ricerche microbiologiche standard del regno unito · in ordine alfabetico ottimizzate le...
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Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE
Batteriologia I B 17 I Emissione no: 6.1 I Data emissione: 13.12.16 I Pagina 1 di 26
© Crown copyright 2016
Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito
Ricerca su tessuti e biopsie da sedi profonde e organi
Ricerca su tessuti e biopsie da sedi profonde e organi
Batteriologia | B 17 | Emissione: no: 6.1 | Data emissione: 13.12.16 | Pagina: 2 di 26
UK Standards for Microbiology Investigations | Issued by the Standards Unit, Public Health England
Ringraziamenti
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultar https://www.gov.uk/government/groups/ standards-for-microbiology-investigations-steering-committee).
Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit Microbiology Services Public Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ E-mail: [email protected]
Website:https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories
Numero di accesso alle pubblicazioni PHE: 2016019
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la collaborazione di:
I loghi sono aggiornati al momento della pubblicazione
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Batteriologia | B 17 | Emissione: no: 6.1 | Data emissione: 13.12.16 | Pagina: 3 di 26
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Contenuti
TABELLA MODIFICHE ........................................................................................................... 4
SMI RU: SCOPO E OBIETTIVO .............................................................................................. 7
SCOPO DEL DOCUMENTO ................................................................................................. 10
INTRODUZIONE.................................................................................................................... 10
INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI ............................................................................ 13
1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ..................................................................... 14
2 PRELIEVO DEL CAMPIONE ........................................................................................ 14
3 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE ................................................ 15
4 PROCEDURA/PROCESSAZIONE SUL CAMPIONE ................................................... 15
5 PROCEDURA DI REFERTAZIONE ............................................................................ 20
6 NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE ..................................................................... 22
APPENDICE: RICERCA SU TESSUTI E BIOPSIE DA SEDI PROFONDE E ORGANI ......... 23
BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................... 24
NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for Microbiology Investigations. L’accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più dettagliate sull’accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation.
Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: www.nice.org.uk/accreditation
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Tabella delle Modifiche Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la E-mail: [email protected]
I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il sistema locale di gestione della qualità.
Modifica No/data 11/13.12.16
Emissione eliminata. no 6
Emissione inserita no. 6.1
Sezione(i) interessate Modifica.
Procedura/processazione dell campione.
Sezione 4.4.2 Supplementari
Informazioni aggiornate sulla preparazione del tessuto per l'esame nel caso di sospetto di infezioni fungine con un link al documento B 39 per ulteriori informazioni.
Sezione 4.5.1 (terreni di coltura, condizioni e microrganismi) aggiornati terreni e incubazione
Per Nocardiosi, la temperatura, l'atmosfera e il tempo di incubazione sono stati aggiornati in conformita a quanto specificato nelle altre SMI del RU.
Per le specie Legionella, è stato aggiornata l'atmosfera di incubazione.
Per chiarezza sono state aggiunte delle note a piè pagina.
Appendice. Aggiornata per adeguamento alla sezione 4.5.1.
Modifica No/data. 10/08.04.16
Emissione eliminata. no 5.3
Emissione inserita no. 6
Sezione(i) interessate Modifica.
Documento intero .
Collegamenti ipertestuali aggiornati al gov.uk.
Titolo aggiornato per includere 'da sedi e organi profondi’.
Bibliografia completamente revisionata.
Aggiunto tessuto polmonare e biopsia per il
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sospetto di infezione da specie Legionella.
Pagina 2 Aggiornata con aggiunta di loghi
Scopo Scopo aggiornato per includere metodi rapidi e collegamenti alle SMI pertinenti.
Introduzione
Riorganizzata per chiarezza. Tessuti specifici elencati in ordine alfabetico
Ottimizzate le Informazioni relative alle infezioni cutanee e presenti nella B11 - Ricerca con tamponi da infezioni cutanee e tessuti molli.
Informazione tecnica/limitazioni Inclusa la sezione con inclusi metodi rapidi
Considerazioni sulla sicurezza
Modificate le considerazioni di sicurezza relative al Gruppo dei microrganismi di Rischio 3.
Si raccomanda che tutti i coccobacilli Gram-negativi da sedi sterili siano processati in cabina microbiologica di sicurezza di Classe I o Classe II fino alla definitiva esclusione degli agenti patogeni del Gruppo di Rischio 3 (quali Brucella)
Procedura del campione I campioni per l'esame micologico non devono essere omogeneizzati/macinati
Procedura/processazione del campione
In teoria, tutto il processo di macinazione e di omogeneizzazione deve essere eseguito in cabina di Classe II con scarico protetto.
I campioni ottenuti chirurgicamente per la coltura fungina devono essere tagliati (in modo sottile) e non omogeneizzati.
Aggiunta la tecnica di colorazione fluorescente.
Aggiornata la Sezione 4.5.1 (terreni di coltura, condizioni e microrganismi) terreni e incubazione.
• Immunocompromessi/sospetta infezione fungina su Sabouraud a becco di clarino + cloramfenicolo (35-37ºC per14g di incubazione, modificato in incubazione 28-30ºC per 28g).
• Micetoma aggiunta di agar Sabouraud a becco di clarino + cloramfenicolo.
• Nocardiosi - semina in agar sangue 35-37ºC fino a 7g.
• Aggiunta semina di specie Legionella su BMPA o alternativa, a 35-37ºC fino a 10g.
• Infezione mista/procedure locali, aggiungere Agar Sale Mannite.
Sezione 4.6.1 (livello minimo di identificazione) livello di identificazione aggiornato per streptococchi β emolitici, stafilococchi coagulasi negativi,
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enterobatteriaceae e pseudomonas. Prendere in considerazione l'invio di stafilococchi isolati da campioni post mortem per il test della tossina.
Procedura di refertazione Aggiornata la modalità di refertazione della coltura.
Appendice Aggiornata in conformità alla sezione 4.5.1
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SMI del RU scopo e obiettivo
Utilizzatori delle SMI
Nel Regno unito le PMI Sono principalmente destinate venire Risorsa generale ai Professionisti Che
operano nel campo della medicina di laboratorio e delle Malattie infettive. Le SMI forniscono ai clinici
Informazioni in Merito allo standard di dei Servizi di laboratorio riferibili alle Ricerche per la diagnosi
delle infezioni nia Loro Pazienti e Le documentazioni forniscono predette Indicazioni Che facilitano la
prenotazione elettronica di prova appropriati. I Documenti forniscono Gli standard di per le Ricerche
microbiologiche Anche ai di Responsabili della Sanità Pubblica Che devono considerarle venire
parte delle procedura da Adottare per la salute SIA clinica Che pubblica per la propria popolazione..
Informazioni di base per le SMI
Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del
processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di
laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).Gli algoritmi delle
sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle indagini per
specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi differenziale
e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono metodologie
di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione della prova.
La standardizzazione delle procedure diagnostiche tramite l’applicazione delle SMI aiuta a garantire
uniformità nelle strategie di ricerca nei diversi laboratori nel RU ed è una condizione essenziale per
la sorveglianza della salute pubblica, ricerca e sviluppo di attività.
Coinvolgimento delle organizzazioni professionali
Lo sviluppo delle SMI è condotto in condizione paritaria da PHE, NHS,Royal College of
Patholoogists e organizzazioni professionali. L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere
trovato su sito:https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-
consistency-in-clinical-laboratories. L'inclusione del logo di un’organizzazione in una SMI implica il
sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I rappresentanti delle
organizzazioni professionali fanno parte del Comitato Direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano
le SMI. Le opinioni dei partecipanti non sono necessariamente quelle espresse da tutta
l'organizzazione che essi rappresentano. I rappresentanti agiscono da tramite con funzione di
collegamento bi-direzionale per informazione e dialogo. Le attività di rappresentanza sono ricercate
tramite un processo di consultazione. Le SMI sono sviluppate, revisionate e aggiornate tramite un
ampio processo di consultazione.
Assicurazione di qualità
La NHS Evidence ha accreditato la procedura usata dai SMI Working Groups per produrre le SMI.
L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida emesse dall’Ottobre 2009. La procedura per lo
sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008. Le SMI rappresentano una procedura standard
di buona qualità pratica alla quale si devono attenere per la propria attività tutti i laboratori clinici e di
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(Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica
riconosciute dal GMC (General Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia)
e la Virologia Medica.
sanità pubblica. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti dell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo. Le prestazioni della SMI dipendono da personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e che i risultati siano idonei allo scopo. I laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del controllo di qualità interno.
Coinvolgimento del paziente e della comunità Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato, la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero al nostro sito web.
Informazione della gestione dei dati sensibili La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza. Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza https://www.gov.uk/
https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/equality-and-diversity.
I Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti.
Dichiarazione legale Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, la PHE e ogni altra organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente, escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche evidenza e anche essere a conoscenza che la PHE e le organizzazioni partecipanti non si assumono alcuna responsabilità per tali modifiche. Per evitare ogni altro equivoco, poiché le SMI sono state sviluppate per l'applicazione all'interno del RU, Il rischio di qualsiasi applicazione al di fuori di questo territorio sarà a carico dell'utente.
Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel corso della revisione successiva. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell’ente accreditato NICE.
Le SMI sono assoggettate a diritti d’autore che dovrebbero essere riconosciti ove aproppriato
Citazione suggerita per questo documento Public Health England. (2016). Investigation of tissues and biopsies from deep-seated sites. UK Standards for Microbiology Investigations. B 17 Emissione 6.1.
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http://www.hpa.org.uk/SMI/pdfhttps://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories
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Scopo del Documento
Tipo di campione
Tessuto, biopsia.
Questa SMI descrive le procedure e la ricerca batteriologica di batteri e funghi in tessuti e biopsie da sedi profonde e organi.
Oltre ai metodi colturali, possono essere usati i metodi rapidi includenti il NAAT.
Per ulteriori informazioni riguardanti le indagini di infezioni causate da funghi, specie di Mycobacterium e parassiti fare riferimento a:
B 39 - Investigation of dermatological specimens for superficial mycoses
B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species
B 31 - Investigation of specimens other than blood for parasites
Non sono inclusi in questo documento i seguenti campioni:
Tessuti associati a infezione dell’impianto ortopedico (B 44 - Investigation of prosthetic joint infection samples).
Osso e tessuto molle associati a osteomielite (B 42 - Investigation of bone and soft tissue associated with osteomyelitis).
