Rozdział 8

ROZDZIAŁ 8 TECHNIKI ŁĄCZONE W ŚRODOWISKOWEJ

ANALIZIE SPECJACYJNEJ

Brice Bouyssiere,a Ryszard Łobińskia,b i Joanna Szpunara aUMR 5034 CNRS, Hélioparc, 2, av. Pr. Angot, 64 000 Pau, Francja

bKatedra Chemii Analitycznej, Wydział Chemiczny Politechniki Warszawskiej, ul. Noakowskiego 3, 00-664 Warszawa

STRESZCZENIE Uznanie faktu, że chemiczne, biologiczne i toksykologiczne właściwości pierwiastka są w decydującym stopniu zależne od formy, w jakiej dany pierwiastek występuje w próbce, pobudziło gwałtowny rozwój działu analityki chemicznej nazywanego analityką specjacyjną [1]. Podstawowym narzędziem używanym w badaniach specjacyjnych jest połączenie technik chromatograficznego rozdzielania, których zastosowania dają pewność, że każdy analit opuszcza kolumnę osobno, bez żadnej innej towarzyszącej mu formy pierwiastka, ze spektrometrią atomową, zapewniającą czułą i specyficzną detekcję badanego pierwiastka. W rozdziale omówiono ostatnie postępy w zastosowaniu tych właśnie technik łączonych do elektywnego dla danej formy oznaczania: (i) lotnych metaloorganicznych (Sn, Hg, Pb) zanieczyszczeń pochodzenia antropogenicznego oraz (ii) nielotnych związków organicznych metaloidów (As, Se) i kompleksów metali ciężkich

w matrycach środowiskowych. Szczególną uwagę zwrócono na ograniczenia związane z identyfikacją sygnału chromatograficznego, spowodowane niedostępnością wzorców dla wielu form, ze względu na fakt, że duża ilość związków występujących w środowisku nie została jeszcze zidentyfikowana i scharakteryzowana. Przedyskutowano w tym celu potencjalne możliwości zastosowania spektrometrii mas w tym zakresie. 1. WPROWADZENIE Uznanie faktu, że, w chemii środowiska, ochronie zdrowia, żywieniu czy medycynie, chemiczne, biologiczne i toksykologiczne właściwości danego pierwiastka zależą w decydującym stopniu od formy w jakiej ten pierwiastek występuje, pobudziło gwałtowny rozwój działu analityki chemicznej nazywanego analityką specjacyjną [1].Zgodnie z definicją zaproponowaną przez IUPAC formę chemiczną określa się jako specyficzną i unikalną cząsteczkową, elektronową, bądź też jądrową strukturę pierwiastka [1] Specjacja pojedynczego pierwiastka odnosi się do jego występowania lub rozpowszechnienia w różnych formach. Analityka specjacyjna jest zatem postępowaniem analitycznym prowadzącym do identyfikacji i oznaczenia ilość jednej lub większej liczby form chemicznych pierwiastka obecnych w próbce [1]. Połączenie technik chromatograficznego rozdzielania, których zastosowanie daje pewność, że analizowany związek opuszcza kolumnę osobno, bez żadnej innej towarzyszącej mu formy, ze spektrometrią atomową, umożliwiającą czułą i specyficzną detekcję badanego pierwiastka, stało się podstawowym narzędziem w analityce specjacyjnej, co jest omówione w licznych publikacjach przeglądowych [2-7]. W pierwotnym ujęciu [3], przedmiotem analityki specjacyjnej były dokładnie określone anality, zazwyczaj związki metaloorganiczne pochodzenia antropogenicznego

Rozdział 8

163

takie, jak alkiloołów, związki butylo- i fenylocyny, oraz proste formy arsenoorganiczne i selenoorganiczne, jak również produkty ich rozkładu w środowisku. Wzorce niezbędne do kalibracji były dostępne, bądź też mogły być łatwo zsyntezowane. Obecność wiązania kowalencyjnego pomiędzy węglem a metalem (bądź też metaloidem) zapewniała dostateczną stabilność analitu (analitów) na etapie przygotowania próbki. Lotność danej formy pozwalała na zastosowanie techniki chromatografii gazowej z właściwymi jej zaletami takimi, jak wysoka sprawność rozdzielania oraz brak skondensowanej fazy ruchomej, które zapewniały czułą (do poziomu femtogramów) i specyficzną dla pierwiastka detekcję przy użyciu spektroskopii atomowej [8,9]. Wiadomo, że metaloidy takie jak arsen i selen, są metabolizowane przez organizmy żywe w sposób, który prowadzi do powstawania wiązania kowalencyjnego pomiędzy heteroatomem a węglem przyłączonym do większej struktury (np. arsenocukry, selenoproteiny). Mikroorganizmy i rośliny wytworzyły wiele mechanizmów wewnętrznych do kontroli równowagi istotnych dla siebie pierwiastków oraz do radzenia sobie z obciążeniem spowodowanym przez pierwiastki toksyczne [10]. Niektóre rośliny, określane mianem hiperakumulatorów, rozwinęły szczególnie skuteczne mechanizmy utrzymywania homeostazy metali, które pozwalają im żyć i rozmnażać się w środowisku bogatym w metale. Do mechanizmów odpornościowych należą: duże wykorzystanie kwasów organicznych (np. fitynowego, malonowego, cytrynowego, szczawiowego) oraz indukcja i aktywacja enzymów-przeciwutleniaczy [10]. Dobrze znanym mechanizmem usprawniającym akumulację i tolerancję metali ciężkich w roślinach jest wydzielanie przez nie protein i peptydów wiążących metale [11]. W wyniku kompleksowania metali powstaje wiele względnie słabo scharakteryzowanych kompleksów metalicznych. Zrozumienie mechanizmów regulujących detoksykację możliwe jest jedynie dzięki dostępności danych analitycznych co do powstających form pierwiastków. Powstające związki trudno jest przekształcić do postaci lotnej, co nie pozwala na użycie techniki chromatografii gazowej (ang. Gas Chromatography –GC) do ich rozdzielania. Co więcej, dla większości z tych form brak jest odpowiednich, jako że wiele naturalnie syntezowanych związków nie zostało jeszcze zidentyfikowanych i scharakteryzowanych. Dlatego też wyzwania analityczne skłaniają do stosowania technik separacji w fazie ciekłej, takich jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. High-Performance Liquid Chromatography - HPLC) oraz kapilarna elektroforeza strefowa (ang. Capillary Zone Electrophoresis –CZE) z detekcją opartą na wykorzystaniu techniki plazmowej spektrometrii mas (ang. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry –ICP MS) w połączeniu z użyciem technik specyficznych dla cząsteczki, zwłaszcza tandemowej spektrometrii mas z wykorzystaniem jonizacji przez elektrorozpraszanie (ang. Electrospray MS MS –ES MS/MS). W rozdziale omówione zostały ostatnie postępy w stosowaniu technik łączonych do selektywnego dla formy określania:

(i) lotnych metaloorganicznych (Sn, Hg, Pb) zanieczyszczeń pochodzenia antropogenicznegooraz

(ii) nielotnych organicznych związków metaloidów (As, Se) i kompleksów metali ciężkich występujących w matrycach środowiskowych.

Szczególną uwagę zwrócona na ograniczenia związanym z identyfikacją sygnału chromatograficznego, spowodowane brakiem wzorców dla wielu form, jako że wiele naturalnie syntezowanych związków nie zostało jeszcze zidentyfikowanych i scharakteryzowanych. W tym celu przedstawiono również możliwości wykorzystania spektrometrii mas.

Rozdział 8

164

2. FORMY ORGANICZNE METALI I METALOIDÓW W ŚRODOWISKU Interesujące przypadki formy, występowania danego pierwiastka zawierające kowalencyjne wiązanie pomiędzy węglem a metalem (metaloidem), w środowiskowej analityce specjacyjnej mogą być podzielone na następujące kategorie: (i) produkty środowiskowej metylacji rtęci, selenu, arsenu, cyny, bizmutu,

lub karbonylacji molibdenu i wolframu (Mo(CO)6, W(CO) 6), (ii) metaloorganiczne zanieczyszczenia pochodzenia antropogenicznego i produkty

ich degradacji lub transformacji w środowisku. Grupa ta obejmuje czteroalkilowany ołów (EtxMeyPb, x+y = 4), przeciwstukowy dodatek do benzyny, który jest rozkładany do form trójalkilu czy dwualkilu, składniki farb przeciwporostowych, takie jak formy butylo-, oktylo i fenylocyny, przedostające się do środowiska wodnego, oraz produkty ich degradacji lub biometylacji.

(iii) produkty metabolizmu arsenu przez florę i faunę morską (ang. „marine biota”) prowadzące do powstawania wiązania pomiędzy węglem i arsenem, jak np. w aresenobetainie lub arsenocukrach,

(iv) selenoaminokwasy, -peptydy i białka, biosyntezowane przez bakterie, grzyby i rośliny

(v) peptydy wiążące metale, syntezowane enzymatycznie w organizmach żywych narażonych na ekspozycję metali ciężkich (Cd, Cu, ...).

3. TECHNIKI ŁĄCZONE W ANALIZIE SPECJACYJNEJ Odpowiednia technika analityczna do badań specjacyjnych powinna spełniać trzy podstawowe wymagania: (i) selektywność techniki rozdzielania pozwalająca na dotarcie oznaczanych form

analitu do detektora, oddzielonych od potencjalnych interferentów matrycowych i od siebie nawzajem,

(ii) czułość techniki detekcji selektywnej dla pierwiastka lub cząsteczki (niskie stężenia pierwiastków śladowych w badanych próbkach środowiskowych są zazwyczaj rozproszone w postaci wielu form),

(iii) identyfikacja formy chemicznej (zazwyczaj stosowane porownywanie czasu retencji wymaga dostępności odpowiednich wzorców. Gdy wzorce nie są dostępne, konieczne jest użycie techniki detekcji specyficznej dla cząsteczki).

