risoluzione eno 10/2005 guida pratica per la convalida, … · di un metodo alternativo di analisi...

RISOLUZIONE ENO 10/2005

Esemplare certificato conforme

Parigi, il 20 luglio 2005 Il Direttore Generale dell’OIV

Secretario dell’Assemblea Generale

Federico CASTELLUCCI

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GUIDA PRATICA PER LA CONVALIDA, IL CONTROLLO QUALITÀ, E LA STIMA DELL’INCERTEZZA DI UN METODO ALTERNATIVO DI ANALISI ENOLOGICA L’ASSEMBLEA GENERALE, Visto l’articolo 2 paragrafo 2 iv dell’accordo del 3 aprile 2001 che istituisce l’Organizzazione internazionale della vigna e del vino Su proposta della Sottocommissione dei metodi d‘analisi e valutazione dei vini, DECIDE: di introdurre nell’Allegato E della Raccolta Internazionale dei metodi di analisi dei vini e dei mosti, la Guida seguente che annulla e sostituisce la risoluzione Eno 6/99 «protocollo di convalida di un metodo abituale d‘analisi rispetto al metodo di riferimento OIV»

Guida pratica per la convalida, il controllo qualità, e la stima dell’incertezza di un metodo alternativo d‘analisi enologica

Indice

1. OGGETTO ..............................................................................................................5

2. PREAMBOLO E CAMPO DI APPLICAZIONE .............................................................5

3. VOCABOLARIO GENERALE.....................................................................................6

4. PRINCIPI GENERALI ...........................................................................................11 4.1 METODOLOGIA ................................................................................................................11 4.2 DEFINIZIONE DELL’ERRORE DI MISURA ......................................................................................11

5. CONVALIDA DI UN METODO................................................................................13 5.1 METODOLOGIA ................................................................................................................13 5.2 PRIMA FASE: CAMPI D’APPLICAZIONE DEL METODO.........................................................................13

5.2.1 Definizione delle matrici analizzabili ........................................................13 5.2.2 Limite di rilevazione e di quantificazione ..................................................14

5.2.2.1 Definizione normativa .......................................................................................14 5.2.2.2 Documentazione di riferimento...........................................................................14 5.2.2.3 Applicazione ....................................................................................................14 5.2.2.4 Modalità operative............................................................................................14

5.2.2.4.1 Determinazione su bianco .......................................................................14 5.2.2.4.1.1 Campi d’applicazione..............................................................................14 5.2.2.4.1.2 Protocollo di base e calcoli ......................................................................15

5.2.2.4.2 Metodo di studio di linearità ....................................................................16






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5.2.2.4.2.1 Campi d’applicazione..............................................................................16 5.2.2.4.2.2 Protocollo di base e calcoli ......................................................................16

5.2.2.4.3 Metodo grafico derivato dal rumore di fondo della registrazione....................17 5.2.2.4.3.1 Campi di applicazione.............................................................................17 5.2.2.4.3.2 Protocollo di base e calcoli ......................................................................18

5.2.2.4.4 Verifica di un limite di quantificazione predeterminato.................................18 5.2.2.4.4.1 Campi d’applicazione..............................................................................18 5.2.2.4.4.2 Protocollo di base e calcolo .....................................................................18

5.2.3 Robustezza..........................................................................................20 5.2.3.1 Definizione ......................................................................................................20 5.2.3.2 Determinazione................................................................................................20

5.3 SECONDA PARTE: STUDIO DELL’ERRORE SISTEMATICO.....................................................................20 5.3.1 Studio di linearità.................................................................................20

5.3.1.1 Definizione normativa .......................................................................................20 5.3.1.2 Documenti di riferimento...................................................................................20 5.3.1.3 Applicazione ....................................................................................................20 5.3.1.4 Metodo tipo ISO 11095 .....................................................................................21

5.3.1.4.1 Protocollo di base ..................................................................................21 5.3.1.4.2 Calcoli e risultati....................................................................................22

5.3.1.4.2.1 Definizione del modello di regressione ......................................................22 5.3.1.4.2.2 Stima dei parametri ...............................................................................22 5.3.1.4.2.3 Rappresentazioni grafiche .......................................................................23 5.3.1.4.2.4 Test dell’ipotesi di linearità......................................................................25

5.3.1.4.2.4.1 Definizioni di errori legati alla taratura....................................................25 5.3.1.4.2.4.2 Test di Fischer-Snedecor ......................................................................27

5.3.1.5 Metodo ISO 8466 .............................................................................................27 5.3.1.5.1 Protocollo di base ..................................................................................27 5.3.1.5.2 Calcoli e risultati....................................................................................28

5.3.1.5.2.1 Definizione del modello di regressione lineare ............................................28 5.3.1.5.2.2 Definizione di modello di regressione polinomiale .......................................28 5.3.1.5.2.3 Confronto delle deviazioni standard residue ...............................................29

5.3.2 Specificità ...........................................................................................31 5.3.2.1 Definizione normativa .......................................................................................31 5.3.2.2 Applicazione ....................................................................................................31 5.3.2.3 Modalità operative............................................................................................31

5.3.2.3.1 Test delle aggiunte dosate ......................................................................31 5.3.2.3.1.1 Campo d’applicazione.............................................................................31 5.3.2.3.1.2 Protocollo di base ..................................................................................31 5.3.2.3.1.3 Calcoli e risultati....................................................................................32

5.3.2.3.1.3.1 Studio della retta di regressione r = a + b.v............................................32 5.3.2.3.1.3.2 Gestione dei risultati ............................................................................33 5.3.2.3.1.3.3 Rappresentazione grafica della retta di sovrapposizione ............................34

5.3.2.3.2 Studio dell’influenza di altri composti sul risultato della misurazione..............35 5.3.2.3.2.1 Campo d’applicazione.............................................................................35 5.3.2.3.2.2 Protocollo di base e calcoli ......................................................................35 5.3.2.3.2.3 Interpretazione .....................................................................................36

5.3.3 Studio dell’esattezza del metodo ............................................................37 5.3.3.1 Presentazione della fase ....................................................................................37






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5.3.3.1.1 Definizione ...........................................................................................37 5.3.3.1.2 Principi generali.....................................................................................37 5.3.3.1.3 Documenti di riferimento ........................................................................37

5.3.3.2 Confronto del metodo abituale con il metodo di riferimento OIV ..............................37 5.3.3.2.1 Campo d’applicazione.............................................................................37 5.3.3.2.2 Esattezza del metodo abituale rispetto al metodo di riferimento....................38

5.3.3.2.2.1 Definizione ...........................................................................................38 5.3.3.2.2.2 Campo di applicazione............................................................................38 5.3.3.2.2.3 Protocollo di base e calcoli ......................................................................38 5.3.3.2.2.4 Interpretazione .....................................................................................39

5.3.3.3 Confronto con saggi interlaboratorio ...................................................................41 5.3.3.3.1 Campo d’applicazione.............................................................................41 5.3.3.3.2 Protocollo di base e calcoli ......................................................................41 5.3.3.3.3 Interpretazione .....................................................................................42

5.3.3.4 Confronto con materiali di riferimento .................................................................42 5.3.3.4.1 Campo d’applicazione.............................................................................42 5.3.3.4.2 Protocollo di base e calcoli ......................................................................43 5.3.3.4.3 Interpretazione .....................................................................................44

5.4 TERZA PARTE: STUDIO DELL’ERRORE ALEATORIO ...........................................................................44 5.4.1 Principio generale.................................................................................44 5.4.2 Documenti di riferimento.......................................................................45 5.4.3 Precisione del metodo ...........................................................................45

5.4.3.1 Definizione ......................................................................................................45 5.4.3.2 Campo di applicazione ......................................................................................45 5.4.3.3 Caso teorico generale .......................................................................................45

5.4.3.3.1 Protocollo di base e calcoli ......................................................................45 5.4.3.3.1.1 Calcoli con diversi materiali di prova.........................................................45 5.4.3.3.1.2 Calcoli con 1 materiale di prova ...............................................................48

5.4.3.4 Ripetibilità.......................................................................................................48 5.4.3.4.1 Definizioni ............................................................................................48 5.4.3.4.2 Campo d’applicazione.............................................................................49 5.4.3.4.3 Protocollo di base e calcoli ......................................................................49

5.4.3.4.3.1 Caso generale .......................................................................................49 5.4.3.4.3.2 Caso particolare applicabile ad 1 sola ripetizione ........................................49

5.4.3.4.4 Confronto di ripetibilità...........................................................................51 5.4.3.4.4.1 Determinazione delle ripetibilità dei due metodi .........................................51 5.4.3.4.4.2 Test di Fischer-Snedecor.........................................................................51

5.4.3.5 Riproducibilità intralaboratorio ...........................................................................52 5.4.3.5.1 Definizione ...........................................................................................52 5.4.3.5.2 Campo di applicazione............................................................................52 5.4.3.5.3 Protocollo di base e calcoli ......................................................................52

6. CONTROLLO DI QUALITÀ DEI METODI DI ANALISI (CIQ)...................................54 6.1 DOCUMENTI DI RIFERIMENTO ................................................................................................54 6.2 PRINCIPI GENERALI ...........................................................................................................54 6.3 I MATERIALI DI RIFERIMENTO ................................................................................................54 6.4 CONTROLLO DELLE SERIE ANALITICHE .......................................................................................56






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6.4.1 Definizione ..........................................................................................56 6.4.2 Controllo dell’esattezza a partire dai materiali di riferimento.......................56 6.4.3 Precisione intra-serie ............................................................................56 6.4.4 Campione interno.................................................................................56

6.5 CONTROLLO DEL SISTEMA DI ANALISI .......................................................................................57 6.5.1 Definizione ..................................................................................................57

6.5.2.1 Acquisizione dei dati .............................................................................................57 6.5.2.2. Presentazione dei risultati e definizione dei limiti...................................................57 6.5.2.3 Utilizzo della mappa di Shewhart ............................................................................58

6.5.3. Confronto interno dei sistemi di analisi ...........................................................59 6.5.4. Confronto esterno del sistema di analisi...................................................59

6.5.4.1. Catena di analisi di confronto interlaboratorio.......................................................59 6.5.4.2. Confronto con dei materiali di riferimento esterni ..................................................59

6.5.4.2.1 Incertezza standard del materiale di riferimento.........................................59 6.5.4.2.2.Definizione dei limiti di validità di una misurazione del materiale di riferimento........60

7. STIMA DELL’INCERTEZZA DI MISURA .................................................................61 7.1 DEFINIZIONE ..................................................................................................................61 7.2 DOCUMENTI DI RIFERIMENTO ................................................................................................61 7.3 CAMPO D’APPLICAZIONE ......................................................................................................61 7.4 METODOLOGIA ................................................................................................................62

7.4.1 Definizione del misurando, e descrizione del metodo di analisi quantitativo...62 7.4.2 Analisi critica del processo di misura .......................................................62 7.4.3 Calcoli di stima dell’incertezza standard (procedura intralaboratorio) ...........63

7.4.3.1 Principio..........................................................................................................63 7.4.3.2 Calcolo della deviazione standard di riproducibilità intralaboratorio ..........................65 7.4.3.3 Stima delle fonti di errori sistematici standard non presi in cosiderazione nelle

condizioni di riproducibilità ................................................................................65 7.4.3.3.1 Errore di calibratura (o di taratura) ..........................................................65

7.4.3.3.1.1 Modalità operativa .................................................................................66 7.4.3.3.1.2 Calcoli e risultati....................................................................................66 7.4.3.3.1.3 Stima dell’incertezza standard associata alla retta di calibratura (o di taratura)

..........................................................................................................67 7.4.3.3.2 Errore sistematico..................................................................................68

7.4.3.3.2.1 Metodi perequati con un solo materiale di riferimento .................................68 7.4.3.3.2.2 Metodi perequati con diversi materiali di riferimento (gamme di taratura…)....68

7.4.3.3.3 Effetto matrice ......................................................................................69 7.4.3.3.3.1 Definizione ...........................................................................................69

7.4.3.3.4 Effetto campione ...................................................................................70 7.4.4 Stima dell’incertezza standard con i saggi interlaboratorio..........................71

7.4.4.1 Principio..........................................................................................................71 7.4.4.2 Utilizzo della deviazione standard di riproducibilità interlaboratorio e intrametodo

SRinter(metodo) ................................................................................................71 7.4.4.3 Utilizzo della deviazione standard di riproducibilità interlaboratorio e intermetodo SRinter

.....................................................................................................................72 7.4.4.4 Altre componenti del bilancio d’incertezza ............................................................72

7.5 ESPRESSIONE DELL’INCERTEZZA ALLARGATA ...............................................................................72






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1. Oggetto L’obiettivo di questa guida è accompagnare i laboratori di enologia che effettuano analisi in serie, nelle loro procedure di convalida, di controllo qualità interno e di stima dell’incertezza dei metodi usuali di loro applicazione

2. Preambolo e campo di applicazione La norma internazionale ISO 17025, che definisce « le prescrizioni generali che riguardano la competenza dei laboratori di taratura e di prova », precisa che i laboratori accreditati debbano, quando applicano un metodo analitico abituale, assicurarsi sulla qualità dei risultati ottenuti. A questo fine, si indicano una serie di fasi. La prima consiste nel definire le esigenze della clientela rispetto al parametro considerato, per determinare, di conseguenza, se il metodo utilizzato risponda bene a queste ultime. La seconda fase integra, per i metodi non standardizzati, modificati o sviluppati dal laboratorio, una convalida iniziale. Una volta applicato il metodo, i laboratori devono utilizzare dei mezzi di controllo e di raccordo che permettano di monitorare la qualità dei risultati ottenuti. Infine, devono stimare l’incertezza associata ai risultati ottenuti. Per rispondere a queste esigenze, i laboratori dispongono di una notevole documentazione di riferimento costituita da numerose guide e norme internazionali. Tuttavia, nella pratica, l’applicazione di questi testi si rileva delicata, in quanto, rivolgendosi a tutte le categorie di laboratori di taratura e di prova, sono troppo generici e presuppongono da parte del lettore conoscenze approfondite delle regole matematiche che si applicano al trattamento statistico dei dati. Questa guida è stata redatta a partire da tale documentazione di riferimento internazionale e tenendo conto delle particolarità tipiche dei laboratori di enologia che praticano, di routine, analisi su delle serie di campioni di vino o di mosto. Avendo delimitato in questo modo il campo di applicazione, si è potuta fare una scelta adatta e pertinente alfine di conservare solo gli strumenti più adatti. La guida, nata dal referenziale internazionale, rimane quindi strettamente conforme. Il lettore avrà quindi la possibilità di approfondire uno qualsiasi degli argomenti della guida, facendo riferimento alle norme ed alle guide internazionali i cui riferimenti sono elencati in ogni capitolo. I redattori hanno scelto di raggruppare i vari strumenti che permettono di rispondere alle esigenze della norma ISO 17025 in quanto esiste un’evidente soluzione di continuità nella loro applicazione e nei dati ottenuti da questi, che spesso possono essere utilizzati per gli altri. Inoltre i mezzi matematici applicati sono spesso simili. I vari capitoli includono esempi di applicazioni, presi dai laboratori di enologia che utilizzano questi strumenti. È importante precisare che questa guida non ha la pretesa di essere esaustiva. Si pone semplicemente l’obiettivo di presentare, in modo il più possibile chiaro ed applicabile, il contenuto dei requisiti della norma ISO 17025 e degli strumenti di base da applicare per potervisi attenere nella routine di laboratorio. Ogni laboratorio è perfettamente libero di completare questi strumenti o di sostituirli con quelli che riterrà più efficaci o più adatti.






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Infine, è importante attirare l’attenzione degli utenti sul fatto che gli strumenti presentati non sono fini a se stessi e che il loro impiego, così come l’interpretazione dei risultati ottenuti, deve sempre essere oggetto di un approccio critico. Solo a queste condizioni si garantirà la loro pertinenza ed il laboratorio potrà utilizzarli come strumenti di miglioramento della qualità delle analisi realizzate.

3. Vocabolario generale Le seguenti definizioni sono funzionali a questo documento e sono nate dai riferimenti normativi citati in bibliografia. Analita Oggetto del metodo di analisi. Bianco Prova realizzata in assenza di matrice (bianco reattivo) o su una matrice che non contiene l’analita (bianco matrice). Distorsione Differenza tra il valore previsto dei risultati di prova ed un valore di riferimento convenuto. Bilancio d’incertezza Elenco delle fonti di incertezza e delle loro incertezze standard, redatto per valutare l’incertezza standard composta associata ad un risultato di misura. Calibratura (di uno strumento di misura) (Gauging, in inglese) Posizionamento materiale di ogni riferimento (ed eventualmente soltanto di alcuni riferimenti principali) di uno strumento di misura in funzione del valore corrispondente del misurando. NOTA Non confondere « calibratura » e « taratura » Condizione di ripetibilità Condizione per cui i risultati di prova indipendenti sono ottenuti con lo stesso metodo su individui di prova identici nello stesso laboratorio, da parte dello stesso operatore, utilizzando la stessa attrezzatura e nel corso di un breve intervallo di tempo. Condizione di riproducibilità (intralaboratorio) Condizioni per cui i risultati di prova sono ottenuti con lo stesso metodo, sugli stessi individui di prova identici, nello stesso laboratorio, con lo stesso o con diversi operatori e utilizzando calibrature diverse in giorni diversi. Deviazione standard sperimentale Per una serie di n misurazioni dello stesso misurando, grandezza s che caratterizza la dispersione dei risultati, data dalla formula:






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2)(−=

∑ −=

n

is

n

ixx

essendo xi il risultato della ia misurazione e x la media aritmetica degli n risultati considerati. Deviazione standard di ripetibilità Deviazione standard di numerose ripetizioni ottenute in un solo laboratorio da uno stesso operatore su uno stesso strumento, vale a dire in condizioni di ripetibilità. Deviazione standard di riproducibilità interna (o variabilità intralaboratorio totale) Deviazioni standard di ripetizioni ottenute in un solo laboratorio con lo stesso metodo, facendo intervenire diversi operatori o strumenti e, in particolare, effettuando le misure in date diverse, cioè in condizioni di riproducibilità. Errore aleatorio Risultato di una misurazione meno la media di un numero infinito di misurazioni dello stesso misurando, effettuate in condizioni di ripetibilità. Errore di misura Risultato di una misurazione meno un valore vero del misurando. Errore sistematico Media che risulterebbe da un numero infinito di misurazioni dello stesso misurando, effettuate in condizioni di ripetibilità, meno un valore vero del misurando. NOTA Il concetto di errore è un concetto del tutto teorico, nella misura in cui esso fa riferimento a grandezze che non sono accessibili in pratica, e precisamente i valori veri dei misurandi. Per principio l’errore è ignoto. Speranza matematica Per una serie di n misurazioni dello stesso misurando, se n tende ad infinito, la media x tende alla Speranza E(x).

