliferacija blasta (osim slezene), velika žarišta ili nakupine blasta kod biopsije koštane srži

- terapija: ionizirano zračenje, busulfan, hidroksiurea, interferon alfa, Imatinib mesilate (Glivec®)

- glivec je pametan lijek, inhibitor tirozin kinaze (TKI), koji specifično blokira enzimsku aktivnost BCR-ABL fuzijskog proteina – molekularno ciljana terapija koja inhibira stanični rast i inducira apoptozu u CML

- glivec se veže na mjesto vezanja ATP na tirozin kinazi i ireverzibilno inhibira njeno djelovanje (ne veže se za aktivno mjesto!)

- odovor na terapiju se prati hematološkim, citogenetičkim i molekularnim odgovorom

1. Potpuni hematološki odgovor - Trombociti < 450x109/L, Leukociti <10x109/L, DKS - bez nezrelih granulocita i <5% bazofila, slezena se ne palpira

2. Citogenetički odgovor (CyR) - Potpuni – Ph+ 0%, Djelomični – Ph+ 1% - 35%, Mali – Ph+ 36% - 65%, Minimalni – Ph+ 66% - 95%, Bez odgovora – Ph+>95%

3. Molekularni odgovor (MR) – Potpuni – prijepis BCR-ABL nije dokazan s osjetljivošću > 104 u dva zasebna uzorka periferne krvi, Značajan (MMoR) – ≤0,1%* (Standardizirana bazna linija predstavlja 100% na međunarodnoj ljestvici; 0,1% je smanjenje od 3-log u odnosu na standardnu baznu liniju).

- hematološki odgovor se prati KKS-om (kod dijagnoze i svaka 2 tjedna dok se ne postigne i potvrdi potpuni hematološki odgovor, tada svaka 3 mjeseca)

- citogenetički odgovor se prati klasičnom citogenetikom ili FISH (samo prije terapije), a učestalost: kod dijagnoze, 3 i 6 mjeseci nakon početka terapije, svakih 6 mjeseci dok se ne postigne i potvrdi potpuni citogenetski odgovor, tada svakih 12 mjeseci

- molekularni odgovor – RQ-PCR; kod dijagnoze; svaka 3 mjeseca dok se ne postigne i potvrdi potpuni molekularni odgovor, tada svakih 6 mjeseci

- MUTACIJE u genu za ABL se prate kod suboptimalnog odgovora ili bez odgovora na terapiju, te prije promjene terapije

- Praćenje minimalne ostatne bolesti – temeljni problem racionalne dijagnostike u remisiji je praćenje leukemijske mase kako bi se potvrdio intenzitet i trajanje liječenja. Dokazivanje minimalne ostatne bolesti obuhvaća utvrđivanje prisutnosti lekemoidnih stanica u fazi remisije, kada je leukemijska masa mala. To se čini PCR tehnikama (RQ-PCR), i to u onih bolesnika koji pokazuju molekularne markere bolesti. Moguće je pratiti i otkriti leukemijsku masu veličine do 10-6 (1 leukemijska stanica na mlijun zdravih).


� Ph NEGATIVNE MPN Postavljanje dijagnoze MPN: Uzorak prije terapije - koštana srž (KS) i periferna krv (PK)

1. Procjena broja blasta (citologija, histologija) - PK – 200 stanica leukocita (≥20% AML) - KS – 500 stanica s jezgrom u aspiratu - Oskudni uzorak – fibroza? – histologija – CD34+

2. Procjena blasta (imunofenotipizacija) - Određivanje linije blasta i aberantnih fenotipova (NE POSTOTKA

BLASTA) 3. Procjena genetičkih parametara (citogenetika, molekularna dijagnostika)

i. Kompletna citogenetska obrada KS (klasika, FISH) ii. Molekularna dijagnostika

1. RT-PCR (BCR/ABL, FIP1L1/PDGFRA) 2. mutacije (JAK2, MPL, KIT )

KRONIČNA NEUTROFILNA LEUKEMIJA

1. Dijagnoza – isključiti reaktivnu neutrofiliju ili druge MPN a. u 20% slučajeva – prati neki drugi neoplasični poremećaj najčešće

multipli mijelom 2. Leukociti > 25x109/L

a. DKS - segmentirani granulociti uz povećan broj nesegmentiranih, ne više od 10% nezrelijih stanica granulocitne loze

3. KS – hipercelularnost, pojačana proliferacija neutrofila 4. 90% - normalni kariotip, ostalo +8, +9, +21,del(20q), del(11q), del(12p) 5. JAK2 V617F – pojedinačni slučajevi (Janus kinaza, tirozin kinaza koja

sudjeluje u diferencijaciji, proliferaciji, opstanku stanice) 6. Slabo progresivna (MDS, AML)

JAK 2 V617F Točkasta mutacija u genu za Janus kinazu 2

a. Gen - kratki krak kromosoma 9 (9p) b. G u T mutacija u genu na mjestu 1849 c. Valin u fenilalanin na mjestu 617 u autoinhibitornoj JH2 regiji JAK2

kinaze Dokazuje se alel specifičnim PCR-om i RFLP-om, sekvencioniranje. POLICITEMIJA VERA Zloćudna klonalna mijeloproliferatvna bolest nastala transformacijom multipotentne matične stanice. Očituje se nekontroliranom proliferacijom eritrocitopoeze, granulocitopoeze i trombocitopoeze. U perifernoj krvi dominira eritrocitopoeza, i umjerena leukocitoza i trombocitoza. Kroničnog je tijeka, polagano prelazi u fazu iscrpljenja koja sliči idiopatskoj mijelofibrozi.


Dijagnostički kriteriji – za postavljanje dijagnoze potrebna su oba glavna kriterija i jedan sporedni ili prvi glavni i dva sporedna kriterija. Glavni kriteriji:

1. Hemoglobin >185 g/L za muškarce i >165 g/L za žene ili neki drugi dokaz povećanog volumena eritrocita (Hb ili Hct > 99-tog percentila GGRR; Hb >170 g/L za muškarce i >150 g/L za žene uz porast od 20 g/L od bazne vrijednosti koji se ne može povezati s terapijom nedostatka željeza; eritrocitna masa >25% iznad normalne predviđene vrijednosti)

2. Dokaz mutacije JAK2 V617F (90%!) ili druge funkcionalno srodne mutacije npr. mutacija JAK2 u eksonu 12

Sporedni kriteriji: 1. Biopsija koštane srži koja pokazuje hipercelularnost (panmijeloza) i izraženom

eritroidnom, granulocitnom i megakariocitnom proliferacijom 2. Eritropoetin u serumu ispod donje granice referentnog intervala (njegovu

sintezu suprimira hipercelularna koštana srž) 3. Autonomni rast eritroidnih kolonija in vitro.

Terapija: kontrolirane flebotomije. ESENCIJALNA TROMBOCITEMIJA Klonalna mijeloproliferativna bolest koja se manifestira povećanom megakariocitopoezom i trombocitozom na periferiji. Dijagnostički kriteriji - za dijagnozu su potrebna sva 4 kriterija.

1. Dugotrajna trombocitoza ≥450×109/L 2. Biopsija koštane srži pokazuje proliferaciju većinom megakariocitne loze s

povećanim brojem velikih, zrelih megakariocita. Bez značajnog porasta ili skretanja u lijevo neutrofilne granulocitopoeze ili eritrocitopoeze.

3. Nisu zadovoljeni uvjeti za policitemiju veru (nemogućnost nadomjesne terapije željezom da poveća hemoglobin na razinu karakterističnu za PV u prisutnosti snižene koncentracije feritina), primarnu mijelofibrozu (nedostatak značajne retikulinske fibroze, kolagenske fibroze, periferne leukoeritroblastoze, hipercelularne koštane srži s proliferacijom megakariocita karakterističnom za PM), BCR-ABL1 pozitivnu KML, sindrom mijelodisplazije (nedostatak diseritropoeze i disgranulopoeze) ili druge mijeloidne neoplazme.

4. Dokaz mutacije JAK2 V617F ili drugog biljega klonalnosti, a u nedostatku JAK2 V617F bez dokaza za reaktivnu trombocitozu (deficit željeza, splenektomija, operativni zahvat, infekcija, upala, upalna bolest vezivnog tkiva, metastatski karcinom, limfoproliferativne bolesti iako prisutnost reaktivne trombocitoze ne isključuje postojanje ET kada su ispunjeni drugi uvjeti).

PRIMARNA MIJELOFIBROZA Karakterizira ju ekstramedularna hematopoeza u slezeni ili više organa te reaktivna fibroza koštane srži. Dijagnostički kriteriji – za dijagnozu je potrebno dokazati sva 3 glavna kriterija i 2 sporedna kriterija.


Glavni kriteriji: 1. Proliferacija megakariocita uz atipiju praćeno retikulinskom ili kolagenskom

fibrozom (atipija – mali do veliki megakariociti s poremećenim nukleo-citoplazmatskih omjerom i hiperkromnom, nepravilno svijenom jezgrom = displastični megakariociti) ili u odsutnosti značajne retikulinske fibroze, promjene megakariocita moraju biti praćene hipercelularnom koštanom srži zbog granulocitne proliferacije i često smanjene eritrocitopoeze (prefibrotična faza bolesti – celularna faza)

2. Nisu zadovoljeni uvjeti za policitemiju veru (nemogućnost nadomjesne terapije željezom da poveća hemoglobin na razinu karakterističnu za PV u prisutnosti snižene koncentracije feritina), BCR-ABL1 pozitivnu KML, sindrom mijelodisplazije (nedostatak diseritropoeze i disgranulopoeze) ili druge mijeloidne neoplazme.

3. Dokaz mutacije JAK2 V617F ili drugog biljega klonalnosti (npr. MPLW515K/L), ili u odsutnosti biljega klonalnosti isključiti fibrozu koštane srži kao posljedicu infekcije, autoimunih bolesti i drugih kroničnih upalnih bolesti, leukemije vlasastih stanica i drugih limfoidnih neoplazmi, metastatskih karcinoma ili toksične mijelopatje.

Sporedni kriteriji: 1. Leukoeritroblastoza 2. Povećana aktivnost LDH u serumu 3. Anemija 4. Palpabilna splenomegalija

� SINDROM MIJELODISPLAZIJE

Zloćudne bolesti matične hematopoetske stanice koje se očituju dishematopoezom u koštanoj srži. Bolest može prijeći u akutnu leukemiju, najčešće mijeloičnu. Klonalna je bolest matične hematopoetske stanice. U perifernoj krvi se nalazi citopenija barem jedne mijeloidne stanične loze. Dijagnostički kriterij: Barem 10% stanica barem jedne mijeloidne loze u koštanoj srži mora nedvojbeno pokazivati displaziju (poremećaj u sazrijevanju) pri čemu treba isključiti uzroke sekundarne displazije. U slučaju nemogućnosti morfološkog dokazivanja displazije, a kada postoji trajna citopenija neutvrđenog uzroka, sumnja na MDS se može postaviti ukoliko postoje specifični klonalni kromosomski poremećaji tj. kompleksni kariotipovi od 3 ili više abnormalnosti od kojih barem jedna od navedenih: del(7q), del(5q), i(17q), del(13q), del(11q), del(12q), del(9q), t(11;16), t(3;21), t(1;3), t(2;11), t(6;9), inv(3).

S t r a n i c a 100 |

Klasifikacija:

Bolest Periferna krv Koštana srž

Refraktorna citopenija s displazijom jedne loze (RCUD)

Unicitopenija ili bicitopenija* Bez blasta ili <1%**

Displazija jedne loze: ≥10% stanica jedne mijeloidne loze <5% blasta <15% prstenastih sideroblasta (u odnosu na eritroidne prekursore)

Refraktorna anemija s prstenastim sideroblastima (RARS)

Anemija je primarni nalaz, Pelgerova anomalija Bez blasta Refraktorna znači da ne odgovara na konvencionalnu terapiju.

≥15% prstenastih sideroblasta (u odnosu na eritroidne prekursore) Samo eritroidna displazija <5% blasta Prstenasti sideroblasti – eritroblasti sa nakupljenim nehemoglobinskim Fe u mth, dokazuje se reakcijom berlinskog modrila

Refraktorna citopenija s displazijom više loza (RCMD)

Citopenija (bicitopenija/pancitopenija) Bez blasta ili <1%** Nema Auerovih štapića < 1×109/L monocita

Displazija u ≥10% stanica 2 ili više mijeloidnih loza <5% blasta Nema Auerovih štapića ±15% prstenastih sideroblasta

Refraktorna anemija s viškom blasta - 1 (RAEB-1)

Citopenija (bicitopenija/pancitopenija) <5% blasta** Nema Auerovih štapića < 1×109/L monocita

Displazija jedne ili više loza 5 – 9% blasta**

Nema Auerovih štapića

Refraktorna anemija s viškom blasta - 2 (RAEB-2)

Citopenija (bicitopenija/pancitopenija) 5 – 19% blasta*** ± Auerovi štapići*** < 1×109/L monocita

Displazija jedne ili više loza 10 – 19% blasta***

± Auerovi štapići***

Sindrom mijelodisplazije, neklasificiran (MDS-U)

Citopenija <1% blasta**

Jednoznačna displazija u <10% stanica jedne ili više mijeloidnih loza uz prisutnost citogenetskih poremećaja za postavljanje sumnje na MDS <5% blasta

Mijelodisplazija s izoliranom delecijom del(5q)

Anemija Normalan ili povećan broj trombocita Bez blasta ili <1%

Normalan ili povećan broj megakariocita s hipolobuliranom jezgrom <5% blasta Nema Auerovih štapića Izolirana delecija del(5q)

* u slučaju pancitopenije svrstati u MDS-U.

**kada je <5% mijeloblasta u koštanoj srži, ali ima 2-4% mijeloblasta u perifernoj krvi – svrstati u RAEB-1. Slučajeve RCUD i RCMD s 1% mijeloblasta u krvi treba svrstati u MDS-U.

***Slučajeve s Auerovim štapićima i <5% mijeloblasta u krvi i <10% blasta u koštanoj srži treba svrstati u RAEB-2. Za RAEB-2 treba biti ispunjen barem 1 od 3 kriterija (5-19% blasta u perifernoj krvi, 10-19% blasta u koštanoj srži i/ili prisutnost Auerovih štapića)

AKUTNE MIJELOIČNE LEUKEMIJE

Poremećaji matične stanice obilježeni maligno proliferacijom i nakupljanjem nezrelih i nefunkcionalnih hematopoetskih stanica u koštanoj srži. Neoplastične stanice

S t r a n i c a 101 |

pokazuju povećanu proliferaciju i poremećenu apoptozu. Dolazi do ekspanzije zloćudnog klona nauštrb normalnih stanica. Dijele se u AML i ALL. Kod AML je zahvaćena mijeloidna matična stanica, a kod ALL limfoidna matična stanica. Leukocitoza u perifernoj krvi sa prisutnošću blasta koji ukazuju na AL (stanice ne sazrijevaju već ostaju na razini mijeloblasta i promijelocita). Mora ih prema WHO biti više od 20% u perifernoj krvi odnosno koštanoj srži kako bi se podtavila dijagnoza AL. Identifikacija pojedinih podtipova morfološki, citokemijskim tehnikama, imunofenotipizacijom i molekularnim metodama. Eritrociti i trombociti su sniženi u perifernoj krvi. Molekularne promjene koje mogu izazvati zloćudnu bolest uključuju:

� kromosomske translokacije � delecije � amplifikacije � točkaste mutacije.

Mogu zahvatiti gene koji reguliraju tirozinske kinaze, regulacijske faktore transkripcije, receptore na površini stanice te faktore rasta. Analizom tih promjena dobivamo ne samo uvid u molekularnu patofiziologiju leukemija i limfoma, već i prognostičku informaciju koja utječe na terapiju i ishod bolesti. Klasifikacija AML: 1. Akutna mijeloična leukemija s povratnim genetskim preuredbama (s citogenetskim promjenama) 2. Akutna mijeloična leukemija s mijelodisplastičnim promjenama 3. Mijeloidna neoplazma udružena s terapijom (nakon terapije) 4. Akutna mijeloična leukemija, nije specificirana na drugi način (FAB) 5. Mijeloidni sarkom 6. Mijeloidna proliferacija udružena s Down sindromom 7. Neoplazma blastične plazmacitoidne dendritičke stanice Akutna mijeloična leukemija s povratnim genetskim preuredbama (s citogenetskim promjenama) Za nastanak akutne leukemije tj. maligno promijenjene stanice nije dovoljna jedna genetička promjena već je potrebna istovremena prisutnost (suradnja) više mutacija – 2-hit model: 1. Mutacije klase I su mutacije gena koji kodiraju proteine uključene u prijenos

signala (npr. tirozin kinaze) i leukemijskom klonu osiguravaju prednost preživljenja i/ili proliferacije kao npr. ABL, FLT3, JAK2, RAS, KIT, PDGFRA, FGFR1.

2. Mutacije klase II su mutacije gena koji kodiraju transkripcijske faktore i primarno kontroliraju sposobnost diferencijacije te time dovode do zastoja u sazrijevanju npr. RUNX1, CBF, RARα, MLL ili mutacije koje dovode do povećane sposobnosti samoobnavljanja i inhibicije apoptoze npr. NPM1, TP53.

S t r a n i c a 102 |

22--HIT MODELHIT MODEL

proteinske tirozin kinaze

�� ABLABL

�� PDGFPDGFRRαααααααα�� JAKJAK22

�� FGFRFGFRII

transkripcijski faktori

�� CBFCBF�� RRARAR�� HOXHOX�� p300/CBPp300/CBP

�� RUNX1RUNX1

�� C/EBPC/EBPαααααααα�� PU.1PU.1

�� FLT3FLT3�� KITKIT�� RASRAS

kronikroniččne ne mijeloproliferativne mijeloproliferativne

bolestibolesti

mijelodisplastimijelodisplastiččni ni sindromsindromakutna mijeloiakutna mijeloiččna na

leukemijaleukemija

mutacije klase Imutacije klase I mutacije klase IImutacije klase II

prednost proliferacije i/ili prednost proliferacije i/ili preprežživljenjaivljenja

zastoj u sazrijevanjuzastoj u sazrijevanju

Cools i Schwaller, Drug Discovery Today, 2004Cools i Schwaller, Drug Discovery Today, 2004

WHO dijeli AML prema biološkim i međusobno isključivim kriterijima na temelju prognostičke vrijednosti genetske abnormalnosti, ali također i na temelju morfoloških, kliničkih, fenotipskih i drugih jedinstvenih bioloških karakteristika. Međutim, kod mnogih citogenetski „normalnih“ AML svaka od ovih mutacija predstavlja važan prognostički faktor. Mutacije NPM1 i CEBPA uključene su u podjelu kao privremeni entiteti. Zbog svoje prognostičke vrijednosti. Ispitivanje na mutaciju FLT3 (npr. FLT3-ITD) se preporuča u svim slučajevima citogenetski normalne AML.

1. Preuredbe t(8;21), inv(16), t(16;16) i t(15;17) dovoljno je dokazati za potvrdu dijagnoze AML bez obzira na postotak blasta u perifernoj krvi i koštanoj srži. Ove preuredbe imaju dobru prognozu.

