registro clinico per i pazienti con ischemia critica … · l’ischemia critica degli arti...

REGISTRO CLINICO PER I PAZIENTI CON ISCHEMIA CRITICA

NON RIVASCOLARIZZABILE DEGLI ARTI INFERIORI

(no option ctitical limb ischemia, CLI)

TRATTATI CON CONCENTRATO AUTOLOGO DI MIDOLLO OSSEO

Protocollo esecutivo

(27/12/1015)

Società Italiana di Chirurgia Vascolare ed Endovascolare

SICVE

Coordinatori (ricercatori principali)

Dr. Flavio Peinetti, Dr. Eugenio Caradonna

Commissione Scientifica di valutazione

Prof. Roberto Chiesa

Prof. Alessandro Cappelli

Prof. Franco Grego

Dr Pietro Modugno

Dr Potito Rosario Scalzulli

SICVE Terapia dell’ischemia critica non rivascolarizzabile con concentrato autologo di

midollo osseo

2

Dr. Flavio Peinetti

Presidente SICVE 2013/2015

Direttore Dipartimento Cardio-Toraco-Vascolare

Azienda USL Valle D’Aosta

Ospedale Regionale Umberto Parini

Viale Ginevra 3, Aosta

Tel. 0165543349

Cell. 348 22600336

335 203210

e-mail [email protected]

[email protected]

Dr. Eugenio Caradonna

Fondazione di Ricerca e Cura Giovanni Paolo II

Largo Gemelli 1 , Campobasso

Tel. 0874312320

email [email protected]

IRCSS Multimedica

Via Gaudenzio Fantoli, 16/15

20138 Milano

Prof. Roberto Chiesa

Direttore Chirurgia Vascolare

Ospedale Ospedale San Raffaele

mailto:[email protected]




midollo osseo

3

Via Olgettina 60, Milano

Tel. 03213733154


Prof. Alessandro Cappelli

SC Chirurgia Vascolare – Università degli studi di Siena

Ospedale Policlinico Santa Maria delle Scotte

Località Le Scotte, viale Bracci 16, Siena

Tel. 0577585234

email [email protected]

Prof. Franco Grego

Direttore Chirurgia Vascolare

Azienda Ospedaliera di Padovw

Via Giustiniani 2

35128 Padova

Tel. 0821/ 26361394


Dr. Pietro Modugno

Fondazione di Ricerca e Cura Giovanni Paolo II

Largo Gemelli 1, Campobasso

Tel. 0874312614

Email [email protected]






midollo osseo

4

Dr Potito Rosario Scalzulli

Dirigente SC Ematologia

IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza - San Giovanni Rotondo ( FG )

Tel. 0882 410566

Email: [email protected]

Sommario

INTRODUZIONE E SINOSSI 7

RAZIONALE DEL REGISTRO CLINICO 8

PRESUPPOSTI TEORICI E CLINICI E MECCANISMO D’AZIONE DELLE CELLULE STAMINALI

DERIVATE DAL MIDOLLO OSSEO. 10

FISIOPATOLOGIA DELL'ISCHEMIA CRITICA 13

ESPERIENZA CLINICA 15

RIASSUNTO DEI RISULTATI CLINICI E NON CLINICI RILEVANTI A SUPPORTO DEL

RAZIONALE DEL REGISTRO 19

VALUTAZIONE DI UN METODO POINT OF CARE PER LA CONCENTRAZIONE DI MIDOLLO

OSSEO AUTOLOGO 21

OBIETTIVO E FINALITÀ DEL REGISTRO 26

ENDPOINT PRIMARI E SECONDARI E LORO MISURAZIONE DURANTE IL REGISTRO 26

ARRUOLAMENTO DEI PAZIENTI 28

DESCRIZIONE DEI TRATTAMENTI 31



midollo osseo

5

DESCRIZIONE DEL PRODOTTO 36

DESCRIZIONE DELLA CONFEZIONE E DELLE ETICHETTE 38

SCADENZA DEL PRODOTTO 38

MODALITÀ CONSERVAZIONE/CRIOPRESERVAZIONE/SCONGELAMENTO 39

VALUTAZIONE DELL’EFFICACIA E SICUREZZA 39

RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI DATI 41

ANALISI STATISTICA 43

GESTIONE DEI DATI 43

PUBBLICAZIONE E COMUNICAZIONE DEI DATI. 44

BIBLIOGRAFIA 45


midollo osseo

6

Glossario dei termini

Ankle/Brachial index ABI

Bone marrow aspirate concentrate BMAC

Cellule Endoteliali progenitrici EPC

Colony Forming Unit CFU

Fibroblast Growth Factor FGF

Insulin Growth Factor IGF

Prostaglandin derivated Growth factor PDGF

Stromal Derived Factor SDF

Transcutaneous Oxygen Pressure TcPO2

Vascular endothelial Growth factor VEGF


midollo osseo

7

Introduzione e Sinossi

L’ischemia critica degli arti inferiori è un’emergenza sanitaria. L’incidenza in Italia è

di circa 15.000 pazienti, per il 30% dei quali non vi sono alternative terapeutiche ed è

indicata l’amputazione.

L’incidenza dell’ischemia critica dell’arto inferiore è in costante aumento a causa

dell’invecchiamento della popolazione 1, 2

Il numero delle amputazioni negli ultimi anni è uniforme nonostante lo sviluppo di

nuove tecniche chirurgiche ed endovascolari. È quindi necessario introdurre nella pratica

clinica terapie innovative 3 .

La terapia angiogenetica si è dimostrata potenzialmente efficace per ridurre l'incidenza

di amputazioni nell'ischemia critica non rivascolarizzabile.

La terapia angiogenetica è stata inserita nelle Linee Guida dell’American Heart

Association con evidenza II 4. La Società di Chirurgia Vascolare ed Endovascolare intende

creare un registro clinico al fine di: 1) seguire nel tempo i pazienti sottoposti alla terapia

angiogenetica e osservarne i risultati secondo gli end point stabiliti, 2) individuare i responder

vs i non responder, 3) controllare la corretta applicazione della terapia angiogenetica..

Al fine di garantire l’omogeneità dei dati sarà utilizzato come protocollo esecutivo il

protocollo della Fondazione di Ricerca e Cura Giovanni Paolo II (UCSC) già approvato dal

Centro Nazionale Trapianti e dal Consiglio Superiore di Sanità.

Il registro coinvolgerà 30 Centri di Chirurgia Vascolare (Allegato A).

Il point of care device (Harvest SmartPrep2) sarà utilizzato per il prelievo e la

centrifugazione del midollo osseo come previsto nel protocollo approvato. Il sistema ha avuto

recentemente la certificazione CE per l’utilizzo nella terapia dell’ischemia critica non

rivascolarizzable.


midollo osseo

8

Razionale del registro clinico

L’arteriopatia degli arti inferiori evolve frequentemente nell’ischemia critica degli arti

inferiori.

L’ischemia critica degli arti inferiori è presente quando vi è dolore a riposo, rischio di

perdita di tessuto o lesioni trofiche (classe Rutheford 4-6). La sindrome è associata a una storia

naturale sfavorevole con un esito caratterizzato da elevata mortalità e morbilità 5, 6.

Il 25% dei pazienti subisce l’amputazione dell’arto interessato e il 25% muore entro

l’anno dalla presentazione della patologia.

L‘incidenza in Italia è di circa 15.000 pazienti per il 30% dei quali non vi sono

ulteriori opzioni terapeutiche ed è indicata l’amputazione.

L’incidenza dell’ischemia critica dell’arto inferiore è in costante aumento a causa

dell’invecchiamento della popolazione 1,2. L’ischemia critica è una reale emergenza

epidemiologica. Nel 2010 sono state rilevate in Italia 12.295 amputazioni delle quali 7.373 in

pazienti diabetici e 4922 in pazienti non affetti da diabete.