→ n

xnxE

n

ii∑

=∞= 1lim)(

Taratura (Calibration, in inglese) Insieme di operazioni che stabiliscono in condizioni specifiche, la relazione tra i valori della grandezza indicata da uno strumento di misura o un sistema di misura, oppure i valori rappresentati da una misura materializzata, o da un materiale di riferimento e i valori corrispondenti della grandezza realizzata da campioni. Valutazione intralaboratorio di un metodo di analisi L’azione di sottoporre un metodo di analisi ad uno studio statistico intralaboratorio, fondato su un protocollo standardizzato e/o riconosciuto, che attesti che nel suo campo di applicazione, il metodo di analisi soddisfa i criteri di prestazione prestabiliti.






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Nell’ambito di questo documento, la valutazione di un metodo si basa su uno studio intralaboratorio che include il confronto con un metodo di riferimento. Precisione Per precisione si intende la concordanza tra i risultati di prove indipendenti ottenuti in condizioni concordate. NOTA 1 La precisione dipende unicamente dalla distribuzione degli errori aleatori e non ha alcuna relazione con il valore vero o specificato. NOTA 2 La misura della precisione viene espressa quale deviazione standard del risultato della prova. NOTA 3 Il termine "risultati di prova indipendenti " significa risultati ottenuti in modo non influenzato da un risultato precedente sullo stesso materiale di prova o simile. Le misure quantitative della precisione dipendono in modo critico dalle condizioni concordate. Le condizioni di ripetibilità e di riproducibilità sono insiemi particolari di condizioni estreme. Grandezza (misurabile) Attributo di un fenomeno, di un corpo o di una sostanza, che può essere distinto qualitativamente e determinato quantitativamente. Incertezza di misura Parametro associato al risultato di una misurazione, che caratterizza la dispersione di valori che potrebbero ragionevolmente essere attribuiti al misurando. Incertezza standard (u(xi)) Incertezza del risultato di una misurazione espressa sotto forma di deviazione standard. Esattezza Per esattezza si intende la concordanza tra il valore medio ottenuto da un'ampia serie di risultati e un valore di riferimento accettato. NOTA La misura dell’esattezza generalmente è espressa in termini di distorsione. Limite di rilevazione La più piccola quantità di analita da esaminare in un materiale di prova, che si può rilevare e considerare diversa dal valore del bianco (con una data probabilità), ma non necessariamente quantificata. In effetti, occorre tenere conto di due rischi:

- Il rischio α di considerare la sostanza presente nel materiale di prova quando invece la sua grandezza è nulla; - Il rischio β di considerare assente una sostanza quando invece la sua grandezza non è nulla.

Limite di quantificazione La più piccola grandezza di un analita da esaminare in un materiale di prova che si può determinare quantitativamente in condizioni sperimentali descritte nel metodo, con una variabilità definita (coefficiente di variazione determinato). Linearità Capacità di un metodo di analisi, all’interno di un certo intervallo, di fornire un valore di informazioni o risultati proporzionali alla quantità di analiti da dosare nel materiale di prova per il laboratorio.






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Questa proporzionalità si esprime attraverso un’espressione matematica definita a priori. I limiti di linearità sono i limiti sperimentali di grandezze, tra le quali si può applicare un modello di taratura lineare, con un livello di attendibilità noto (generalmente dell’1 %). Materiale di prova Materiale o sostanza sulla quale si può applicare una misurazione con il metodo di analisi considerato. Materiale di riferimento Materiale o sostanza in cui uno o più valori della/e proprietà è (sono) sufficientemente omogenei e ben definito/i per permettere il loro utilizzo per la taratura della strumentazione, la valutazione di un metodo di misurazione, o l’attribuzione di valori ai materiali. Materiale di riferimento certificato Materiale di riferimento, accompagnato da un certificato, in cui uno (o più) valori della/e proprietà ha una realizzazione esatta dell’unità nella quale i valori di proprietà sono espressi e per il quale ogni valore certificato è accompagnato da un’incertezza ad un livello di attendibilità indicato. Matrice Insieme di costituenti del materiale di prova diverse dall’analita. Metodo di analisi Procedura scritta che descrive l’insieme dei mezzi e delle modalità operative necessarie per effettuare l’analisi dell’analita, cioè : campo di applicazione, principio e/o reazioni, definizioni, reagenti, macchinari, modalità operative, espressione dei risultati, fedeltà, rapporto della prova. AVVERTENZA Le espressioni « metodo di dosaggio » e « metodo di determinazione » sono talvolta utilizzate come sinonimi dell’espressione « metodo di analisi ». Queste due espressioni non si devono utilizzare in questo senso. Metodo di analisi quantitativa Metodo di analisi che permette di misurare la quantità di analita presente nel materiale di prova per laboratorio. Metodo di analisi di riferimento (metodo di tipo I o di tipo II) Metodo di analisi che dà il valore di riferimento accettato della grandezza dell’analita da misurare. Metodi di analisi alternativi non classificati Metodo di analisi di routine utilizzato dal laboratorio non considerato come metodo di riferimento. NOTA Un metodo abituale di analisi può consistere in una semplificazione del metodo di riferimento. Misurazione Insieme di operazioni che hanno come scopo di determinare un valore di una grandezza. NOTA Lo svolgimento delle operazioni può essere automatico. Misurando Grandezza particolare sottoposta alla misurazione.






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Media Per una serie n di misurazioni dello stesso misurando, valore medio, dato dalla formula:

n

xx

n

ii∑

== 1

xi essendo il risultato della ia misurazione. Risultato di una misurazione Valore attribuito ad un misurando, ottenuto tramite misurazione. Sensibilità Rapporto della variazione del valore d’informazione del metodo di analisi rispetto alla variazione della grandezza in analita. La variazione della grandezza in analita è ottenuta generalmente preparando diverse soluzioni campione, oppure effettuando delle aggiunte di analita in una matrice. NOTA 1 È consigliabile evitare di definire, per estensione, la sensibilità di un metodo come la sua capacità di rilevare grandezze deboli. NOTA 2 Un metodo è definito « sensibile » se una debole variazione della grandezza o della quantità dell’analita provoca una variazione importante del valore d’informazione. Segnale di misura Grandezza che rappresenta il misurando, e che gli è funzionalmente legato. Specificità Proprietà di un metodo di analisi di convenire esclusivamente alla determinazione della grandezza dell’analita considerato, con garanzia che il segnale misurato provenga soltanto dall’analita. Tolleranza Deviazione rispetto al valore di riferimento, definita dal laboratorio per un dato livello, nel quale sarà accettato un valore misurato di un materiale di riferimento. Valore di una grandezza Espressione quantitativa di una grandezza particolare, generalmente sotto forma di unità di misura moltiplicata per un numero. Valore vero di una grandezza Valore compatibile con la definizione di una data grandezza particolare. NOTA 1 È un valore che si otterrebbe con una misurazione perfetta NOTA 2 Qualsiasi valore vero è per sua natura indeterminato Valore di riferimento accettato Valore che serve da riferimento, convenuto per un confronto, e che risulta : a) da un valore teorico o stabilito, fondato su principi scientifici; b) da un valore assegnato o certificato, fondato sui lavori sperimentali di un’organizzazione nazionale o internazionale;






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c) da un valore di consenso o certificato, fondato su un lavoro sperimentale in collaborazione e posto sotto gli auspici di un gruppo scientifico o tecnico; Nel quadro particolare del presente documento, il valore di riferimento accettato (o valore convenzionale vero) del materiale di prova è fornito dalla media matematica dei valori di misura ripetuti secondo il metodo di riferimento. Varianza Quadrato della deviazione standard.

4. Principi generali

4.1 Metodologia Per la preparazione di un nuovo metodo abituale, il laboratorio applica un protocollo che include una serie di fasi. La prima fase, che si applica una sola volta per la parte iniziale, o periodicamente, è la convalida del metodo. Questa fase è seguita da un controllo qualità permanente. L’insieme dei dati acquisiti nel corso di queste due fasi permette di valutare la qualità del metodo. I dati acquisiti in queste due fasi sono utilizzati per la stima dell’incertezza di misura. Valutati regolarmente essi costituiscono un indicatore della qualità dei risultati ottenuti con il metodo scelto. Tutte queste fasi sono collegate e costituiscono un procedimento globale che permette di valutare e controllare gli errori di misura.

4.2 Definizione dell’errore di misura Qualsiasi misurazione realizzata con il metodo studiato porta ad un risultato. Questo è inevitabilmente associato ad un errore di misura, definito come la differenza tra il risultato ottenuto ed il valore vero del

Sviluppo o adozione di un metodo

Fase di convalida iniziale

Messa in atto e applicazione del sistema di controllo qualità

Stima dell’incertezza






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misurando. In pratica, il valore vero del misurando è inaccessibile, e si è portati ad utilizzare un valore convenzionalmente accettato come tale. L’errore di misura include due componenti:

Valore vero = Risultato dell’analisi + Errore sistematico + Errore aleatorio L’errore sistematico si traduce in pratica con una distorsione rispetto al valore vero, l’errore aleatorio è l’insieme di errori che accompagnano l’applicazione del metodo. Si può rappresentare graficamente questi errori nel modo seguente:

Gli strumenti di convalida e di controllo qualità permettono di valutare gli errori sistematici e gli errori aleatori, e di monitorare la loro evoluzione nel tempo.

Valore vero Media di un numero infinito di risultati

Risultato di un’analisi

fedeltà

Errore

Errore sistematico Errore aleatorio

Dispersione gaussiana dei risultati

Errore di misura






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5. Convalida di un metodo

5.1 Metodologia L’applicazione della convalida richiede 3 fasi, nelle quali figurano gli obiettivi. Per raggiungere questi obiettivi, il laboratorio dispone di strumenti di convalida. Questi strumenti per un dato obiettivo sono talvolta molteplici, e vengono adattati a varie situazioni. È compito del laboratorio fare la scelta giusta degli strumenti più adatti al metodo da convalidare. Fasi Obiettivi Strumenti di convalida Campi d’applicazione

-Definire le matrici analizzabili -Definire la gamma analizzabile Limite di rilevazione e quantificazione Studio di robustezza

Errore sistematico

o distorsione -Risposta lineare sulla scala dei valori analizzabili Studio di linearità -Specificità del metodo Studio di specificità -Precisione del metodo Confronto con un metodo di riferimento Confronto con materiali di riferimento Confronto interlaboratorio

Errore aleatorio -Precisione del metodo Studio di ripetibilità Studio di riproducibilità intralaboratorio

5.2 Prima fase: campi d’applicazione del metodo 5.2.1 Definizione delle matrici analizzabili La matrice è l’insieme dei costituenti del materiale di prova diversi dall’analita. Nel caso in cui questi costituenti possano avere un’influenza sul risultato di una misurazione, è opportuno che il laboratorio definisca le matrici sulle quali è applicabile il metodo. Ad esempio, in enologia, il dosaggio di taluni parametri può essere influenzato dalle diverse matrici possibili (vini, mosti, vini liquorosi…) In caso di dubbio su un effetto matrice, si potranno realizzare studi più approfonditi nell’ambito dello studio di specificità.






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5.2.2 Limite di rilevazione e di quantificazione Questa fase, evidentemente non è applicabile, e non è necessaria per i metodi il cui limite inferiore non tenda a 0, ad esempio il titolo alcolico volumetrico nei vini, l’acidità totale nei vini, il pH… 5.2.2.1 Definizione normativa Il limite di rilevazione è la quantità minima del composto da dosare che è possibile rilevare, ma non necessariamente quantificata come esatta. Il limite di rilevazione è un parametro delle prove limite. Il limite di quantificazione è la quantità minima del composto che si può dosare con il metodo. 5.2.2.2 Documentazione di riferimento

- Norma NF V03-110, procedura di convalida intralaboratorio di un metodo alternativo rispetto ad un metodo di riferimento.

- Raccolta internazionale dei metodi di analisi – OIV, Stima del limite di rilevazione e di quantificazione di un metodo di analisi (Risoluzione eno 7/2000).

5.2.2.3 Applicazione Molto spesso nella prassi, il limite di quantificazione è più pertinente del limite di rilevazione, essendo quest’ultimo convenzionalmente 1/3 del primo. Vi sono molti metodi che permettono di stimare i limiti di rilevazione e di quantificazione: - Determinazione su bianco - Metodo tramite studio di linearità - Metodo grafico Questi metodi si adattano a varie situazioni, ma si tratta in ogni caso di metodi matematici, i cui risultati hanno solo valore informativo. È importante, quando possibile, introdurre una verifica del valore ottenuto, con uno di questi metodi o empiricamente, utilizzando il protocollo di verifica di un limite di quantificazione predeterminato. 5.2.2.4 Modalità operative 5.2.2.4.1 Determinazione su bianco 5.2.2.4.1.1 Campi d’applicazione Si può utilizzare questo metodo quando l’analisi dei bianchi fornisce risultati che presentano una deviazione standard non nulla. L’operatore potrà valutare l’opportunità di utilizzare bianchi reattivi, o bianchi matrice. Se il bianco, per ragioni legate ad un pre-trattamento non gestito del segnale, talvolta non è misurabile e non offre alcuna variazione registrabile (deviazione standard 0), il metodo si può applicare su una concentrazione molto bassa di analita, vicino al bianco.






15

5.2.2.4.1.2 Protocollo di base e calcoli Procedere all’analisi di n materiali di prova assimilati ai bianchi, con n superiore o uguale a 10. - Calcolare la media dei risultati xi ottenuti:

n

xx

n

ii

blanc∑

== 1

- Calcolare la deviazione standard dei risultati xi ottenuti:

11

2)(−=

∑ −=

n

blanciS

n

iblanc

xx

- A partire da questi risultati si definisce convenzionalmente il limite di rilevazione con la formula:

).3( blancblancd SxL +=

- A partire da questi risultati si definisce convenzionalmente il limite di quantificazione con la formula:

).10( blancblancq SxL +=

Esempio : La tavola seguente fornisce qualche risultato ottenuto durante la determinazione del limite di rilevazione per il dosaggio abituale di Biossido di zolfo libero.

N° del materiale

di prova X

(in mg/l) 1 0 2 1 3 0 4 1.5 5 0 6 1 7 0.5 8 0 9 0

10 0.5 11 0 12 0






16

I valori calcolati sono i seguenti:

q = 12

Mbianco = 0,375

Sbianco = 0,528 mg/l

LR = 1.96 mg/l

LQ = 5.65 mg/l

5.2.2.4.2 Metodo di studio di linearità 5.2.2.4.2.1 Campi d’applicazione Questo metodo si può applicare in tutti i casi, e obbligatoriamente quando il metodo di analisi non presenta rumori di fondo. Esso utilizza i dati calcolati nel corso dello studio di linearità. NOTA Questo approccio statistico può essere distorto e dare risultati pessimistici quando la linearità è calcolata su una scala molto

ampia di valori di materiali di riferimento, e i cui risultati delle misure presentano deviazioni standard variabili. In un caso del genere, lo studio di linearità limitato ad una scala di valori bassi, vicino a 0, e di dispersione più omogenea permetterà una stima più pertinente.

5.2.2.4.2.2 Protocollo di base e calcoli Utilizzare i risultati ottenuti con lo studio di linearità che hanno permesso di calcolare i parametri della funzione di taratura y = a+ b.x I dati da recuperare dallo studio di linearità sono (vedere il capitolo 5.3.1, studio di linearità):

- inclinazione della retta di regressione:

∑ −

∑

=

=−−

= n

i

n

iyixi

xi

MyMxb

Mx1

21

)(

))((

- deviazione standard residua: 2

,,1 1

2)ˆ(−=

∑∑ −= =

pn

jijiS

n

i

p

jres

yy

- deviazione standard sull’ordinata all’origine (da calcolare):

+=∑ −

=

n

i

resa

xipx

npSSMx

M

1

2

2

)(1






17

Le stime del limite di rilevazione LR, e del limite di quantificazione LQ si calcolano secondo le formule seguenti:

LR bSa×=3

Limite di rilevazione stimato

LQ bSa×=10

Limite di quantificazione stimato

Esempio: Stima dei limiti di rilevazione e di quantificazione del dosaggio dell’acido sorbico tramite elettroforesi capillare, a partire dai dati di linearità acquisiti su una gamma da 1 a 20 mg.L-1.

X (rif) Y1 Y2 Y3 Y4 1 1.9 0.8 0.5 1.5 2 2.4 2 2.5 2.1 3 4 2.8 3.5 4 4 5.3 4.5 4.7 4.5 5 5.3 5.3 5.2 5.3

10 11.6 10.88 12.1 10.5 15 16 15.2 15.5 16.1 20 19.7 20.4 19.5 20.1

Numero di materiali di riferimento

n = 8 Numero di repliche

p = 4 Retta (y = a + b*x)

b = 0.9972

a = 0.51102 Deviazione standard residua:

Sres = 0.588 Deviazione standard sull’ordinata

all’origine Sa = 0.1597

Il limite di rilevazione stimato è LR = 0.48 mg.L-1 Il limite di quantificazione stimato è LQ = 1.6 mg.L-1

5.2.2.4.3 Metodo grafico derivato dal rumore di fondo della registrazione 5.2.2.4.3.1 Campi di applicazione Questa procedura si può applicare ai metodi di analisi che forniscono una registrazione grafica (cromatografia…) che presentano un rumore di fondo. I limiti sino stimati a partire da uno studio del rumore di fondo.






18

5.2.2.4.3.2 Protocollo di base e calcoli Procedere alla registrazione di bianchi reattivi procedendo per 3 serie di 3 iniezioni a più giorni di intervallo. Determinare i valori seguenti :

• hmax il maggiore scarto di ampiezza in ordinata del segnale osservato tra due punti di acquisizione, fuori deriva, su una distanza uguale a venti volte la larghezza a media altezza del picco corrispondente alla sostanza da ricercare, centrato sul tempo di ritenzione del composto studiato.

