Reporte final del proyecto: Transformación genética de S. violaceusniger YCED-9

Registro asignado por la CGPI: 20050953 I. RESUMEN Los actinomicetos son bacterias filamentosas Gram-positivas, los cuales conforman el grupo microbiano más abundante en suelos y compostas. Dentro de los actinomicetos, el género Streptomyces es conocido como el productor más importante de metabolitos secundarios, algunos de los cuales tienen una aplicación comercial en la industria farmacéutica y agrícola. Streptomyces violaceusniger YCED-9 es un potente antagonista de amplio espectro contra hongos que pudren raíces. La cepa YCED-9 controla enfermedades de la planta y de las raíces causadas por Pythium spp y otros hongos patógenos. Los mecanismos de antagonismo en S. violaceusniger

cepa YCED-9 son diversos, involucran el control de crecimiento y diferenciación de células fúngicas, producción de tres diferentes poliquétidos antifúgicos y por lo menos dos diversos sistemas enzimáticos fuertemente líticos de la pared celular de hongos. Bajo condiciones de fermentación sumergida y sólida, en suelo y otros substratos naturales, YCED-9 produce tres compuestos antifúngicos, guanidilfungina A, geldanamicina y nigericina. Para probar el papel de la secreción de la enzima y otras características implicadas en el biocontrol de la cepa YCED-9, se generó un sistema genético para dicha cepa. En el actual estudio, se reportan varias contribuciones específicas para el establecimiento del sistema genético de la cepa YCED-9. Primero, se realizaron algunas modificaciones a una técnica previamente publicada para la generación de protoplastos competentes de Streptomyces coelicolor o S. lividans. Para el mejoramiento del protocolo en la generación de protoplastos de S. violaceusniger cepa YCED-9, se modificaron las condiciones de incubación, la concentración de lisozima para obtener una lisis eficiente, también el sistema de filtración fue adecuado para este sistema. Se observo que el proceso de filtración constituye un paso crítico en la obtención de protoplastos. Los mejores resultados se obtuvieron con un embudo de plástico de tallo corto y filtros de algodón compacto estéril. Una vez que se obtuvieron los protoplastos, se iniciaron los ensayos de transformación de YCED-9 Los plásmidos pIJ2345 y pIJ2346, contienen genes de resistencia a ampicilina, tetraciclina y cloranfenicol, por lo que fueron utilizados como marcadores de selección para seguir con el proceso

de transformación ya que la cepa YCED-9, es naturalmente resistente al antibiótico thiostrepton, y los plásmidos pIJ702 y pIJ922 no fueron utilizados para este proceso, porque contienen genes de resistencia a thiostrepton. La eficiencia de transformación obtenida fue de 60-70 transformantes/μg de DNA con S.

violaceusniger YCED-9. II. INTRODUCCIÓN Los biofungicidas recientemente desarrollados se han obtenido a partir de miembros del grupo de los actinomicetos. Estos microorganismos son muy abundantes en suelos en general y en suelos agrícolas en particular, además de ser los principales responsables de la mayor parte de la degradación de lignocelulosa. Los actinomicetos son bacterias filamentosas que constituyen el grupo microbiano más abundante en suelos y compostas (Alexander, 1997; Nola y Cross, 1988). Este grupo comprende además a los microorganismos más importantes desde el punto de vista industrial tanto químico como farmacológico (Crawford, 1988). Los actinomicetos han sido descritos como la fuente más grande de antibióticos y constituyen el origen de más de 4000 antibióticos naturales (dos terceras partes del total conocido) (Okami y Hotta, 1988). En la última década, algunas de las publicaciones sobre el control biológico de hongos fitopatógenos, se refieren a las experiencias que existen con cepas del género Streptomyces. La cepa YCED-9 pertenece a la especie Streptomyces violaceusniger y tiene una capacidad muy elevada de degradación de substratos lignocelulósicos derivados de la lignificación de tallos y raíces de pastos, lo cual incrementa su potencial para establecerse en cultivos de diferentes tipos de gramíneas (Chamberlain, 1997).

Streptomyces violaceusniger YCED-9 tiene un claro potencial de antagonismo in vitro contra hongos patógenos de pastos. Sin embargo, en experimentos in vivo, a nivel de laboratorio e invernadero, tuvo un efecto de control biológico parcial de la patogénesis causada por Rhizoctonia solani y por Sclerotinia homeocarpa. Fusarium nivale y Phythium ultimum no fueron susceptibles al control biológico por la cepa YCED-9 (Trejo Estrada et al., 1998 bis). Experimentos posteriores utilizando pasto, demostraron que bajo ciertas condiciones YCED-9 puede controlar la pudrición de raíz causada por cepas patogénicas del género Pythium spp. (Campos-Reyes, 2002) El antagonismo que la cepa YCED-9 mostró en suelos, se consiguió con niveles de inoculación de

hasta 1 X 105 esporas (UFC) por gramo de suelo. Paralelamente se pudo comprobar que tanto el suelo como la paja de pasto humectados a presión, en autoclave, constituyen sustratos adecuados para la proliferación de YCED-9, y para la producción de antibióticos (Trejo Estrada et al., 1998 bis; Reyes-Carrera, 2002; Trejo-Estrada y Crawford datos no publicados). La producción de antibióticos en Streptomyces, está relacionada con el proceso de diferenciación bioquímica y morfológica del microorganismo (Stone y Williams, 1992).