Il rapporto annuale sull'attività di ricovero ospedaliero del Ministero della Salute

mostra che il tasso di ospedalizzazione per amputazione dell'arto inferiore in pazienti diabetici

è stato del 13,22 per cento nell'anno 2009 e del 13,17 per cento nell'anno 2010; secondo i dati

del Ministero, nel 2010 in Italia sono state rilevate ben 7.261 amputazioni riferite all’ischemia

critica complicanza del diabete con 137.148 giornate di ricovero ospedaliero. La degenza

media è stata di 18,9 giorni per paziente.

La Lombardia è la regione dove avviene il maggior numero di amputazioni: nel 2010

sono state registrate 1.599 amputazioni, con 24.542 giornate di degenza.

Negli ultimi otto anni, dal 2003 al 2010, sono state registrate 55.872 amputazioni con

1.097.562 giornate di degenza, per una degenza media di 19,6 giorni per paziente/diabetico.


midollo osseo

9

I costi sociali dell'amputazione degli arti inferiori sono enormi (tabella 1)

Tabella 1

:

Review of the cost of diabetes complications in Australia, Canada, France, Germany, Italy

and Spain (Curr Med Res Opin , 2005 vol. 21 (10) pp. 1617-1629).

L’importanza epidemiologica della patologia e dei costi sociali correlati è stata di recente

evidenziata dall’autorità politica *.

L'applicazione di cellule staminali autologhe derivate dal midollo osseo sì è rivelata una

terapia potenzialmente efficace e sicura per ridurre l'incidenza di amputazione nell'ischemia

critica non rivascolarizzabile 7, 8.

*ATTO SENATO interrogazione n. 4/68355 legislazione 16, seduta 809 4/10/2012

Senato interrogazione scritta 4/08355 seduta 809 4/10/ 2012, Legislazione 16


midollo osseo

10

Nel marzo del 2012 è stato approvato dal Consiglio Superiore di Sanità il protocollo di

ricerca inerente “l'applicazione del concentrato di midollo osseo autologo nell'ischemia critica

non rivascolarizzabile”.

La terapia angiogenica è stata inserita nelle linee guida dell'American Heart Association

(Class II) 4.. La SICVE intende quindi allocare in un apposito registro i pazienti sottoposti a

terapia con concentrato di midollo osseo n un apposito registro.

I pazienti inseriti nel registro saranno sottoposti a terapia con concentrato autologo di midollo

osseo secondo il protocollo del Centro Ricerca e Cura Giovanni Paolo II (UCSC) già

approvato dal Centro Nazionale Trapianti e dal Consiglio Superiore di Sanità. Il registro è

richiesto e sponsorizzato dalla Società Italiana di Chirurgia Vascolare ed Endovascolare.

Presupposti teorici e clinici e meccanismo d’azione delle cellule staminali derivate dal

midollo osseo.

La terapia chirurgica e/o endovascolare ha ridotto l'incidenza di amputazioni degli arti

inferiori nei pazienti con ischemia critica non rivascolarizzabile.

L'obiettivo del trattamento dell'ischemia critica degli arti inferiori è quello di migliorare

l'apporto di sangue nel tessuto ischemico.

Il 50% dei pazienti è trattabile con chirurgia standard o con approccio endovascolare.

Nei pazienti non suscettibili di trattamento chirurgico e/o endovascolare, sono stati utilizzati

fino ad oggi dei farmaci vasodilatatori, i prostanoidi, che hanno avuto un successo limitato

dato che è stato osservato un miglioramento del quadro clinico solo nel 50% dei casi trattati.

Nuove possibilità terapeutiche sono state oggetto di ricerca per alleviare il dolore,

migliorare l'autonomia di marcia e ridurre il numero di amputazioni nei pazienti con ischemia

critica non rivascolarizzabile.


midollo osseo

11

Asahara et al. hanno scoperto nel 1997, che una popolazione circolante di cellule

derivate dal midollo osseo (CD+34) contribuisce alla formazione di nuovi vasi 16, 17.

Questa popolazione cellulare, cellule endoteliali progenitrici (EPC), è coinvolta nei

processi fisiologici che portano alla formazione di nuovi vasi 18, 19.

Il contributo delle cellule staminali endoteliali progenitrici può essere considerato come

l'integrazione fisiologica al mantenimento dell'omeostasi endoteliale e parte essenziale del

processo patofisiologico di riparazione del danno ischemico. Le EPC sono presenti

nell’avventizia dei vasi, organizzate in strutture simili alle colony forming unit del midollo

osseo, assieme a cellule c-kit+ 20 21.

Cellule staminali progenitrici endoteliali con elevate capacità proliferative (ECFC) sono

presenti nei tessuti 22, 23.

L’attività paracrina delle EPC, ECFC, C-kit si svolge mediante la produzione di

citochine quali VEGF-A, FGF, IGF-1, che stimolano la vasculogenesi 24-28.

Le cellule EPC interagiscono direttamente con le popolazioni di cellule EPC, C-kit+, e con le

cellule ECFC presenti nell’avventizia dei vasi e nel tessuto.

Durante il processo di differenziazione le EPCs perdono il CD133+ ed esprimono

CD31+ e vascular endothelial cadherin-e 28-30. L'evento ischemico determina un complesso

processo patofisiologico nel tentativo di riparare il danno ischemico.

Le citochine rilasciate durante il danno ischemico interagiscono con le nicchie cellulari

del midollo osseo determinando la migrazione delle cellule endoteliali progenitrici nel tessuto

ischemico che avviene attraverso processi di adesione, proliferazione, differenziazione e

rilascio di citochine 24, 31, 32 (figura 1).


midollo osseo

12

Figura 1: mobilizzazione di EPCs dal midollo osseo per la neoangiogenesi; interazione delle

nicchie del midollo osseo, citochine e cellule endoteliali progenitrici. Asse nicchie midollo

osseo- area ischemica.

Le cellule EPC interagiscono con il tessuto ischemico richiamando e attivando le cellule

staminali del tessuto. Le piastrine sono parte integrante di questo processo 33 34. Le piastrine

interagiscono con i leucociti e con le EPC. Le piastrine esprimono fattori angiogenetici quali:

VEGF-A, Angiopoietina -1, PDGF e reclutano le cellule staminali dal midollo osseo

attraverso la secrezione di SDF-1 33, 35-38.

La presenza di una zona vasculogenica nelle arterie con cellule CD34+ che hanno la capacità

di formare arterie in colture in vitro ( E. Zengin et al. “Vascular wall resident progenitor cells:

a source for postnatal vasculogenesis.,” Development, vol. 133, no. 8, pp. 1543–1551, Apr.

2006). Pasquinelli et al. Hanno confermato la presenza di cellule della linea ematopoietica

CD34+ e di cellule mesenchimali che esprimono il c-Kit nella parete dell’aorta e dell’arteria

femorale e che in coltura, in presenza di VEGF, danno origine ad un network di capillari (S.

Valente, “The Emerging Issue of Human Resident Arterial Progenitors: The Contribution of

Organ Culture,” Ultrastruct Pathol, vol. 36, no. 2, pp. 117–123, Apr. 2012). Campagnolo et


midollo osseo

13

al. hanno isolato popolazioni di cellule CD34+ dall’avventizia di vena safena prelevata dai

pazienti sottoposto ad intervento di rivascolarizzazione miocardica. Queste cellule, quando

impiantate nell’arto ischemico di topi immunodeficienti, hanno stimolato l’angiogenesi alle

cellule endoteliali e migliorando l’ischemia dell’arto (P. Campagnolo, et al. “Human adult

vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and

proangiogenic potential.,” Circulation, vol. 121, no. 15, pp. 1735–1745, Apr. 2010). Le EPC

sono presenti nell’avventizia dei vasi, organizzate in strutture simili alle colony forming unit

del midollo osseo, assieme a cellule c-kit 23,20.

Cellule staminali progenitrici endoteliali con elevate capacità proliferative (ECFC) sono

presenti nei tessuti22.

Le cellule EPC e le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo sono quindi presenti nei

tessuti e nelle pareti dei vasi e svolgono la funzione di omeostasi e di risposta al danno

ischemico (asse midollo osseo-tessuto ischemico, omofunzione).