2. Ostale preuredbe trebaju biti dokazane uz nalaz ≥20% blasta u perifernoj krvi ili koštanoj srži za potvrdu dijagnoze AML. Imaju lošiju prognozu.

t(8;21); RUNX1-RUNX1T1 ili drugim nazivom AML1-ETO je fuzijski protein koji inhibira aktivaciju transkripcije. Normalni protein RUNX1 (AML1) je jedan od oblika CBFα podjedinice (core binding factor) koja zajedno s CBFβ podjedinicom čini transkripcijski faktor CBF. Normalni RUNX1(CBFα) protein veže CBFβ i time se pojačava transkripcija ciljnog gena. Mutirani RUNX1-RUNX1T1 ne može vezati CBFβ, već veže nuklearni korepresor koji onemogućuje transkripciju. U DKS-u mijeloblasti sa Auerovim štapićima. Slično djeluju fuzijski prijepisi inv(16) ili t(16;16); CBFβ-MYH11 i t(12;21); TEL-AML1 (ETV6-RUNX1) kod B limfoblastične leukemije/limfoma. CBFβ-MYH11 predstavlja mutirani oblik CBFβ podjedinice transkripcijskog faktora koji dovodi do AML s eozinofilijom.

3. t(15;17); PML-RARα (M3) – fuzijski protein koji inhibira diferencijaciju stanice u fazi promijelocita (nekada se zvala akutna promijelocitna leukemija) koji je

S t r a n i c a 103 |

mijeloperoksidaza pozitivan (MPO+). RARα predstavlja receptor za retinoičnu kiselinu, koja svojim vezanjem na RARα potiče transkripciju ciljnih gena. Fuzijski protein PML-RARα veže na sebe nuklearni korepresor te onemogućuje transkripciju gena. Primjenom transretinoične kiseline (ATRA) onemogućeno je vezanje nuklearnog korepresora čime je ponovno uspostavljena transkripcija gena i sazrijevanje stanica.

4. MLL (11q23) često biva translociran te ima više od 80 partnerskih gena za translokacije, a rezultati takvih prijepisa nemaju jednake karakteristike (zahvaća monocite i promonocite). MLL je DNA-vezujući protein koji se veže za nuklearne proteine i olakšava vezanje transkripcijskih faktora. Važno je definirati varijantu MLL translokacije kada t(9;11); MLLT3-MLL nije potvrđena kao što je npr. AML s t(11;19); prijepis MLL-ENL

5. Iako postoji dokaz za postojanje AML s t(9;22); prijepis BCR-ABL1, kriteriji za jasno razlikovanje ovog entiteta od blastične faze KML ne postoje. Zato ovaj entitet nije uključen u osnovnu podjelu. Za potvrdu AML pozitivnim BCR-ABL1 prijepisom te također potvrdu ALL ili akutne bifenotipske leukemije s istim prijepisom, treba isključiti blastičnu fazu KML.

AKUTNE LIMFATIČNE LEUKEMIJE

Vidi klasifikaciju.

LIMFOIDNE NEOPLAZME

Podjela se temelji na histološkim obilježjima u kombinaciji s imunološkim, kliničkim i genetskim obilježjima. Prevladana je klasifikacija na limfome i leukemije, jer oni prelaze jedni u druge ili se prezentiraju zajedno. Klasifikacija prema WHO

1. neoplazme zrelih B stanica 2. neoplazme zrelih T/NK stanica 3. Hodgkin-ove bolesti.

Prema tijeku bolesti se dijele na indolentne (sporo napreduju), agresivne (brži porast tumorske mase) i vrlo agresivne. Kronična limfocitna leukemija/limfom malih limfocita, KLL/SLL � Infiltracija organa malim, naizgled zrelim limfocitima, koji izražavaju biljege B

stanica (CD19, CD20, CD79a), CD5 i CD23. obično se prezentita kao KLL i najčešća je leukemija u bijele rase. U koštanoj srži i razmazu periferne krvi prevladavaju mali limfociti. Moguć nalaz prolimfocita i atipičnih limfocita (razlikovati od prolimfocitne leukemije), delecija 13q, 11q i trisomija 12.

� Limfom ne tako dobre prognoze � Molekularna dijagnostika – mutirani varijabilni dijelovi gena za teški lanac

imunogobulina u oko 50 % pacijenata, t(14;19)

S t r a n i c a 104 |

� Leukemija se prezentira kao asimptomatska limfocitoza. Kasnije ono što bolesnike dovodi liječniku je supresija imunopoeze – autoimuna hemolitička anemija, infekcije, autoimune bolesti, imunotrombocitopenija.

� Dijagnoza KLL se postavlja kada je apsolutni broj monoklonalnih B stanica tipičnog imunofenotipa >5,0 x109/L u perifernoj krvi, a nema prisutnih simptoma, citopenije ili infiltracije tkiva (osim koštane srži). Kada je prisutna apsolutna limfocitoza (>5,0 x109/L), a u koštanoj srži je >30% limfocita tada se postavlja sumnja na KLL.

� Dijagnoza SLL se postavlja kada je prisutna limfadenopatija ili splenomegalija zbog infiltracije malim B limfocitima (CLL limfocitima), a njihov broj u perifernoj krvi je <5,0 × 109/L.

Limfoplazmocitni limfom, LPL – Waldenströmova makroglobulinemija � Tumor građen od različitih tipova stanica; mali B limfociti, limfoplazmocitoidni

limfociti, plazma stanice koje izražavaju površinski IgM antigen i B stanične antigene.

� Stanice infiltriraju koštanu srž i ponekad limfne čvorove i slezenu, a ovaj se tip tumora ne može svrstati u niti jednu dugu B staničnu neoplazmu koja zahvaća plazmoidne stanice.

� Neki bolesnici imaju t(9;14) tj. mutacije PAX5 gena iako novija istraživanja pokazuju da se ova mutacija rijetko nalazi kod LPL

� Limfom ne tako dobre prognoze � Tumorske stanice mogu izlučivati monoklonski IgM pa tada bolest predstavlja

Waldenströmovu makroglobulinemiju (LPL (tj. infiltracija koštane srži) + monoklonski IgM)

� Prisutnost monoklonskog IgM bez znakova LPL ne predstavlja Waldenströmovu makroglobulinemiju, kao niti LPL bez monoklonskog IgM.

Limfom plaštenih stanica (Mantle cell limfom) � Tumor malih i srednje velikih stanica B loze (plazma stanice i blasti) koje su vrlo

pozitivne na IgM stanični antigen. U većini slučajeva nalazi se t(11;14) koja dovodi do povećane ekspresije ciklina D1, a nerijetko dolazi do dodatnih mutacija poput p53. Mantle cell limfom je limfom loše prognoze.

Leukemija vlasastih stanica � Tumor malih B limfocita s obilnom citoplazmom i produljcima, izražavaju B biljege

i CD25, CD103 i FMC7, citokemijski se dokazuje tartarat rezistentna kisela fosfataza

Difuzni B velikostanični limfom, DLBCL � Tumor velikih stanica B loze s velikim jezgrama. Limfoidna neoplazma s vrlo

heterogenim kliničkim, histološkim, imunofenotipskim, citogenetskim i molekularnim obilježjima. Skupina tumora s različitim tipovima stanica (centroblasti, imunoblasti). Postoji čak i tip bogat stanicama T loze. Najčešći

S t r a n i c a 105 |

limfom (40% NHL u odraslih), ne tako dobre prognoze. Najčešći kromosomski poremećaj t(3;14)

Burkittov limfom � Tumor srednje velikih jednoličnih zrelih B limfocita s bazofilnom citoplazmom i

brojnim mitozama koji izražavaju membranski IgM, laki Ig lanac, B stanične antigene.

� Najčešća citogenetska promjena je t(8;14) kojom se myc gen dovodi u područje djelovanja promotora za teški ili laki lanac imunoglobulina čime se povećava ekspresija MYC proteina koji sprječava zaustavljanje stanice u G0 fazi ciklusa.

� Treba ga razlikovati od difuznog B velikostaničnog limfoma (DLBCL) � Burkittova leukemija odgovara L3 tipu ALL po FAB klasifikaciji � Najbrže rastući ljudski tumor koji najčešće zahvaća moždane ovojnice, a spada u

skupinu limfoma ne tako loše prognoze. Bolesti plazma stanica (nije primarno u WHO podjeli (entiteti označeni s *), ali ova podjela jest prema WHO) 1. Monoklonska gamapatija neutvrđenog značenja (MGUS) – 1-3% prelazi u MM 2. Multipli mijelom a. Indolentni ili šuljajući mijelom b. Plazma stanična leukemija c. Nesekretorni mijelom 3. Plazmocitom a. Solitarni plazmocitom kostiju b. Ekstramedularni plazmocitom 4. Bolest odlaganja imunoglobulina c. Primarna amiloidoza d. Sistemska bolest odlaganja lakih i teških lanaca imunoglobulina 5. Osteosklerotski mijelom (POEMS) - polineuropatija, organomegalija, endokrinopatija, M-protein, kožne promjene Definicija bolesti plazma stanica temelji se na identifikaciji kliničkih i laboratorijskih pokazatelja koji ukazuju na potrebu za terapijom. U izdvojenu skupinu ulaze MGUS, indolentni i šuljajući mijelom kao entiteti koji ne zahtijevaju terapiju već praćenje. Nova WHO preporuka je koristiti termin asimptomatski mijelom koji obuhvaća indolentni i šuljajući mijelom, ali ne i MGUS. Kriteriji za postavljanje dijagnoze asimptomatskog mijeloma: 1. M-protein u serumu >30 g/L i/ili ≥10 % klonalnih plazma stanica u koštanoj srži.

Kada ovi kriteriji nisu ispunjeni postavlja se dijagnoza MGUS. 2. Bez oštećenja organa ili tkiva te koštanih lezija karakterističnih za mijelom –

CRAB � hiperkalcemija (>2,75 mmol/L) � bubrežna insuficijencija (kreatinin >173 mol/L)

S t r a n i c a 106 |

� anemija (<100 g/L) � ozljede kostiju (nastaju zbog djelovanja citokina na osteoklaste, a ne samo zbog

infiltracije stanica) � uz hiperviskoznost, amiloidozu i ponavljajuće bakterijske infekcije Kriteriji za postavljanje dijagnoze simptomatskog mijeloma:

1. M-protein u serumu ili urinu (bez obzira na koncentraciju iako se najčešće nađe >30 g/L IgG ili >25 g/L IgA ili >1g/24h slobodnih lakih lanaca u urinu)

2. Prisutnost klonalnih plazma stanica u koštanoj srži ili plazmocitom (monoklonalne plazma stanice obično čine >10% ukupnih stanica s jezgrom, ali minimalni kriterij nije postavljen)

3. Oštećenja organa i tkiva karakteristična za mijelom (CRAB) – najvažniji kriterij za postavljanje dijagnoze simptomatskog mijeloma

Prognostički kriteriji: α-2-mikroglobulin, delecija 13, CRP, albumin, LDH, imunološki podtip Stadij I β-2-mikroglobulin <3,5 mg/L Albumin >35 g/L Stadij II - između stadija I i stadija III β-2-mikroglobulin <3,5 mg/L, ali albumin <35 g/L ili β-2-mikroglobulin 3,5 – 5,5 mg/L bez obzira na albumin Stadij III β-2-mikroglobulin >5,5 mg/L Najčešće kromosomske promjene su aneuploidija, monosomija 13 (del13) i translokacije u genu za teški lanac imunoglobulina na kromosomu 14, ali nisu nužne za postavljanje dijagnoze i terapiju. Bolest odlaganja imunoglobulina tj. primarna amiloidoza je rezultat klonalne proliferacije plazma stanica, ali zbog odlaganja amiloida bolest postaje klinički uočljiva prije znatnog opterećenja plazma stanicama (<10% u koštanoj srži i M-protein <30 g/L) što je kriterij za MGUS. Kako pacijenti imaju značajne simptome zbog odlaganja amiloida treba bolest razlučiti od simptomatskog mijeloma jer amiloidoza ipak ima karakteristične simptome. Postoje i slučajevi kombinacije mijeloma i amiloidoze, ali je preporuka kod pacijenata s dokazanom amiloidozom dijagnozu simptomatskog mijeloma postaviti kada je >30 % plazma stanica u koštanoj srži. Hodgkinov limfom

1. Nodularna limfocitna predominacija HL – mješavina B i T limfocita i dendritičkih stanica u limfnom čvoru

2. Klasični Hodgkinov limfom a. Nodularna skleroza HL b. Miješana staničnost HL (nema skleroze)

S t r a n i c a 107 |

c. Limfocitima bogati HL – slično nodularnoj limfocitnoj predominaciji, ali ovdje se nalaze Reed-Sternbergove stanice

d. Limfocitna deplecija HL HL je zloćudni tumor limfocitnog tkiva koji primarno zahvaća limfne čvorove i slezenu, a dijagnoza se postavlja na temelju karakteristične histološke slike uz obavezan nalaz polinuklearnih Reed-Sternbergovih stanica ili njihovih mononuklearnih oblika, Hodgkinovih stanica. Razlikuju se dva patohistološka tipa (nodularna limfocitna predominacija i klasični HL). Zloćudne stanice čine <1% svih stanica jer se uz njih nalazi mnogo reaktivnih limfocita, granulocita, histiocita i plazma stanica. Klonalni zreli limfociti B izlučuju obilje citokina i tako uzrokuju ne samo opće simptome već i vlastiti rast i preživljenje. Za vrijeme selekcijskog procesa u preustroju gena za imunoglobuline pojavlju se somatske mutacije. Limfociti koji sadrže povoljne mutacije izražavaju bcl-2 gen koji inhibira apoptozu. Upravo ovi B limfociti pokazuju klonalnu ekspanziju nakupljanjem dodatnih mutacija. Reed-Sternbergove i Hodgkinove stanice izražavaju antigene MHC II, IgG Fc receptor, CD15 (granulocitni antigen), CD71 (transferinski receptor), CD25 (receptor IL2), a u 40-60% stanica pronađen je EBV čime se HL dovodi u vezu s infektivnom mononukleozom. Dijagnoza: histološki pregled limfnog čvora (biopsija) Laboratorijska dijagnostika:

- povišena SE, LDH, bakar, haptoglobin, ALP, feritin - leukocitoza, eozinofilija, limfopenija, trombocitoza ili trombocitopenija - poremećaj stanične imunosti – rizik oportunističkih infekcija.

S t r a n i c a 108 |

WHO klasifikacija mijeloidnih neoplazmi i akutnih leukemija Mijeloproliferativne neoplazme (MPN)

1. Kronična mijeloična leukemija, BCR-ABL1 pozitivna 2. Kronična neutrofilna leukemija 3. Policitemija vera 4. Primarna mijelofibroza 5. Esencijalna trombocitemija 6. Kronična eozinofilna leukemija, nije specificirana na drugi način 7. Mastocitoza – gotovo uvijek udružena s mutacijom KIT D816V

(tirozin kinaza) 8. Mijeloproliferativna neoplazma, neklasificirana

Mijelodisplastične/Mijeloproliferativne neoplazme (MDS/MPN)

1. Kronična mijelomonocitna leukemija, KMML a. KMML1 <5% blasta i promonocita u perifernoj krvi i <10% u koštanoj

srži b. KMML2 ≥5% blasta i promonocita u perifernoj krvi ili ≥10% u koštanoj

srži 2. Atipična kronična mijeloična leukemija, aKML, BCR-ABL1 negativna – 30 –

40% slučajeva KMML i aKML ima mutacije NRAS ili KRAS signalnih proteina 3. Mladenačka (juvenilna) mijelomonocitna leukemija, JMML – poremećaj RAS

signalnog puta 4. Mijelodisplastična/mijeloproliferativna neoplazma, neklasificirana

Privremeni entitet: Refraktorna anemija s prstenastim sideroblastima i trombocitozom

Sindrom mijelodisplazije (MDS) 1. Refraktorna citopenija s displazijom jedne loze

a. Refraktorna anemija b. Refraktorna neutropenija c. Refraktorna trombocitopenija

2. Refraktorna anemija s prstenastim sideroblastima, RARS 3. Refraktorna citopenija s displazijom više loza 4. Refraktorna anemija s viškom blasta, RAEB 5. Sindrom mijelodisplazije s izoliranom delecijom del(5q) 6. Sindrom mijelodisplazije, neklasificiran 7. Dječji sindrom mijelodisplazije

Privremeni entitet: Dječja refraktorna citopenija

S t r a n i c a 109 |

Akutne mijeloične leukemije i srodne neoplazme 1. Akutna mijeloična leukemija s povratnim genetskim preuredbama (s

citogenetskim promjenama)

1.1. AML s t(8;21); prijepis RUNX1-RUNX1T1 (M2) 1.2. AML s inv(16) ili t(16;16); prijepis CBFβ-MYH11 (M4eo) 1.3. APL (promijelocitna) s t(15;17); prijepis PML-RARα (M3) 1.4. AML s t(9;11); prijepis MLLT3-MLL (M4, M5) (ili s t(11;19); prijepis MLL-

ENL) 1.5. AML s t(6;9); prijepis DEK-NUP214 1.6. AML s inv(3) ili t(3;3); prijepis RPN1-EVI1 1.7. AML (megakarioblastična) s t(1;22); prijepis RBM15-MKL1

Privremeni entiteti: AML s mutiranim NPM1 (nukleofozmin) AML s mutiranim CEBPA

2. Akutna mijeloična leukemija s mijelodisplastičnim promjenama

3. Mijeloidna neoplazma udružena s terapijom (nakon terapije)

4. Akutna mijeloična leukemija, nije specificirana na drugi način (FAB)

4.1. AML s minimalnom diferencijacijom, M0 4.2. AML bez sazrijevanja, M1 4.3. AML sa sazrijevanjem, M2 4.4. Akutna mijelomonocitna leukemija, AMMo, M4 4.5. Akutna monoblastična/monocitna leukemija, M5 4.6. Akutna eritroidna leukemija, M6

a. Čista eritroidna leukemija b. Eritroleukemija, eritroidna/mijeloidna

4.7. Akutna megakarioblastična leukemija, M7 4.8. Akutna bazofilna leukemija, M8 4.9. Akutna panmijeloza s mijelofibrozom

5. Mijeloidni sarkom

6. Mijeloidna proliferacija udružena s Down sindromom

6.1. Prolazna abnormalna mijelopoeza 6.2. Mijeloidna leukemija udružena s Down sindromom

7. Neoplazma blastične plazmacitoidne dendritičke stanice

B limfoblastične leukemije/limfomi

1. B limfoblastična leukemija/limfom, nije specificirana na drugi način 2. B limfoblastična leukemija/limfom s povratnim genetskim preuredbama (s

citogenetskim promjenama) 2.1. B limfoblastična leukemija/limfom s t(9;22); prijepis BCR-ABL1 2.2. B limfoblastična leukemija/limfom s t(var;11); preuredbe MLL

S t r a n i c a 110 |

2.3. B limfoblastična leukemija/limfom s t(12;21); prijepis TEL-AML1 (ETV6-RUNX1)

2.4. B limfoblastična leukemija/limfom s hiperploidijom 2.5. B limfoblastična leukemija/limfom s hipoploidijom 2.6. B limfoblastična leukemija/limfom s t(5;14); prijepis IL3-IGH 2.7. B limfoblastična leukemija/limfom s t(1;19); prijepis TCF3-PBX1

T limfoblastične leukemije/limfomi - Većina T-ALL je udružena s abnormalnim kariotipom (npr. T stanični receptor)

međutim neoplazme T stanica nisu podijeljene u posebne kategorije prema njihovoj genetičkoj abnormalnosti.

- Kada je prisutna masa sastavljena od B ili T limfoblasta i ≥25% stanica s jezgrom u koštanoj srži čine limfoblasti tada se postavlja dijagnoza limfoblastične leukemije umjesto limfoblastičnog limfoma. Kako se ALL rijetko javlja sa niskim brojem blasta u koštanoj srži, dijagnozu ALL treba odgoditi ukoliko je u koštanoj srži <20% blasta sve dok se ALL definitivno ne dokaže osim ako nije dokazana specifična citogenetska abnormalnost koja nedvojbeno dokazuje ALL.

- B-ALL ne treba koristiti za Burkittov limfom/leukemiju koji je zloćudna bolest zrelih B stanica.

