Bacillus pallidusD-AI (BpDAI)

Pseudomonas cichoriiD-TE (PcDTE)

Pseudomonas stutzeri L-RhI (PsRhI)

non-rare sugar

Rare sugar

23

D‐seriesL‐series

D‐Glucose

D‐Galactose

D‐PsicoseD‐Allose

D‐Mannitol

D‐Altrose

D‐AltritolD‐Talitol

D‐Talose

D‐Idose

D‐Tagatose

D‐Sorbose

D‐Mannose

D‐Iditol

L‐Idose

L‐ Iditol

Galactitol

Allitol

L‐AlloseL‐Psicose

D‐GulitolL‐Gulcitol

L‐Fructose

L‐Mannitol

L‐Mannose

L‐ Altrose

L‐Tagatose

L‐TalitolL‐Altritol

L‐Talose

L‐Gulose

L‐Sorbose D‐GulcitolL‐Gulitol

L‐Galactose

L‐Glucose D‐Gulose

D‐,L‐series

D‐Fructose

Izumoring

立体構造解析に基づく希少糖生産酵素の反応機構の解明

吉田裕美1, 吉原明秀2, 石井知彦3, 何森 健2,  神鳥成弘1

香川大学 1総合生命科学研究センター, 2希少糖研究センター, 3工学部

STUDY ON CATALYTIC REACTION MECHANISIMS OF ENZYMES FOR RARE SUGAR PRODUCTION BASED ON X-RAY STRUCTURES

Hiromi Yoshida 1, Akihide Yoshihara 2, Tomohiko Ishii 3, Ken Izumori 2, Shigehiro Kamitori 1

1 Life Science Research Center, 2 Rare Sugar Research Center, 3 Faculty of Engineering, Kagawa University

N-terminus→

←C-terminus

共同研究における参加学生 Students from collaborating groups

希少糖生産 Rare sugar production strategy

希少糖研究センター，工学部石井研究室からの参加学生とその共同研究の業績。

Students from collaborating groups, Rare Sugar Research Center (Faculty ofAgriculture) and Prof. Ishii’s lab. (Faculty of Engineering) and their publications.

共同研究による業績 Publication list with collaborating laboratories.1. Yoshida, H., Teraoka, M. Yoshihara, A., Izumori, K. & Kamitori, S. (2011). Overexpression, crystallization and preliminary X-ray diffraction

analysis of L-ribose isomerase from Acinetobacter sp. strain DL-28. Acta Crystallogr. Sect. F 67, 1281-1284.2. Kamitori, S., Ueda, A., Tahara ,Y., Yoshida, H., Ishii, T., Uenishi ,J. (2011) Crystal structures of rare disaccharides, α-d-glucopyranosyl β-d-

psicofuranoside, and α-d-galactopyranosyl β-d-psicofuranoside. Carbohydr. Res., 346, 1182-1185.3. Yoshida, H., Takeda, K., Izumori, K. & Kamitori, S. (2010) Elucidation of the role of Ser329 and the C-terminal region in the catalytic activity

of Pseudomonas stutzeri L-rhanmose isomerase. Protein Eng. Des. Sel., 23, 919-927.4. Takeda, K., Yoshida, H., Izumori, K. & Kamitori, S. (2010). X-ray structures of Bacillus pallidus D-arabinose isomerase and its complex with

L-fucitol. BBA - Proteins and Proteomics, 1804, 1359-1368.5. Yoshida, H., Yamaji, M., Ishi, T., Izumori, K. & Kamitori, S. (2010). Catalytic reaction mechanism of Pseudomonas stutzeri L-rhamnose

isomerase deduced from X-ray structures. FEBS J., 277, 1045-1057.6. Watanabe, Y., Yoshida, H., Takeda, K., Ishii, T. & Kamitori, S. (2009). -D-Altrose. Acta Crystallogr. Sect. E 65, o280.7. Takeda, K., Yoshida, H., Takada, G., Izumori, K. & Kamitori, S. (2008). Overexpression, purification, crystallization and preliminary X-ray

crystal analysis of Bacillus pallidus D-arabinose isomerase. Acta Crystallogr. Sect. F 64, 945-948.8. Yoshida, H., Yamada, M., Nishitani, T., Takada, G., Izumori, K. & Kamitori, S. (2007). Crystal Structures of D-Tagatose 3-Epimerase from