Nel diabete e nell'arteriosclerosi la mobilizzazione delle cellule staminali dal midollo

osseo è alterata. L'assenza di risposta all'evento ischemico e alla fisiologica omeostasi

vascolare è una delle principali cause dell'elevata incidenza delle patologie vascolari nei

pazienti diabetici 39, 40. La presenza delle cellule staminali ECFC, EPC nei tessuti è ridotta.

Recenti ricerche hanno evidenziato il ruolo dell'iniezione di cellule derivate dal

midollo osseo nell’area ischemica, nel ripristinare la risposta tissutale che permane costante

oltre la vita della componente cellulare 30, 41.

Fisiopatologia dell'ischemia critica


midollo osseo

14

I pazienti con ischemia critica presentano una riduzione di flusso a livello degli arti inferiore,

quantificato attraverso la misurazione del rapporto tra la pressione arteriosa a livello dell'arto

inferiore e di quello superiore 4 13,17.

La pressione arteriosa a livello dell'arto inferiore è superiore a 100 mmHg. Quando si

riduce la pressione di perfusione, l'apporto di ossigeno ai tessuti è diminuito.

I muscoli e la cute, che ricevono un insufficiente apporto di sangue e ossigeno, iniziano a

presentare i segni clinici d’ischemia. Uno dei primi segni d’ischemia è la comparsa di

claudicatio, che dipende dall'apporto insufficiente di sangue e ossigeno a livello delle logge

muscolari durante il camminare e l'esercizio fisico.

Il dolore da claudicatio cessa dopo pochi minuti di riposo. Se il quadro d’ischemia è più

severo, il dolore è presente non solo sotto sforzo, ma anche a riposo.

Quando la pressione arteriosa agli arti inferiori permane al di sotto di 60 mmHg per un

periodo prolungato di tempo, si instaura un quadro di ipoperfusione che porta all'insorgenza

di una necrosi e di un'ulcera 42.

L'instaurarsi di un quadro clinico d’ischemia critica richiede un intervento diagnostico

e terapeutico urgente al fine di salvare l'arto. Solo il 50% dei pazienti con ischemia critica

avanzata è suscettibile di rivascolarizzazione; di questi il 25% sono trattati con terapia medica

e medicazioni, mentre il restante 25% sono candidati a un intervento di amputazione d'amble'.

I pazienti presentano spesso co-morbilità quali: cardiopatia ischemica, bronco

pneumopatia cronica ostruttiva, diabete, insufficienza renale cronica.

La mortalità è del 20-40% entro 12 mesi dall'insorgenza dell'episodio acuto 43.

Nonostante le attuali possibilità terapeutiche, il 25% dei pazienti muore entro l'anno, il 30 %

migliora, il 25% andrà incontro ad amputazione e il 20 % vedrà un peggioramento

dell'ischemia critica. L’ischemia critica degli arti inferiori causa una perdita di funzione e di

sostanza del tessuto muscolare. La popolazione delle cellule satelliti del muscolo, deputate ai


midollo osseo

15

normali processi riparativi, è ridotta 44. La capacità di mobilizzazione delle cellule HSC dal

midollo osseo è alterata nei pazienti diabetici e/o arteriosclerotici 40.

L’iniezione di HSC, EPC, citochine e piastrine ripristina l’ambiente idoneo per l’angiogenesi

e i processi riparativi del muscolo. 45

Dei pazienti trattati con amputazione maggiore, solo il 32%, a un anno dall'intervento, riusce

a utilizzare una protesi per camminare.

I pazienti diabetici e i fumatori hanno una maggiore probabilità di essere amputati una volta

instaurato un quadro d’ischemia critica, rispetto a pazienti ipertesi e dislipidemici 43.

Esperienza clinica

Diversi studi hanno analizzato la sicurezza e l'efficacia clinica del preparato ottenuto con

point of care device, Harvest SmartPrep2, nella terapia della vasculopatia periferica in

pazienti per i quali i trattamenti convenzionali erano falliti. I risultati clinici sono stati positivi

7, 11, 46, 48, 56.

Presso il Centro della Fondazione di Ricerca e cura Giovanni Paolo II, Università Cattolica

del Sacro Cuore, Campobasso, sono stati trattati 18 pazienti nei quali la terapia convenzionale

(rivascolarizzazione, prostanoidi) era fallita con indicazione ad amputazione (Tabella 2

gruppo A) 52,67. I risultati clinici sono stati positivi. Non vi sono stati effetti collaterali.

Tabella 2 risultati clinici gruppo A


midollo osseo

16

Arruolamento Follow up a 3

mesi

Follow up a 6

mesi

Follow up a 12

mesi

Follow up a 24

mesi

Caso

1

Dolore a riposo

(9)

Migliorato (4) Migliorato (3) Scomparso (0) Scomparso (0)

Caso

2

Dolore a riposo

(7)

Scomparso (0) Scomparso (0) Scomparso (0) Scomparso (0)

Caso

3

Dolore a riposo

(10)

n.v. (PERSO) n.v. (PERSO) n.v.(PERSO) n.v. (PERSO)

Caso

4

Dolore a riposo

(10)


Caso

5

Dolore a riposo

(8)


Caso

6

Dolore a riposo

(9)

Migliorato (3) Migliorato (3) Migliorato (3) Migliorato (3)

Caso

7

Dolore a riposo

(10)

Migliorato (5) Amputata Moncone di

coscia

Moncone di

coscia

Caso

8

Dolore a riposo

(9)

Migliorato (1) Scomparso (0) Scomparso (0) Deceduta per

neoplasia

Caso

9

Dolore a riposo

(9)

n.v.

(deceduto)

n.v.

(deceduto)

n.v. (deceduto) n.v. (deceduto)

Caso

10

Dolore a riposo

(9)

n.v.

(deceduto)

n.v.

(deceduto)

n.v. (deceduto) n.v. (deceduto)

Caso Dolore a riposo Migliorato (5) Scomparso (0) Scomparso (0) Scomparso (0)


midollo osseo

17

11 (8)

Caso

12

Dolore a riposo

(8)

Migliorato (4) Scomparso (0) Scomparso (0) Scomparso (0)

Caso

13

Dolore a riposo

(8)

Migliorata (4) Scomparso (0) Scomparso (0) n.v.

Caso

14

Dolore a riposo

(7)

Migliorata (

3)

Scomparso (0) Scomparso (0) n.v.

Caso

15

Dolore a riposo

(8)

Migliorato (4) Scomparso n.v. n.v.

Caso

16

Dolore a riposo (

9)

Migliorato (2) Scomparso n.v. n.v.

Caso

17

Dolore a riposo

(8)

Migliorato (3) n.v. n.v. n.v.

Caso

18

Dolore a riposo (

9)

Migliorato (4) n.v. n.v. n.v.

In 17 casi si è evitata l'amputazione e l'esame angiografico eseguito a 6 mesi ha

evidenziato la formazione di nuovi vasi come dimostra l’angiografia di controllo a sei mesi

(Figura 2). La neoangiogenesi è confermata anche in altre esperienze cliniche 57. Nei 9

pazienti, gruppo di controllo (Tabella 3 , gruppo B), in terapia medica si sono verificate tre

amputazioni e una persistenza di lesione trofica. La qualità di vita dei pazienti è stata peggiore

(tabella 4).

Tabella 3 gruppo B


midollo osseo

18

Arruolamento Follow up

a 3 mesi

Follow up 6

mesi

Follow up 12

mesi

Follow up a 24

mesi

caso

1

Dolore riposo

( 9)

Migliorato

(5)

Persistenza (5) Amputazione

avampiede

Deceduto neoplasia

Caso

2

Dolore a

riposo (8)

Migliorato

(5)

Persistenza (5) Lesioni

trofiche (4)

Elettrostimolatore

midollare

Caso

3

Dolore a

riposo (7)

Migliorato

(4)

Migliorato (3)

con lesione

trofica guarita

Risultato

consolidato

Ricomparsa lesione

trofica e dolore (7)

Caso

4

Dolore a

riposo (9)

Migliorato

(3) Amputazione di

coscia

n.v. n.v.