El desarrollo de un sistema de clonación de DNA para Streptomyces, podría facilitar en gran medida el análisis genético detallado de las rutas metabólicas asociadas a la producción de antibióticos, la identificación de genes de resistencia, así como el desarrollo de estudios sobre regulación de la diferenciación y la expresión de antibióticos (Bibb, et al., 1980). Se han descrito varias estrategias para incrementar la producción de antibióticos por parte de cepas industriales de Streptomyces spp. Una de estas estrategias es la que Piepersberg (1994), describe como "el mejoramiento de los flujos biosintéticos utilizando una vía existente". Esta estrategia consiste en la generación de mutantes derivadas de manipulación genética clásica o molecular, que permitan mejorar la producción de un metabolito que ya se produce en esa cepa. La generación de un sistema genético a partir de Streptomyces violaceusniger YCED-9, es decir, la capacidad de introducir DNA por transformación, puede permitir que la cepa se transforme con genes de enzimas hidrolíticas o con genes de antibióticos de otro tipo, o que se genere mutagénesis dirigida para interrumpir genes de producción de las propias enzimas o de los genes involucrados en la biosíntesis de antibióticos antifúngicos. Los cambios genéticos dirigidos de ese tipo pueden tener efectos en la capacidad de YCED-9 para controlar la patogénesis por hongos causales de la pudrición de raíz, su competencia en la colonización de rizósferas y suelos, y su potencial global como agente de control biológico. El presente estudio reporta la generación de protoplastos, la definición de marcadores de resistencia útiles para la selección de transformantes a partir de YCED-9, y la transformación exitosa de la cepa. III. ANTECEDENTES Características generales de los actinomicetos. Los actinomicetos son un grupo de bacterias filamentosas Gram positivas, que forman una estructura de filamentos ramificados denominada micelio. La composición de bases del DNA de todos los miembros de dicho grupo, tiene un alto contenido en Guanina + Citosina. Son los microorganismos más abundantes en suelos y compostas (Alexander, 1997; Nolan y Cross, 1988). La mayoría de los actinomicetos son aerobios (actinomicetos oxidativos), la cual es muy numerosa y se encuentra básicamente en suelos habitables, el olor característico a tierra húmeda se debe a su actividad metabólica y a la producción de pigmentos, terpenoides (geosminas) y enzimas extracelulares que son capaces de degradar materia orgánica de origen vegetal y animal. Algunas otras especies son patógenos de humanos, animales o plantas o son fijadores de nitrógeno (Holt et

al., 1994). Dentro de este grupo de los actinomicetos existen los que son anaerobios facultativos u obligados (actinomicetos fermentativos) que por lo general se encuentra en cavidades naturales de animales y del hombre (Holt et al., 1994; Lechevalier M. P. y Lechevalier H., 1970) El grupo de actinomicetos comprende además a los microorganismos más importantes desde el punto de vista industrial, que son los estreptomicetos, cuyo género principal es Streptomyces spp. Los estreptomicetos se encuentran en toda la naturaleza, su capacidad de colonizar el suelo es facilitada por el crecimiento de una masa de hifas vegetativas que puede diferenciarse como esporas que se expanden y persisten en el medio ambiente. Las esporas están en un estado latente en su ciclo de vida y pueden sobrevivir en suelos por largos períodos. Un número relativamente alto de estreptomicetos puede permanecer viable en el suelo como esporas inactivas durante mucho tiempo Los estreptomicetos producen muchas enzimas extracelulares en suelo, lo cual puede deberse a la descomposición de mezclas de complejos de polímeros en plantas muertas, por material de hongos y animales (Mortimer et al., 1981). Estos estreptomicetos son importantes en la degradación del suelo por el reciclado de nutrientes asociados con polímeros recalcitrantes. La adición de quitina a un suelo ácido conduce a la actividad quitinolítica de estreptomicetos acidofílicos (Hirsch y McCann- McCormick 1985). Recientes evaluaciones de estreptomicetos como antagonistas potenciales de patógenos de plantas se han enfocado en conocer su capacidad de producción de metabolitos antifúngicos naturales. Como por ejemplo, S. rochei y S. rimosus que tanto en condiciones in vitro, como a partir de la rizósfera de garbanzo demostraron ser altamente antagónicos de Fusarium oxisporum (Basar y Rai, 1994). Por otra parte, una cepa de S. hygroscopicus creció en suelo estéril antagonizando a Rhizoctonia solani, lo cual se repitió en rizósferas de garbanzo, potencial que se asoció con la producción in vitro de geldanamicina, un compuesto activo contra la cepa patógena probada (Rothrock y Gottlieb, 1984). Streptomyces violaceusniger YCED-9 YCED-9 fue aislada por Don Crawford y el grupo de Dr. David Lynch a partir de suelos dedicados al cultivo de trigo en Inglaterra. Se describió inicialmente como una cepa capaz de proteger a plántulas de lechuga contra el ataque del oomiceto Phytium ultimum, en un estudio para el aislamiento y selección de actinomicetos con potencial antifúngico (Crawford et al., 1993). YCED-9 tiene un potencial de producción de enzimas líticas y antibióticos fungistáticos y fungicidas (Trejo-Estrada y Crawford, 1996; Trejo-Estrada et al., 1998). Además, el antagonismo de la cepa

cubre a diversas clases de patógenos fúngicos in vitro, y al menos a dos de los más importantes hongos patógenos de pasto, tanto en experimentos a nivel invernadero, como en experimentos de campo (Trejo-Estrada et al., 1998 bis). Enzimas producidas por YCED-9 En experimentos en los que se inocularon medios líquidos con la cepa YCED-9, se observó que produce constitutivamente dos enzimas hidrolíticas asociadas con la lisis de pared celular de hongos. Tanto quitinasa como beta-glucanasa se producen en bajas concentraciones, tanto en medios complejos como en medios definidos que no contenían el inductor correspondiente. La utilización de quitina coloidal y laminarina como substratos, permitió la producción de quitinasa y beta-glucanasa respectivamente, mientras que una preparación de paredes celulares de Fusarium

oxysporium indujo la producción y secreción de ambas enzimas en forma simultánea (Trejo-Estrada y Crawford, 1996; Trejo-Estrada et al., 1998). Sin embargo no fue posible la detección de quitinasa y beta-glucanasa en suelos inoculados con la cepa YCED-9 a diferentes tiempos de incubación (Trejo-Estrada y Crawford, datos no publicados). Antibióticos producidos por la cepa YCED-9 Los antibióticos son metabolitos secundarios de bajo peso molecular los cuales en bajas concentraciones inhiben el crecimiento de microorganismos (Brock et al., 1984). La cepa YCED-9 produce tres compuestos como son guanidilfungina A, nigericina y geldanamicina, estos compuestos muestran una fuerte actividad antagonista hacia hongos fitopatógenos, como: AFA (Actividad Anti-Fusarium), un complejo de compuestos similares a los polienos, los cuales están relacionados con las lactonas macrocíclicas con grupos guanidil. Dicho antibiótico es idéntico o muy similar a la guanidilfungina A, (miembro de las lactonas macrocíclicas). Las guanidilfunginas son un grupo heterogéneo de compuestos, los cuales están relacionados y tienen espectros similares por lo cual son de difícil separación. El espectro de AFA es idéntico al reportado para guanidilfungina A. Este antibiótico, es un fungicida complejo, el cual presenta una actividad antifúngica contra miembros representativos del Reino Fungi exceptuando a los oomicetos (Trejo-Estrada et al., 1998). La nigericina, es un poliéter, que presenta una baja absorción en la región UV y una pobre resolución en cromatografía liquida de fase reversa. ABA (Actividad Anti-Bacillus) es uno de los pocos poliéteres con actividad fungistática, y es activo contra diferentes especies fúngicas excepto Pythium ultimum.