Pseudomonas cichorii and its Complexes with D-Tagatose and D-Fructose. J. Mol. Biol. 374, 443-353.9. Yoshida, H., Yamada, M., Nishitani, T., Takada, G., Izumori, K. & Kamitori, S. (2007). Purification, crystallization and preliminary X-ray

diffraction studies of D-tagatose 3-epimerase from Pseudomonas cichorii. Acta Crystallogr. F 63, 123-125.10. Yoshida, H., Yamada, M., Ohyama, Y., Takada, G., Izumori, K. & Kamitori, S. (2007). The structures of L-rhamnose isomerase from

Pseudomonas stutzeri in complexes with L-rhamnose and D-allose provide insights into broad substrate-specificity. J. Mol. Biol. 365, 1505-1516.

大山祐矢 Y. Ohyama農学部4年生2005.7 - 2006.3（希少糖研究センター）

山地理嗣 M. Yamaji工学研究科修士2年生2006.4 - 2007.3

武田耕青 K. Takeda愛媛大学連合大学院博士3年生2007.4 - 2010.3(希少糖研究センター）

西谷岳頼 T. Nishitani農学部4年生2006.4 -2007.3（希少糖研究センター）

渡部優史 Y. Watanabe工学研究科修士2年生2007.9 - 2009.3

田原康宏 Y. Tahara工学研究科修士2年生2009.4 - 2011.3

茅原静佳 S. Kayahara工学研究科修士1年生2011.4 -

Rare Sugars and Izumoring

工学部 石井研究室からの学生希少糖研究センターからの学生

1. Epimerization

HCOHHOCHR1

R2

R1

R2

3. Reduction

HCOHC=OR1

R2

R1

R2

2. Aldose-ketoseisomerization

HCOHC=OH2COH

R1

HC=O

R1

Rare Sugar Production Strategy by Three Enzymes from a Non-Rare Sugar D-fructose

D-Tagatose 3-epimerase (D-TE)

Pseudomonas cichorii D-Tagatose 3-epimerase(D-TE) catalyzes the epimerization of D-tagatoseto D-sorbose and is also able to epimerizebetween D-fructose and D-psicose.

D-Arabinose isomerase (D-AI)

D-Arabinose isomerase from Bacillus pallidus (D-AI) can catalyze the isomerization between D-arabinose and D-ribulose, L-fucose and L-fuculose and so on.

L-Rhamnose isomerase (L-RhI)L-Rhamnose isomerase from Pseudomonas stutzeri (L-RhI)catalyzes the reversible isomerization of not only L-rhamnoseto L-rhamnulose but also D-psicose to D-allose.

希少糖生産酵素 Enzymes for rare sugar production

単糖とは，糖の基本単位で，炭素原子3つ以上からなるポリヒドロキシアルデヒド（アルドー

ス）あるいはポリヒドロキシケトン（ケトース）である。その構造中，不斉炭素が多くあり，例えば，炭素原子６つからなるアルドースでは，D‐グルコース等のアルドヘキソースで16種，D‐フルクトース等のケトヘキソースで8種，計24種もの立体異性体が存在する。しかしながら，天然に存在する単糖はかぎられており，ヘキソースであれば，D‐グルコース，D‐フルクトース，D‐ガラクトース，D‐マンノースのみが多量に存在し，その他のものは，ごく微量にしか存在が確認でき

ない「希少糖」と呼ばれている。香川大学の希少糖研究センターでは，種々の単糖異性化酵素（エピメラーゼとイソメラーゼ）を用いて，天然に豊富に存在するD‐グルコースおよびD‐フル

