Regulacja acetylacji histonu H4,Regulacja acetylacji histonu H4,podczas dojrzewania mejotycznego, podczas dojrzewania mejotycznego, w oocytach myszyw oocytach myszy

TOMOHIKO AKIYAMA, JIN-MOON TOMOHIKO AKIYAMA, JIN-MOON

KIM,KIM, MASAO NAGATA, MASAO NAGATA, ANDAND FUGAKU AOKI FUGAKU AOKI

MOLEKULAR REPRODUCTION ANDMOLEKULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT 69:222-227 (2004)DEVELOPMENT 69:222-227 (2004)

University of Tokyo, Chiba, JapanUniversity of Tokyo, Chiba, Japan

WstępWstęp Oznaką rozpoczęcia dojrzewania mejotycznego jest Oznaką rozpoczęcia dojrzewania mejotycznego jest

rozpuszczenie osrozpuszczenie osłłonki jądrowej (zanik pęcherzyka onki jądrowej (zanik pęcherzyka zarodkowego) i kondensacja chromatynyzarodkowego) i kondensacja chromatyny

Po 4-5 h zostaje wyrzucone I ciałko kierunkowePo 4-5 h zostaje wyrzucone I ciałko kierunkowe Po ukończeniu I podziału mejotycznego utworzone zostaje Po ukończeniu I podziału mejotycznego utworzone zostaje

wrzeciono II podziału (metafaza II); w tym momencie wrzeciono II podziału (metafaza II); w tym momencie dojrzewanie oocytu ponownie ulega zablokowaniudojrzewanie oocytu ponownie ulega zablokowaniu

Rozpoczęcie dojrzewania mejotycznego spowodowane jest Rozpoczęcie dojrzewania mejotycznego spowodowane jest wzrostem aktywności czynnika MPFwzrostem aktywności czynnika MPF

MPF jest białkowym kompleksem złożonym z kinazy p34 cdc2 MPF jest białkowym kompleksem złożonym z kinazy p34 cdc2 (podjednostka katalityczna) i cykliny B (podjednostka (podjednostka katalityczna) i cykliny B (podjednostka regulatorowa)regulatorowa)

Podczas dojrzewania mejotycznego następuje aktywna synteza Podczas dojrzewania mejotycznego następuje aktywna synteza białek; nowo zsyntetyzowane białka biorą udział w dalszych białek; nowo zsyntetyzowane białka biorą udział w dalszych przemianach mejotycznych.przemianach mejotycznych.

Jeśli synteza białek jest zatrzymana podczas dojrzewania Jeśli synteza białek jest zatrzymana podczas dojrzewania mejotycznego, zatrzymana jest także synteza kinazy p34 cdc2; mejotycznego, zatrzymana jest także synteza kinazy p34 cdc2; mejoza jest zatrzymana we wczesnym etapiemejoza jest zatrzymana we wczesnym etapie

Wstęp c.d.Wstęp c.d. Podczas dojrzewania mejotycznego oocytów myszy mają Podczas dojrzewania mejotycznego oocytów myszy mają

miejsce zmiany epigenetyczne (modyfikacje chromatyny), które miejsce zmiany epigenetyczne (modyfikacje chromatyny), które przekładają się na fizyczną strukturę chromatyny i ekspresję przekładają się na fizyczną strukturę chromatyny i ekspresję genów; związane jest to z acetylacją i deacetylacją histonu H4genów; związane jest to z acetylacją i deacetylacją histonu H4

Acetylacja histonu H4 odgrywa ważną rolę w ekspresji genów, Acetylacja histonu H4 odgrywa ważną rolę w ekspresji genów, gdyż skutkuje zmianami w strukturze chromatyny, co przekłada gdyż skutkuje zmianami w strukturze chromatyny, co przekłada się na zróżnicowaną ekspresję genów w oocytach myszysię na zróżnicowaną ekspresję genów w oocytach myszy

Podczas mejozy (ale nie mitozy) ma miejsce ogólna Podczas mejozy (ale nie mitozy) ma miejsce ogólna deacetylacja histonu H4 w Lys-12 (H4K12); deacetylaza histonu deacetylacja histonu H4 w Lys-12 (H4K12); deacetylaza histonu (HDACs) jest w stanie deacetylować histony, co wiąże się z (HDACs) jest w stanie deacetylować histony, co wiąże się z zacieraniem epigenetycznych markerów aktywnych genówzacieraniem epigenetycznych markerów aktywnych genów

Acetylotransferaza histonów (HATs) jest inaktywowana Acetylotransferaza histonów (HATs) jest inaktywowana specyficznie podczas mejozyspecyficznie podczas mejozy

Materiały i metodyMateriały i metody3 tygodniowe samice myszy;

47 h przed sekcją zastrzyk z PMSG

Jajniki w pożywce Witten’s medium (Wm) + albumina 3 mg/ml

Wykluto oocyty; usunięto komórki pęcherzykowe

Selekcja; oocyty z pęcherzykiem zarodkowym (GV) (świeża pożywka Wm, cieplarka 38 st. C, 5% CO2)

Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 Doświadczenie 3

Doświadczenie 1Doświadczenie 1

Cel doświadczenia:Cel doświadczenia: Obserwacja czasowych zmian w acetylacji Obserwacja czasowych zmian w acetylacji

histonu H4histonu H4

Materialy i metody:Materialy i metody: Inkubacja w pożywce Wm + DMSOInkubacja w pożywce Wm + DMSO Barwienie immunocytochemiczne; przeciwciała Barwienie immunocytochemiczne; przeciwciała

przeciwko zacetylowanemu H4K12; przeciwciała; przeciwko zacetylowanemu H4K12; przeciwciała; FITC (FITC (zielonyzielony) )

Barwienie DNA przy użyciu DAPI (Barwienie DNA przy użyciu DAPI (niebieskiniebieski))

Doświadczenie 1Doświadczenie 1

Wnioski:Wnioski: • Histon H4K12 jest deacetylowany w momencie rozpoczęcia dojrzewania Histon H4K12 jest deacetylowany w momencie rozpoczęcia dojrzewania oocytu, czasowo acetylowany momencie ukończenia I podziału oocytu, czasowo acetylowany momencie ukończenia I podziału mejotycznego i wyrzucenia I cialka kierunkowego, ponownie mejotycznego i wyrzucenia I cialka kierunkowego, ponownie deacetylowany w momencie rozpoczęcia II podziału mejotycznegodeacetylowany w momencie rozpoczęcia II podziału mejotycznego

Wyniki:Wyniki:

Doświadczenie 2Doświadczenie 2 Cel doświadczenia:Cel doświadczenia:

Czy kinaza p34 cdc2 bierze udział w deacetylacji histonu H4K12Czy kinaza p34 cdc2 bierze udział w deacetylacji histonu H4K12 Zbadanie roli kinazy p34 w utrzymaniu stanu deacetylacji H4K12 Zbadanie roli kinazy p34 w utrzymaniu stanu deacetylacji H4K12 cdc2 podczas II podziału mejotycznegocdc2 podczas II podziału mejotycznego Czy roskowityna indukuje acetylację zdeacetylowanego histonu H4 Czy roskowityna indukuje acetylację zdeacetylowanego histonu H4 podczas II podziału mejotycznegopodczas II podziału mejotycznego

Materialy i metody:Materialy i metody: Oocyty GV, oocyty 8h, oocyty 11hOocyty GV, oocyty 8h, oocyty 11h Preinkubacja oocytów GV w pożywce Wm + IBMX + roskowityna Preinkubacja oocytów GV w pożywce Wm + IBMX + roskowityna lub WM + IBMX + DMSO (kontrola)lub WM + IBMX + DMSO (kontrola) Inkubacja oocytów (GV przez 4 h; 8 h przez 9 h; 11 h przez 6 h)Inkubacja oocytów (GV przez 4 h; 8 h przez 9 h; 11 h przez 6 h) w pożywce Wm + roskowityna lub Wm + DMSOw pożywce Wm + roskowityna lub Wm + DMSO Barwienie immunocytochemiczne; przeciwciała przeciwko Barwienie immunocytochemiczne; przeciwciała przeciwko zacetylowanemu H4K12; przeciwciała FITC (zacetylowanemu H4K12; przeciwciała FITC (zielonyzielony) ) Barwienie DNA przy użyciu DAPI (Barwienie DNA przy użyciu DAPI (niebieskiniebieski))

Doświadczenie przeprowadzono w 3 powtórzeniachDoświadczenie przeprowadzono w 3 powtórzeniach

Doświadczenie 2 Doświadczenie 2

Wnioski: Wnioski: • Deacetylacja histonu H4 podczas I i II podziału mejotycznego jest zależna od Deacetylacja histonu H4 podczas I i II podziału mejotycznego jest zależna od kinazy p34 cdc2kinazy p34 cdc2• Kinaza p34 cdc2 jest niezbędna do deacetylacji histonu H4 podczas I i II Kinaza p34 cdc2 jest niezbędna do deacetylacji histonu H4 podczas I i II podziału mejotycznego, ale nie jest niezbędna do utrzymania stanu podziału mejotycznego, ale nie jest niezbędna do utrzymania stanu deacetylacji podczas II podziału mejotycznegodeacetylacji podczas II podziału mejotycznego• Kinaza p34 indukuje HDAC, a nie indukuje HATKinaza p34 indukuje HDAC, a nie indukuje HAT

Wyniki:Wyniki:

Doświadczenie 3Doświadczenie 3 Cel doświadczenia:Cel doświadczenia:

Zbadanie wpływu nowozsyntetyzowanych białek na utrzymanie Zbadanie wpływu nowozsyntetyzowanych białek na utrzymanie deacetylacji histonu H4 podczas mejozy w oocytach myszydeacetylacji histonu H4 podczas mejozy w oocytach myszy

Zbadanie wpływu inhibicji syntezy białek na acetylację histonu H4 Zbadanie wpływu inhibicji syntezy białek na acetylację histonu H4 podczas II podziału mejotycznegopodczas II podziału mejotycznego