- B limfoblastična leukemija/limfom s t(5;14); prijepis IL3-IGH često je udružena s eozinofilijom na što treba paziti prilikom diferencijalne dijagnoze (testirati FGFR1). Kada je broj blasta u koštanoj srži nizak ova citogenetska abnormalnost dovoljna je za postavljanje dijagnoze

- t(9;22); BCR-ABL1 i t(12;21); TEL-AML1 (ETV6-RUNX1) – jako prognostički važno, t(12;21) pogotovo za dječje leukemije te ih stoga uvijek treba testirati

WHO klasifikacija limfoidnih neoplazmi Non-Hodgkin limfomi – nodalni i ekstranodalni tumori NK/T i B loze, katkad uključuju i leukemije T i B loze. Prema mjestu nastanka i raspodjeli tumorske mase limfoidne neoplazme mogu se podijeliti na:

1. Nodalne limfome – u limfnim čvorovima

2. Ekstranodalne limfome – u ekstralimfatičnim i ekstramedularnim organima (probavni sustav, CNS, pluća, koža). Najmanje četvrtina non-Hodgkinovih limfoma nastaje izvan limfnih čvorova pa čak i na mjestima koja ne sadrže limfno tkivo. a. Primarni limfomi probavnog sustava – MALT limfomi želuca kod infekcije

Helicobacter pylori (pretežno B limfociti), Imunoproliferativna bolest tankog crijeva- IPSID (histološka slika bolesti alfa-teških lanaca), Intestinalni T stanični limfom tipa enteropatije

b. Primarni limfomi kože – najčešće T stanične loze, razlikuju se od nodalnih limfoma koji infiltriraju kožu (Mycosis fungoides, Sézaryjev sindrom)

c. Primarni limfomi CNS-a

S t r a n i c a 111 |

3. Leukemije – u koštanoj srži Prema tijeku bolesti limfoidne neoplazme mogu se podijeliti na:

1. Indolentne - Limfom malih limfocita/kronična limfocitna leukemija, limfoplazmocitni limfom, folikularni limfom (1 i 2), limfom marginalne zone, leukemija vlasastih stanica, limfocitna leukemija velikih granuliranih T limfocita, Mycosis fungoides, T stanična prolimfocitna leukemija

2. Agresivne – Hodgkinov limfom, folikularni limfom (3), difuzni B velikostanični limfom, limfom plaštenih stanica (Mantle cell), B prolimfocitna leukemija, anaplastični T velikostanični limfom, periferni T stanični limfomi

3. Vrlo agresivne – limfoblastični limfom (B i T), Burkittov limfom/leukemija, T stanični limfom/leukemija odraslih

Prognostička podjela Non-Hodgkin limfoma:

1. Dobra prognoza – Folikularni limfom, Ekstranodalni limfom marginalne zone, Anaplastični velikostanični limfom T

2. Ne tako dobra prognoza – Limfom malih limfocita, Nodalni limfom marginalne zone, Limfoplazmocitni limfom

3. Ne tako loša prognoza – Difuzni B velikostanični limfom, Burkittov limfom/leukemija

4. Loša prognoza – Limfoblastični limfom, Periferni T stanični limfom, Limfom plaštenih stanica (Mantle cell)

Neoplazme zrelih B limfocita

1. Kronična limfocitna leukemija/limfom malih limfocita, KLL/SLL – u 50% slučajeva t(14;19)

2. B stanična prolimfocitna leukemija – atipični B limfociti, agresivan tijek i loša prognoza

3. Limfoplazmocitni limfom, LPL – neki bolesnici imaju t(9;14) mutacije PAX5 gena

a. Waldenströmova makroglobulinemija 4. Bolest teških lanaca

a. Bolest α teških lanaca b. Bolest γ teških lanaca c. Bolest µ teških lanaca

5. Multipli mijelom* (vidi kasnije)

6. Solitarni plazmocitom kosti* (vidi kasnije)

7. Ekstramedularni plazmocitom* (vidi kasnije)

8. Limfom plaštenih stanica (Mantle cell limfom) - U većini slučajeva t(11;14) ciklin D1

S t r a n i c a 112 |

9. Folikularni limfom – najčešći kromosomski poremećaj t(14;18) Privremeni entitet: Pedijatrijski folikularni limfom bez t(14;15)

10. Primarni kožni limfom folikularnog centra

11. Ekstranodalni limfom marginalne zone B stanica, MALT tipa (mucosa-associated lymphoid tissue) – najčešći kromosomski poremećaj t(11;18)

12. Nodalni limfom marginalne zone B stanica – ne tako dobra prognoza Privremeni entitet: Pedijatrijski nodalni limfom marginalne zone B

stanica

13. Splenični limfom marginalne zone B stanica – najčešće delecija del(7q)

14. Leukemija vlasastih stanica Privremeni entitet: Splenični limfom/leukemija, neklasificirana

15. Difuzni B velikostanični limfom, DLBCL – najčešći kromosomski poremećaj t(3;14)

a. DLBCL, nije specificiran na drugi način b. DLBCL – T-stanični/histiocitni c. Primarni DLBCL CNS-a d. Primarni kožni DLBCL, tip nogu

Privremeni entitet: EBV pozitivan DLBCL starije populacije

16. Limfomi velikih B stanica a. Primarni medijastinalni (timusni) DLBCL b. Intravaskularni DLBCL c. DLBCL – ALK pozitivni d. Primarni efuzijski DLBCL e. Plazmablastični limfom f. DLBCL udružen s kroničnom upalom g. Limfomatoidna granulomatoza

17. Burkittov limfom – najčešća citogenetska promjena je t(8;14)

18. B stanični limfom, neklasificiran, sa značajkama između DLBCL i Burkittovog limfoma

19. B stanični limfom, neklasificiran, sa značajkama između DLBCL i klasičnog Hodgkinovog limfoma

Neoplazme zrelih T limfocita i NK stanica

1. T stanična prolimfocitna leukemija

- nakupljanje malih do srednje velikih T limfocita (CD2, CD3 i CD7 pozitivni) u jetru, slezenu, kožu i druge ekstralimfatične organe. Tijek bolesti je progresivan.

2. Limfocitna leukemija velikih granuliranih T limfocita

Privremeni entitet: Kronični limfoproliferativni poremećaj NK stanica

- U krvi se nalazi >2×109/L velikih granuliranih stanica T imunofenotipa. Tijek je kroničan.

S t r a n i c a 113 |

3. Agresivna leukemija NK stanica

4. T stanična leukemija/limfom odraslih (kožna)

5. Periferni T stanični limfomi – nije jedinstveni entitet, agresivan tijek i vrlo loša prognoza. d. Intestinalni T stanični limfom tipa enteropatije e. Supkutani T stanični limfom poput panikulitisa f. Ekstranodalni NK/T stanični limfom, nazalni tip g. Periferni T stanični limfom, nije specificiran na drugi način h. Hepatosplenični T stanični limfom i. Angioimunoblastični T stanični limfom j. Primarno kožni limfomi T stanica (vidi dalje) – jedini indolentni T stanični

limfomi

6. Anaplastični T velikostanični limfom

- Tumor velikih CD30 pozitivnih stanica obilne citoplazme i pleomorfnih (potkovastih) jezgri. U više od polovice slučajeva nalazi se t(2;5) koja dovodi do aberantne ekspresije ALK proteina. Nerijetko su stanice slične Hodgkinovim ili Reed-Sternbergovim stanicama.

a. ALK pozitivan – 60-85% slučajeva, dobra prognoza b. ALK negativan – lošija prognoza

S t r a n i c a 114 |

KOAGULACIJA Hemostaza se događa u tri faze: primarna, sekundarna hemostaza i fibrinoliza. U primarnoj hemostazi, trombociti reagiraju sa ozljedom na krvnoj žili ali i međusobno, što rezultira stvaranjem primarnog hemostatskog ugruška koji može privremeno zaustaviti krvarenje, ali je vrlo krhak i lako se uklanja. Nakon toga, u reakcijama sekundarne hemostaze netopljivi se fibrin taloži u primarni trombocitni ugrušak. Na taj se način ugrušak stabilizira i omogućava se cijeljenje rane. Ukratko, sekundarna hemostaza obuhvaća reakcije stvaranja netopljivog fibrina iz fribrinogena u seriji kompleksnih reakcija u kojima čimbenici koagulacije reagiraju sa endotelnim stanicama krvne žile i trombocitima. Krajnji je učinak stvaranje sekundarnog hemostatskog ugruška. Tijekom fibrinolize se stvoreni ugrušak uklanja nakon što je rana zacijelila. Hemostaza regulira dva osnovna procesa ljudskog života: održava fluidnost krvi i spriječava prekomjerni gubitak krvi nakon ozljede krvne žile. Zgrušavanje krvi je ključan proces za postizanje hemostaze jer dovodi do nastajanja fibrina (iz topljivog fibrinogena). Čimbenici koji su uključeni u normalnu hemostazu su

� Trombociti � Čimbenici zgrušavanja i inhibitori (proteini plazme) � Endotel krvne žile.

Njihovim međudjelovanjem dolazi do hemostatskog odgovora na krvarenje u okviru fizioloških potreba (stvaranje ugruška ograničeno je na područje ozljede, tako da je cirkulacija održana u ostalim krvnim žilama). Poremećaj bilo kojeg od čimbenika u ovom sustavu dovodi do narušavanja ravnoteže, pomak u smjeru krvarenja ili tromboze.

Modeli zgrušavanja:

1. Klasični model iz 1905. godine – objašnjavao je samo krajnje reakcije koagulacije, odnosno pretvorbu fibrinogena u fibrin

2. Kaskadni model (1950.) 3. Stanični model.

KASKADNI MODEL – predlaže da proteini koagulacije kontroliraju koagulacijski proces; temelji se na konceptu serijskih proteolitičkih reakcija koje služe kao biološki amplifikator; faktori zgrušavanja cirkuliraju u obliku proenzima (zimogena), aktivacijom jednog dolazi do cijepanja/aktivacije drugog u nizu faktora koagulacije, ovaj pak aktivira slijedeći itd. ; konačna reakcija je djelovanje trombina na fibrinogen i stvaranje velikih količina fibrina. Kaskada u obliku slova Y, dijeli se na vanjski i unutrašnji put zgrušavanja, sastaju se na zajedničkom putu zgrušavanja kod stvaranja protrombinaznog kompleksa (FXa/FVa). Predlaže da unutrašnji i vanjski put djeluju neovisno jedan o drugome, neovisno jedan o drugome stvaraju FXa. Međutim, kliničke manifestacije nedostatka pojedinih faktora koagulacije upućuju na suprotan zaključak.

S t r a n i c a 115 |

Za aktivaciju faktora zgrušavanja potrebni su fosfolipidi i kalcij. Početna reakcija u vanjskom putu je vezanje FVIIa/TF, početna reakcija u unutrašnjem putu zgrušavanja je aktivacija FXII uz kalikrein i HMWK. Čimbenici zgrušavanja su u neaktivnom obliku jednolančani, faktori zgrušavanja ovisni o vitaminu K imaju GLA regiju na svojem N-kraju, aktivacijom dolazi do cijepanja jednolančanog u dvolančani oblik povezan disulfidnim mostom. GLA je gama-karboksiglutaminska regija – kalcij vezujuća regija, vezanjem kalcija mijenja se konformacija jednolančanog oblika pa je olakšano cijepanje i aktivacija. Samo FV i FVIII nisu enzimi, oni su kofaktori i aktiviraju se na drugi način, tako i HMWK i TF. Kaskadni je model sekvencijski u kojem enzim aktivira proenzim kako bi se stvorio slijedeći enzim u kaskadi. Kaskadni se model pokazao korisnim u razumijevanju kako se procesi koagulacije događaju u plazmi in vivo, omogućio je kliničarima razumijevanje i praćenje poremećaja koagulacije laboratorijskim testovima (poremećaji vanjskog i zajedničkog puta pratili su se PV-om, poremećaji unutrašnjeg puta APTV-om). Međutim, vanjski i unutrašnji put zgrušavanja ne djeluju odvojeno, već su faktori zgrušavanja u međusobnoj interakciji. NEDOSTACI KASKADNOG MODELA: ne može objasniti hemostatski proces in vivo!!!

1. nedostatak početnih komponenata unutrašnjeg puta zgrušavanja (FXII, HMWK, PK) uzrokuje izrazito produženje APTV-a, ali nije povezan sa pojavom krvarenja

2. nedostatak FXI (hemofilija C) povezan je sa varijabilnom kliničkom slikom, krvarenje se javlja samo kod pojedinaca

3. nedostatak FVIII i FIX uvijek je povezan sa izraženim krvarenjem (hemofilija A i B), iako je vanjski put očuvan!

4. nedostatak FVII (prvog enzima u vanjskom putu) je povezan sa krvarenjem unatoč tome što je unutrašnji put očuvan.

S t r a n i c a 116 |

STANIČNI MODEL HEMOSTAZE

Hemostaza se događa na specifičnim staničnim površinama, a ne na fosfolipidnim vezikulama kao u reakcijama za PV i APTV. Procesom hemostaze upravljaju i kontroliraju stanice, a ne proteini koagulacije. Stanice ključne za stanični model hemostaze su TF-stanice, trombociti i endotelne stanice. TF-stanice i trombociti podržavaju prokoagulacijske reakcije, dok endotelne stanice vaskulature podržavaju antikoagulacijske reakcije. Time se postiže i lokalizacija snažnih prokoagulantnih reakcija na mjestu ozljede, na specifičnim staničnim površinama --- regulacija hemostaze! Sve dok su stanice koje sudjeluju u hemostazi odvojene (što nije slučaj kod ozljede), nema aktivacije hemostaze, što je ključno u regulaciji samog procesa. Model se dijeli u tri faze koje se preklapaju:

� INICIJACIJA – početna faza � AMPLIFIKACIJA � PROPAGACIJSKA FAZA.

Proteini koagulacije FVII, FIX, FX, protrombin, PC, PS, PZ sadrže Gla (glutaminska kiselina) ostatke koji im omogućuju interakciju sa Ca i negativnim fosfolipidima na membrani, dolazi do njihovog vezanja na membranu. Vezanje kalcija za Gla regije ovisi o njihovoj karboksilaciji, karboksiliraju se u posttranslacijskoj reakciji modifikacije u ciklusu vitamina K u jetri. INICIJACIJSKA FAZA Inicijacijska je faza lokalizirana na stanicama koje ispoljavaju TF. Jedini relevantni inicijator hemostaze in vivo je tkivni faktor (TF). Normalno se stanice koje sadrže TF nalaze izvan vaskularnog prostora, pa nema inicijacije koagulacije. Nakon ozljede endotela, TF-stanice se izlažu struji krvi i to je početak koagulacije. TF je strukturno različit od ostalih proteina koagulacije, ostaje vezan kao transmembranski glikoprotein za stanice u kojima se sintetizirao (monociti, makrofagi, neutrofili, aktivirane endotelne stanice, stanice glatkog mišičja, cirkulirajuće vezikule). Eksprimira se na različitim ekstravaskularnim stanicama, mogu ga eksprimirati i monociti i endotelne stanice u upalnim procesima. Važno je da inicijacija i propagacija budu ograničene na različitim staničnim površinama, kako bi se ograničila neželjena aktivacija koagulacije. Ključan korak u efektivnoj inicijaciji koagulacije je približavanje kompleksa TF-FVIIa aktiviranim trombocitima. Prva reakcija je brzo vezanje TF i FVIIa u kompleks; FVIIa je jedini protein koagulacije koji cirkulira u aktivnom obliku u krvi (oko 1%), dok su svi ostali proteini koagulacije u obliku proenzima. Stvoreni kompleks TF/FVIIa dodatno aktivira još FVII u FVIIa što pojačava stvaranje kompleksa TF/FVIIa. Kompleks TF/FVIIa aktivira male količine FIX u FIXa i FX u FXa. Iako sporo, stvoreni FXa može aktivirati FV u FVa, njegov kofaktor; stvara se kompleks FXa/FVa koji se naziva PROTROMBINAZNI KOMPLEKS, i cijepa protrombin u trombin FIIa. Tako stvoreni trombin mjeri se u nmol, i predstavlja manje od 5% ukupnog trombina. FXa ostaje vezan za TF-stanicu te je tako zaštićen od djelovanja TFPI ili AT (inhibitori), ako disocira u otopinu biva brzo inaktiviran. Ove male količine stvorenog trombina nisu dovoljne da pretvore fibrinogen u fibrin i stvore hemostatski ugrušak, ali u početnoj fazi koagulacije imaju višestruku funkciju:

• Taj trombin djeluje na kompleks FVIII/vWF, odcjepljuje vWF iz kompleksa (on djeluje kao nosač nestabilnog FVIII) te se oslobođeni FVIII aktivira u FVIIIa djelovanjem trombina (vWF dalje posreduje u adheziji i agregaciji trombocita)

S t r a n i c a 117 |

• Taj trombin aktivira FV u FVa i to proteolitičkim cjepanjem sa izrezivanjem B domene, FVa se veže i za trombocite i za TF-stanicu

• Taj trombin aktivira FXI u FXIa na površini trombocita • Taj trombin difundira do Trc, veže se i uzrokuje njihovu aktivaciju (promjena

oblika, promjena površine u prokoagulantnu, oslobađanje sadržaja iz granula Trc); takav aktivirani Trc može vezati faktore koagulacije.

FIXa stvoren u početnoj fazi koagulacije može difundirati do Trc (slabije se inhibira djelovanjem TFPI i AT).

ULOGA TROMBOCITA U HEMOSTAZI

Uloga trombocita u hemostazi je višestruka. Trombociti nadziru endotelne stanice krvnih žila i traže moguće ozljede i pukotine, održavaju integritet i kontinuitet krvnih žila popunjavajući male pukotine. Ukoliko se dogodi prava ozljeda krvne žile, trombociti reagiraju prvo sa kolagenom iz subendotela, a nakon toga međusobno, stvarajući primarni hemostatski ugrušak. Nakon toga, osiguravaju fosfolipidnu površinu na kojoj se događaju reakcije sekundarne hemostaze (sekundarni hemostatski ugrušak). Naposljetku, izlučuju čimbenike rasta koji stimuliraju rast stanica glatkog mišičja i fibroblasta, i tako doprinose cijeljenju rane. Trombociti sudjeluju u održavanju hemostaze:

1. adhezija i agregacija na mjestu ozljede krvne žile 2. sekrecija granula nakon aktivacije 3. osiguravanje prokoagulantne površine za aktivirane proteinske komplekse.

Adhezija i agregacija trombocita na mjestu ozljede krvne žile spriječava sustavnu aktivaciju zgrušavanja jer ograničava prokoagulacijske događaje na mjestu ozljede. Aktivirani Trc reguliraju širenje koagulacijske reakcije izlučivanjem neaktivnih peptida i malih molekula iz α-granula i gustih granula, to privlači nove trombocite na mjesto ozljede. Nakon adhezije i agregacije, Trc sudjeluju u prokoagulantnim događajima tako da eksprimiraju membranske receptore za koagulacijske proteaze, zimogene i kofaktore. Na svojoj površini vežu faktore koagulacije te ih na taj način zaštićuju od inaktivacije, a ujedno i lokaliziraju prokoagulantni odgovor na mjestu ozljede.