クトースから，「希少糖」を大量に生産する技術開発に成功し，現在では，数多くの種類の希少糖が比較的安価で市販されるようになり，希少糖を用いた研究が可能となった。

Monosaccharides are polyhydroxy aldehydes (aldose) or polyhydroxy ketone (ketose)consisting of more than three carbons, being the most basic units of carbohydrates. Thepresence of many chiral centers gives rise to numerous potential stereoisomers.Hexoses, such as glucose, can exist as 16 aldohexose isomers, and as 8 ketohexoseisomers. Among them, D-glucose, D-fructose, D-galactose and D-mannose areabundant, and other hexoses are so-called “rare sugars” which exist in small amountsin nature. Rare Sugar Research Center, Kagawa university, succeeded in developmentof a rare sugar production strategy from D-glucose and D-fructose using enzymes(epimerases and isomerases). Now some of rare sugars can be supplyed as a low-costcommercial product, enabling the research using rare sugars.

希少糖の生産ストラテジーの最初の段階では，D‐フルクトースの3位をエピマー化（不斉炭素のキラリティーを反転）するエピメラーゼを用いてD‐プシ

コースを生産する。次に，ケトース⇔アルドースの異性化を行うイソメラーゼを作用させる。イソメラーゼの種類によってD‐アロースとD‐アルトロースが生じる。このように，エピメラーゼとイソメラーゼを順次作用させて，24種の

立体異性体が生産できる。さらに，それぞれの単糖を化学的に還元することにより10種の糖アルコールが合成でき，合計34種の単糖（ほとんどが希

少糖）生産ストラテジーが提案されている。本研究では，これら希少糖生産に用いられる酵素の立体構造を決定することにより、それらの希少糖を認識する機構および触媒反応機構を解明し，より選択的で効率的な希少糖生産酵素の分子設計を行うことを目指している。

The first step of the rare sugar production strategy is theepimerization of 3-carbon of D-fructose to produce D-psicose usingthe enzyme of 3-epimerase. The next step is the aldose-ketoseisomerization of D-psicose. Depending on the enzymes (isomerases),D-altrose or D-allose can be produced. By the combinations ofepimerization and isomerization of monosaccharides, total of 24stereoisomes of hexose can be obtained. Chemical reductions ofhexoses give 10 sugar alcohols. The X-ray structures of the enzymesfor rare sugar production have been determined to elucidate their raresugar recognition and catalytic reaction mechanisms. Furthermore,we have performed the molecular design for more effective rare sugarproduction based on the structural information.

立体構造解析に基づくD‐タガトース 3‐エピメラーゼの反応機構

吉田裕美1, 吉原明秀2, 石井知彦3, 何森 健2,  神鳥成弘1

香川大学 1総合生命科学研究センター, 2希少糖研究センター, 3工学部

STUDY ON CATALYTIC REACTION MECHANISM OF D-TAGATOSE 3-EPIMERASE BASED ON X-RAY STRUCTURESHiromi Yoshida1, Akihide Yoshihara2, Tomohiko Ishii3, Ken Izumori2 , Shigehiro Kamitori1

1Life Science Research Center, 2Rare Sugar Research Center, 3Faculty of Engineering, Kagawa University

予想される触媒反応機構 Proposed catalytic reaction mechanism

D-タガトース 3-エピメラーゼ D-Tagatose 3-epimerase

立体構造 X-ray structure of PcD-TE

1994年，D‐タガトースの3位のエピマー化を触媒する土壌菌Pseudomonascichorii由来D‐タガトース3‐エピメラーゼ（PcD‐TE）が香川大学希少糖研究センター

により発見された。それまで，リン酸化された単糖のエピメラーゼは見つかっていたが，フリーの単糖に作用するエピメラーゼの報告はなかった。さらに，PcD‐TEは，D‐タガトースだけではなく，D‐フルクトース（D‐タガトースの4位エピマー）にも作用しD‐プシコースを生成できることがわかった。このPcD‐TEの発見によって希少糖生産は飛躍的に進展した。

In 1994, Pseudomonas cichorii D-tagatose 3-epimerase (PcD-TE, 290amino acid residues, 32,615 Da) was found as the first epimerase for a freemonosaccharide as a substrate by Rare Sugar Research Center, KagawaUniversity, and it was also reported to have an ability to catalyzeepimerization of not only D-tagatose to D-sorbose, but also D-fructose to D-psicose. This enzyme was the first breakthrough for rare sugar production.