Powyższe zadania realizowane są poprzez techniki łączone, których wybór schematycznie przedstawiono na Rysunku 1. W najczęstszym przypadku technika służąca do rozdzielania mieszanin – chromatografia (gazowa lub cieczowa), elektrochromatografia lub elektroforeza żelowa łączona jest z techniką ICP MS. Łączenie realizowane jest bezpośrednio (dla GC), poprzez rozpylacz (dla kolumnowych technik rozdzielania cieczy) lub poprzez ablację laserową (dla technik planarnych). Kiedy badane formy mają podobne własności fizykochemiczne, wówczas szczególnej uwagi wymaga technika rozdzialu. Chromatografia gazowa jest techniką dominujacą, ze względu na jej wysoką sprawność rozdzielania i możliwość osiągnięcia bardzo niskich granic wykrywalności – dzięki brakowi skondensowanej fazy ruchomej. Dla form nielotnych, najczęstszym wyborem są kolumnowe techniki rozdzielania w fazie ciekłej, takie jak HPLC czy elektroforeza kapilarna (ang. Capillary Electrophoresis –CE), ze względu na łatwość łączenia w układzie on-line oraz różnorodność mechanizmów rozdzielania i dostępnych faz ruchomych, pozwalających na zachowanie oznaczonej formy w stanie niezmienionym. Dwuwymiarowa

Rozdział 8

165

elektroforeza żelowa, ze względu na jej imponującą zdolność rozdzielającą, jest niezastąpiona w przypadku seleno- i fosforoproteomiki. Do detekcji specyficznej dla danego pierwiastka w chromatografii gazowej można użyć różnych spektrometrycznych technik detekcji, np. bezpłomieniowej absorpcyjnej spektrometrii atomowej lub fluorescencji atomowej (dla rtęci), emisyjnej spektrometrii atomowej z wzbudzeniem w plazmie mikrofalowej (dla ołowiu lub cyny). Niemniej jednak, pozycję najbardziej wszechstronnego detektora zajmuje spektrometria mas z wzbudzeniem plazmowym (ang. ICP MS). Jest to praktycznie jedyna technika pozwalająca na oznaczaniue w układzie on-line stężeń pierwiastków śladowych obecnych w eluatach w LC i CE. Absolutne granice wykrywalności na poziomie femtograma mogą okazać się niewystarczające, jeżeli pierwiastek obecny w próbce na poziomie ng/mL rozdzielany jest na kilka form, lub kiedy właściwa ilość badanej próbki jest ograniczona do kilku nanolitrów, jak w przypadku techniki elektroforezy kapilarnej. Izotopowa specyficzność techniki ICP MS oferuje nadal słabo wykorzystany potencjał do badań z wykorzystaniem wskaźników izotopowych i do zwiększenia dokładności w określaniu ilości przy użyciu techniki rozcieńczenia izotopowego.

Trzecim ważnym elementem strategii analitycznej jest identyfikacja i charakteryzacja form metali, bądź tych nowo odkrytych, bądź też tych, dla których wzorce nie są dostępne. Można tego dokonać przy użyciu techniki MS z jonizacją przez elektrorozpraszanie lub z wykorzystaniem spektrometrii mas z wykorzystaniem techniki desorpcji laserowej wspomaganej przez matrycę (ang. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MS - MALDI MS) odpowiednio dla kolumnowych lub planarnych technik rozdzielania. Zaleca się użycie spektrometrii mas czasu przelotu (ang. Time of Flight MS –TOF MS), gdyż dokładność pomiaru Mr rzędu 5-10 ppm pozwala na określenie wzoru empirycznego dla form metali z Mr < 500. Dane strukturalne można uzyskać korzystając z techniki dysocjacji zderzeniowej (ang. Collision Induced Dissociation –CID) jonu wybranego przez kwadrupolowy filtr mas i następujące po niej jonowe skanowanie produktów z wykorzystaniem kwadrupolowego analizatora mas, lub analizatora TOF. Pomimo znacznych udoskonaleń instrumentów analitycznych, do zakończenia charakteryzacji konieczne jest użycie enzymatycznego trawienia selenopolipeptydu przed sekwencjonowaniem aminokwasów przy użyciu techniki ES MS/MS.

4. SELEKTYWNA DETEKCJA PIERWIASTKÓW

W CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

W praktyce, analityka specjacyjna lotnych form metaloorganicznych zdominowana jest przez trzy techniki: chromatografię gazową z mikrofalowym plazmowym detektorem emisyjnym (ang. GC–Microwave Induced Plasma Atomic Emission Detector – GC–MIP AED), chromatografię gazową z plzamową spektometrią mas (GC–ICP MS) i chromatografię gazową ze spektrometrią mas ze wzbudzeniem elektronowym (GC–EI MS). Jedyny wyjątek stanowi oznaczanie metylortęci w próbkach środowiskowych, w którym to przypadku pozycja technik GC–AAS i GC –AFS jest wciąż niezagrożona. Podobnie, choć już w mniejszym stopniu, rzecz się ma z oznaczaniem organocyny, które nadal można pomyślnie wykonać przy użyciu sprzężonej techniki GC–FPD, zwłaszcza gdy używa się ulepszonej wersji pulsacyjnego płomieniowego detektora fotometrycznego. Podczas oznaczania pierwiastków S, F i Cl, których jonizacja w przypadku zastosowania techniki ICP jest niezmiernie trudna, preferuje się technikę MIP AES. Ulepszona optyka jonowa, a co za tym idzie lepsza czułość spektrometrów

Rozdział 8

166

ICP MS kompensuje ten niedostatek, zwłaszcza, że zastosowanie komory zderzeniowej (ang. „collision cell”) może poprawić selektywność.

Rys. 1. Schematyczne ujęcie najbardziej popularnych technik łączonych wykorzystywanych w śladowej analityce specjacyjnej.

Ze względu na dużą zdolność rozdzielczą technik chromatografii gazowej, jak również dobrą czułość i specyficzność techniki ICP MS, połączenie kapilarnej GC z urządzeniem ICP MS stało się doskonałą praktyką metodologiczną w zakresie analityki specjacyjnej związków metaloorganicznych w złożonych próbkach środowiskowych oraz przemysłowych. Faktycznie, cechy charakterystyczne techniki ICP MS, takie jak niskie granice wykrywalności, sięgające poziomu jednego femtograma (1fg), wysoka tolerancja względem matrycy, pozwalająca na bezpośrednią analizę złożonych próbek, jak np. kondensaty gazów naturalnych, oraz zdolność pomiaru stosunków izotopowych, pozwalająca na dokładne oznaczenie ilościowe z wykorzystaniem techniki rozcieńczenia izotopowego, kwalifikują technikę ICP MS, razem ze specyficznymi dla pierwiastków detektorami GC, jako jedną z najlepszych metod analitycznych.

Powadzone są pracę nad udoskonaleniem spektrometru ICP MS, które prowadzą do uzyskania bardziej czułych, mniej podatnych na zakłócenia, mniejszych i tańszych instrumentów, co czyni je coraz bardziej atrakcyjnymi detektorami chromatograficznymi. Wprowadzenie przyrządu ICP - TOFMS zwiększyło szybkość uzyskiwania danych, co pozwoliło na wieloizotopowy pomiar pików

Pomiar natężenia izotopów

(Q, TOF, SF)

Analiza z wykorzystaniem

techniki rozcieńczenia

Detekcja przy pomocy ICP MS

Pomiar stosunków izotopów

(TOF, MC) Badania ze wskaźnikami izotopowymi

Identyfikacja

Rozdzielanie

MALDI MS

MS z elektrorozpraszaniem

Rozpad za źródłem

CID MS (QqQ,

QqTOF)

MS z wychwytem

jonów

FT ICR

Wykluczanie rozmiaru

Wymiana jonowa

Odwrócone fazy

Powinowactwo

HPLC

Kolumna z wypełnieniem

Kolumna kapilarna

Kolumna wielokapilarna

Chromatografia

gazowa

CZE

CEC

MEK

Elektro chromatografia

Rozdział 8

167

chromatograficznych o szerokości mierzonej w milisekundach oraz poprawę precyzji określania stosunków izotopów [12-16]. Niedawno doniesiono o jeszcze większej precyzji dla wielokolektorowych sektorowych specktrometrów masowych, stosowanych jako detektory w przypadku techniki GC w układzie on-line [17,18]. Rozwój instrumentacji idzie w parze z miniaturyzacją aparatury GC, co pozwala na rozłożone w czasie wprowadzenie analitów gazowych do urządzenia ICP, np. opartych na wielokapilarnej mikrokolumnowej GC, a także technik przygotowywania próbek takich, jak wspomagana mikrofalowo mikroekstrakcja do fazy ciekłej lub zautomatyzowane systemy wprowadzania próbek przy użyciu techniki kriowychwytywania w kapilarze [19].

Podstawowym wymogiem dla łącznika (tj. interfejsu) jest możliwość utrzymania gazowej postaci analitów podczas transportu z kolumny GC do urządzenia ICP, tak żeby zapobiec ich kondensacji. Można to osiągnąć albo poprzez ogrzewanie linii przesyłowej w celu uniknięcia zimnych miejsc, albo przy użyciu nośnika w postaci aerozolu. Daje to w rezultacie dwa podstawowe typy struktury łącznika stosowanego w przypadku łączenia technik GC – ICP MS. Można je opisać w następujący sposób: (i) oparty na bezpośrednim połączeniu linii przesyłowej z palnikiem [20]. (komora

rozpylania została usunięta, a linia przesyłowa umieszczona w centralnym kanale palnika).

(ii) oparty na mieszaniu eluatu z GC z wodnym aerozolem w komorze natryskowej przed wprowadzeniem do detektorów plazmowych [17,18].

Bez względu na typ łącznika, istotną rzeczą jest dodatek tlenu do gazu plazmowego w celu uniknięcia osadzania węgla (a czasami również i osadzaniu metali) oraz redukcji piku rozpuszczalnika. Budowa różnych typów łączników została omówiona szczegółowo w pracy [9]. Łączniki dla urządzeń GC–ICP MS są dostępne na rynku. 4.1 Rozwój technik chromatografii gazowej. Chromatografia gazowa na kolumnami z wypełnieniem, stosowana w początkowych badaniach nad połączeniem GC–ICP MS [21, 22], praktycznie ustąpiła już miejsca kapilarnej chromatografii gazowej. Połączenie tej ostatniej z techniką ICP MS zostało po raz pierwszy opisane w publikacjach [23, 24]. Jak wynika z założeń projektowych kolumn pakowanych są one przystosowane do pracy przy wysokim natężeniu przepływu strumienia gazu nośnego i dużych próbkach, ale ich sprawność oraz rozdzielności są gorsze z powodu dużej dyspersji analitów za kolumną. Duża pojemność kolumn wpływa negatywnie na czułość (w sensie wysokości pików) i granice wykrywalności. Samo wypełnienie może być aktywne chemicznie w stosunku do wielu form metaloorganicznych, co wymusza silanizację i zmniejsza wiarygodność wyników. Jednakże, należy zaznaczyć, iż duża ilość prac, zwłaszcza tych opartych na wykorzystaniu techniki wymywania i wychwytywania wytwarzanego wodorku, jest ciągle realizowana przy użyciu chromatografii z kolumną z wypełnieniem, ze względu na łatwość operacji wysoko lotnymi formami analitów w temperaturach poniżej –100ºC [25, 26].

Technika kapilarnej GC oferuje zwiększoną zdolność rozdzielczą w stosunku do połączenia GC (z kolumną pakowaną) z techniką ICP MS. Jest to szczególnie ważne przy rozdzielaniu złożonych mieszanin związków metaloorganicznych obecnych w wielu próbkach środowiskowych. Kapilarna GC pozwala przeciwdziałać współelucji rozpuszczalnika i związków lotnych, takich jak Me4Sn czy Me2Hg, a co za tym idzie pozwala uniknąć lub zminimalizować niekorzystny proces gaszenia się plazmy. Zmniejszona wielkość próbki, wysoki współczynnik rozcieńczenia oraz gaz

Rozdział 8

168

uzupełniający w detektorze, konieczny do dobrania optymalnego natężenia przepływu w spektrometrze, prowadzą jednak w rezultacie do zmniejszonej czułości.