S t r a n i c a 118 |

Primarna hemostaza – prvotna adhezija Trc na oštećeni endotel ovisna je o interakciji sa vWF. vWF je visokomolekularni protein iz plazme koji se proteolitički cijepa metaloproteinazom ADAMTS13 na multimere svih veličina, funkcionalno aktivne. TROMBOSPONDIN-1 (TSP-1) modulira djelovanje ADAMTS 13. vWF služi kao most između tkiva i Trc, može vezati i izloženi kolagen na mjestu ozljede i membranski protein GPIb-V-IX na Trc, što uvjetuje vezanje Trc na kolagen. Adhezija Trc popraćena je morfološkim promjenama Trc, stvaraju se pseudopodiji koji olakšavaju vezanje te se ispoljavaju negativno nabijeni fosfolipidi. Iz Trc se secerniraju tromboksan A2, te ADP, Ca i serotonin iz tamnih granula, što uzrokuje aktivaciju dodatnih Trc i kontrakciju glatke muskulature krvne žile (vazokonstrikcija). Sve te reakcije popraćene su konformacijskom promjenom integrina GPIIb/IIIa iz Trc te ispoljavanjem veznih mjesta za fibrinogen, vWF, fibronektin i trombospondin. Svi ti proteini stvaraju dodatne mostove između Trc što uzrokuje njihovu agregaciju. Za održavanje normalne hemostaze neophodna je interakcija između Trc i komponenti sustava zgrušavanja:

• Međudjelovanje trombina i Trc izravnom aktivacijom Trc od strane trombina • Izlučivanje faktora zgrušavanja iz Trc te pojačano izlaganje fosfatidilserina na

vanjskoj površini membrane Trc nakon aktivacije • Nastajanje hemostatske količine trombina na površini Trc neophodne za

stvaranje fibrinskog ugruška. Kombinacija vezanja kolagena i djelovanja trombina dovodi trombocit u jače prokoagulatno stanje. To znači da su «najprokoagulantniji» Trc oni koji prvi dođu na mjesto vaskularne ozljede i reagiraju sa kolagenom i stvorenim trombinom. Daljnjim gomilanjem Trc ne mjestu ozljede dolazi do blokiranja interakcije tih Trc sa kolagenim strukturama vaskulature, jer se oni vežu za prvi sloj Trc na ozljedi, pa im je stoga i prokoagulatna aktivnost površine manja – još jedan vid regulacije hemostaze, nema širenja reakcije u trombotičnom smjeru. AKTIVACIJA TRC TROMBINOM Nanomolarna (pmol?) količina trombina nastalog u početnoj fazi zgrušavanja veže se za Trc adherirane na mjestu ozljede krvne žile. Trombin se za površinu neaktiviranih trombocita veže posredstvom najmanje tri različita vezna proteina:

� Jedan je glikoprotein Ibα, koji je u sastavu kompleksa GPIb-IX-V � Veže se i na transmembranske proteine PAR1 i PAR4 (proteazom aktivirani

receptori, vezani za G protein); trombin ih hidrolitički cijepa i tako aktivira te oni prenose signale u stanicu: PAR1 potiče aktivaciju Trc kod niskih koncentracija trombina, dok PAR4 doprinosi aktivaciji Trc samo kod visokih koncentracija trombina.

Trombociti sadrže α-granule (fibrinogen FI, PFV u kompleksu sa multimerinom, FXI, vWF, PAI-1, HMWK...), tamne granule (ADP, serotonin, Ca) te FXIII koji se nalazi u citosolu. Aktivacijom Trc dolazi do izlučivanja hemostatski aktivnih tvari iz Trc, među kojima su i 4 faktora zgrušavanja iz α-granula i citoplazme: fibrinogen, FV, FXI i FXIII. Fibrinogen se u trombocitima nalazi u α-granulama i citoplazmi, pohranjuje se u Trc endocitozom iz plazmatskog pool-a. Predstavlja 3-10% ukupne koncentracije trombocitnih proteina, izlučuje se kao odgovor na trombin, kolagen i ADP. Trombocitni faktor V (PFV) se nalazi u α-granulama, predstavlja 18-25% ukupnog FV koji se nalazi u krvi. Razlikuje se od plazmatskog jer nije jednolančani već smjesa polipeptida različite molekularne mase, djelomično je aktiviran i ima kofaktorsku aktivnost, dodatno se aktivira trombinom ili FXa.

S t r a n i c a 119 |

Trombocitni faktor XI predstavlja 0.5% ukupnog FXI i razlikuje se strukturno od plazmatskog FXI. Oko 50% trombocitnog FXI izraženo je konstitutivno na površini neaktiviranih Trc. Sintetizira se u stadiju megakariocita. Trombocitni faktor XIII se sintetizira u megakariocitima, nalazi se u citoplazmi Trc. Plazmatski je FXIII heterotetramer (2A+2B podjedinice), dok je trombocitni FXIII homodimer (2A). Može se aktivirati neproteolitičkim mehanizmom nakon porasta IC koncentracije Ca nakon aktivacije Trc, ali se FXIIIa ne izlučuje iz Trc nakon njihove aktivacije. Aktivirani Trc imaju ključnu ulogu u sekundarnoj hemostazi jer oni osiguravaju prokoagulacijsku površinu na kojoj nastaje >95% ukupnog trombina za vrijeme procesa koagulacije. Aktivacija Trc dovodi do njohove agregacije, promjene oblika i narušavanja fosfolipidne asimetrije. Fosfolipidna asimetrija Vanjska površina membrane neaktiviranih Trc sastoji se pretežno od neutralnih fosfolipida (fosfatidilkolina i sfingomijelina). Fosfolipidnu asimetriju održavaju različiti enzimi ovisni o ATP-u, središnju ulogu ima FLIPAZA, translokaza koja prenosi fosfatidilserin (PS) i fosfatidiletanolamin (PE) sa vanjske na unutrašnju stranu dvosloja; tu djeluje i FLOPAZA koja čini obratno, ali puno sporije. Aktivacijom Trc negativno nabijeni fosfolipidi PS i PE se premještaju u vanjski sloj membrane, a za taj je proces odgovoran enzim SKRAMBLAZA. Ključni regulator narušavanja fosfolipidne asimetrije je koncentracija Ca, povećana koncentracija kalcija aktivira skramblazu, a inhibira flipazu. Izlaganje PS na vanjskoj površini membrane Trc nužno je za stvaranje prokoagulacijske površine, njegova najvažnija uloga je vezanje GLA-domene faktora zgrušavanja u prisutnosti Ca. Prilikom narušavanja fosfolipidne asimetrije dolazi na membrani Trc do stvaranja ispupčenja, to su prokoagulantne mikrovezikule, čime se povećava površina za koagulacijske reakcije. Rijedak poremećaj je Scott-ov sindrom kada ne funkcionira prijenos PS na površinu membrane. Narušavanje fosfolipidne simetrije nakon aktivacije stanica jedan je od regulatornih mehanizama procesa hemostaze. Membrana u mirovanju endotelnih stanica ne podržava hemostatske reakcije. TROMBOCITNI RECEPTORI ZA FAKTORE KOAGULACIJE Ti su receptori odgovorni za sastavljanje pojedinačnih faktora u funkcionalne komplekse. GP Ib-IX GP IIb/IIIa EPR-1(effector protease receptor) – receptor za Xa na Trc. KOMPLEKS GPIb-IX-V Taj glikoproteinski kompleks ima dva različita vezna mjesta za faktore zgrušavanja: jedno vezno mjesto za vWF, a drugo za trombin. Tako se omogućava njihovo istodobno vezanje. Uloga je GPIb-IX-V lokalizacije trombina i FVIII na površini Trc. Receptor GPIb/IX dobro je u literaturi opisan kao receptor za vWF, međutim veže i trombin te naj taj način doprinosi aktivaciji Trc trombinom. Lokalizira trombin na površini Trc. Osim toga, kako vezuje vWF, promovira adheziju neaktiviranih Trc na mjesto ozljede, čime dolazi do njihove djelomične aktivacije.

S t r a n i c a 120 |

AMPLIFIKACIJA Događa se na različitoj staničnoj površini od inicijacijske faze, to je upravo zato kako bi se ograničila koagulacijska reakcija (regulacijski mehanizam). Trombociti adheriraju na komponente ekstracelularnog matriksa na mjestu ozljede krvne žile. Vezanjem komponenata matriksa Trc se djelomično aktiviraju i bivaju lokalizirani na mjestu izlaganja TF. Amplifikacijska se faza događa na trombocitima, koji bivaju do kraja aktivirani malom količinom trombina koji se stvara u početnoj fazi. Taj isti trombin aktivira i FV u FVa, FXI u FXIa, FVIII u FVIIIa te pojačava signal za adheziju Trc. Dolazi do amplifikacije koagulacijskog mehanizma, a ova faza završava vezanjem FVa i stvaranjem FVIIIa, oba su vezana za površinu Trc. Prokoagulacijska površina na Trc podrazumijeva vezane faktore na površini Trc: FVa, FVIIIa, FXIa i FIXa (aktiviran FXIa). Vidi sliku!

PROPAGACIJA Ostatak se reakcija zbiva na površini aktiviranih trombocita. U ovoj fazi nastaje >95% ukupnog trombina tijekom procesa zgrušavanja, što omogućava nastanak fibrina iz fibrinogena. Trombin je najvažniji fiziološki agonist Trc. Aktvirani kofaktori FVa i FVIIIa te faktor FXIa vezani su za površinu Trc prije ostalih faktora zgrušavanja i čine prokoagulacijske enzimske komplekse.

S t r a n i c a 121 |

Propagacijska faza započinje vezanjem FIXa (nastalog aktiviranjem FIX uz TF/FVIIa kompleks, dodatna količina nastaje djelovanjem FXIa iz amplifikacijske faze) na Trc. Vezani FIXa stvara kompleks sa vezanim FVIIIa, nastaje TENAZNI KOMPLEKS koji je osnova za nastajanje fiziološki značajne koncentracije FXa na aktiviranim Trc. Tenazni kompleks 105-106 puta brže aktivira FX od FIXa, te 50-100 puta brže aktivira FX od TF/FVIIa kompleksa. Djelovanjem tenaznog kompleksa nastaje više od 90% ukupno stvorenog FXa. FXa vezan za površinu Trc je zašzićen od djelovanja inhibitora (TFPI, AT, heparin), stoga samo takav FXa može stvarati protrombinazni kompleks. FXa veže FVa u enzimski kompleks PROTROMBINAZA koja cijepa protrombin u trombin. Djelovanjem protrombinaze nastaje dostatna količina trombina za cijepanje fibrinogena u fibrin i nastajanje stabilnog fibrinskog ugruška. Koncentracija faktora zgrušavanja u plazmi:

� Najviša je koncentracija fibrinogena � Onda ga slijedi protrombin (50000 puta veća koncentracija od FVII) � Zatim FX, FIX � FVIII ima 50x manju koncentraciju od fibrinogena.

Čini se da FXII, prekalikrein i HMWK nemaju ključnu ulogu u hemostazi, njihov doprinos procesu hemostaze treba još biti istražen. Regulacija trombina i nastanak fibrina stvaranje dovoljnih količina trombina koje rezultiraju stvaranjem ugruška nije kraj hemostatskog procesa. Velike količine trombina koje se stvaraju i nakon formiranja fibrinskog gela (polimerizacije fibrina) imaju višestruku ulogu:

� Trombin aktivira FXIII u FXIIIa koji sudjeluje u modifikaciji polimeriziranog fibrina stvarajući unakrsne veze između fibrinskoh niti – stabilizacija ugruška!

� Nešto će se trombina vezati za TM (trombomodulin) na površini endotelne stanice, ovako vezani trombin aktivira TAFI (trombinom aktivirani inhibitor fibrinolize) – čuva se stvoreni ugrušak od proteolize tako što TAFI odstranjuje terminalne lizinske ostatke sa molekula fibrina i na taj način uklanja vezno mjesto za fibrinolitičke proteine te povećava otpornost na fibrinolizu

� Trombin vezan za TM aktivira PC u aPC te ovaj stvara kompleks sa svojim kofaktorom PS; taj kompleks zatim cijepa FVa i FVIIIa što sprječava daljnje stvaranje trombina – završna faza koagulacije (TERMINACIJA)

� Trombin se ugrađuje i ostaje vezan za stvoreni ugrušak što ga opet dodatno stabilizira.

ULOGA ENDOTELNIH STANICA

Endotelne stanice reguliraju kontrolne mehanizme koji ograničavaju stvaranje trombina na mjestu ozljede krvne žile. Stanična površina endotelnih stanica je u stanju mirovanja stoga one ne podržavaju reakcije koagulacije, a osim toga na staničnoj površini ispoljavaju antikoagulantne proteine:

� Sintetiziraju i luče TFPI (inhibitor puta tkivnog faktora) čime se inhibira početna faza zgrušavanja (put TF); TFPI se ireverzibilno veže za FXa i stvara kvaternarni kompleks TFPI-FXa-TF-FVIIa što je temelj inhibicije početne faze (sprječava se daljnje stvaranje trombina)

� Endotelne stanice izlučuju preoteoglikan heparan sulfat (HSPG), on se veže za AT i ubrzava njegovo djelovanje (inaktivira trombin) slično heparinu

S t r a n i c a 122 |

� Endotelne stanice eksprimiraju komponente sustava PC (TM, EPCR – endotelni receptor za PC, PS); trombin se veže za TM i prelazi iz pro- u antikoagulantnu molekulu jer kompleks TM-IIa brzo aktivira PC; aPC u kompleksu sa PS ireverzibilno cijepa FVa i FVIIIa (koji su vezani za membranu), što onemogućava daljnje stvaranje trombina

� Kompleks aPC-PS inaktivira i PAI-1 (inhibitor aktivatora plazminogena), to je važan inhibitor fibrinolize čime se ona potiče.

Glavni učinak TFPI je blokiranje kompleksa FVIIa-TF-FXa (prvo se TFPI veže za Xa, i onda za kompleks TF- FVIIa) čime se suprimira početno stvaranje FXa i FIXa. Ima visoki afinitet za kompleks, ali se TFPI nalazi u niskim koncentracijama u plazmi te stoga samo odgađa hemostatski proces. Heparin utječe na oslobađanje TFPI vezanog za endotelne stanice što povećava njegovu koncentraciju u krvi. Nasuprot tome, AT ima niži afinitet, ali se nalazi u dva puta višim koncentracijama od TFPI. AT učinkovito neutralizira sve serinske proteaze, pogotovo ako su u slobodnom obliku (ne u kompleksu). I α2-makroglobulin isto može inhibirati trombin. Vezanjem trombina na TM koji se konstitutivno eksprimira na endotelnim stanicama, dolazi do aktivacije PC u aPC. EPCR pojačava prezentaciju PC trombomodulinu. Aktivirani PC veže kompetitivno i FVa i FVIIIa, inaktivira ih te onemogućava stvaranje protrombinaznog i tenaznog kompleksa. TM je receptor za trombin, eksprimira se u visokim koncentracijama na endotelnim stanicama, pogotovo u mikrovaskulaturi. Nakon vezanja za TM, trombin mijenja svoju specifičnost, od prokoagulantna postaje antitrombotik, postaje učinkovitiji u aktivaciji PC. Kompleks TM-trombin aktivira PC na površini endotelnih stanica. PC biva lokalizira na površini endotelnih stanica receptorom EPCR-1 (endothelial PC receptor), a uloga mu je olakšavanje aktivacije PC kompleksom TM-Iia. APC stvara kompleks sa PS te cijepa i inaktivira FVa i FVIIa koji su se aktivirali na endotelnoj površini. Time se sprječava aktivacija dodatna aktivacija faktora koagulacije na površini zdravog endotela. Endotelne stanice ispoljavaju i površinsku ADP-aznu aktivnost (CD39). Taj enzim metabolizira ADP oslobođen iz Trc i time blokira agregaciju Trc u blizini zdravog endotela. U slučaju ozljede ili upale, endotelne stanice postaju manje antitrombotske jer mijenjaju ekspresiju receptora. Upalni su citokini odgovorni za smanjenu ekspresiju TM i istodobnu pojačanu ekspresiju TF i ostali adhezijskih molekula. Upravo je taj mehanizam odgovoran za trombozu u poremećajima kao ateroskleroza, tromboflebitis i vaskulitis. TERMINACIJA HEMOSTAZE U ovu su fazu uključena najmanje 4 proteina plazme:

� TFPI koji se oslobađa iz endotelnih stanica i Trc, a inhibira TF, FVIIa i FXa � ATIII, inhibira trombin, FIXa, FXa i FXIa i kompleks TF-FVIIa � Protein C, o vitaminu K ovisan inhibitor FVa i FVIIIa, a aktiviran kompleksom

TM-trombin � Protein S, kofaktor proteina C.

Aktivirani trombociti izlučuju i neksin II, proteazu koja inhibira FXIa.

S t r a n i c a 123 |

FIBRINOLIZA (ELIMINACIJSKA FAZA)

Kako bi se održala hemostatska ravnoteža, fibrinski se ugrušak razara plazminom u procesu fibrinolize. Tkivni aktivator plazminogena (tPA) otpušta se iz endotelnih stanica pod utjecajem trombina, odmah se veže za fibrinska vlakna (ugrušak) i aktivira plazminogen u plazmin, najvažniji fibrinolitički enzim. Plazmin cijepa fibrin na kraboksi-terminalnim lizinskim ostacima, stvarajući topive fragmente, među kojima je i D-dimer. Sustav fibrinolize reguliran je PAI-1 (inhibitorom aktivacije plazminogena) i trombinom aktiviranim TAFI, oba štite ugrušak od fibrinolize (fiziološki inhibitor PAI-1je aPC). PAI-1 veže tPA koji je slobodan u otopini te ga odmah inhibira; dok TAFI cijepa karboksi-terminalne lizinske ostatke te čini fibrin otpornijim na fibrinolizu (tako strukturno promijenjeni fibrin ne veže plazmin). Tu je još jedan inhibitor, to je antiplazmin (AP) koji inhibira plazminogen. STABILIZACIJA KOAGULACIJE Oprečno djelovanje fibrinolizi posredovano FXIIIa koji se aktivirao trombinom. FXIIIa prevodi slabo unakrsno povezan fibrin u čvrsto povezanu fibrinsku mrežu. TM-trombin kompleks uzrokuje aktivaciju TAFI i uklanja lizinske ostatke sa fibrina, što ometa vezanje plazminogena i t-PA za fibrin. PAI-1 je brzi i ireverzibilni inhibitor t-PA i u-PA, oslobađaju ga endotelne stanice i trombociti. Tu je i α2-antiplazmin, inhibitor sa visokim afinitetom za plazmin. Zašto hemofiličari krvare? Kod hemofiličara trombociti normalno adheriraju na mjesto ozljede krvne žile, normalno se stvara početna količina Xa na TF-stanicama, ali izostaje aktivacija Xa na površini Trc. Dakle, Xa se stvara na pogrešnoj staničnoj površini, što znači da se hemofilija može promatrati kao poremećaj stvaranja Xa i generacije trombina na Trc. Pravi problem nije što se ne stvara dovoljno Xa, već što se on stvara na krivoj staničnoj površini (Na TF stanici, pa mu je vrlo teško probiti se do Trc kroz otopinu punu inhibitora – ATIII i TFPI). Rekombinantni rFVIIa aktivira Xa na površini aktiviranog Trc (ključna je ekspresija fosfatidilserina na površini, koji privlači rFVIIa) čime nastaje dovoljno Xa za aktivaciju trombina. Populacijske studije omogućile su identifikaciju čimbenika rizika za vensku trombozu, to su nedostatal proteina C, nedostatak proteina S i nedostatak AT, zatim FV Leiden, mutacija u genu za protrombin 20210, visoke koncentracije fibrinogena, povećane aktivnosti FVIII itd. McKenzie - Klinička hematologija Proteini koagulacije ovisni o vitaminu K Radi se o protrombinu i faktorima VII, IX i X te proteinima S, C i Z. Kako bi postali funkcionalni potreban im je vitamin K. Ovi proteini sadrže GLA domene, bogate gama-karboksiglutaminskom kiselinom i neophodne kod vezanja Ca. Za gama karboksilaciju glutaminskih ostataka u toj skupini proteina, neophodno je prisustvo vitamina K. Gama karboksilacija je posttranslacijska modifikacija koja se zbiva u ER stanice jetre. Neophodna je jer omogućava vezanje faktora koagulacije za negativno nabijenu fosfolipidnu površinu putem kalcija. Gama karboksilacija je katalizirana karboksilazom, koja za svoju aktivnost treba reducirani oblik vitamina K. Prilikom karboksilacije se vitamin K oksidira u epoksidni oblik, a ovaj se konvertira u

S t r a n i c a 124 |

reducirani vitamin K djelovanjem vitamin K epoksid reduktaze. Antagonisti vit K, kao warfarin i kumadin, inhibiraju djelovanje epoksid reduktaze te spriječavaju recikliranje vitamina K. Kod nedostatka vitamina K, jetra sintetizira nefunkcionalne proteine koagulacije jer im nedostaje gama karboksilna skupina neophodna za vezanje Ca/fosfolipida. Takvi se proteini nazivaju PIVKA (protein induced by vitamin K absence) ili akarboksi oblici.