Biopsie gastriche (per presenza di Helicobacter pylori) (B 55 - Investigation of gastric biopsies for Helicobacter pylori).
Questa SMI deve essere usata con le altre SMI.
Introduzione
La biopsia è definita come una porzione di tessuto rimosso da un organismo vivente per accertamento successivo. Con il progressivo incremento della tecnologia delle immagini cliniche e degli strumenti per il campionamento, pochi sono gli organi del corpo umano che non possono essere sottoposti a biopsia. I tessuti ottenuti con un atto operatorio sono particolarmente preziosi in quanto le procedure di campionamento possono non essere ripetibili. In teoria questi materiali dovrebbero essere oggetto di discussione con il laboratorio prima del loro prelievo, al fine di assicurare che il trasporto e le procedure siano tempestive e le prove appropriate.
Le biopsie ed altri campioni tissutali sono ottenute principalmente con tre modalità:
con procedura chiusa, di solito attraverso la cute (vale a dire agobiopsia). I campioni da biopsia percutanea sono associati a problemi particolari; solitamente sono di dimensioni molto piccole, possono mancare la lesione infetta o possono contaminarsi con flora cutanea
come procedura aperta durante un intervento (ad esempio sbrigliamento o devitalizzazione o tessuto infetto). Il tessuto ottenuto in questo modo è di solito più soddisfacente, in modo particolare quando l’indirizzo chirurgico è quello di rimuovere tessuto infetto.
tessuti prelevati post mortem (tessuti da polmoni di pazienti con polmonite). Nella maggior parte dei casi lo scopo principale del campionamento è quello di ottenere tessuto per l’esame istologico. Le possibilità microbiologiche su questi campioni sono ridotte perché di solito sono contaminati da flora enterica. Si deve porre attenzione all’interpretazione clinica di questi risultati perché spesso non sono significativi.
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Le biopsie possono essere prelevate da tessuti cronicamente infetti e pertanto,oltre alla ricerca di infezione batterica, possono anche richiedere quella delle forme fungine, specie Mycobacterium o parassiti. L’esame istologico fornisce spesso indicazioni per intraprendere ricerche per particolari tipologie infettive. Ad esempio, la presenza di un granuloma caseoso dovrebbe far sospettare un’infezione tubercolare; aspetti simili possono essere prodotti talvolta da infezioni fungine profonde.
I tessuti e le biopsie non sono campioni facilmente ripetibili e pertanto la conservazione prolungata (1 mese) dei materiali residui può essere critica per consentire l’esecuzione di ulteriori indagini del caso, quali le culture dei micobatteri o l’invio a un laboratorio di riferimento per la 16S rDNA PCR.
Tessuti specifici1
Contenuti aneurisma aortico
I contenuti dell’aneurisma aortico possono essere inviati per l'esclusione di una causa di infezione2.
Materiali artificiali
Per le indagini possono essere inviati al laboratorio anche materiali artificiali. Questi comprendono protesi valvolari cardiache, pacemaker, innesti, articolazioni artificiali e impianti di tessuto.
Biopsie cerebrali
Le biopsie cerebrali possono talvolta essere prelevate per differenziare le condizioni non infettive dalle infezioni.
Cornee
Le cornee dovrebbero essere esaminate nei casi in cui si sospetta infezione oculare radicata profondamente. Fare riferimento a: SMI B 2 - Investigation of bacterial eye infections.
Donatore di valvole cardiache o cerchi corneali
Il donatore di valvole cardiache o di cerchi corneali deve essere sottoposto a screening per l'infezione batterica prima dell'impianto.
Valvole cardiache
Le valvole cardiache provengono da pazienti con endocardite infettiva sottoposti a sostituzione valvolare o prelevate post mortem. Le valvole protesiche infette possono essere inviate per l’esame colturale. Ove possibile i risultati di questi esami colturali devono essere correlati alle emocolture o agli esami sierologici.
Negli anni recenti, la PCR è stata utile nella diagnosi di endocardite infettiva, rilevando nei campioni di valvole cardiache Coxiella burnetii3,4. La PCR Duplex è stato utilizzata con successo per differenziare Coxiella burnetii e altre cause di endocardite infettiva5.
Biopsie polmonari (percutanee, broncoscopiche, chirurgiche o post mortem)6
Le biopsie polmonari sono classificate per la tipologia di ingresso o per il motivo della biopsia. Possono essere utili per le infezioni causate da batteri, comprese le specie Actinomyces, specie
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Nocardia, specie Legionella, specie Mycobacterium e funghi, in particolare per le specie Aspergillus e Pneumocystis jirovecii. La polmonite da Pneumocystis (PCP) si manifesta quasi esclusivamente nei pazienti immunocompromessi. La PCP può essere diagnosticata in modo meno invasivo (di solito con sensibilità ridotta) mediante espettorazione indotta o su campioni di lavaggio broncoalveolare. Fare riferimento a B 57 - Investigation of brochoalveolar lavage, sputum and associated specimens.
Linfonodi
I linfonodi asportati sono sottoposti a indagini per linfoadenite, in modo particolare se sospetta
linfoadenite da micobatteri. La causa più frequente nei bambini di età inferiore a 15 anni è
sostenuta da micobatteri diversi da Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium non tubercolari
(NTM)), in particolar modo Mycobacterium avium intracellulare. Tuttavia, anche il Mycobacterium
tuberculosis può anche essere isolato da questi soggetti e da quelli con età superiore7. Altre cause
importanti di linfoadenite sono sostenute dalla toxoplasmosi; dalla malattia da graffio di gatto,
dovuta a Bartonella henselae, microrganismo Gram negativo endemico tra i gatti domestici; e dal
linfogranuloma venereo - infezione sessualmente trasmessa da clamidia8. Tutte queste condizioni
sono forse meglio diagnosticate dalla combinazione di indagini istologiche e sierologiche,
associate a test diagnostici molecolari, se disponibili (ad es. NAAT per genoma di Toxoplasma,
disponibile presso il Laboratorio di Riferimento per Toxoplasma
https://www.gov.uk/government/collections/toxoplasma-reference-laboratorio-trl).
Campioni placentari e prodotti del concepimento
I prodotti del concepimento e i campioni placentari sono inviati per l'accertamento di aborto settico
e listeriosi. La Listeria monocytogenes può causare gravi infezioni nelle donne in gravidanza, nei
neonati e nei pazienti immunocompromessi9,10. Nelle donne in gravidanza la setticemia causata da
L. monocytogenes si presenta come una malattia febbrile acuta che può nuocere al feto10. Questa
condizione può determinare infezioni sistemiche (granulomatosi infantisepticum), nascita di feti
morti e meningite neonatale. Devono essere esaminati per questo microrganismo i prodotti del
concepimento, placenta e tamponi dello screening neonatale. La coltura di routine dei tamponi
vaginali per L. monocytogenes non è di solito eseguita anche se può essere utile nei casi sospetti.
Sono indicate le emocolture. Le indagini sierologiche non sono utili nella diagnosi di listeriosi
(consultare B 28 - Investigation of genital tract and associated specimens)9.
L’aborto settico può provocare gravi morbilità materna e può essere a esito infausto10. La
perforazione uterina, la presenza di detriti necrotici, e la ritenzione di prodotti placentari possono
indurre infezioni. La maggior parte delle infezioni sono polimicrobiche e coinvolgono gli anaerobi.
La sepsi da Clostridium può complicare l'aborto ed essere potenzialmente letale. In alcune donne
le specie Clostridium appartengono alla flora vaginale normale.
Biopsie cutanee
Le biopsie cutanee possono essere inviate per la ricerca di batteri e funghi cutanei e per infezioni
dei tessuti molli, e di parassiti tissutali quali Onchocerca volvulus, Mansonella streptocerca e
specie Leishmania (B 31 - Investigation of specimens other than blood for parasites. Sono anche
utilizzate per confermare i casi di granuloma da piscina o da acquario, infezione cutanea cronica
causata dal Mycobacterium marinum, che è associata a ferita e al contatto con l'acqua per i
nuotatori e addetti alla manutenzione di pesci tropicali11 (B 40 - Investigation of specimens for
Mycobacterium species).
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La fascite necrotizzante è limitata dalla fascia profonda. L'infezione si diffonde ampiamente e rapidamente per l'assenza di barriere interne nella fascia. L'infezione può essere fatale in un tempo molto breve. Alcuni casi si verificano nel post-operatorio o in pazienti con patologie soggiacenti, come tumori maligni. Alcuni autori ritengono che possa essere di due tipi distinti. Il tipo I è dovuta a un’infezione di tipo polimicrobico di organismi aerobici ed anaerobi (streptococchi del gruppo A, anaerobi, S. aureus e componenti delle Enterobacteriaceae). Il tipo II (cancrena emolitica streptococcica) è dovuta a infezione da streptococci di gruppo A12.
Informazione Tecnica/Limitazioni
Limitazioni delle SMI del RU
Le raccomandazioni formulate nelle SMI del RU sono basate su prove (ad esempio sensibilità e specificità), se disponibili, opinioni degli esperti e pragmatismo, tenendo in considerazione anche dlle risorse disponibili. I laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali, se appropriato. Prima del loro uso, i laboratori devono assicurare che tutti i saggi commerciali e in-house sono stati validati e sono idonei allo scopo
Terreni selettivi nelle procedure di screening
I terreni selettivi non sono in grado di sviluppare la crescita di tutti i ceppi dei microrganismi circolanti che possono essere ricercati sulla base degli elementi a disposizione. Deve essere pertanto ricercato un equilibrio tra le evidenze disponibili e la disponibilità delle risorse richieste se si utilizza più di una piastra di terreno.
Contenitori per campioni13,14
Le SMI usano Il termine '' contenitore a chiusura ermetica con marchiatura CE ” per descrivere quelli contrassegnati con la marchiatura CE per la raccolta e il trasporto dei campioni clinici. I requisiti per i contenitori dei campioni sono riportati nella Direttiva EU per i Dispositivi Sanitari Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) in cui si stabilisce:'' La progettazione deve consentire un'agevole manipolazione e, se necessario, ridurre per quanto possibile la contaminazione dei, e perdite dal dispositivo durante l'uso e, nel caso di recipienti per campioni, il rischio di contaminazione degli stessi. Le procedure di fabbricazione devono essere adatte a questi scopi''.
