rip-assay kit for microrna -...
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研究用試薬
https://ruo.mbl.co.jp/
TM
RiboCluster
RIP-Assay Kit for microRNA
AAAAA
AGO
RISC
60S
elFsA遺伝子
mRNA
B遺伝子mRNA
特定の疾患や機能に関連した mRNA や miRNA な
どは RNA 結合タンパク質 (RBP) を介してクラス
ター(RiboCluster)を形成していると考えられて
います。
本キットでは RBP に対する抗体を用いてリボ
ヌクレオタンパク質(RNP)を免疫沈降し、その
RNPからRNAを抽出する手法、すなわちRIPアッ
セイにより、RiboCluster ごとの mRNA および
miRNA を分離・濃縮することができます。これに
より各クラスターごとの mRNA と miRNA を同定
することが可能になります。
miRNA
miRNA とそのターゲットmRNAの同定に!
miRNAの成熟メカニズムの解明に!
RISC構成因子の同定と機能解析に!
新規miRNA同定及びライブラリー構築に!
Approach: 1
Approach: 2
特定のクラスターに分類されるmRNA、
miRNA群を特異的に回収
Microarray RT-PCR Sequencing
mRNA-miRNAのマッチング
同定
~RBP-mRNA-miRNAクラスターの網羅的解析ツール誕生~
mRNA及びその翻訳産物の機能解析へRIP-Chip技術はRibonomics, Inc. の特許技術 (USP# 6,635,422、USP# 7,504,210 ) です。
MBLはRibonomics, Inc.からワールドワイドな通常実施権を得てキットを開発しています。
40SRBP-Y
AAAAA
RBP-X
RBP-Z
RISC 構成因子以外でのRIP
RISC 構成因子でのRIP
実施例1
RNA intensity
2. 分離された large RNA画分をバイオアナライザーで解析しました。
Nucleotide length
1. 免疫沈降後のビーズにAGO2が結合していることをWBで確認しました。
Lane 1: Input sample (Jurkat cell lysate)
Lane 2: post-IP beads of Control IgG
Lane 3: post-IP beads of Anti-ElF2C2/AGO2 monoclonal antibody (Code No. RN003M)
75
50
37
100EIF2C2/AGO2
(kDa)
RISCの中心的役割を担うAGO2に対する抗体によるRIPアッセイ。(Approach: 1)
21 3
Light chain
Heavy chain
Control IgG EIF2C2/AGO2 Total RNA
3. 分離された large RNA画分をRT-PCRで解析しました。 4. 分離された small RNA画分を銀染色で確認しました。
Anti-AGO2Control IgG Total RNA
RIP sample
IRF2BP2
EIF5
c-Myc
40
30
20
50
21Lane 1: Control IgG
Lane 2: Anti-ElF2C2/AGO2 monoclonal antibody
small RNA画分
5. 精製した small RNAをシークエンス解析しました。
miRNA: coverage>90%, identity>90%
Similar to miRNA: coverage>80%, identity>80%
Artificial error: PCR等のクローニング過程に起因すると考えられるエラー
Sequencing error: シークエンスが起因と考えられるエラー
AGO2を含むクラスターから large RNA が濃縮分離されたことが確認できました。
AGO2を含むクラスターからsmall RNAが
濃縮分離された事が確認できました。
small RNA 画分から多くのmiRNAが同定されました。
(解析:96クローン )
c-Myc, EIF5, IRF2BP2のmRNAが同定されました。
18S rRNA
28S rRNA
(nt)
IB: Anti-ElF2C2/AGO2 monoclonal antibody (Code No. RN003M)
Similar to miRNA
Artificial error
Sequencing error
miRNA(70.8%)
実施例2
1. 免疫沈降後のビーズにRBPが結合していることをWBで確認しました。
Lane 1, 2: Input sample (K562 cell lysate)
Lane 3, 4: post-IP beads of Control IgG
Lane 5, 6: post-IP beads of Anti-IGF2BP1/IMP1 polyclonal antibody (Code No. RN007P)
75
50
100EIF2C2/AGO2
(kDa)
RISCの構成因子ではないIGF2BP1/IMP1*(Approach: 2)と
RISCの構成因子であるTNRC6A/GW182 (Approach: 1)に対する抗体によるRIPアッセイ。
*IGF2BP1/IMP1は細胞内にてmRNAの輸送や局在化、翻訳制御の役割を担うという報告があります。
21 3
IGF2BP1/IMP1
IgG Heavy chain
654
250
150
(kDa)21 3
TNRC6A/GW182
Lane 1: Input sample (K562 cell lysate)
Lane 2: post-IP beads of Control IgG
Lane 3: post-IP beads of Anti-TNRC6A/GW182 polyclonal antibody (Code No. RN033P)
2. 分離された large RNA画分をバイオアナライザーにて解析しました。
3. 分離された small RNA画分を銀染色で確認しました。
RNA intensity
Nucleotide length
IGF2BP1/IMP1Control IgG Total RNATNRC6A/GW182
4030
20
50
(nt)
21 3 54
small RNA画分
Lane 1: Control IgG
Lane 2: Anti-EIF2C2/AGO2 monoclonal antibody (Code No. RN003M)
Lane 3: Control IgG
Lane 4: Anti-IGF2BP1/IMP1 polyclonal antibody (Code No. RN007P)
Lane 5: Anti-TNRC6A/GW182 polyclonal antibody (Code No. RN033P)
4. 精製した small RNAをシークエンス解析しました。
miRNA: (coverage>90%, identity>90%)
Non-Identification: 同定できなかった配列 (新規miRNAの可能性を含む)