• R il fattore di risposta quantità / segnale, espresso in altezza. Il limite di rilevazione LR, e il limite di quantificazione LQ si calcolano secondo le formule seguenti :

LR = 3 hmax R LQ = 10 hmax R 5.2.2.4.4 Verifica di un limite di quantificazione predeterminato Questo approccio permette di convalidare un valore di quantificazione ottenuto con approccio statistico, o eventualmente empiricamente. 5.2.2.4.4.1 Campi d’applicazione Questo metodo permette di verificare che un limite di quantificazione dato a priori è accettabile. È applicabile quando il laboratorio ha la capacità di disporre di almeno 10 materiali di prova che comportino quantità di analiti conosciuti, si situano al livello del limite di quantificazione stimata. Nel caso di metodi dal segnale specifico, non sensibili agli effetti matrice, questi materiali potranno essere delle soluzioni sintetiche il cui valore di riferimento viene ottenuto mediante formulazione. Negli altri casi, saranno utilizzati vini (o mosti) il cui valore del misurando, ottenuto con il metodo di riferimento, sarà uguale al limite da studiare. Ovviamente in questo caso, il limite di quantificazione del metodo di riferimento deve essere inferiore a questo valore. 5.2.2.4.4.2 Protocollo di base e calcolo Analizzare n materiali di prova indipendenti il cui valore accettato è uguale al limite di quantificazione da verificare, n deve essere almeno uguale a 10.

- Calcolare la media delle n misurazioni : n

xx

n

ii

LQ

∑== 1

- Calcolare la deviazione standard di n misurazioni : 11

2)(−=

∑ −=

n

LQiS

n

iLQ

xx






19

con ix risultati della misurazione del ia materiale di prova. Si devono rispettare le due condizioni seguenti : a) Assicurarsi che la grandezza media misurata LQx non sia diversa dal limite di quantificazione

predeterminato LQ:

Se

n

xLQ

S LQ

LQ− < 10 allora il limite di quantificazione LQ è giudicato valido.

NOTA 10 è un valore puramente convenzionale relativo al criterio della LQ.

b) Assicurarsi che il limite di quantificazione sia diverso da 0:

Se 5 LQs < LQ allora il limite di quantificazione è diverso da 0.

Il valore 5 corrisponde ad un valore vicino di allargamento della deviazione standard tenendo conto del rischio α e del rischio β per assicurarsi che LQ sia diverso da 0. Questo porta a verificare che il coefficiente di variazione per LQ sia inferiore al 20%. NOTA 1 Si ricorda che il limite di rilevazione è ottenuto dividendo il limite di quantificazione per 3. NOTA 2 È opportuno verificare che il valore di SLQ non sia troppo grande (in quanto produrrebbe un test artificialmente positivo), e corrisponda ad una deviazione standard ragionevole della variabilità dei risultati al livello considerato. È compito del laboratorio fare questa valutazione critica del valore di SLQ.

Esempio: Verifica del limite di quantificazione del dosaggio dell’acido malico con il metodo enzimatico. Limite di quantificazione stimato: 0.1 g.L-1

Vino Valori 1 0.1 2 0.1 3 0.09 4 0.1 5 0.09 6 0.08 7 0.08 8 0.09 9 0.09

10 0.08

Media: 0.090

Deviazione standard: 0.008

Prima condizione: 1087.3 <=−

n

xLQ

S LQ

LQ Il limite di quantificazione a 0.1 è considerato valido.






20

Seconda condizione: 1.004.0.5 <=LQS Il limite di quantificazione è ritenuto notevolmente diverso da 0.

5.2.3 Robustezza 5.2.3.1 Definizione La robustezza è la capacità di un metodo di dare risultati concordanti in presenza di piccoli cambiamenti delle condizioni sperimentali che si possono verificare durante la procedura. 5.2.3.2 Determinazione Qualora esista un dubbio sull’influenza della variazione dei parametri operativi, il laboratorio metterà in atto l’applicazione scientifica dei piani di esperimenti che permetteranno di fare intervenire questi parametri operativi critici nel campo di applicazione che è possibile riscontrare in condizioni normali. Questi test sono faticosi da realizzare.

5.3 Seconda parte: studio dell’errore sistematico 5.3.1 Studio di linearità 5.3.1.1 Definizione normativa La linearità di un metodo è la sua capacità, entro un certo intervallo, di fornire un valore d’informazione oppure risultati proporzionali alla quantità di analiti da dosare nel materiale di prova. 5.3.1.2 Documenti di riferimento

- Norma NF V03-110, procedura di convalida intralaboratorio di un metodo alternativo rispetto ad un metodo di riferimento.

- Norma ISO 11095, Taratura lineare che utilizza materiali di riferimento. - Norma ISO 8466-1 Qualità dell’acqua – Taratura e valutazione dei metodi di analisi e di stima

delle caratteristiche di prestazione

Applicazione Lo studio di linearità permette di definire un campo di linearità, e di convalidarlo. Questo studio è fattibile quando il laboratorio può disporre di materiali di riferimento stabili i cui valori accettati siano stati acquisiti con certezza (in teoria questi valori dovrebbero avere un’incertezza uguale a






21

0). Potrà quindi trattarsi di materiali di riferimento interni dosati con materiale tarato, di vini o di mosti il cui valore sia dato dalla media di almeno 3 ripetizioni del metodo di riferimento, di materiali di riferimento esterni, o di materiali di riferimento esterni certificati. In quest’ultimo caso, e solo in questo caso, tale studio permette altresì il raccordo del metodo. Il piano sperimentale realizzato potrà quindi essere considerato come una taratura. In ogni caso, conviene accertarsi che la matrice del materiale di riferimento sia compatibile con il metodo. Infine, si dovranno effettuare i calcoli con il risultato finale della misurazione, e non con il valore del segnale. Si suggeriscono due metodi:

- Metodo di tipo ISO 11095 il cui principio consiste nel confrontare l’errore residuo con l’errore sperimentale grazie ad un test di Fischer. Questo metodo è valido soprattutto per gamme di lavoro relativamente ristrette (in cui il misurando non varia oltre un fattore 10). D’altra parte, in condizioni sperimentali che generano un errore di riproducibilità bassa, il test diventerà eccessivamente rigoroso. Al contrario, in caso di condizioni sperimentali mediocri, il test sarà facilmente positivo e perderà ugualmente la sua pertinenza. Questo approccio richiede una buona omogeneità nel numero di misure su tutta la gamma studiata.

- Metodo di tipo ISO 8466, il cui principio consiste nel confrontare l’errore residuo prodotto dalla

regressione lineare, con l’errore residuo prodotto da una regressione polinomiale (di ordine 2 per esempio) realizzata a partire dagli stessi dati. Se il modello polinomiale dà un errore residuo significativamente più debole, si potrà concludere che non vi sia linearità. Questo metodo è indicato precisamente quando esiste un rischio di grande dispersione sperimentale a una delle due estremità del campo. È quindi naturalmente molto adatto ai metodi di analisi delle tracce. Non è utile lavorare con una omogeneità del numero di misura su tutta la gamma di lavoro, e si raccomanda altresì di rafforzare il numero di misure alle estremità del campo.

5.3.1.4 Metodo di tipo ISO 11095 5.3.1.4.1 Protocollo di base Si suggerisce di operare con un numero n di materiali di riferimento. Questo numero sarà superiore a 3, quindi non è necessario arrivare oltre 10. I materiali di riferimento saranno misurati p volte, in condizioni di riproducibilità, p sarà superiore a 3, anche se generalmente si consiglia un numero di 5. I valori accettati dei materiali di riferimento dovranno essere ripartiti in modo regolare sulla scala dei valori studiati. Il numero di misure deve essere lo stesso per tutti i materiali di riferimento. NOTA È importante che le condizioni di riproducibilità permettano l’intervento del numero massimo di fonti potenziali di variabilità, anche a rischio che il test si concluda con una eccessiva non-linearità.






22

I risultati vengono rappresentati in una tavola come la seguente :

Valori misurati Materiale x di riferimento

Valore accettato del materiale di riferimento

Replica1 … Replica j … Replica p

1 x1 y11 … y1j … y1p

… … … … … … … i xi yi1 … yij … yip

… … … … … … …

n xn yn1 … ynj … ynp

5.3.1.4.2 Calcoli e risultati 5.3.1.4.2.1 Definizione del modello di regressione Il modello da calcolare e da testare è il seguente:

ijiij xbay ε++= . dove

ijy è jia replica del iio materiale di riferimento

ix è il valore accettato del io materiale di riferimento. b è l’inclinazione della retta di regressione. a è l’ordinata all’origine della retta di regressione.

ixba .+ rappresenta la speranza del valore di misurazione del iio materiale di riferimento.

ijε è la deviazione tra yij e la speranza del valore di misurazione del iio materiale di riferimento. 5.3.1.4.2.2 Stima dei parametri I parametri della retta di regressioni si ottengono a partire dalle formule seguenti :






23

- media delle p misurazioni del io materiale di riferimento ∑=

=p

jijypyi

1

1

- media di tutti i valori accettati degli n materiali di riferimento ∑=

=n

iix xnM

1

1

- media di tutte le misurazioni ∑=

=n

iiynMy

1

1

- stima inclinazione b ∑ −

∑

=

=−−

= n

i

n

iyixi

xi

MyMxb

Mx1

21

)(

))((

- stima ordinata all’origine a xy MbMa ×−=

- valore di regressione associato al io materiale di riferimento iy ii xbay ×+=ˆ

- residuo eij iijij yye ˆ−= 5.3.1.4.2.3 Rappresentazioni grafiche I risultati si possono presentare ed analizzare graficamente. Si utilizzano due tipologie di rappresentazioni grafiche. - Il primo tipo di grafico è la rappresentazione dei valori misurati in funzione dei valori accettati dei materiali di riferimento. È altresì rappresentata la retta di sovrapposizione calcolata.






24

R e t t a di sov r a pposi z i one

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00

V al or i accet t a t i de i mat er i a l i di r i f er i ment o

y=x

y i ^ (r egr essi one)

r epl i ca 1

r epl i ca 2

r epl i ca 3

r epl i ca 4

" r epl i ca 1"

-

- Il secondo grafico realizzato è la rappresentazione dei valori residui in funzione dei valori stimati dei materiali di riferimento ( y ) con la retta di sovrapposizione. Questo grafico è un buon indicatore della deviazione rispetto all’ipotesi di linearità: il campo di linearità è valido se i valori residui sono ripartiti equamente tra valori positivi e valori negativi. Valori residui rispetto ai valori corretti:

esempio di metodo lineare

-0,2

-0,15

-0,1

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0 2 4 6 8 10 12

Valori corretti y^

Valo

ri re

sidu

i

replica 1

replica 2

replica 3

replica 4






25

Valori residui rispetto ai valori corretti:esempio di metodo non lineare

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8 10 12

Valori corretti y^

Valo

ri re

sidu

i replica 1

replica2

replica 3

replica 4

In caso di dubbio sulla linearità della regressione, si potrà applicare un test di Fischer-Snedecor per testare l’ipotesi: « Il campo di linearità non è valido », oltre all’analisi grafica. 5.3.1.4.2.4 Test dell’ipotesi di linearità Inizialmente è utile definire alcuni valori di errori legati alla taratura, che si potrà stimare a partire dai dati acquisiti nel corso dell’esperimento. A partire da questi risultati si attua un test statistico che permette di testare l’ipotesi di non validità del campo di linearità: si tratta del test di Fischer-Snedecor.

5.3.1.4.2.4.1 Definizioni di errori legati alla taratura Questi errori sono segnalati come una deviazione standard, costituita dalla radice quadrata del rapporto tra la somma del quadrato e un grado di libertà. Errore residuo L’errore residuo corrisponde all’errore tra i valori misurati e il valore dato dalla retta di regressione. La somma dei quadrati dell’errore residuo è la seguente: ∑∑ −

= =

=n

i

p

jres iijQ yy

1 1

2)ˆ(

Il numero di gradi di libertà è np-2.






26

La deviazione standard residua è quindi stimata con la formula :

2

1 1

2)ˆ(−=

∑∑ −= =

np

iijS

n

i

p

jres

yy

Errore sperimentale L’errore sperimentale corrisponde alla deviazione standard di riproducibilità dell’esperimento. La somma dei quadrati dell’errore sperimentale è la seguente:

∑∑ −= =

=n

i

p

jiijQ yy

1 1

2exp )(

Il numero di gradi di libertà è np-n. La deviazione standard sperimentale (riproducibilità) si stima quindi con la formula:

nnp

iijS

n

i

p

jyy

−=∑∑ −

= =1 1

2

exp

)(

NOTA Questa grandezza è talvolta anche annotata come SR. Difetto di correzione L’errore del difetto di correzione è l’errore residuo dedotto dall’errore sperimentale. La somma dei quadrati del difetto di correzione è :

expQQQ resdef −= oppure

∑∑ −∑∑ −= == =

−=n

i

p

j

n

i

p

jdef iijiijQ yyyy

1 1

2

1 1

2 )()ˆ(

Il numero di gradi di libertà è n-2 La deviazione standard del difetto di correzione è stimato con la formula :

2exp

−−= n

QQS resdef

oppure

21 1

2

1 1

2 )()ˆ(−

−=

∑∑ −∑∑ −= == =

n

iijiijS

n

i

p

j

n

i

p

jdef

yyyy






27

5.3.1.4.2.4.2 Test di Fischer-Snedecor

Il rapporto exp

2

2

SSdefFobs = segue la legge di Fischer-Snedecor con i gradi di libertà n-2, np-n.

Il valore sperimentale calcolato Fobs è confrontato con il valore limite: F1-α(n-2,np-n), estratto dalla tavola della legge di Snedecor. Il valore di α generalmente utilizzato in pratica è del 5%. Se Fobs ≥ F1-α l’ipotesi di non validità del campo di linearità è accettata (con un rischio d’errore α del 5%). Se Fobs < F1-α l’ipotesi di non validità del campo di linearità è rifiutata

Esempio : Studio di linearità del dosaggio dell’acido tartarico tramite elettroforesi capillare. Sono utilizzati 9 materiali di riferimento, si tratta di soluzioni sintetiche di acido tartarico, titolati a partire da un bilancio collegato a masse campione.

Materiale.rif Ti (rif) Y1 Y2 Y3 Y4 1 0.38 0.41 0.37 0.4 0.41 2 1.15 1.15 1.12 1.16 1.17 3 1.72 1.72 1.63 1.76 1.71 4 2.41 2.45 2.37 2.45 2.45 5 2.91 2.95 2.83 2.99 2.95 6 3.91 4.09 3.86 4.04 4.04 7 5.91 6.07 5.95 6.04 6.04 8 7.91 8.12 8.01 8.05 7.9 9 9.91 10.2 10 10.09 9.87

Retta di regressione

Retta (y = a + b*x) b = 1.01565

a = - 0.00798

Errori legati alla taratura Deviazione standard residua

Sres= 0.07161 Deviazione standard di riproducibilità sperimentale

Sexp = 0.07536 Deviazione standard del difetto di correzione Sdef = 0.0548

Interpretazione, test di Fischer-Snedecor

Fobs = 0.53 < F1-α = 2.37 L’ipotesi di non validità del campo di linearità è rifiutata

5.3.1.5 Metodo ISO 8466 5.3.1.5.1 Protocollo di base È opportuno preparare un numero n di materiali di riferimento. Questo numero sarà superiore a 3, quindi non è necessario andare oltre 10. I materiali di riferimento saranno misurati alcune volte, in condizioni di riproducibilità, questo numero di misure può essere basso al centro del campo di studio (minimo = 2) e deve






28

essere più elevato alle estremità del campo dove si consiglia generalmente un numero minimo di 4. I valori accettati dei materiali di riferimento dovranno essere ripartiti in modo regolare sulla scala dei valori studiata. NOTA È importante che le condizioni di riproducibilità lascino intervenire il massimo numero di fonti di variabilità potenziale. I risultati sono riportati in una tabella come la seguente:



Replica 1 Replica 2 Replica j … Replica p

1 x1 y11 y12 y1j … y1p

… … … … … … i xi yi1 yi2

… … … … … … n xn yn1 … ynj … ynp

5.3.1.5.2 Calcoli e risultati 5.3.1.5.2.1 Definizione del modello di regressione lineare Calcolare il modello di regressione lineare secondo i calcoli precedentemente dettagliati. Successivamente si calcolerà la deviazione standard dell’errore residuo del modello lineare Sres, secondo i calcoli indicati al § 5.3.1.4.2.4.1 5.3.1.5.2.2 Definizione di modello di regressione polinomiale Diamo qui di seguito il calcolo del modello polinomiale di ordine 2 Conviene determinare i parametri del modello di regressione polinomiale di ordine 2 applicabile ai dati del piano dell’esperimento.

cbay xx ++= 2

Si tratta di determinare i parametri a, b, e c. Questa determinazione è generalmente automatizzabile nei fogli elettronici e software di statistica. Le formule di stima di questi parametri sono i seguenti :






29

∑ ∑ ∑

∑∑ ∑ ∑∑

∑∑∑

∑ ∑ ∑ ∑∑∑ ∑ ∑∑

∑∑∑

−+

−−

−

−+

−−

−

=

i i iiii

i i iii

iii

ii

ii

i i i iii

iiiii

i i iii

iiii

ii

iii

iiN

iN

Ni

N

a

xxxxxxxxxixx

xyxyxxyxyxxxixyx

22

32233

2

24

223

2

22

∑ ∑ ∑

∑∑ ∑ ∑∑

∑∑∑

∑ ∑ ∑ ∑∑∑ ∑ ∑∑∑∑∑∑

−+

−−

−

−+

−−

−

=

i i iiii

i i iii

iii

ii

ii

i i i iii

iiii

i i iii

iiii

ii

ii

iii

ii

iiN

iN

iNNb

xxxxxxxxxixx

xyxxyxxxxyxyxyxx

22

32233

2

24

2322324

∑ ∑ ∑

∑∑ ∑ ∑∑

∑∑∑

∑ ∑

∑∑∑ ∑ ∑∑ ∑∑∑∑∑∑

−+

−−

−

−+

−−

−

=

i i iiii

i i iii

iii

ii

ii

i i iiiii

i i iiii

i iiii

iii

ii

ii

ii

ii

iiN

iN

ii

c

xxxxxxxxxixx

xxxyxyxxyxxyxxyxx

2

2

2

32233

2

24

2

3223324

Una volta stabilito il modello si calcoleranno i valori seguenti:

- valore di regressione associato all’ io materiale di riferimento iy′ˆ cbay xxi ++=′ 2ˆ

- residuo eij iijij yye ′−=′ ˆ La deviazione standard residua del modello polinomiale

2

1 1

2)ˆ(−

=∑∑ ′−

′ = =

np

iijn

i

p

jres

yyS

5.3.1.5.2.3 Confronto delle deviazioni standard residue Si calcola

SSDS resres NN ′−−−= 222 )3()2(






30

Successivamente

SDS

res

PG′

= 2

2

Il valore PG è confrontato al valore limite F1-α dato dalla tavola di Fischer-Snedecor per un livello di attendibilità 1-α e per un grado di libertà 1 e (N-3). NOTA In generale il rischio α utilizzato è il 5%. Il test in certi casi può essere ottimista ed un rischio del 10 % potrà rivelarsi più realistico. Se PG ≤ F1-α : la funzione di taratura non lineare non dà una correzione migliorata; ad esempio, la funzione di taratura è lineare. Se PG > F1-α : si dovrà ridurre il più possibile l’entità del lavoro per ottenere una funzione di taratura lineare: altrimenti i valori d’informazione che provengono dai campioni analizzati dovranno essere valutati utilizzando una funzione di taratura non lineare.