Metodi rapidi
Per migliorare la sensibilità e ridurre i tempi di risposta, le prove d’identificazione e di sensibilità rapide possono essere eseguite contemporaneamente ai metodi di routine, se appropriato. Sono stati valutati numerosi metodi d’identificazione e di sensibilità rapidi; questi includono tecniche molecolari e il matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flight (MALDI-TOF)15-17. E’ importante garantire la disponibilità di colture recenti di isolati singoli puri da saggiare per evitare di refertare risultati fuorvianti.
I laboratori devono seguire le istruzioni del produttore e tutti i test rapidi devono essere validati prima dell'uso ed aver dimostrato di essere idonei allo scopo.
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1 Considerazioni sulla Sicurezza13,14,18-32
1.1 Prelievo, Trasporto, Conservazione del Campione 13,14,18-21
Usare tecnica asettica.
Raccogliere in appropriati contenitori con marchiatura CE a tenuta ermetica i campioni e trasportarli in sacchetti di plastica sigillati.
E’ essenziale la conformità alle normative postali e dei trasporti.
1.2 Procedura sul Campione13,14,18-32
Livello di Contenimento 2.
Se si sospettano microrganismi di Gruppo di Rischio 3, quali, M. tuberculosis, Brucella abortus, Histoplasma capsulatum, specie Coccidioides, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Penicillium marneffei, specie Cladophialophora, specie Fonsecea e Ramichlordium mackenziei, tutti i campioni devono essere processati in cabina microbiologica di sicurezza in complete condizioni di completo Contenimento di Livello 3.
Si raccomanda che tutti i coccobacilli Gram-negativi da sedi sterili siano processati in cabina microbiologica di sicurezza di Classe I o Classe II fino a quando sono stati definitivamente esclusi agenti patogeni appartenenti al Gruppo di Rischio 3 (quale Brucella)33.
Le procedure di laboratorio che si ritiene possano generare aerosol dovrebbero essere eseguite in cabina di sicurezza24.
La macinazione e l’omogeneizzazione di tutti i campioni devono essere eseguite in cabina microbiologica di sicurezza. Ove possibile, l'uso di forbici sterili è raccomandato preferendole ai bisturi.
Nota: I campioni per esami micologici non devono essere omogeneizzati/macinati
I contenitori dei campioni devono essere collocati su appropriati supporti.
Fare riferimento alle attuali linee guida per la manipolazione sicura di tutti i microrganismi documentati in questa SMI.
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio.
2 Prelievo Campione
2.1 Tipo di campione
Tessuto, biopsia
2.2 Tempo ottimale e metodo di prelievo1 Per considerazioni sulla di sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1.
Prelevare i campioni prima della terapia antimicrobica se possible1.
Di norma un medico, preleverà il campione.
Prelevare i campioni in contenitori impermeabili con marchiatura CE inseriti in sacchetti di plastica sigillati.
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Generalità
Se il campione è di piccole dimensioni, immergerlo in acqua sterile per evitare l'essiccamento. Nota: I campioni ricevuti in formalina-salina non sono adatti per la cultura.
Nota: Assicurarsi che la conservazione e l'eliminazione dei tessuti sia conforme con lo Human Tissue Act 2004.
Sospetto di specie Legionella (tessuto polmonare e biopsia)
Se il campione è di piccole dimensioni, immergerlo in acqua sterile per prevenire l'essiccamento.
Nota: ciò non sarebbe appropriato per campioni sottoposti a trattamento per la diagnosi con metodi molecolari.
Nota: Evitare l'uso di soluzione fisiologica, nota per essere un inibitore delle specie Legionella
2.3 Quantità adeguata e numero appropriato di campioni1
In teoria, i campioni, devono essere di dimensioni sufficienti per eseguire l’esame microscopico e colturale.
La dimensione minima del campione è condizionata dal numero di accertamenti richiesti
Numero e frequenza dei campioni dipendono dalle condizioni cliniche del paziente
3 Trasporto e Conservazione del Campione13,14
3.1 Condizioni ottimali di Trasporto e Conservazione
Per considerazioni sulla di sicurezza,fare riferimento alla Sezione 1.1.
I campioni devono essere trasportati e processati il più presto possibile1.
Se la procedura è ritardata è preferibile la conservazione a temperatura ambiente1.
Il volume del campione influenza l’accettabilità del tempo di trasporto. Volumi consistenti di materiale purulento mantengono più a lungo la vitalità degli anaerobi34
I tessuti e le biopsie non sono campioni facilmente ripetibili e pertanto la conservazione prolungata (1 mese) di campioni residui possono essere fondamentali per consentire la disponibilità di qualsiasi successiva appropriata indagine, quale le colture dei micobatteri o l’invio per una 16S rDNA PCR.
4 Procedura sul campione13,14
4.1 Selezione della prova Selezionare una quota rappresentativa del campione per le appropriate procedure, quali coltura per funghi, (B 39 - Investigation of dermatological specimens for superficial mycoses) e specie Mycobacterium (B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species), e ricerca di parassiti (B 31 - Investigation of specimens other than blood for parasites) in funzione delle notizie cliniche.
Se il campione è insufficiente per tutte le indagini, queste devono essere selezionate in accordo con le indicazioni cliniche dopo consultazione con un medico microbiologo.
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4.2 Aspetto
N/D
4.3 Preparazione del campione
Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.2
4.3.1 Pre-trattamento
Standard
Macinare o omogeneizzare il campione come appropriato, usando un macina per tessuto sterile (perline Ballotini), un bisturi sterile o (preferibilmente) forbici sterili e piastra di Petri. L'aggiunta di una piccola quantità (circa 0,5 ml) di acqua sterile, filtrata, fisiologica, peptone o brodo aiuterà il processo di omogeneizzazione.
In teoria,tutte le procedure di macinazione o omogeneizzazione dovrebbero essere eseguite in cabine di Classe II con scarico protetto.
Nota: i campioni ottenuta per via chirurgica per la coltura fungina dovrebbero essere tagliati (in modo sottile) e non omogeneizzati35.
4.3.2 Prove supplementari
N/D
4.4 Microscopia
4.4.1 Standard
N/D
4.4.2 Prove Supplementari
Colorazione Gram
Campioni omogeneizzati
(Per i metodi di omogeneizzazione consultare la Sezione 4.3.1).
Porre una goccia di campione su un vetrino da microscopio pulito utilizzando una pipetta sterile.
Diffonderlo con un’ansa sterile per formare uno striscio sottile per la colorazione Gram.
Campioni non omogeneizzati
Preparare un campione per impressione – utilizzare pinze sterili per afferrare il frammento di campione, appoggiare il lato di uno o più frammenti del campione su un vetrino da microscopio pulito per colorazione Gram. Raggruppare i preparati ottenuti per impressione al fine di facilitarne l’osservazione. Questa campione non può essere utilizzato per l’esame colturale.
Consultare TP 39 - Staining procedures.
Tecnica di colorazione fluorescente
Seguire le istruzioni del produttore
Legionella
Per sospetta presenza di specie Legionella (tessuto polmonare e biopsie) omogeneizzare il campione come indicato nella sezione 4.3.1
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Usando una pipetta sterile deporre una goccia di campione omogeneizzato su un vetrino pulito da microscopio PTFE (politetrafluoroetilene).
Diffondere la goccia con un'ansa sterile per fare uno striscio sottile per la colorazione fluorescente.
Sospette infezioni fungine
Per le infezioni fungine sospette tagliare finemente i campioni come indicato nella sezione 4.3.1.
Inserire una piccola porzione di tessuto in una provetta sterile Eppendorf con alcune gocce di KOH 20%, posto per ammorbidire in un blocco termico per 20 min.
Usando una pipetta sterile trasferire il tessuto ammorbidito su un vetrino, aggiungere una goccia di calcofluor/blankophor e osservare al microscopio a fluorescenza.
Notare il tipo delle strutture visualizzate in correlazione con i successivi risultati della coltura, cioè pseudoife, vere ife, forme di lievito, altri elementi fungini
Per maggiori informazioni consultare TP 39 - Staining procedures e B 39 - Investigation of dermatological specimens for superficial mycoses.
4.5 Coltura e ricerca
Campioni omogeneizzati
Seminare ciascuna piastra e il brodo di arricchimento con campioni omogeneizzati o macinati (consultare Q 5 – Inoculation of Culture Media for Bacteriology
Per ottenere colonie isolate diffondere l’inoculo utilizzando un’ansa sterile.
Campioni non omogeneizzati
Inoculare ciascuna piastra di agar con un frammento di tessuto (consultare Q 5 – Inoculation of culture media for bacteriology).
Per ottenere colonie isolate diffondere l’inoculo utilizzando un’ansa sterile.
4.5.1Terreni di coltura, condizioni e microrganismi: Aspetti clinici/ /
condizioni
Campione Terreni standard
Incubazione Lettura colture
Microrgani- smo(i) bersaglio Temp.
°C Atmos. Time
Tutte le condizioni cliniche
Tessuto
Biopsia
Agar sangue 35-37 5-10% CO2
40-48 ore
giornal. Qualsiasi microrganismo
CLED/
Agar MacConkey
35-37 Air 18-24 ore
18 ore
Agar selettivo per anaerobi
35-37 Anaerobia 5g 40 ore e a 5g Anaerobi
Anaerobi esigenti, brodo carne cotta o equivalente.