Caso

5

Dolore a

riposo (9)

Migliorato

(4)

Lesioni trofiche n.v. n.v.

Caso

6

Dolore a

riposo (8)

Migliorato

(4) Persistenza (4)

+ lesione trofica

n.v n.v.

Caso

7

Dolore a

riposo (9)

Migliorato

(6)

n.v. n.v. n.v

Caso

8

Dolore a

riposo (9)

Migliorato

(6)

n.v. n.v. n.v

Caso

9

Dolore a

riposo (10)

n.v. n.v. n.v. n.v.

Turan et al. hanno iniettato in sede intracoronarica il concentrato di midollo osseo

(BMAC) ottenuto con il sistema point of care Harvest SmartPrep confermando la sicurezza

del concentrato 58,59

Figura. 2: Immagini angiografiche preoperatorie (A e C); follow up a sei mesi (B e D)


midollo osseo

19

A B

C D

Il BMAC ottenuto con il sistema Harvest è stato utilizzato in oltre 2500 casi di CLI.

Non sono stati riportati eventi dannosi (comunicazione Harvest)

Riassunto dei risultati clinici e non clinici rilevanti a supporto del razionale del registro


midollo osseo

20

Diversi studi in vivo, in modelli animali e nell'uomo, hanno documentato l'effetto positivo

delle EPCs, MSC, HSC derivanti dal midollo osseo nel trattamento di tessuti ischemici

mediante la formazione di vasi collaterali. 46, 47 48

L'efficacia terapeutica e la sicurezza del trapianto di cellule autologhe prelevate dal

midollo osseo nell’ischemia periferica, è stata dimostrata in numerosi lavori scientifici

13,16,19,21. Un’analisi completa dei trial clinici è presente nella tabella 4.

Tabella 4: Trial clinici con cellule staminali autologhe

derivate dal midollo osseo in NO-CLI

Autore anno Trial n Totale n Trattati n Controlli

Benoit 2011 RCT 48 34 14

Idei 2011 Cohort 97 51 46

Lu 2011 RCT 82 41 41

Madaric 2011 Case series 31 31 0

Murphy 2011 Case series 30 30 0

Perin 2011 Case series 10 10 0

Powell 2011 RCT 46 32 14

Ruiz-Salmeron 2011 Case series 20 20 0

Subrammaniyan 2011 Case series 6 6 0

Walter 2011 RCT w cross 40 19 21

Burt 2010 Case series 9 9 0

Higashi 2010 Case series 16 16 0

Horie 2010 Case series 162 162 0

Lara-Hernandez 2010 Case series 28 28 0

Mizuno 2010 Case series 8 8 0

Prochazka 2010 RCT 96 42 54

Amann 2009 Case series 51 51 0

Franz 2009 Case series 9 9 0

Kawamoto 2009 Case series 17 17 0

Moriya 2009 Case series 42 42 0

Chochola 2008 Case series 24 24 0

Cobellis 2008 Case series 10 10 0

De Vriese 2008 Case series 16 16 0

Matoba 2008 Case series 115 115 0

Motukuru 2008 Case series 36 36 0

Napoli 2008 Cohort 36 18 18

Van Tongeren 2008 Case series 27 27 0

Wester 2008 Case series 8 8 0

Zhang 2008 Case series 15 15 0

Bartsch 2007 Cohort 25 13 12

Hernandez 2007 Case series 12 12 0

Huang 2007 Case series 150 150 0

Saito 2007 Case series 14 14 0

Arai 2006 RCT 25 13 12

Durdu 2006 Case series 28 28 0


midollo osseo

21

Koshikawa 2006 Case series 7 7 0

Miyamoto 2006 Case series 8 8 0

Huang 2005 RCT 28 14 14

Ishida 2005 Case series 6 6 0

Lenk 2005 Case series 7 7 0

Higashi 2004 Case series 7 7 0

Huang 2004 Case series 5 5 0

Saigawa 2004 Case series 8 8 0

Esato 2002 Case series 8 8 0

Tateishi-Yuyama 2002 Case series 45 45 0

Come si nota i primi trial risalgono al 2002.

I pazienti con ischemia critica degli arti inferiori non suscettibili di rivascolarizzazione

chirurgica e/o endovascolare , trattati con concentrati cellulari estratti da midollo osseo

autologo, hanno mostrato rispetto ai controlli trattati con placebo, un netto miglioramento del

flusso sanguigno espresso clinicamente dall'aumento dell'autonomia di marcia, incremento

della saturazione tissutale d'ossigeno e significativa riduzione del dolore.

L'amputazione è stata evitata nel 75% dei casi 48-55.

Valutazione di un metodo point of care per la concentrazione di midollo osseo autologo

L’utilizzo di point of care device ha determinato la possibilità di avere il concentrato di

midollo osseo ottenuto nella stessa seduta per l’impianto nell’arto ischemico. La valutazione

della composizione e dell’efficacia è stata fatta con lo standard di riferimento. Appare quindi

utile riportare i dati presenti in letteratura.

Confronto del metodo Harvest verso lo standard di riferimento Ficoll

La metodologia Ficoll è stata utilizzata in modo estensivo per produrre concentrati di cellule

mononucleate derivate dal midollo osseo ed è considerata il gold standard.

La composizione cellulare ottenuta con il dispositivo Harvest SmartPrep2 differisce da quella

del metodo Ficoll. La composizione cellulare del sistema Ficoll contiene prevalentemente

cellule mononucleate (linfociti, eritroblasti e monociti) e pochi granulociti. E' importante

notare che tra i due sistemi cambia il contenuto di cellule mononucleate e anche la


midollo osseo

22

composizione cellulare. Nel sistema Ficoll, per esempio, sono di norma poco rappresentati i

proeritroblasti e i promieloblasti.

Le cellule staminali mesenchimali possiedono la capacità produrre colony forming unit (CFU)

e di migrare in risposta al SDF-1α (Stromal derivated factor). Tali specifiche qualità

sono maggiormente presenti nelle sospensioni eritrocitarie piuttosto che in una sospensione

monocellulare ricavata da aspirato midollare. Il sistema concentra l'intera popolazione

cellulare nucleata e le piastrine. Il metodo Ficoll prevede dei passaggi operatore dipendente

che sono del tutto eliminati con un sistema automatizzato point of care.

Questa tecnologia (SmartPrep, Harvest) è maggiormente efficace nel reclutare le cellule

mononucleate 62. Il sistema richiede 15' per ottenere il concentrato di midollo osseo.

Le differenze nella composizione sono illustrate nella Tabella 6.

Tabella 6: composizione cellulare dei due diversi sistemi Ficoll e point of care device.

Tipo cellulare % cellulare con Ficoll % percentuale cellulare Point of

care device (Smartprep

Harvest)

Mononucleari

Monociti/linfociti

85% 34%

eritrociti 10% 17%

granulociti 5% 54%

piastrine < 0.5% > 400%

Analisi della composizione cellulare


midollo osseo

23

Un'importante differenza tra i due sistemi è la diversa composizione del concentrato e in

particolare la presenza di piastrine e granulociti che caratterizza il concentrato ottenuto. Un

parametro importante della performance cellulare è la produzione di fattori di crescita.

Le concentrazioni di Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) sono state misurate nel

midollo osseo e nel BMAC.

La concentrazione di VEGF è aumentata di cinque volte nel BMAC.

Il processo di concentrazione non altera la capacità funzionale delle cellule nucleare e

l'elevata presenza di citochine favorisce il processo di neoangiogenesi 62 .

Le piastrine che i granulociti svolgono un ruolo chiave per l'induzione della

neovascolarizzazione 35, 37, 38.

Questo effetto è stato attribuito 63 all'aumentata presenza di fattori angiogenici

(principalmente VEGF) e citochine 64 .