Esempio : Caso teorico.

Ti (rif) Y1 Y2 Y3 Y4

1 35 22,6 19,6 21,6 18,42 62 49,6 49,8 53 3 90 105,2 103,5 4 130 149 149,8 5 205 203,1 202,5 197,3 6 330 297,5 298,6 307,1 294,2

Modello lineare e modello polinomiale metodo : caso teorico

0 50

100 150 200 250 300 350

0 50 100 150 200 250 300 350

Valori accettati dei materiali di riferimento

Media valori misurati

y=x yi^(reg lin) yi'^(reg poly) yi (media)

Regressione lineare y = 1.48.x – 0.0015

Sres = 13.625






31

Regressione polinomiale y= - 0,0015x² + 1,485x - 27,2701

S'res=7,407

Test di Fischer PG=10,534 > F(5%)=10,128

PG>F la funzione di taratura lineare non può essere presa in considerazione 5.3.2 Specificità 5.3.2.1 Definizione normativa La specificità di un metodo è la sua capacità di misurare solo il composto ricercato. 5.3.2.2 Applicazione Se esiste un dubbio sulla specificità del metodo testato, il laboratorio potrà applicare dei piani di esperimento con l’obiettivo di verificare la specificità. Qui di seguito proponiamo due tipi di esperimenti complementari che potranno rispondere ad un gran numero di casi che si trovano in enologia. -Il primo test è la prova delle aggiunte dosate. Permette di verificare che il metodo misuri l’integralità dell’analita. -Il secondo test permette di verificare l’influenza di altri composti sul risultato di misurazione. 5.3.2.3 Modalità operative 5.3.2.3.1 Test delle aggiunte dosate 5.3.2.3.1.1 Campo d’applicazione Questo test permette di verificare che il metodo misuri l’integralità dell’analita. Il piano dell’esperimento si basa su delle aggiunte dosate del composto ricercato. Si può applicare soltanto sui metodi non essendo sensibile agli effetti matrice. 5.3.2.3.1.2 Protocollo di base Si tratta di ritrovare in modo significativo le grandezze aggiunte su materiali di prova analizzati prima e dopo le aggiunte. Effettuare aggiunte dosate variabili su n materiali di prova. La concentrazione iniziale di analita dei materiali di prova, e le aggiunte dosate sono scelti in modo da coprire il campo di applicazione del metodo. Questi materiali di prova devono essere costituiti da tipologie di matrice destinate ad essere analizzate di routine. Si consiglia di utilizzare almeno 10 materiali di prova.






32

I risultati sono riportati in una tavola come la seguente:

NOTA 1 Si realizza un’aggiunta con una soluzione campione pura. Si consiglia di scegliere questa aggiunta dello stesso ordine di

grandezza del materiale di prova sul quale questa viene effettuata. Ecco perché i materiali di prova più concentrati devono essere diluiti per restare nel campo di applicazione del metodo.

NOTA 2 Si consiglia di preparare le aggiunte a partire dalle soluzioni campione indipendenti, in modo da evitare qualsiasi errore

sistematico. NOTE 3 La qualità dei valori x e w si può migliorare utilizzando diverse ripetizioni.

5.3.2.3.1.3 Calcoli e risultati Il principio di misura della specificità consiste nello studio della retta di regressione r = a + b.v e nella verifica che l’inclinazione b sia equivalente a 1 e che l’ordinata all’origine a sia equivalente a 0.

5.3.2.3.1.3.1 Studio della retta di regressione r = a + b.v I parametri della retta di regressione si ottengono a partire dalle formule seguenti:

- media delle grandezze aggiunte v n

vv

n

ii∑

== 1

- media delle grandezze trovate r n

rr

n

ii∑

== 1

Materiale di prova

Grandezza prima dell’aggiunta

(x)

Grandezza aggiunta

(v)

Grandezza dopo aggiunta

(w)

Grandezza risultante

(r) 1 x1 v1 w1 r1 = w1 – x1 ... ... ... ... ... i xi vi wi ri = wi – xi

... ... ... ... ... n Xn Vn wn rp = wn – xn






33


∑

=

=−−

= n

i

n

iii

vvi

rrvvb

1

21

)(

))((

- stima ordinata all’origine a vbra .−=

- valore di regressione associato al ia materiale di riferimento iy ii vbar ×+=ˆ

- deviazione standard residua

( )2

ˆ1

2

−

−=

∑=

n

rrS

n

iii

res

- deviazione standard sull’inclinazione

−=

∑=

n

ii

resb

vvSS

12)(

1

- deviazione standard sull’ordinata all’origine

−+=∑

=

n

ii

resa

vvv

nSS

12

2

)(1

5.3.2.3.1.3.2 Gestione dei risultati Si tratta di concludere che vi sia un’assenza di interferenze e una specificità accettabile. Questo è vero se la retta di sovrapposizione r = a + bv è equivalente alla retta y=x. Per far questo vengono realizzati due test: -Test dell’ipotesi dell’inclinazione b della retta di sovrapposizione equivalente a 1. -Test dell’ipotesi dell’ordinata all’origine equivalente a 0.






34

Queste ipotesi sono testate con un test di Student associato al rischio di errore dell’1% in generale. In certi casi un rischio del 5% può rivelarsi più realistico.

Sia Tcritico, bilaterale[ ddl ; 1%] che corrisponde ad una variabile bilaterale di Student associato al rischio di errore dell’1% per un numero ddl di gradi di libertà.

Fase 1: calcoli

Calcolo del criterio di confronto sull’inclinazione a 1 b

obs Sb

T1−

=

Calcolo del confronto sull’ordinata all’origine a 0 a

obs Sa

T ='

Calcolo del valore critico di Student: Tcritico, bilaterale [p-2; 1%]

Fase 2: interpretazione

Se Tobs è inferiore a Tcritico l’inclinazione della retta di regressione è equivalente 1 Se T’obs è inferiore a Tcriitico l’ordinata all’origine della retta di regressione è equivalente a 0. Se si verificano le due condizioni, allora la retta di sovrapposizione equivale a = y=x, e il metodo

è considerato specifico. NOTA 1 Si potrebbe calcolare, a partire da questi risultati, un tasso di sovrapposizione medio che permetta di quantificare la specificità. In nessun caso, si potrà applicare per « correggere » i risultati. In effetti se viene messa in evidenza una distorsione, il metodo abituale non si può convalidare rispetto ad un rendimento del 100%. NOTA 2 Poiché il principio del test consiste nel calcolare una retta, è importante prendere almeno tre livelli di aggiunte e scegliere correttamente il loro valore per ottenere una ripartizione ottimale dei punti.

5.3.2.3.1.3.3 Rappresentazione grafica della retta di sovrapposizione

Esempio di specificità

La specificità è accettata

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

X : Ttenore aggiunto

Y: T

enor

e rit

rova

to

Y = X

Relazione stimata tra il tenore aggiunto e il tenore ritrovato

La specificità non è accettata

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

X :Tenore aggiunto

Y: T

enor

e rit

rova

to

Y = X

elazione stimata tra il tenore aggiunto e il tenore ritrovatoe il tenore it t






35

5.3.2.3.2 Studio dell’influenza di altri composti sul risultato della misurazione 5.3.2.3.2.1 Campo d’applicazione Nel caso in cui il laboratorio sospetti l’interazione di composti diversi da quelli analizzati, si potrà attuare un piano sperimentale per testare l’influenza di vari composti. Il piano che proponiamo permette la ricerca dell’influenza di composti definiti a priori: il laboratorio, grazie alla sua conoscenza del processo analitico ed al suo know how, deve riuscire a definire un certo numero di composti che si potrebbero trovare nel vino, e che potrebbero influenzare il risultato analitico. 5.3.2.3.2.2 Protocollo di base e calcoli Analizzare n vini in doppio, prima e dopo l’apporto del composto che si sospetta abbia un’influenza sul risultato analitico, con n che deve essere almeno uguale a 10. Si calcoleranno i valori medi Mxi delle 2 misure xi e x’i effettuate prima dell’apporto e i valori medi Myi delle 2 misure yi e y’i effettuate dopo apporto, successivamente la differenza di tra i valori Mxi e Myi. I risultati dell’esperimento si potranno rappresentare nella seguente tabella:

x : Prima di Apporto y : Dopo apporto Medie Differenza Campioni Rep1 Rep2 Rep1 Rep2 x y d 1 x1 x’1 y1 y’1 Mx1 My1 d1=Mx1-My1 … … … … … … … … i xi x’i yi y’i Mxi Myi di=Mxi-Myi … … … … … … … … n xn x’n yn y’n Mxn Myn dn= Mxn-Myn

La media dei risultati prima dell’apporto Mx ∑=

=n

iix MxnM

1

1

La media dei risultati dopo l’apporto My ∑=

=n

iiy MynM

1

1

Calcolare la media delle differenze Md MxMyndM

n

i

id −==∑=1






36

Calcolare la deviazione standard delle differenze Sd 11

2)(−=

∑ −=

n

diS

n

id

Md

Calcolare lo Z-score d

dscore S

MZ =

5.3.2.3.2.3 Interpretazione

Se lo Zscore è inferiore o uguale a 2, si può ritenere con un rischio del 5% che l’influenza del composto aggiunto è trascurabile sul risultato d’analisi.

Se lo Zscore è superiore a 2, si può ritenere con un rischio del 5% che il composto aggiunto ha un’influenza sul risultato d’analisi.

NOTA L’interpretazione dello Zscore è possibile mella misura in cui si considera l’ipotesi che le deviazioni seguano una legge normale con un 95% di certezza.

Esempio: Studio dell’interazione di composti che si possono trovare nei campioni, sul dosaggio di glucosio fruttosio nei vini tramite una calibratura a infrarossi a trasformazione di Fourier. (IRTF)

Prima dell’apporto

+ 250 mg.L-1 sorbato di potassio

+ 1 g.L-1 acido salicilico Differenze

vino rep1 rep2 rep1 rep2 rep1 rep2 diff sorbato diff salicilico

1 6.2 6.2 6.5 6.3 5.3 5.5 0.2 -0.8 2 1.2 1.2 1.3 1.2 0.5 0.6 0.05 -0.65 3 0.5 0.6 0.5 0.5 0.2 0.3 -0.05 -0.3 4 4.3 4.2 4.1 4.3 3.8 3.9 -0.05 -0.4 5 12.5 12.6 12.5 12.7 11.5 11.4 0.05 -1.1 6 5.3 5.3 5.4 5.3 4.2 4.3 0.05 -1.05 7 2.5 2.5 2.6 2.5 1.5 1.4 0.05 -1.05 8 1.2 1.3 1.2 1.1 0.5 0.4 -0.1 -0.8 9 0.8 0.8 0.9 0.8 0.2 0.3 0.05 -0.55

10 0.6 0.6 0.5 0.6 0.1 0 -0.05 -0.55

Sorbato di potassio Md = 0.02 Sd = 0.086 Zscore = 0.23<2

Acido salicilico Md = -0.725 Sd = 0.282 Zscore = 2.57>2

In conclusione, si può dire che il sorbato di potassio non influenza il dosaggio di glucosio fruttosio con la calibratura IRTF studiata. Per contro, l’acido salicilico presenta un’influenza, e si consiglia di fare in modo che i campioni non contengano acido salicilico, per restare nel quadro di validità della calibratura studiata.






37

5.3.3 Studio dell’esattezza del metodo 5.3.3.1 Presentazione della fase 5.3.3.1.1 Definizione Per esattezza si intende la concordanza tra il valore medio ottenuto da un'ampia serie di risultati e un valore di riferimento accettato. 5.3.3.1.2 Principi generali Quando il valore di riferimento deriva da un sistema certificato, lo studio di precisione potrà essere considerato come un raccordo. Si tratterà segnatamente, di due casi specifici: -Raccordo con dei materiali di riferimento certificati: in questo caso, questo studio di precisione potrà essere intrapreso congiuntamente allo studio di linearità e di taratura, utilizzando il piano sperimentale descritto per quest’ultimo studio. -Raccordo con una catena certificata di analisi dei confronti interlaboratorio. Gli altri casi che utilizzano riferimenti non derivanti da sistemi certificati, sono i più comuni nei laboratori di enologia di routine. Converrà quindi, parlare di confronti: -Confronto con un metodo di riferimento -Confronto con i risultati di una catena non certificata di analisi di confronto interlaboratorio -Confronto con materiali di riferimento interni, o esterni non certificati 5.3.3.1.3 Documenti di riferimento

- Norma NF V03-110, Procedura di convalida interlaboratorio di un metodo alternativo rispetto ad un metodo di riferimento.

- Norma NF V03-115, Guida per l’utilizzo di materiali di riferimento. - Norma ISO 11095, Taratura lineare con l’utilizzo di materiali di riferimento. - Norma ISO 8466-1, Qualità dell’acqua – Taratura e valutazione dei metodi di analisi e stima

delle caratteristiche di prestazione. - Norma ISO 57025, Esattezza dei risultati e metodi di misura

5.3.3.2 Confronto del metodo abituale con il metodo di riferimento OIV 5.3.3.2.1 Campo d’applicazione Si applicherà questo metodo nel caso in cui il laboratorio pratichi il metodo di riferimento OIV, o eventualmente un metodo, raccordato, convalidato e le cui qualità delle prestazioni siano conosciute e rispondano alle esigenze dei clienti del laboratorio.






38

Per studiare l’esattezza tra i due metodi, conviene inizialmente assicurarsi della qualità della ripetibilità del metodo da convalidare e confrontarla con il metodo di riferimento. La metodologia per realizzare il confronto delle ripetibilità è descritta nel capitolo sulla ripetibilità. 5.3.3.2.2 Esattezza del metodo abituale rispetto al metodo di riferimento 5.3.3.2.2.1 Definizione Per esattezza si intende la concordanza tra i valori ottenuti con il metodo di riferimento accettato e quello ottenuto con il metodo abituale, indipendentemente dagli errori di precisione dei due metodi. 5.3.3.2.2.2 Campo di applicazione L‘esattezza del metodo abituale rispetto al metodo di riferimento si definisce rispetto ad campo di applicazione in cui le ripetibilità dei due metodi sono costanti. In pratica, converrà quindi spesso dividere la gamma dei valori analizzabili in più tronconi o « livelli di gamma » (da 2 a 5) nei quali si potrà ragionevolmente prevedere che le ripetibilità dei metodi sono assimilabili ad una costante. 5.3.3.2.2.3 Protocollo di base e calcoli Si determinerà l’esattezza per ogni livello di gamma, a partire da una serie di n materiali di prova che presentino valori di concentrazione di analiti che coprano il livello di gamma considerato. È necessario un numero minimo di 10 materiali di prova per ottenere risultati significativi. Ogni materiale di prova sarà analizzato in doppio dai due metodi in condizioni di ripetibilità. Si calcoleranno i valori medi Mxi delle 2 misure xi e x’i effettuate con il metodo abituale ed i valori medi Myi delle 2 misure yi e y’i effettuate con il metodo di riferimento, successivamente la differenza di tra i valori Mxi e Myi. I risultati dell’esperimento si riporteranno come nella tabella seguente :

x : Metodo abituale y : Metodo di riferimento

Medie Differenza Materiale di

prova Rep1 Rep2 Rep1 Rep2 x y d 1 x1 x’1 y1 y’1 Mx1 My1 d1=Mx1 - My1 … … … … … … … … i xi x’i yi y’i Mxi Myi di=Mxi - Myi

… … … … … … … … n xn x’n yn y’n Mxn Myn dn= Mxn - Myn






39

Si effettueranno i calcoli seguenti

- La media dei risultati del metodo abituale Mx ∑=

=n

iix MxnM

1

1

- La media dei risultati del metodo di riferimento My ∑=

=n

iiy MynM

1

1

- Calcolare la media delle differenze Md MyMxndM

n

i

id −==∑=1

- Calcolare la deviazione standard delle differenze Sd

11

2)(−=

∑ −=

n

diS

n

id

Md

- Calcolare lo Zscore d

dscore S

MZ =

5.3.3.2.2.4 Interpretazione - Se lo Zscore è inferiore o uguale a 2.0, si può concludere che l’esattezza di un metodo rispetto all’altro è soddisfacente, nel livello di gamma considerato, con un rischio d’errore α = 5%. - Se lo Zscore è superiore a 2.0, si può concludere che il metodo abituale non sia corretto rispetto al metodo di riferimento, nel livello di gamma considerato, con un rischio d’errore α = 5%. NOTA L’interpretazione dello Zscore è possibile nella misura in cui si ipotizza che le deviazioni seguano una legge normale con il 95% di affidabilità.






40

Esempio : Studio dell’esattezza di una calibratura IRTF per il dosaggio del glucosio e fruttosio rispetto al metodo enzimatico. Il primo livello di gamma copre la scala da 0 a 5 g.L-1 e il secondo livello di gamma copre una scala da 5 a 20 g.L-1.