Subcolture se evidenza di crescita (≥40ore), o a 5g
35-37
35-37
Aria
Come sopra
Fino a 5g
Come sopra
N/D
Come sopra
Qualsiasi microrganismo
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Come terreni precedenti escludendo agar MacConkey
Per queste situazioni aggiungere quanto segue.:
Aspetti clinici/
condizioni
Campione Terreni supplementari
Incubazione Lettura colture
Microrgani- smo(i) bersaglio
Temp. °C
Atmos. Time
Se microscopia è indicativa di infezione mista
Tessuto
Biopsia
Agar selettivo per anaerobi con disco da 5μg di metronidazolo
35-37 Anaerobia 5g 40ore e a 5g
Anaerobi
Actinomicosi
Tessuto
Biopsia
Agar sangue arricchito con metronidazolo e acido nalidixico
35-37 Anaerobia 10g 40ore, a 7g e 10g
Specie Actinomyces
Immunocompromessi, o sospetta infezione fungina
Tessuto
Biopsia
Agar Sabouraud a becco di clarino+ cloramfenicolo
35-37
e
28-30
Aria 14g
28g
giornal# Funghi
Muffe
Micetoma Tessuto
Biopsia
Lowenstein-Jensen a becco di clarino/ Agar sangue
o
Agar Sabouraud a becco di clarino+ cloramfenicolo
35-37
28-30
Aria
Aria
Fino a
28g
Ogni 3- 4 giorni
Specie Actinomycetes aerobie
Lieviti
Muffe
Nocardiosi Tessuto
Biopsia (lavaggio bronco-alveolare)
Agar sangue 35-37 5-10% CO2
16 - 48 ore
giornal. Specie Nocardia
Sospetta Legionellosi
Tessuto
Biopsia
BMPA o BCYEA o agar Legionella alternativo
35-37 Atmosfera umida
Fino a 10g
3g, 7g e 10g
Specie Legionella
Terreni opzionali:
Quando l’aspetto clinico o la microscopia suggeriscono infezione mista
o
in funzione delle disposizioni locali
Tessuto
Biopsia
Agar selettivo Stafilococchi/ Streptococchi
o
Agar Sale Mannite
35-37 Aria 40-48ore
giornal. S. aureus
Streptococchi
Altri microrganismi da considerare – Funghi (B 39 - Investigation of dermatological specimens for superficial mycoses), H. pylori (B 55 - Investigation of gastric biopsies for Helicobacter pylori), specie Listeria, specie Mycobacterium (B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species) e parassiti (B 31 - Investigation of specimens other than blood for parasites).
#Agenti di micosi esotiche importate quali Histoplasma capsulatum e alcuni isolati di Cryptococcus per crescere
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possono richiedere fino 8 settimane; sarà pertanto richiesta un’incubazione con adeguata umidificazione36,37
.
* Va notato che l'incubazione in 2-5% CO2 può migliorare la crescita di alcune specie di Legionella come L. sainthelensi e L. oakridgensis
38. Questa ridotta concentrazione di CO2 non influenzerà la crescita di L. pneumophila,
ma livelli superiori al 5% possono inibire la crescita.
** Se laboratori scelgono di utilizzare piastre di agar selettivo per Legionella come agar BCYE come terreno supplementare per l'isolamento di specie Nocardia, il suo utilizzo deve essere soggetto ai risultati di validazione locale. Il documento, ID10: Identification of aerobic actinomycetes raccomanda che, se si utilizzano piastre di agar selettivo, queste devono essere incubate per 2 o 3 settimane.
4.6 Identificazione
Per l’identificazione dei microrganismi fare riferimento alle singole SMI.
4.6.1 Livello minimo di identificazione in laboratorio
Actinomycetes Livello genere
ID 10 – Identification of aerobic Actinomycetes species
ID 15 – Identification of anaerobic Actinomycetes species
Anaerobes Livello "anaerobi"
ID 8 - Identification of Clostridium species
β-haemolytic streptococci Livello specie
Coagulase-negative staphylococci Livello “coagulasi-negativi"
Enterobacteriaceae Livello specie
Pseudomonads Livello specie
S. aureus Livello specie
(considerare la leucocidina Panton-Valentine (PVL) e il test della tossina, se compatibile con i sintomi clinici)
(considerare la ricerca di tossine su campioni da autopsie)
S.anginosus group Livello gruppo S. anginosus
Funghi Livello specie
Lieviti Livello specie
Legionella species Livello specie
Mycobacterium species Livello specie
B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species
Parasites Livello specie
B 31 - Investigation of specimens other than blood for parasites
I microrganismi possono essere successivamente identificati in modo più approfondito se indicato clinicamente o epidemiologicamente.
4.7 Prova di sensibilità agli antimicrobici
Fare riferimento alle linee guida della British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) e/o EUCAST.
Per isolati di candida sono disponibili i breakpoint della CLSI
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4.8 Invio per ricerche su focolaio epidemico
Fare riferimento alle linee guida della British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC)
4.9 Invio ai laboratori di riferimento
Per informazioni sulle prove disponibili, tempi di risposta, procedure per il trasporto e altre richieste del laboratorio di riferimento, click here for user manuals and request forms.
I microrganismi con resistenze insolite o inattese, o qualora sussista un problema clinico o di laboratorio, o anomalie che richiedano approfondimenti devono essere inviati agli appropriati laboratori di riferimento
Considerare l'invio degli S. aureus isolati per il test della tossina per i quali sono disponibili appropriati dettagli clinici. Ad esempio, gli isolati da campioni autoptici devono essere inviati per il test della tossina quando il campione è sospettato di essere l’agente causale della morte.
Contattare gli appropriati laboratori nazionali specializzati per informazioni sulle prove disponibili tempi di risposta, procedure di trasporto e altre richieste per l’invio del campione.
Inghilterra e Galles
https://www.gov.uk/specialist-and-reference-microbiology-laboratory-tests-and-services
Scozia
http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx
Irlanda del Nord
http://www.publichealth.hscni.net/directorate-public-health/health-protection
5 Procedura di Refertazione
5.1 Microscopia Colorazione Gram
Segnalare i leucociti ed i microrganismi osservati
Legionella immunofluorescenza
Legionella pneumophila rilevata con immunofluorescenza o
Legionella pneumophila non rilevata con immunofluorescenza
Colorazione fluorescente per funghi
Refertare la tipologia dell’elemento fungino osservato.
5.1.1 Tempo di refertazione Microscopia
Tutti i risultati dovrebbero essere rilasciati al clinico richiedente appena disponibili, a meno che siano state concordate soluzioni specifiche con i richiedenti.
Risultati urgenti possono essere trasmessi per telefono o inviati per via elettronica secondo le disposizioni locali.
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5.2 Coltura
I seguenti risultati dovrebbero essere refertati nel modo seguente
isolati microrganismi clinicamente significativi
altre crescite, con appropriati commenti, ad esempio, nessuna crescita significativa
assenza di crescita
Refertare anche i risultati delle prove supplementari
5.2.1 Tempo per referto coltura
Risultati intermedi o preliminari dovrebbero essere rilasciati dopo il rilievo di isolati clinici
potenzialmente significativi, non appena viene riconosciuta la loro crescita, tranne nel caso che
siano state concordate soluzioni alternative specifiche con i richiedenti.
I risultati urgenti dovrebbero essere comunicati per telefono o trasmessi elettronicamente in
conformità con le disposizioni locali.
Il referto finale scritto o generato dal computer dovrebbe seguire le comunicazioni preliminari e
verbali nel più breve tempo possibile.
Legionella
Il referto finale scritto o generato dal computer dovrebbe seguire le comunicazioni preliminari/
verbali entro 3 - 10 giorni, segnalando, se del caso, che verrà inviato un referto successivo.
5.3 Sensibilità agli antimicrobici
Refertare le sensibilità come clinicamente suggerito. Usare in modo prudente gli antibiotici
secondo i protocolli locali e nazionali raccomandati
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6 Notifica al PHE39,40 o Equivalente41,44
Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla
Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella
Scheda 2 della Direttiva. Le denunce devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica,
entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si
raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro
sette giorni.
Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE.
Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è
ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad
agenti causali soggetti a tale disposizione.
La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non
sostituisce l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala
spontaneamente alla PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti
eziologici e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni
urgenti di alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare.
Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione
per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare
Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt–Jakob disease CJD da includere nel ‘Notification
Duties of Registered Medical Practitioners’, e non al ‘Notification Duties of Diagnostic
Laboratories’.
https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/our-governance#health-protection-regulations-2010
In Scotland41,42, Wales43 e Northern Ireland44 sono vigenti altre disposizioni.
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Appendice: Ricerca su tessuti e biopsie da sedi profonde e organi
Campione macinato od omogeneizzato
(tranne se sospettata infezione fungina)
Terreni standard Terreni
Supplementari
Terreni Opzionali
Sedi sporche o
quando
microscopia
suggerisce
infezione mista, o
in funzione delle
procedure locali
Agar selettivo
Staph/Strep
O
ASM
Incubare a 35-
37°C
Aria
40-48 ore
Lettura
gionaliera
Se microscopia
indicativa per
infezione mista
Actinomicosi
Immunocomprom
essi o suspettata
infezione fungina
Mycetoma
Incubare a 35-
37°C
Anaerobica
5 g
Lettura a ≥ 40ore
e a 5 g
Incubare a 35-
37°C
Anaerobica
10 g
Lettura a ≥ 40ore
e
a 7 g e 10 g
Agar Sabouraud
becco di clarino +
cloramfenicolo
Incubare a 35-
37°C
Aria
14 g
Lettura
giornaliera
o 28-30°C
Fino a 28 g
LJ becco clarino/
Agar sangue
o
Agar Sabouraud
becco di clarino +
cloramfenicolo
Incubare a 28-
30°C
Aria
Fino a 28 g
Lettura ogni 3-4 g
Incubare a
35-37°C
Aria
5 g
Subcoltura in
Agar sangue
Agar selectivo
anaerobi
CLED
Se presente
crescita
(≥40ore) o 5 g
Anaerobi
ID 8, 14, 25
Actinomyces
sp
Rifer a ID 15
Actinomyceti
Anaerobi
S. aureus
ID 7
Streptococchi
ID 4
Agar sangue Agar Selettivo
per anaerobi
Agar CLED/
MacConkey
Anaerobi
esigenti, brodo
carne cotta o
equivalente
Incubare a
35-37°C
5-10% CO2
40-48 ore
Lettura
giornaliera
Incubare a
35-37°C
Anaerobiosi
5 g
Lett. a ≥ 40ore
e a 5 g
Incubare a
35-37°C
Aria
18-24 ore
Lettura a ≥ 18
ore
Funghi
Muffe
Suspected
Legionellosis
BPMA/CYE/
BCYEA/
Agar selettivo
Legionella
Incubare a 35-
37°C
Atmos Umida
10 g
Lettura a 3 g, 7 g
e 10 g
Legionella sp
ID 18
Nocardiosis
Agar sangue
Incubare a 35-
37°C
5-10% CO2
16-48 ore
Lettura giornal.