Otro de los antibióticos producidos por YCED-9 es la geldanamicina, un poliquetido benzoquinoide que inhibe el crecimiento miceliar de Pythium spp. y Phytophtora spp. (Trejo-Estrada, et al., 1998). Los antibióticos producidos por YCED-9 muestran otras actividades además de la antifúngica:

• La geldanamicina tiene una actividad antitumoral y antihelmíntica • La nigericina tiene actividad coccidiostática y antibacteriana • La guanidilfungina solo presenta actividad antifúngica.

La producción de antibióticos se encontró claramente dependiente de las condiciones nutricionales de los medios de cultivo (Trejo-Estrada et al., 1998). Uno de los aspectos de mayor relevancia de la fisiología de producción de antibióticos por la cepa YCED-9, es el hecho de que, en cultivo sumergido, es capaz de producir nigericina en una concentración muy elevada, cuando se somete a un medio semisintético con altas concentraciones de sales minerales y almidón, como fuente de carbono, la producción de guanidilfungina A es mínima. Paralelamente, cuando se utiliza un medio complejo (más nutritivo), la producción se invierte, la nigericina se hace indetectable pero la guanidilfungina A se produce activamente (Trejo-Estrada et

al., 1998). Transformación Genética Existen diferentes métodos para lograr la recombinación genética. Dicho proceso implica el intercambio físico de material genético. El proceso de recombinación genética en procariotas puede observarse porque se transfieren fragmentos de DNA desde un donador a una célula receptora por alguno de estos procesos: a) conjugación, en la que la transferencia implica un contacto célula–célula y la presencia de un plásmido conjugativo en la célula donadora; b) transducción, donde la transferencia del DNA donador esta mediada por un virus y c) el proceso de transformación, método asociado a la introducción de DNA por procesos químicos o físicos. El proceso de transformación natural ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se puede conseguir este proceso de forma artificial, sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos, para generar células competentes. Este último proceso se detallará en mayor medida, debido a la importancia que tiene para este trabajo (Madigan et al., 1998).

Generación de Protoplastos Definición de protoplastos Los protoplastos son células desprovistas de la pared celular bacteriana. Esta remoción se logra mediante hidrólisis de la célula bacteriana con lisozima o mediante el bloqueo de la biosíntesis del peptidoglucano con un antibiótico como la penicilina (Jawetz et al., 1981). Generación de protoplastos en Streptomyces El desarrollo de técnicas para la formación y regeneración de protoplastos de Streptomyces

incrementa considerablemente el potencial para la manipulación genética de este género bacteriano de importancia industrial. Se ha observado que aunque lo métodos de transformación pueden ser generales y pueden ser aplicados para diferentes especies, las condiciones para obtener resultados óptimos varia de cepa en cepa (Mirdamadi et al., 1986). Los protoplastos son usados para fusión, transformación y para la transfección de células, con el objetivo de amplificar genes y localizar estructuras subcelulares de forma exacta. Las células de diferentes especies de Streptomyces pueden ser convertidos en protoplastos, lo que permite que el DNA pueda ser introducido dentro de las células. Se ha reportado los protoplastos de Streptomyces

tratados con PEG, permiten una alta frecuencia de transformación (Bibb et al., 1978; Baltz, 1978; Hopwood et al., 1977). Un factor de suma importancia en la producción de protoplastos consiste en determinar la edad y/ o el estado fisiológico del micelio apropiados para la generación de estos. Un caso específico es el reportado para S. lividans. En ese caso, la obtención de protoplastos en altas concentraciones se presentó cuando el micelio se recolectó en la fase exponencial tardía (36-40 h). En esa etapa del cultivo, el micelio produce un pigmento que le da un aspecto rosa/naranja. En contraste, para la transfección de S. parvulus se requiere que los protoplastos provengan de un micelio más joven (18 h de crecimiento) (Okanishi et al., 1974). Un inóculo pequeño, de baja concentración de esporas por unidad de volumen, genera muy poco micelio, lo que da como resultado una baja concentración de protoplastos. Lo anterior ocasiona una baja frecuencia de transformación en Streptomyces (Kieser et al., 2000) Definición de plásmido El termino plásmido fue originalmente usado por Lederberg, quien los describió como determinantes extracromosómicos hereditarios (Lederberg 1952). Actualmente los plásmidos son considerados como elementos genéticos circulares o lineales de un tamaño menor que el del cromosoma. El

tamaño de los plásmidos van de 1 a 200 Kb, aunque se han reportado plásmidos de 1.5 Mb en Rhizobium spp. (Brom et al., 2002). Su replicación es autónoma, y tienen una existencia extracromosómica. La información que contienen los plásmidos puede conferir a la célula que los alberga, resistencia a antibióticos, capacidad para la degradación de compuestos aromáticos, y capacidad de fermentación de azúcares, entre otras (Gerhardt et al., 1994). A diferencia de los virus, los plásmidos no tienen una forma extracelular y simplemente existen dentro de las células como ácidos nucleicos (Madigan, 1998). Es posible diferenciar entre un plásmido y un cromosoma en los procariotas, porque los plásmidos no llevan genes que sean requeridos por el hospedero en todas las condiciones. Esto a veces dificulta la distinción en procariotas entre cromosomas y plásmidos muy grandes. A pesar de estas dificultades, se conocen miles de tipos de plásmidos diferentes. De hecho, solo en cepas de Escherichia coli se han aislado más de 300 plásmidos naturales. El número de plásmidos presentes en una célula puede oscilar; de manera que algunas células bacterianas no contienen ningún plásmido, en cambio otras especies tienen varias copias del mismo plásmido (Madigan, 1998). Vectores de clonación utilizados en Streptomyces Los plásmidos de Streptomyces carecen de genes de resistencia a antibióticos o a metales pesados (excepto los genes de traslado). Tampoco cuentan con otros tipos de marcadores de selección, por lo que estos deben ser insertados como secuencias funcionales en los plásmidos para generar vectores utilizables en transformación genética. Los diferentes replicones de Streptomyces que se han desarrollado dentro de vectores de clonación difieren en su tamaño, modo de replicación, el número de copias, espectro hospedero, y otras características. Los replicones presentes en los plásmidos pSG5 y pJVl son los más frecuentemente encontrados dentro de los actinomicetos (Kieser et al., 2000). Los plásmidos integrativos pueden tener un espectro hospedero más amplio, se ha encontrado que el pSAM2, aislado originalmente de un Streptomyces, puede integrarse en sitios específicos dentro del genoma de Mycobacterium smegmatis (Hagege et al., 1994). Los plásmidos de tipo silvestre que más frecuentemente se han utilizado para la construcción de vectores de clonación son: pIJ101, pJV, pSG5 y SCP2*. Se ha observado cierta compatibilidad para la replicación en la misma célula, por lo que pueden coexistir dentro del mismo hospedero. Los