Vino IRTF 1 IRTF2 Enz 1 Enz 2 di

1 0 0.3 0.3 0.2 -0.1 2 0.2 0.3 0.1 0.1 0.2 3 0.6 0.9 0.0 0.0 0.7 4 0.7 1 0.8 0.7 0.1 5 1.2 1.6 1.1 1.3 0.2 6 1.3 1.4 1.3 1.3 0.0 7 2.1 2 1.9 2.1 0.0 8 2.4 0 1.1 1.2 0.1 9 2.8 2.5 2.0 2.6 0.3

10 3.5 4.2 3.7 3.8 0.1 11 4.4 4.1 4.1 4.4 0.0 12 4.8 5.4 5.5 5.0 -0.2

Md 0.13 Sd 0.23

Zscore 0.55 < 2

Vino IRTF 1 IRTF2 Enz 1 Enz 2 di 1 5.1 5.4 5.1 5.1 0.1 2 5.3 5.7 5.3 6.0 -0.2 3 7.7 7.6 7.2 7.0 0.6 4 8.6 8.6 8.3 8.5 0.2 5 9.8 9.9 9.1 9.3 0.6 6 9.9 9.8 9.8 10.2 -0.1 7 11.5 11.9 13.3 13.0 -1.4 8 11.9 12.1 11.2 11.4 0.7 9 12.4 12.5 11.4 12.1 0.7

10 16 15.8 15.1 15.7 0.5 11 17.7 18.1 17.9 18.3 -0.2 12 20.5 20.1 20.0 19.1 0.7

Md = 0.19 Sd = 0.63

Zscore = 0.30 < 2 Per i due livelli di gamma, lo Zscore è inferiore a 2. La calibrazione IRTF per il dosaggio di glucosio fruttosio qui studiato, può essere considerato corretto rispetto al metodo enzimatico.






41

5.3.3.3 Confronto con saggi interlaboratorio 5.3.3.3.1 Campo d’applicazione I saggi interlaboratorio sono di due tipi:

1. Gli studi collaborativi relativi ad un solo metodo. Questi studi vengono realizzati per la convalida iniziale di un nuovo metodo al fine di definire principalmente la deviazione standard di riproducibilità interlaboratorio SRinter(metodo). La media m potrà altresì essere data.

2. Le catene di confronto interlaboratorio, o prove di competenza. Queste prove sono realizzate

per la convalida di un metodo adottato dal laboratorio, e il controllo qualità di routine (vedere § 5.3.3.3). Il valore fornito è la media interlaboratorio m, così come la deviazione standard di riproducibilità interlaboratorio e intermetodo SRinter.

Nell’ambito di una partecipazione ad una catena di analisi, o ad uno studio in collaborazione, il laboratorio può sfruttare i risultati per studiare l’esattezza di un metodo alfine di assicurare inizialmente la convalida ed il controllo qualità di routine. Se i saggi interlaboratorio si effettuano nell’ambito di un’organizzazione certificata, questo lavoro di confronto potrà permettere il raccordo del metodo. 5.3.3.3.2 Protocollo di base e calcoli Per ottenere un confronto sufficiente, è necessario utilizzare almeno 5 materiali di prova sul periodo. Per ogni materiale di prova, sono forniti due risultati: -La media di tutti i laboratori che abbiano prodotto dei risultati significativi m -La deviazione standard della riproducibilità interlaboratorio SR-inter I materiali di prova sono analizzati con p repliche dal laboratorio, essendo queste ultime realizzate in condizioni di ripetibilità. p deve essere almeno uguale a 2. D’altro canto, il laboratorio potrà verificare che la variabilità intralaboratorio (riproducibilità intralaboratorio) è inferiore alla variabilità interlaboratorio (riproducibilità interlaboratorio) data dalla catena di analisi. Per ogni materiale di prova, il laboratorio calcolerà lo Zscore, dato dalla formula seguente:

erR

labscore S

mmZ

int−

−=






42

I risultati si potranno riportare nella tavola seguente:

Materiale di prova Rep1 … Rep j … Rep p Media labo Media

catena Dev.standard Zscore

1 x11 … x1j … x1p p

xm

p

jj

lab

∑== 1

1

1 m1 SR-inter(1) )1(int

111

erR

labscore S

mmZ

−

−=

… … … … … … … … … …

i xi1 … xij … xip p

xm

p

jij

labi

∑== 1 mi SR-inter(i)

)(int ierR

ilabscore S

mmZ

i

i−

−=

… … … … … … … … … …

n xn1 … xnj … xnp p

xm

p

jnj

labn

∑== 1 mn SR-inte(n)

)(int nerR

nlabscore S

mmZ

n

n−

−=

5.3.3.3.3 Interpretazione Se tutti gli Zscore sono inferiori a 2, i risultati del metodo studiato potranno essere giudicati identici a quelli ottenuti dai laboratori che hanno ottenuto risultati significativi. NOTA L’interpretazione dello Zscore è possibile nella misura in cui si ipotizza che le deviazioni seguano una legge normale con il 95% di affidabilità.

Esempio: Una catena di analisi interlaboratorio per il parametro biossido di zolfo libero, su due campioni, evidenzia i risultati seguenti.

Campioni x1 x2 x3 x4 Media

laboratorioMedia catena

Dev Standard Zscore

1 34 34 33 34 33.75 32 6 0.29 <2 2 26 27 26 26 26.25 24 4 0.56 <2

Si può concludere che su questi due campioni, il confronto con la catena di analisi è soddisfacente.

5.3.3.4 Confronto con materiali di riferimento 5.3.3.4.1 Campo d’applicazione Nelle situazioni in cui non esistono metodi di riferimento (né altri metodi) per un dato parametro, e quando questo parametro non è trattato dalle catene di analisi, la sola possibilità che rimane è il confronto con i risultati del metodo da convalidare con i loro valori accettati di materiali di riferimento interni o esterni.






43

I materiali di riferimento potranno ad esempio essere soluzioni sintetiche fissate con una vetreria di classe A e/o materiale di metrologia tarato. Nel caso di materiali di riferimento certificati, il confronto avrà valore di raccordo, e potrà essere condotto insieme allo studio di taratura e di linearità. 5.3.3.4.2 Protocollo di base e calcoli È necessario disporre di n materiali di riferimento per un livello di gamma dato, nel quale si potrà ragionevolmente stimare che la ripetibilità è assimilabile ad una costante, n deve essere almeno uguale a 10. Analizzare in doppio ogni materiale di riferimento. Si calcoleranno i valori medi Mxi delle 2 misure xi et x’i effettuate con il metodo abituale. Si definisce Ti il valore accettato del io materiale di riferimento. I risultati si potranno riportar nella tavola seguente:

x : Metodo abituale Differenza

Materiale di riferimento

Rep1 Rep2 Media x T: Valore

accettato del materiale di riferimento

d

1 x1 x’1 Mx1 T1 d1=Mx1-T1 … … … … i xi x’i Mxi Ti di=Mxi-Ti

… … … … n xn x’n Mxn Tn dn= Mxn-Tn

La media dei risultati del metodo abituale Mx ∑=

=n

iix MxnM

1

1

La media dei valori accettati dei materiali di riferimento MT ∑=

=n

iiT TnM

1

1

Calcolare la media delle differenze Md Tn

i

id MMxndM −==∑

=1






44

Calcolare la deviazione standard delle differenze Sd 11

2)(−=

∑ −=

n

diS

n

id

Md

Calcolare lo Z-score d

dscore S

MZ =

5.3.3.4.3 Interpretazione - Se lo Zscore è inferiore o uguale a 2.0, si può concludere che la precisione del metodo abituale rispetto ai valori accettati del materiale di riferimento è buona nel livello di gamma considerato. - Se lo Zscore è superiore a 2.0, si può concludere che il metodo abituale non sia corretto rispetto ai valori accettati dei materiali di riferimento nel livello di gamma considerato. NOTA L’interpretazione dello Zscore è possibile nella misura in cui si ipotizzi che le deviazioni seguano una legge normale con il 95% di affidabilità.

Esempio: Non esiste metodo di riferimento per confrontare i risultati dell’analisi dell’ Etil-4 Fenolo (4-EF) per mezzo della Cromatografia in Fase Gassosa accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS). I risultati sono confrontati con i valori accettati dei materiali di riferimento costituiti da soluzioni sintetiche formulate con materiale raccordato.

Materiale di prova Ti (ref) Y1 Y2 Y3 Y4 My di

1 4.62 6.2 6.56 4.9 5.7 5.8 1.2 2 12.3 15.1 10.94 12.3 11.6 12.5 0.2 3 24.6 24.5 18 25.7 27.8 24.0 -0.6 4 46.2 48.2 52.95 46.8 35 45.7 -0.5 5 77 80.72 81.36 83.2 74.5 79.9 2.9 6 92.4 97.6 89 94.5 99.5 95.2 2.8 7 123.2 126.6 129.9 119.6 126.9 125.8 2.6 8 246.4 254.1 250.9 243.9 240.4 247.3 0.9 9 385 375.8 366.9 380.4 386.9 377.5 -7.5

10 462 467.5 454.5 433.3 457.3 453.2 -8.9

Md = -0.7 Sd =. 4.16 Zscore = 0.16 Alla luce di questi risultati, i valori ottenuti con il metodo di analisi del 4-EF con GC-MS si possono considerare corretti rispetto ai valori accettati dei materiali di riferimento.

5.4 Terza parte: studio dell’errore aleatorio 5.4.1 Principio generale L’errore aleatorio si definisce a partire dagli studi di precisione. La precisione si calcola secondo una metodologia che si può applicare in diverse condizioni sperimentali, comprese tra quelle di ripetibilità e quelle di riproducibilità, che costituiscono le condizioni estreme della sua misura.






45

Lo studio di precisione è uno degli elementi indispensabili per lo studio dell’incertezza di misura. 5.4.2 Documenti di riferimento

- Norma ISO 5725, Accuratezza dei risultati e metodi di misurazione - Norma NF V03-110, procedura di convalida intralaboratorio di un metodo alternativo rispetto

ad un metodo di riferimento. 5.4.3 Precisione del metodo 5.4.3.1 Definizione Per precisione si intende la concordanza tra i risultati di prove indipendenti ottenuti in condizioni concordate. NOTA 1 La precisione dipende unicamente dalla distribuzione degli errori aleatori e non ha alcuna relazione con il valore vero o specificato. NOTA 2 La misura della precisione viene espressa quale deviazione standard del risultato della prova. NOTA 3 Il termine "risultati di prova indipendenti" significa risultati ottenuti in modo non influenzato da un risultato precedente sullo stesso materiale di prova o simile. Le misure quantitative della precisione dipendono in modo critico dalle condizioni concordate. Le condizioni di ripetibilità e di riproducibilità sono insiemi particolari di condizioni estreme. In pratica, si parlerà di precisione per tutte le condizioni sperimentali comprese tra le condizioni di ripetibilità e quelle di riproducibilità. 5.4.3.2 Campo di applicazione Segue il dettaglio dei protocolli e dei calcoli a partire dal caso teorico generale, fino ai casi particolari di ripetibilità e di riproducibilità. Questo approccio esaustivo deve permettere di applicare lo studio di precisione nella grande maggioranza delle situazioni di laboratorio. Lo studio di precisione si può applicare a priori senza difficoltà a tutti i metodi quantitativi. In molti casi, la precisione non è costante su tutta la gamma di validità del metodo. È utile quindi definire molti tronconi o “livelli di gamma” nei quali si potrà ragionevolmente considerare che la precisione sia assimilabile ad una costante. Il calcolo di precisione sarà quindi reiterato per ciascun livello di gamma. 5.4.3.3 Caso teorico generale 5.4.3.3.1 Protocollo di base e calcoli 5.4.3.3.1.1 Calcoli con diversi materiali di prova Si analizzano n materiali di prova in un periodo di tempo piuttosto lungo con molteplici repliche, essendo pi il numero di repliche del io materiale di prova. I materiali di prova devono conservare proprietà costanti nel corso del periodo considerato.






46

Ad ogni replica, si può realizzare la misura con k ripetizioni, (in questo caso non si considera il caso in cui il numero di ripetizioni k possa essere variabile da un materiale di prova all’altro, in quanto complicherebbe ancor più i calcoli). Il numero totale di repliche dovrà essere superiore a 10, ripartiti sull’insieme dei materiali di prova. I risultati potranno essere annotati sulla tabella seguente, (caso di k = 2)

Repliche Materiali di prova

1 … j p1 pi pn

1 x11 x’11 … … x1j x’1j x1p1 x’1p1 … i xi1 x’i1 … … xij x’ij … … xipi x’ipi

… n xn1 x’n1 … … xnj x’nj … … … … xnpn x’npn

In questa situazione, la deviazione standard della variabilità totale (ovvero deviazione standard di precisione Sv) è data dall’espressione generale:

)()11()( répetVarkxVarS ijv −+=

con:

)( ijxVar varianza della media delle ripetizioni delle repliche di tutti i materiali di prova. )(répetVar varianza della ripetibilità di tutte le ripetizioni.

- Nel caso in cui i materiali di prova siano stati analizzati in doppio a ciascuna replica (k = 2), l’espressione sarà:

2)()( répetVarxVarS ijv +=

- Nel caso in cui sia stata eseguita una sola misura del materia di prova ad ogni replica (k = 1), la varianza di ripetibilità è nulla e l’espressione sarà:

)( ijv xVarS =

- Calcolo di )( ijxVar






47

La media delle due repliche xij e x’ij è: 2'ijij

ijxxx +=

Per ogni materiale di prova, si calcola la media delle n repliche: i

p

jij

i p

xMx

i

∑== 1

Il numero di misure differenti N è la somma delle pi ∑=

=n

iipN

1

La varianza )( ijxVar è quindi data dall’equazione seguente nN

ixijxVar

n

i

p

jij

i

Mx−=

∑∑ −= =1 1

2)()(

NOTA Questa varianza può altresì essere calcolata a partire dalle varianze di variabilità di ogni materiale di prova: Vari(xj). Si utilizza in questo caso la seguente relazione strettamente equivalente alla relazione precedente:

nN

xVarpxVar

n

ijii

ij−

−=∑

=1)().1(

)(

- Calcolo di )(répetVar

La varianza di ripetibilità si calcola come una ripetibilità classica con N materiali di prova in doppio. Secondo il calcolo di ripetibilità illustrato nel capitolo « ripetibilità », per k = 2 la varianza di ripetibilità è:

N

ijrépetVar

p

i

n

j

i

w2)( 1 1

2∑∑= == con ijijij xxw '−=

La precisione v si calcola secondo la formula:

vv SSv .8.2.22 == Il valore di precisione v significa che nel 95% dei casi la deviazione tra i due valori ottenuti con il metodo, nelle condizioni definite, sarà inferiore o uguale a v. NOTA 1 L’utilizzo e l’interpretazione di questi risultati è possibile nella misura in cui si ipotizzi che le deviazioni seguano una legge normale con il 95% di affidabilità. NOTA 2 Si può allo stesso modo definire una precisione al 99% con vv SSv .65.3.258.2 ==






48

5.4.3.3.1.2 Calcoli con 1 materiale di prova In questo caso, i calcoli si semplificano. Conviene procedere a p repliche di misure del materiale di prova, eventualmente con una ripetizione della misura ad ogni replica. p deve essere almeno uguale a 10. Nei calcoli seguenti, si considera che la misura sia effettuata in doppio ad ogni replica. - La varianza )( ijxVar è quindi data dall’equazione seguente:

1)( 1

2)(−=

∑ −=

p

xixVar

p

iij

Mx

con:

ix media delle due ripetizioni della replica i p numero di repliche Mx media di tutte le repliche - La varianza )(répetVar è quindi data dall’equazione seguente:

p

wrépetVar

p

ii

2)( 1

2∑==

con iw : differenza tra le due ripetizioni della replica i

5.4.3.4 Ripetibilità 5.4.3.4.1 Definizione La ripetibilità è la concordanza tra i risultati di analisi indipendenti tra loro, ottenuti con il metodo considerato su uno stesso vino, nello stesso laboratorio, con lo stesso operatore che utilizza lo stesso materiale, in un breve intervallo di tempo. Queste condizioni sperimentali sono definite condizioni di ripetibilità. Il valore di ripetibilità r è il valore al di sotto del quale si può stimare che si situi la differenza assoluta tra due risultati di analisi unica, ottenuti nelle condizioni di ripetibilità sopra definite, e questo, con un livello di attendibilità del 95%.






49

La deviazione standard di ripetibilità Sr è la deviazione standard dei risultati ottenuti nelle condizioni di ripetibilità. È un parametro della dispersione dei risultati, ottenuti in condizioni di ripetibilità. 5.4.3.4.2 Campo d’applicazione Lo studio di ripetibilità si può applicare a priori senza difficoltà a tutti i metodi quantitativi, nella misura in cui le condizioni di ripetibilità possano essere rispettate. In molti casi, la ripetibilità non è costante su tutta la gamma di validità del metodo. Conviene quindi definire molti tronconi o « livelli di gamma », nei quali si potrà ragionevolmente considerare che la ripetibilità sia assimilabile a una costante. Il calcolo di ripetibilità sarà quindi reiterato ad ogni livello di gamma. 5.4.3.4.3 Protocollo di base e calcoli 5.4.3.4.3.1 Caso generale Il numero di materiali di prova potrà essere variabile in funzione del numero di ripetizioni. In pratica si considererà che il numero di misure di tutti i materiali i materiali di prova, dovrà essere superiore a 20. Non è necessario che le condizioni di ripetibilità siano mantenute da un materiale di prova all’altro, ma tutte le repliche realizzate su uno stesso materiale di prova dovranno essere realizzate in tali condizioni di ripetibilità.

La ripetibilità rimane un caso particolare di calcolo della fedeltà 2)(

)(ripetVar

xVarS ijv += . La parte

)(ripetVar è naturalmente uguale a 0 (una sola misura ad ogni replica misura), e il calcolo si riassume

calcolando )( ijxVar

nNixij

xVarS

n

i

p

jijr

i

Mx−==

∑∑ −= =1 1

2)()(

Il valore r significa che nel 95% dei casi, la deviazione tra due valori acquisiti in condizioni di ripetibilità sarà inferiore o uguale a r. 5.4.3.4.3.2 Caso particolare applicabile a 1 sola ripetizione In pratica la situazione più corrente per i sistemi automatizzati è l’analisi dei materiali di prova con una sola ripetizione. Conviene utilizzare almeno 10 materiali per arrivare alle 20 misure necessarie. Le due repliche di misura di uno stesso materiale di prova dovranno essere realizzate in condizioni di ripetibilità. In questo caso specifico, il calcolo di Sr si semplifica e diventa :






50

p

wS

q

ii

r 21

2∑==

in cui: Sr = deviazione standard di ripetibilità p = numero di materiali di prova analizzati in doppio wi = differenze assolute tra doppi La ripetibilità r si calcola secondo la formula:

r = 2,8 Sr

Esempio: Per il metodo abituale di dosaggio del Biossido di zolfo libero previsto, e per una gamma di misura da 0 a 50mg/l, l’operatore cercherà almeno 10 campioni che presentino concentrazioni comprese tra questi valori e regolarmente ripartite.