Nocardia sp
Rifer a ID 10
Tutti i campioni
Anaerobi
ID 8, 14, 25
Ogni organismo
Referimento
alle ID
Ogni organismo
Referimento
alle ID
Agar selettivo
per anaerobi
con disco 5μg
metronidazole
Agar sangue
supplementato con
metronizadolo e
acido nalidixico
Incubare come
’i terreni’
da semina diretta
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39. Public Health England. Laboratory Reporting to Public Health England: A Guide for Diagnostic
Laboratories 2013. 1-37. 40. Department of Health. Health Protection Legislation (England) Guidance. 1-112. 2010. 41. Scottish Government. Public Health (Scotland) Act. 2008. 42. Scottish Government. Public Health etc. (Scotland) Act 2008. Implementation of Part 2: Notifiable
Diseases, Organisms and Health Risk States. 2009. 43. The Welsh Assembly Government. Health Protection Legislation (Wales) Guidance. 2010. 44. Home Office. Public Health Act (Northern Ireland) 1967 Chapter 36. 1967.
Ricerca su tessuti e biopsie da sedi profonde e organi
Batteriologia | B 17 | Emissione: no: 6.1 | Data emissione: 13.12.16 | Pagina: 2 di 26
UK Standards for Microbiology Investigations | Issued by the Standards Unit, Public Health England
Ringraziamenti
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultar https://www.gov.uk/government/groups/ standards-for-microbiology-investigations-steering-committee).
Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit Microbiology Services Public Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ E-mail: [email protected]
Website:https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories
Numero di accesso alle pubblicazioni PHE: 2016019
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la collaborazione di:
I loghi sono aggiornati al momento della pubblicazione
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Contenuti
TABELLA MODIFICHE ........................................................................................................... 4
SMI RU: SCOPO E OBIETTIVO .............................................................................................. 7
SCOPO DEL DOCUMENTO ................................................................................................. 10
INTRODUZIONE.................................................................................................................... 10
INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI ............................................................................ 13
1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ..................................................................... 14
2 PRELIEVO DEL CAMPIONE ........................................................................................ 14
3 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE ................................................ 15
4 PROCEDURA/PROCESSAZIONE SUL CAMPIONE ................................................... 15
5 PROCEDURA DI REFERTAZIONE ............................................................................ 20
6 NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE ..................................................................... 22
APPENDICE: RICERCA SU TESSUTI E BIOPSIE DA SEDI PROFONDE E ORGANI ......... 23
BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................... 24
NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for Microbiology Investigations. L’accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più dettagliate sull’accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation.
Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: www.nice.org.uk/accreditation
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Tabella delle Modifiche Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la E-mail: [email protected]
I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il sistema locale di gestione della qualità.
Modifica No/data 11/13.12.16
Emissione eliminata. no 6
Emissione inserita no. 6.1
Sezione(i) interessate Modifica.
Procedura/processazione dell campione.
Sezione 4.4.2 Supplementari
Informazioni aggiornate sulla preparazione del tessuto per l'esame nel caso di sospetto di infezioni fungine con un link al documento B 39 per ulteriori informazioni.
Sezione 4.5.1 (terreni di coltura, condizioni e microrganismi) aggiornati terreni e incubazione
Per Nocardiosi, la temperatura, l'atmosfera e il tempo di incubazione sono stati aggiornati in conformita a quanto specificato nelle altre SMI del RU.
Per le specie Legionella, è stato aggiornata l'atmosfera di incubazione.
Per chiarezza sono state aggiunte delle note a piè pagina.
Appendice. Aggiornata per adeguamento alla sezione 4.5.1.
Modifica No/data. 10/08.04.16
Emissione eliminata. no 5.3
Emissione inserita no. 6
Sezione(i) interessate Modifica.
Documento intero .
Collegamenti ipertestuali aggiornati al gov.uk.
Titolo aggiornato per includere 'da sedi e organi profondi’.
Bibliografia completamente revisionata.
Aggiunto tessuto polmonare e biopsia per il
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sospetto di infezione da specie Legionella.
Pagina 2 Aggiornata con aggiunta di loghi
Scopo Scopo aggiornato per includere metodi rapidi e collegamenti alle SMI pertinenti.
Introduzione
Riorganizzata per chiarezza. Tessuti specifici elencati in ordine alfabetico
Ottimizzate le Informazioni relative alle infezioni cutanee e presenti nella B11 - Ricerca con tamponi da infezioni cutanee e tessuti molli.
Informazione tecnica/limitazioni Inclusa la sezione con inclusi metodi rapidi
Considerazioni sulla sicurezza
Modificate le considerazioni di sicurezza relative al Gruppo dei microrganismi di Rischio 3.
Si raccomanda che tutti i coccobacilli Gram-negativi da sedi sterili siano processati in cabina microbiologica di sicurezza di Classe I o Classe II fino alla definitiva esclusione degli agenti patogeni del Gruppo di Rischio 3 (quali Brucella)
Procedura del campione I campioni per l'esame micologico non devono essere omogeneizzati/macinati
Procedura/processazione del campione
In teoria, tutto il processo di macinazione e di omogeneizzazione deve essere eseguito in cabina di Classe II con scarico protetto.
I campioni ottenuti chirurgicamente per la coltura fungina devono essere tagliati (in modo sottile) e non omogeneizzati.
Aggiunta la tecnica di colorazione fluorescente.
Aggiornata la Sezione 4.5.1 (terreni di coltura, condizioni e microrganismi) terreni e incubazione.
• Immunocompromessi/sospetta infezione fungina su Sabouraud a becco di clarino + cloramfenicolo (35-37ºC per14g di incubazione, modificato in incubazione 28-30ºC per 28g).
• Micetoma aggiunta di agar Sabouraud a becco di clarino + cloramfenicolo.
• Nocardiosi - semina in agar sangue 35-37ºC fino a 7g.
• Aggiunta semina di specie Legionella su BMPA o alternativa, a 35-37ºC fino a 10g.
• Infezione mista/procedure locali, aggiungere Agar Sale Mannite.
Sezione 4.6.1 (livello minimo di identificazione) livello di identificazione aggiornato per streptococchi β emolitici, stafilococchi coagulasi negativi,
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enterobatteriaceae e pseudomonas. Prendere in considerazione l'invio di stafilococchi isolati da campioni post mortem per il test della tossina.
Procedura di refertazione Aggiornata la modalità di refertazione della coltura.
Appendice Aggiornata in conformità alla sezione 4.5.1
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SMI del RU scopo e obiettivo
Utilizzatori delle SMI
Nel Regno unito le PMI Sono principalmente destinate venire Risorsa generale ai Professionisti Che
operano nel campo della medicina di laboratorio e delle Malattie infettive. Le SMI forniscono ai clinici
Informazioni in Merito allo standard di dei Servizi di laboratorio riferibili alle Ricerche per la diagnosi
delle infezioni nia Loro Pazienti e Le documentazioni forniscono predette Indicazioni Che facilitano la
prenotazione elettronica di prova appropriati. I Documenti forniscono Gli standard di per le Ricerche
microbiologiche Anche ai di Responsabili della Sanità Pubblica Che devono considerarle venire
parte delle procedura da Adottare per la salute SIA clinica Che pubblica per la propria popolazione..
Informazioni di base per le SMI
Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del
processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di
laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).Gli algoritmi delle
sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle indagini per
specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi differenziale
e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono metodologie
di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione della prova.
La standardizzazione delle procedure diagnostiche tramite l’applicazione delle SMI aiuta a garantire
uniformità nelle strategie di ricerca nei diversi laboratori nel RU ed è una condizione essenziale per
la sorveglianza della salute pubblica, ricerca e sviluppo di attività.
Coinvolgimento delle organizzazioni professionali
Lo sviluppo delle SMI è condotto in condizione paritaria da PHE, NHS,Royal College of
Patholoogists e organizzazioni professionali. L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere
trovato su sito:https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-
consistency-in-clinical-laboratories. L'inclusione del logo di un’organizzazione in una SMI implica il
sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I rappresentanti delle
organizzazioni professionali fanno parte del Comitato Direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano
le SMI. Le opinioni dei partecipanti non sono necessariamente quelle espresse da tutta
l'organizzazione che essi rappresentano. I rappresentanti agiscono da tramite con funzione di
collegamento bi-direzionale per informazione e dialogo. Le attività di rappresentanza sono ricercate
tramite un processo di consultazione. Le SMI sono sviluppate, revisionate e aggiornate tramite un
ampio processo di consultazione.
Assicurazione di qualità
La NHS Evidence ha accreditato la procedura usata dai SMI Working Groups per produrre le SMI.
L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida emesse dall’Ottobre 2009. La procedura per lo
sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008. Le SMI rappresentano una procedura standard
di buona qualità pratica alla quale si devono attenere per la propria attività tutti i laboratori clinici e di
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(Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica
riconosciute dal GMC (General Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia)
e la Virologia Medica.
sanità pubblica. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti dell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo. Le prestazioni della SMI dipendono da personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e che i risultati siano idonei allo scopo. I laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del controllo di qualità interno.
Coinvolgimento del paziente e della comunità Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato, la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero al nostro sito web.
Informazione della gestione dei dati sensibili La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza. Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza https://www.gov.uk/
https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/equality-and-diversity.
I Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti.
Dichiarazione legale Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, la PHE e ogni altra organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente, escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche evidenza e anche essere a conoscenza che la PHE e le organizzazioni partecipanti non si assumono alcuna responsabilità per tali modifiche. Per evitare ogni altro equivoco, poiché le SMI sono state sviluppate per l'applicazione all'interno del RU, Il rischio di qualsiasi applicazione al di fuori di questo territorio sarà a carico dell'utente.
Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel corso della revisione successiva. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell’ente accreditato NICE.
Le SMI sono assoggettate a diritti d’autore che dovrebbero essere riconosciti ove aproppriato
Citazione suggerita per questo documento Public Health England. (2016). Investigation of tissues and biopsies from deep-seated sites. UK Standards for Microbiology Investigations. B 17 Emissione 6.1.
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http://www.hpa.org.uk/SMI/pdfhttps://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories
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Scopo del Documento
Tipo di campione
Tessuto, biopsia.
Questa SMI descrive le procedure e la ricerca batteriologica di batteri e funghi in tessuti e biopsie da sedi profonde e organi.
Oltre ai metodi colturali, possono essere usati i metodi rapidi includenti il NAAT.
Per ulteriori informazioni riguardanti le indagini di infezioni causate da funghi, specie di Mycobacterium e parassiti fare riferimento a:
B 39 - Investigation of dermatological specimens for superficial mycoses
B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species
B 31 - Investigation of specimens other than blood for parasites
Non sono inclusi in questo documento i seguenti campioni:
Tessuti associati a infezione dell’impianto ortopedico (B 44 - Investigation of prosthetic joint infection samples).