plásmidos SLP1 y pSAM2 presentan incompatibilidad entre sí, pero pueden ser compatibles con otros vectores de replicación (Kieser et al., 2000). El vector más comúnmente utilizado para la transformación genética en Streptomyces es el pIJ101 de S. lividans. Las principales ventajas de su utilización, en manipulación genética de actinomicetos, consiste en que son estables, presentan gran número de copias por célula, un conveniente tamaño de 8.83 Kb, y un amplio rango de hospederos. Los vectores basados en pIJ101 pueden ser utilizados para la construcción de bibliotecas genómicas, análisis transcripcionales, y otros estudios de genética básica. Birch y Cullum (1985) aislaron un replicón sensible a temperatura derivado de pIJ101, obtenido después de mutagénesis química in vitro por la utilización de hidroxilamina. El plásmido conjugativo SCP2* de 31.4 Kb ha sido intensamente estudiado como plásmido representativo del grupo de vectores con bajo número de copias por célula. Fue originalmente aislado de S. coelicolor A3. Las ventajas de utilizar vectores derivados de SCP2* son una alta estabilidad y su particular habilidad para transportar grandes fragmentos de DNA. Estos vectores han sido usados para clonar clusters de genes enteros, como los genes que codifican para el antibiótico actinorrodina y en las construcciones utilizadas para la clonación y expresión de genes que permitieron la producción del primer antibiótico híbrido por ingeniería genética (Kieser, et al

2000).

VII. METODOLOGÍA Métodos microbiológicos Se utilizó el medio de cultivo PDA (Papa Dextrosa Agar) para la esporulación de la cepa de Streptomyces violaceusniger YCED-9. En 1L. de agua destilada se agregaron 36 g/l de PDA en polvo (Bioxon), se ajustó a un pH a 7.2, se esterilizó por autoclave a 121ºC y 15 psi durante 25 min. Las placas se estriaron con esporas de YCED-9, y se incubaron por 21 días a 28 – 30 ºC. Método de conservación de esporas de S. violaceusniger YCED-9 Para la obtención de esporas de S. violaceusniger YCED-9, se utilizaron placas con esporulación abundante, y se generó un stock obtenido de cultivos en medio de esporulación PDA, mediante la siguiente técnica: Cada cultivo en caja petri de YCED-9 se lavó con 4 ml de agua destilada estéril. Las esporas recuperadas se depositaron en un tubo estéril, el cual se centrífugó (4000 x g durante 5 min, 4°C) con el fin de concentrarlas. El paquete de esporas se conservó, y el sobrenadante se descartó por decantación. Después de obtener un paquete combinado de esporas provenientes de dos o tres placas, se agregaron 5 ml de glicerol estéril al 20 % y se resuspendieron por agitación en el vortex. Las esporas colectadas y suspendidas, se guardaron en viales estériles (tubos de1.5 ml) y se congelaron a – 20 °C. Evaluación de la susceptibilidad de S. violaceusniger YCED-9 a los antibióticos transferidos por los plásmidos La cepa YCED-9 se cultivó en los medios de cultivo PDA, R2YE y YCED (Anexo I). Se inocularon en paralelo los medios de cultivo antes mencionados con esporas de la cepa YCED-9 provenientes de cultivos puros. A una serie de medios de cultivo se le agregó los diferentes antibióticos correspondientes a los marcadores de selección de los plásmidos, en sus respectivas concentraciones. Los antibióticos probados en la cepa YCED-9 fueron: Thiostrepton, ampicilina, tetraciclina, cloramfenicol y geneticina. La otra serie de medios de cultivos se inoculó con la misma cepa, sin agregar el antibiótico y se dejó incubando por aproximadamente 25 días a 30 ºC

Método de extracción para plásmidos Los plásmidos utilizados fueron donados por el Dr. David A. Hopwood del departamento de Biología Molecular John Innes Centre (Norwich). Los antibióticos utilizados en el presente estudio se enlistan en la tabla 1. TABLA 1. Plásmidos donados.

Plásmido Célula Hospedera Resistencia

pIJ922 S. lividans TK 64 ThioR

pIJ702 S. lividans TK24 ThioR

pIJ2345 Escherichia coli ApR, TetR, ChR

pIJ2346 Escherichia coli ApR, TetR, ChR

pSET152 Liofilizado GtR

Thiostrepton=ThioR, Geneticina= GtR, Ampicilina=ApR, Tetraciclina=TetR, Cloramfenicol=ChR

Generación y conservación de esporas para S. lividans

Se probaron diferentes medios de cultivo para las cepas TK64 y TK 24 de Streptomyces lividans. En dichas cepas se encuentran integrados el plásmido pIJ922 (TK64) y pIJ702 (TK24). Los medios de cultivo probados para la esporulación de la bacteria se presentan en la tabla 2. TABLA 2. Medios de cultivo utilizados para la propagación de S. lividans

