rodrigo rocha latado. 2 cultura de tecidos vegetais infraestrutura Área de preparo de meios de...
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RODRIGO ROCHA LATADORODRIGO ROCHA LATADO
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CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS INFRAESTRUTURA
Área de Preparo de Meios de Cultura
- água: destilador e deionizador, osmose reversaultra purificação
- balanças: analítica ou eletrônica (g até Kg) e (mg até g)
- agitador magnético, com aquecimento
- distribuidor de meio de cultivo - pHmetro
- drogas (sais)
- vidrarias
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INFRAESTRUTURA
Área de Esterilização e Lavagem de Vidraria
- autoclave
- estufa para secagem
- estufa para esterilização
- máquina de lavar vidraria
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INFRAESTRUTURA
Área de Manipulação e Exame das Culturas
- Capela (câmara) de fluxo laminar
- Microscópios: comum, invertido (com fluorescência) (câmara fotográfica ou acoplamento a
vídeo)
- Material para manipulação (pinças, bisturis, espátulas, etc...)
- Lupa
- Centrífuga
- Eletroporador
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INFRAESTRUTURA
Câmara de fluxo laminar vertical
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INFRAESTRUTURA
Câmara de fluxo laminar horizontal
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INFRAESTRUTURA
Área de Incubação das Culturas
- sala com luz e temperatura, controladas
- incubadora
- agitador orbital (Shaker)
Área de Aclimatização das Plantas
- câmara úmida
- casa-de-vegetação
- telado
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MEIOS NUTRITIVOS
Desenvolvimento de Plantas Inteiras
- nutrientes minerais (solo, água)- CO2
- Cfixado + minerais: síntese de vitaminas e hormônios- síntese de compostos orgânicos ocorre em diferentes órgãos
Desenvolvimento de Segmentos de Tecidos ou Órgãos Isolados
Cultivo in vitro- condições inadequadas de iluminação e CO2
- plantas não são completamente autotróficas- explantes com baixo teor ou ausência de clorofila
- necessidade de fornecer compostos orgânicos
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MEIOS NUTRITIVOS
Meio Nutritivo ou Meio de Cultura
- fornecer substâncias essenciais para o crescimento- permitir que os explantes se desenvolvam em ambiente artificial- baseados nas exigências das plantas inteiras em sais minerais- suplementados com componentes orgânicos- controlam o padrão de desenvolvimento in vitro
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MEIOS NUTRITIVOS
HISTÓRICO
- primeiros trabalhos: soluções inorgânicas simples
solução de Knop (1865)solução de Knudson (1925)solução de Hoagland & Arnon (1938)
- atualmente: meios de cultura mais completos
White (White, 1943)MS (Murashige & Skoog, 1962)B5 (Gamborg et al., 1968)KM (Kao & Michayluk, 1975)WPM
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ÁGUA - Métodos de Purificação
Água grau primário - alto índice de impurezas - alta condutividade - utilizada para lavar vidraria
Água grau de laboratório - alto índice de pureza- baixo nível de orgânicos e microorganismos- utilizada no preparo de meios de cultura (microbiologia)
Água ultrapura (tipo 1)- estádio posterior à destilação e deionização- alta resistividade, baixo nível de orgânicos e microorganismos- utilizada em técnicas analíticas (HPLC, eletroforese capilar)- utilizada em biologia molecular
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MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO DE ÁGUA
Destilação: aquecer – ferver – evaporar a águacondensar o vapor e coletar
alto consumo de energia (1KW/litro)alto consumo de água (30l/litro)resistividade 1M-cmnão elimina CO2, amônia e voláteisprocesso lento
Deionização: resina de troca iônica
H+ cátionsOH- ánions
processo contínuoresistividade 18M-cmnão elimina orgânicos
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MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO DE ÁGUA
Osmose Reversa: pressão > pressão osmótica
90-98% íons orgânicos100% contaminantes não iônicos
moléculas orgânicas PM >100não remove gases
normalmente associado a resina de troca iônica
Adsorção por Carvão Ativado
remove cloro, orgânicos dissolvidosinstalado antes do equipamento de purificação
Filtração em Microporo: filtro de 0.22m
elimina bactérias e esporos de fungos
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MEIOS NUTRITIVOS
Componentes Inorgânicos
macronutrientesmicronutrientes
Componentes Orgânicos
vitaminasfonte de C
reguladores vegetais outros: mio-inositol
aminoácidos antioxidantes
substâncias complexascarvão ativado
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MEIOS NUTRITIVOS
COMPONENTES INORGÂNICOS
MACRONUTRIENTES