PcD‐TEは，2量体を形成する。その界面は疎水性の溝

になっており，基質は，まず，この溝に捕えられて，活性部位へと送られる。PcD‐TEは，活性部位にMn2+を持ち，Glu152，Asp185，His211，Glu246と配位結合を形成している。残り二つの配位座に，基質であるD‐タガトースの2位カルボニル酸素（O2）と3位の水酸基（O3）が配位結合を形成している。His188 とArg217が都合よくO1，O2と水素結合を形成し，基質の1，2，3位は，かなり厳密に認識されている。それに対して，基質の4，5，6位付近は疎水性ア

ミノ酸残基が配置されており，水素結合による認識はない。このことが，4，5，6位の基質認識を甘くしている原因であり，その結果，PcD‐TEはD‐タガトースとD‐フルクトースの双方を基質とすることができると考えられる。

The biological unit of PcD-TE is a homo-dimer,forming the hydrophobic groove reaching the activesites, which a accessible surface for substrate binding.PcD-TE requires the metal ion, Mn2+,for its catalyticactivity, which is coordinated with Glu152, Asp185,His211, and O2/O3 of a substrate. His188 and Arg217make hydrogen bonds with O1 and O2 of a substrate,strictly recognizing 1-, 2- and 3- positions of asubstrate. On the other hand, there are few specificinteractions between substrates and the enzyme atthe 4-, 5- and 6-positions, suggeting that PcD-TEloosely recognizes substrates at these positions. Thismay be a reason why PcD-TE can also efficientlycatalyze the epimerizations of D-tagatose and D-fructose.

PcD‐TEにおいては，基質をはさむように向かい合った2つのグルタミン酸，Glu152とGlu246が酸‐塩基触媒として働くことが予想される。まず，Glu246がC3位のプロトンを引き抜く。それにともない基質は平面構造を持ったcis‐エンジオレート反応中間体になり，O3位のプロトンがGlu152に引き抜かれると同時にGlu246からプロトンがO3に移る。最後にGlu152がC3をプロトン化して反応が終わる。結果的にC3とO3上にあったプロトンが交換されたことになるというC3‐O3 proton‐exchange機構が考えられる。

In the catalytic reaction of PcD-TE, two Glu residues facing each other atthe Mn2+ binding site are expected to act as acid/base catalysts. Uponsubstrate binding, Glu246 removes a proton from C3 to produce a cis-enediolate intermediate with a plane structure of O2-C2-C3-O3 that isstabilized by Mn2+. Subsequently, proton transfer possibly occurs fromGlu246 to O3 and from O3 to Glu252 at the same time. Finally, Glu152protonates C3. Consequently, protons of C3 and O3 are exchangedthrough the catalytic reaction.

HCOH

HCOH

C=O

CH2OH

HCOH

CH2OH

HCOH

C=O

CH2OH

HCOH

HOCH

CH2OH

D-psicose

D-sorbose

C=O

CH2OH

HOCH

HCOH

HOCH

CH2OH

D-tagatose

HCOH

HOCH

C=O

CH2OH

HCOH

CH2OH

D-fructose

Epimerization catalyzed by PcD-TE

290 amino acid residuesR = 0.176 at 1.79 Å resolution

Glu246Glu152

1

23

4

5

6

O

O

O

R1

R2

HH O

O

O

Mn2+

O

O

O

R1O

R2

O

O

Mn2+

H H

O

O

O

R1

R2

OH

O

O

Mn2+

O

R1O

R2

H

O

O H

Mn2+

O

O

H

--

-

--

Glu246

Glu152

Glu246

Glu246

Glu152

Glu152

Glu152 -Glu246

2

3

3

3

3

2

2

2

Mn2+

D-fructose

Proposed catalytic reaction mechanism of PcD-TE.