Koagulacijska se kaskada zbiva na fosfolipidnoj površini (stanične membrane). Takvu površinu in vivo pružaju subendotel nakon ozljede krvne žile ili površina aktiviranih trombocita. Odigravanje rekacija na staničnim površinama snizuje Km reakcije i omogućava lokalizaciju reakcije na mjestu ozljede. Tri su prokoagulantna kompleksa koji se formiraju na fosfolipidnoj površini: - ekstrinzična tenaza - tijekom ozljede se struji krvi izlaže integralni membranski lipoprotein TF, on veže FVIIa u prisutnosti kalcija i nastaje kompleks TF-FVIIa koji aktivira dalje FX - intrinzična tenaza - nastaje na fosfolipidnoj površini vezanjem FIXa i FVIIIa u prisutnosti kalcija, aktivira FX - protrombinaza - vezanje FXa i FVa na fosfolipidnoj membrani uz kalcij omogućava aktivaciju FII u trombin.

UNUTRAŠNJI PUT KOAGULACIJE

Uključuje čimbenike FXII, FXI, PK i HMWK. Ovi kontaktni čimbenici se aktiviraju prilikom izlaganja negativno nabijenim površinama kao što su staklo ili kaolin. Za njihovu aktivaciju nije potreban kalcij, stoga u in vitro uvjetima može doći do pre-aktivacije unutrašnjeg puta prilikom stajanja uzorka u staklenim epruvetama. Pacijenti sa nedostatkom FXII, PK i HMWK (HK) nemaju kliničku sliku krvarenja, ali imaju značajno produžen APTV. Oko 50% pacijenata sa nedostatkom FXI ima klinički značajno krvarenje, stoga se smatra da je taj faktor važan učesnik u koagulaciji, ali nije neophodan. Faktor XII (Hagemanov) se sintetizira u jetri, aktivira se proteolitičkim cijepanjem i to djelovanjem kalikreina, plazmina ili najčešće autoaktivacijom. Autoaktivacija se događa kontaktom sa negativno nabijenim površinama (in vitro autoaktivacija!). FXIIa vezan za tu površinu cijepa zatim PK u kalikrein, koji uz HK kao kofaktorom, pozitivnom spregom aktivira još FXII u FXIIa - amplifikacija reakcije.

S t r a n i c a 125 |

FXIIa ima i dodatne funkcije: prvi je enzim u unutrašnjem putu, ali aktivira i FXI u FXIa, te aktivira sustav komplementa i fibrinolitički sustav (izravno, ali slabo, plazminogen). Faktor XI je serinska proteaza koja se aktivira djelovanjem FXIIa uz kofaktor HK. Može se aktivirati i djelovanjem trombina (koji je fiziološki relevantni aktivator) kao i FXIa mehanizmom pozitivne povratne sprege. FXI i trombin se vežu za aktivirane trombocite, gdje se in vivo događa aktivacija u FXIa i djelovanje na FIX → FIXa. Faktor IX je o vitaminu K ovisan zimogen. Akivira se djelovanjem FXIa u prisutnosti kalcija. Odmah po aktivaciji, FIXa stvara kompleks sa kofaktorom FVIIIa uz kalcij, i to na površini aktiviranih trombocita. Taj kompleks aktivira dalje FX u FXa. Ekstrinzična tenaza TF-FVIIa također aktivira FIX. FIXa se veže samo za površinu aktiviranih trombocita i to u prisutnosti kalcija. Gen koji kodira FIX kao i gen za FVIII nalazi se na 10. kromosomu. Nedostatak FIX (hemofilija B) obilježen je ozbiljnim krvarenjima, što ukazuje na njegovu kritičnu ulogu u koagulaciji. Faktor VIII se sintetizira u jetri, a u plazmi cirkulira u kompleksu sa vWF. Vezanjem za vWF FVIII se stabilizira i zaštićen je od inhibicije i degradacije. Aktivira se djelovanjem trombina ili FXa. FVIIIa djeluje kao kofaktor u kompleksu sa FIXa kod aktivacije FX. vWF ne samo da stabilizira FVIII, već mu produžuje poluživot (jer je FVIII izrazito labilan, aktivnost mu se gubi na sobnoj temperaturi izrazito brzo), te spriječava njegovo vezanje za aktivirane trombocite i fosfolipidne površine regulirajući njegovu aktivnost. Osim toga, u kompleksu sa vWF, FVIII je zaštićen od inaktivacije djelovanjem proteina C. Djelovanjem trombina, FVIII se aktivira u FVIIIa i oslobađa veze sa vWF, čime se može onda vezati za aktivirani trombocit. Gen za FVIII nalazi se na 10. kromosomu, nedostatak FVIII je hemofilija A. vWF (von Willebrandov faktor) je veliki multimerni glikoprotein koji se sintetizira u endotelnim stanicama i megakariocitima. Uskladišten je u α-granulama trombocita i Weibel-Paladeovim tjelešcima u endotelnim stanicama. Oslobađa se djelovanjem trombina. Sintetizira se kao monomer, ali u plazmi cirkulira kao multimer različitih veličina (molekularnih masa). Veći multimeri učinkovitiji su u poticanju adhezije trombocita. vWF doprinosi primarnoj i sekundarnoj hemostazi. Može vezati GPIb/IX na površini trombocita te istovremeno kolagen i elastin iz subendotela, i tako potiče adheziju trombocita na mjestu ozljede. Osim toga može vezati i GPIIb/IIIa na trombocitima i time potiče agregaciju trombocita. Upravo se zato vWF smatra međustaničnim mostom između dva trombocita, trombocita i subendotela te trombocita i endotela. Uloga u sekundarnoj hemostazi mu je zaštita i stabilizacija FVIII u kompleksu vWF/FVIII.

VANJSKI PUT KOAGULACIJE

Uključuje FVII i njegov kofaktor TF ili tkivni tromboplastin. Kod ozljede krvne žile, TF se izlaže struji krvi. Veže FVII i FVIIa u prisutnosti kalcija, i stvara se kompleks FVIIa/TF. Taj tenazni kompleks odgovoran je za aktivaciju FX u FXa Tkivni faktor je transmembranski lipoprotein (nazivao se i FIII). Konstitutivno se ispoljava na staničnim membranama nevaskularnih stanica. Obično ga nema na površini stanica koje su doticaju sa cirkulirajućom krvlju, ali stimulacijom monocita i endotelnih stanica djelovanjem endotoksina, C5a komplementa, imunih kompleksa, IL1 i TNF, ove mogu ispoljiti TF na svojoj površini. FVII je o vitaminu K ovisan protein koji se sintetizira u jetri. Jedini je protein koagulacije koji cirkulira u malim količinama (oko1%) u aktivnom obliku (kao FVIIa).

S t r a n i c a 126 |

Upravo je ta količina FVIIa dovoljna za početak koagulacije, i to kada ozljedom dolazi do ispoljavanja TF na endotelnim stanicama, pri čemu se stvara kompleks TF/FVIIa. Nadalje, FVIIa autokatalizira aktivaciju FVII u FVIIa. I FXa vezan za fosfolipidnu površinu, može katalizirati aktivaciju FVII.

ZAJEDNIČKI PUT KOAGULACIJE

Unutrašnji i vanjski put koagulacije se sastaju u zajednički put, tj. u koraku aktivacije FX. FX može biti aktiviran djelovanjem FVIIa/TF/Ca kompleksa ili kompleksa FIXa/FVIIIa/Ca/fosfolipidi. Aktivirani FX stvara kompleks sa kofaktorom FVa, fosfolipidima i Ca2+ - protrombinaza - koji optimalno aktivira protrombin u trombin. FX je o vitaminu K ovisan protein koagulacije koji se sintetizira u jetri. Faktor V je veliki glikoprotein koji se također sintetizira u jetri. Naziva se i labilnim faktorom jer mu aktivnost, slično FVIII, na sobnoj temperaturi brzo opada. Oko 25% FV u plazmi nalazi se u α-granulama trombocita, a oslobađa se prilikom njihove aktivacije. FV mogu aktivirati trombin (primarni aktivator in vivo) te FXa. FVa se nakon aktivacije veže za aktivirani trombocit i služi kao vezno mjesto za FXa. Protrombin (FII) je o vitaminu K ovisma protein koji se sintetizira u jetri. Cirkulira kao zimogen, cijepa se djelovanjem protrombinaze FXa/FVa. Oslobođeni trombin može disocirati sa fosfolipidne površine u otopinu. Trombin ima ključnu ulogu u hemostazi. Trombin kao prokoagulant:

- cijepa fibrinopeptide A i B iz fibrinogena i time se stvara fibrin monomer - aktivira FVa, VIIIa, XIIIa i tako amplificira svoju aktivaciju - stimulira endotelne stanice na oslobađanje vWF i inhibitora aktivatora

fibrinogena (PAI-1), stimulira ispoljavanje TF na endotelnim stanicama - aktivira trombocite i potiče njihovu agregaciju - suprimira fibrinolizu aktivirajući TAFI (thrombin activatable fibrinolysis

inhibitor). Trombin kao antitrombotik:

- veže trombomodulin i aktivira protein C - stimulira oslobađanje tkivnog aktivatora plazminogena i NO iz endotelnih

stanica. Trombin ima mitogene aktivnosti i svojstva slična citokinima - uloga u upali, cijeljenju rana, aterosklerozi. Stvaranje fibrina Netopivi se fibrin stvara iz topljivog fibrinogena u tri koraka: trombin proteolitički cijepa fibrinogen, pri čemu se oslobađaju fibrinopeptidi A i B i stvara se fibrin monomer; spontana polimerizacija monomera u polimere fibrina; stabilizacija polimera fibrina unakrsnim povezivanjem uz djelovanjem FXIIIa. Fibrinogen je veliki glikoprotein koji se nalazi u plazmi i trombocitnim α-granulama (apsorbiran iz plazme). Najzastupljeniji je koagulacijski protein, koncentracija u plazmi od 2-4 g/L. Osim toga, on se u jetri sintetizira kao protein akutne faze (posredstvom IL-6). Molekula se sastoji od tri para različitih polipeptidnih lanaca složenih u trinodularnu strukturu D-E-D. E domena je centralna, u njoj se sastaju N krajevi svih 6 lanaca, tu se nalaze i fibrinopeptidi A i B. Dvije vanjske D domene sadrže karboksi krajeve lanaca.

S t r a n i c a 127 |

Trombin se veže za centralnu E domenu fibrinogena i cijepa veze između Arg-Gly, oslobađa 4 peptida iz molekule fibrinogena (2 fibrinopeptida A i 2 fibrinopeptida B). Ostatna se molekula naziva monomer fibrina. Cijepanjem FPA i FPB, vezna mjesta na E domeni postaju dostupna; ona reagiraju sa komplementarnim D domenama drugih monomera fibrina, čime se uspostavlja kontakt D-E. Polimerizacija se nastavlja nekovalentnim vezanjem trećeg monomera fibrina (D-D i D-E kontakt).

Tijekom polimerizacije monomera i drugi proteini plazme, uključujući komponente fibrinolitičkog sustava (plazminogen, aktivatori plazminogena, inhibitori fibrinolize) se vežu za površinu fibrina. Spontano polimerizirane fibrinske niti su nestabilne, međutim one se dodatno unakrsno kovalentno povezuju posredstvom FXIIIa. FXIIIa katalizira posljednju reakciju u stvaranju fibrina. On cirkulira kao heterotetramer A2B2. Nalazi se i u citoplazmi trombocita. FXIII se za polimerizirani fibrin veže kao A2B2 kompleks, zatim biva učinkovito aktiviran djelovanjem trombina uz kalcijeve ione u FXIIIa. FXIIIa je o kalciju ovisna transglutaminaza koja katalizira stvaranje izopeptidnih veza unutar polimera fibrina. Kovalentno unakrsno povezanifibrinski ugrušak mehanički je stabilniji i otporniji na proteolitičko djelovanje plazmina. Djelovanjem FXIIIa u fibrinski se ugrušak ugrađuju i inhibitori fibrinolize kao α2-antiplazmin, inhibitor aktivatora plazminogena 2 (PAI-2) i TAFI. Stoga je stvaranje fibrina inhibirano što dodatno utječe na stabilizaciju fibrina. FXIIIa još unakrsno povezuje fibrin za molekule ekstracelularnog matriksa i time "usidruje" ugrušak za stijenku krvne žile potičući cijeljenje.

FIBRINOLIZA

Fibrinoliza se aktivira gotovo istovremeno sa aktivacijom koagulacijske kaskade. Taj naziv podrazumijeva proces uklanjanja fibrina. Proces fibrinolize uključuje otapanje ugruška i održavanje fluidnosti vaskularnog sustava. Ključne su komponente fibrinolitičkog sustava: plazminogen, aktivatori plazminogen, plazmin, fibrin, degradacijski produkti fibrina/fibrinogena, inhibitori aktivatora plazminogena i plazmina. Stvaranje fibrina događa se intra- i ekstravaskularno kao posljedica koagulacije, upale i cijeljenja tkiva. Fibrinolitički sistem djeluje na lokalnoj razini, na mjestima nakupljanja fibrina, uz izostanak sistemskih učinaka. Poticaj za početak procesa fibrinolize je stvaranje fibrina. Upravo fibrin okuplja fibrinolitičke komponente na jednom mjestu kako bi optimizirao reakcije i lokalizirao proces. Plazminogen se veže za fibrin uzduž cijelog ugruška. tPA se također veže za fibrin, konvertira plazminogen u plazmin. Dakle, na fibrinu se slaže ternarni kompleks

S t r a n i c a 128 |

aktivatora-zimogena-supstrata što rezultira specifičnim cijepanjem fibrina. Plazmin cijepa fibrin u degradacijske produkte. Cijeli proces inhibiraju PAI te α2-antiplazmin. Slobodni oblik plazmina u otopini biva brzo inaktiviran djelovanjem α2-antiplazmina, no onaj vezan za fibrinski ugrušak je zaštićen od inaktivacije. Plazminogen je glikoprotein koji se sintetizira u jetri, sadrži vezna mjesta za lizin koja su odgovorna za vezanje plazminogena i plazmina za fibrin i druge proteine kao α2-antiplazmin. Aktivatori plazminogena (PA) hidrolitički cijepaju plazminogen u aktivni oblik plazmin. Plazmin nije usko specifičan enzim, može razgraditi bilo koji protein u plazmi. Stoga su njegovo nastajanje i inaktivacija in vivo usko regulirani. Plazminogen je vezan za fibrin, gdje je proces aktivacije olakšan, a plazmin ciljano djeluje na svoj supstrat fibrin. Plazmin pozitivnom povratnom spregom potiče dodatno svoju aktivaciju. U kontaktnoj se fazi koagulacije plazminogen izravno aktivira u plazmin (ali u malim količinama) djelovanjem FXIIa, FXIa i kalikreina. Fiziološki aktivatori fibrinolize su tPA (tkivni aktivator plazminogena) i uPA (urokinazni aktivator plazminogena). To su serinske proteaze visoko specifične za konverziju plazminogena u plazmin. tPA se stvara u endotelnim stanicama malih krvnih žila na podražaj trombina, bradikinina, histamina, staze krvi ili stresa. Dominantan je aktivator plazminogena u plazmi. Sadrži vezna mjesta za lizine, njima se veže za fibrin, za plazminogen i za receptore na endotelnim stanicama. tPA je jedinstven po tome što cirkulira u aktivnom obliku (a ne kao zimogen) u plazmi, međutim aktivacija plazminogena u tom obliku je neučinkovita. Za učinkovitu aktivaciju plazminogena tPA-u je potrebno vezanje za fibrin. Dakle, tPA se veže i ispoljava svoju funkciju vezan za fibrin, ali se može vezati i za membrane endotelnih stanica, i to za vlastiti receptor koji se naziva aneksin II. I tPA i PLG se vežu za endotelnu stanicu, stvara se aktivni plazmin koji omogućava održavanje fibrinolitičkog potencijala na neoštećenom endotelu. uPA se stvara u renalnom tubularnom epitelu i endotelu krvnih žila. Uloga mu je prvenstveno digestija ekstracelularnog matriksa čime omogućava migraciju stanica. Za razliku od tPA, nema afinitet za vezanje fibrina, ali može aktivirati za fibrin vezani i nevezani plazminogen. Može se vezati i za endotelne stanice krvnih žila putem receptora uPAR. Nekoliko bakterija proizvodi učinkovite aktivatore plazminogena (egzogeni aktivatori). Jedan je i streptokinaza iz beta hemolitičkog streptokoka. Nije serinska proteaza, već se veže za plazminogen, uzrokuje njegovu konformacijsku promjenu i dolazi do autokatalize plazminogena u plazmin. Streptokinaza se koristi u terapijske svrhe za otapanje ugrušaka. Jednako dobro djeluje na plazminogen vezan za fibrin i onaj slobodan u cirkulaciji - rasprostranjena aktivacija plazminogena i generalizirano proteolitičko stanje. DEGRADACIJA FIBRINA Plazmin je odgovoran za progresivnu degradaciju fibrina (ili fibrinogena) pri čemu se stvaraju tzv. produkti degradacije fibrina (FDPs). Oni bivaju brzo uklonjeni iz cirkulacije djelovanjem jetre. Plazmin slično proteolitički cijepa i fibrinogen i unakrsno vezani fibrin. Produkti degradacije fibrinogena su fragmenti X, Y, D i E.

S t r a n i c a 129 |

Fragment X se stvara cijepanjem malih peptida sa karboksilnih krajeva α lanaca fibrinogena. Zatim, djelovanjem plazmina na regiju između terminalne D i centralne E domene, nastaju D fragment i Y (E-D) fragment. Plazmin nastavlja cijepati Y fragment stvarajući slobodni D i E fragment. Dakle, konačni rezultat degradacije fibrinogena jesu dva D i jedan E fragment te nekoliko malih peptida. Plazmin nešto sporije i teže cijepa unakrsno povezani fibrin, te stvara jedinstvene degradacijske produkte kao posljedica međumolekularnih veza posredovanih faktorom XIIIa. Najmanji je D-D fragment, on se nalazi i u sklopu ostalih degradacijskih produkata fibrina. Fragmenti fibrina u visokim koncentracijama u cirkulaciji imaju antikoagulantni učinak; fragmenti usporavaju polimerizaciju fibrina, ali i inhibiraju agregaciju trombocita čime interferiraju sa primarnom hemostazom.

Plazmin slobodan u plazmi može proteolitički razgraditi mnogobrojne proteine uključujući fibrinogen, FV, VIII i XII. Taj je potencijalno opasan proces spriječen brzim vezanjem plazmina za njegov inhibitor α2-antiplazmin. INHIBITORI FIBRINOLIZE Utječu na fibrinolitički sistem kako bi spriječili sistemsku proteolizu. Djeluju na aktivaciju plazminogena ili izravno na plazmin.