Massberg e coll. hanno dimostrato che le piastrine giocano un ruolo importante nel reclutare

CD34+ e c-Kit Sca-1 cellule progenitrici di derivazione midollare nella zona del danno 37. Le

piastrine attivate producono una citochina molto potente, SDF-1α, che determina la

migrazione delle cellule progenitrici circolanti e del midollo osseo attraverso il legame con il

recettore specifico CXCR4.

Un altro effetto positivo della somministrazione di granulociti è dato dalla loro capacità di

produrre diversi fattori angiogenici ed in particolare VEGF 65.

Al fine di dimostrare che la composizione ottenuta con un sistema point of care (Harvest) è

uguale o migliore della composizione ottenuta con il metodo Ficoll è stato utilizzato un noto

modello di ischemia dell'arto posteriore nel topolino.

La composizione cellulare ottenute con i due metodi, era iniettata per via intramuscolare 24

ore dopo l'induzione di ischemia. La concentrazione della composizione cellulare era


midollo osseo

24

mantenuta costante diluendo il concentrato ottenuto con la centrifugazione point of care

(Harvest), la capacità di rigenerare il network vascolare dell'arto ischemico era esaminato 14

giorni dopo l'ischemia. Entrambi i gruppi trattati con Ficoll e il metodo point of care (Harvest)

dimostravano una permanenza di tessuto ischemico del 5%.

Tuttavia occorre precisare che, se il preparato point of care (BMAC, Harvest) era inoculato

senza diluizione, i risultati erano superiori al gruppo trattato con metodo Ficoll nella

rigenerazione vascolare.

Questo risultato sperimentale potrebbe essere dovuto alla presenza di piastrine e granulociti

nel preparato point of care (Harvest) 62.

I granulociti sono ricchi di VEGF che stimola le cellule CD 34+ a produrre EPC, le quali in

seguito danno origine a cellule endoteliali mature necessarie per la formazione di nuovi vasi.

Il concentrato ottenuto è ricco di citochine quali VEGF, SDF, Prostaglandine Derivated

Factor-AB 62 (tabella 7).

Tabella 7: chemochine e citochine presenti nel concentrato point of care (Harvest)

PDGF-AB

ng/mL

VEGF

pg/mL

SDF-1a

pg/mL

86.8± 8.2

687 ± 322

2301 ± 1561

L'importanza della capacità di migrare da parte delle cellule è stata dimostrata nel lavoro

pubblicato da Hermann 66. Questo studio ha dimostrato che la capacità di migrazione delle

cellule mononucleate del midollo osseo era l'unico fattore indipendente predittivo della i

neovascolarizzazione, come dimostrato nel modello ischemico dell'arto posteriore.


midollo osseo

25

A questo proposito, appare evidente dal risultato che la composizione ottenuta con il point of

care device (Harvest SmartPrep2) è uguale e forse superiore alla composizione Ficoll per la

capacità di migrazione cellulare.

L'analisi citofluorimetrica eseguita sul midollo osseo e sul concentrato di midollo osseo dei

soggetti da noi trattati, ha dimostrato la presenza di un panel completo di cellule staminali

della linea ematopoietica comprese le cellule c-kit nel concentrato di midollo osseo ottenuto

con la tecnologia point of care Harvest (Tabella. 8) .

Il Concentrato di midollo osseo ottenuto presenta tutte le componenti che sono parte

essenziale del processo di omeostasi e di riparazione del danno ischemico, ripristinando

l’ambiente naturale nei pazienti con alterato asse midollo osseo-tessuto.

Tabella 8: analisi citofluorimetrica aspirato midollare e concentrato point of care

(Laboratorio Analisi UCSC, Campobasso)

L’utilizzo di singole popolazioni cellulari non consente di ripristinare l’ambiente naturale

patofisiologico nel riparare il danno ischemico. Inoltre le cellule coltivate sono influenzate

dalle diverse metodologie di coltura. La coltura cellulare altera i recettori cellulari per le

citochine riducendo la capacità di insediamento nel tessuto (Nieto, J. C. et al. (2012).

PIASTRINECD34 CD34 CD133 CD133 CD309 CD309 CD309+133CD309+133CD309+34 CD309+34 CD117 CD117

(c-kit) (c-kit)

cell / 10-6 x L cell / 10-6 x L cell / 10-6 x L cell / 10-6 x L cell / 10-6 x L cell / 10-6 x L

PLT 115 1,409% 228 0,272% 44 0,024% 4,0 0,003% 0,5 0,008% 1,3 1,012% 164

PLT 725 1,227% 486 0,153% 60 0,011% 4,3 0,002% 0,8 0,003% 1,2 0,963% 381

PLT 85 1,432% 212 0,192% 28 0,003% 0,4 0,001% 0,1 0,001% 0,1 0,470% 69

PLT 395 1,576% 813 0,103% 53 0,014% 7,2 0,003% 1,5 0,003% 1,5 0,399% 206

PLT 109 0,664% 57 0,096% 8 0,010% 0,8 0,007% 0,6 0,007% 0,6 0,380% 32

PLT 641 0,879% 366 0,043% 18 0,027% 11,2 0,003% 1,2 0,003% 1,2 0,500% 208

PLT 99 1,778% 258 0,148% 21 0,014% 2,0 0,008% 1,1 0,008% 1,1 0,958% 139

PLT 401 1,970% 1315 0,156% 104 0,019% 12,6 0,013% 8,6 0,013% 8,6 1,286% 859

PLT 56 0,523% 44 0,125% 10 0,012% 1,0 0,001% 0,1 0,001% 0,1 1,151% 97

PLT 152 0,529% 140 0,078% 21 0,017% 4,5 0,005% 1,3 0,005% 1,3 1,176% 313


midollo osseo

26

Selective Loss of Chemokine Receptor Expression on Leukocytes after Cell Isolation. PloS

One, 7(3), e31297. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0031297).

Obiettivo e finalità del registro

Il Registro clinico, ha come scopo principale quello di valutare i risultati del concentrato di

midollo osseo utilizzando la tecnologia point of care Harvest SmartPrep2 BMAC, per la

terapia dell’ischemia critica non rivascolarizzabile nei pazienti che non hanno altre opzioni

terapeutiche. I risultati del registro e l’allocazione appropriata dei costi possono, inoltre

contribuire alla definizione di un DRG idoneo. Il sistema Harvest SmartPrep2 ha avuto il

marchio CE. In particolare tra le indicazioni per l’utilizzo elencate nella certificazione è

specificato: “per la terapia dell’ischemia critica degli arti inferiori non rivascolarizzabile (no-

option critical limb ischemia)”.

Endpoint primari e secondari e loro misurazione durante il registro

Gli end point e le modalità di misurazione sono stati individuati in accordo alla “Transatlantic

Conference on Clinical Trial Guidelines in Peripheral Arterial Disease : clinical trial

methodology (Circulation, 100 (17), e75-81,1999)”. Sono stati osservati i criteri stabiliti per

le terapie cellulari 60, 61 .

Gli obiettivi sono i seguenti (Tabella 5):

Obiettivo primario

1) Valutare gli effetti della somministrazione di concentrato di midollo osseo

autologo nella terapia dell’ischemia critica non rivascolarizzabile degli arti inferiori, in


midollo osseo

27

termini di percentuale di amputazione maggiore d’arto evitata (per una percentuale del

62%).