Nitrogênio: NH4NO3 e KNO3
Fósforo: KH2PO4 ou K2HPO4
Potássio: KH2PO4 e KI Cálcio: CaCl2*2H2O
Magnésio: MgSO4*7H2O
Enxofre: MgSO4*7H2O, MnSO4*H2O, ZnSO4*7H2O, CuSO4*H2O e FeSO4*7H2O
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MEIOS NUTRITIVOS
COMPONENTES INORGÂNICOS
MACRONUTRIENTES
Nitrogênio: participa do desenvolvimento geral das plantas
NO3-: nitrato [25 - 40mM] Norg: aminoácidos
NH4+: amônia [2 - 20mM] ác. orgânicos
Total de N: [25 - 60mM] caseína hidrolisada
Fósforo: parte integrante de ác. nucléicos e compostos estruturais
PO4-: [1 - 3mM] Fosfato de sódio ou de potássio
aminoácidos proteínasNinorg
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MACRONUTRIENTES
Potássio: atividades de membrana, controle da osmolaridade K+ : [20 - 30mM] acompanha nitratos e fosfatos
Cálcio: cofator de enzimas, síntese da parede celular
Ca+2: [1 - 3mM] cloreto ou nitrato de cálcio
Magnésio: integrante da clorofila, atividade de enzimas
Mg+2 : [1 - 3mM] sulfato de magnésio
Enxofre: estrutura das proteínas, presente em aminoácidos
SO4-2 : [1 - 3 mM] sulfato de magnésio
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MICRONUTRIENTES
Boro: atividade enzimática, biossíntese de lignina ácido bórico: [100mM]
Cobalto: cloreto de cobalto: [0.1mM]
Cobre: atividade enzimática sulfato de cobre: [0.1mM]
Iodo: iodeto de potássio [5mM]
Ferro: síntese de clorofila, reações de oxi-redução presente na forma de quelato (EDTA) sulfato de ferro: [100mM]
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MICRONUTRIENTES
Manganês: atividade enzimática (respiração e fotossíntese) sulfato de manganês: [30 - 100mM]
Molibdênio: cofator de enzimas molibdato de sódio: [1mM]
Zinco: atividade enzimática sulfato de zinco: [5 - 30mM]
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COMPONENTES ORGÂNICOS
- Fontes de C: sacarose [2 - 5%] hidrolisado em glicose + frutose glicose
manitol, maltose, outros
- Vitaminas: (mg/l) tiamina: essencial (metabolismo de carboidratos e biossíntese de aminoácidos) ác. nicotínico piridoxina
- Outros: mio-inositol: carbohidrato (desenvolvimento de membranas e parede celular)
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- Substâncias Complexas: água de coco extrato de levedura extrato de malte
caseína hidrolisada
- Antioxidantes: ácido ascórbico PVP (adsorção de fenóis) ácido cítrico
- Carvão Ativado: [0.2 - 3.0%] - adsorção fenóis liberados no meio de cultura - adsorção de componentes orgânicos (auxinas, citocininas) - contribui com o desenvolvimento de raízes
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HORMÔNIOS / REGULADORES DE CRESCIMENTO
- essenciais, pois direcionam o processo morfogenético em cultura de tecidos vegetais ( 1 M até 40 M) Auxinas: primeiro hormônio vegetal identificado (AIA) associadas a sítios de alta divisão celular
in vivo: alongamento de célulasdominância apicalformação de raiz adventícia
in vitro: divisão celular, associada a citocininaformação de calodiferenciação de raízesinibe desenvolvimento de gemas
lateraisindução de embriogênese somática
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Auxinas
auxina natural: IAA - ácido 3-indol acéticoIBA - ácido 3-indol butírico
auxina sintética: NAA - ácido naftaleno acético2,4-D - ácido 2,4-diclorofenoxi acético2,4,5-T - ácido 2,4,5-triclorofenoxi acético
substitutos de auxina: picloram, dicamba- alta concentração são herbicidas- in vitro atividade de auxina
inibidores da síntese de auxina: HNB - 5-hidroxi-nitrobenzil bromide7-AZA - 7-azaindole
inibidores do transporte de auxina: TIBA - ácido 2,3,5-triiodobenzóicoPCIB - acido isobutírico clorofenoxi acético NPA - ácido naftilphthalamico
COMPONENTES ORGÂNICOS
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COMPONENTES ORGÂNICOS
Citocininas - dominância apical (indução de brotações múltiplas)
- balanço citocinina/auxina - divisão celular
citocinina natural: zeatina 2iP - 2-isopentenil adenina
citocinina sintética: BAP - 6-benzilaminopurinacinetina
derivados de feniluréia: TDZ – thidiazuronatividade de citocinina in vitroestimula síntese de citocinina natural
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Giberelinas: isolada do fungo Gibberella fujikoroirelacionada com alongamento (altura) das plantasácido giberélico (GA3)
in vitro: inibe organogêneseinibe enraizamentoestimula alongamento de brotos
Ácido Abscísico: relacionado com a dormência de sementes e gemas
relacionado com a senescência, abscisão de folhas
in vitro: diminui o crescimento modera efeito de auxina/citocinina
regula desenvolvimento de embriões somáticos
COMPONENTES ORGÂNICOS
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AGENTES GELIFICANTES
polissacarídeos, que servem como suporte as plantas ou explantes.