S t r a n i c a 130 |

PAI (inhibitor aktivatora plazminogena) pripada obitelji inhibitora serinskih proteaza nazvanih serpinima. 5 je različitih PAI proteina koji svoju inhibitornu aktivnost ostvaruju vezanjem za ciljnu molekulu u omjeru 1:1. PAI-1 je glavni fiziološki inhibitor tPA i uPA, stvara se u endotelnim stanicama, monocitima, makrofagima, stanicama glatkog mišičja i adipocitima. Oko 70% tPA u plazmi cirkulira u kompleksu sa PAI-1. Oslobađa se iz trombocita u početni hemostatski ugrušak kako bi spriječio prerano liziranje početnog matriksa fibrina od strane plazmina. Osim toga, PAI-1 je i protein akutne faze. Oslobađa se u povećanim koncentracijama djelovanjem trombina, IL-1, TGF-β, TNFα i endotoksina. Povećane koncentracije u plazmi umanjuju aktivaciju plazminogena sa tPA i uzrokuju hiperkoagulabilnost. Nedostatak PAI-1 dovodi do ozbiljnih krvarenja. PAI-2 se nalazi u niskim koncentracijama u plazmi, osim u trudnoći kada su mu razine drastično povećane. Kompleksi PA/PAI se iz cirkulacije ukljanjaju u jetri ili djelovanjem makrofaga. TAFI u aktiviranom obliku inhibira fibrinolizu. Radi se o prokarboksipeptidazi B koja se aktivira na način da se stvara ternarni kompleks TAFI-trombin-trombomodulin. Mehanizam supresije fibrinolize temelji se na uklanjanju C-terminalnih lizina i arginina iz fibrina, stoga se uklanjaju vezna mjesta za plazminogena na molekuli polimeru fibrina. Dakle, štiti fibrin od degradacije, kako bi se on stabilizirao i učvrstio. U jetri se sintetizira i αααα2-antiplazmin, glavni fiziološki inhibitor plazmina. Vrlo se brzo veže za plazmin slobodan u plazmi, dok je plazmin vezan za fibrin zaštićen od djelovanja α2-antiplazmina. Uloga je cirkulirajućeg α2-antiplazmina ograničavanje sistemske fibrinolize. αααα2-makroglobulin je također inhibitor ali široke specifičnosti jer reagira sa mnogobrojnim proteazama u cirkulaciji. Djeluje kao backup inhibitor kada se zbog široko rasprostranjene aktivacije fibrinolize potroše zalihe α2-antiplazmina. Svojim djelovanjem inaktivira preostali plazmin.

FIZIOLOŠKA KONTROLA HEMOSTAZE

Koagulacijske se reakcije moraju ograničiti na mjestu ozljede krvne žile kako bi se održala fluidnost u neozljeđenim krvnim žilama. To se postiže nizom mehanizama koji osiguravaju zadržavanje aktiviranih faktora koagulacije i trombocita lokalizirano na mjestu ozljede. Jedan od mehanizama je kontrola protoka krvi. Kako bi se omogućilo stvaranje ugruška, prvo dolazi do vazokonstrikcije ozljeđene krvne žile. Time se potiče nastanak ugruška usporavajući protok krvi na tom mjestu, što omogućava i prostorno zbližavanje trombocita, faktora koagulacije i endotelnih stanica - inicijacija primarne i sekundarne hemostaze. Nakon toga se ponovno uspostavlja uobičajeni protok krvi, čime se reakcije koagulacije ograničavaju razrijeđivanjem aktiviranih faktora na mjestu ozljede i njihovim vezanjem za inhibitore. Većina se faktora koagulacije sintetizira u jetri, ali se oni u kompleksu sa svojim inhibitorima uklanjaju iz cirkulacije djelovanjem jetre. Prirodni biokemijski inhibitori su topljivi proteini plazme koji reguliraju enzimske reakcije serinskih proteaza. Reguliraju inicijaciju ili amplifikaciju koagulacije. To su prvenstveno antitrombin III, heparin kofaktor II, protein C i protein S, TFPI, protein Z, α2-makroglobulin, α1-antitripsin, TAFI, i α2-antiplazmin. Antitrombin (nekada ATIII) je najvažniji inhibitor prokoagulantnih serinskih proteaza. Može neutralizirati trombin, faktore XIIa, XIa, IXa i Xa, kalikrein i plazmin. Ostvaruje svoj učinak stvarajući kompleks 1:1 sa proteazom, međutim ta je reakcija vrlo spora u

S t r a n i c a 131 |

odsutnosti heparina. Uz heparin kao kofaktor reakcija inhibicije se ubrzava 3-4 puta. Prokoagulantne proteaze koje se nalaze u kompleksima na površini trombocita zaštićene su od inaktivacije AT/heparinom. AT se sintetizira u hepatocitima i endotelnim stanicama. Heparin se nalazi u granulama mastocita i bazofila, te se u normalnim uvjetima ne oslobađa, stoga ga niti nema u plazmi. Endotel krvnih žila je bogat molekulama heparan sulfat proteoglikana (HSPGs). AT i trombin se vežu za heparan sulfat proteoglikane, čime se omogućava njihovo približavanje, konformacijska promjena u molekuli AT i njegova aktivacija. Trombin/AT kompleks (TAT) se oslobađa veze sa proteoglikanom, tako da ovaj dalje reagira sa slijedećim AT. HSPGs iz stijenke krvnih žila vežu i lokaliziraju AT, stoga endotel ima antikoagulantna i antitrombotska svojstva inhibirajući slobodni trombin i proteaze. Put proteina C glavni je inhibitorni mehanizam uključen u kontrolu koagulacije. Aktivirani protein C (APC) inhibira dva regulatorna proteina koagulacije FVa i FVIIIa. PC i njegov kofaktor PS su o vitaminu K ovisni proteini koji se sintetiziraju u jetri. Nakon što se trombin stvori na mjestu ozljede krvne žile, njegov se suvišak veže za trombomodulin (TM) na endotelnim stanicama. TM je integralni membranski protein, a ime mu potječe iz činjenice da može prokoagulantna svojstva trombina promjeniti u antikoagulantna, tako da trombin gubi sposobnost zgrušavanja fibrinogena, aktivacije FV i aktivacije trombocita, te umjesto toga okreće se na brzu aktivaciju proteina C u prisutnosti kalcija.

APC se oslobađa iz veze sa trombin/TM kompleksom, te nakon vezanja sa svojim kofaktorom PS, proteolitički inaktivira FVa i FVIIIa (djeluje samo na aktivne oblike faktora). Time trombin, posredstvom APC, ublažava svoj učinak na rast fibrinskog ugruška. Kako bi ostvario punu aktivnost, APC mora vezati kofaktor PS u prisutnosti kalcija i fosfolipidne površine. U krvi PS cirkulira kao slobodan PS (40% od ukupnog proteina) i PS nekovalentno vezan za C4b-vezujućim proteinom iz sustava komplementa. Samo slobodni oblik PS je učinkovit kofaktor za APC. Kompleks PC-PS se zatim veže za površinu stanice i inaktivira FVa i FVIIIa. EPCR (endothelial protein C receptor) se nalazi na endotelnim stanicama većih krvnih žila. Njegovim vezanjem za PC povećava se aktivacija PC povećanjem afiniteta trombin/TM kompleksa za PC. APC zatim disocira iz veze sa receptorom, veže PS i inhibira FVa.

S t r a n i c a 132 |

APC se neutralizira djelovanjem PC inhibitora. Nedostatak PC ili PS rezultira trombofilijom. Osim toga, APC rezistencija (FV Leiden) je još jedan od faktora rizika za trombofiliju. TFPI (tissue factor pathway inhibitor) inhibira kompleks FVIIa/TF. Glavni izvor TFPI je endotel, najvećim se dijelom on nalazi vezan za heparan sulfat na površini endotelnih stanica, dok je ostatak vezan za LDL lipoproteine. Primjenom heparina oslobađa se TFPI iz veze sa heparan sulfatom te mu se koncentracija u plazmi poveća nekoliko puta. TFPI je jedinstven među inhibitorima proteaza, može inhibirati i FXa i FVIIa. Prvo se veže za aktivno mjesto FXa i inhibira ga, a nakon toga taj binarni kompleks reagira i sa FVIIa/TF stvarajući tako kvaternarni kompleks VIIa-TF-FXa TFPI na membrani, čime se inaktiviraju obje proteaze.

METODE U LABORATORIJSKOJ KOAGULACIJI "The result is only as good as the sample."

PREDANALITIKA U LABORATORIJSKOJ KOAGULACIJI

Krajnji cilj testova u koagulaciji, kao i u ostalim područjima laboratorijske medicine, jest osigurati da nalaz vjerno predstavlja stanje hemostatske funkcije in vivo u datom trenutku. Svaki čimbenik koji može utjecati na pogrešnu interpretaciju rezultata hemostatske funkcije, izravno utječe i na mogući nepovoljan ishod za pacijenta. U posljednjih 50-tak godina postignut je značaj napredak u području analitičkih tehnika, laboratorijskih intrumenata i organizacije laboratorijskog dijagnostičkog procesa (akreditacija i certifikacija), što jamči visoku razinu analitičke kvalitete. Unatoč tome, u području laboratorijske koagulacije ima još mjesta za poboljšanje pouzdanosti i kvalitete rada.

Antikoagulantni lijekovi kao što su warfarin i heparin imaju uski terapijski raspon, što znači da neadekvatna doza vodi ili u trombozu ili u sklonost krvarenju. Ovi lijekovi uzrokuju produženje PV-a odnosno APTV-a, stoga se ti testovi koriste za praćenje

S t r a n i c a 133 |

terapije. Lažno produženi PV i APTV dovest će kliničara do krivog zaključka, taj će smanjiti dozu lijeka i dovesti pacijenta u povećani rizik od tromboze. Istraživanja pokazuju da greške predanalitičke faze čine 70% od ukupnih pogrešaka u cjelokupnom analitičkom procesu. Upravo su procesi predanalitičke faze izvan izravnog nadzora laboratorijskih stručnjaka, a tiču se uzorkovanja i rukovanja uzorkom. Metode u koagulaciji su izrazito podložne pogreškama zbog neadekvatnog uzorkovanja (kvaliteta uzorka nije optimalna, a najčešće se radi o hemolizi, nedovoljnom volumenu krvi, ugrušanom uzorku, gubitku uzorka, krivo identificiranom uzorku). To je zbog toga što i sam čin kojim se dobiva uzorak - venepunkcija - inicira hemostazu, upravo onaj fiziološki sistem koji se treba određivati. Predanalitička varijabilnost u koagulaciji ovisi o:

1. složenosti biokemijskih i staničnih reakcija obuhvaćenih PV-om i APTV-om 2. labilnosti nekih proteina koagulacije 3. ovisnosti većine reakcija koagulacije o kalciju 4. o aktivaciji trombocita.

Napredak u laboratorijskoj automatizaciji značajno je umanjio analitičku varijabilnost analizatora za koagulaciju. To znači da je postignuta visoka razina točnosti i preciznosti hemostatskih podataka, ali je paradoksalno povećana i ovisnost tih podataka o kvaliteti citratnog uzorka. Kalcij je neophodna komponenta koagulacijskog mehanizma, stoga umjetno uklanjanje kalcija uz pomoć citrata kao antikoagulansa spriječava početak koagulacije u epruveti. Može se reći da su testovi u koagulaciji optimizirani ako postoji visoka razina standardizacije i kontrole u koracima flebotomije, izbora antikoagulansa, transporta uzorka, centrifugiranja i rekalcifikacije (analiza uzorka). Varijable koje su vezane uz bolesnika Utječu ne samo na koagulaciju u laboratorijskim uvjetima, već i na hemostazu in vivo. Ne svrstavaju se u predanalitičke varijable, ali ih je važno poznavati kako bi se upotrijebile adekvatne referentne vrijednosti i inerpretirala mala odstupanja u testovima koagulacije u slučaju dijagnostike poremećaja hemostaze. Npr. referentne vrijednosti specifične za dob su ključne kod interpretacije nalaza hemostaze u novorođenčadi i dojenčadi. Ili, poznato je da pojedinci sa krvnom grupom 0 imaju niže razine vWF i FVIII od pojedinaca sa ostalim krvnim grupama. Pušenje utječe na povišenje koncentracije fibrinogena, vWF, i drugih faktora koagulacije, a utječe i na pojačanu kativaciju trombocita. Lijekovi, kao u slučaju hormonske nadomjesne terapije ili oralnih kontraceptiva, utječu na koagulaciju i trombocite. Promjene se događaju i u trudnoći, menopauzi ili različitim fazama menstrualnog ciklusa. Poremećaji kao anemija, policitemija ili hemoliza, utječu na testove koagulacije (koncentracija citrata). Preporuka je NCCLS= sada CLSI dokumenta prilagoditi omjer citrata i krvi u alučaju hematokrita >0.550. Hemoliza pak utječe na biokemijski dio koagulacijske reakcije ali i detekciju signala u testovima koagulacije. Varijable vezane uz bolesnika:

- dob i spol - krvna grupa - intraindividualna varijacija, cirkadijalna i sezonska - prehrana, pušenje, uzimanje alkohola - lijekovi

S t r a n i c a 134 |

- menstrualni ciklus, trudnoća, menopauza - tjelovježba - emotivni stres i psihički poremećaji - poremećaji povezani sa anemijom, policitemijom i hemolizom.

Uzimanje uzorka Mogući izvori pogrešaka:

- identifikacija pacijenta - pogreške u slučaju alikvotiranja - pogreške kod prepisivanja zahtjeva od kliničara - neadekvatna epruveta - standardizirani položaj pacijenta kod uzimanja uzorka (15-30 minuta odmora,

prilikom ustajanja dolazi do redukcije volumena plazme i do 12%, to utječe na prividno povećanje broja trombocita i koncentracije proteina koagulacije, sjedeći položaj!)

- tehnika venepunkcije - povez dulje od 1 minute djeluje na povećanje proteina koagulacije u krvotoku, a može i uzrokovati aktivaciju koagulacije; traumatska ili produžena venepunkcija može aktivirati hemostazu; nakon brisanja mjesta uboda ostaviti da alkohol za dezinfekciju ishlapi

- premalo ili previše uzorkovane krvi uzrokuje neadekvatan omjer antikoagulansa i krvi u epruveti, što može uzrokovati lažno produžena ili skraćena vremena zgrušavanja; CLSI preporuča odbacivanje uzoraka koji su napunjeni manje od 90% od očekivanog ukupnog volumena

- ne uzorkovati iz mjesta pokraj infuzije intravenoznih tekućina, pogovo heparina!

CLSI preporuke govore o korištenju epruveta sa podtlakom koje sadrže točno naznačenu količinu natrijevog citrata. Ne preporuča se korištenje šprice za uzorkovanje i prebacivanje u epruvetu (hemoliza, aktivacija koagulacije, neadekvatan omjer sa citratom). Volumen krvi je kritičan za točne rezultate testova koagulacije, omjer krvi i antikoagulansa mora biti 9:1. Upravo taj omjer osigurava pravilnu količinu kalcija dostupnu za zgrušavanje. Ako je krvi u epruveti previše, ionizirani kalcij se neće kelirati do kraja i doći će do aktivacije koagulacije in vitro - lažno skraćeno zgrušavanje. Obratno, ako je krvi premalo u epruveti, ioniziranog je kalcija manje dostupno što rezultira lažno produženim vremenima zgrušavanja. Preporučena koncentracija citrata prema WHO i CLSI je 3.2% (0.109M). Kod uzoraka sa hematokritom većim od 0.55 reduciran je volume plazme u odnosu na stanice, pa je stoga i omjer antikoagulansa i krvi poremećen. U takvim je slučajevima preporuka namjestiti (smanjiti) volumen citrata u epruveti. CLSI govori i o redoslijedu uzorkovanja više epruveta:

- hemokulture - staklene epruvete za serum (biokemijske) bez aditiva i aktivatora zgrušavanja - citratne epruvete za koagulaciju - biokemijske epruvete sa gel separatorom ili obične plastične epruvete (serum) - heparinske epruvete - EDTA epruvete - epruvete za određivanje glukoze (antiglikolitička sredstva).

Redoslijed vađenja ukratko: hemokulture, epruvete bez aditiva, epruvete za koagulaciju i epruvete sa aditivima. Preporuka je da ako se vadi samo koagulacija, prva se epruveta za koagulaciju baci, a druga zadržava i analizira, kako bi se

S t r a n i c a 135 |

spriječila kontaminacija uzorka tkivnim tromboplastinom (koji se oslobađa prilikom uboda i aktivira koagulaciju in vitro). Preporuka je CLSI kada je potrebno vaditi samo koagulaciju, vaditi samo jednu epruvetu, jer je pokazano da nema značajne razlike u vrijednostima rutinskih pretraga koagulacije između prvo- i drugovađene epruvete. Nakon uzorkovanja neophodno je lagano promiješati uzorak nekoliko puta (3-4x), kako bi se osiguralo miješanje krvi sa antikoagulansom i spriječilo zgrušavanje in vitro. Transport i rukovanje uzorkom Proteini koagulacije, a pogotovo FV i FVIII, su izrazito labilni, te se in vitro degradiraju proporcionalno vremenu. To se dodatno ubrzava kod viših temperatura. Lažno su produženi PV i APTV. Suprotno tome, čuvanje uzorka plazme u hladnjaku može dovesti do aktivacije unutrašnjeg puta hladnoćom (FVII) i time lažnim skraćivanjem PV-a. Preporuka je analizirati centrifugiranu plazmu (plazma ostaje na stanicama) za PV unutar 24 sata, a za APTV unutar 4 sata od primitka. Ako je potrebno, plazma se može smrznuti na -20°C do 2 tjedna, ili 6 mjeseci na -70°C. Plazme se otapaju na 37°C (brzo), i kao takve analiziraju odmah nakon otapanja. Preporuča se centrifugiranje na sobnoj temperaturi unutar jednog sata od venepunkcjije, i to 15 minuta na 4000 okr/min kako bi se dobila plazma siromašna trombocitima (PPP, ≤ 10 x 109/L trombocita). Zašto se koristi PPP? Tri su razloga: trombociti sadrže PF4 koji neutralizira heparin, trombociti sadrže fosfolipide koji utječu na određivanje LA i faktora koagulacije, trombociti sadrže proteaze koje mogu djelovati na određivanje vWF. Za određivanje funkcije trombocita koristi se plazma bogata trombocitima (PRP, 200-300 x 109/L trombocita), takva se plazma odmah odvaja od stanica nakon centrifugiranja i analizira unutar 3 sata. Unutar perioda od 8 sati od centrifugiranja mogu se dodatno (po potrebi) odrediti PV i APTV, ali ne i APTV kod pacijenata na terapiji UFH. Epruvete za koagulaciju Preporuka je da materijal od kojeg je napravljena epruveta bude silikonizirano staklo (zbog prevencije kontaktne aktivacije). CTAD antikoagulans, sadrži pored natrijevog citrata i teofilin, adenozin i dipiridamol - metabolički inhibitori za stabilizaciju trombocita. Istraživanja su pokazala redukciju u predanalitičkoj varijabilnosti APTV-a kod pacijenata na heparinu uz korištenje tih epruveta. Najveći klinički rizik povezan sa predanalitičkom varijabilnošću ispoljava se kod PV-a u pacijenata na OAK, APTV-a u pacijenata na heparinu. Praćenje terapije warfarinom Uvođenjem INR-a uklonila se varijabilnost povezana sa osjetljivošću tromboplastinskih reagensa. ISI kojeg određuju proizvođači reagenasa jednako je podložan varijabilnostima kao i uzorak iz citrata. Praćenje terapije heparinom Reagensi za APTV pokazuju različitu osjetljivost na heparin. Međutim, za razliku od uvođenja INR-a, u ovom području nema standardizacije. Većina laboratorija koristi tradicionalni terapijski raspon za APTV: 1.5-2.5x srednja vrijednost referentnog raspona za tu populaciju. Međutim, preporuke postoje za izradu lokalnih terapijskih raspona, koji će uzeti u obzir osjetljivost korištenog reagensa za APTV i karakteristike

S t r a n i c a 136 |

analizatora. To uključuje analizu serije uzoraka dobivenih od pacijenata na heparinu, i to određivanje APTV uz lokalni predanalitički sistem i lokalni sistem reagens/instrument, a zatim određivanje heparinske aktivnosti kromogenom anti-FXa metodom u tim istim uzorcima. Vrijednosti APTV-a dobivene za razine heparina 0.3 i 0.7 U/mL definiraju lokalni, reagens specifični terapijski raspon. Broj trombocita u citratnom uzorku Od 1-2% bolesnika u klinici i do 0.2% ambulantnih bolesnika ispoljava agregaciju trombocita u prisutnosti EDTA ili zbog antitijela stvorenih na trombicite uslijed djelovanja EDTA. Najčešće se agregati trombocita pojavljuju zbog loše prakse u venepunkciji i nedovoljnog miješanja uzorka nakon vađenja. Standardni protokoli u ovakvim slučajevima podrazumijevaju razmaz dobiven iz prsta ili određivanje trombocita iz citratnog uzorka. Hemoliza Vodeći je uzrok neprikladnosti uzorka za obradu u kliničkoj kemiji i koagulaciji. Može biti posljedica transfera mokrog alkohola u epruvetu prilikom vađenja, korištenja igli malog promjera, otežanog vađenja, djelomične opstrukcije katetera ili drugih sustava za uzorkovanje, snažnog miješanja uzorka nakon vađenja, produženog centrifugiranja uzorka na većoj brzini. Izlazak intracelularnih komponenti u plazmu uzrokuje interferencije biološke i analitičke prirode.