MEDIO DE CULTIVO CEPA

AGAR DEXTROSA PAPA (PDA) S. lividans TK64 y TK24

R2YE S. lividans TK64 y TK24

R2 S. lividans TK64 y TK24

SB S. lividans TK64 y TK24

Medio Mínimo S. lividans TK64 y TK24

YCED S. lividans TK64 y TK24

El antibiótico thiostrepton se agregó después de esterilizado por filtración con membranas (PALL) de nylon de 0 .45 μm de diámetro del poro. Cada cultivo en caja petri de S. lividans (cepas TK64 y TK24) se lavó con 4 ml de agua destilada estéril. Posteriormente la suspensión de esporas se depositó en un tubo estéril, y se centrifugó (4000 x g durante 5 min, 4°C), con el fin de descartar el agua como sobrenadante y obtener un paquete limpio de esporas. Las esporas se suspendieron posteriormente en 5 ml de una solución esterilizada de glicerol al 20 %, la suspensión se agitó en el vortex con el fin de homogeneizarla. La suspensión de esporas se distribuyó en viales estériles (tubos de 1.5 ml) a los que se les agregaron 10 μl del antibiótico thiostrepton como mecanismo de conservación del plásmido y se congeló a –20 °C. Generación y conservación de células bacterianas de E. coli

Los plásmidos pIJ2345 y pIJ2346 fueron recibidos en células de E. coli. Las cepas fueron cultivadas en medio sólido LB y posteriormente en medio líquido LB (Anexo I). Las cepas que contenían los plásmidos pIJ2345 y pIJ2346 se cultivaron en medios de cultivo sólidos y líquidos, previamente esterilizados a los que se adiciono 50 μg/ml de ampicilina, 12 μg/ml de tetraciclina y 20 μg/ml de cloramfenicol. Los antibióticos fueron esterilizados por filtración con membranas (PALL) de nylon de 0 .45 μm el diámetro del poro. Las células bacterianas se depositaron en un tubo estéril y se centrifugaron (4000 x g durante 5 min, 4°C) para obtener un paquete celular concentrado y se descarto el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 5 ml de glicerol estéril al 20 %, y se agitó en el vórtex para homogeneizar. La suspensión se distribuyó en viales estériles (tubos de 1.5 ml.) a los cuales se les agregaron los antibióticos antes mencionados para la conservación de los plásmido, posteriormente se congelaron a –20 °C para su conservación. Extracción de Plásmidos Para la extracción de los plásmidos pIJ2345 y pIJ2346 en las células hospederas de E. coli se utilizó un kit de extracción (KID MIDI PREP SNAP Invitrogen).

Extracción de DNA plasmídico de pSET152 Al plásmido SET152 que se envió liofilizado, se integró el DNA plasmídico en células de E.coli de la cepa XLI-Blue. Esta cepa se cultivó en medio sólido LB con el antibiótico geneticina en una concentración de 10μg/ml para probar la susceptibilidad de esta célula al antibiótico. E.coli se transformó usando Cloruro de calcio que se detalla mas adelante. Soluciones: Cloruro de calcio (Anexo I). Preparación de las células competentes (Ausubel et al., 1992; Sambrook et al., 1989). Se inoculó una colonia de E. coli en medio de agar LB. Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC. Las células del crecimiento en placa se inocularon en medio líquido LB para generar una alta densidad de células. El cultivo se incubó a 37 ºC con agitación a 1000 x g, hasta alcanzar una densidad óptica específica (OD

590 = 0.375).

El caldo de fermentación se distribuyó en tubos estériles falcón preenfriados, mismos que se incubaron en hielo por 10 min y se centrifugaron posteriormente a 1000 x g durante 7 min a 4ºC. El sobrenadante de centrifugación se descartó, y el paquete celular se resuspendió en 10 ml de una solución de cloruro de calcio enfriada, que se centrifugó a 1000 x g durante 5 min a 4ºC. El sobrenadante de centrifugación se descartó, y el paquete celular se volvió a resuspender en 10 ml de una solución de cloruro de calcio previamente enfriada a 4 ºC. La suspensión celular se incubó en hielo por 30 min, se centrifugó a 1000 x g durante 5 min a 4ºC. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el paquete celular en 2 ml de una solución de cloruro de calcio. Se prepararon alícuotas de 250 μl en viales estériles, que se conservaron a - 70 ºC inmediatamente. Transformación de células competentes Se adicionaron 10 ng de DNA plasmídico de pSET152 a cada tubo falcón previamente esterilizado. Se colocó inmediatamente en un baño de agua-hielo. El stock de células competentes se llevó a temperatura ambiente y se tomaron 100 μl que se agregaron a cada tubo que contuviera DNA plasmídico. Los tubos se incubaron en hielo por 10 min, y posteriormente se calentaron en baño María a 42 ºC por 2 min.

Un mililitro de la mezcla de transformación se sembró en placa petri, en medio de cultivo sólido LB que contenía el antibiótico geneticina. Las placas de agar se incubaron a 37ºC por 12 h. El conteo de células viables en el medio selectivo en placa es un indicador directo de las células transformadas utilizando el plásmido pSET152. Electroforesis de DNA en gel de agarosa Esta técnica ha sido usada rutinariamente para visualizar el DNA obtenido (Ausubel et al., 1992). En este trabajo se utilizó una concentración de azarosa de 0.8% en TBE (50 mM Tris, 1mM ácido bórico, 2 mM EDTA, pH 8), al cual se agrego 0.5 μg/mL de bromuro de etidio. Como marcador de peso molecular se utilizó DNA del fago λ digerido con Hind III y corriendo el gel a 60 V en buffer TBE (1x). Las bandas de DNA se visualizaron colocando el gel sobre una fuente de luz ultravioleta (transiluminator Gel Doc 2000 BIO RAD). La emisión de luz se capto con una cámara fotográfica. Generación de protoplastos Se siguió una técnica de generación para protoplastos probada en S. lividas 66 y S. coliecolor A3, y establecida por Hopwood (Kieser et al., 2000). La técnica establecida por Hopwood se modificó para S. violaceusniger YCED-9, puesto que las necesidades y las condiciones eran diferentes para la generación de protoplastos de dicha cepa. Material biológico

Esporas de S. violaceusniger YCED-9 (6 X109). Soluciones Medio de cultivo YEME Solución de lisozima (2mg/ml en buffer P, esterilizado por filtración) Buffer P (Anexo I) Procedimiento Las esporas de S. violaceusniger YCED-9 se cultivaron en medio liquido YEME para generar micelio.