Obiettivi secondari

a) Valutare la sicurezza della somministrazione di concentrato di midollo osseo

autologo, nella terapia dell’ischemia critica non rivascolarizzabile degli arti

inferiori, in termini di percentuale di eventi avversi maggiori evitati (decesso,

infarto miocardico acuto, Stroke),

b) Valutare l’efficacia della somministrazione di concentrato di midollo osseo

autologo, nella terapia dell’ischemia critica non rivascolarizzabile degli arti

inferiori, in termini di miglioramento clinico soggettivo (riduzione del dolore

mediante scoring system, VAS) e oggettivo (TCPO2, indice di Windsor,

miglioramento delle lesioni trofiche, quadro angiografico),

Tabella 5

Endpoints clinici

Frequenza dell’amputazione

Tempo all’amputazione

Mortalità

Sopravvivenza senza amputazione

Amputazione maggiore (sopra la caviglia)

Tempo all’amputazione maggiore

Tutte le cause di mortalità

Tempo all’evento: amputazione maggiore

Endpoints funzionali

Classe di Rutheford Dolore Qualità della vita Guarigione dell’ulcera Treadmill test

Classificazione della gravità della patologia Misurato dalla Visual Analog Scale Misurata con VascuQol Cambiamento nelle dimensioni e numero delle ulcere Distanza di percorrenza libera dal dolore

Endpoints secondari

Ankle brachial index (ABI)

Rapporto tra pressione alla caviglia ed al braccio


midollo osseo

28

Pressione transcutanea di ossigeno (TCPO2) Angiografia

Valutazione non invasiva del flusso ematico Dimostrazione angiografica della neovascolarizzazione

Arruolamento dei pazienti

Nel registro saranno inseriti i pazienti con ischemia critica non rivascolarizzabile degli arti

inferiori selezionati e arruolati secondo criteri d’inclusione e esclusione, afferenti a 30

Centri di Chirurgia Vascolare ritenuti idonei sul territorio nazionale. I Centri sono stati

selezionati dal Consiglio direttivo della SICVE. I criteri individuati per la selezione dei

centri sono:

a) Unità Operativa di Chirurgia Vascolare con comprovata esperienza nelle

rivascolarizzazioni periferiche.

b) Partecipazione al Registro Nazionale SICVE degli Interventi Chirurgici

c) Presenza in sede delle Strutture di Ematologia e del Centro Trasfusionale e in

alternativa di apposita convenzione con il Servizio Trasfusionale di riferimento

territoriale

I pazienti per i quali è possibile la terapia ma che presentano controindicazioni alla stessa

saranno inseriti nel registro al fine di valutarne il percorso terapeutico secondo la miglior

terapia medica. A tutti i pazienti è proposta la scheda informativa e il consenso informato.

Criteri d’inclusione dei pazienti:

1) Diagnosi d’ischemia critica degli arti inferiori dovuta a PAOD non suscettibile

di trattamento chirurgico open, endovascolare o ibrido

2) Pazienti in cui è riscontrato almeno uno fra i seguenti criteri diagnostici:

a) occlusione dell’arteria alla caviglia con pressione assoluta <50 mmHg o


midollo osseo

29

ABI <0.4.

b) pressione a livello del dito del piede < 40 mmHg;

c) TcPO2 <20% in aria ambiente.

3) Impossibilità di trattamento chirurgico open, endovascolare o ibrido,

determinato in conformità a:

a) Criteri anatomici:

assenza di condotti;

presenza di occlusione segmentali lunghe e lesioni calcifiche

predittive di scarso risultato con approccio endovascolare o

chirurgico

b) Condizioni mediche di alto rischio:

angina instabile;

insufficienza renale;

c) Pregresso tentativo inefficace di rivascolarizzazione.

4) Età > 18 anni e capacità di comprendere il trattamento.

5) Il paziente deve aver compreso e accettato il consenso informato.

6) Il paziente arruolato in terapia con i seguenti farmaci deve mostrare

almeno un mese di stabilità dei relativi parametri ematochimici di riferimento:

Plavix/aspirina, TAO, statine, anti-ipertensivi.

7) Hct >=28%, GB <=14000/mmc, Plt >= 50000/mmc, INR <=1.6 o PTT <1.5

x controllo (per evitare sanguinamenti) N.B i pazienti in terapia con Coumadin

devono avere un INR <1.6 al momento dell’arruolamento.


midollo osseo

30

Criteri di esclusione dei pazienti:

1) Attesa di vita < 6 mesi per patologie collaterali.

2) Anamnesi positiva per malattie ematologiche (Linfomi Non Hodgkin, Linfomi

di Hodgkin, Sindromi mielodisplastiche) che impediscono il trapianto di midollo.

3) Insufficienza renale cronica in trattamento dialitico.

4) Neoplasie maligne o alterazione ai seguenti Test:

1. - PSA (se maschio >45anni);

2. - Rx torace (se età >50 anni);

3. - Mammografia (se donna > 40 anni);

4. - PAP test (se donna > 21 anni)

5) Diabete Mellito scompensato (emoglobina glicosilata > 10%).

6) Rischio anestesiologico elevato (ASA classe IV, V).

7) Lesione ischemica che mette a rischio la vita del paziente che necessita di

amputazione immediata.

8) Occlusione completa dell’asse iliaco non trattata, omolaterale al lato da

trattare.

9) Necrosi estesa dell’arto inferiore da trattare o altre condizioni che rendono

inevitabile l’amputazione dell’arto.

10) Infezione clinicamente attiva trattata con antibiotici entro 7 giorni

dall’arruolamento.

11) Trattamento con farmaci immunosoppressori (incluso Prednisone > di 5 mg /die).

12) Donne in gravidanza o allattamento o potenzialmente fertili.

13) Pazienti che hanno presentato un evento cardiovascolare maggiore (Stroke o

infarto miocardico acuto) nei 30 giorni precedenti la terapia con concentrato


midollo osseo

31

autologo di cellule staminali.

Descrizione dei trattamenti

Trattamento con la miglior terapia medica

La miglior terapia medica è intesa secondo le linee guida internazionali4 e la prassi del centro

Trattamento con il concentrato di midollo osseo

A) Modalità di raccolta del midollo osseo

Il midollo osseo viene prelevato in sala operatoria secondo le modalità tipiche di un espianto

di midollo osseo effettuato da professionisti medici qualificati. L’aspirato midollare viene

prelevato dalla cresta iliaca posteriore per un volume totale pari a 240 ml.

In breve:

Il materiale (siringhe, aghi da aspirazione, sacca da sangue) viene predisposto su un apposito

servitore sterile

Una soluzione anticoagulante, fisiologica eparinata (2000 IU/ml), viene preparata ed utilizzata

per il lavaggio del materiale da prelievo.

A seguito di un’incisione cutanea di circa 1 cm, si accede alla cavità midollare della cresta

iliaca posteriore mediante apposito ago dotato di stiletto

Rimosso lo stiletto e connessa una siringa di aspirazione, si aspirano 15 ml di midollo osseo

in ogni siringa, aspirando aliquote di circa 4-5 ml di midollo ad ogni retrazione dello

stantuffo. Tra una aliquota e la successiva, si riposiziona l’ago di aspirazione di circa 1 cm,

ruotandolo di 90 gradi.


midollo osseo

32

Prelevati 15 ml, si disconnette la siringa dall’ago di aspirazione, si trasferisce l’aspirato dalla

siringa alla sacca di raccolta e, connessa una nuova siringa si ripete il ciclo fino a raccogliere

il volume totale necessario di 240 ml.

A puro titolo esemplificativo, si riporta di seguito quanto descritto da Hermann e colleghi, a

seguito di 25 prelievi di 120 ml di aspirato midollare effettuati su donatori sani.

Midollo Osseo Aspirato (n=25, V= 120 ml)

Cellule nucleate totali (x 106/ml) 23.1 ± 5.0

Cellule mononucleate totali (x 106/ml) 4.51 ± 0.9

Cellule CD34+ (x 103/ml) 183 ± 60

Piastrine (x 103/µl) 103.3 ± 19.2

.

Un campione dell’aspirato di midollo osseo (1 ml) e un campione di concentrato (1 ml) sono

inviati al laboratorio di ematologia per l’analisi del contenuto e della funzionalità cellulare.

Un ml sarà inviato al laboratorio per verificare la sterilità del prodotto.

Effettuato il prelievo, il midollo osseo viene immediatamente processato mediante il sistema

point of care (Harvest SmartPrep2 BMAC) in 15 minuti e nella medesima sala operatoria, al

fine di eliminare i globuli rossi e concentrare cellule nucleate e piastrine nel plasma autologo

in un volume finale pari a 40 ml.

B) Metodo di preparazione del prodotto finale con la tecnologia SmartPReP2 BMAC di

Harvest Technologies.