Ostatnio pojawiło się wiele prac na temat szybkiej chromatografii gazowej (ang. Flash GC), w której stosuje się kolumny składające się ze zbioru 900 – 2000 kapilar o małej (20-40 µm) średnicy wewnętrznej. Kolumny takie określa się mianem kolumn wielokapilarnych lub kolumn multikapilarnych (więcej na ten temat w pracy [27]). Taka wiązka kapilar pozwala wyeliminować wady związane zarówno z zastosowaniem kolumn kapilarnych, jak i kolumn z wypełnieniem, a jednocześnie zachować zalety obu typów kolumn. Wielokapilarna GC wyróżnia się dużymi natężeniami przepływu strumienia gazu nośnego, co wpływa na zmniejszenie współczynnika rozcieńczenia i ułatwia transport analitów do plazmy. Sprzężenie techniki wielokapilarnej chromatografii gazowej (ang. MultiCapillary Gas Chromatography - MC GC) z techniką ICP MS przy użyciu nie ogrzewanego łącznika umożliwiło osiągnięcie granic wykrywalności (dla badań specjacyjnych Hg) rzędu 0,08 pg [28].

Interesującą możliwością jest użycie wielokapilarnych mikrokolumn do wprowadzenia próbki do plazmy ICP. W publikacji [20] przedstawiono przykład izotermicznego rozdzielenia form metaloorganicznych przy użyciu mikrokolumn o długości 50 mm, co otwiera drogę do miniaturyzacji modułów GC do wprowadzania próbek, prawdopodobnie czyniąc zbyteczną klasyczny piec chromatografu gazowego. 4.2 Selektywna detekcja pierwiastków w chromatografii gazowej Początkowo stosowana płomieniowa absorpcyjna spektrometria atomowa (ang. Flame Atomic Absorption Spectrometry –FAAS) została wkrótce zaniechana, z powodu niewystarczającej czułości, uniemożliwiającej jej zastosowanie w przypadku analizy próbek rzeczywistych. Jako komory rozpylania zazwyczaj używa się elektrotermicznie ogrzewanej rury kwarcowej [29, 30].

Urządzenie do atomowej spektrometrii fluorescencyjnej (ang. Atomic Fluorescense Spectroscopy –AFS) sprzężone z chromatografem gazowym jest dostępnym na rynku systemem łączonym, pozwalającym na prowadzenie badań specjacyjnych rtęci [31]. Sprzężenie typu GC–AFS jest dogodną metodą badania specjacji rtęci w matrycach środowiskowych, lecz ryzyko powstawania artefaktów z powodu obecności węglowodorów nie pozwala na pomyślne wykorzystanie tej techniki w przypadku próbek charakteryzujacych się bardziej złożonym składem matrycy.

Pomimo problemów z całkowitą eliminacją zakłóceń tła i interferencji węglowodorów, płomieniowy detektor fotometryczny (ang. Flame Photometric Detector –FPD) cieszy się mocną pozycją jako detektor selektywny dla cyny. W celu uniknięcia interferencji od siarki używa się zazwyczaj filtru o przepustowości pasma 600-610 nm. W celu zapobiegnięcia formowaniu się artefaktów, często zwracano uwagę na potrzebę chemicznej eliminacji siarki podczas analizy próbek osadów. [32, 33]. Postępem w zakresie wykorzystania płomieniowego detektora fotometrycznego jest zastosowanie pulsacji płomienia (ang. Pulse FPD –PFPD), który, jak stwierdzono, gwarantuje dziesięciokrotne zwiększenie czułości w detekcji organocyny [34, 35].

W analityce specjacyjnej względnie rzadko używa się spektrometrii mas jonów cząsteczkowych, która jest powszechnie używaną techniką w detekcji z użyciem GC do oznaczania związków organicznych. Pod względem analizy ilościowej największą popularnością cieszyły się spektrometry mas z jonizacją z wykorzystaniem bombardowania za pomocą wiązki elektronów, wykorzystywane w trybie monitorowania pojedynczych jonów (ang. Single Ion Monitoring - SIM), dla którego granice wykrywalności są o dwa rzędy niższe niż w przypadku trybu przemiatania

Rozdział 8

169

całego widma (ang. FullScan). Dla większości związków metaloorganicznych można osiągnąć granice wykrywalności na poziomie poniżej pikogramów w trybie monitorowania pojedynczych jonów.

Detektory plazmowe wypadają korzystnie na tle wymienionych powyżej spektrometrów. Użycie różnych typów plazm do detekcji specyficznej dla danego pierwiastka w eluatach z GC zostało krytycznie omówione w pracy [8]. Praktyczne znaczenie tych badań jest w zasadzie znikome poza wyjątkiem plazmy mikrofalowej.

Technika łączona GC–MIP AED cieszy się niezwykłą popularnością w analizie specjacyjnej antropogenicznych zanieczyszczeń środowiskowych i produktów ich degradacji. Powodem jest uniwersalność oraz granice wykrywalności poniżej poziomu pikogramów, które można uzyskać jeszcze tylko przy pomocy instrumentu ICP MS [8]. Innym czynnikiem znacznie wpływającym na popularność techniki GC–MIP AED jest dostępność odpowiedniej aparatury na rynku.

Zestaw GC–MIP AED oferuje zalety sprawiające, że nadaje się on do zastosowań rutynowych do specjacji związków organicznych cyny i ołowiu w próbkach środowiskowych i metylortęci w próbkach biologicznych. Jest on jednak stopniowo wypierany przez połączenie technik GC i ICP MS. Niższe granice wykrywalności tego urządzenia pozwalają na prostszą procedurę przygotowywania próbek, pracę z bardziej rozcieńczonymi ekstraktami, a nade wszystko czułą analizę specjacyjną próbek o złożonym składzie matrycy. Pozycja techniki ICP MS umocniła się ostatnio dzięki dostępności na rynku odpowiedniego łącznika. Ta technika detekcji omówiona została szczegółowo w dalszej części rozdziału. 4.3 Detekcja z wykorzystaniem techniki ICP MS w chromatografii gazowej Kwadrupolowe analizatory mas należą do najczęściej używanych, a ich czułość poprawiła się w ciągu ostatnich dziesięciu lat dziesięciokrotnie. W pozycji [36] doniesiono o osiągniętej granicy wykrywalności rzędu 0,7 fg, przy użyciu palnika ekranowego z zastosowaniem aparatu HP 4500 i HP 7500. Spośród innych typów analizatorów, w ciągu ostatnich kilku lat szczegółowo badano urządzenia TOF MS jako detektor w technice GC [14-16, 37]. Pojawiają się informacje o zastosowaniu do detekcji w chromatografii sektorowych wysokorozdzielczych spektrometrów mass [17, 18, 38], także wielokolektorowych [17, 18]. 4.3.1 Technika GC – ICP MS -TOF W wyniku pomiaru zależnego od czasu sygnału przejściowego za pomocą skanowania sekwencyjnego przy użyciu kwadrupolowego spektrometru mas (ang. Quadrupole MS –QMS) lub spektrometru sektorowego (z pojedynczym kolektorem) powstają dwa główne typy trudności. Pierwszą jest ograniczona liczba pomiarów natężenia izotopu, jakie mogą być wykonane w granicach rozpiętości czasowej jednego piku chromatograficznego (zwłaszcza w przypadku kapilarnej lub wielokapilarnej GC). Drugim problemem jest błąd ilościowy, znany jako skos widmowy [39], który powstaje podczas pomiaru sąsiednich pików widm masowych, w różnym czasie wzdłuż sygnału przejściowego. Aby zminimalizować te problemy należy zwiększyć ilość punktów pomiarowych w jednostce czasu, oraz dokonać jednoczesnego pomiaru izotopów, których stosunek jest mierzony.

Możliwość uzyskania pełnych widm masy przy wysokiej częstotliwości (typowo > 20 000s-1) czyni z techniki TOF MS prawie idealne narzędzie do detekcji sygnałów przejściowych wytwarzanych w wyniku zastosowania bardzo szybkich technik chromatograficznych. Jednoczesny wybór jonów o wszystkich m/z do analizy mas w technice TOF MS umożliwia eliminację błędów kwantyfikacji wywołanych skosem

Rozdział 8

170

widmowym, redukuje powielanie szumów i czyni z urządzenia TOF MS cenne narzędzie do mierzenia stosunków izotopowych w piku chromatograficznym [14-16, 37]. Podczas gdy niektóre zastosowania układu GC – ICP TOF MS, o których doniesiono do tej pory [14, 15, 37] mogły być łatwo wykonane z użyciem kwadrupolowego analizatora mas, uwidaczniający się potencjał zestawu ICP–TOF MS staje się oczywisty do trzech zastosowań: (i) jako narzędzie diagnostyczne w eksperymentach z użyciem wskaźników

izotopowych, (ii) do badań reakcji frakcjonowania izotopowego w procesach biologicznego

ulatniania się metali, (iii) do faktycznie wielopierwiastkowych (powyżej 3 pierwiastków) badań

przesiewowych na obecność lotnych metali (metaloidów) w próbce Do problemów praktycznych, stawianych przed układem GC – ICP TOF MS należą: (i) potrzeba usunięcia jonów C+ pochodzących z rozpuszczalnika, które w przeciwnym

wypadku przeciążyłyby detektor. Realizowane jest to poprzez opcję odrzucania jonów za pomocą impulsów poprzecznych. Jony są odbijane przy pomocy impulsu o wysokim napięciu, nałożonego prostopadle, w czasie odpowiednim dla odrzucania jonu [15],

(ii) ilość teoretycznie możliwych do rejestracji w ciągu sekundy widm mas jest imponująca, lecz olbrzymia ilość danych zbieranych z tą prędkością wymusza zmniejszenie ich ilości. Szybkość uzyskiwania danych rzędu 200 pojedynczych widm na sekundę została uznana za wystarczającą do uzyskiwania danych co 10 ms. Pozwala to na pomiar wszystkich sygnałów przejściowych za wyjątkiem najkrótszych (o szerokościach piku < 50 ms) [14],

(iii)mniejsza czułość w trybie jednopierwiastkowym w porównaniu z najnowszą generacją kwadrupolowych spektrometrów mas z jonizacją w indukowanej plaźmie (ICP). Minimalna ilość – około 500 pg każdej formy – jest konieczna do pomiaru stosunków izotopów z precyzją lepszą niż 0,5% [16]. Wyraźnie widać ograniczenia systemu zliczającego impulsy, przy wysokościach pików powyżej 2000 jednostek, sięgających przesycenia (dla czasu całkowania 100 ms) [16]. Z drugiej jednak strony, w pracy [15] doniesiono o granicy wykrywalności rzędu 10-50fg dla związków alkiloołowiowych – wartość porównywalna z uzyskiwanymi przy użyciu techniki ICP QMS. Należy podkreślić, iż utrata czułości w trybie jednopierwiastkowym jest kompensowana przez fakt, że ilość izotopów oznaczanych podczas uzyskiwania pojedynczego chromatogramu nie jest już ograniczona rozdzielczością pików (jak w przypadku techniki ICP MS opartej na wykorzystaniu analizatora kwadrupolowy), ponieważ ilość punków danych na jeden pik chromatograficzny nie zależy od liczby badanych izotopów.