Zbadanie wpływu CHX na syntezę białek w oocytach, w których Zbadanie wpływu CHX na syntezę białek w oocytach, w których deacetylacja już nastąpiładeacetylacja już nastąpiła

Materialy i metody:Materialy i metody: Oocyty GV, oocyty 8h, oocyty 11hOocyty GV, oocyty 8h, oocyty 11h Preinkubacja oocytów GV w pożywce Wm + IBMX + CHXPreinkubacja oocytów GV w pożywce Wm + IBMX + CHX lub WM + IBMX (kontrola)lub WM + IBMX (kontrola) Inkubacja oocytów (GV przez 4 h; 8 h przez 9 h; 11 h przez 6 h) w Inkubacja oocytów (GV przez 4 h; 8 h przez 9 h; 11 h przez 6 h) w

pożywce Wm + CHX lub Wm pożywce Wm + CHX lub Wm Barwienie immunocytochemiczne; przeciwciała przeciwko Barwienie immunocytochemiczne; przeciwciała przeciwko zacetylowanemu H4K12; przeciwciała FITC (zacetylowanemu H4K12; przeciwciała FITC (zielonyzielony) ) Barwienie DNA przy użyciu DAPI (Barwienie DNA przy użyciu DAPI (niebieskiniebieski))

Doświadczenie przeprowadzono w 3 powtórzeniachDoświadczenie przeprowadzono w 3 powtórzeniach

Doświadczenie 3Doświadczenie 3

Wnioski:Wnioski:• Nowozsyntetyzowane białka, podczas dojrzewania mejotycznego, Nowozsyntetyzowane białka, podczas dojrzewania mejotycznego, są odpowiedzialne za utrzymanie stanu deacetylacji histonu H4K12są odpowiedzialne za utrzymanie stanu deacetylacji histonu H4K12• Jeśli synteza białek jest zatrzymana, następuje ponowna acetylacja Jeśli synteza białek jest zatrzymana, następuje ponowna acetylacja histonu H4 histonu H4 • Acetylotransferaza HAT jest inaktywowana przez nowozsyntetyzowane Acetylotransferaza HAT jest inaktywowana przez nowozsyntetyzowane białkabiałka

Wyniki:Wyniki:

PodsumowaniePodsumowanie Podczas mejozy (ale nie mitozy) ma miejsce ogólna deacetylacja Podczas mejozy (ale nie mitozy) ma miejsce ogólna deacetylacja

histonu H4 w Lys-12 (H4K12) histonu H4 w Lys-12 (H4K12) Tylko deacetylaza histonu (HDACs) jest w stanie katalizować Tylko deacetylaza histonu (HDACs) jest w stanie katalizować

acetylację histonu H4acetylację histonu H4 Acetylotransferaza histonów (HATs) jest inaktywowana specyficznie Acetylotransferaza histonów (HATs) jest inaktywowana specyficznie

podczas mejozypodczas mejozy Kinaza p34 cdc2 reguluje deacetylację histonu H4K12 podczas Kinaza p34 cdc2 reguluje deacetylację histonu H4K12 podczas

dojrzewania oocytów; indukuje deacetylację histonu H4K12 poprzez dojrzewania oocytów; indukuje deacetylację histonu H4K12 poprzez aktywację HDACsaktywację HDACs

Nowozsyntetyzowane białka, podczas dojrzewania mejotycznego, są Nowozsyntetyzowane białka, podczas dojrzewania mejotycznego, są niezbędne do utrzymania stanu deacetylacji histonu H4K12, gdyż niezbędne do utrzymania stanu deacetylacji histonu H4K12, gdyż hamują działanie HAThamują działanie HAT

Acetylacja histonu H4 odgrywa ważną rolę w ekspresji genów, gdyż Acetylacja histonu H4 odgrywa ważną rolę w ekspresji genów, gdyż skutkuje zmianami w strukturze chromatyny, co przekłada się na skutkuje zmianami w strukturze chromatyny, co przekłada się na zróżnicowaną ekspresję genów w oocytach myszyzróżnicowaną ekspresję genów w oocytach myszy

Mejotyczna deacetylacja histonu H4K12 może być odpowiedzialna za Mejotyczna deacetylacja histonu H4K12 może być odpowiedzialna za przemodelowanie genomu oocytu w totipotencjalną zygotęprzemodelowanie genomu oocytu w totipotencjalną zygotę

WNIOSEKWNIOSEK

Aktywność kinazy p34 cdc2 wywołuje Aktywność kinazy p34 cdc2 wywołuje deacetylację histonu H4 podczas dojrzewania deacetylację histonu H4 podczas dojrzewania mejotycznego w oocytach myszy; stan ten mejotycznego w oocytach myszy; stan ten jest utrzymywany przez nowosyntetyzowane jest utrzymywany przez nowosyntetyzowane białka, które hamują działanie HAT podczas II białka, które hamują działanie HAT podczas II podziału mejotycznegopodziału mejotycznego

KONIEC