Based on the ene-diolate intermediate,C3-O3 proton exchange mechanism.

Biological unit of dimer of PcD-TE

Substrate

Substrate

1

6

Arg217

Leu108

Glu246

Trp15

His188

Cys66

Trp113

Asp185

Glu152

His211Phe248

Phe7

5

43

2

C=O

CH2OH

HOCH

HCOH

HOCH

CH2OH

D-tagatose

HCOH

HOCH

C=O

CH2OH

HCOH

CH2OH

D-fructose

Active site structures with bound D-tagatose and D-fructose.

Loose recognition

Subunit structure of PcD-TE

1

6

Arg217

Leu108

Glu246

Trp15

His188

Cys66Trp113

Asp185

Glu152

His211Phe248

Phe7

5

3

2

4

立体構造解析に基づくL‐ラムノースイソメラーゼの反応機構

吉田裕美1, 吉原明秀2, 石井知彦3, 何森 健2,  神鳥成弘1

香川大学 1総合生命科学研究センター, 2希少糖研究センター, 3工学部

STUDY ON CATALYTIC REACTION MECHANISM OF L-RHAMNOSE ISOMERASE BASED ON X-RAY STRUCTURESHiromi Yoshida1, Akihide Yoshihara2, Tomohiko Ishii3, Ken Izumori2 , Shigehiro Kamitori1

1Life Science Research Center, 2Rare Sugar Research Center, 3Faculty of Engineering, Kagawa University

予想される糖開環を含めた触媒反応機構 Proposed catalytic reaction mechanism including sugar-ring opening

L-ラムノースイソメラーゼ L-Rhamnose isomerase

立体構造 X-ray structure of PsL-RhI

L‐ラムノースイソメラーゼは，L‐ラムノース（アルドース）とL‐ラ

ムヌロース（ケトース）との間の異性化反応を可逆的に触媒する酵素である。土壌菌Pseudomonas stutzeri由来L‐ラムノースイソメラーゼ（PsL‐RhI）は，L‐ラムノースの他，D‐アロース⇔D‐プシコースの異性化反応も触媒することからD‐プシコースからD‐アロースの生産に使われている。

L-Rhamnose isomerase catalyzes the reversibleisomerization of L-rhamnose (aldose) to L-rhamnulose(ketose). Pseudomonas stutzeri L-Rhamnose isomerase(PsL-RhI) is capable of the isomerization between D-allose and D-psicose, and it has been attracting muchattention regarding the industrial production of rare sugar,D-allose from D-psicose.

PsL‐RhI は，4量体を形成する。Mol‐AとMol‐B，およびMol‐CとMol‐Dの界面は深い溝になっていて，基質は，まず，この溝に捕えられて活性部位へと送られる。PsL‐RhIの活性部位には2つMn2+が存在し，これらはアミノ酸残基，水分子，基質により6配位8面体構造をとっている。基質のO1，O2，O3は，金属イ

オンと配位結合するとともに，周囲のアミノ酸残基と水素結合を形成しており，酵素により厳密に認識されている。L‐ラムノースのO4はAsp327と，O5はHis101と水素結合している。一方，D‐プシコースのO4はHis101と，O5はAsp327と，それぞれ水素結合を形成している。 PsL‐RhIは，基質の4，5位のキラリティーの反転に対して，His101とAsp327が逆に働いて基質を認識することができ，このことが，D‐プシコース/D‐アロースを基質とできる要因となっている。

