RAPPORT DE STAGE

Sur le thème : Les Staphylocoques isolés des hémocultures de patients fébriles

présenté par

RAKOTOZANDRINDRAINY Njariharinjakamampionona

Doctorant en Microbiologie

Encadreurs :

Pr RAHERIMANDIMBY Marson

Pr RAKOTOZANDRINDRAINY Raphaël

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Remerciements

Avant tout, ma reconnaissance s’adresse au BON DIEU qui m’a toujours guidé et m’a mené là où j’en suis maintenant, la gloire est à lui Seul.

« Par la grâce de Dieu, je suis ce que je suis et sa grâce envers moi n’a pas été vaine »

I. Cor. 15 : 10

Je tiens à remercier toutes les personnes qui ont contribué à la réalisation de mon stage et qui

m'ont aidé lors de la rédaction de ce rapport, notamment pour les instructions émises par les

comités scientifiques.

J’adresse mes remerciements à l’Equipe G/DHD dirigée par Mr le VPFR qui a permis la

collaboration avec le PNUD, l’UNESCO et l’Université d’Antananarivo.

Mes remerciements s’adressent également à notre encadreur académique en la personne du

Pr RAHERIMANDIMBY Marson, Doyen de la Faculté des Sciences, à notre encadreur

professionnel Pr RAKOTOZANDRINDRAINY Raphaël.

Je remercie également toute l'équipe du laboratoire de l’ESSAGRO qui a facilité nos tâches

lors de la réalisation des activités de laboratoire.

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Sommaire

INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1

I. OBJECTIFS ............................................................................................................................ 3

I.1 Objectifs scientifiques : ..................................................................................................... 3

I.2 Objectifs scientifiques escomptés après le stage : ............................................................. 3

II. Cadre d’étude ......................................................................................................................... 4

III. MATERIELS ET METHODOLOGIE ................................................................................. 4

III.1 Matériels utilisés ............................................................................................................. 4

III.1.1 Matériels de laboratoires .......................................................................................... 4

III.1.2 Matériels de collecte des données ............................................................................ 5

III.2 Type d’étude ................................................................................................................... 5

III.3 Période d’étude ............................................................................................................... 5

III.4 Activités de recherches ................................................................................................... 5

III.4.1 Recherches bibliographiques ................................................................................... 5

III.4.2 Commande et approvisionnement en réactifs et consommables ............................. 6

III.4.3 Activités de laboratoire ............................................................................................ 6

III.5 Retranscription des résultats dans des cahiers d’enregistrement .................................... 8

IV. RESULTATS ....................................................................................................................... 9

IV.1 Résultats de l’identification des staphylocoques ............................................................ 9

IV.1.1 Identification à partir des colonies sur les milieux de culture ................................. 9

IV.1.2 Résultats des tests biochimiques (galeries API Staph) .......................................... 10

IV.1.3 Résultats de l’antibiogramme ................................................................................ 10

V. ACQUIS PERSONNELS .................................................................................................... 11

VI. CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................... 12

Références bibliographiques ....................................................................................................... I

ANNEXES ................................................................................................................................ II

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LISTE DES ANNEXES

Annexe n° 1 : Aspect microscopique des Staphylocoques après coloration de Gram .............. II

Annexe n° 2 : Aspect macroscopique des colonies de Staphylocoques .................................... II

Annexe n° 3: Galeries API STAPH mettant en évidence des réactions positives ................... III

Annexe n° 4: Antibiogramme mettant en évidence la sensibilité des souches aux antibiotiques

testés ......................................................................................................................................... III

1

INTRODUCTION

Ce stage s’inscrit dans le cadre d’un accord de Coopération entre le PNUD,

l’UNESCO, les Universités et les équipes de la Gouvernance et du Développement Humain

Durable (G/DHD). Les travaux ont été réalisés dans le laboratoire de Microbiologie de

l’ESSAGRO à Ankatso.

Madagascar de par sa situation dans la ceinture intertropicale constitue un terrain de

prédilection pour les infections microbiennes. Parmi ces infections, les staphylococcies

occupent une place de choix. Ce sont des infections ubiquitaires dues à des bactéries du genre

Staphylococcus qui restent un problème majeur de santé publique dans le Monde. Les

staphylocoques sont des bactéries impliquées dans des pathologies variées et souvent

responsables d'infections contractées dans les hôpitaux.