Osso e tessuto molle associati a osteomielite (B 42 - Investigation of bone and soft tissue associated with osteomyelitis).
Biopsie gastriche (per presenza di Helicobacter pylori) (B 55 - Investigation of gastric biopsies for Helicobacter pylori).
Questa SMI deve essere usata con le altre SMI.
Introduzione
La biopsia è definita come una porzione di tessuto rimosso da un organismo vivente per accertamento successivo. Con il progressivo incremento della tecnologia delle immagini cliniche e degli strumenti per il campionamento, pochi sono gli organi del corpo umano che non possono essere sottoposti a biopsia. I tessuti ottenuti con un atto operatorio sono particolarmente preziosi in quanto le procedure di campionamento possono non essere ripetibili. In teoria questi materiali dovrebbero essere oggetto di discussione con il laboratorio prima del loro prelievo, al fine di assicurare che il trasporto e le procedure siano tempestive e le prove appropriate.
Le biopsie ed altri campioni tissutali sono ottenute principalmente con tre modalità:
con procedura chiusa, di solito attraverso la cute (vale a dire agobiopsia). I campioni da biopsia percutanea sono associati a problemi particolari; solitamente sono di dimensioni molto piccole, possono mancare la lesione infetta o possono contaminarsi con flora cutanea
come procedura aperta durante un intervento (ad esempio sbrigliamento o devitalizzazione o tessuto infetto). Il tessuto ottenuto in questo modo è di solito più soddisfacente, in modo particolare quando l’indirizzo chirurgico è quello di rimuovere tessuto infetto.
tessuti prelevati post mortem (tessuti da polmoni di pazienti con polmonite). Nella maggior parte dei casi lo scopo principale del campionamento è quello di ottenere tessuto per l’esame istologico. Le possibilità microbiologiche su questi campioni sono ridotte perché di solito sono contaminati da flora enterica. Si deve porre attenzione all’interpretazione clinica di questi risultati perché spesso non sono significativi.
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Le biopsie possono essere prelevate da tessuti cronicamente infetti e pertanto,oltre alla ricerca di infezione batterica, possono anche richiedere quella delle forme fungine, specie Mycobacterium o parassiti. L’esame istologico fornisce spesso indicazioni per intraprendere ricerche per particolari tipologie infettive. Ad esempio, la presenza di un granuloma caseoso dovrebbe far sospettare un’infezione tubercolare; aspetti simili possono essere prodotti talvolta da infezioni fungine profonde.
I tessuti e le biopsie non sono campioni facilmente ripetibili e pertanto la conservazione prolungata (1 mese) dei materiali residui può essere critica per consentire l’esecuzione di ulteriori indagini del caso, quali le culture dei micobatteri o l’invio a un laboratorio di riferimento per la 16S rDNA PCR.
Tessuti specifici1
Contenuti aneurisma aortico
I contenuti dell’aneurisma aortico possono essere inviati per l'esclusione di una causa di infezione2.
Materiali artificiali
Per le indagini possono essere inviati al laboratorio anche materiali artificiali. Questi comprendono protesi valvolari cardiache, pacemaker, innesti, articolazioni artificiali e impianti di tessuto.
Biopsie cerebrali
Le biopsie cerebrali possono talvolta essere prelevate per differenziare le condizioni non infettive dalle infezioni.
Cornee
Le cornee dovrebbero essere esaminate nei casi in cui si sospetta infezione oculare radicata profondamente. Fare riferimento a: SMI B 2 - Investigation of bacterial eye infections.
Donatore di valvole cardiache o cerchi corneali
Il donatore di valvole cardiache o di cerchi corneali deve essere sottoposto a screening per l'infezione batterica prima dell'impianto.
Valvole cardiache
Le valvole cardiache provengono da pazienti con endocardite infettiva sottoposti a sostituzione valvolare o prelevate post mortem. Le valvole protesiche infette possono essere inviate per l’esame colturale. Ove possibile i risultati di questi esami colturali devono essere correlati alle emocolture o agli esami sierologici.
Negli anni recenti, la PCR è stata utile nella diagnosi di endocardite infettiva, rilevando nei campioni di valvole cardiache Coxiella burnetii3,4. La PCR Duplex è stato utilizzata con successo per differenziare Coxiella burnetii e altre cause di endocardite infettiva5.
Biopsie polmonari (percutanee, broncoscopiche, chirurgiche o post mortem)6
Le biopsie polmonari sono classificate per la tipologia di ingresso o per il motivo della biopsia. Possono essere utili per le infezioni causate da batteri, comprese le specie Actinomyces, specie
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Nocardia, specie Legionella, specie Mycobacterium e funghi, in particolare per le specie Aspergillus e Pneumocystis jirovecii. La polmonite da Pneumocystis (PCP) si manifesta quasi esclusivamente nei pazienti immunocompromessi. La PCP può essere diagnosticata in modo meno invasivo (di solito con sensibilità ridotta) mediante espettorazione indotta o su campioni di lavaggio broncoalveolare. Fare riferimento a B 57 - Investigation of brochoalveolar lavage, sputum and associated specimens.
Linfonodi
I linfonodi asportati sono sottoposti a indagini per linfoadenite, in modo particolare se sospetta
linfoadenite da micobatteri. La causa più frequente nei bambini di età inferiore a 15 anni è
sostenuta da micobatteri diversi da Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium non tubercolari
(NTM)), in particolar modo Mycobacterium avium intracellulare. Tuttavia, anche il Mycobacterium
tuberculosis può anche essere isolato da questi soggetti e da quelli con età superiore7. Altre cause
importanti di linfoadenite sono sostenute dalla toxoplasmosi; dalla malattia da graffio di gatto,
dovuta a Bartonella henselae, microrganismo Gram negativo endemico tra i gatti domestici; e dal
linfogranuloma venereo - infezione sessualmente trasmessa da clamidia8. Tutte queste condizioni
sono forse meglio diagnosticate dalla combinazione di indagini istologiche e sierologiche,
associate a test diagnostici molecolari, se disponibili (ad es. NAAT per genoma di Toxoplasma,
disponibile presso il Laboratorio di Riferimento per Toxoplasma
https://www.gov.uk/government/collections/toxoplasma-reference-laboratorio-trl).
Campioni placentari e prodotti del concepimento
I prodotti del concepimento e i campioni placentari sono inviati per l'accertamento di aborto settico
e listeriosi. La Listeria monocytogenes può causare gravi infezioni nelle donne in gravidanza, nei
neonati e nei pazienti immunocompromessi9,10. Nelle donne in gravidanza la setticemia causata da
L. monocytogenes si presenta come una malattia febbrile acuta che può nuocere al feto10. Questa
condizione può determinare infezioni sistemiche (granulomatosi infantisepticum), nascita di feti
morti e meningite neonatale. Devono essere esaminati per questo microrganismo i prodotti del
concepimento, placenta e tamponi dello screening neonatale. La coltura di routine dei tamponi
vaginali per L. monocytogenes non è di solito eseguita anche se può essere utile nei casi sospetti.
Sono indicate le emocolture. Le indagini sierologiche non sono utili nella diagnosi di listeriosi
(consultare B 28 - Investigation of genital tract and associated specimens)9.
L’aborto settico può provocare gravi morbilità materna e può essere a esito infausto10. La
perforazione uterina, la presenza di detriti necrotici, e la ritenzione di prodotti placentari possono
indurre infezioni. La maggior parte delle infezioni sono polimicrobiche e coinvolgono gli anaerobi.
La sepsi da Clostridium può complicare l'aborto ed essere potenzialmente letale. In alcune donne
le specie Clostridium appartengono alla flora vaginale normale.
Biopsie cutanee
Le biopsie cutanee possono essere inviate per la ricerca di batteri e funghi cutanei e per infezioni
dei tessuti molli, e di parassiti tissutali quali Onchocerca volvulus, Mansonella streptocerca e
specie Leishmania (B 31 - Investigation of specimens other than blood for parasites. Sono anche
utilizzate per confermare i casi di granuloma da piscina o da acquario, infezione cutanea cronica
causata dal Mycobacterium marinum, che è associata a ferita e al contatto con l'acqua per i
nuotatori e addetti alla manutenzione di pesci tropicali11 (B 40 - Investigation of specimens for
Mycobacterium species).
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La fascite necrotizzante è limitata dalla fascia profonda. L'infezione si diffonde ampiamente e rapidamente per l'assenza di barriere interne nella fascia. L'infezione può essere fatale in un tempo molto breve. Alcuni casi si verificano nel post-operatorio o in pazienti con patologie soggiacenti, come tumori maligni. Alcuni autori ritengono che possa essere di due tipi distinti. Il tipo I è dovuta a un’infezione di tipo polimicrobico di organismi aerobici ed anaerobi (streptococchi del gruppo A, anaerobi, S. aureus e componenti delle Enterobacteriaceae). Il tipo II (cancrena emolitica streptococcica) è dovuta a infezione da streptococci di gruppo A12.
Informazione Tecnica/Limitazioni
Limitazioni delle SMI del RU
Le raccomandazioni formulate nelle SMI del RU sono basate su prove (ad esempio sensibilità e specificità), se disponibili, opinioni degli esperti e pragmatismo, tenendo in considerazione anche dlle risorse disponibili. I laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali, se appropriato. Prima del loro uso, i laboratori devono assicurare che tutti i saggi commerciali e in-house sono stati validati e sono idonei allo scopo
Terreni selettivi nelle procedure di screening
I terreni selettivi non sono in grado di sviluppare la crescita di tutti i ceppi dei microrganismi circolanti che possono essere ricercati sulla base degli elementi a disposizione. Deve essere pertanto ricercato un equilibrio tra le evidenze disponibili e la disponibilità delle risorse richieste se si utilizza più di una piastra di terreno.
Contenitori per campioni13,14
Le SMI usano Il termine '' contenitore a chiusura ermetica con marchiatura CE ” per descrivere quelli contrassegnati con la marchiatura CE per la raccolta e il trasporto dei campioni clinici. I requisiti per i contenitori dei campioni sono riportati nella Direttiva EU per i Dispositivi Sanitari Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) in cui si stabilisce:'' La progettazione deve consentire un'agevole manipolazione e, se necessario, ridurre per quanto possibile la contaminazione dei, e perdite dal dispositivo durante l'uso e, nel caso di recipienti per campioni, il rischio di contaminazione degli stessi. Le procedure di fabbricazione devono essere adatte a questi scopi''.