N° di campione

xi (in mg/l)

x’i (in mg/l)

Wi (valore

assoluto) 1 14 14 0 2 25 24 1 3 10 10 0 4 2 3 1 5 35 35 0 6 19 19 0 7 23 23 0 8 27 27 0 9 44 45 1

10 30 30 0 11 8 8 0 12 48 46 2

Esempio: Riprendendo i valori dati nella tabella di cui sopra, si ottengono i risultati seguenti: q = 12 Sr = 0,54 mg/l r = 1,5 mg/l Questo risultato permette di affermare che, con una probabilità del 95%, i risultati ottenuti con il metodo in studio avranno una ripetibilità inferiore a 1,5 mg/l.






51

5.4.3.4.4 Confronto di ripetibilità 5.4.3.4.4.1 Determinazione delle ripetibilità dei due metodi Per valutare le prestazioni di un metodo, può essere utile confrontare la sua ripetibilità con quella di un metodo di riferimento. Ovvero Sr-alt la deviazione standard di ripetibilità del metodo abituale, e Sr-ref la deviazione standard della ripetibilità del metodo di riferimento. Il confronto è diretto. Se il valore di ripetibilità del metodo abituale è inferiore o uguale a quello del metodo di riferimento, il risultato è favorevole. Se è più elevato, il laboratorio dovrà assicurarsi che questo risultato rimanga conforme alle specifiche che ha accettato per il metodo in questione. In quest’ultimo caso, potrà anche applicare un test di Fischer-Snedecor per sapere se il valore trovato per il metodo abituale sia significativamente superiore a quello del metodo di riferimento. 5.4.3.4.4.2 Test di Fischer-Snedecor Si calcolerà il rapporto:

refraltrF

SS

obs 2

2

=

Si utilizzerà il valore critico di Snedecor con un rischio α uguale a 0,05 corrispondente alla variabile di Fischer al livello di confidenza 1- α, con ν1=N(x)-n, e ν2=N(z)-m gradi di libertà: F(N(x)-n, N(y)-m, 1- α). Nel caso di una ripetibilità calcolata con una sola ripetizione su p materiali di prova per il metodo abituale e q materiali di prova per il metodo di riferimento, la variabile di Fischer avrà per gradi di libertà ν1=p, et ν2=q, cioè F(p, q, 1-α). Interpretazione del test: 1/ Fobs > F1- α, il valore di ripetibilità del metodo abituale è significativamente superiore a quello del metodo di riferimento. 2/ Fobs < F1- α, non si può affermare che il valore di ripetibilità del metodo abituale sia significativamente superiore a quello del metodo di riferimento.

Esempio : Il valore di deviazione standard di ripetibilità ritrovato per il metodo di dosaggio del Biossido di zolfo libero è:

Sr = 0,54 mg/l

Il laboratorio ha effettuato il dosaggio sugli stessi materiali di prova con il metodo di riferimento OIV. Il valore della deviazione standard di ripetibilità ritrovato in caso è:

Srif = 0,39 mg/l






52

93,115,029,0

39.054.0

2

2

===obsF

ν 2 = 12 ν 1 = 12 F1-α = 2,69 > 1.93 Il valore Fobs ottenuto è inferiore al valore F1-α ; non si può affermare che il valore di ripetibilità del metodo abituale sia significativamente superiore a quello del metodo di riferimento.

5.4.3.5 Riproducibilità intralaboratorio 5.4.3.5.1 Definizione La riproducibilità intralaboratorio è la concordanza tra i risultati di analisi ottenuti con il metodo considerato su uno stesso vino, nello stesso laboratorio, con lo stesso operatore o operatori diversi che utilizzano curve di calibratura diverse, in giorni diversi. 5.4.3.5.2 Campo di applicazione Gli studi di riproducibilità si possono attuare, se il tempo di analisi è ragionevolmente limitato, se esiste la capacità di mantenere almeno un materiale di prova stabile nel tempo. In numerosi casi, la riproducibilità non è costante su tutta la gamma di validità del metodo. Conviene quindi definire alcuni tronconi o “livelli di gamma”, nei quali si potrà ragionevolmente considerare che la riproducibilità sia assimilabile ad una costante. Il calcolo di riproducibilità sarà quindi reiterato ad ogni livello di gamma. 5.4.3.5.3 Protocollo di base e calcoli Il laboratorio sceglierà uno più materiali di prova stabili. Applicherà il metodo regolarmente per un periodo di almeno un mese e conserverà i risultati ottenuti (Xij, materiali i, replica j). È consigliabile un numero di 5 repliche per ogni materiale di prova essendo 10 il numero totale minimo di repliche. Le repliche potranno essere analizzate in doppio. Il calcolo della precisione si applica integralmente per il calcolo di riproducibilità, integrando, )(répetVar se le misure sono state realizzate in doppio. La riproducibilità R si calcola secondo la formula:

R = 2,8 SR Il valore R significa che nel 95% dei casi, la deviazione tra due valori acquisiti in condizioni di riproducibilità sarà inferiore o uguale a R.






53

Esempio: Studio di riproducibilità del dosaggio dell’acido sorbico nei vini con azionamento a vapore e lettura per assorbimento a à 256 nm. Due vini con acido sorbico sono stati conservati per un periodo di 3 mesi. Il dosaggio dell’acido sorbico è stato realizzato ad intervalli regolari in questo periodo, con una ripetizione ad ogni misura.

Materiale di prova 1

Materiale di prova 2

Repliche x1 x2 x1 x2 1 122 125 140 139 2 123 120 138 137 3 132 130 139 141 4 121 115 143 142 5 130 135 139 139 6 135 142 135 138 7 137 135 139 139 8 130 125 145 145 9 123 130 138 137

10 112 115 135 134 11 131 128 146 146 12 137 138 13 146 147 14 145 148 15 130 128

n = 2 p1 = 11 p2 = 15 N = 26

8.37)( =ijxVar 01.5)( =repetVar

SR = 6.35 R = 17.8






54

6. Controllo di qualità dei metodi di analisi (CIQ)

6.1 Documenti di riferimento

- Risoluzione OIV Eno 19/2002: Raccomandazioni armonizzate per il controllo interno di qualità nei laboratori di analisi.

- CITAC / EURACHEM: Guida per la qualità in chimica analitica, Edizione 2002 - Norma NF V03-115, Guida per l’utilizzo di materiali di riferimento

6.2 Principi generali Si ricorda che un risultato d’analisi è intaccato da due tipi di errori: l’errore sistematico tradotto in termini di distorsione, e l’errore aleatorio. Per le analisi in serie si può definire un altro tipo di errore, che può a sua volta rientrare nell’ambito dell’errore sistematico e dell’errore aleatorio: si tratta dell’effetto di serie, illustrato ad esempio dalla deviazione del sistema dal sistema di misura nel corso di una serie. Il CIQ mira a sorvegliare e a controllare questi tre errori.

6.3 I materiali di riferimento Il CIQ si basa essenzialmente sulla gestione dei risultati di misurazione dei materiali di riferimento. La scelta a la costituzione di questi sono fasi essenziali che conviene gestire per assicurare una base di elevate prestazioni al sistema. Un materiale di riferimento si definisce con due parametri: - La sua matrice - L’assegnazione del suo valore di riferimento Sono possibili vari casi; quelli che s’incontrano in enologia sono raggruppati nella tavola a doppia entrata seguente:






55

Vino

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Un

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Esemplare certificato conforme Parigi, il 20 luglio 2005

Il Direttore Generale dell’OIV Secretario dell’Assemblea Generale


56

6.4 Controllo delle serie analitiche 6.4.1 Definizione Una serie analitica è un insieme di misurazioni realizzate in condizioni di ripetibilità. Per un laboratorio che utilizzi principalmente la modalità di analisi in serie analitiche è necessario verificare il buon adeguamento istantaneo degli strumenti di misura e la sua stabilità nel corso della serie analitica. Sono possibili due procedimenti complementari: - l’utilizzo di materiali di riferimento (per estensione spesso definiti « materiali di controllo ») - l’utilizzo di un campione interno soprattutto per i metodi separativi. 6.4.2 Controllo dell’esattezza a partire dai materiali di riferimento L’errore sistematico si controllerà con l’introduzione di materiali di riferimento, il calore di riferimento è stato assegnato a partire dalle medie esterne al metodo controllato. Il valore misurato del materiale di riferimento è associato ad una tolleranza, all’interno della quale si accetta il valore misurato come valido. Il laboratorio definisce i valori di tolleranza per ogni parametro e per ogni sistema analitico. Questi valori sono di pertinenza del laboratorio. I materiali di controllo dovranno essere scelti in modo che i loro valori di riferimento corrispondano ai livelli dei valori solitamente ritrovati per un dato parametro. Nel caso in cui la scala di misura sia ampia, e in l’incertezza di misura non sia costante sulla scala, conviene utilizzare diversi materiali di controllo per coprire i vari livelli di gamma. 6.4.3 Precisione intra-serie Quando le serie analitiche sono molto lunghe, esiste un rischio di deriva del sistema analitico. Conviene allora controllare la precisione intra-serie utilizzando uno stesso materiale di riferimento posizionato ad intervalli regolari nella serie. Si potranno utilizzare gli stessi materiali di controllo utilizzati per la precisione. Occorre che la deviazione dei valori misurati dello stesso materiale di riferimento nel corso della serie sia inferiore al valore di ripetibilità r calcolato per un livello di affidabilità del 95%. NOTA Per un livello di affidabilità del 99% si potrà utilizzare come valore 3.65.Sr. 6.4.4 Campione interno Taluni metodi separativi permettono l’introduzione di un campione interno nel prodotto da analizzare. È quindi utile procedere all’introduzione di un campione interno con del materiale tarato di cui sia nota l’incertezza di misura. Il campione interno permette sia un controllo della precisione sia un controllo della fedeltà intra-serie. È da notare che una deviazione influisce in proporzioni uguali sui segnali dell’analita essendo questo calcolato con il valore del segnale del campione interno, l’effetto della deviazione è annullato. La serie sarà convalidata se i campioni interni sono all’interno delle tolleranze definite.






57

6.5 Controllo del sistema di analisi 6.5.1 Definizione Si tratta di un controllo complementare al controllo delle serie. Se ne differenzia per il fatto che i valori acquisiti sono registrati su scale temporali lunghe, e/o confrontati con valori risultanti da altri sistemi di analisi. Svilupperemo due applicazioni: - Mappe di Shewhart per il follow-up della stabilità del sistema di analisi - Confronto interno ed esterno del sistema di analisi 6.5.2 Mappa di Shewhart Le mappe di Shewhart sono strumenti grafico-statistici che permettono di monitorare le derive dei sistemi di misura, con l’analisi regolare, in pratica in condizioni di riproducibilità, di materiali di riferimento stabili. 6.5.2.1 Acquisizione dei dati Si misura un materiale di riferimento stabile per un periodo sufficientemente lungo, ad intervalli regolari, definiti. Queste misurazioni sono registrate e riportate sulle schede di controllo. Esse sono realizzate in condizioni di riproducibilità, e di fatto sono sfruttabili per il calcolo di riproducibilità, e inoltre per la stima dell’incertezza di misura. I valori dei parametri analitici dei materiali di riferimento scelti devono situarsi in quelli delle gamme di misura validi. I materiali di riferimento sono analizzati nel corso di una serie analitica, se possibile di routine, con una posizione variabile nella serie da una volta all’altra. In pratica, è perfettamente possibile utilizzare le misurazioni dei materiali di controllo delle serie per alimentare le schede di controllo. 6.5.2.2. Presentazione dei risultati e definizione dei limiti I risultati individuali sono messi a confronto con il valore accettato del materiale di riferimento, e con la deviazione standard di riproducibilità del parametro considerato, al livello di gamma considerato. Nelle mappe di Shewart sono definiti due tipi di limite, i limiti associati ai risultati individuali e i limiti associati alla media. I limiti definiti per i risultati individuali sono abitualmente fondati sui valori di deviazione standard di riproducibilità intralaboratorio per il livello di gamma considerato, sono di due tipi:

- Il limite di allerta: RS.2/−+ . - Il limite di azione: RS.3/−+ .






58

Il limite definito per la media cumulata è tanto più stretto quanto più il numero di misure è elevato.

- Questo limite è un limite d’azione: nSR.3/−+ con n il numero di misure riportato sulla mappa.

NOTA Per maggiore leggibilità, il limite di allerta della media cumulata compare raramente sulla scheda di controllo, e questo limite

avrebbe il seguente valore nSR.2/−+ .

Mappa di Shewhart

0,23

0,25

0,27

0,29

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

risultati individuali

Media cumulata

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Limite inf. di azione media

Limite sup. di allerta indiv.

Limite inf. di allerta indiv.

Limite sup. di azione indiv.

Limite inf. di azione indiv.

risultati individuali

6.5.2.3 Utilizzo della mappa di Shewhart Diamo qui di seguito i criteri di utilizzo utilizzati più frequentemente. Saranno i laboratori a dover definire in modo più preciso i criteri che applicheranno.

Sarà attivata un’azione correttiva sul metodo (o il macchinario): a) se un risultato individuale è all’esterno dei limiti d’azione dei risultati individuali. b) se due risultati individuali consecutivi si situano all’esterno dei limiti di allerta dei risultati individuali. c) se inoltre, l’analisi a posteriori delle schede di controllo rivelano derive del metodo in tre casi specifici:

- nove punti dei risultati individuali consecutivi si situano sullo stesso lato della retta dei valori di riferimento.

- sei punti dei risultati individuali successivi salgono o scendono. - due punti su tre successivi si situano tra il limite d’allerta ed il limite d’azione.

d) se la media aritmetica degli n risultati registrati è al di là dei limiti d’azione della media cumulata (questo evidenzia una deviazione sistematica dei risultati). NOTA La scheda di controllo deve essere ripresa a n=1 non appena è stata effettuata un’azione correttiva sul metodo.






59

6.5.3. Confronto interno dei sistemi di analisi In un laboratorio che disponga di molti metodi di analisi per un dato parametro, è interessante realizzare delle misurazioni degli stessi materiali di prova per mettere a confronto i risultati. L’accordo dei risultati è giudicato soddisfacente tra i due metodi se la loro deviazione rimane inferiore a 2 volte la deviazione standard di differenza calcolata in convalida, e questo, con un livello di affidabilità del 95%. NOTA Questa interpretazione è possibile nella misura in cui si ipotizzi che le deviazioni seguano una legge normale con il 95% di affidabilità. 6.5.4. Confronto esterno del sistema di analisi 6.5.4.1. Catena di analisi di confronto interlaboratorio L’organizzazione dei saggi e dei calcoli è illustrata nel capitolo « confronto con una catena d’analisi interlaboratorio ». Al di là della verifica dell’esattezza con lo Zscore i risultati potranno essere analizzati più accuratamente, soprattutto per quanto riguarda la posizione dei valori; in particolare la posizione dei valori del laboratorio rispetto alla media. Se questi sono posizionati sullo stesso lato della media per molte catene di analisi successive, questo può giustificare l’attuazione di azioni correttive, anche se Zscore rimane inferiore al valore critico. NOTA L’interpretazione dello Zscore è possibile nella misura in cui si ipotizzi che le deviazioni seguano una legge normale con il 95% di affidabilità. Nel caso in cui la catena di confronto incrociato è oggetto di un accreditamento, questo lavoro di confronto ha valore di raccordo. 6.5.4.2. Confronto con materiali di riferimento esterni La misurazione a intervalli regolari dei materiali di riferimento esterni permette anche di sorvegliare la comparsa di un errore sistematico (distorsione). Il principio è quello di procedere alla misurazione di materiali di riferimento esterni, e di accettare o di rifiutare il valore, in funzione dei limiti di tolleranza. Questi limiti sono definiti a partire dalla combinazione del metodo controllato ed il valore di riferimento del materiale di riferimento. 6.5.4.2.1 Incertezza standard del materiale di riferimento I valori di riferimento di questi materiali sono accompagnati da intervalli di confidenza. Il laboratorio deve determinare la natura di questo dato, e ricavarne il valore di incertezza standard del valore di riferimento Sref ; in effetti, si presentano molti casi e devono essere distinti: - Caso in cui l’incertezza a è data sotto forma di un intervallo di affidabilità al 95% (incertezza allargata). Questo significa che ci si pone all’interno di una legge normale. A costituisce quindi un”incertezza allargata” e corrisponde a 2 volte la deviazione standard Sref dell’incertezza standard dei valori di riferimento dei materiali forniti.






60

2aSref =

- Caso di certificato, o altra specifica, che dia dei limiti +/- a senza specificare il livello di confidenza. Ci si pone allora nell’ambito di una dispersione rettangolare, il valore di misurazione X ha la stessa probabilità di assumere un qualsiasi valore nell’intervallo ref+/- a.

3aSref =

- Caso particolare di vetreria che dia dei limiti +/- a. È questo il caso di una dispersione triangolare.

6aSref =

6.5.4.2.2. Definizione dei limiti di validità di una misurazione del materiale di riferimento All’incertezza standard Sref del valore del materiale di riferimento esterno, si aggiunge l’incertezza standard del metodo del laboratorio da controllare Smetodo. Queste due fonti di variabilità devono essere considerate per la determinazione dei limiti. Smetodo si calcola a partire dall’incertezza allargata del metodo del laboratorio nel modo seguente:

2incertezza

Smetodo =

Il limite di validità del risultato (con un livello di affidabilità del 95%) =

valore di riferimento metodoref SS 22.2/ ++

Esempio: Si utilizza una soluzione tampone pH 7 per il controllo di pH-metro. L’intervallo di affidabilità dato dalla soluzione pH è di +/- 0.01, si indica che questo intervallo di affidabilità corrisponde all’incertezza allargata con un livello di affidabilità del 95%. D’altro canto l’incertezza allargata del pH-metro è di 0.024. Una soluzione tampone pH 7 si utilizza per il controllo di un pH-metro. L’intervallo di affidabilità dato per la soluzione pH è +/- 0.01, si indica che questo intervallo di affidabilità corrisponde all’incertezza allargata con un livello di affidabilità del 95%.

I limiti saranno )2024.0()2

01.0(22

2/ +−+

ovvero +/- 0.026 rispetto al valore di riferimento, e questo con un livello di affidabilità del 95%.