Le genre Staphylococcus de la famille des Micrococcaceae correspond à des cocci, Gram

positif, non capsulés, groupés en tétrades ou en grappe de raisin, très résistants dans le milieu

extérieur et peu exigeants en culture.

Les réservoirs naturels des staphylocoques sont constitués par l’homme et les animaux à sang

chaud, cependant, éliminées dans le milieu extérieur, ces bactéries très résistantes sont

fréquemment retrouvées dans l’environnement (eau, sol, air, aliments, objets

Selon l’aptitude à produire une coagulase, on distingue le staphylocoque coagulase positive,

Staphylococcus aureus le plus rencontré en pathologie communautaire et les staphylocoques

coagulase négative (SCN) tels que Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus

saprophyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus capitis,… pouvant être également

responsables de maladies chez l’homme, notamment en milieux hospitaliers. ). Le traitement

est difficile car de nombreuses souches sont multi résistantes aux antibiotiques.

Le choix de notre thème a été guidé par l’ampleur des conséquences néfastes de cette

maladie dans la santé humaine, en effet la prise en charge de cette maladie découle de la

qualité des démarches diagnostiques et thérapeutiques, d’où l’intérêt de la réalisation de ce

stage qui a permis d’acquérir et d’approfondir les connaissances pratiques et théoriques sur

les moyens de diagnostic des staphylocoques ainsi que la détermination des molécules

indispensables à la prise en charge thérapeutique de ces maladies.

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La question qui se pose concerne la répartition des différentes espèces de

Staphylocoques pouvant être répertoriées à Madagascar, en effet les études récentes sur

l’identification des différentes espèces de staphylocoques sont rares dans notre pays d’où

l’intérêt de cette étude qui permettrait d’avoir des données préliminaires sur les

staphylocoques dans le zone d’Antananarivo.

Devant l’ampleur des infections dues aux Staphylocoques ainsi que leur présence effective

dans l’environnement, l’étude sur ces agents pathogènes s’avère indispensable afin de réduire

la morbidité liée à leur infection de l’homme, pouvant entrainer des conséquences néfastes du

point de vue socio-économique,

Cette étude revêt un aspect fondamental et pratique compte tenue de l’apparition des

résistances bactériennes aux antibiotiques et de l’élaboration de nouvelles molécules

d’antibiotiques.

Le choix de notre thème de recherche contribue à l’amélioration de la Gouvernance et

le Développement humain Durable (G/DHD) puisqu’un être humain ayant un état de santé

précaire ne pourra pas assurer pleinement sa participation dans les projets de développement

de son pays du fait de son incapacité à travailler correctement et du coût élevé du traitement

lié à la maladie.

Ainsi, l’intérêt porté sur l’acquisition des démarches diagnostiques et thérapeutiques des

maladies infectieuses telles que les staphylococcies en vue du bien être des patients

correspond aux thématiques de la G/DHD.

Dans un premier temps, des recherche bibliographiques ont été effectuées, ensuite les activités

de laboratoire ont été réalisées successivement jusqu’à l’obtention des résultats préliminaires.

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I. OBJECTIFS

I.1 Objectifs scientifiques :

Identifier les espèces des staphylocoques à coagulase négative

Déterminer les antibiotiques sensibles aux espèces identifiées

I.2 Objectifs scientifiques escomptés après le stage :

Acquérir les techniques d’identification de staphylocoques

Acqu2rir la capacité de la pratique du test de sensibilité aux antibiotiques

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II. Cadre d’étude

Notre stage a été effectué dans le laboratoire de Microbiologie de l’ESSAGRO situé dans

l’enceinte de l’Université d’Antananarivo à Ankatso. Ce laboratoire a été fondé en 1990

grâce au soutien financier de la Suisse, sous la direction du Docteur Vétérinaire

TYBERAENC, le Professeur RAKOTOZANDRINDRAINY Raphaël a dirigé le laboratoire

depuis 1993.

En 1996, la coopération française a contribué pour un appui technique et financier. Une

réhabilitation du laboratoire a été réalisée en 2007 par l’Union Européenne.