The PsL-RhI forms a homo-tetramer composed of fourmolecules (Mol-A, Mol-B, Mol-C and Mol-D). The pairs ofMol-A/Mol-B and Mol-C/Mol-D form an accessible surfacefor substrate-binding, on the opposite side to each other.PsL-RhI requires two metal ions (Mn2+) for its catalyticactivity, which are coordinated in a distorted octahedralform with six coordination bonds from the enzyme, water,and a substrate. O1, O2, and O3 of a substratecoordinate to the metal ions , and form many hydrogenbonds with the enzyme, helping to fix the substrate in theappropriate conformation for the catalytic reaction. O4and O5 of L-rhamnose make a hydrogen bond withAsp327 and His101, respectively, while O4 and O5 of D-psicose with His101 and Asp327, respectively. Thismeans that PsL-RhI can recognize substrates withdifferent configurations of C4 and C5, by using His101and Asp327, and vice versa.

変異酵素を用いて，反応の各ステップで止まった X線構造を得ることにより，糖開環を含む反応機構の詳細について明らかにした。まず，6員環構造をもつ基質（L‐ラムノピラノース）が酵素の活性部位に結合して，基質のO1，O2，O3が金属イオンと配位結合する（A）。金属イオンに配位している水分子（W1）が酸塩基触媒となり，6員環が開く。基質のC3‐C4結合まわりにtorsion角が回転し，基質と酵素との間で水素結合が形成され，基質が固定される。ふたたびW1が酸塩基触媒となりプロトンをO2からO1に移し，C2からC1へhydride（水素イオン）が移動する。この際，移動するhydride（H2あるいはH1）はTrp179によってカバーされている（B）。2位にカルボニル基が移動した基質は，O5がC2を求核的にアタックすることによりケトースを生成，酵素から離れていく。

Using mutant PsL-RhIs, the complete catalytic reaction mechanism includingsugar-ring opening could be deduced. -L-rhamnopyranose forms the metal-coordination with O1, O2 and O3, and a catalytic water molecule (W1) transfersa proton from O1 to O5 to open the pyranose-ring (A). The conformation of thelinear substrate changes with the rotation around C3-C4, and the hydride-shiftfrom C2 to C1 occurs with the transfer of a proton from O2 to O1 assisted by acatalytic water molecule (W1) (B). After the isomerization to L-rhamnulose, O5nucleophilly attacks C2 to form -L-rhamnulofuranose, being released from theenzyme (C).

Isoimerization reaction catalyzed by PsL-RhI

430 amino acid residuesR = 0.163 at 1.60 Å resolution

Complete catalytic reaction mechanism including sugar-ring opening of PsL-RhI

Biological unit of tetramer of PsL-RhI

L-rhamnose D-psicose

Active site structures with bound L-rhamnose and D-psicose

Subunit structure of PsL-RhI

W1Mn2

Mn1

W1Mn2

Mn1W1

Mn2

Mn1

O

H

Mn2+

O

O

O

O

OH

H

Mn2+

H

H

OMn2+

OH

O

O

O

Mn2+

H

OH

HH

H

O

H

Mn2+

OH

O

O

OH

Mn2+

H

H

O12

34

5

1

23

45

1

23

45

BA C

Trp179Asp327→ Asn

OMn2+

OH

O

O

O

Mn2+

H

H

OH

H

H1

23

45

H O

H O

H OH

OH H

OH H

CH3

H

H OH

OH H

OH H

CH3

O

O

H

H H

O CH2OH

OH

OH

OH

CH3

O

OHOH

OHCH3 OH

L-rhamnose L-rhamnulose (-L-rhamnulofuranose) (-L-rhamnopyranose)

D-allose D-psicose (-D-psicofuranose) (-D-allopyranose)