METODE U LABORATORIJSKOJ KOAGULACIJI

Metode u modernoj hemostazi mogu se praktično podijeliti na rutinske koagulacijske testove, koji su obično screening testovi, i dijagnostičke testove za hemostazu (specijalna hemostaza) koji se koriste za potvrdu specifične dijagnoze. Metode se također mogu podijeliti na metode koje se odnose na primarnu, na sekundarnu hemostazu te na metode za određivanje fibrinolitičkog statusa. RUTINSKA HEMOSTAZA PV Jedan od najstarijih testova koagulacije. Koristi se kao screeening test kod sumnje na urođene ili stečene poremećaje vanjskog ili zajedničkog puta koagulacijske kaskade. Izvodi se tako da se uzorku PPP plazme dodaje tkivni faktor,fosfolipidi i kalcij (tromboplastin), te se mjeri vrijeme u sekundama do nastanka ugruška (stavranja fibrina). Obuhvaća faktore II, V, VII i X, te koncentraciju i funkciju fibrinogena. Komercijalni (biološki) izvori tromboplastina su različiti (najčešće mozak kunića), pa je stoga i osjetljivost pojedinog reagensa prema nedostatku faktora različita. Varijabilnost u rezultatima nije samo posljedica različite osjetljivosti reagensa, već ovisi i o metodologiji te sustavu reagens/instrument. Zato se preporuča da svaki laboratorij odredi vlastite referentne vrijednosti. Uzroci produženog PV-a su:

� nedostatak faktora VII, X, V i II � nedostatak fibrinogena � prisutnost inhibitora.

Koristi se za praćenje OAT. U tom slučaju se izražava u obliku INR-a, kako bi se umanjila varijabilnost u rezultatima (intra- i interlaboratorijskim) - veća standardizacija rezultata među laboratorijima. INR se izračunava koristeći ISI vrijednost koja se može

S t r a n i c a 137 |

interpretirati kao korektivni faktor za standard proizvođača, a prema WHO referentnom pripravku. ISI za određeni reagens ovisi o instrumentu. Izračun INR-a sadrži i MNPT, a to je geometrijska sredina PV-a dobivena od 20-30 zdravih ispitanika (svaki bi je laboratorij trebao određivati za sebe, i to sa svakim novim lotom reagensa). Prednosti su korištenja INR za praćenje OAT neovisnost od korištenih metoda i instrumenata za određivanje PV-a - bolje praćenje dugoročno takvih pacijenata. APTV Test za screeening nasljednih ili stečenih poremećaja unutrašnjeg i zajedničkog puta koagulacije. Može se koristiti i kao screening test kod sumnje na prisutnost cirkulirajućih inhibitora (lupus antikoagulans). Osjetljivost komercijalnih reagensa na nedostatak faktora ili prisutnost LA se razlikuje, stoga je preporuka da svaki laboratorij odabere reagens za APTV prema vlastitim potrebama. Obuhvaća faktore VIII, IX, XI, XII te fibrinogen, FII, FV i FX. Za određivanje APTV se koriste dva reagensa: aktivirani parcijalni tromboplastin i ionizirani kalcij. Parcijalni tromboplastin simulira površinu aktiviranog trombocita jer sadrži fosfolipide i kontaktni aktivator (elagijska kiselina, kaolin, silika - simuliraju negativno nabijenu površinu za aktivaciju FXII). Nakon što se uzorku PPP plazme dodao aktivirani parcijalni tromboplastin, inkubira se reakcijska smjesa određeno vrijeme, a zatim se dodaje kalcijev klorid te mjeri vrijeme do pojave fibrinskog ugruška (u sekundama). Tradicionalno se APTV koristi za praćenje terapije nefrakcioniranim heparinom. Produženje APTV ovisi o reagensu, analizatoru pa i lotu korištenog reagensa. Međutim, za razliku od PV, u ovom području nema standardizacije. Dodatno cijeli problem komplicira i heterogenost heparinskih pripravaka koji se koriste u terapiji, individualnost odgovora pojedinca na heparin zbog fizioloških mehanizama uklanjanja ili vezanja heparina na pojedine proteine. Upravo zbog sveg navedenog raspon od 1.5-2.5 od bazalne APTV vrijednosti nema značenja. Međutim od laboratorija se zahtjeva da odredi terapijski raspon za APTV za pacijente na heparinu. To se može učiniti korelacijom rezultata APTV-a dobivenih od pacijenata na heparinu sa rezultatima anti-Xa aktivnosti iz tih istih uzoraka. Za anti-Xa je terapijski raspon 0.3 - 0.7 U/mL, pa vrijednosti APTV koje odgovaraju ovim granicama predstavljaju terapijki raspon izražen u sekundama (APTV).

S t r a n i c a 138 |

LMWH ima pouzdaniju farmakokinetiku i bioraspoloživost, stoga ne zahtjeva praćenje APTV-om. TV Kao screening test može mjeriti konverziju fibrinogena u fibrin. Izvodi se tako da se plazmi doda suvišak trombina, te se prati vrijeme potrebno da nastane ugrušak. Trombinsko vrijeme osjetljivo je na heparin, na direktne inhibitore trombina i nedostatak ili poremećaje u fibrinogenu. Produženo TV opaža se u slučaju: kongenitalne afibrinogenemije i disfibrinogenemije, prisutnosti heparina (izrazito produžen TV!), prisutnosti FDP (razgradnih produkata fibrinogena). FIBRINOGEN Određuje se referentnom metodom po Claussu (funkcionalna metoda), ali može i imunološki (antigen). Trombin se dodaje plazmi, te se mjeri vrijeme stvaranja fibrinskog ugruška. Koncentracija fibrinogena je obrnuto proporcionalna vremenu zgrušavanja. U kontekstu traume, ugriza zmije, DIK-a. Snižene vrijednosti fibrinogena kod:

� DIK-a � primarne i sekundarne fibrinolize � bolesti jetre � urođeni poremećaji kao dis- ili afibrinogenemija.

Povišene vrijednosti kod: � upalnih procesa (reaktant akutne faze) � trudnoće � kod uzimanja oralnih kontraceptiva.

D-DIMER Specifičan fragment koji nastaje degradacijskim djelovanjem plazmina na fibrinski ugrušak koji je unaksno povezan sa FXII, pa je stoga mjera fibrinolize. Određuje se kao marker tromboze, odnosno razgradnje ugruška kod tromboze. Odličan je marker za DIC, ali je povišen i u slučaju PE, DVT, arterijskog TE, svježe traume ili operacije, kod ciroze jetre i zatajenja bubrega. Metoda za određivanje koristi monoklonalna antitijela na fragment D-dimer u 3 različite izvedbe:

� semikvantitativni test - makroskopska lateks aglutinacija � ELISA - osjetljiva i specifična, ali dugotrajna � Automatizirana, a temelji se na mikroskopskoj lateks aglutinaciji - lateks

čestice su obložene At na D-dimer, dolazi do agregacije u prisutnosti D-dimera, određuje s turbidimetrijski; vrlo osjetljiva metoda, ima visoku NPV za DVT i PE, ovisno o cut off vrijednostima.

D-dimeri se ne bi smjeli određivati kod pacijenata na terapiji heparinom ili warfarinom, istraživanja su pokazala da antikoagulansi smanjuju koncentraciju D-dimera u cirkulaciji i tako uzrokuju lažno snižene vrijednosti odnosno maskiraju VTE.

S t r a n i c a 139 |

DIJAGNOSTIČKA HEMOSTAZA

TESTOVI ZA IDENTIFIKACIJU NEDOSTATKA SPECIFIČNOG FAKTORA Kada su PV i APTV produženi potrebno je upotrebom specifičnih testova ustanoviti o kojem se poremećaju radi (osim ako abnormalne vrijednosti nisu uzrokovane predanalitičkom greškom ili je bolesnik na antikoagulantnoj terapiji). Prvi u nizu je tzv. test miješanja (ili screening test za cirkulirajuće inhibitore), a koristi se kako bi se razlikovao nedostatak specifičnog faktora od prisutnosti cirkulirajućih inhibitora u uzorku. Ponavlja se određivanje PV i APTV ali u nekoliko različitih razrijeđenja uzorka pacijenta sa normalnom (pool) plazmom. Ukoliko se radi o nedostatku jednog ili više faktora koagulacije, razrijeđenja pokazuju korekciju produženih vrijednosti PV-a i APTV-a (dovoljna je razina faktora oko 50% od normale za normalne vrijendosti PV-a i APTV-a). Normalna je plazma "nadopunila" nedostatak faktora u uzorku pacijenta. Nakon toga se određuje nedostatak specifičnog faktora o kvantificira njegova aktivnost. Ako ne dođe do korekcije produženih testova, radi se o prisutnosti cirkulirajućeg ili specifičnog inhibitora faktora koagulacije. Cirkulirajući inhibitor inhibira faktore koagulacije u plazmi pacijenta i u normalnoj plazmi. Slijedeći je korak identifikacija inhibitora specifičnim testovima. Specifičnim se određivanjem faktora potvrđuje nedostatak specifičnog faktora i utvrđuje aktivnost tog faktora u plazmi. Metoda za određivanje pojedinačnog faktora temelji se na sposobnosti pacijentove plazme da korigira produženi PV i APTV ako se doda plazmi deficijentnoj tim istim faktorom (supstrat). Faktori vanjskog (FVII) i zajedničkog puta (FII, FV i FX) određuju se metodom koja se temelji na mjerenju PV-a. Određuje se vrijeme zgrušavanja u smjesi razrijeđene pacijentove plazme i specifične faktorom deficijentne plazme koja predstavlja supstrat (sadrži normalne razine svih faktora, osim onog kojeg određujemo). Rade se najmanje dva razrijeđenja (obično 1:10 i 1:20, ako rezultati nisu linearni prisutna je i inhibitor - LA). Dakle, toj se smjesi dodaje reagens za PV i mjeri vrijeme do nastanka ugruška. Faktori unutrašnjeg puta (FVIII, FIX, FXI, FXII) određuju se metodom koja se temelji na mjerenju APTV-a. Princip je isti kao gore. Referentna vrijendost za većinu faktora je 50-150%. Za određivanje FVIII dostupni su i komercijalni kromogeni reagensi.

S t r a n i c a 140 |

VRIJEME REPTILAZE Koristi se zajedno sa TV kako bi se prepoznala kontaminacija uzorka heparinom (jer na njega ne utječe prisutnost heparina u uzorku) i olakšala diferencijalna dijagnoza disfibrinogenemije od prisutnosti FDP-a u uzorku. Reptilaza je serinska proteaza iz otrova zmije slična trombinu, cijepa fibrinopeptid A iz fibrinogena, dok trombin za razliku cijepa fibrinopeptid A i B. Reptilaza se dodaje PPP i dolazi do stvaranja ugruška (referenca 18-22 sek). Vrijeme reptilaze duže od 25 sekundi ukazuje na disfibrinogenemiju, hipo- ili afibrinogenemiju. TESTOVI ZA ODREĐIVANJE vWF Za dijagnozu VWB potrebno je kvantificirati VWF u funkcionalnom i antigeničnom smislu. Na točnost tih određivanja utječe niz analitičkih varijabli. Jedna od njih je odstupanje vrijednosti VWF unutar dužeg vremenskog perioda (godina dana) od prvog određivanja (intraidividualna varijabilnost). Drugi je problem što screeening pretrage (VK i APTV) mogu biti unutar raspona u VWB tipa I. Oslobađanje adrenalina u organizmu (flebotomija pogotovo kod djece) utječe pak na privremeno povećanje vrijednosti FVIII i VWF, tako da pacijenti sa VWB tipa I rezultiraju normalni. Ukoliko se adekvatnim centrifugiranjem ne dobije PPP, zaostali višak trombocita može kod zamrzavanja uzorka uzrokovati oslobađanje proteaza koje će degradirati multlimere VWF, te prividno povećati VWF:Ag, a smanjiti VWF:A. Osim toga, referentni standard za aktivnost i antigeničnost VWF nije jednak, iz čega proizlazi dodatna varijabilnost. Na VWF utječe i krvna grupa samog pacijenta (KG 0). Ristocetin kofaktor (VWF:Rco) test, odnosno kvantitativno određivanje aktivnosti VWF. Trombociti fiksirani na formalinu (ne pacijentovi!) suspendiraju se u plazmi pacijenta i toj se smjesi dodaje ristocetin. On inducira VWF iz pacijentove plazme da veže GPIb/IX receptor na tim fiksimranim trombocitima. Nastala se aglutinacija određuje u agregometru. Obično je VWF:A smanjena u plazmi pacijenata sa svim oblicima VWB, najniže vrijednosti primjećene su kod tipa III.

S t r a n i c a 141 |

Može se određivati koncentracija vWF u plazmi (VWF:Ag) bez obzira na njegovu aktivnost. Metoda je sandwich ELISA, reproducibilna, točna i brza. Kao vezno antitijelo se koristi specifično zečje antihumano At na VWF:Ag, njime je obložena jažica mikrotitarske pločice. Veže VWF:Ag iz uzorka, a zatim se kao sekundarno antitijelo dodaje zečje antihumano At obilježeno ALP ili fosfatazom. Na kraju se dodaje supstrat za enzim kojim je obilježeno sekundarno antitijelo, te je intenzitet nastalo obojenja proporcionalan koncentraciji VWF u uzorku. Dosupna je i imunoturbidimetrijska metoda na lateks česticama. Tu je i test vezanja kolagena (VWF: CB), čime se određuje sposobnost VWF da veže subendotelne proteine matriksa. ODREĐIVANJE FUNKCIJE TROMBOCITA PFA-100 se koristi u identifikaciji poremećaja trombocita ili učinka antitrombocitne terapije, sveobuhvatnija testiranja trombocita su potrebna za karakterizaciju specifičnog kvalitativnog poremećaja trombocita. Dakle, kod određivanja funkcije trombocita screening testovi su vrijeme krvarenja i PFA-100. Potvrdni testovi su agregacija trombocita u PRP ili punoj krvi, protočna citometrija i retrakcija ugruška. Vrijeme krvarenja obuhvaća in vivo procjenu funkcije trombocita. Međutim, na VK ne utječe samo funkcija trombocita, već i broj trombocita i integritet vaskulature. Obuhvaća mjerenje vremena do prestanka krvarenja iz površinske incizije koju je proizveo laboratorijski tehničar. Referentni interval je 1-9 minuta. Pretraga je opsoletna zbog niza čimbenika koji onemogućavaju standarizaciju metode. TESTOVI ZA TROMBOFILIJU (HIPERKOAGULABILNA STANJA) Određuju se urođeni poremećaji u prirodnim antikoagulansima (PC, PS, AT) ili stečeni poremećaji povezani sa prisutnošću aPL. Antitrombin ima snažnu i trenutnu antiproteaznu aktivnost u prisutnosti heparina. Određuje se kromogenom metodom, određuje se aktivnost AT u prisutnosti heparina. Plazma se inkubira sa suviškom trombina u prisutnosti heparina. AT neutralizira trombin, a ostatni se trombin određuje enzimski uz kromogeni supstrat. Koncentracija ostatnog trombina obrnuto je proporcionalna koncentraciji AT u uzorku. To je funkcionalni test. Imunološke metode određuju koncentraciju AT proteina, a to su EIA, ELISA, i imunološke metode na mikročesticama (LIA). Stečeni nedostatak AT bilježi se u DIC-u, bolesti jetre zbog nedostatne sinteze ili u nefrotskom sindromu. Davanjem heparina dolazi do sniženja vrijednosti AT vjerojatno zbog ubrzanog klirensa AT-heparin kompleksa. Zdrava novorođenčad ima upola niže vrijednosti AT od odraslih, s vremenom one dosegnu vrijednosti odraslih (sa 3-6 mjeseci života). Protein C / APC inaktivira FVa i FVIIIa. Funkcionalno se određivanje temelji na dodatku zmijskog otrova, protaca (specifični aktivator za PC) i PF3 uzorku, čime se aktivira PC i faktori unutrašnjeg puta. Dakle, pacijentova se plazma inkubira sa PC-deficijentnom plazmom (tako se kompenzira nedostatk bilo kojeg faktora osim PC). Zatim se smjesi dodaje reagens i kalcijev klorid, mjeri se vrijeme do nastanka ugruška. Aktivacijom PC inaktivira se FVa i FVIIIa, što uzorkuje produljenje modificiranog APTV. Produljenje APTV-a je to dulje što je u uzorku prisutno više funkcionalnog PC. Za određivanje funkcije PC koristi se i kromogena metoda. Inkubira se PC iz uzorka sa aktivatorom, te se nastali APC određuje na temelju njegove enzimatske aktivnosti na kromogeni supstrat. APCR, odnosno mutacija FVL rezistentna na degradaciju djelovanjem PC. Metoda za funkcionalno određivanje APCR je koagulometrijska, temelji se na činjenici da se

S t r a n i c a 142 |

dodatkom APC plazmi produžuje APTV (zbog inaktivacije FVa i FVIIIa). Prethodno se analizi dodaje pacijentovoj plazmi FV-deficijentna plazma kako bi se nadoknadio eventualni manjak svih ostalih faktora. Zatim se određuje APTV sa i bez dodatka APC-a, određuje se omjer iz dobivenih rezultata (APTV sa dodatkom APC / APTV bez dodatka APC uzorku). APCR je obilježena omjerom manjim od zadanog (ovisno o sistemu reagens/analizator određenog laboratorija). Treba imati na umu da 10% pacijenata sa APCR nema FVL, već mutacije kao što su FV-Cambridge, stoga je za kliničku dijagnozu pozitivan funkcionalni test potrebno potvrditi molekularnom analizom FVL. Genetički screening PCR amplifikacijom gena je jedina pouzdana metoda za dokazivanje mutacije G20210A za FII.