61

7. Stima dell’incertezza di misura

7.1 Definizione Parametro, associato al risultato di una misurazione, che caratterizza la dispersione dei valori che potrebbero ragionevolmente essere attribuiti al misurando. In pratica, l’incertezza si esprime sotto forma di una deviazione standard denominata incertezza standard u(x), in una forma allargata (con k=2 generalmente) U =+/- k.u

7.2 Documenti di riferimento - Norma AFNOR ENV 13005: 1999 – Guida per l’espressione dell’incertezza di misura - EURACHEM: 2000 – Quantificare l’incertezza nella misurazione analitica, EURACHEM, 2a edizione 2000 - Norma ISO 5725: 1994 – Accuratezza (precisione e fedeltà) dei risultati e metodi di misurazione - Norma ISO 21748: 2004 – Linee guida relative all’utilizzo della stima della ripetibilità, della riproducibilità e della precisione nella valutazione dell’incertezza di misura - Perruchet C. e Priel M. – Stimare l’incertezza, Edizioni AFNOR, 2000

7.3 Campo d’applicazione L’incertezza apporta due tipi di informazioni.

- Da un lato, quella destinata ai clienti del laboratorio indicando le deviazioni potenziali da tenere in considerazione per interpretare un risultato di analisi. Conviene precisare tuttavia che questa informazione non può essere utilizzata come mezzo di valutazione esterno del laboratorio.

- Dall’altro, costituisce uno strumento interno dinamico di valutazione della qualità dei risultati di

analisi del laboratorio. Nella misura in cui la sua valutazione è regolare ed effettuata a partire da una metodologia fissa e ben definita, permette di sapere se le deviazioni presentate da un metodo evolvono favorevolmente o sfavorevolmente (nel caso della stima, a partire esclusivamente dai dati intralaboratorio).

Questa guida si limita ad apportare una metodologia pratica nell’ambito del laboratorio di enologia che tratta analisi in serie. Questi laboratori dispongono di dati il cui numero dà loro una dimensione statistica significativa. La stima delle incertezze si può in questo effettuare nella maggioranza dei casi a partire da dati acquisiti nell’ambito dei lavori di convalida e di controllo qualità (precisamente con i dati delle carte di Shewhart). Questi dati potranno essere completati con dei piani sperimentali, proprio per determinare gli errori sistematici.






62

I referenziali descrivono due grandi procedure per la determinazione dell’incertezza: la procedura intralaboratorio e la procedura interlaboratorio. Ciascuna procedura fornisce risultati naturalmente e significativamente diversi. Il loro significato e la loro interpretazione non possono essere identici.

- La procedura intralaboratorio fornisce un risultato tipico del metodo considerato, nel laboratorio considerato. L’incertezza che ne deriva è un indicatore della prestazione del laboratorio per il metodo considerato. Risponde seguente alla domanda del cliente: «quale dispersione di risultati mi posso aspettare da parte del laboratorio che pratica il metodo».

- La procedura interlaboratorio utilizza risultati che derivano da saggi di interlaboratorio che

apportano un’informazione di prestazione globale relativa al metodo. I laboratori potranno utilizzare le due procedure congiuntamente. Sarà quindi interessante verificare che i risultati ottenuti nella procedura intralaboratorio diano valori inferiori ai valori della procedura interlaboratorio.

7.4 Metodologia Il lavoro di stima dell’incertezza si sviluppa in 3 fasi fondamentali: - Definizione del misurando, e descrizione del metodo di analisi quantitativa - Analisi critica del processo di misura - Stima dell’incertezza. 7.4.1 Definizione del misurando, e descrizione del metodo di analisi quantitativo In un primo tempo occorre: - Precisare chiaramente l’oggetto della misurazione - Definire la grandezza misurata - Nel caso in cui il misurando fosse ottenuto con un calcolo a partire da grandezze misurate, se possibile si esprimerà la relazione matematica che le lega. - Indicare tutte le condizioni operative. Questi elementi figurano in linea di massima nelle procedure del sistema di qualità del laboratorio. L’espressione della relazione matematica tra il misurando e le grandezze può essere in certi casi (metodi fisici…) molto complessa, e non è certamente pertinente né possibile dettagliarle integralmente. 7.4.2 Analisi critica del processo di misura Occorre recensire le fonti di errore che influenzano il risultato finale per creare il bilancio d’incertezza. Si potrà stimare l’importanza di ogni fonte, così da eliminare quelle che hanno solo un’influenza minore trascurabile. Questo si effettua mediante valutazione

- del livello di gravità della deriva generata da una cattiva gestione del fattore in questione - dalla frequenza dei problemi potenziali






63

- dalla loro rilevabilità. Questa analisi critica si potrà effettuare ad esempio, secondo il metodo delle « 5M ». Manodopera: Effetto operativo Materia: Effetto campione (stabilità, omogeneità, effetti matrice), e materiali di consumo (reagenti, prodotti, soluzioni, materiali di riferimento)… Materiale: Effetto attrezzatura (risposta, sensibilità, modalità di integrazione, ecc…), e materiale di laboratorio (bilancia, vetreria…)… Metodo: Effetto applicazione modalità operativa (condizioni operative, sequenza della operazioni…)… Ambiente: Condizioni ambientali (temperatura, pressione, illuminazione, vibrazione, irradiamento, umidità…)… 7.4.3 Calcoli di stima dell’incertezza standard (procedura intralaboratorio) 7.4.3.1 Principio Nel caso di laboratori che operano su delle serie importanti di campioni con un numero di metodi limitato, un approccio statistico basato sulla riproducibilità intralaboratorio, integrata con il calcolo delle fonti di errore non prese in considerazione nelle condizioni di riproducibilità intralaboratorio, sembra essere l’approccio più adatto. Un risultato di analisi si allontana dal valore vero sotto l’effetto di due fonti di errore. Gli errori sistematici e gli errori aleatori.

Risultato dell’analisi = Valore vero + Errore sistematico + Errore aleatorio

L’incertezza caratterizza la dispersione del risultato dell’analisi. Questo si traduce sotto forma di deviazione standard. Variabilità (risultato d’analisi) = incertezza Variabilità (valore vero) = 0

Variabilità (Errore sistematico) = ∑S uessystématiqerreurs

2

_

Variabilità (Errore aleatorio) = SR (Deviazione standard riproducibilità intralaboratorio)






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Le deviazioni standard sommandosi al quadrato, la stima dell’incertezza standard u(x) prende la forma seguente :

∑ += Su Ruessystématiqerreursxu 22

)_()(

Le fonti d’errore non integrabili in condizioni di riproducibilità intralaboratorio, vale a dire gli errori sistematici, devono essere determinati sotto forma di deviazione standard per essere combinati tra loro e alla deviazione standard di riproducibilità. Il laboratorio potrà agire in modo tale che le condizioni di riproducibilità applicate permettano di inglobare il massimo delle fonti di errore. Questo si ottiene precisamente costituendo dei materiali di prova stabili in un periodo sufficientemente lungo, durante il quale il laboratorio si preoccuperà di far variare tutti i fattori sperimentali possibili. Così SR coprirà il maggior numero di fonti di errori (aleatori) possibile, e sarà minimizzato il lavoro di stima degli errori sistematici, spesso più complesso da realizzare. Qui si fa notare che la guida EURACHEM/CITAC « Quantificare l’incertezza nelle misure analitiche » ricorda che « In generale, la Guida ISO esige che le correzioni siano applicate a tutti gli effetti sistematici identificati e significativi ». In un metodo « sotto controllo », gli errori sistematici dovrebbero quindi costituire una parte minore dell’incertezza. Questa tabella, non esaustiva, fornisce alcuni esempi di fonti di errore standard propone un approccio di valutazione per ciascuna di queste fonti, utilizzando il più possibile l’integrazione nelle condizioni di riproducibilità.

Fonte d’errore Tipologia di errore Commento Metodo di stima

Campionamento (costituzione del campione)

Aleatorio Il campionamento è una delle« prassi» definite dalla norma ISO 17025. I laboratori che dichiarano di non fare campionamento, non includono questa fonte di errore nella stima dell’incertezza.

Possibilità di accludere alla riproducibilità intralaboratorio includendo il campiona-mento nella manipolazione.

Sotto campionamento (prelievo di una quantità di campione per la realizzazione del prova)

Aleatorio È significativo se il campione non è omogeneo. Questa fonte di errore rimane minore per il vino.

Incluso nelle condizioni di riproducibilità intralaboratorio nella misura in cui il materiale di prova utilizzato sia simile ai materiali di prova di routine.

Stabilità del campione Aleatorio Funzione di condizione di conservazione del campione. I laboratori potranno prestare un’attenzione particolare, per quanto riguarda i vini, alle perdite di diossido di zolfo e di etanolo.

Le eventuali evoluzioni del campione si possono integrare alle condizioni di riproducibilità. Questa fonte di incertezza sarà quindi valutata globalmente.

Taratura dell’apparecchiatura

Sistematico / Aleatorio Questo errore è sistematico se la taratura è fissata per una lunga durata, e diventa aleatorio se la taratura è effettuata regolarmente su una scala temporale integrata alle condizioni di riproducibilità

Fonte d’errore da prendere in considerazione nei metodi assoluti

Errore della retta di taratura § 7.4.2.4.1 Preso in considerazione in condizioni di riproducibilità se la taratura è revisionata regolarmente.

Effetto di contaminazione o di memoria

Aleatorio Questo effetto sarà minimizzato da una buona progettazione degli strumenti di misura e delle operazioni risciacquatura

Le condizioni di riproducibilità prendono in considerazione questo effetto, a condizione di intercalare i materiali di riferimento in posizioni diverse nelle serie di analisi.






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Precisione degli automi

Aleatorio Si tratterà essenzialmente di possibili derive intraserie. Queste ultime saranno principalmente controllate dal posizionamento di materiali di controllo nell’ambito del CQI

Le condizioni di riproducibilità prendono in considerazione questo effetto a condizione di intercalare i materiali di riferimento in diverse posizioni nelle serie di analisi.

Purezza dei reagenti Aleatorio La purezza dei reagenti avrà un effetto trascurabile sui relativi metodi, nella misura in cui la calibratura e le analisi siano realizzate con gli stessi lotti di reagenti. Questo effetto è da prendere in considerazione nei metodi assoluti.

Da integrare alle condizioni di riproducibilità utilizzando diversi lotti di reagenti.

Condizioni di misura Aleatorio Effetti della temperatura, dell’umidità… Tipicamente preso in considerazione in condizioni di riproducibilità

Effetto matrice Aleatorio da un campione all’altro, sistematico su uno stesso campione

Questi effetti sono da prendere in considerazione sui metodi il cui segnale misurato non sia perfettamente specifico

Se questo effetto è considerato significativo, si potrà attuare un piano sperimentale specifico per stimare l’incertezza dovuta a questo effetto § 7.4.2.4.3 Questo effetto non è considerato integrato alle condizioni di riproducibilità.

Effetto di calibratura Sistematico se la calibratura è costante Aleatorio se la calibratura rinnovata regolarmente

Preso in considerazione nelle condizioni di riproducibilità se la calibratura è rinnovata regolarmente. Se la calibratura utilizzata rimane invariata (sulla scala dei periodi considerati nel quadro delle condizioni di riproducibilità), conviene attuare un piano sperimentale per la stima dell’errore della retta di calibratura. § 7.4.2.4.1

Effetto operativo Aleatorio Da prendere in considerazione nelle condizioni di riproducibilità avendo cura di fare intervenire tutti gli operatori abilitati.

Distorsione Sistematico Deve essere minimizzato con il lavoro di controllo qualità del laboratorio.

Effetto sistematico che si può stimare a partire da riferimenti certificati.

7.4.3.2 Calcolo della deviazione standard di riproducibilità intralaboratorio La deviazione standard di riproducibilità SR si calcola secondo il protocollo descritto nel capitolo « Riproducibilità intralaboratorio» (cf. § 5.4.3.5). Questo calco si potrà realizzare a partire da diversi materiali di prova. Nel caso importante in cui SR sia proporzionale alla grandezza del misurando, non è auspicabile combinare i dati acquisiti su diversi materiali prova a grandezze diverse, ma SR sarà in questo caso espresso come valore relativo (%). 7.4.3.3 Stima delle fonti di errori sistematici standard non presi in considerazione nelle condizioni di riproducibilità 7.4.3.3.1 Errore di calibratura (o di taratura) Nel caso in cui la calibratura di uno strumento (o la taratura di un metodo assoluto) non sia ripetuta regolarmente, non può essere integrata nella riproducibilità. Per la sua stima si dovrà attuare un piano sperimentale con l’errore residuo della regressione.






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7.4.3.3.1.1 Modalità operativa La procedura è simile a quella realizzata nello studio di linearità del metodo. Conviene mettere in campo un numero n di materiali di riferimento. Questo numero sarà superiore a 3, non è quindi necessario andare oltre 10. I materiali di riferimento saranno misurati p volte in condizioni di precisione intralaboratorio, p sarà superiore a 3, pur consigliando un numero di 5. I valori accettati di materiali di riferimento dovranno essere ripartiti in modo regolare sulla scala dei valori studiati. Il numero di misure deve essere identico per tutti i materiali di riferimento. I risultati sono riportati in una tabella simile alla seguente



Replica 1

… Replica j

… Replica p

1 x1 y11 … y1j … y1p

… … … … … … … i xi yi1 … yij … yip

… … … … … … …

n xn yn1 … ynj … ynp

7.4.3.3.1.2 Calcoli e risultati Si calcola il modello di regressione lineare.

ijiij xbay ε++= . ove

ijy è la jia replica del io materiale di riferimento.

ix è il valore accettato del io materiale di riferimento. b è l’inclinazione della retta di regressione. a è l’ordinata all’origine della retta di regressione.

ixba .+ rappresenta la speranza del valore di misurazione del io materiale di riferimento.

ijε è la deviazione tra yij e la speranza del valore della misurazione del io materiale di riferimento.






67

I parametri della retta di regressione sono ottenuti a partire dalle seguenti formule :

- media delle misurazioni p del io materiale di riferimento ∑=

=p

jijypyi

1

1

- media di tutti i valori accettati degli n materiali di riferimento ∑=

=n

iix xnM

1

1

- media di tutte le misurazioni ∑=

=n

iiynMy

1

1


∑

=

=−−

= n

i

n

iyixi

xi

MyMxb

Mx1

21

)(

))((

- stima ordinata all’origine a xy MbMa ×−=

- valore di regressione associato al io materiale di riferimento iy ii xbay ×+=ˆ

- residuo eij iijij yye ˆ−=

7.4.3.3.1.3 Stima dell’incertezza standard associata alla retta di calibratura (o di taratura) Nel caso in cui gli errori dovuti alla retta di regressione siano costanti sull’insieme del campo, l’incertezza standard è stimata in modo globale e unico con la deviazione standard residua globale.

2

1 1

2

)(

)ˆ(−

==∑∑ −

= =

np

iijSu

n

i

p

jrescalibrage

yy

Nel caso in cui gli errori dovuti alla retta di regressione non siano costanti sull’insieme del campo, l’incertezza standard è stimata per un dato livello dalla deviazione standard residua su questo livello.






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1

1

2

,),(

)ˆ(−

==∑ −

=

p

iijSu

p

jiresicalibrage

yy

NOTA Queste stime di deviazioni standard sono sfruttabili se il modello di regressione lineare e il campo di calibratura (o taratura) sono convalidati. (vedere § 5.3.1) 7.4.3.3.2 Errore sistematico Secondo la guida EURACHEM, « Quantificare l’incertezza nelle misure analitiche», si ricorda che la guida ISO in genere esige che le correzioni siano applicate per tutti gli effetti sistematici significativi identificati. Stessa cosa vale per le distorsioni dei metodi per i quali il laboratorio applica il suo sistema di controllo qualità (veder §6), e che tendono a 0 per i metodi « sotto controllo ». In pratica, si possono distinguere due casi. 7.4.3.3.2.1 Metodi perequati con un solo materiale di riferimento La distorsione è perequata continuamente con uno stesso materiale di riferimento. Il materiale di riferimento certificato (MRC) assicura il raccordo metrologico del metodo. È stato attribuito un valore di riferimento al MRC accompagnato dalla sua incertezza standard uref. Questa incertezza standard dell’MRC è combinata all’incertezza composta del metodo, ucomp, per determinare l’incertezza standard globale del metodo del laboratorio u(x). L’incertezza standard globale del metodo perequato con l’MRC considerato è quindi:

comprefxu uu 22)( +=

NOTA 1 La Metodologia è identica nel caso dei metodi perequati con i risultati di una catena di confronti interlaboratorio.. NOTA 2 Si suggerisce di osservare attentamente la differenza tra un MRC che serve a perequare la distorsione di un metodo, e la cui incertezza del valore di riferimento si combina con questo metodo, ed un MRC che serve a controllare un metodo perequato diversamente (cf. § 6.5.4.2). In questo secondo caso, l’incertezza dell’ MRC non deve essere utilizzata per la stima dell’incertezza del metodo.

7.4.3.3.2.2 Metodi perequati con diversi materiali di riferimento (gamme di taratura…) Non esiste una perequazione particolare della distorsione oltre al lavoro di calibratura. Resta inteso che ogni calibro apporta un’incertezza di distorsione. Esiste quindi un’ incertezza teorica globale di distorsione che combina le incertezze dei calibratori. Questa incertezza è molto delicata da






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stimare, ma si rileva generalmente sufficientemente debole per essere trascurata, principalmente nel caso in cui il laboratorio si preoccupi della qualità dei suoi calibratori, e dell’incertezza dei loro valori di riferimento. Salvo casi particolari, l’incertezza della distorsione sarà in questo caso trascurata. 7.4.3.3.3 Effetto matrice 7.4.3.3.3.1 Definizione L’effetto matrice produce una fonte di errore aleatorio per un dato campione, ma aleatorio da un campione all’altro. Questo errore è legato all’interazione dei composti presenti nel prodotto da analizzare sulla misurazione dell’analita ricercato. L’effetto matrice si manifesta nei metodi che presentano un segnale non specifico. L’effetto matrice costituisce una parte spesso debole dell’incertezza, soprattutto nei metodi separativi. Ma in taluni metodi, tra cui le tecniche a infrarossi, è una componente importante dell’incertezza.