4.3.2. Technika GC – ICP MS z zastosowaniem sektorowych analizatorów mas Dotychczas pojawiło się tylko kilka prac omawiających tą technikę [17, 18, 38]. W jednym eksperymencie użyto analizatora mas ze wzbudzeniem w indukowanej plaźmie z podwójnym ogniskowaniem do oznaczania wodorków arsenu i związków organicznych arsenu w gazach emitowanych z mikrokosmosu, po ich rozdzieleniu w kolumnie kapilarnej [40]. Brak doniesień o instrumentalnych granicach wykrywalności, jak również nie zostały pokazane żadne chromatogramy. Te same rozwiązanie zostało zaproponowane do detekcji 32S w oznaczaniu lotnych związków o nieprzyjemnym zapachu w oddechu ludzkim z zastosowaniem techniki chromatografii

Rozdział 8

171

gazowej. Dostępne są informacje o osiągnięciu granicy wykrywalności na poziomie nanogramów [38], gdy użyto elektrody zabezpieczającej w warunkach zimnej plazmy.

Dwa inne doniesienia dotyczyły precyzyjnego pomiaru stosunków izotopowych przy pomocy układu GC–ICP MS z możliwością detekcji wielokolektorowej [17, 18]. Monitorowano jednocześnie cztery izotopy ołowiu, 203Tl, 205Tl (w celu korekcji błędu odchylenia mas) oraz 202Hg (w celu korekcji nakładania się sygnału izobarycznego 204Pb). Instrument z podwójnym ogniskowaniem zastosowany do tego celu pozwalał na osiągnięcie granicy wykrywalności rzędu 1pg dla 207Pb (wprowadzonego w postaci Et4Pb), co jest gorsze od wartości, które uzyskano przy użyciu innych spektrometrów mas takim samym sposobem wzbudzenia analitów [17]. Minimalna rozdzielczość czasowa była ograniczona przez oprogramowanie do 50 ms, a 60 punktów mogło wyznaczyć całkowitą szerokość piku rzędu 3s [17]. Dużo niższe granice wykrywalności uzyskano przy pomocy techniki GC sprzężonej z pojedynczym instrumentem z sektorem magnetycznym, wyposażonym w sześciobiegunową komorę zderzeniową. O wartości 2,9 fg doniesiono dla najbardziej rozpowszechnionego izotopu 208Pb [18]. Wartości przytaczane dla innych izotopów były proporcjonalne do rozpowszechnienia izotopu. 4.3.3. Badania nad zestawem GC – ICP MS z użyciem stabilnych izotopów Zastosowanie wzbogaconych izotopów w przypadku detektorów ICP MS przyniosło niebagatelne korzyści dla rozwoju metodologii specjacyjnej. Specyficzność izotopowa techniki ICP MS otwiera drogę dla stosowania stabilnych izotopów lub form wzbogaconych w stabilne izotopy do badań nad transformacjami i tworzeniem się artefaktów podczas procesów ekstrakcji i derywatyzacji, a także dla wdrażania na szerszą skalę oznaczania ilościowego z wykorzystaniem techniki rozcieńczenia izotopowego. To ostatnie było jeszcze do niedawna ograniczone niedostępnością form metaloorganicznych z pierwiastkiem wzbogaconym izotopowo. Jednakże niedawno dokonano syntezy wzorców dla wzbogaconych izotopowo związków typu Me201Hg [41], MBT, DBT i TBT [42] i przeprowadza się badania nad ich zastosowaniem. Warunkiem użycia technik stabilnych rozcieńczeń jest precyzyjny i dokładny pomiar stosunków izotopowych. Do tej pory dla próbek rzeczywistych używano wyłącznie techniką ICP QMS, ale doniesiono już o dokładności i precyzji dla pomiaru stosunków izotopowych w związkach wzorcowych przy pomocy technik ICP TOF MS [14] i sektrowych spektrometrów wielokolektorowych [17, 18]. Eksperymenty wskaźnikowe można wykonywać przy pomocy techniki ICP QMS, ale do badań frakcjonowania naturalnego ich rozdzelczość może to już nie wystarczyć. 4.3.4. Pomiary stosunków izotopowych Wyznaczanie stosunków izotopowych w przypadku zastosowań techniki GC–ICP MS jest bardziej precyzyjne, jeżeli natężenia izotopów są całkowane po całym piku chromatograficznym, niż gdy stosunek izotopów mierzy się tylko w jednym punkcie piku [43]. Doniesiono o precyzji 1% dla stosunków izotopów Hg wyznaczonych dla MeEtHg eluowanego z kolumny z wypełnieniem z wykorzystaniem techniki GC–ICP MS [44]. Uzyskano również precyzję 0,5% dla Se (po derywatyzacji do piazoselenolu) w przypadku zastosowania techniki GC ICP QMS [43].

W przypadku piku uzyskanego chromatograficznie (GC) dla Me4Sn o szerokości 1 s wyliczono dokładność pomiaru stosunków izotopów cyny na 0,28%, a precyzję na 2,88% [14]. Doniesiono również, że konieczne jest ilość (0,5ng) formy metaloorganicznej do pomiaru stosunków izotopowych z precyzją lepszą niż 0,5%. Najniższą wartość (0,34%) osiągnięto dla Me2SnH2 [16]. Podczas analizy próbek gazu

Rozdział 8

172

ziemnego z wykorzystaniem techniki ICP TOF MS powinno uzyskać w porównywalnych warunkach precyzję o jeden rząd wielkości lepszą od przypadku gdy wykorzystuje się technikę ICP QMS [16]. Przy użyciu jednoczesnego pomiaru wielu jonów, precyzja wyznaczania stosunków izotopowych ulega poprawie [15].

Precyzję pomiarów stosunku izotopowego można również polepszyć poprzez użycie wielokolektorowego sektorowego spektrometru mas. Wartości precyzji odnotowane dla pomiaru stosunku głównych izotopów Pb przy pomocy aparatu z podwójnym ogniskowaniem były lepsze niż 0,07% (dla trzysekundowego sygnału przejściowego), co odpowiadało dokładności 0,35% [17]. Gdy użyto instrumentu z pojedynczym sektorem magnetycznym (z sześciobiegunową komorą zderzeniową i detekcją wielokolektorową) precyzja zawierała się w zakresie 0,02–0,07% dla stosunków rozpowszechnionych izotopów i nastrzyków próbek rzędu 5–50 pg [18]. Po korekcji błędu odchylenia mas, dokładność oznaczenia wahała się przedziale 0,02–0,15% [18].

W celu dokładnych oznaczeń z wykorzystaniem techniki rozcieńczenia izotopowego, musi zostać wzięty pod uwagę efekt zróżnicowania mas. Błąd odchylenia mas wynosił około 0,5% na jednostkę masy.17 Sposobami pomiaru i korekcji tego efektu były: sekwencyjny pomiar stosunku izotopów w próbce i we wzorcu [45] lub dodatek wzorców wewnętrznych, takich jak np. Cd [15, 16] czy Tl [17, 18] oraz jednoczesny pomiar stosunków izotopów 111Cd/113Cd czy 203Tl/205Tl. Z praktycznego punktu widzenia, ten ostatni system wymaga jednoczesnego dostarczenia analitu i wzorca wewnętrznego do przyrządu ICP MS, czego, wobec nielotności form Cd i Tl, można dokonać jedynie poprzez łącznik z komorą rozpylania.

W celu umożliwienia alternatywnego pomiaru stosunków izotopowych analizowanego pierwiastka znajdującego się we wzorcu, zaproponowano komorę dyfuzyjną zawierającą chemicznie czysty pierwiastek, który ma być oznaczony do kalibracji badanych stosunków izotopowych [45]. Składała się ona ze szklanej fiolki przykrytej membraną, która umożliwiała dyfuzję lotnej formy kalibracyjnej do komory przepływowej. Jeśli znane są stosunki izotopowe pierwiastka w związku kalibracyjnym, można skorygować stosunek izotopowy wyznaczony dla rozdzielonych form pierwiastkowych w badanej próbce [45].

4.3.5. Analiza próbek z wykorzystaniem techniki rozcieńczeń izotopowych Metoda rozcieńczeń izotopowych (ang. Isotope Dilution MS –ID MS) jest techniką o dowiedzionej wysokiej dokładności. Źródła błędów systematycznych są dobrze poznane i mogą być eliminowane, co sprawia że technikę ID MS uznaje się jako definitywną technikę analizy. Podstawy technik GC–ICP ID MS w analizie specyficznej dla danej formy związku chemicznego zostały obszernie omówione w opublikowanej pracy [45]. Zaprezentowano je na przykładzie oznaczenia Se(IV) w wodzie po przekształceniu go w piazoselenol [45].

W przypadku stosowania techniki GC–ICP ID MS, do próbki dodaje się badaną formę związku chemicznego, w której jeden z izotopów metalu lub metaloidu został wzbogacony. Po zrównoważeniu dodatku uruchamia się pracę urządzenia GC-ICP MS i dokonuje się pomiaru stosunku izotopowego metalu (metaloidu) w badanej formie. Zasada analizy jest generalnie taka sama, jak w przypadku klasycznej techniki ICP ID MS, niemniej jednak istnieją pewne fundamentalne różnice.

Analiza specjacyjna z wykorzystaniem techniki rozcieńczenia izotopowego jest możliwa tylko dla dobrze określonych co do struktury i składu form pierwiastków. Przed rozdzieleniem, formy pierwiastków nie mogą ulec wzajemnej konwersji i wymianie izotopów. Nie można zagwarantować, że uda się ustalić równowagę

Rozdział 8

173

dodatku i analitu w trakcie prowadzenia oznaczeń z wykorzystaniem tej techniki w przypadku próbek stałych, tak jak można tego dokonać w klasycznej ID MS z jonizacją termiczną poprzez wielokrotne, kolejne cykle rozcieńczenia i odparowania do sucha. Dlatego też wprowadzenie dodatku w formie identycznej z analitem jest niezmiernie trudne, żeby nie powiedzieć niemożliwe do osiągnięcia. Jednakże niektóre zalety są oczywiste, np.: cechujące tę technikę wyrównywanie strat analitu podczas przygotowania próbki, korygowanie niezadowalającego wyniku derywatyzacji oraz tłumienia/podwyższania mocy plazmy. Oznaczanie ilościowe z wykorzystaniem techniki rozcieńczenia izotopowego ID jest najbardziej atrakcyjne w przypadku analityki specjacyjnej złożonych matryc (np. kondensatów gazowych), gdzie różne organiczne składniki próbki ciągle mogą wpływać na zmiany parametrów plazmy, a przez to także i czułość [46].