Metodi rapidi
Per migliorare la sensibilità e ridurre i tempi di risposta, le prove d’identificazione e di sensibilità rapide possono essere eseguite contemporaneamente ai metodi di routine, se appropriato. Sono stati valutati numerosi metodi d’identificazione e di sensibilità rapidi; questi includono tecniche molecolari e il matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flight (MALDI-TOF)15-17. E’ importante garantire la disponibilità di colture recenti di isolati singoli puri da saggiare per evitare di refertare risultati fuorvianti.
I laboratori devono seguire le istruzioni del produttore e tutti i test rapidi devono essere validati prima dell'uso ed aver dimostrato di essere idonei allo scopo.
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1 Considerazioni sulla Sicurezza13,14,18-32
1.1 Prelievo, Trasporto, Conservazione del Campione 13,14,18-21
Usare tecnica asettica.
Raccogliere in appropriati contenitori con marchiatura CE a tenuta ermetica i campioni e trasportarli in sacchetti di plastica sigillati.
E’ essenziale la conformità alle normative postali e dei trasporti.
1.2 Procedura sul Campione13,14,18-32
Livello di Contenimento 2.
Se si sospettano microrganismi di Gruppo di Rischio 3, quali, M. tuberculosis, Brucella abortus, Histoplasma capsulatum, specie Coccidioides, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Penicillium marneffei, specie Cladophialophora, specie Fonsecea e Ramichlordium mackenziei, tutti i campioni devono essere processati in cabina microbiologica di sicurezza in complete condizioni di completo Contenimento di Livello 3.
Si raccomanda che tutti i coccobacilli Gram-negativi da sedi sterili siano processati in cabina microbiologica di sicurezza di Classe I o Classe II fino a quando sono stati definitivamente esclusi agenti patogeni appartenenti al Gruppo di Rischio 3 (quale Brucella)33.
Le procedure di laboratorio che si ritiene possano generare aerosol dovrebbero essere eseguite in cabina di sicurezza24.
La macinazione e l’omogeneizzazione di tutti i campioni devono essere eseguite in cabina microbiologica di sicurezza. Ove possibile, l'uso di forbici sterili è raccomandato preferendole ai bisturi.
Nota: I campioni per esami micologici non devono essere omogeneizzati/macinati
I contenitori dei campioni devono essere collocati su appropriati supporti.
Fare riferimento alle attuali linee guida per la manipolazione sicura di tutti i microrganismi documentati in questa SMI.
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio.
2 Prelievo Campione
2.1 Tipo di campione
Tessuto, biopsia
2.2 Tempo ottimale e metodo di prelievo1 Per considerazioni sulla di sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1.
Prelevare i campioni prima della terapia antimicrobica se possible1.
Di norma un medico, preleverà il campione.
Prelevare i campioni in contenitori impermeabili con marchiatura CE inseriti in sacchetti di plastica sigillati.
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Generalità
Se il campione è di piccole dimensioni, immergerlo in acqua sterile per evitare l'essiccamento. Nota: I campioni ricevuti in formalina-salina non sono adatti per la cultura.
Nota: Assicurarsi che la conservazione e l'eliminazione dei tessuti sia conforme con lo Human Tissue Act 2004.
Sospetto di specie Legionella (tessuto polmonare e biopsia)
Se il campione è di piccole dimensioni, immergerlo in acqua sterile per prevenire l'essiccamento.
Nota: ciò non sarebbe appropriato per campioni sottoposti a trattamento per la diagnosi con metodi molecolari.
Nota: Evitare l'uso di soluzione fisiologica, nota per essere un inibitore delle specie Legionella
2.3 Quantità adeguata e numero appropriato di campioni1
In teoria, i campioni, devono essere di dimensioni sufficienti per eseguire l’esame microscopico e colturale.
La dimensione minima del campione è condizionata dal numero di accertamenti richiesti
Numero e frequenza dei campioni dipendono dalle condizioni cliniche del paziente
3 Trasporto e Conservazione del Campione13,14
3.1 Condizioni ottimali di Trasporto e Conservazione
Per considerazioni sulla di sicurezza,fare riferimento alla Sezione 1.1.
I campioni devono essere trasportati e processati il più presto possibile1.
Se la procedura è ritardata è preferibile la conservazione a temperatura ambiente1.
Il volume del campione influenza l’accettabilità del tempo di trasporto. Volumi consistenti di materiale purulento mantengono più a lungo la vitalità degli anaerobi34
I tessuti e le biopsie non sono campioni facilmente ripetibili e pertanto la conservazione prolungata (1 mese) di campioni residui possono essere fondamentali per consentire la disponibilità di qualsiasi successiva appropriata indagine, quale le colture dei micobatteri o l’invio per una 16S rDNA PCR.
4 Procedura sul campione13,14
4.1 Selezione della prova Selezionare una quota rappresentativa del campione per le appropriate procedure, quali coltura per funghi, (B 39 - Investigation of dermatological specimens for superficial mycoses) e specie Mycobacterium (B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species), e ricerca di parassiti (B 31 - Investigation of specimens other than blood for parasites) in funzione delle notizie cliniche.
Se il campione è insufficiente per tutte le indagini, queste devono essere selezionate in accordo con le indicazioni cliniche dopo consultazione con un medico microbiologo.
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4.2 Aspetto
N/D
4.3 Preparazione del campione
Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.2
4.3.1 Pre-trattamento
Standard
Macinare o omogeneizzare il campione come appropriato, usando un macina per tessuto sterile (perline Ballotini), un bisturi sterile o (preferibilmente) forbici sterili e piastra di Petri. L'aggiunta di una piccola quantità (circa 0,5 ml) di acqua sterile, filtrata, fisiologica, peptone o brodo aiuterà il processo di omogeneizzazione.
In teoria,tutte le procedure di macinazione o omogeneizzazione dovrebbero essere eseguite in cabine di Classe II con scarico protetto.
Nota: i campioni ottenuta per via chirurgica per la coltura fungina dovrebbero essere tagliati (in modo sottile) e non omogeneizzati35.
4.3.2 Prove supplementari
N/D
4.4 Microscopia
4.4.1 Standard
N/D
4.4.2 Prove Supplementari
Colorazione Gram
Campioni omogeneizzati
(Per i metodi di omogeneizzazione consultare la Sezione 4.3.1).
Porre una goccia di campione su un vetrino da microscopio pulito utilizzando una pipetta sterile.
Diffonderlo con un’ansa sterile per formare uno striscio sottile per la colorazione Gram.
Campioni non omogeneizzati
Preparare un campione per impressione – utilizzare pinze sterili per afferrare il frammento di campione, appoggiare il lato di uno o più frammenti del campione su un vetrino da microscopio pulito per colorazione Gram. Raggruppare i preparati ottenuti per impressione al fine di facilitarne l’osservazione. Questa campione non può essere utilizzato per l’esame colturale.
Consultare TP 39 - Staining procedures.
Tecnica di colorazione fluorescente
Seguire le istruzioni del produttore
Legionella
Per sospetta presenza di specie Legionella (tessuto polmonare e biopsie) omogeneizzare il campione come indicato nella sezione 4.3.1
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Usando una pipetta sterile deporre una goccia di campione omogeneizzato su un vetrino pulito da microscopio PTFE (politetrafluoroetilene).
Diffondere la goccia con un'ansa sterile per fare uno striscio sottile per la colorazione fluorescente.
Sospette infezioni fungine
Per le infezioni fungine sospette tagliare finemente i campioni come indicato nella sezione 4.3.1.
Inserire una piccola porzione di tessuto in una provetta sterile Eppendorf con alcune gocce di KOH 20%, posto per ammorbidire in un blocco termico per 20 min.
Usando una pipetta sterile trasferire il tessuto ammorbidito su un vetrino, aggiungere una goccia di calcofluor/blankophor e osservare al microscopio a fluorescenza.
Notare il tipo delle strutture visualizzate in correlazione con i successivi risultati della coltura, cioè pseudoife, vere ife, forme di lievito, altri elementi fungini
Per maggiori informazioni consultare TP 39 - Staining procedures e B 39 - Investigation of dermatological specimens for superficial mycoses.
4.5 Coltura e ricerca
Campioni omogeneizzati
Seminare ciascuna piastra e il brodo di arricchimento con campioni omogeneizzati o macinati (consultare Q 5 – Inoculation of Culture Media for Bacteriology
Per ottenere colonie isolate diffondere l’inoculo utilizzando un’ansa sterile.
Campioni non omogeneizzati
Inoculare ciascuna piastra di agar con un frammento di tessuto (consultare Q 5 – Inoculation of culture media for bacteriology).
Per ottenere colonie isolate diffondere l’inoculo utilizzando un’ansa sterile.
4.5.1Terreni di coltura, condizioni e microrganismi: Aspetti clinici/ /
condizioni
Campione Terreni standard
Incubazione Lettura colture
Microrgani- smo(i) bersaglio Temp.
°C Atmos. Time
Tutte le condizioni cliniche
Tessuto
Biopsia
Agar sangue 35-37 5-10% CO2
40-48 ore
giornal. Qualsiasi microrganismo
CLED/
Agar MacConkey
35-37 Air 18-24 ore
18 ore
Agar selettivo per anaerobi
35-37 Anaerobia 5g 40 ore e a 5g Anaerobi
Anaerobi esigenti, brodo carne cotta o equivalente.