Esempio : Stima dell’effetto matrice sull’IRTF

Il segnale dell’IRTF, lo spettro a infrarossi, non è un segnale specifico di ciascuno dei componenti misurati da questa tecnica. Il modello statistico di calibratura permette di trattare l’informazione spettrale non specifica, e che produce rumore, in una stima sufficientemente esatta del valore del misurando. Questo modello integra influenze di altri composti del vino, che variano da un vino all’altro e introducono un errore nel risultato. A monte del lavoro di analisi di routine, gli sviluppatori di calibratura effettuano un lavoro particolare per minimizzare questo effetto matrice e rendere le calibrature robuste, vale a dire in grado di integrare queste variazioni senza ripercussioni sul risultato. Ciononostante l’effetto matrice è sempre presente e costituisce una fonte di errore all’origine di una parte importante dell’incertezza di un metodo IRTF. A rigore, questo errore di effetto matrice si può stimare confrontando, da un lato, medie di un gran numero di repliche di misurazioni IRTF, ottenute su diversi materiali di riferimento (almeno 10), in condizioni di riproducibilità, e dall’altro i valori veri dei materiali di riferimento che presentano una matrice di vino naturale. La deviazione standard delle differenze dà in questo caso questa variabilità di calibratura (a condizione che la calibratura sia stata corretta in precedenza (distorsione = 0)). Questo approccio teorico non è realizzabile in pratica, in quanto i valori veri non sono mai conosciuti, ma sperimentalmente è possibile avvicinarsi abbastanza:

- Prima di tutto, la calibratura IRTF statisticamente perequata (distorsione = 0) rispetto ad un metodo di riferimento che parte da almeno 30 campioni. Questo permette di eliminare gli effetti di distorsione nelle misure successive. - I materiali di riferimento devono essere vini naturali. Conviene utilizzare almeno 10 materiali di riferimento diversi, i cui valori siano situati all’interno di un livello di gamma in cui l’incertezza si può considerare costante. - Viene acquisito un valore di riferimento accettabile a partire dalla media di diverse misurazioni con il metodo di riferimento, effettuato in condizioni di riproducibilità. Questo permette in effetti di abbassare l’incertezza del valore di riferimento: se per il metodo di riferimento utilizzato, tutte le fonti d’incertezza importanti sono incluse nelle condizioni di riproducibilità, la moltiplicazione del numero p di misurazioni realizzate in condizioni di riproducibilità, permette all’incertezza collegata alla media di essere divisa per p . La media ottenuta a partire da un numero sufficiente di misurazioni, avrà in questo un’incertezza debole, ovvero trascurabile rispetto all’incertezza del metodo abituale : e potrà quindi essere utilizzata come valore di riferimento. p deve essere almeno uguale a 5.






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- I materiali di riferimento sono analizzati con il metodo IRTF, con diverse repliche, acquisite in condizioni di riproducibilità. Il fatto di moltiplicare il numero di misurazioni q in condizioni di riproducibilità sul metodo IRTF permette di diminuire la variabilità legata alla fedeltà del metodo (errore aleatorio). Il valore medio di queste misurazioni avrà una deviazione standard di variabilità divisa per q. Questo errore aleatorio può diventare trascurabile rispetto alla variabilità legata alla calibratura (effetto matrice) che qui cerchiamo di stimare. q deve essere almeno uguale a 5.

L’esempio seguente è applicato al dosaggio dell’acido acetico con una calibratura IRTF. I valori di riferimento sono dati per 5 misurazioni in condizioni di riproducibilità su 7 materiali di prova stabili. Il numero di 7 materiali è teoricamente insufficiente, ma questi dati hanno solo valore di esempio.

Metodo di riferimento IRTF

Materiali 1 2 3 4 5 Met.Rif. 1 2 3 4 5 Met. IRTF Diff

1 0.30 0.32 0.31 0.30 0.31 0.308 0.30 0.31 0.31 0.30 0.30 0.305 -0.004 2 0.31 0.32 0.32 0.32 0.31 0.316 0.31 0.32 0.30 0.31 0.31 0.315 -0.006 3 0.38 0.39 0.39 0.38 0.38 0.384 0.37 0.37 0.37 0.37 0.36 0.37 -0.016 4 0.25 0.25 0.25 0.24 0.25 0.248 0.26 0.26 0.26 0.25 0.26 0.26 0.01 5 0.39 0.39 0.40 0.40 0.39 0.394 0.43 0.42 0.43 0.42 0.42 0.425 0.03 6 0.27 0.26 0.26 0.26 0.26 0.262 0.25 0.26 0.25 0.25 0.26 0.255 -0.008 7 0.37 0.37 0.37 0.37 0.36 0.368 0.37 0.36 0.36 0.35 0.36 0.365 -0.008

Calcolo delle differenze : diff = Moy IRTF – Moy Ref. Si verifica che la media delle differenze Md = 0.000 (una buona perequazione dell’IRTF rispetto al metodo di riferimento) La deviazione standard delle differenze, Sd = 0.015. È questa deviazione standard che permette di stimare la variabilità generata dalla calibratura, e si può quindi dire che:

Uf = 0.015 NOTA È necessario notare che il valore di Uf può essere sovrastimato con questo approccio. Se il laboratorio ritiene che il valore sia significativamente eccessivo nelle condizioni operative definite, potrà aumentare il numero di misurazioni sul metodo di riferimento e/o sul metodo dell’IRTF. Le condizioni di riproducibilità inglobano tutte le altre fonti significative di errore, SR è stato calcolato in altro modo: SR = 0.017 L’incertezza del dosaggio dell’acido acetico con questa applicazione IRTF è:

017.0015.0 22*2/ +−+ ovvero +/- 0.045 g.L-1

7.4.3.3.4 Effetto campione I taluni casi, i piani sperimentali per la stima dell’incertezza si realizzano a partire da materiali di prova sintetici. In questa situazione, la stima con coprirà l’effetto campione (omogeneità). I laboratori dovranno allora stimare questo effetto. Conviene notare tuttavia che questo effetto è spesso trascurabile nei laboratori di enologia, che utilizzano campioni omogenei di piccola dimensione.






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7.4.4 Stima dell’incertezza standard con i saggi interlaboratorio 7.4.4.1 Principio L’approccio interlaboratorio attiva l’intervento dei dati provenienti da saggi intralaboratorio a partire dai quali si calcola una deviazione standard di riproducibilità interlaboratorio, secondo i principi enunciati al §5.4.3. Gli statistici responsabili del calcolo dei risultati dei saggi interlaboratorio possono identificare risultati o laboratori « aberranti », utilizzando i test descritti nella norma ISO 5725 (test di Cochran). L’isolamento di questi risultati allora potrà essere realizzato in seguito ad un accordo tra statistici e analisti. Per la stima dell’incertezza con un metodo interlaboratorio i principi di base enunciati nella norma ISO 21748 sono i seguenti:

1. La deviazione standard di riproducibilità (interlaboratorio) ottenuta in uno studio collaborativi è una base valida per la valutazione dell’incertezza di misura.

2. Gli effetti non osservati nel quadro dello studio in collaborazione devono essere manifestamente

trascurabili o tenuti esplicitamente in considerazione. I saggi interlaboratorio sono di due tipi:

1. Gli studi collaborativi relativi ad un solo metodo. Questi studi sono realizzati per la convalida

iniziale di un nuovo metodo per definire la deviazione standard di riproducibilità interlaboratorio SRinter (metodo).

2. Le catene di confronto interlaboratorio, o prove di competenza. Queste prove sono realizzate per

la convalida di un metodo adottato dal laboratorio, e il controllo qualità di routine (vedere § 5.3.3.3). I dati sono trattati globalmente ed integrano tutti i metodi di analisi utilizzati dai laboratori partecipanti. I risultati sono la media interlaboratorio m, e la deviazione standard di riproducibilità interlaboratorio e intermetodo SRinter.

7.4.4.2 Utilizzo della deviazione standard di riproducibilità interlaboratorio e intrametodo SRinter(metodo) La deviazione standard di riproducibilità intralaboratorio SRinter (metodo) tiene in considerazione le variabilità intralaboratorio totali legate al metodo. In seguito conviene tenere in considerazione il fatto che il metodo di analisi possa produrre una distorsione sistematica rispetto al valore vero. Nel quadro di uno studio in collaborazione, e quando questo è possibile, l’errore prodotto da questa distorsione si potrà stimare utilizzando materiali di riferimento certificati, nelle stesse condizioni descritte nel § 7.4.3.3.2, e aggiunte a SRinter(metodo)






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7.4.4.3 Utilizzo della deviazione standard di riproducibilità interlaboratorio e intermetodo SRinter La deviazione standard di riproducibilità intralaboratorio SRinter tiene in considerazione le variabilità intralaboratorio e la variabilità interlaboratorio per il parametro studiato. Il laboratorio deve verificare la sua precisione rispetto a questi risultati (vedere § 5.3.3). Non è il caso di aggiungere componenti associate alla precisione del metodo al bilancio dell’incertezza, in quanto nei saggi di idoneità « multi metodo » si può considerare che gli errori di precisione siano tenuti in considerazione nel SRinter 7.4.4.4 Altre componenti del bilancio d’incertezza Nella misura in cui i materiali di prova utilizzati per i saggi interlaboratorio siano rappresentativi dei campioni classici analizzati dai laboratori, e seguano l’insieme della procedura analitica (sotto-campionamento, estrazione, concentrazione, diluizione, distillazione…),SR-inter rappresenta l’incertezza standard u(x) del metodo, nel senso di interlaboratorio. Gli errori non tenuti in considerazione nei saggi di laboratorio dovranno quindi essere studiati per stimarne la loro incertezza standard composta che sarà combinata con l’incertezza standard composta dei saggi interlaboratorio.

7.5 Espressione dell’incertezza allargata L’incertezza si esprime in pratica nella sua forma allargata che è data in modo assoluto per i metodi nei quali l’incertezza è stabile nel campo di lavoro, o in modo relativo quando l’incertezza varia proporzionalmente secondo la grandezza del misurando : Incertezza assoluta: )(.2/ xuU −+=

Incertezza relativa (in %): 100.)(.2/x

xuU −+= con x media dei risultati di riproducibilità.

NOTA Questa espressione dell’incertezza è possibile nella misura in cui si ipotizzi che le deviazioni seguano una legge normale con il 95% di affidabilità. Queste espressioni inducono un valore d’incertezza dato con un livello di affidabilità del 95%.






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Allegato N°1 Tabella A - Legge di SNEDECOR

La tabella riporta i valori di F in funzione di ν1 e ν2 per un rischio α di 0,05

P=0,950 ν1

ν2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ν1 ν2

1 161,4 199,5 215,7 224,6 230,2 234,0 236,8 238,9 240,5 241,9 1 2 18,51 19,00 19,16 19,25 19,30 19,33 19,35 19,37 19,38 19,40 2 3 10,13 9,55 9,28 9,12 9,01 8,94 8,89 8,85 8,81 8,79 3 4 7,71 6,94 6,59 6,39 6,26 6,16 6,09 6,04 6,00 5,96 4 5 6,61 5,79 5,41 5,19 5,05 4,95 4,88 4,82 4,77 4,74 5 6 5,99 5,14 4,76 4,53 4,39 4,28 4,21 4,15 4,10 4,06 6 7 5,59 4,74 4,35 4,12 3,97 3,87 3,79 3,73 3,68 3,64 7 8 5,32 4,46 4,07 3,84 3,69 3,58 3,50 3,44 3,39 3,35 8 9 5,12 4,26 3,86 3,63 3,48 3,37 3,29 3,23 3,18 3,14 9 10 4,96 4,10 3,71 3,48 3,33 3,22 3,14 3,07 3,02 2,98 10 11 4,84 3,98 3,59 3,36 3,20 3,09 3,01 2,95 2,90 2,85 11 12 4,75 3,89 3,49 3,26 3,11 3,00 2,91 2,85 2,80 2,75 12 13 4,67 3,81 3,41 3,18 3,03 2,92 2,83 2,77 2,71 2,67 13 14 4,60 3,74 3,34 3,11 2,96 2,85 2,76 2,70 2,65 2,60 14 15 4,54 3,68 3,29 3,06 2,90 2,79 2,71 2,64 2,59 2,54 15 16 4,49 3,63 3,24 3,01 2,85 2,74 2,66 2,59 2,54 2,49 16 17 4,45 3,59 3,20 2,96 2,81 2,70 2,61 2,55 2,49 2,45 17 18 4,41 3,55 3,16 2,93 2,77 2,66 2,58 2,51 2,46 2,41 18 19 4,38 3,52 3,13 2,90 2,74 2,63 2,54 2,48 2,42 2,38 19 20 4,35 3,49 3,10 2,87 2,71 2,60 2,51 2,45 2,39 2,35 20 21 4,32 3,47 3,07 2,84 2,68 2,57 2,49 2,42 2,37 2,32 21 22 4,30 3,44 3,05 2,82 2,66 2,55 2,46 2,40 2,34 2,30 22 23 4,28 3,42 3,03 2,80 2,64 2,53 2,44 2,37 2,32 2,27 23 24 4,26 3,40 3,01 2,78 2,62 2,51 2,42 2,36 2,30 2,25 24 25 4,24 3,39 2,99 2,76 2,60 2,49 2,40 2,34 2,28 2,24 25 26 4,23 3,37 2,98 2,74 2,59 2,47 2,39 2,32 2,27 2,22 26 27 4,21 3,35 2,96 2,73 2,57 2,46 2,37 2,31 2,25 2,20 27 28 4,20 3,34 2,95 2,71 2,56 2,45 2,36 2,29 2,24 2,19 28 29 4,18 3,33 2,93 2,70 2,55 2,43 2,35 2,28 2,22 2,18 29 30 4,17 3,32 2,92 2,69 2,53 2,42 2,33 2,27 2,21 2,16 30 40 4,08 3,23 2,84 2,61 2,45 2,34 2,25 2,18 2,12 2,08 40 60 4,00 3,15 2,76 2,53 2,37 2,25 2,17 2,10 2,04 1,99 60

120 3,92 3,07 2,68 2,45 2,29 2,17 2,09 2,02 1,96 1,91 120

∞ 3,84 3,00 2,60 2,37 2,21 2,10 2,01 1,94 1,88 1,83 ∞

ν2 ν1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ν2

ν1






75

Allegato N°2 Tabella B - Legge di STUDENT

La tabella fornisce i valori di t in funzione di P e di ν.

7.5.1.1.1ν

0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 0,975 0,990 0,995 0,9995 P

ν

1 0,158 0,325 0,510 0,727 1,000 1,376 1,963 3,078 6,314 12,706 31,821 63,657 636,619 1 2 0,142 0,289 0,445 0,617 0,816 1,061 1,386 1,886 2,920 4,303 6,965 9,925 31,598 2 3 0,137 0,277 0,424 0,584 0,765 0,978 1,250 1,638 2,353 3,182 4,541 5,841 12,929 3 4 0,134 0,271 0,414 0,569 0,741 0,941 1,190 1,533 2,132 2,776 3,747 4,604 8,610 4 5 0,132 0,267 0,408 0,559 0,727 0,920 1,156 1,476 2,015 2,571 3,365 4,032 6,869 5 6 0,131 0,265 0,404 0,553 0,718 0,906 1,134 1,440 1,943 2,447 3,143 3,707 5,959 6 7 0,130 0,263 0,402 0,549 0,711 0,896 1,119 1,415 1,895 2,365 2,998 3,499 5,408 7 8 0,130 0,262 0,399 0,546 0,706 0,889 1,108 1,397 1,860 2,306 2,896 3,355 5,041 8 9 0,129 0,261 0,398 0,543 0,703 0,883 1,100 1,383 1,833 2,262 2,821 3,250 4,781 9

10 0,129 0,260 0,397 0,542 0,700 0,879 1,093 1,372 1,812 2,228 2,764 3,169 4,587 10 11 0,129 0,260 0,396 0,540 0,697 0,876 1,088 1,363 1,796 2,201 2,718 3,106 4,437 11 12 0,128 0,259 0,395 0,539 0,695 0,873 1,083 1,356 1,782 2,179 2,681 3,055 4,318 12 13 0,128 0,259 0,394 0,538 0,694 0,870 1,079 1,350 1,771 2,160 2,650 3,012 4,221 13 14 0,128 0,258 0,393 0,537 0,692 0,868 1,076 1,345 1,761 2,145 2,624 2,977 4,140 14 15 0,128 0,258 0,393 0,536 0,691 0,866 1,074 1,341 1,753 2,131 2,602 2,947 4,073 15 16 0,128 0,258 0,392 0,535 0,690 0,865 1,071 1,337 1,746 2,120 2,583 2,921 4,015 16 17 0,128 0,257 0,392 0,534 0,689 0,863 1,069 1,333 1,740 2,110 2,567 2,898 3,965 17 18 0,127 0,257 0,392 0,534 0,688 0,862 1,067 1,330 1,734 2,101 2,552 2,878 3,922 18 19 0,127 0,257 0,391 0,533 0,688 0,861 1,066 1,328 1,729 2,093 2,539 2,861 3,883 19

20 0,127 0,257 0,391 0,533 0,687 0,860 1,064 1,325 1,725 2,086 2,528 2,845 3,850 20

21 0,127 0,257 0,391 0,532 0,686 0,859 1,063 1,323 1,721 2,080 2,518 2,831 3,819 21 22 0,127 0,256 0,390 0,532 0,686 0,858 1,061 1,321 1,717 2,074 2,508 2,819 3,792 22 23 0,127 0,256 0,390 0,532 0,685 0,858 1,060 1,319 1,714 2,069 2,500 2,807 3,767 23 24 0,127 0,256 0,390 0,531 0,685 0,857 1,059 1,318 1,711 2,064 2,492 2,797 3,745 24 25 0,127 0,256 0,390 0,531 0,684 0,856 1,058 1,316 1,708 2,060 2,485 2,787 3,725 25 26 0,127 0,256 0,390 0,531 0,884 0,856 1,058 1,315 1,706 2,056 2,479 2,779 3,707 26 27 0,127 0,256 0,389 0,531 0,684 0,855 1,057 1,314 1,703 2,052 2,473 2,771 3,690 27 28 0,127 0,256 0,389 0,530 0,683 0,855 1,056 1,313 1,701 2,048 2,467 2,763 3,674 28 29 0,127 0,256 0,389 0,530 0,683 0,854 1,055 1,311 1,699 2,045 2,462 2,756 3,659 29 30 0,127 0,256 0,389 0,530 0,683 0,854 1,055 1,310 1,697 2,042 2,457 2,750 3,646 30 40 0,126 0,255 0,388 0,529 0,681 0,851 1,050 1,303 1,684 2,021 2,423 2,704 3,551 40 60 0,126 0,254 0,387 0,527 0,679 0,848 1,046 1,296 1,671 2,000 2,390 2,660 3,460 60 120 0,126 0,254 0,386 0,526 0,677 0,845 1,041 1,289 1,658 1,980 2,358 2,617 3,373 120

∞ 0,126 0,253 0,385 0,524 0,674 0,842 1,036 1,282 1,645 1,960 2,326 2,576 3,291 ∞

ν

P 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 0,975 0,990 0,995 0,9995 ν

P

risoluzione eno 10/2005 guida pratica per la convalida, … · di un metodo alternativo di analisi...

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