ágar-ágar produzido pela alga (Gelidium amansii) sofre hidrólise, quando autoclavado em meio ácido
Gelrite (Merck) produzido pela bactéria (Pseudomonas elodea) usado em menor quantidade (2,5 g/L)
mais transparente
Phytagel (Sigma) usado em menor quantidade (3,0 g/L) mais transparente
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AGENTES GELIFICANTES
Agarose purificado a partir do ágar
Mais puro, porém muito mais caro vários tipos (diferentes pontos de solidificação)
-Agentes gelificantes podem podem induzir a hiperhidricidade (vitrificação) dos brotos ou plantas cultivadas in vitro.
Hiperhidricidade ou vitrificação - anomalia do tecido, na qual este fica rígido e quebradiço, havendo mal formação dos estômatos na plântula e dificuldade de enraizar.
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PREPARO DE MEIOS DE CULTURA
PROCEDIMENTOS E CUIDADOS
- dissolver sais em água pura - dissolver auxinas em KOH+ água pura e estéril- dissolver citocininas em HCl + água pura e estéril
- não misturar produtos que podem precipitar- armazenar soluções de sais e vitaminas em geladeira- armazenar reguladores de crescimento em freezer- antes do uso, verificar se não há contaminação ou precipitação
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PREPARO DE MEIOS DE CULTURA
UNIDADES DE CONCENTRAÇÃO
- Porcentagem de volume (% v/v):
exemplo: 5% de água de coco = 50ml água coco + 950ml água
- Porcentagem de peso (% p/v):
exemplo: 2% de sacarose = 20g de sacarose em 1000ml
- Molar (M): peso molecular (g/L)
ex. PM do AIA=175,18g 1M de AIA= 175,18g/L
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UNIDADES DE CONCENTRAÇÃO
- Milimolar (mM): 1 M = 1.000 mM 1 mM = 1/1000M = 0,001M = 10-3 M
ex. PM do AIA=175,18g logo 1M de AIA= 175,18g/L
1 mM AIA = ??
como 1mM = 1/1000 M
1 mM = 0,1758 g/L = 175,18 mg/L de AIA
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UNIDADES DE CONCENTRAÇÃO
- Micromolar ( M): 1 M = 1.000.000 M 1 M = 1/1.000.000 M = 10-6 M
ex. PM do AIA=175,18g logo 1M de AIA= 175,18g/L
1 M AIA = ?? como 1 M = 1/1.000.000 M
1 mM = 0,1758 g/L ou 175,18 mg/L de AIA
1 M = 0,0001758 g/L ou 0,17518 mg/L de AIA
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UNIDADES DE CONCENTRAÇÃO
- mg/L ex. reguladores de crescimento
- Ppm: partes por milhão = mg/L
1 ppm = 1 parte em 1.000.000 partes
1 L água pura pesa 1 Kg 1 mL pesa 1 g 1 L pesa 1 mg logo 1 ppm = 1 mg em 1 Kg (mg/K) ou 1 L em 1 L (L/L) ou 1 mg em 1 L (mg/L)
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MEIO DE CULTURA MS (Murashige & Skoog, 1962)
Meio líquido
ajustar o pH 5,8 a 6,0 esterilizar (filtração ou autoclavagem)
Meio semi-sólido ou sólido
ajustar o pH 5,8 a 6,0 acrescentar agente gelificante (Phytagel, ágar) esterilizar (filtração ou autoclavagem)
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ASSEPSIA E ESTERILIZAÇÃO Assepsia - Conjunto de procedimentos para tornar um explante livre de microorganismos (bactérias, fungos filamentosos, leveduras, etc...).
Contaminação: crescimento de microorganismos (fungo e/ou bactéria) no meio de cultura.
Fontes: explante meio de cultura meio ambiente (área de trabalho/materiais) operador
Explantes: obtidos de plantas cultivadas no campo, em estufas ou in vitro.
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ASSEPSIA E ESTERILIZAÇÃO Assepsia: folhas, sementes, gemas, etc...)
- lavar em água corrente com detergente- lavar em água corrente- banho em álcool 70%- hipoclorito de sódio (3:1) + gotas de tween- agitar 15 - 20 min.- na câmara asséptica, lavar com água esterilizada (3x)
Meios de Cultura
- Autoclave: calor úmido (121o C/ 15 - 20min.)
- Filtração: produtos sensíveis à temperatura (membrana 0,22m)
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ASSEPSIA E ESTERILIZAÇÃO •Área de Trabalho/Materiais
- Esterilização de Vidraria e Material: calor seco (estufa: 140 - 180o C/ 2 a 4h.) calor úmido (autoclave) + secagem (estufa) raios-gama: plásticos descartáveis
Flambagem das pinças e bisturis durante o trabalho
- Limpeza Laboratório e Vidraria álcool: balcão e capela detergente + H2O destilada: vidraria desinfetante: chão