Subcolture se evidenza di crescita (≥40ore), o a 5g
35-37
35-37
Aria
Come sopra
Fino a 5g
Come sopra
N/D
Come sopra
Qualsiasi microrganismo
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Come terreni precedenti escludendo agar MacConkey
Per queste situazioni aggiungere quanto segue.:
Aspetti clinici/
condizioni
Campione Terreni supplementari
Incubazione Lettura colture
Microrgani- smo(i) bersaglio
Temp. °C
Atmos. Time
Se microscopia è indicativa di infezione mista
Tessuto
Biopsia
Agar selettivo per anaerobi con disco da 5μg di metronidazolo
35-37 Anaerobia 5g 40ore e a 5g
Anaerobi
Actinomicosi
Tessuto
Biopsia
Agar sangue arricchito con metronidazolo e acido nalidixico
35-37 Anaerobia 10g 40ore, a 7g e 10g
Specie Actinomyces
Immunocompromessi, o sospetta infezione fungina
Tessuto
Biopsia
Agar Sabouraud a becco di clarino+ cloramfenicolo
35-37
e
28-30
Aria 14g
28g
giornal# Funghi
Muffe
Micetoma Tessuto
Biopsia
Lowenstein-Jensen a becco di clarino/ Agar sangue
o
Agar Sabouraud a becco di clarino+ cloramfenicolo
35-37
28-30
Aria
Aria
Fino a
28g
Ogni 3- 4 giorni
Specie Actinomycetes aerobie
Lieviti
Muffe
Nocardiosi Tessuto
Biopsia (lavaggio bronco-alveolare)
Agar sangue 35-37 5-10% CO2
16 - 48 ore
giornal. Specie Nocardia
Sospetta Legionellosi
Tessuto
Biopsia
BMPA o BCYEA o agar Legionella alternativo
35-37 Atmosfera umida
Fino a 10g
3g, 7g e 10g
Specie Legionella
Terreni opzionali:
Quando l’aspetto clinico o la microscopia suggeriscono infezione mista
o
in funzione delle disposizioni locali
Tessuto
Biopsia
Agar selettivo Stafilococchi/ Streptococchi
o
Agar Sale Mannite
35-37 Aria 40-48ore
giornal. S. aureus
Streptococchi
Altri microrganismi da considerare – Funghi (B 39 - Investigation of dermatological specimens for superficial mycoses), H. pylori (B 55 - Investigation of gastric biopsies for Helicobacter pylori), specie Listeria, specie Mycobacterium (B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species) e parassiti (B 31 - Investigation of specimens other than blood for parasites).
#Agenti di micosi esotiche importate quali Histoplasma capsulatum e alcuni isolati di Cryptococcus per crescere
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possono richiedere fino 8 settimane; sarà pertanto richiesta un’incubazione con adeguata umidificazione36,37
.
* Va notato che l'incubazione in 2-5% CO2 può migliorare la crescita di alcune specie di Legionella come L. sainthelensi e L. oakridgensis
38. Questa ridotta concentrazione di CO2 non influenzerà la crescita di L. pneumophila,
ma livelli superiori al 5% possono inibire la crescita.
** Se laboratori scelgono di utilizzare piastre di agar selettivo per Legionella come agar BCYE come terreno supplementare per l'isolamento di specie Nocardia, il suo utilizzo deve essere soggetto ai risultati di validazione locale. Il documento, ID10: Identification of aerobic actinomycetes raccomanda che, se si utilizzano piastre di agar selettivo, queste devono essere incubate per 2 o 3 settimane.
4.6 Identificazione
Per l’identificazione dei microrganismi fare riferimento alle singole SMI.
4.6.1 Livello minimo di identificazione in laboratorio
Actinomycetes Livello genere
ID 10 – Identification of aerobic Actinomycetes species
ID 15 – Identification of anaerobic Actinomycetes species
Anaerobes Livello "anaerobi"
ID 8 - Identification of Clostridium species
β-haemolytic streptococci Livello specie
Coagulase-negative staphylococci Livello “coagulasi-negativi"
Enterobacteriaceae Livello specie
Pseudomonads Livello specie
S. aureus Livello specie
(considerare la leucocidina Panton-Valentine (PVL) e il test della tossina, se compatibile con i sintomi clinici)
(considerare la ricerca di tossine su campioni da autopsie)
S.anginosus group Livello gruppo S. anginosus
Funghi Livello specie
Lieviti Livello specie
Legionella species Livello specie
Mycobacterium species Livello specie
B 40 - Investigation of specimens for Mycobacterium species
Parasites Livello specie
B 31 - Investigation of specimens other than blood for parasites
I microrganismi possono essere successivamente identificati in modo più approfondito se indicato clinicamente o epidemiologicamente.
4.7 Prova di sensibilità agli antimicrobici
Fare riferimento alle linee guida della British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) e/o EUCAST.
Per isolati di candida sono disponibili i breakpoint della CLSI
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4.8 Invio per ricerche su focolaio epidemico
Fare riferimento alle linee guida della British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC)
4.9 Invio ai laboratori di riferimento
Per informazioni sulle prove disponibili, tempi di risposta, procedure per il trasporto e altre richieste del laboratorio di riferimento, click here for user manuals and request forms.
I microrganismi con resistenze insolite o inattese, o qualora sussista un problema clinico o di laboratorio, o anomalie che richiedano approfondimenti devono essere inviati agli appropriati laboratori di riferimento
Considerare l'invio degli S. aureus isolati per il test della tossina per i quali sono disponibili appropriati dettagli clinici. Ad esempio, gli isolati da campioni autoptici devono essere inviati per il test della tossina quando il campione è sospettato di essere l’agente causale della morte.
Contattare gli appropriati laboratori nazionali specializzati per informazioni sulle prove disponibili tempi di risposta, procedure di trasporto e altre richieste per l’invio del campione.
Inghilterra e Galles
https://www.gov.uk/specialist-and-reference-microbiology-laboratory-tests-and-services
Scozia
http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx
Irlanda del Nord
http://www.publichealth.hscni.net/directorate-public-health/health-protection
5 Procedura di Refertazione
5.1 Microscopia Colorazione Gram
Segnalare i leucociti ed i microrganismi osservati
Legionella immunofluorescenza
Legionella pneumophila rilevata con immunofluorescenza o
Legionella pneumophila non rilevata con immunofluorescenza
Colorazione fluorescente per funghi
Refertare la tipologia dell’elemento fungino osservato.
5.1.1 Tempo di refertazione Microscopia
Tutti i risultati dovrebbero essere rilasciati al clinico richiedente appena disponibili, a meno che siano state concordate soluzioni specifiche con i richiedenti.
Risultati urgenti possono essere trasmessi per telefono o inviati per via elettronica secondo le disposizioni locali.
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5.2 Coltura
I seguenti risultati dovrebbero essere refertati nel modo seguente
isolati microrganismi clinicamente significativi
altre crescite, con appropriati commenti, ad esempio, nessuna crescita significativa
assenza di crescita
Refertare anche i risultati delle prove supplementari
5.2.1 Tempo per referto coltura
Risultati intermedi o preliminari dovrebbero essere rilasciati dopo il rilievo di isolati clinici
potenzialmente significativi, non appena viene riconosciuta la loro crescita, tranne nel caso che
siano state concordate soluzioni alternative specifiche con i richiedenti.
I risultati urgenti dovrebbero essere comunicati per telefono o trasmessi elettronicamente in
conformità con le disposizioni locali.
Il referto finale scritto o generato dal computer dovrebbe seguire le comunicazioni preliminari e
verbali nel più breve tempo possibile.
Legionella
Il referto finale scritto o generato dal computer dovrebbe seguire le comunicazioni preliminari/
verbali entro 3 - 10 giorni, segnalando, se del caso, che verrà inviato un referto successivo.
5.3 Sensibilità agli antimicrobici
Refertare le sensibilità come clinicamente suggerito. Usare in modo prudente gli antibiotici
secondo i protocolli locali e nazionali raccomandati
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6 Notifica al PHE39,40 o Equivalente41,44
Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla
Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella
Scheda 2 della Direttiva. Le denunce devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica,
entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si
raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro
sette giorni.
Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE.
Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è
ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad
agenti causali soggetti a tale disposizione.
La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non
sostituisce l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala
spontaneamente alla PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti
eziologici e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni
urgenti di alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare.
Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione
per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare
Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt–Jakob disease CJD da includere nel ‘Notification
Duties of Registered Medical Practitioners’, e non al ‘Notification Duties of Diagnostic
Laboratories’.
https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/our-governance#health-protection-regulations-2010
In Scotland41,42, Wales43 e Northern Ireland44 sono vigenti altre disposizioni.
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Appendice: Ricerca su tessuti e biopsie da sedi profonde e organi
Campione macinato od omogeneizzato
(tranne se sospettata infezione fungina)
Terreni standard Terreni
Supplementari
Terreni Opzionali
Sedi sporche o
quando
microscopia
suggerisce
infezione mista, o
in funzione delle
procedure locali
Agar selettivo
Staph/Strep
O
ASM
Incubare a 35-
37°C
Aria
40-48 ore
Lettura
gionaliera
Se microscopia
indicativa per
infezione mista
Actinomicosi
Immunocomprom
essi o suspettata
infezione fungina
Mycetoma
Incubare a 35-
37°C
Anaerobica
5 g
Lettura a ≥ 40ore
e a 5 g
Incubare a 35-
37°C
Anaerobica
10 g
Lettura a ≥ 40ore
e
a 7 g e 10 g
Agar Sabouraud
becco di clarino +
cloramfenicolo
Incubare a 35-
37°C
Aria
14 g
Lettura
giornaliera
o 28-30°C
Fino a 28 g
LJ becco clarino/
Agar sangue
o
Agar Sabouraud
becco di clarino +
cloramfenicolo
Incubare a 28-
30°C
Aria
Fino a 28 g
Lettura ogni 3-4 g
Incubare a
35-37°C
Aria
5 g
Subcoltura in
Agar sangue
Agar selectivo
anaerobi
CLED
Se presente
crescita
(≥40ore) o 5 g
Anaerobi
ID 8, 14, 25
Actinomyces
sp
Rifer a ID 15
Actinomyceti
Anaerobi
S. aureus
ID 7
Streptococchi
ID 4
Agar sangue Agar Selettivo
per anaerobi
Agar CLED/
MacConkey
Anaerobi
esigenti, brodo
carne cotta o
equivalente
Incubare a
35-37°C
5-10% CO2
40-48 ore
Lettura
giornaliera
Incubare a
35-37°C
Anaerobiosi
5 g
Lett. a ≥ 40ore
e a 5 g
Incubare a
35-37°C
Aria
18-24 ore
Lettura a ≥ 18
ore
Funghi
Muffe
Suspected
Legionellosis
BPMA/CYE/
BCYEA/
Agar selettivo
Legionella
Incubare a 35-
37°C
Atmos Umida
10 g
Lettura a 3 g, 7 g
e 10 g
Legionella sp
ID 18
Nocardiosis
Agar sangue
Incubare a 35-
37°C
5-10% CO2
16-48 ore
Lettura giornal.
Nocardia sp
Rifer a ID 10
Tutti i campioni
Anaerobi
ID 8, 14, 25
Ogni organismo
Referimento
alle ID
Ogni organismo
Referimento
alle ID
Agar selettivo
per anaerobi
con disco 5μg
metronidazole
Agar sangue
supplementato con
metronizadolo e
acido nalidixico
Incubare come
’i terreni’
da semina diretta
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