rodrigo rocha latado. 2 principais tÉcnicas de cultura de tecidos vegetais

RODRIGO ROCHA LATADORODRIGO ROCHA LATADO

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PRINCIPAIS TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS

VEGETAIS

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MICROPROPAGAÇÃO DE PLANTAS

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PROPAGAÇÃO DE PLANTAS

• Semente (via sexuada): espécies com poucas sementesespécies sem sementesperda da germinaçãoprogênie heterogênea

• Vegetativa (via assexual)in vivo: estaca, enxertia, borbulha

processo lentopropagação de doençassazonalidadeespaço físico

in vitro: meristema apicalsegmento nodal estímulo a gemas axilares

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MICROPROPAGAÇÃO: propagação clonal de genótipos selecionados, utilizando técnicas de cultura de tecidos, visando a produção de plantas em massa, a um preço competitivo• uso de explantes com meristemas pré-existentes

• meristema apical: dome com células totipotentes divisão constante

não tem conexão com xilema e floema

• ápice meristemático: dome meristemático + primórdios foliares

Vantagens: > número de mudasrapidezrejuvenescimentolivre de doençasespaço físico reduzidosazonalidade

Desvantagens: variação somaclonalcontaminaçãoaclimatizaçãocustoprotocolo

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meristema x ápice meristemático

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MICROPROPAGAÇÃO: descoberta das citocininas descrição do meio MS

EXPLANTES

• ápice meristemático

• segmento nodal: alongamento de ramo com vários nós

• proliferação de gemas axilares: quebra de dominância apical brotos axilares são explantes secundários para próximos ciclos

Principais culturas: Banana, Cana-de-açúcar, Eucalipto, Pinus, Mandioca, Morango, Batata, Plantas ornamentais

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ETAPAS DA MICROPROPAGAÇÃO

Introdução do explante

Indução de brotações

Aclimatizaçãodas plantas

Alongamento, desenvolvimento e enraizamento das plantas in vitro

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Micropropagação de baunilha Micropropagação de mandioca

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MICROPROPAGAÇÃO

Estádio 0: seleção da planta matrizsanidadeestádio fisiológicoestado nutricional

Estádio 1: estabelecimento da cultura asséptica e viávelépoca de retirada do explanteposição do explante na planta matrizbaixa [ ] de citocinina; baixa [ ] de auxina

Estádio 2: multiplicaçãoalta [ ] de citocininanúmeros de subcultivos

Estádio 3: alongamento e enraizamentoácido giberélico, auxinas (IBA, NAA)

Estádio 4: aclimatizaçãocontrole de umidade e luz

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MICROPROPAGAÇÃO

Meio de Cultura Sólido: ágar, gelmelhor aeraçãoabsorção de nutrientes é deficiente

• Meio de Cultura Líquido: estacionário, agitaçãomaior disponibilidade de nutrientesmaior disponibilidade de águaoxigenaçãosuporte: papel de filtro, espuma

• Imersão Temporária: alternância de meio de cultura líquido com ausência de meio de cultura

melhor aeração maior contato com meio de cultura ex. banana (20min. / 2h)

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CULTIVO DE MERISTEMAS PARA LIMPEZA DE VÍRUS

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LIMPEZA DE VÍRUS

Doenças de Plantas: fungos, bactérias, vírustransmitidas na propagação vegetativa

White (1934): vírus estão distribuídos de maneira desuniforme em raiz de fumoredução da concentração em direção à

extremidadeápice radicular livre de vírus

Limasset & Cormet (1949): gradiente de concentração de vírus na parte aérea

Morel & Martin (1952): plantas de dália livres de vírus

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LIMPEZA DE VÍRUS - Sequência

Principais culturas: Cana-de-açúcar, Mandioca, Morango, Batata,

Plantas ornamentais

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LIMPEZA DE VÍRUS - Sequência

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LIMPEZA DE VÍRUS

• termoterapia + cultura do ápice meristemático

ex: vírus do mosaico da cana-de açúcarcultura de meristema: explante 0,3 mmcultura ápice meristemático (1 – 2,5 cm) +

termoterapia (45oC / 8 horas)

• quimioterapia + cultura do ápice meristemáticoincorporação de antivirais no meio de cultura

• Indexação: avaliação da presença do vírusensaios biológicosmicroscopia eletrônicaserologia (ELISA)hibridação com ácido nucleico

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CULTURA DE CALOS

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CULTURA DE CALOS

FASES 1. ASSEPSIA

2. EXPLANTES (discos de folhas, raiz, caule, sementes, etc...)

3. INTRODUÇÃO AO MEIO DE CULTIVO - INDUÇÃO DE CALOS (geralmente meio contendo auxinas)

Calos em citros (meio contendo BAP)

4. DESDIFERENCIAÇÃO CELULAR - retorno das células ao estado meristemático

Depende de: competência e habilidade para responder ao estímulo

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CULTURA DE CALOS

5. SUBCULTIVOS MENSAIS

- mesmo meio de indução

- outros meios

6. DIFERENCIAÇÃO CELULAR- utilizando uma das duas vias,

- Organogênese somática

- Embriogênese somática

7. REGENERAÇÃO DE PLANTAS

8. ACLIMATIZAÇÃO AO MEIO AMBIENTE

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CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO

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FASES

1. EXPLANTES (calos - células meristemáticas, alta taxa de divisão celular)

2. INTRODUÇÃO AO MEIO DE CULTIVO LÍQUIDO - geralmente no mesmo meio de cultivo de calos

3. AGITAÇÃO CONSTANTE (100 rpm) E ESCURO - oxigenação do meio

4. SUBCULTIVOS SEMANAIS OU QUINZENAIS - duplica ou triplica o volume celular em 7 dias

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SELEÇÃO in vitro - adição de agentes seletivos: herbicidas, toxinas purificadas, NaCl (sal), alumínio, PEG (seca) e outros

5. ALTA TAXA DE CONTAMINAÇÃO - motivo: meio líquido

6. TRANSFERÊNCIA PARA MEIO SÓLIDO - obtenção de calos

7. REGENERAÇÃO DE PLANTAS

8. ACLIMATIZAÇÃO AO MEIO AMBIENTE

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Células Células em meio contendoalta osmolaridade

Células em suspensãoAgitador orbital

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CULTURA DE CÉLULAS HAPLÓIDES

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CULTURA DE CÉLULAS HAPLÓIDES

FASES 1. ASSEPSIA

2. EXPLANTES (anteras (micrósporo), pólen, óvulos, ovários vegetais)

3. INTRODUÇÃO AO MEIO DE CULTIVO (pré-tratamento)

4. INDUÇÃO DE ORGANOGÊNESE OU ÊMBRIOGÊNESE - direta (sem passar pela fase de calos)

- indireta (com passagem pela fase de calos)

Depende de: competência e habilidade para responder ao estímulo

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CULTURA DE PLANTAS HAPLÓIDES

FASES

5. DESENVOLVIMENTO DAS PLANTAS in vitro

- alongamento das plantas - enraizamento - aclimatização

6. OBTENÇÃO DE PLANTAS HAPLÓIDES OU DUPLO-HAPLÓIDES

- duplicação cromossômica natural ou com utilização de drogas antimitóticas

- drogas (colchicina, oryzalina, hidroxiquinolina, etc... )

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Flor Anteras Micrósporogerminando

Embriogênesesomática

MultiplicaçãoAclimatização

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Flor - Ovário Óvulos Calos

Organogênesesomática

Obtenção de plantasMultiplicação

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CULTURA DE PROTOPLASTOSVEGETAIS

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CULTURA DE PROTOPLASTOS

- Células vegetais isoladas e sem parede celular (removidas por enzimas)

Enzimas Hemicelulases - digerem hemicelulose Celulases - digerem celulose Pectinases - digerem pectinas

- sensíveis a modificação na osmolaridade do meio e a luz

- meio mais concentrado protoplastos perdem água para o meio

- meio mais diluído protoplastos absorvem água do meio

meios geralmente entre 0,4 e 0,8M

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- usam manitol ou sacarose para ajustar a osmolaridade do meio

- A ausência de parede celular possibilita a fusão de protoplastos

- Isolamento, purificação e cultivo de protoplastos utilizando meios contendo a mesma osmolaridade

MEIOSMeios CPW - Cell Protoplast Wash, MS 0,4M e MS 0,4M (2X)

Solução de enzimas 0,4M

Solução de Polietileno glicol a 50%

Agarose tipoVII (baixo ponto de fusão) - 1,2%

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MEIO CPW (para protoplastos vegetais ( Gilmour et al., 1989)

Composição mg/L

1. CaCl2*2H2O 1.4802. MgSO4*7H2O 2463. KNO3 1014. KH2PO4 27,25. KI 0,16

- acrescentar Manitol para o controle da osmolaridade (0,4 M)- ajustar o pH 6,0- esterilizar

SOLUÇÕES ESTOQUE CONC. VOLUME USADO / L

A. CaCl2*2H2O 50x 20 mL/L

B. OUTROS SAIS 100x 10 mL/L

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Material esterilizado

- placas de Petri

- peneiras com poros de 50 m

- tubos 8 ml com tampa

- pipetas Pasteur

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FASES1. EXPLANTES - (folhas, calos, suspensão celular, pétalas, anteras)

2. ISOLAMENTO DOS PROTOPLASTOS - Agitação 50 rpm, escuro, 27o C, durante 8 a 16 h.

3. PURIFICAÇÃO - peneiramento, centrifugação, retirada da solução, lavagem com CPW

4. FUSÃO - adição de PEG ou eletrofusão

5. RETIRADA DO PEG

6. CULTIVO DOS PRODUTOS DA FUSÃO - meio MS 0,4M(2X) e agarose

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Explante Protoplastos Viabilidade deprotoplastos

FusãoFusãoFusão múltipla

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Primeira divisão Microcalo Microcolônia

Calos e embriões somáticos

Embrião somáticoEmbrião

germinando

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Plantasin vitro

Placa com embriões germinando

Desenvolvimento das plantase enraizamento

Aclimatização ao meio ambiente

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