Formy wzbogacone izotopowo powinny być podstawowym środkiem do specyficznej, dokładnej i precyzyjnej kalibracji instrumentu. Są one nie tylko użyteczne do rutynowego szybkiego oznaczania, ale także pomocne w testowaniu i diagnostyce nowych technik i metodyk analitycznych. Do tej pory przykłady zastosowania technik GC-ICP-ID-MS w analityce specjacyjnej były względnie rzadkie. Oznaczenie dwubutylocyny w próbkach osadów zostało wykonane z wykorzystaniem techniki ID przy użyciu próbki z dodatkiem wzorca (118Sn). Nie były potrzebne żadne korekcje odzysku dla frakcji etylowania w środowisku wodnym czy ekstrakcji analitów do heksanu. Stosunki izotopowe nie wskazywały również na żadne reakcje, które zmieniałyby istniejący układ [47]. Poprzez bezpośrednie butylowanie metalu (119Sn) przygotowano dodatek zawierający jedno- dwu- i trójbutylocynę wzbogaconą w 119Sn i scharakteryzowano z wykorzystaniem techniki odwróconego rozcieńczenia izotopowego, używając naturalnych wzorców jedno-, dwu- i trójbutylocyny. Scharakteryzowany w ten sposób dodatek został użyty do jednoczesnego oznaczenia tych trzech związków butylocyny w próbkach materiałów odniesienia osadów dennych [42]. Przygotowano oznaczone izotopowo formy Me2Hg, MeHgCl i HgCl2 i użyto ich do oznaczenia istotnych form w kondensatach gazowych z granicą wykrywalności na poziomie pikogramów [46]. 4.4 Postępy w przygotowaniu próbek do analizy z wykorzystaniem technik łączonych opartych na chromatografii gazowej Biorąc pod uwagę fakt, że w analityce specjacyjnej etap przygotowywania próbek jest często niełatwym zadaniem, nie dziwi fakt, iż postępy w tej dziedzinie wzbudzają znaczne zainteresowanie. Coraz częstsze wykorzystanie w analityce specjacyjnej technik ekstrakcji za pomocą rozpuszczalnika wspomaganego promieniowaniem mikrofalowym jest także zauważalne, jeżeli chodzi o techniki sprzężone GC–ICP MS [19, 20, 28]. Do najważniejszych postępów w przygotowaniu próbek należą: - wprowadzenie NaBPr4 jako odczynnika do derywatyzacji form metaloorganicznych

[48], - zastosowanie mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej z fazy nadpowierzchniowej (ang.

Headspace Solid-Phase MicroExtraction – HS SPME) [49-54] - próbnika sorpcyjnego na bazie mieszadełka magnetycznego (ang. Stir Bar Sorptive

Extraction - SBSE) [55] - zastosowanie techniki kriowychwytywania kapilarnego do odzysku i wstępnego

wzbogacenia analitów [56, 57].

Rozdział 8

174

4.4.1 Techniki derywatyzacji analitów Pomimo, że niektórzy używają jeszcze klasycznej ekstrakcji za pomocą DDTC w obecności EDTA, a następnie reakcji butylowania w przypadku analizy specjacyjnej związków ołowioorganicznych [58], znaczenia nabrało zastosowanie czteroalkiloboranów, pozwalających na derywatyzację w fazie wodnej, jak np. NaBEt4 dla związków rtęciorganicznych i analizy specjacyjnej organocyny oraz niedawno wprowadzony NaBPr4 dla związków ołowioorganicznych. Synteza NaBPr4 została szczegółowo opisana w pozycji [48]. Zademonstrowano także możliwość jednoczesnego oznaczania Sn, Hg i Pb po reakcji propylowania [48]. Omówiono również powstawanie artefaktów w przypadku przeprowadzenia związków antymonu w wodorki [59].

Godne uwagi są dwa dokładne studia porównawcze. W jednym z nich trzy podejścia do reakcji derywatyzacji –butylowanie w środowisku bezwodnym przy użyciu odczynnika Grignarda, butylowanie w środowisku wodnym za pomocą NaBEt4 oraz reakcja propylowania z NaBPr4 w środowisku wodnym – porównano pod kątem analizy specjacyjnej związków rtęci. [88]. Brak reakcji transmetylowania podczas przygotowania próbki została sprawdzona przy użyciu wzorca nieorganicznego wzbogaconego do 97% w 202Hg [60]. W drugiej pracy, porównano pod kątem możliwości oznaczania selenometioniny przy pomocy techniki GC–ICP MS dwa różne podejścia do derywatyzacji – estryfikacji grupy karboksylowej selenometioniny z użyciem 2-propanolu po acylowaniu grupy aminowej za pomocą bezwodnika kwasu trójfluorowego i jednoczesnej estryfikacji i acylowaniu za pomocą mieszaniny chloromrówczan etylu–etanol. Struktura pochodnej aminokwasu została potwierdzona jednocześnie poprzez zastosowanie techniki GC–MS [61].

Techniki derywatyzacji dla chromatografii gazowej zostały szerzej omówione w pozycji [62]. 4.4.2 Technika zagęszczania analitów z użyciem krioogniskowania kapilarnego Opisany został półautomatyczny kompaktowy łącznik do rozłożonego w czasie wprowadzania analitów gazowych z roztworów wodnych do urządzenia ICP MS bez potrzeby zastosowania pełnowymiarowego pieca GC [56]. Zasada działania tego modułu aparaturowego oparta była na wymywaniu gazowych analitów przy pomocy strumienia gazu obojętnego, osuszaniu strumienia gazowego przy użyciu 30cm cylindrycznej membrany wykonanej z tworzywa „Nafion” (długość 30 cm), wychwytywaniu związków w kapilarze pokrytej grubą warstwą fazy stacjonarnej i ich izotermicznym rozdzielaniu na kolumnie wielokapilarnej (po etapie uwolnienia pułapki kapilarnej). Doniesiono o uzyskaniu ilościowego odzysku analitów z próbek o objętości rzędu 50 mL [56, 57, 63]. 4.4.3 Mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej (SPME) Mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej jest techniką wstępnego wzbogacania analitów, opartą na sorpcji analitów obecnych w fazie ciekłej, lub też, częściej, w nadpowierzchniowej fazie gazowej, na mikrowłóknie pokrytym warstwą sorbenta chromatograficznego i zamkniętym w mikrostrzykawce. Analit zaadsorbowany na warstwie sorbenta lub filmie fazy stacjonarnej zostaje przemieszczony do dozownika GC, gdzie zostaje poddany desorpcji termicznej. Technika SPME jest coraz bardziej popularnym narzędziem analitycznym do specjacji pierwiastkowej w próbkach środowiskowych i biologicznych [54]. Ta bezrozpuszczalnikowa technika oferuje wiele zalet, jak np. prostota operacji, użycie małej ilości fazy ciekłej, niskie koszty i kompatybilność z procedurami analitycznymi w układach on-line.

Rozdział 8

175

Technika SPME oparta jest przykładem techniki, gdzie wykorzystuje się równowagę pomiędzy stężeniami analitów w fazie nadpowierzchniowej i w warstwie sorbenta lub fazy stacjonarnej pokrywającej włókna ekstrakcyjne. Dlatego też niskie sprawności ekstrakcji są wystarczające do oznaczenia ilościowego, lecz ilość dostępnego analitu może być bardzo mała. Stąd też zainteresowanie połączeniem wysokiej czułości GC–ICP MS z techniką SPME.

Pierwsze praca na temat techniki SPME–GC–ICP MS dotyczyła specjacji związków rtęcioorganicznych, ołowiowoorganicznych i cynoorganicznych poddanych etylowaniu in-situ za pomocą NaBEt4 i zaadsorbowanych z fazy nadpowierzchniowej na włóknie z topionej krzemionki pokrytym warstwą polidimetylosiloksanu. Wykorzystanie techniki SPME do pobierania próbek z fazy nadpowierzchniowej, w której użyto włókna z warstwą polidimetylosiloksanu o grubości 100 µm w warunkach nierównowagowych, została zoptymalizowana jako metoda ekstrakcji/wstępnego wzbogacania pozostałości trifenylocyny w wodorotlenku tetrametyloamoniowym (ang. TetraMethylAmmonium Hydroxide – TMAH) i ekstraktów KOH-EtOH z próbek ziemniaków i małży [51]. Przebadano wariant zastosowania techniki SPME do bezpośredniego pobrania próbek z fazy wodnej, lecz czułość okazała się być o rząd wielkości niższa. Doniesiono o granicy wykrywalności 2pg L-1 dla roztworu wodnego, ale wartość 125 pg L-1 przypisano ekstraktowi próbki odpowiadającemu granicy wykrywalności dolnego zakresu ng/g (suchej masy) [51]. W jeszcze innej pracy uzyskano nieznacznie niższe granice wykrywalności (0,6 - 20 pgL-1) [64].

Bezpośrednie połączenie techniki SPME z urządzeniem ICP MS zostało opisane na przykładzie oznaczania metylortęci [53]. Włókno umieszczano w dozowniku GC (bez podziału strumienia), umieszczonego bezpośrednio przy podstawie palnika. W przypadku pobierania próbek analitów z fazy nadpowierzchniowej uzyskiwano nieco mniejszą czułość niż w przypadku pobierania próbek bezpośrednio z fazy ciekłej. W tym drugim przypadku uzyskiwano jednak większy zakres liniowości. Na skuteczność zastosowania techniki SPME w układzie bezpośrednim poważny wpływ ma skład matrycy, czego wynikiem może być aż 70-krotne zmniejszenie czułości [53]. 5. CHROMATOGRAFIA CIECZOWA Z DETEKCJĄ ICP MS Wiele interesujących z punktu widzenia środowiskowej analityki specjacyjnej form pierwiastków nie występuje w stanie lotnym i nie da się przekształcić do tej postaci poprzez reakcję derywatyzacji. Są to praktycznie wszystkie kompleksy koordynacyjne metali śladowych, ale także liczne związki metaloorganiczne (zawierające kowalencyjnie związany metal lub metaloid). Dla wszystkich tych form, wysokosprawna chromatografia cieczowa jest najważniejszą techniką rozdzielania przed zastosowaniem selektywnej detekcji pierwiastków.

Różnorodne możliwości łączenia w trybie on-line techniki rozdzielania z detektorem specyficznym dla (formy) pierwiastka do selektywnej dla danej formy analizy związków metalicznych pochodzenia biologicznego obejmują różne warianty techniki HPLC oraz elektroforezy, jeśli chodzi o rozdzielanie, oraz atomową spektrometrię mas (lub cząsteczkową), jeśli chodzi o etap detekcji analitów. Obecność metalu związanego z biomakrocząsteczką w próbce jest uważana za warunek użycia detektora specyficznego w stosunku do pierwiastków.

Wybór typu łączenia głównie od celu zamierzonych badań. Część układu łączonego, której zadaniem jest rozdzielanie analitów staje się szczególnie ważna, gdy

Rozdział 8

176

konieczne jest uzyskanie dużego stopnia specyficzności dla danej formy pierwiastka. Konieczne może być również szeregowe połączenie dwóch lub większej ilości technik rozdzielania po to, żeby zapewnić że specyficzna forma pierwiastka pojawi się w określonym czasie w detektorze. Natomiast wybór części detekcyjnej układu sprzężonego staje się kluczowa, kiedy ilość analitu jest bardzo mała, konieczna jest wysoka czułość oznaczenia – najbardziej popularnym wyborem jest technika ICP MS. Ważnym problemem staje się często wybór łącznika pomiędzy urządzeniem chromatograficznym a spektrometrem, jako że warunki rozdzielania mogą być niekompatybilne z warunkami wymaganymi przez detektor – w kategoriach natężenia przepływu strumienia i składu fazy ruchomej.