Artificial error: PCR等のクローニング過程に起因すると考えられるエラー
Sequencing error: シークエンスが起因と考えられるエラー
IMP1に対する抗体で IMP1関連クラスターの1成分として
AGO2も共免疫沈降されていることが確認されました。
それぞれの抗体を用いて得られたRIP サンプルから large RNA が濃縮分離されたことが確認できました。
それぞれの抗体を用いて得られたRIP サンプルから
small RNA が濃縮分離されたことが確認できました。
RISC 構成因子でない IMP1の RIP サンプルからも
多くのmiRNAが同定されました。(解析:各48クローン )
TNRC6A/GW182IGF2BP1/IMP1
IB: Anti-ElF2C2/AGO2 monoclonal antibody (Code No. RN003M)
IB: Anti-IGF2BP1/IMP1 polyclonal antibody (Code No. RN007P) IB: Anti-TNRC6A/GW182 polyclonal antibody (Code No. RN033P)
18S rRNA
28S rRNA
Non-Identification
Artificial error Sequencing error
Non-Identification
Artificial error Sequencing error
miRNA(60.4%)
miRNA (85.4%)
Dicer
ds RNAsiRNA経路miRNA経路
piRNA経路
AAAAAA
AAAAAA
siRNA は、ウイルス感染などの様々な要因で生じる長い 2 本鎖
RNA (dsRNA) が由来とされています。Dicer により、長い
dsRNA から 21-25 nt の 2 本鎖 RNA (siRNA duplex) が切り出
され、siRNA duplex のうち、guide 鎖が RISC 中の AGOに取り
込まれ、silencer として機能します。RISC に取り込まれなかっ
た passenger 鎖は分解されます。
AGO
AAAAAA
Target mRNA
TRBP
TRBP
Dicer
PIWI-interacting RNA (piRNA) は、トランスポゾンの転写産物
の 1 本鎖 RNA が由来とされています。Dicer などの RNase III
活性を持つタンパク質によるプロセシングを必要としない、
Primary processing pathway を介して生合成されます。生殖細
胞特異的な発現が認められている PIWI タンパク質にローディン
グされることにより、トランスポゾンの silencing に寄与してい
ると考えられています。
Target mRNA
miRNA は、核内でステムループ構造を保ったまま Drosha など
によって切り出され、precursor miRNA (pre-miRNA) として
細胞質へと輸送されます。pre-miRNA は、RNase III 活性を有
する Dicer により 21-25 nt の 2 本鎖 RNA へとプロセシング
された後、Argonaute タンパク質(AGO)に取り込まれます。
2 本鎖 RNA のうち passenger 鎖が分解され、guide 鎖が標的
mRNA の 3’ 非翻訳領域に結合する事により、翻訳抑制機構が
働くと考えられています。
deadenylation
リボソーム
AAAAAADrosha
DGCR8
sense transposontranscript
Piwi and/or Aub
guide鎖
Antisense piRNA
小さなRNA
RNA interference (RNAi) の発見により、
配列特異的な遺伝子発現制御機構の存在が
明らかになり、21-25 塩基程度の小さな
RNA が RNA-induced silencing complex
(RISC) に取り込まれ、mRNA の翻訳を制
御していることがわかってきました。小さ
な RNA には mRNA の翻訳調節に関わる
miRNA や siRNA、さらにはトランスポゾ
ンのサイレンシングに関与する piRNA な
どが知られています。
近年 miRNA は細胞増殖、発生・分化、ア
ポトーシスに関連していることが報告され
ています。miRNA の発現量の増減が、癌
を含む様々な疾患と関連していることか
ら、そのターゲット mRNA の同定が、疾
患メカニズムの解明に重要とされていま
す。
RISC
AGO
AGO
発売元
142219-10081030N 2010.08
Copyright 2010 Medical & Biological Laboratories, All Rights Reserved.
● RIP-Assay Kit for microRNA
RIP-Assay Kit for microRNAは、RIP-Assay により機能的
に関連するmRNA及びmiRNAを回収するために、最適化さ
れたキットです。実験デザインに合わせて、
・small RNA、large RNA を同時に回収 (2-step method)
・large RNA、small RNA を分離回収 (Separation method)
・主に small RNA を迅速に回収 (1-step method)
を選択することができます。
コードNo. 包装製品名 希望納入価格
RN1005 RIP-Assay Kit for microRNA 10 assays ¥60,000
試薬
キット構成品
免疫沈降試薬
mi-Lysis Buffer
mi-Wash Buffer
Normal Rabbit IgG
High-Salt Solution
RNA抽出試薬
mi-Solution I
mi-Solution II
mi-Solution III
mi-Solution IV
small RNA画分調製試薬
Gel Extraction Buffer
3 M NaOAc
miSPIKETM
26 mL × 1 bottle
35 mL × 2 bottles
0.33 mL × 1 vial
6 mL × 1 vial
0.26 mL × 1 vial
6 mL × 1 vial
4 mL × 1 vial
0.2 mL × 1 vial
25 mL × 1 vial
1 mL × 2 vials
100 pmoles × 1 vial
容量
RNA抽出ステップ
small RNA と largeRNAを同時回収
Separation method1-step method* 2-step method
large RNA と small RNA を分離回収
*さらに* RNA抽出ステップではフェノール溶液を使用しないため、
廃液処理の手間も省けます。
主に small RNA を迅速に回収
*他2法に比較すると large RNA の回収率は低いですが、少ないステップでアッセイが完了します。
◎学術部 基礎試薬グループ〒460-0008 名古屋市中区栄4丁目5番3号 KDX名古屋栄ビル10階TEL :(052)238-1904 FAX :(052)238-1441E-mail : [email protected]
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