Mol-AMol-B

Mol-C

Mol-D

His257Lys221

Trp179

His101Trp57

Asp291

Asp327

W1

Mn2

Mn1

His257

Lys221

Trp179

His101Trp57

Asp291

Asp327

Ser→Lys329

W1

Mn2

Mn1

HC=O

HCOH

HCOH

HOCH

HOCH

CH3

CH2OH

C=O

HCOH

CH2OH

HCOH

HCOH

1

2 3

4 5

6

1

2 3

45

6

O

OH H

R1

HOMn2+

H

O

R1

O HH

H

OMn2+ H

1

2

1

2

Trp179

Mn2+

Mn2+

OH- H11

2

3

45

6

Hydride-shift mechanism

NH

NH

Substrate

Substrate

Substrate

Substrate

Mol-A Mol-B

Mol-CMol-D

Ser→Lys329

Accessible surface for substrate-binding by Mol-A/Mol-B

Sub-binding site for a substrate

Active site of Mol-B

O

OHOH

OH

OH

OH

H O

H OH

H OH

H OH

H OH

CH2OH

CH2OH

H OH

H OH

H OH

CH2OH

O

O

CH2OH

OH

OHOH

CH2OH

立体構造解析に基づくD‐アラビノースイソメラーゼの反応機構

武田耕青1,2, 吉田裕美1, 何森 健2,  神鳥成弘1

香川大学 1総合生命科学研究センター, 2希少糖研究センター

STUDY ON CATALYTIC REACTION MECHANISM OF D-ARABINOSE ISOMERASE BASED ON X-RAY STRUCTURESKosei Takeda1,2, Hiromi Yoshida1, Ken Izumori2 , Shigehiro Kamitori1

1Life Science Research Center, 2Rare Sugar Research Center, Kagawa University

予想される触媒反応機構 Proposed catalytic reaction mechanism

D-アラビノースイソメラーゼ D-Arabinose isomerase

立体構造および反応機構 X-ray structure catalytic reaction mechanism of BpD-AI

D‐アラビノースイソメラーゼは，D‐アラビノース（アルドース）とD‐ラム

ヌロース（ケトース）との間の異性化反応を可逆的に触媒する酵素であり， L‐フコースにも作用することから，L‐フコースイソメラーゼとも呼ばれている。Bacillus pallidus由来D‐アラビノースイソメラーゼ（BpD‐AI）は，D‐アラビノースの他，D‐アルトロース⇔D‐プシコースの異性化反応も触媒することからD‐プシコースからD‐アルトロースの生産への応用が期待されている。

D-Arabinose isomerase catalyzes the isomerization of D-arabinose (aldose) to D-ribulose (ketose). It is also called L-fucose isomerase due to the capability of the isomerizationbetween L-fucose and L-fuculose. Bacillus pallidus (BpD-AI) cancatalyze the isomerization of D-altrose to D-psicose, as well as D-arabinose to D-ribulose and L-fucose to L-fuculose, and it hasbeen attracting much attention regarding the industrial productionof rare sugar, D-altrose from D-psicose.

Isoimerization reaction catalyzed by BpD-AI

Biological unit of hexamer of BpD-AI

Subunit structure of BpD-AI

120 Å

99 Å

Mol-B

Mol-A

Mol-C

Mol-D

Domain 1(Rossmann fold)

Domain 2(Rossmann fold)

Domain 3(distorted b/a barrel)

595 amino acid residuesR = 0.170 at 1.60 Å resolution

H O

OH H

H OH

H OH

CH2OH

H OH

OH H

CH2OH

O

CH2OH

H O

OH H

H OH

H OH

OH H

CH3

CH2OH

H OH

H OH

OH H

CH3

O

H O

OH H

H OH

H OH

H OH

CH2OH

CH2OH

H OH

H OH

H OH

CH2OH

O

D-arabinose D-ribulose

L-fucose

D-altrose

L-fuculose

D-psicose

HOCH

HCOH

HCOH

HOCH

CH3

CH2OH

D-altrose

HC=O

HOCH

HCOH

HCOH

HCOH

CH2OH

L-fucitol

Active site structures with bound L-fucitol (inhibitor), and D-altrose.