W odróżnieniu od analityki specjacyjnej [65] zanieczyszczeń pochodzenia antropogenicznego (realizowanej głównie poprzez zastosowanie techniki GC– MS), dla których wzorce analityczne są łatwo dostępne, większość form interesujących z punktu widzenia biologiczno-środowiskowej analizy śladowej nie zostało jeszcze wyodrębnionych jako dostatecznie czyste, żeby można ich było używać jako wzorców dla czasu retencji. Dlatego też, coraz bardziej istotne staje się jednoczesne używanie detektora specyficznego dla cząsteczki, w celu dokonania identyfikacji wymywanych związków. Możliwym wyborem jest również spektrometria mas: z jonizacją przez bombardowanie za pomocą szybkich atomów (ang. Fast Atom Bombardment – MS FAB MS) [66-68], techniką elektrorozpraszania (ES MS) [69-72] czy za pomocą techniką desorpcji laserowej z wspomaganej matrycą (MALDI TOF MS) [73]. 5.1. Połączenie HPLC – ICP MS Podstawowe mechanizmy rozdzielania w przypadku techniki HPLC wykorzystywane w środowiskowej analityce specjacyjnej obejmują proces wykluczania, wymianę jonową oraz chromatografię w odwróconym układzie faz. Elektroforeza kapilarna jest techniką mniej rozwiniętą, ale oferującą znakomite możliwości do celów analizy specjacyjnej, dzięki wysokiej zdolności rozdzielczej, wymogowi niewielkiej ilości próbki (na poziomie nanolitrów) i brak wypełnienia podatnego na interakcje z metalami i mogącego wpływać na równowagę reakcji kompleksowania [74-76]. Połączenie przepływu elektroforetycznego i elektroosmotycznego umożliwia rozdzielenie szerokiego wachlarza jonów dodatnich i ujemnych oraz neutralnych związków w trakcie jednej analizy. Złożoność matrycy biologicznej może wymagać zastosowania dwóch lub większej ilości mechanizmów rozdzielania połączonych szeregowo, w celu zapewnienia, że specyficzna forma metalu znajdzie się w danym czasie w detektorze.

Zastosowanie kwadrupolowego analizatora mas na etapie detekcji przy użyciu techniki ICP MS jest tu najbardziej rozpowszechnionym podejściem. Najnowsza generacja urządzeń pomiarowych oferuje dla przypadku wielu pierwiastków absolutne granice wykrywalności na poziomie sub-femtogramowym. Nakładanie się jonów izobarycznych nie stanowi w zasadzie problemu, dzięki oddzieleniu w układzie on-line od potencjalnych substancji zakłócających, jak np. Cl (40Ar35Cl) w przypadku oznaczania 75As, ale piki „duchy” (ang. ghost peaks) mogą się pojawiać. Zastosowanie instrumentu o podwójnym ogniskowania oferuje większą rozdzielczość, która może być konieczna do bezinterferencyjnego oznaczenia siarki czy arsenu. Jednakże zwiększenie rozdzielczości nieuchronnie kończy się radykalnym zmniejszeniem czułości. Należałoby również zauważyć, iż czułość najnowszej generacji urządzeń kwadrupolowych jest tylko 2-3-krotnie niższa od wysokiej rozdzielczości w przypadku urządzenia ICP MS pracującego w trybie niskiej rozdzielczości. Dobrym kompromisem pomiędzy czułością, brakiem zakłóceń izobarycznych oraz ceną są coraz bardziej popularne aparaty ICP MS wyposażone w komorę zderzeniową [77].

Rozdział 8

177

Kluczem do udanego połączenia HPLC/CE–ICP MS jest odpowiedni łącznik. W najprostszym przypadku wyjście kolumny (4,6-10 mm) HPLC połączone jest z konwencjonalnym pneumatycznym lub krzyżowym rozpylaczem (nebulizatorem). Użycie układów HPLC z tradycyjnymi kolumnami kapilarnymi lub kolumnami o średnicy wewnętrznej (0,32–1,0mm), które stają się coraz bardziej popularne, zwłaszcza dzięki zastosowaniu chromatografii faz odwróconych, wymaga zastosowania mikrorozpylaczy – albo z wprowadzaniem bezpośrednim (ang. Direct injection nebulizer - DIN), wysokoefektywny rozpylacz do bezpośredniego nastrzyku (ang. Direct Injection High Efficiency Micronebulizer - DIHEN), albo też mikrorozpylaczy (np. Micromist) z komorą mgielną o małej objętości. Połączenie urządzeń CE i ICP-MS jest bardziej skomplikowane. Problemy powstające z powodu występowania przepływu warstwowego, wywołanego przez efekt zasysania rozpylacza, straty czułości z powodu rozcieńczenia strumienia przepływu elektroosmotycznego przez strumień płynu uzupełniającego (pomocniczego), oraz zjawisko poszerzania pików w komorze rozpylania, zostały rozwiązane w dostępnym na rynku łączniku opartym na samozasysającym mikrorozpylaczu z całkowitym zużyciem, wyposażonym w komorę mgielną o małej objętości [78, 79]. 5.2. Przygotowywanie próbek Rozpuszczalne ekstrakty z tkanek i komórek hodowlanych przygotowywane są poprzez homogenizację próbki w odpowiednim buforze. Do ekstrakcji używa się zazwyczaj buforów obojętnych, gdyż Zn zaczyna dysocjować od kompleksów proteinowych przy pH 5. Anality takie, jak Cd i Cu są wymywane przy niższych wartościach pH. Najpopularniejszym wyborem jest bufor 10–50 mM Tris-HCl o pH z przedziału 7,4–9.

Przed wprowadzeniem do kolumny chromatograficznej wymagana jest filtracja cytozolu przy użyciu filtru 0,45 µm, lub lepiej 0,22 µm. Należy również zastosować kolumnę ochronną, w celu zabezpieczenia kolumny analitycznej przed lipidami z tkanek zwierzęcych, które mogłyby obniżyć skuteczność rozdzielania. Chromatograficzne rozdzielenie związków metali powinno być często poprzedzone kilkoma technikami bioanalitycznymi, takimi jak ultrawirowanie, mikrodializa czy strącanie za pomocą siarczanu amonu.

Niskie wydajności procesu wymywania wodnego dla pewnych form związków i próbek zachęciły niektórych naukowców do zastosowania bardziej agresywnych środków wymywających. Często konieczny jest kompromis pomiędzy odzyskiem ze stałych matryc a zachowaniem pierwotnej formy związku.

Celuloza i złożone, nierozpuszczalne w wodzie polisacharydy pektynowe stanowią główną matrycę osadu nierozpuszczalnego w wodzie po odwirowaniu homogenatów roślinnych. Dlatego też, konieczne jest użycie enzymów pektolitycznych w celu rozpuszczenia próbki stałej. Wiadomo, że pektynoliza łatwo powoduje degradację dużych cząstek wielocukrów pektynowych, lecz niektóre z nich, np. ramnogalakturonian-II, są uważane za odporne na działanie enzymów [80]. Doniesiono o kombinacji preparatów handlowych – Rapidase i Pectinex– do uwalniania kompleksów metalicznych ze stałych części roślin jadalnych, owoców i warzyw [80]. Ekstrakcja związków selenu ze wzbogaconych w selen drożdży przy pomocy mieszaniny zawierającej enzym rozkładający białka umożliwiła odzysk różnych form Se rzędu 85% – większości w postaci selenometioniny [81].

Rozdział 8

178

5.3 Zastosowanie spektrometrii mas z elektrorozpraszaniem w badaniach specjacyjnych Niebagatelnym wyzwaniem dla analityki specjacyjnej jest dostęp do danych strukturalnych, niezbędnych do identyfikacji znanych bądź też nowoodkrytych związków, tym bardziej, że coraz wyższa czułość aparatów ICP MS nieuchronnie przyczyni się do zwiększenia liczby wykrytych form metali i metaloidów. Istnieje kilka nowych publikacji wykazujących potencjalne możliwości, jakie niesie ze sobą spektrometria mas z jonizacją przez elektrorozpraszanie (ESI MS) do precyzyjnego określania masy cząsteczkowej i do strukturalnej charakteryzacji cząsteczek obecnych w ilościach śladowych w próbkach o złożonym składzie matrycy. Ta przewaga powoduje powstawanie coraz większej liczby doniesień o komplementarnej roli techniki ESI MS w stosunku do technik ICP MS w identyfikacji form, po frakcjonowaniu wstępnym z użyciem metod chromatograficznych z selektywną detekcją pierwiastka. Jednakże zastosowanie techniki ESI w ten sposób stawia dużo większe wyzwania, ze względu na charakterystycznie niskie stosunki sygnału do szumu i sygnału do tła, jak również bardziej skomplikowaną chemię jonową fazy gazowej niż ta która jest zazwyczaj spotykana w przypadku techniki ICP. Te różne aspekty spektrometrii mas z jonizacją przez elektrorozpraszanie użytej do analizy specjacyjnej zostały omówione w pracach [82, 83].

Cząsteczki zawierające wiązanie węgiel–metal (metaloid) zazwyczaj łatwo ulegają jonizacji z wytworzeniem jonów o jednym protonie w źródle elektroaerozolu, co teoretycznie powinno umożliwić identyfikację analitu na podstawie masy cząsteczkowej. Jednakże w trybie infuzji, przypisanie sygnału o danym stosunku m/z do konkretnej formy pierwiastkowej jest zadaniem praktycznie niemożliwym w przypadku pierwiastków monoizotopowych, takich jak arsen. Niemniej jednak, jeśli pierwiastek oferuje charakterystyczny układ izotopowy, taki jak Se [84–90] czy Sn [91, 92], łatwiej jest go rozpoznać w widmie mas roztworu próbki, pod warunkiem, że sygnał nie jest tłumiony przez składniki matrycę.

Większą pewność odnośnie identyfikacji danych form można uzyskać dzięki fragmentacji protonowanego jonu cząsteczkowego (oddzielonego na etapie pierwszego filtru mas) poprzez dysocjację zderzeniową (ang. Collision Induced Dissociation –CID) i następującą po niej spektrometrię mas uzyskanych jonów. Tryb MS/MS umożliwił identyfikację związków arsenoorganicznych w ekstraktach z glonów oczyszczonych poprzez zastosowanie techniki SE HPLC [93]. Dla form zawierających pierwiastek z więcej niż jednym stabilnym izotopem, (jak np. Se), cenne dane mogą być uzyskane poprzez fragmentację dwóch protonowanych jonów cząsteczkowych, zawierających najbardziej rozpowszechnione sąsiednie izotopy (78Se i 80Se). Fragmenty zawierające selen będą oddzielone odległością dwóch jednostek, natomiast te, które nie zawierają selenu pozostaną przy takiej samej wartości m/z, co ułatwi interpretację widm mas [84].