En un matraz de 250 ml conteniendo 25 ml de medio YEME se agregaron aproximadamente 6 X109

esporas de YCED-9. Los cultivos se incubaron por 72 h a 30 0C en un agitador orbital a 1000 x g. Al cabo de 72 h de incubación, el caldo de fermentación se vertió en tubos con rosca (falcón) estériles

de 20 ml y se centrifugaron (1000 x g durante 10 min. a 10 0C). Se descartó el sobrenadante. El paquete celular se resuspendió en 15 ml en una solución de sacarosa al 10.3 % y se centrifugó a

1000 x g durante10 min a 10 0C. Se descartó el sobrenadante y se eliminó el resto del cultivo (este paso es opcional en el caso de que no se pueda formar el paquete celular).

El paquete celular formado de micelio, se puede congelar en esta etapa a -20 0C antes de resuspender. Se resuspendió el micelio de Streptomyces violaceusniger YCED-9 (8 ml de volumen empacado)

con 4 ml de solución de lisozima disuelta en buffer P. La suspensión se incubó a 30 0C por un periodo de 90 min. El micelio se mezcló de nuevo por pipeteo suave en tres ocasiones y se incubó por otros 10 min. Se agregaron 10 a 15 ml de buffer P con el propósito de liberar los protoplastos del micelio, un paso fuertemente dependiente de la densidad del micelio. Filtración de protoplastos Se filtraron los protoplastos a través de un embudo Bunsen de plástico de diámetro del cuello interno de 7 mm, de tallo corto esterilizado, al cual se le incorporaron 1.8 g de algodón estéril y se transfirió a un tubo de plástico con rosca (también estéril). Nuevamente se agregaron 10 ml de buffer P sobre el algodón y se dejó hasta obtener el máximo filtrado posible. Los protoplastos se dejaron sedimentar suavemente por centrifugación (1000 x g durante 10 min a 10ºC). Posteriormente se descartó el sobrenadante y se resuspendieron los protoplastos en 2 ml de buffer P. Dicha suspensión se volvió a centrífugar a 1000 x g durante 10 min durante 10ºC. Se descartó el sobrenadante y se resuspendió el protoplasto en 1 ml de buffer P, el cual se transfirió a un tubo eppendorf estéril. Para el almacenamiento de los protoplastos, lo viales de plástico estériles (ependorff de 1.5 ml), se transportaron en vasos de precipitado de plástico, en un baño de agua con hielo por 20 min, y se

congelaron posteriormente a -70 0C toda la noche. Para la descongelación, se agitó el hielo del tubo bajo el chorro de agua tibia. El procedimiento anterior permite la congelación lenta y descongelación rápida, necesarios para mantener la estabilidad y viabilidad de los protoplastos.

Técnica de evaluación de unidades no formadoras de colonias a partir de protoplastos Para la evaluación de unidades no formadoras de colonias se utilizó detergente diluido (SDS al .01%) en buffer P (Kieser et al., 2000). Se utilizó el medio de cultivo sólido R2YE (Placas petri con medio de cultivo de regeneración de protoplastos). Se prepararon diluciones en paralelo con detergente y sin detergente para obtener unidades formadoras de colonias (UFC), se tomó 1ml de la dilución de células tratadas con detergente y se sembró en placa petri con medio R2YE. Las placas se incubaron a 30 °C por 10 días. El mismo procedimiento se empleó para la dilución sin detergente. Una colonia generada a partir de una dilución de células tratadas con detergente solo puede originarse de células que no fueron convertidas en protoplastos, ya que tienen integridad parcial o total de la envoltura y pared celular. Se cuantificaron UFC por conteo directo en placa R2YE, tanto de las preparaciones de protoplastos de las diluciones tratadas con detergente, como de las no tratadas. Transformación genética de S. violaceusniger YCED-9. Técnica asistida con PEG 1000 y protoplastos de Streptomyces con DNA de plásmidos Material biológico

Protoplastos de S. violaceusniger YCED-9 (2 x105 ) DNA plasmídico con una concentración de 58. 4875 μg/ml suspendido en buffer TE Soluciones Buffer P Buffer T Medios de cultivo Placas para transformación con medio de cultivo sólido R2YE con un 85% de humedad del peso inicial. Placas para transformación con medio de cultivo sólido R2YE que contienen antibiótico correspondiente al marcador de selección del plásmido, y que tienen el 85% del peso inicial, como indicador de una pérdida de humedad.

Procedimiento La suspensión concentrada de protoplastos se diluyó con 5 ml de buffer P y posteriormente se centrifugó, utilizando una centrífuga de mesa (1000 x g durante 8 min a temperatura ambiente). Este proceso hace las funciones de un lavado. Se descartó el sobrenadante y se resuspendieron los protoplastos en la gota de buffer P (cerca de 50 μl) que quedó en el fondo, pegando suavemente en el tubo. Se adicionaron 20 μl de DNA plasmídico en una concentración de 58. 4875 μg/ml suspendido en buffer TE, inmediatamente se agregaron 0.5 ml de buffer T (el cual contiene PEG 1000) y se mezcló suavemente por pipeteo. Tan pronto como fue posible (menos de 1 min) se adicionaron 5 ml de buffer P y se centrifugó (1000 x g durante 3 min a temperatura ambiente). Se descartó el sobrenadante y se resuspendieron los protoplastos en la gota de buffer P que quedó en el tubo (cerca de 50 μl), pegando suavemente en el tubo. La muestra se diluyó agregando 1 ml de buffer P. Se sembraron 0.1 ml de la solución de células transformadas en placas petri con medio sólido R2YE y adicionada con los antibióticos correspondientes a los marcadores de selección respectivos para

cada plásmido. Las placas se incubaron a 30 0 por 15 días Para los plásmidos pIJ2345 y pIJ346 los marcadores de selección fueron ampicilina en una concentración final de 50 μg/ml, tetraciclina 12 μg/ml y cloramfenicol 20 μg/ml en el medio de cultivo. Para el plásmido pSET152 el marcador que se agregó al medio de cultivo fue geneticina en una concentración final de 10 μg/ml. Evaluación de la eficiencia de transformación de S. violaceusniger YCED-9 De la suspensión de protoplastos de YCED-9 transformados se tomaron 0.1 ml del stock de protoplastos mantenidos en congelación, posteriormente se inoculó en placa con medio de cultivo sólido R2YE (Placas de regeneración) así como en medio PDA. Al medio de selección se le agregó el respectivo antibiótico, marcador correspondiente al plásmido. Simultáneamente, un volumen igual del stock de protoplastos se inoculó en un medio de cultivo sólido R2YE y en medio PDA que no contenían antibióticos. Se registró el número de UFC derivadas de la suspensión de protoplastos (cuantificadas en el medio sin antibiótico), y las UFC derivadas de transformación (cuantificadas en el medio con antibiótico). Se efectuó el conteo directo de las unidades formadoras de colonias (UFC) según Hopwood (1985).