SmartPReP2 BMAC di Harvest Technologies rappresenta una tecnologia integrata e

automatizzata per la produzione rapida e sicura al sito di cura di un concentrato di midollo

osseo aspirato.


midollo osseo

33

Componenti:

- centrifuga SmartPReP2, controllata da microprocessore interno, con capacità

di decantazione automatica. È dotata di un rotore ad ampolle basculanti,

specificatamente conformate per accogliere gli appositi contenitori a doppia

camera inclusi nel kit sterile monouso nei quali avviene la separazione secondo

gradiente di densità.

- Kit sterile monouso BMAC, include il materiale necessario alla procedura di

aspirazione del midollo osseo e la successiva concentrazione per

centrifugazione: siringhe ed aghi di aspirazione, sacca da sangue, dispositivo/i

di processamento (PD) a doppia camera per centrifuga, siringhe per procedura

di concentrazione e successiva somministrazione del concentrato midollare.

Descrizione del dispositivo a doppia camera per centrifuga (PD)

Il dispositivo di processamento è una provetta per centrifuga da 60 ml a doppia camera. Le

due camere sono identificate come segue:

“Camera Midollo (o posteriore)”: accessibile mediante un port rosso in gomma perforabile

auto-sigillante, è la camera in cui viene caricato l’aspirato midollare (60 ml per ogni PD) e

nella quale avviene la separazione della frazione eritrocitaria dal buffy-coat. Contiene un setto

semipermeabile flottante in grado di trattenere i globuli rossi nella camera.

“Camera Plasma (o anteriore”): accessibile mediante un port bianco in gomma perforabile

auto-sigillante, è la camera dove il buffy-coat viene trasferito per decantazione automatica.

Qui avviene la separazione per centrifugazione della componente corpuscolata (cellule

nucleate e piastrine) dal plasma povero.


midollo osseo

34

Descrizione del meccanismo di separazione e concentrazione

Il campione di aspirato midollare prelevato viene caricato nella camera posteriore della

provetta da centrifuga, che viene poi alloggiata nel rotore.

All’avvio, la centrifuga SmartPReP2 esegue un ciclo di centrifugazione della durata

complessiva di 15 minuti a due differenti velocità: 3 minuti a 2500 rpm e 9 minuti a 2300

rpm, separati da un periodo di arresto.

Durante la prima fase gli eritrociti sedimentano e passano attraverso il setto semipermeabile,

che si colloca automaticamente all’interfaccia plasma-eritrociti. Nella fase di arresto (alcuni

secondi) il buffy coat decanta per gravità nella camera anteriore, mentre il setto

semipermeabile trattiene gli eritrociti nella camera posteriore. La seconda fase di

centrifugazione opera la separazione della componente cellulare dal plasma.

Camera Midollo Camera Plasma


midollo osseo

35

Al termine della centrifugazione, la provetta viene estratta dalla centrifuga, il plasma in

eccesso rimosso dalla camera anteriore e la frazione cellulare risospesa nel volume di plasma

residuo, (pari a 10 ml per ogni 60 ml di aspirato processato); si ottiene così un Concentrato di

Midollo Osseo Aspirato (BMAC).

L’intero processo avviene in sterilità all’interno della singola provetta, senza che il campione

di midollo entri in contatto con liquidi diversi dal plasma autologo. Ciò, oltre a garantire la

sicurezza biologica del preparato, comporta un’elevata efficienza di recupero delle

popolazioni cellulari d’interesse (cellule totali nucleate e mononucleate, piastrine) e una

notevole riproducibilità; vengono infatti evitate le fasi di lavaggio del campione e si riducono

al minimo le operazioni manuali, eliminando la variabilità dipendente dall’operatore

comunemente associata a metodiche analoghe (separazione su Ficoll).

Il Sistema point of care device che ha ottenuto il marchio CE per questa procedura, cenrifuga

il midollo osseo, ottenendo un concentrato che è ricco di cellule EPCs, HSC, MSC, piastrine e

citochine, componenti fondamentali del processo di vasculogenesi. Le cellule, le piastrine e le

citochine sono nel loro ambiente naturale, il plasma62.

Un sistema point of care offre diversi vantaggi nella preparazione cellulare. L'aspirato è

collocato direttamente nel contenitore per la centrifuga nella sala operatoria. Non vi è

trasporto del midollo osseo al di fuori della sala operatoria. Il processo per ottenere il

concentrato è di circa 15’.

C) Modalità di applicazione del concentrato di midollo osseo

Prima di procedere all’iniezione del concentrato di midollo osseo si preleva un campione di

concentrato (1 ml) che verrà inviato al laboratorio di ematologia per l’analisi del contenuto e

della funzionalità cellulare. Un ml sarà inviato al laboratorio per verificare la sterilità del


midollo osseo

36

prodotto., occorre determinare l’area ischemica.

Il punto d’inizio dell’area da rivascolarizzare deve essere entro 4 cm dall’occlusione

dell’arteria in esame e i punti di iniezione vengono scelti nelle zone in cui l’irrorazione

arteriosa è assente o severamente compromessa.

Si segnano sulla gamba del paziente i punti d’iniezione (documentazione fotografica).

Le iniezioni devono essere eseguite a distanza di 1-2 cm l’una dall’altra, preferibilmente entro

1 cm dal letto vascolare da trattare, per una lunghezza complessiva di 40-80 cm e possono

essere eseguite sotto guida ecografica. La distanza tra un’iniezione e l’altra è funzione del

territorio da trattare. La distanza massima consentita è di 2 cm. Il numero di iniezioni è

quaranta. Le iniezioni devono essere regolate a seconda dell’ampiezza dell’area ischemica da

trattare tenendo presente i criteri enunciati.

Se è presente un’ulcera, le iniezioni andranno eseguite lungo i margini dell’ulcera a distanza

di circa 1-2 cm. Il volume di ogni iniezione di concentrato cellulare è di 1 ml (ago 21 G per la

gamba a una profondità di 1,5 cm, per la zona pedidia ago 26 G, a una profondità di 0.5-1

cm). I siti d’iniezione vengono in seguito coperti da garze sterili e la gamba avvolta anch’essa

da garze sterili.

Nel post-operatorio è eseguita profilassi antibiotica con Cefazolina 1 g entro un’ora

dall’iniezione (in caso di allergie a penicillina: Vancomicina 1 g. o Clindamicina 600 mg).

Nella nostra esperienza clinica e in quella riportata in letteratura non sono state descritte

complicanze. Il tempo medio di degenza è di circa 2 gg.

Descrizione del prodotto

Il prodotto finale (bone marrow aspirate concentrate, BMAC) ha una composizione pressoché

identica a quella dell’aspirato di midollo originariamente prelevato dal paziente. Le sole

differenze introdotte mediante il processo di centrifugazione sono l’eliminazione della


midollo osseo

37

maggior parte dei globuli rossi e la riduzione del volume di plasma in cui cellule e piastrine

sono risospese.

In uno studio di caratterizzazione effettuato da Hermann et al.66 si è dimostrato che la

composizione finale del BMAC, è identica in termini di sottopopolazioni cellulari a quella

dell’aspirato midollare.


midollo osseo

38

Si è inoltre definito il quantitativo di piastrine e di alcuni fattori di crescita contenuti nel

preparato.

Si è infine dimostrato che le cellule processate mediante la tecnologia SmartPReP2 BMAC

mantengono inalterata la loro vitalità e funzionalità, quest’ultima misurata mediante test di

formazione di colonie, test di migrazione in risposta a SDF-1 e capacità di sostenere e

stabilizzare la formazione di circoli collaterali in un modello animale di ischemia periferica.

(*)= Hermann PC et al. Concentration of Bone Marrow Total Nucleated Cells by a Point-of-

Care Device Provides a High Yield and Preserves Their Functional Activity. Cell

Transplantation 2008; 16: 1059-69.

Descrizione della confezione e delle etichette

Il prodotto finale viene immediatamente somministrato al donatore (autotrapianto)

nell’ambito della stessa procedura chirurgica, pertanto non è soggetto a

confezionamento ed etichettatura.