Interpretacja widm mas staje się łatwiejsza z użyciem techniki ES MS jako detektora chromatograficznego [87, 89, 94, 95] lub elektroforetycznego [96–98]. Wykorzystanie dysocjacji wzbudzonej kolizjami w źródle pozwala na użycie techniki ES MS jako detektora selektywnego na poszczególne pierwiastki [99]. Opcja pierwiastkowa techniki ES MS jest wolna od licznych wieloatomowych interferencji obecnych w ICP MS. Granice wykrywalności są jednak o 2-3 rzędy wielkości wyższe niż w przypadku technikiICP MS.

Rozdział 8

179

5.4 Wielowymiarowa strategia analityczna do identyfikacji fitochelatyn w próbkach materiału roślinnego W przypadku próbek biologicznych ze względu na złożoność procesu specjacji pierwiastkowej, często konieczne jest połączenie kilku różnych mechanizmów rozdzielania, w celu wyodrębnienia interesującego związku przed jego charakteryzacją z wykorzystaniem technik MS z elektrorozpraszaniem. Podejście to zostało pomyślnie zastosowane do charakteryzacji fitochelatyn w roślinach narażonych na obciążenie metalami ciężkimi [100-103]. Fitochelatyny są krótkimi peptydami bogatymi w grupy tiolowe o ogólnej strukturze: (γ-GluCys)n-Gly, gdzie n = 2–11, indukowanymi przez metale. Są one syntezowane z glutationu przez rośliny i grzyby narażone na ekspozycję jonów metali: Cd2+, Cu2+ i Zn2+. Metale ulegają chelatowaniu w wyniku koordynacji z grupą tiolową w cysteinie. Dwie podstawowe struktury fitochelatyn opisane w literaturze to: kadystyna A (γ-EC)3G i kadystyna B (γ-EC)2G, gdzie jednostka γEC – oznacza – γ-Glu-Cys.

Czas migracji, min

x 10 7

5 10 15 20 25

2.0

4.0

6.0

8.0

x 10 6

17.11 min 786.3

400 500 600 700 800 900 m/z, u

0.5

1.5

Inten

sywn

ość s

ygnału

0 5 10 15 20 25 30Czas, min

0,4

0,8

1,2

1,6

x 10 5 (a) SEC - ICP MS

(b) CZE - ES MS

(c) ES MS

x 10 7

5 10 15 20 25

2.0

4.0

6.0

8.0 x 10 7

5 10 15 20 25

2.0

4.0

6.0

8.0

x 10 6

17.11 min 786.3

400 500 600 700 800 900 m/z, u

0.5

1.5

x 10 6

17.11 min 786.3

400 500 600 700 800 900 m/z, u

0.5

1.5

0 5 10 15 20 25 30

0,4

0,8

1,2

1,6

x 10 5 (a) SEC - ICP MS

(b) CZE - ES MS

(c) ES MS

Inten

sywn

ość s

ygnału

Inten

sywn

ość s

ygnału

Rys.2: Strategia analityczna pozwalająca na bezwzorcową identyfikację fitochelatyn w ekstraktach roślinnych: (a) zastosowane techniki HPLC–ICP MS do detekcji frakcji zawierającej metale ciężkie (kadm), (b) wykorzystanie techniki CE – ES MS do rozdzielania pojedynczych form, (c) uzyskane wyniki zastosowania techniki ES MS uzyskane przy wierzchołku piku umożliwiające wyznaczenie masy cząsteczkowej badanej formy.

Rozdział 8

180

γ Glu

Cys Cys

Cys Cys β Ala

1

2

3

4

x 10 4

y fragmenty

b fragmenty

(d) ES MS/MS

( γ Glu - Cys ) 3 ( β Ala )

iso-Phytochelatin (3) - (β Ala)

( γ Glu - Cys ) 3 ( β Ala )

iso-Phytochelatin (3) - (β Ala)

(e) wzór

0 100 200 300 400 500 600 700 800 m/z

786

657

554

425

322

193

768 697 594

465

362

233

γ Glu γ Glu γ Glu

γ Glu γ Glu

Cys Cys

Cys Cys β Ala

1

2

3

4

x 10 4

(d) ES MS/MS

( γ Glu - Cys ) 3 ( β Ala )

iso-Phytochelatin (3) - (β Ala)

( γ Glu - Cys ) 3 ( β Ala )

izo-Fitochelatyna (3) - (β Ala)

Inten

sywn

ość s

ygnału

(TIC

)

Rys. 2: Strategia analityczna pozwalająca na bezwzorcową identyfikację fitochelatyn w ekstrakcie roślinnym: (d) widmo mas uzyskane w wyniku zastosowania techniki ES MS/MS dla sygnału pokazanego powyżej (c) pozwalające wyznaczyć strukturę związku, (e) wzór zidentyfikowanej formy. Pojedyncze związki obecne w ekstraktach uzyskanych z soi wyodrębniane są przy użyciu dwuwymiarowego systemu (Rys. 2) obejmującego chromatografię wykluczenia sprzężoną z techniką ICP – MS (Rys. 2A), oraz następującą po niej elektroforezę kapilarną (Ryc. 2b). Wyodrębnione odmetalizowane formy analizowane są przy użyciu techniki MS z elektrorozpraszaniem (Rys. 2c). Potwierdzenie identyfikacji lub identyfikację nieznanego związku można przeprowadzić przy pomocy techniki CID MS (Rys. 2d). Szereg izoform fitochelatynowych można zidentyfikować bez potrzeby wiarygodnych wzorców czasu retencji. Ten przykład bezwzorcowej analizy w próbkach środowiskowej materii ożywionej ilustruje użyteczność tandemowej spektrometrii mas w badaniach specjacyjnych próbek środowiskowych. 6. WNIOSKI Chromatografia gazowa z detekcją ICP MS osiągnęła swoją dojrzałość jako technika analityczna do oznaczania form metaloorganicznych obecnych w próbkach o różnym składzie matrycy. Wykazuje się ona zaletami porównywalnymi z techniką GC–MIP AED w zastosowaniach standardowych takich, jak analiza specjacyjna związków rtęcio-, ołowio- i cynoorganicznych w próbkach środowiskowych, ale posiada przewagę w przypadkach, gdzie wymagane są bardzo wysoka czułość, wielopierwiastkowe badania przesiewowe, precyzyjne pomiary stosunków izotopowych oraz analiza próbek charakteryzujących się złożonym składem matrycy.

Droga do charakteryzacji endogennych form metaloorganicznych w systemach biologicznych zostaje otwarta dzięki osiąganiu niższych granic wykrywalności techniki ICP MS, dostępności skutecznych łączników do HPLC i elektroforezy kapilarnej, a także coraz większej czułości urządzenia MS z elektrorozpraszaniem do specyficznej dla detekcji cząsteczek na poziomie stężeń śladowych. Rozwój metod analitycznych do biochemicznej analityki specjacyjnej przebiega na skrzyżowaniu zainteresowań wielu dyscyplin naukowych, i może skorzystać z tego interdyscyplinarnego podejścia równie wielce jak ucierpieć z jego braku. Nie ma wątpliwości, iż żeby stawić czoła złożoności

Rozdział 8

181

składu matryc próbek biologicznych, techniki wielowymiarowego rozdzielania i detekcji z wykorzystaniem spektrometrii mas są niezastąpione. LITERATURA [1.] Templeton D.M., Ariese F., Cornelis R., Danielsson L.G., Muntau H., Van Leeuwen H.P. and

Lobinski R., Pure and Applied Chemistry, 72, 1453-1470, (2000) [2.] Wang J.S., Tomlinson M.J. and Caruso J.A., Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 10, 601-

607, (1995) [3.] Lobinski R., Applied Spectroscopy, 51, A260-A278, (1997) [4.] Zoorob G.K., McKiernan J.W. and Caruso J.A., Mikrochimica Acta, 128, 145-168, (1998) [5.] Caruso J.A., Ackley K.L. and Sutton K.L., Introduction in: Elemental Speciation. New approaches

for trace element analysis, J.A. Caruso, K.L. Ackley and K.L. Sutton (eds), vol XXXIII, Elsevier, Amsterdam, 2000, 1

[6.] Szpunar J., Analyst, 125, 963-988, (2000) [7.] Cornelis R., Heumann K.G., Caruso J.A. and Crews H., Introduction in: Handbook of Elemental

Speciation, R. Cornelis, K.G. Heumann, J.A. Caruso and H. Crews (eds), vol.1, Wiley-VCH, 2003 [8.] Lobinski R. and Adams F.C., Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy, 52, 1865-1903,

(1997) [9.] Bouyssiere B., Szpunar J. and Lobinski R., Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy, 57,

805-828, (2002) [10.] Prasad M.N.V. and Hagemeyer J. (Eds.), Heavy Metal Stress in Plants - From

Molecules to Ecosystem, Springer, Heidelberg, 1999 [11.] Mejare M. and Bulow L., Trends in Biotechnology, 19, 67-73, (2001) [12.] Pack B.W., Broekaert J.A.C., Guzowski J.P., Poehlman J. and Hieftje G.M., Analytical Chemistry,

70, 3957-3963, (1998) [13.] Vanhaecke F. and Moens L., Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 364, 440-451, (1999) [14.] Leach A.M., Heisterkamp M., Adams F.C. and Hieftje G.M., Journal of Analytical Atomic

Spectrometry, 15, 151-155, (2000) [15.] Heisterkamp M. and Adams F.C., Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 370, 597-605, (2001) [16.] Haas K., Feldmann J., Wennrich R. and Stark H.J., Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 370,

587-596, (2001) [17.] Krupp E.M., Pecheyran C., Meffan-Main S. and Donard O.F.X., Fresenius Journal of Analytical

Chemistry, 370, 573-580, (2001) [18.] Krupp E.M., Pecheyran C., Pinaly H., Motelica-Heino M., Koller D., Young S.M.M., Brenner I.B.

and Donard O.F.X., Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy, 56, 1233-1240, (2001) [19.] [ Lobinski R., Pereiro I.R., Chassaigne H., Wasik A. and Szpunar J., Journal of Analytical Atomic

Spectrometry, 13, 859-867, (1998) [20.] Rodriguez I., Mounicou S., Lobinski R., Sidelnikov V., Patrushev Y. and Yamanaka M., Analytical

Chemistry, 71, 4534-4543, (1999) [21.] Vanloon J.C., Alcock L.R., Pinchin W.H. and French J.B., Spectroscopy Letters, 19, 1125-1135,

(1986) [22.] Chong N.S. and Houk R.S., Applied Spectroscopy, 41, 66-74, (1987) [23.] Kim A., Hill S., Ebdon L. and Rowland S., Hrc-Journal of High Resolution Chromatography, 15,

665-668, (1992) [24.] Kim A.W., Foulkes M.E., Ebdon L., Hill S.J., Patience R.L., Barwise A.G. and Rowland S.J.,

Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 7, 1147-1149, (1992) [25.] Amouroux D., Tessier E., Pecheyran C. and Donard O.F.X., Analytica Chimica Acta, 377, 241-254,

(1998) [26.] Pecheyran C., Amouroux D. and Donard O.F.X., Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 13,

615-621, (1998)

Rozdział 8

182

[27.] Lobinski R., Sidelnikov V., Patrushev Y., Rodriguez I. and Wasik A., Trac-Trends in Analytical Chemistry, 18, 449-460, (1999)

[28.] Slaets S., Adams F., Pereiro I.R. and Lobinski R., Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 14, 851-857, (1999)

[29.] Forsyth D.S. and Marshall W.D., Analytical Chemistry, 57, 1299-1305, (1985) [30.] Dirkx W., Lobinski R. and Adams F.C., Analytical Sciences, 9, 273-278, (1993) [31.] Armstrong H.L., Corns W.T., Stockwell P.B., O'Connor G., Ebdon L. and Evans E.H., Analytica

Chimica Acta, 390, 245-253, (1999) [32.] Lalere B., Szpunar J., Budzinski H., Garrigues P. and Donard O.F.X., Analyst, 120, 2665-2673,

(1995) [33.] Kalontarov L., Jing H.W., Amirav A. and Cheskis S., Journal of Chromatography A, 696, 245-256,

(1995) [34.] Tzanani N. and Amirav A., Analytical Chemistry, 67, 167-173, (1995) [35.] Amirav A. and Jing H.W., Analytical Chemistry, 67, 3305-3318, (1995) [36.] Tao H., Rajendran R.B., Quetel C.R., Nakazeto T., Tominaga M. and Miyazaki A., Analytical

Chemistry, 71, 4208-4215, (1999) [37.] Baena J.R., Gallego M., Valcarcel M., Leenaers J. and Adams F.C., Analytical Chemistry, 73, 3927-

3934, (2001) [38.] Rodriguez-Fernandez J., Montes-Bayon M., Pereiro R. and Sanz-Medel A., Journal of Analytical

Atomic Spectrometry, 16, 1051-1056, (2001) [39.] Holland J.F., Enke C.G., Allison J., Stults J.T., Pinkston J.D., Newcome B. and Watson J.T.,

Analytical Chemistry, 55, A997-&, (1983) [40.] Prohaska T., Pfeffer M., Tulipan M., Stingeder G., Mentler A. and Wenzel W.W., Fresenius

Journal of Analytical Chemistry, 364, 467-470, (1999) [41.] Demuth N. and Heumann K.G., Analytical Chemistry, 73, 4020-4027, (2001) [42.] Encinar J.R., Villar M.I.M., Santamaria V.G., Alonso J.I.G. and Sanz-Medel A., Analytical

Chemistry, 73, 3174-3180, (2001) [43.] Heumann K.G., Gallus S.M., Radlinger G. and Vogl J., Spectrochimica Acta Part B-Atomic

Spectroscopy, 53, 273-287, (1998) [44.] Hintelmann H., Evans R.D. and Villeneuve J.Y., Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 10,

619-624, (1995) [45.] Gallus S.M. and Heumann K.G., Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 11, 887-892, (1996) [46.] Snell J.P., Stewart I.I., Sturgeon R.E. and Frech W., Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 15,

1540-1545, (2000) [47.] Encinar J.R., Alonso J.I.G.A. and Sanz-Medel A., Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 15,

1233-1239, (2000) [48.] De Smaele T., Moens L., Dams R., Sandra P., Van der Eycken J. and Vandyck J., Journal of

Chromatography A, 793, 99-106, (1998) [49.] Moens L., DeSmaele T., Dams R., VandenBroeck P. and Sandra P., Analytical Chemistry, 69, 1604-

1611, (1997) [50.] De Smaele T., Moens L., Sandra P. and Dams R., Mikrochimica Acta, 130, 241-251, (1999) [51.] Vercauteren J., De Meester A., De Smaele T., Vanhaecke F., Moens L., Dams R. and Sandra P.,

Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 15, 651-656, (2000) [52.] Aguerre S., Bancon-Montigny C., Lespes G. and Potin-Gautier M., Analyst, 125, 263-268, (2000) [53.] Mester Z.N., Lam J., Sturgeon R. and Pawliszyn J., Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 15,

837-842, (2000) [54.] Mester Z., Sturgeon R. and Pawliszyn J., Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy, 56,

233-260, (2001) [55.] Vercauteren J., Peres C., Devos C., Sandra P., Vanhaecke F. and Moens L., Analytical Chemistry,

73, 1509-1514, (2001)

Rozdział 8

183

[56.] Wasik A., Pereiro I.R. and Lobinski R., Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy, 53, 867-879, (1998)

[57.] Wasik A., Pereiro I.R., Dietz C., Szpunar J. and Lobinski R., Analytical Communications, 35, 331-335, (1998)

[58.] Leal-Granadillo I.A., Alonso J.I.G. and Sanz-Medel A., Analytica Chimica Acta, 423, 21-29, (2000) [59.] Koch I., Feldmann J., Lintschinger J., Serves S.V., Cullen W.R. and Reimer K.J., Applied

Organometallic Chemistry, 12, 129-136, (1998) [60.] Fernandez R.G., Bayon M.M., Alonso J.I.G. and Sanz-Medel A., Journal of Mass Spectrometry, 35,

639-646, (2000) [61.] Pelaez M.V., Bayon M.M., Alonso J.I.G.A. and Sanz-Medel A., Journal of Analytical Atomic

Spectrometry, 15, 1217-1222, (2000) [62.] Liu W.P. and Lee K., Journal of Chromatography A, 834, 45-63, (1999) [63.] Wasik A., Lobinski R. and Namiesnik J., Instrumentation Science & Technology, 29, 393-405,

(2001) [64.] Aguerre S., Lespes G., Desauziers V. and Potin-Gautier M., Journal of Analytical Atomic

Spectrometry, 16, 263-269, (2001) [65.] Quevauviller P., Trac-Trends in Analytical Chemistry, 17, 314-316, (1998) [66.] Pergantis S.A., Francesconi K.A., Goessler W. and ThomasOates J.E., Analytical Chemistry, 69,

4931-4937, (1997) [67.] Lawrence J.F., Michalik P., Tam G. and Conacher H.B.S., Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 34, 315-319, (1986) [68.] Lau B.P.Y., Michalik P., Porter C.J. and Krolik S., Biomedical and Environmental Mass

Spectrometry, 14, 723-732, (1987) [69.] Chassaigne H. and Lobinski R., Analusis, 25, M37-M40, (1997) [70.] Agnes G.R. and Horlick G., Applied Spectroscopy, 48, 649-654, (1994) [71.] Agnes G.R., Stewart I.I. and Horlick G., Applied Spectroscopy, 48, 1347-1359, (1994) [72.] Zoorob G., Brown F.B. and Caruso J., Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 12, 517-524,

(1997) [73.] Pergantis S.A., Cullen W.R. and Eigendorf G.K., Biological Mass Spectrometry, 23, 749-755,

(1994) [74.] Kajiwara H., Journal of Chromatography, 559, 345-356, (1991) [75.] Richards M.P., Journal of Chromatography B-Biomedical Applications, 657, 345-355, (1994) [76.] Richards R.M.E. and Xing D.K.L., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 12, 301-

305, (1994) [77.] Tanner S.D., Baranov V.I. and Bandura D.R., Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy, 57,

1361-1452, (2002) [78.] Prange A. and Schaumloffel D., Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 14, 1329-1332, (1999) [79.] Schaumloffel D. and Prange A., Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 364, 452-456, (1999) [80.] Szpunar J., Pellerin P., Makarov A., Doco T., Williams P. and Lobinski R., Journal of Analytical

Atomic Spectrometry, 14, 639-644, (1999) [81.] Casiot C., Szpunar J., Lobinski R. and Potin-Gautier M., Journal of Analytical Atomic

Spectrometry, 14, 645-650, (1999) [82.] Barnett D.A., Handy R. and Horlick G., Electrospray Ionisation Mass Spectrometry in: Elemental

Speciation. New approaches for trace element analysis, J.A. Caruso, K.L. Ackley and K.L. Sutton (eds), vol XXXIII, Elsevier, Amsterdam, 2000, 1-6

[83.] Chassaigne H., Vacchina V. and Lobinski R., Trac-Trends in Analytical Chemistry, 19, 300-313, (2000)

[84.] Casiot C., Vacchina V., Chassaigne H., Szpunar J., Potin-Gautier P. and Lobinski R., Analytical Communications, 36, 77-80, (1999)

Rozdział 8

184

[85.] Crews H.M., Clarke P.A., Lewis D.J., Owen L.M., Strutt P.R. and Izquierdo A., Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 11, 1177-1182, (1996)

[86.] Kotrebai M., Bird S.M., Tyson J.F., Block E. and Uden P.C., Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy, 54, 1573-1591, (1999)

[87.] Kotrebai M., Birringer M., Tyson J.F., Block E. and Uden P.C., Analyst, 125, 71-78, (1999) [88.] Kotrebai M., Birringer M., Tyson J.F., Block E. and Uden P.C., Analytical Communications, 36,

249-252, (1999) [89.] Kotrebai M., Tyson J.F., Block E. and Uden P.C., Journal of Chromatography A, 866, 51-63,

(2000) [90.] Fan T.W.M., Lane A.N., Martens D. and Higashi R.M., Analyst, 123, 875-884, (1998) [91.] Jones T.L. and Betowski L.D., Rapid Communications in Mass Spectrometry, 7, 1003-1008, (1993) [92.] Siu K.W.M., Gardner G.J. and Berman S.S., Analytical Chemistry, 61, 2320-2322, (1989) [93.] McSheehy S., Pohl P., Lobinski R. and Szpunar J., Analytica Chimica Acta, 440, 3-16, (2001) [94.] Le Bouil A., Cailleux A., Turcant A. and Allain P., Journal of Analytical Toxicology, 23, 257-261,

(1999) [95.] Corr J.J. and Larsen E.H., Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 11, 1215-1224, (1996) [96.] Schramel O., Michalke B. and Kettrup A., Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 363, 452-

455, (1999) [97.] Mounicou S., Polec K., Chassaigne H., Potin-Gautier M. and Lobinski R., Journal of Analytical

Atomic Spectrometry, 15, 635-642, (2000) [98.] Mounicou S., Vacchina V., Szpunar J., Potin-Gautier M. and Lobinski R., Analyst, 126, 624-632,

(2001) [99.] Corr J.J., Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 12, 537-546, (1997) [100.] Vacchina V., Chassaigne H., Oven M., Zenk M.H. and Lobinski R., Analyst, 124, 1425-1430,

(1999) [101.] Vacchina V., Polec K. and Szpunar J., Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 14, 1557-1566,

(1999) [102.] Vacchina V., Lobinski R., Oven M. and Zenk M.H., Journal of Analytical Atomic Spectrometry,

15, 529-534, (2000) [103.] Vacchina V., Baldrian P., Gabriel J. and Szpunar J., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 372,

453-456, (2002)