Ce laboratoire constitue un site d’accueil des étudiants qui effectuent des stages et des

travaux pratiques de Microbiologie et de Parasitologie, les activités entrent dans le cadre des

formations et de recherches sur les diverses maladies infectieuses et parasitaires courantes

dans notre pays, notamment pour les mémoires de fins d’études et les thèses de Doctorat.

III. MATERIELS ET METHODOLOGIE

III.1 Matériels utilisés

III.1.1 Matériels de laboratoires

Consommables : gants masques, Öse, pipettes de transferts stériles, Bec Bunsen

Matériels utilisés pour l’identification des colonies

o Milieux de culture : gélose au sang coulée dans des boites de Pétri en plastique

et en verre

o Réactifs : colorants (Gram), huile à immersion, produits antiseptiques

o Etuve à 37°C

o Microscope optique à l’objectif x 100

Matériels utilisés pour l’identification par les tests biochimiques

o Galeries API STAPH

Matériels utilisés pour les tests de sensibilité aux antibiotiques

o Disques d’antibiotiques

o Milieux de culture

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III.1.2 Matériels de collecte des données

Cahier d’enregistrement, ordinateur complet avec les logiciels Word et Excel 2007

III.2 Type d’étude

Il s’agit d’un stage qui figure dans le cadre d’une étude prospective descriptive effectuée

après accord du comité d’éthique et avec le respect de la confidentialité des patients.

III.3 Période d’étude

Comme ce stage figure parmi les activités de recherche de la thèse, la plupart des activités de

laboratoire ont été déjà initiés depuis le mois de Janvier 2014, ce stage constitue ainsi la

continuité de nos travaux depuis cette date jusqu’à ce jour.

III.4 Activités de recherches

Les activités de recherche ont déjà débuté depuis quelques mois, et grâce à l’appui de la

G/DHD et tous les collaborateurs, nous pouvons continuer à mener à bien nos activités

notamment celles qui sont effectuées en laboratoire et qui nécessitent des financements pour

pouvoir être effectuées dans les meilleures conditions, ceci dans un but d’avoir les meilleurs

résultats possibles.

Nos activités de recherche ont été initiées par des recherches bibliographiques et se sont

inspirés des recherches déjà entreprises par d’autres chercheurs afin de pouvoir apporter plus

d’amélioration dans la qualité de notre travail.

III.4.1 Recherches bibliographiques

Les recherches bibliographiques ont été effectuées à partir de la consultation des ouvrages

scientifiques (articles et livres) ou des documents sur internet ; elles ont été axées sur

l’identification des souches de Staphylocoques et sur les différentes modalités de réalisation

de l’antibiogramme à partir des souches de staphylocoques isolées.

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III.4.2 Commande et approvisionnement en réactifs et consommables

Après la détermination des réactifs et des consommables indispensables à la réalisation des

activités de laboratoire, une commande auprès des fournisseurs a été réalisée afin de faciliter

l’approvisionnement.

III.4.3 Activités de laboratoire

i. Echantillonnage

Les souches étudiées ont été obtenues à partir du sang des patients fébriles ayant effectué des

hémocultures en vue d’une analyse bactériologique.

ii. Isolement et identification des souches de Staphylocoques

Pratique de la culture d’une centaine de souches de staphylocoques en vue de leur

isolement

o Principe : isolement des staphylocoques à partir des colonies avec

détermination des caractéristiques :

macroscopiques : aspect morphologique des colonies (consistance,

couleur, relief)

et microscopiques : aspect morphologique à l’examen direct au

microscope après coloration Gram (cf Annexe n°01)

o Technique :

Ensemencement en stries sur les milieux de culture type gélose au sang

coulés dans des boites de Pétri en verre

Puis incubation dans l’étuve à 37°C

o Résultat attendu : apparition des colonies en 24 ou 48 heures (cf Annexe

n°02)

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Identification des espèces de staphylocoques par tests biochimiques API STAPH

(Kit d’identification fourni par Biomérieux)

o Principe :

Il s’agit d’un test biochimique miniaturisé comportant 20 microtubes et

qui utilisent des tests d’acidification ou d’assimilation des sucres et des

tests enzymatiques

Ces galeries consistent essentiellement à l’identification des espèces de

staphylocoques à coagulase négative.