Scadenza del prodotto

Il prodotto finale viene somministrato dopo circa 20-30 minuti dal prelievo del

midollo osseo.


midollo osseo

39

Modalità conservazione/criopreservazione/scongelamento

La procedura non prevede conservazione, criopreservazione, scongelamento.

Valutazione dell’efficacia e sicurezza

Commissione scientifica di valutazione

Ogni paziente al primo controllo di follow-up dalla Commissione Scientifica di valutazione al

fine di definire la reale appartenenza al Gruppo ischemia critica non rivascolarizzabile.

La Commissione valuterà il corretto arruolamento dei pazienti per caratteristiche cliniche e

strumentali. Come deciso dalla Commissione e Consiglio della SICVE, la valutazione sarà

effettuata il mese successivo all’arruolamento al fine di non interferire con il giudizio clinico

del medico curante. I pazienti arruolati in modo giudicato non corretto saranno tolti

dall’analisi statistica.

La Commissione inoltre dovrà:

a) valutare la sicurezza e l’efficacia di tutti i pazienti inseriti nel registro, b) informare il CNT

immediatamente di ogni eventuale reazione o evento avverso verificatosi in un paziente.

Follow-up dei pazienti

I controlli di follow up sono previsti al mese 1, 3, 6 e 12.

Primo mese

1) Esame obiettivo locale;

2) esame emocromocitometrico ed esami ematochimici (GOT, GPT, creatinina,CPK,

PCR; Analisi citotofluorometrica cellule staminali ematopoietiche ematiche ( CD+

34,CD+133,CD+117,CD+45);

3) Ecocolordopper arterioso arti inferiori con determinazione ABI;


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4) Determinazione TcPO2;

5) Valutazione soggettiva del dolore e della qualità di vita (VascuQOL)

Terzo mese


2) esame emocromocitometrico ed esami ematochimici (GOT, GPT, creatinina, CPK,

PCR; Analisi citotofluorometrica cellule staminali ematopoietiche ematiche (

CD+34,CD+133,CD+117,CD+45);



5) Valutazione soggettiva del dolore e della qualità di vita (VascuQOL)

Sesto mese

Output dei dati


2) esame emocromocitometrico ed esami ematochimici (GOT, GPT, creatinina,CPK,

PCR; Analisi citotofluorometrica cellule staminali ematopoietiche ematiche (

CD+34,CD+133,CD+117,CD+45)



5) Treadmill test

Valutazione soggettiva del dolore e della qualità di vita (VascuQOL)


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Follow-up annuale e conclusivo

Output dei dati


2) esame emocromocitometrico ed esami ematochimici (GOT, GPT, creatinina, CPK,

PCR; Analisi citotofluorometrica cellule staminali ematopoietiche ematiche (CD+ 34,

CD+133, CD+117, CD+45);

3) ecocolordopper arterioso arti inferiori con determinazione ABI;

4) determinazione TcPO2;

5) valutazione soggettiva del dolore e della qualità di vita (VascQOL).

6) angio-RMN o Angio-TAC arti inferiori.

7) Treadmill test

Raccolta e conservazione dei dati

Tutti i dati saranno allocati in un database dedicato, secondo la normativa vigente che regola

la sicurezza e la privacy dei dati personali dei pazienti. Il database sarà tenuto dalla SICVE. Il

paziente sarà inserito esclusivamente con un codice dal medico responsabile dalla

sperimentazione.

Nel database per ogni paziente saranno inseriti i dati personali, clinici e la terapia utilizzata.

Ad ogni paziente inserito il sistema assocerà un codice identificativo univoco e a seconda del

personale che si connetterà al database (tramite accesso con password e livelli differenti)

saranno possibili procedure differenti.

I medici responsabili dei centri potranno inserire i dati dei pazienti e la terapia utilizzata. I

medici responsabili avranno accesso a tali dati ma non potranno vedere il codice univoco che


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42

il sistema genererà nel database per quel paziente al fine di garantire l’oscuramento dei dati ai

valutatori.

I medici che dovranno valutare i casi potranno invece accedere ai dati clinici del paziente solo

tramite codice univoco; questo per poter garantire la privacy e la riservatezza riguardo la

terapia utilizzata.

Il registro degli eventi avversi sarà tenuto dalla SICVE. Ogni centro che osserverà eventi

avversi gravi correlati alla terapia sarà tenuto a comunicarlo entro due giorni ai Coordinatori e

alla Commissione Scientifica che ne darà immediata comunicazione al Centro Nazionale

Trapianti.

I dati dei pazienti saranno riportati sul case report form (allegato B)

Il case report form è diviso in quattro parti.

Le modalità di compilazione del case report form sono:

a) Il case report form deve essere compilato in tutte le sue parti per i pazienti per i

pazienti trattati.

b) Il case report form deve essere compilato per i pazienti che presentano

controindicazioni e allocati alla miglior terapia per le parti I, IV (escludendo quindi la

parte inerente l’intervento).

c) Entrambi i case report form devono essere conservati nella documentazione del

paziente.

Tutti i dati previsti nel follow-up saranno inseriti nell’apposito database gestito dalla SICVE.

Al database avranno accesso:

i responsabili designati presso i singoli centri che avranno la responsabilità del

corretto inserimento dei dati nel database e della conservazione degli stessi in forma

cartacea secondo normativa vigente.


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i coordinatori del registro

Il responsabile del database, Dr. Paolo Servi, Responsabile Database Registro SICVE.

Il responsabile dell’analisi statistica

Tutti i dati in forma cartacea ed elettronica saranno conservati secondo la normativa vigente e

resteranno a disposizioni delle autorità competenti.

Analisi statistica

Gestione dei dati

La gestione dei dati e le analisi statistiche verranno condotte tramite l’uso del software

statistico SAS (SAS, 9.1.3 for Windows, Cary, NC: SAS Institute Inc.1989). La statistica sarà

eseguita per protocollo. Qualora possibile sarà eseguita un’analisi tra questo gruppo e coloro

che non sono stati sottoposti alla terapia sperimentale al termine del follow-up

La descrittiva del campione verrà presentata per tutti gli individui e per i due gruppi in

trattamento (Intervento e terapia medica). I dati continui verranno presentati come media ±

deviazione standard. Le variabili categoriche verranno presentate come frequenza e

percentuale. Per le variabili non distribuite normalmente verranno presentati mediana ed

interquartili. Le variabili continue che presenteranno skewness (asimmetria) positiva verranno

trasformate al logaritmo, e come tali analizzate. Le variabili non conformi alla distribuzione

normale neanche dopo opportuna trasformazione saranno comparate tramite test non

parametrici (Wilcoxon o Mann-Whitney U test).

Per confrontare le caratteristiche preoperatorie dei pazienti appartenenti ai due gruppi (miglior

terapia medica/trattamento con concentrato di cellule staminali autologhe), ad 6, 12, 24 si

utilizzerà il t Test di Student per i dati continui ed il χ2 test per i dati di categoria (Test esatto

di Fisher se compariranno celle con frequenza <6).


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L’incidenza di eventi avversi verrà comparata tra i due gruppi con il metodo di Kaplan-Meier

seguito da long-rank test, e tramite analisi logistica multivariata, corretta per eventuali

variabili di confondimento.

Al fine di valutare gli effetti del trattamento nel tempo, il confronto tra i due gruppi nei

cambiamenti dei differenti indicatori d’efficacia verrà effettuato tramite analisi della varianza

multivariata per misure ripetute, con ausilio del Greenhouse-Geisser F test nel caso di

variabili dipendenti continue.

La analisi statistiche verranno effettuate con il software SAS© (versione 8.12 for Windows,

Cary, NC: SAS Institute Inc.1989).

Pubblicazione e comunicazione dei dati.

I risultati clinici saranno resi pubblici a 3, 6, mesi e al termine del follow-up da parte della

SICVE.

Non è consentito ai singoli centri utilizzare i dati per pubblicazioni e comunicazioni

scientifiche individualmente.


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registro clinico per i pazienti con ischemia critica … · l’ischemia critica degli arti...

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