INHIBITORI FAKTORA Specifični se inhibitori mogu razviti protiv bilo kojeg faktora koagulacije, što se očituje produženjem PV ili APTV-a. Najčešći su ipak lupus antikoagulant (LA) ili antifosfolipidna antitijela (aPL) te inhibitori na FVIII. Klinički su ti pacijenti visokog rizika za krvarenje. Lupus antikoagulant spada u vrlo raznoliku skupinu inhibitora koji se danas nazivaju antifosfolipidna antitijela. Obično se radi o IgG koji su usmjereni na proteinski dio kompleksa proteina-fosfolipida. In vivo se aPL povezuju sa sklonošću prema trombozi, in vitro produžuju APTV (nema korekcije vrijednosti ako se uzorka razrijeđuje sa normalnom plazmom). Bethesda titar se koristi za određivanje inhibitora FVIII (ali se može modificirati i za određivanje inhibitora na bilo koji drugi faktor). Obično se kod teških hemofiličara izvodi 2 puta godišnje. 10-15% hemofiličara razvija inhibitore na FVIII. Bethesda titar za faktor VIII koristi jednake volumene normalne pool plazme (poznatih aktivnosti FVIII) i pacijentove plazme, miješaju se i inkubiraju 2 sata na 37°C. Dodatno se napravi nekoliko različitih razrijeđenja plazme pacijenta i pool plazme i inkubira. Zatim se FVIII određuje u svim razrijeđenjima. Ako je prisutan inhibitor FVIII, inaktivirat će FVIII normalne plazme u razrijeđenjima, a ostatni se FVIII kvantificira.

S t r a n i c a 143 |

NASLJEDNI I STEČENI ČIMBENICI TROMBOFILIJE TROMBOFILIJA Termin koji označava sklonost razvoju tromboze temeljem nasljednih ili stečenih poremećaja hemostaze koji dovode do protrombotskog stanja (u osnovi se radi o poremećenoj ravnoteži prokoagulantnih i antikoagulantnih reakcija). To je patološko stanje povezano s različitim bolestima (maligne, trudnoća, postpartalno, lijekovi....) ili je genetički uvjetovano. Fiziološka hemostaza se temelji na homeostazi prokoagulantnih i antikogulantnih reakcija. Poremećaj te ravnoteže u smjeru prokoagulantnih procesa naziva se hiperkoagulabilnošću. Trombozom se smatra stvaranje trombocitne i/ili fibrinske mase (tromba) unutar krvne žile. Trombi mogu nastati bilo gdje u cirkulaciji. Njihovo nastajanje ima za posljedicu dva patološka događaja: opstrukcija krvne žile i posljedična ishemija i nekroza tkiva; te stvaranje embolusa koji se odavaja od tromba i smješta u udaljeno mjesto od nastanka izvornog tromba, ali ima isti učinak. Tromboza može biti arterijska (manifestira se kao AIM i CVI) i venska (PE, DVT donjih ekstremiteta, površinska VT). Arterijski trombi nastaju u krvnim žilama gdje je protok brz, nazivaju se bijeli trombi. Sastoje se prvenstveno od fibrina i trombocita. Često nastaju u regijama gdje se stvaraju aterosklerotski plakovi (brzi protok i oštećenje endotela). Tromboza je obično posljedica rupture plaka i izlaganja trombogenog materijala iz subendotela struji krvi. Tradicionalni faktori rizika za nastanak ateroskleroze i arterijskih tromba su hiperkolesterolemija, hipertenzije, pušenje, fizička aktivnost, pretilost i dijabetes. Venski trombi nastaju u uvjetima sporog protoka krvi pa se nazivaju crveni trombi. Primarno se sastoje od eritrocita i fibrina, sa malo leu i trc. Venska je tromboza češća, i to VT donjih ekstremiteta. Mnoge osobe sa trombofilijom ne razviju trombozu, pa stoga trombofiliju treba promatrati u kontekstu drugih faktora rizika za razvoj tromboze ili pokazatelja recidiva tromboze. Venska tromboembolijska bolest (VTE) je bolest sa mnogo uzroka (multifaktorijelna bolest); tromboza je rezultat interakcije gena sa genom i gena s okolinom (operacija, trauma, trudnoća, oralni kontraceptivi). Karakterizirana je stvaranjem ugruška u donjim ekstremitetima ili PE. Pojavljuje se godišnje u 1-3/1000 slučajeva. Nasljedna i stečena stanja povezana sa povećanim rizikom od tromboze:

• Nasljedna: manjak AT, manjak PC, manjak PS, disfibrinogenemija (prisutnost patološkog fibrinogena u plazmi), FV Leiden, mutacija gena za protrombin G20210A

• Stečena: antifosfolipidna antitijela (APL), hiperhomocisteinemija (uzrokovana nasljednim manjkom enzima iz metabolizma homocisteina - polimorfizam gena za MTHFR- ali se može pojaviti zbog slabog unosa prehranom folne i B12), APC rezistencija, povišena aktivnost FVIII, trudnoća, imobilizacija, trauma, postoperativno stanje, starija dob, oralna kontracepcija, malignitet.

Dijagnoza VTE se postavlja na temelju slikovnih tehnika, jer klinička slika i laboratorijski parametri mogu biti dvosmisleni. Od slikovnih tehnika se koristi ultrazvuk, spiralni CT, a za PE pulmonalna angiografija i ventilacijski/perfuzijski scan. Virchow prepoznaje 3 kategorije čimbenika koji se smatraju rizičnima za pojavu VTE i PE. To su:

• Poremećaji u stijenci krvne žile (danas govorimo o oštećenju endotela)

S t r a n i c a 144 |

• Promjene u protoku krvi (staza) • Promjene su sastavu krvi (hiperkoagulabilnost).

Intaktni endotel ima antitrombotski učinak, u mirovanju ne aktivira trombocite i čimbenike koagulacije. Oštećenjem endotelnih stanica dolazi do oslobađanja protrombotskih tvari (TF, TXA2, PAI-1) i gubitka zaštitnih antitrombotskih funkcija (TM / PC aktivacija, heparan sulfat / AT, No i prostaciklin). Nadalje, i poremećaj protoka krvi (staza) ima trombogeni učinak. U stazi ne dolazi do dilucije i otplavljivanja aktiviranih čimbenika sa mjesta aktivacije.

U posljednih je 50-tak godina rasvijetljen mehanizam hemostaze te su identificirani mnogi genetički rizični čimbenici za pojavu VT.

NASLJEDNA TROMBOFILIJA

Pojam koji se odnosi na pojedince sa genetičkim pogreškama koje ih čine sklonijima trombozi. Stupnjevanje rizika za razvoj tromboze u nasljednoj trombofiliji Rizični čimbenici ili povećavaju prokoagulantni potencijal ili se radi o smanjenju u prirodnim inhibitorima hemostaze, a dijele se u tri skupine:

S t r a n i c a 145 |

1. snažni - AT, PC, PS, homozigotni FV Leiden, homozigotni FII 20210 2. umjereni - FV Leiden, FII 20210A, krvna grupa, disfibrinogenemija (prisutnost

fibrinogena gamma 10034T) 3. slabi - MTHFR C677T, FXIII.

Stečena predispozicija za trombozu, kao što je imobilizacija ili trudnoća, može utjecati na genetičke čimbenike i ubrzati akutni trombotski događaj. Kombinacija više od jednog nasljednog čimbenika izrazito ubrzava trombotski proces. Nasljedna se trombofilija obično povezuje sa venskom trombozom. Najčešće su opisani nasljedni čimbenici trombofilije FV Leiden, nedostatak PC, PS i AT te mutacija u genu za FII. Oni su zajedno odgovorni za 30% inicijalnih slučajeva DVT, a pronađeni su 75% obitelji sa trombofilijom. Učestalost nasljedne trombofilije Najrjeđi je manjak prirodnih antikoagulansa (AT, PC i PS) koji se nalazi u manje od 1% opće populacije i manje od 10% bolesnika sa VTE. Nositelji ovih poremećaja imaju 5-8x veći rizik o VTE od opće populacije. FV Leiden prisutan je samo u bjelaca, prevalencija je u općoj populaciji 5% i 18% u bolesnika sa VTE. Rizik je u heterozigota povećan 2-7x, dok je u homozigota rizik veći 40-80x od VTE. Alel sa mutacijom protrombina javlja se u 2% zdrave populacije i 7% bolesnika s VTE. Rizik od pojave VTE je u heterozigota 22x veći. Kombinacija tih nasljednih poremećaja povećava rizik od pojave VTE! Pretraživanje na nasljednu trombofiliju Nije opravdano pretraživanje opće populacije, no iznimke mogu biti FV Leiden i mutacija gena za protrombin u bijelaca. Kandidati za pretraživanje bili bi prvenstveno svi bolesnici sa VTE, neovisno o dobi (stariji ili mlađi od 45) i okolnostima u kojima je došlo do tromboze (provocirana ili ne) i težini kliničke manifestacije. Zatim, sve žene sa komplikacijama u trudnoći osim VTE, sa jednom ili više epizodom ranih ili kasnih gubitaka čeda. Nadalje, sve žene sa preeklampsijom, zastojem rasta fetusa ili abrupcijom posteljice. Kandidati za pretraživanje su i sve asimptomatske osobe koje su rođaci prve linije sa dijagnosticiranim nositeljima trombofilije. Kandidati su i asimptomatske žene s pozitivnom anamnezom na VTE, a prije uzimanja oralnih kontraceptiva, hormonske nadomjesne terapije ili trudnoće. Rezultati testiranja ne mogu utjecati na odluku o terapiji kod akutne epizode VTE, ali mogu utjecati na prevenciju retromboze (sekundarna profilaksa). Ukratko, indikacije za testiranje na nasljednu trombofiliju:

- Pojava učestalih tromboza - Pozitivna obiteljska anamneza - Manje od 45 godina starosti - Idiopatska DVT nogu - Tromboza u trudnoći uz gubitak čeda.

Dijagnostika trombofilija Prva linija pretraživanja na nasljednu trombofiliju uključuje određivanje AT, PC, PS (ukupni i slobodni), APC-rezistenciju, FV Leiden, protrombin G20210A, homocistein. Na taj se način otkriva trećina bolesnika s nasljednim trombofilijama. Homocistein

S t r a n i c a 146 |

otkriva još 10% bolesnika sa trombofilijom - sveukupno 40%. Ispitivanje uključuje plazmatske pretrage (fenotip) i analizu DNA. Određuju se biljezi aktivacije zgrušavanja - D-dimeri su jedini pokazatelj koji se u praksi određuje kao negativni prediktor pojave DVT (povišen je nespecifično i u drugim stanjima). Molekularne analize podrazumijevaju određivanje uzroka trombozi. FV LEIDEN / APC REZISTENCIJA APC rezistencija je fenotipsko ispoljavanje FV Leiden (dakle, genetičkog poremećaja). Analitički je karakterizirana nesposobnošću APC dodanom reakcijskoj smjesi da produži vrijeme zgrušavanja. FV u cirkulaciji dolazi kao jednolančani protein, a aktivira se tako da trombin (ili Xa) cijepa nekoliko peptidnih veza (na položajima 709, 1018, 1545) te dolazi do oslobađanja B domene. Normalni FVa se inaktivira cijepanjem peptidnih veza na položajima 306, 506, 679. u slučaju FV Leiden na položaju 506 dolazi do točkaste mutacije i zamjene ak Arg za Gln, što predstavlja gubitak glavnog mjesta cijepanja za APC. To znači da inaktivacija FV Leiden izostaje, izostaje i inaktivacija FVIII, što dovodi do stanja APC rezistencije ili hiperkoagulabilnosti. FV Leiden odgovoran je za više od 90% slučajeva APCR. APC rezistencija je čimbenik rizika za VT. Učestalost VT kod takvih bolesnika jer 20%, u odabranim obiteljima sa trombofilijom je 50%. Heterozigoti imaju 5x, a homozigoti 50x veći rizik od VT. Zahvaća bijelu populaciju, učestalost u zdravim ispitanicima je 15%. Screening test za FV Leiden je APC rezistencija (koja se temelji na koagulometrisjkim metodama) zato što 10% pojedinaca sa APCR nema FVL mutaciju. Za potvrdu dijagnoze koristi se genetički test PCR-om. NEDOSTATAK PROTEINA C Protein C je o vitaminu K ovisan prirodni inhibitor koagulacije, aktivira se djelovanjem trombina koji se veže za trombomodulin (TM) na površini endotelnih stanica. APC ima antikoagulacijska i profibrinolitička svojstva. Njegov se glavni učinak na inhibiciju koagulacije očituje u specifičnom cijepanju FVa i FVIIIa (time ih inaktivira), uz njegov kofaktor PS i prisutnost kalcija. Redukcija PC na razine oko 50% povećava rizik od VT. Smanjena sposobnost PC da inaktivira FVa i FVIIIa rezultira povećanim stvaranjem trombina i posljedično fibrina. Opisna su dva oblika nedostatka PC: Tip1. - snižena i funkcija i antigena komponenta PC (na razinu od 40-60% od normale); Tip2. - snižena je samo funkcija PC, dok su vrijednosti Ag komponente normalne (kvalitativni poremećaj), a posljedica je više od 160 mutacija. Nedostatak PC se nasljeđuje autosomno dominantno. Učestalost u općoj populaciji je 0.3% HT, u bolesnika sa prvom DVT je 3%, a u odabranim bolesnicima je 6%. Povećava rizik od pojave VT 6-10x u odabranim bolesnicima. Zbog velikog broja nađenih mutacija ne radi se molekularna analiza mutacija već specifični funkcionalni testovi koji mjere funkcionalnu aktivnost i antigenu komponentu PC.

S t r a n i c a 147 |

NEDOSTATAK PROTEINA S Protein S je kofaktor APC. Nalazi se u plazmi u dva oblika: slobodni PS (40%, i fiziološki je aktivan kao kofaktor) i kao dio kompleksa sa C4b vezujućim proteinom (BP) (60%, BP je regulator komplementa). Udio slobodnog PS ovisi o količini C4b vezujućeg proteina u plazmi. Kako je C4b-BP reaktant akutne faze, stanja u kojima dolazi do njegove povećane koncentracije, utječu na sniženu frakciju slobodnog PS, što doprinosi protrombotskom stanju. Nedostatak PS je posljedica delecija i točkastih mutacija u genu za PS, a otkriveno ih je više od 140. Slobodni PS bolje razlučuje heterozigota od normalnog ispitanika zato jer se nedostatak PS (pogotovo blagi) prvo odražava na slobodni oblik. Učestalost heterozigota u zdravoj populaciji je <1%, kod bolesnika sa VTE je 2%, a kod bolesnika sa obiteljskom trombofilijom 6%. Povećava rizik za 6-10x. Urođeni nedostatak PS se pojavljuje u tri oblika:

1. tip I - sniženi ukupni i funkcionalni PS (slobodni) 2. tip II - normalna koncentracija PS (slobodnog i vezanog), ali smanjena

funkcionalna aktivnost (disfunkcija molekule) 3. tip III - normalne razine ukupnog PS, ali smanjena funkcija i frakcija slobodnog

PS (visoka koncentracija C4b-BP u plazmi ili poremećaj vezanja PS za taj transportni protein).

Nađeno je više od 150 mutacija. NEDOSTATAK AT Smatra se prvim identificiranim genetičkim rizičnim faktorom za VT. AT je spori prirodni inhibitor koagulacije pa se udružuje sa heparan sulfatom iz endotela (ili heparinom) koji ga stimulira i ubrzava 1000x njegov inhibitorni učinak. Redukcija AT vrijednosti na 50% predisponira pojedinca na vensku trombozu. Nedostatak AT se dijeli na: TIP I. - rezultat je smanjene sinteze biološki normalnog proteina (kvantitativni defekt); nalazi se snižena aktivnost AT (smanjena funkcija) i snižena Ag-komponenta (snižena koncentracija u plazmi); taj je tip posljedica velikog broja mutacija i vrlo je rijedak. TIP II. - rezultat je specifičnog molekularnog poremećaja u samom inhibitoru (kvalitativni defekt); nalazi se samo smanjena funkcionalna sposobnost AT, a posljedica je mutacija u mjestu za aktivno mjesto (koje veže proteazu) ili mjesto za vezanje heparina. Dakle, funkcije je AT smanjena, dok je Ag-komponenta u principu normalna. Učestalost deficita AT u općoj je populaciji 0.04% (heterozigoti). Povećava rizik za nastanak VT 5-20x. Opisano je više od 200 mutacija. Razna klinička stanja mogu reducirati koncentraciju AT u krvi kao što su jetrene bolesti (smanjena sinteza), akutna tromboza i DIK (povećana potrošnja), te povećani klirens ili gubitak (nefrotski sindrom, povećani klirens davanjem heparina). MUTACIJA U GENU ZA PROTROMBIN (FII 20210A) Točkasta mutacija u genu za protrombin koja je pronađena sekvenciranjem gena. Mutacija se događa na 3' kraju gena za FII u regiji koja se ne prepisuje (zamjena G u A u nukleotidu 20210), pa stoga ne mijenja strukturu protrombina, ali povećava njegovu aktivnost (koncentraciju) za 25% u plazmi. To dovodi do hiperkoagulabilnog stanja. FII 20210 povećava rizik za VT 3-4x. Kako nema funkcionalnog testa, detektira se PCR-om (cijepanje restrikcijskim enzimom).

S t r a n i c a 148 |

Učestalost u zdravih osoba (bjelaca) je 0.7-4%, u bolesnika sa DVTom 6%, u bolesnika sa nerazjašnjenom trombozom 18%. KRVNA GRUPA Pojedinci sa krvnom grupo non-0 imaju 4x veći rizik od tromboze od onih sa krvnom grupom 0. Krvna grupa 0 ima snižene koncentracije vWF, koji je zaštitnik FVIII; nema vWF - snižena koncentracija FVIII - smanjen je rizik od tromboze. POVEĆANA AKTIVNOST FVIII Radi se o mogućem rizičnom čimbeniku ako je aktivnost faktora veća od 150%. To predstavlja 5x veći rizik za DVT od FVIII<100%. U obiteljima sa trombofilijom i FV Leiden, ovaj poremećaj doprinosi ukupnom riziku za VT. POLIMORFIZAM U GENU ZA PAI-1 Najvažniji je insercija/delecija 1 nukleotida, homozigotnost je povezana sa povećanim aktivnostima PAI-1 u cirkulaciji. To posljedično dovodi do smanjene fibrinolize. HIPERHOMOCISTEINEMIJA (HC) Homocistein je ak koja se metabolizira transulfuracijom u cistationin ili remetilacijom u metionin. Glavni enzimi uključeni u te reakcije su cistationin beta sintaza (CBS) i metilen tetrahidrofolat reduktaza (MTHFR). HC je rezultat poremećenog metabolizma homocisteina. Blago povećane koncentracije homocisteina povezane su još nerazjašnjenim mehanizmom sa VTE i trombozom. Smatra se da se glavni učinak homocisteina ostvaruje preko stijenke krvne žile. Identificirane su nasljedne (ali mogu biti i stečene) mutacije u genima za CBS i MTHFR. Najučestaliji uzrok blagoj HC je mutacija u MTHFR genu (nukleotid C677T, zamjena Ala sa Val) Smatra se da su čimbenici kao sniženi TFPI, EPCR i TM uključeni u rizične čimbenike za VT, ali se njihov nedostatak teško dokazuje. Heterozigotnost za neki od navedenih čimbenika rizika ne znači nužno ispoljavanje fenotipa, međutim ukoliko dođe do interakcije više čimbenika rizika ili gena i okolišnih čimbenika, zasigurno će se ispoljiti fenotip. FV Leiden je najčešći, pa onda nedostatak PC ili FII 20210. Rezultati dobiveni dokazivanjem genetički uvjetovane trombofilije koriste se u planiranju trajanja oralne antikoagulantne terapije.

sadržaj - andragog.hr · stranica 5 | proteinske ag. u limfnim se čvorovima zbiva imunološka...

Documents