X-ray structure Modeling structure

Trp95*Met190

Arg23*

Tyr444

Pro121*

His532

Glu342

Asn531

Asp366

Val124*

Gln307

Mn1

O2

O4

O1

O3

O5Trp95*

Met190

Tyr444

Pro121*

His532

Glu342

Asn531

Asp366

Val124*

Gln307

Mn1

O2

O4

O1

O3

O5

Arg23*

O6

Catalytic reaction mechanism of BpD-AI

Mn2+Glu342Asp366

L-fucitol

1

2

3 4

5

BpD‐AI most likely adopts the ene-diol mechanism.O

O

O

O

H

R1

O

OH

HH

Mn2+

Mn2+

O

OH

O

O

Mn2+

H

O

O

O

O

R1

H

H

HO

O Mn2+

H

O

HO

R1

HO

O

H

O

O

O

O

R1

HH

H

-Glu342

Asp366

-Glu342

1

2

2

1Asp366

Glu342

2

1Asp366

Glu342

2

1Asp366-

Accessible surface for substrate-binding at the interface of Mol-A/Mol-B/Mol-D

BpD‐AIは，一辺120 Å高さ99 Åの三角柱形の 6量体を形成する。活性部位は6つあり，3分子の界面（例えばMol‐A/Mol‐B/Mol‐D）に位置する。BpD‐AIは，活性部位にMn2+を持ち，Glu342，Asp366，His532，および基質の1，2位水酸基（O1とO2）と配位結合を形成している。Gln307，Asp366，Asn531 は，基質のO1，O2，O4，O5と水素結合を形成し，基質をかなり厳密に認識している。L‐フシトール複合体のX線結晶解析の結果から，D‐アルトロースが結合した状態をモデリングすることができる。D‐アルトロースの1位から5位水酸基は，L‐フシトールと同じ構造で酵素に結合し，6位の‐CH2OH基は，Tyr444，Trp95，Pro121によって形成されている疎水領域に位置することが予想される。このモデルは，D‐アルトロースあるいはD‐プシコースが基質としてBpD‐AIに結合できるということを示している。

BpD-AI forms a homo-hexamer with a triangularprismatic shape, 120 Å in length and 99 Å in height,having six active sites. One active site is located at theinterface between Mol-A, Mol-B, and Mol-D. BpD-AIrequires the metal ion, Mn2+, for its catalytic activity,which is coordinated with Glu342, Asp366, His532, andO1/O2 of a substrate. Gln307, Asp366 and Asn531 makehydrogen bonds with O1, O2, O4, and O5 of a substrate,strictly recognizing 1-, 2-, 4-, 5- positions of a substrate.A model of the enzyme bound to D-altrose could bededuced from the X-ray structure of the complex with L-fucitol. O1 to O5 of D-altrose form the same interactionswith the enzyme as the bound L-fucitol, and C6 and O6 ofD-altrose could be located at the hydrophobic spacesurrounded by Tyr444, Trp95 and Pro121, giving aplausible model for the enzyme recognizing D-altrose.

Substrate

SubstrateSubstrate

Substrate

Substrate

Substrate

Substrate

Mol-E

Mol-F

Mol-AMol-B

Mol-DMol-F

Substrate

BpD‐AIにおいては，基質をはさむように向かい合ったグルタミン酸（Glu342）とアスパラギン酸（Asp366）が酸‐塩基触媒として働くことが予想される。まず，Glu342がC2のプロトンを引き抜き， Asp366がO1にプロトンを与え，基質は平面構造を持ったcis‐エンジオール反応中間体となる。次に，Asp366がO2からプロトンを引き抜き，Glu342がC1にプロトンを与えてケトースを生成する。

In the catalytic reaction of BpD-AI, Glu342 and Asp366 facing each otherat the Mn2+ binding site are expected to act as acid/base catalysts. Uponsubstrate binding, Glu342 removes a proton from C2 and Asp366 gives aproton to O1, producing a ene-diol intermediate with the planar structureO1–C1–C2–O2 that is stabilized by Mn2+. Then, a proton transfers from O2to Asp366, and Glu342 protonates C1, to produce a ketose.

Mol-A

Mol-B

Mol-D