La evaluación de la eficiencia de transformación se refiere al número de células transformadas, o UFC, que se obtienen por microgramo de DNA del vector de transformación. En el presente estudio, se utilizaron 20μl de DNA plasmídico de los plásmidos pIJ2345 y pIJ2346 suspendidos en buffer TE, los cuales contenían una concentración de 58.4875 μg de DNA para pIJ2345. En el caso de pIJ2346 se utilizó una concentración de 119.49 μg de DNA. El número de UFC transformadas, se dividió entre 1.2 μg, la cantidad total de DNA plasmídico utilizado. El resultado obtenido es lo que se reporta como eficiencia de transformación.

VIII. RESULTADOS Medios de esporulación El medio agar PDA pH 7.2 (Bioxon) y el medio R2YE (pH 7.2) resultaron ser los mas adecuados para la esporulación de S.lividans (Fig 5). Fig. 5 Crecimiento de la cepa Streptomyces lividans en medios de cultivo Agar Dextrosa Papa (PDA)

y R2YE a 30 ºC, en un periodo de incubación de 480 h. Para el caso de S. violaceusniger YCED-9 se observó que el medio de cultivo en el cual se obtiene una mejor esporulación es el medio PDA, más abundante que en R2YE y que en los demás medios probados. La geneticina, el marcador utilizable para este plásmido, resultó ser extraordinariamente tóxico para la cepa de E. coli que se utilizó, aun cuando presumiblemente se obtuvieron transformantes temporales. El antibiótico geneticina se adicionó a una concentración final de 5 μg/ml, (una muy baja concentración) en el medio de cultivo LB en estado sólido y líquido, con el objeto de verificar si a concentraciones mas bajas se podían obtener colonias transformadas de la cepa. En ningún caso se obtuvieron transformantes estables. Debido a lo anterior no se obtuvo una concentración suficiente de DNA plasmídico de pSET152, para el proceso de transformación de S. violaceusniger YCED-9. Extracción de DNA plasmídico de S. lividans El método de extracción de DNA plasmídico utilizado en el presente estudio corresponde a una modificación de la técnica propuesta por D. Hopwood y F. Malpartida (1985). El protocolo empleado fusionó dos protocolos, uno clásico, para la preparación de plásmidos por tratamiento de micelio de cepas de Streptomyces, y otra parte que corresponde a un kit comercial de purificación. El protocolo integrado resultó claramente efectivo para la extracción y purificación de los plásmidos pIJ702 con un peso molecular de 5685 pb y el plásmido pIJ922, con un peso molecular de 24000 pb. Extraídos a partir de cultivos de las cepas hospederas de S. lividans (fig. 8)

pIJ922

Marcadorbp

2,027 2,322

6,5574,361

23,13 09,416

pIJ702

Fig. 8 Electroforesis en gel de agarosa (0.8%), de los plásmidos pIJ702 y pIJ922. La electroforesis

se corrió en buffer TBE 1x, a 60 volts, en paralelo al marcador DNA de λ / Hind III.

Generación de protoplastos La formación de protoplastos a partir de YCED-9, se realizó a través de la modificación de la técnica establecida por D. Hopwood (Kieser et al., 2000). Las modificaciones generadas para tal proceso fueron de central importancia. El protocolo original fue desarrollado por el grupo del autor citado, se modificó para la cepa YCED-9 en los siguientes puntos: El tiempo de fermentación utilizado para colectar el micelio fue de 72 h, en contraste con el de 36-40 h reportado para S. lividans 66 y S. coliecolor A3 por Kieser et al., (2000). En el protocolo de Hopwood et al., (1985), la concentración de lisozima es de 1 mg/ml. Dicha concentración resultó insuficiente para la generación de protoplastos de la cepa YCED-9. En el presente estudio se utilizó una concentración de 2 mg/ml para la generación de protoplastos funcionales como células competentes de YCED-9. En la etapa de lisis de la pared celular, el tiempo de incubación en presencia de la solución de lisozima, para la generación de células competentes, tuvo un periodo óptimo de 90 min, en contraste con los 15 a 30 min que se sugieren para los sistemas modelo.

En este caso, se probaron diferentes tiempos de incubación de micelio en presencia de la solución de lisozima. Los tiempos de incubación probados fueron de 15, 30, 60, 90 y 105 min. En este grupo de experimentos, se demostró que un tiempo de incubación menor a 90 min no es suficiente para la generación de protoplastos. La presencia y concentración de protoplastos a partir de una suspensión de micelio en tratamiento, se determinó por el análisis de colonias viables (UFC), presentes en alícuotas de la suspensión. Las UFC determinadas en una muestra de la suspensión sin tratamiento con SDS revela el total de las células. Es decir la suma de protoplastos y células con pared celular integra o parcialmente removida pero que se puede regenerar. Las UFC determinadas a partir de una muestra de la suspensión, tratada con SDS al 0.01%, corresponden exclusivamente a las células que no son protoplastos, aquellas cuya pared celular no fue afectada por el tratamiento con lisozima. La sustracción de ambos valores genera el número de protoplastos viables. En este experimento se pudo demostrar que en periodos menores de 90 min de incubación con lisozima, los protoplastos derivados del tratamiento de micelio de YCED-9 son inexistentes o se encuentran en muy baja concentración. En el tiempo de incubación de 90 min, no se generaron colonias viables después del tratamiento con SDS, pero la concentración de células viables en la muestra sin

tratamiento era muy elevada (> 106 UFC / ml).

Obtención de colonias de los sistemas de filtración

A partir de una suspensión de esporas de S. violaceusniger de 6 X 109, se inoculó el medio de cultivo líquido, se recuperó el micelio después de 72 h de fermentación, y se trató con la solución de lisozima. La suspensión que contenía tanto micelio de YCED-9 como protoplastos unicelulares se filtró con el objeto de recuperar en el liquido filtrado el máximo posible de protoplastos y detener en el material filtrante lo mas posible de micelio. El embudo Bunsen de plástico, con algodón compactado resulto ser el sistema más adecuado para la filtración eficiente y liberación máxima de

protoplastos. Con este sistema se generaron 17 X105 unidades formadoras de colonia en cuenta viable, mientras que con el embudo Bunsen de vidrio de tallo largo se obtuvo una concentración de

solo 1 X105 unidades formadoras de colonia formadas a partir de protoplastos Selección de vectores de transformación Para el proceso de transformación genética de S. violaceusniger YCED-9, se siguió la técnica establecida Bibb et al., y Thompson et al., (1982), los plásmidos utilizados fueron pIJ2345 y pIJ2346. Los plásmidos pIJ702 y pIJ922 no eran vectores de uso factible en la transformación, debido a que tienen un gen de resistencia a thiostrepton en diferentes concentraciones y, dado que la cepa YCED-9 creció de forma normal en medio de cultivo con dicho antibiótico, no puede usarse como marcador de selección. El plásmido pSET152 presentó otros problemas. No se pudo obtener transformación en E. coli, y por tanto la amplificación fue imposible. La ausencia de DNA plasmídico suficiente limitó el uso de pSET152, a pesar de que la cepa YCED-9 mostró susceptibilidad al antibiótico geneticina. La cepa S. violaceusniger YCED-9 se sembró en medio de cultivo de regeneración R2YE con los antibióticos Ampicilina en una concentración de 4 mg/ml, Tetraciclina con 12 mg/ml y cloramfenicol con una dosis de 10mg/ml, el crecimiento de YCED-9 silvestre fue nulo .

Transformación de la cepa YCED-9 Se logró el proceso de transformación de S. violaceusniger YCED-9 con los plásmidos pIJ2345 y pIJ2346. Las colonias transformantes adquirieron resistencia a los antibióticos ampicilina, tetraciclina y cloramfenicol, por lo que estos plásmidos fueron favorables para poder seleccionar a las células transformadas. Los resultados de la transformación que se obtuvieron con el plásmido pIJ2345 fueron 80 UFC generadas con una concentración 58.4875μg de DNA y para el plásmido pIJ2346 se obtuvo una cantidad de 68 UFC transformadas a partir de una concentración de 119.49 μg de DNA (fig. 10).

(A) (B)

Fig. 10 Colonias transformadas de la cepa YCED-9 en medio de cultivo PDA solidó con antibióticos am 50 µg/ml, tet 12 µg/ml y ch 20 µg/ml, a 30 ºC. En la fotografía (A) Colonias transformantes que contienen el plásmido pIJ2345 con un periodo de incubación de 360 h y en la fotografía (B) Colonias transformantes que contienen el plásmido pIJ2346 con un periodo de incubación de 480 h.

En la figura 11 se observa el crecimiento en placa de las células transformadas de S. violaceusniger cepa YCED-9 y la cepa silvestre en medio de cultivo con los antibióticos am 50 µg/ml, tet 12 µg/ml y ch 20 µg/ml.

Células transformadas

con pIJ2346

YCED-9 TSL

Células transformadas

con pIJ2345

YCED-9 TSM S. violaceusniger YCED-9

Fig. 11 Comparación de la cepa silvestre de S. violaceusniger cepa YCED-9 y las células transformadas de la misma cepa en medio sólido PDA, con antibióticos (am, tet y ch), a 30 ºC, con un periodo de incubación de 480 h Análisis de DNA plasmídico de E.coli y de S. violaceusniger YCED-9 Se extrajo el DNA plasmídico de las cepas transformantes de YCED-9 que contenían pIJ2345 o pIJ2346. Simultáneamente, se recuperó el DNA plasmídico de las cepas de E.coli que originalmente contenían dichos plásmidos. Las cuatro preparaciones de plásmidos purificados se analizaron por electroforesis. Los resultados de dicho análisis se presentan en la figura 7. Las bandas correspondientes demostraron tener el mismo perfil de bandas para la cepa YCED-9 y para los plásmidos extraídos de las células hospederas de E.coli (fig.12).

Fig. 12 Fotografía de electroforesis en gel de agarosa (0.8%), buffer TBE 1x, a 60 volts, marcador DNA de λ / Hind III

Eficiencia de transformación La transformación de YCED-9 con pIJ2345 se obtuvo a partir de una suspensión que contenía 1.3 x

104 protoplastos en 1 ml de suspensión. Se agregó 1.17 μg de DNA de pIJ2345. Se consiguió una eficiencia de 80 transformantes por μg de DNA.

La transformación de YCED-9 con pIJ2346 se efectuó de una suspensión que contenía 2.4 x 103

protoplastos en 1 ml de suspensión. Se agregó 1.17 μg de DNA de pIJ2346. Se obtuvo una eficiencia de 68 transformantes por μg de DNA.

X. CONCLUSIONES ♦ YCED-9 es susceptible a los antibióticos ampicilina, tetraciclina, cloramfenicol y geneticina,

y claramente resistente a thiostrepton. ♦ Se logró la transformación genética de YCED-9 mediante el uso de un protocolo definido

experimentalmente, que incluyó un tiempo de incubación, la recolección de micelio, lisis enzimática de pared celular y recuperación de protoplastos por un sistema especifico de filtración.

♦ Mediante el uso de los plásmidos pIJ2345 y pIJ2346, y de los antibióticos ampicilina,

tetraciclina y cloramfenicol para la selección de transformantes, se obtuvieron transformantes de YCED-9 con eficiencias de transformación de 80 UFC para el plásmido pIJ2345, y de 68 UFC para el plásmido pIJ2346

♦ La modificación de un protocolo de recuperación de DNA plasmídico a partir de

Streptomyces, y la adaptación de un kit comercial, permitieron la recuperación de DNA plasmídico de alta pureza a partir de cultivos de las cepas transformantes YCED-9 TSM y YCED-9 TSL. Ambas cepas transformantes son altamente estables en cultivo.

♦ Se logró integralmente la conformación de un sistema genético para YCED-9 mediante el

cual se puede introducir y recuperar DNA plasmídico a partir de protocolos simples, claros y reproducibles.