o Technique :

Inoculation d’une suspension bactérienne (obtenue à partir des souches

isolées de la culture) dans les microtubes de la galerie

Puis incubation à 37°C dans l’étuve pendant 18 à 24 heures.

o Lecture de la galerie après incubation suivant un tableau de lecture (fourni

avec le kit).

o Résultat attendus et interprétation :

Détermination des virages colorés

• une couleur rose franche ou violette ou rouge indique une

réaction positive

• une couleur rose pâle ou rose claire indique une réaction

négative (cf Annexe n°03)

Identification à partir du profil numérique (après addition des valeurs

correspondant à des réactions positives)

Puis réalisation à l’aide d’un catalogue analytique ou d’un logiciel

apiweb (nécessitant une connexion à l’internet).

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iii. Test de sensibilité aux antibiotiques des souches de staphylocoques

isolées

Ce test consiste à la réalisation de l’antibiogramme vis-à-vis des antibiotiques définis à

partir des souches de staphylocoques isolées.

Utilisation de disques d’antibiotiques

o Principe : il consiste à mettre les colonies de bactéries en présence des

antibiotiques à tester pour pouvoir observer les conséquences de la présence des antibiotiques

sur le développement ou la survie des bactéries testées.

o Intérêt : outil d’orientation de certaines souches difficiles à identifier car il

permet la détermination de la résistance ou de la sensibilité des staphylocoques vis-à-vis

d’une molécule d’antibiotiques.

o Technique : elle consiste à placer plusieurs pastilles (disques) imbibées

d’antibiotiques sur les souches de staphylocoques ayant été ensemencées sur les milieux de

culture ayant été coulés dans des boites de Pétri stériles.

o Résultats attendus et interprétation : on peut distinguer trois types

d’interprétation selon le diamètre du cercle qui entoure le disque d’antibiotiques (cf Annexe

n°04 ) pour la détermination des souches de staphylocoques sensibles, intermédiaires ou

résistants.

III.5 Retranscription des résultats dans des cahiers d’enregistrement

Chaque étape des activités de laboratoires et chaque résultat obtenu ont été régulièrement

retranscrits dans des cahiers d’enregistrement avant d’effectuer la saisie et le traitement des

données.

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IV. RESULTATS

Il serait utile de préciser que les résultats obtenus à l’issue de cette étude permettraient

d’établir de nouveaux moyens d’identification des différentes espèces de Staphylocoques à

Madagascar et pourraient être également extrapolés vers d’autres études qui pourraient être

menées dans les autres régions de Madagascar. De plus, les procédures de laboratoire

pourraient être améliorées en fonction du budget disponible pour le déroulement de cette

étude.

Comme ce stage constitue une partie des travaux déjà effectués dans le cadre de la thèse de

Doctorat, l’intégralité des résultats sera communiquée ultérieurement.

IV.1 Résultats de l’identification des staphylocoques

IV.1.1 Identification à partir des colonies sur les milieux de culture

Figure n°01 : Proportion des souches de Staphylocoques identifiées à partir de la culture

Près de la moitié des souches ensemencées soit 47,6% ont permis d’isoler et d’identifier des

Staphylocoques.

POSITIVE

NEGATIVE

47,6% 52,4%

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IV.1.2 Résultats des tests biochimiques (galeries API Staph)

Parmi les souches isolées à partir des colonies, 67% ont été identifiées comme

Staphylocoques Coagulase Négative par les tests biochimiques API STAPH après 18 heures

d’incubation à 37°C.

Ce test a également permis de déterminer une dizaine d’espèces de staphylocoques dont la

publication sera effectuée ultérieurement.

IV.1.3 Résultats de l’antibiogramme

Certains disques d’antibiotiques indispensables au test de sensibilité des

Staphylocoques étant encore en attente de livraison, les résultats de ce test sont en cours et

seront également présentés ultérieurement.

La liste des antibiotiques testés est représentée ci-dessous :

Amoxicilline/Clavulanate

Ampicilline

Ceftazidime

Ceftriaxone

Chloramphénicol

Ciprofloxacine

Acide nalidixique

Triméthoprime/ sulfaméthoxazole

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V. ACQUIS PERSONNELS

Ce stage initié par l’équipe de la G/DHD a renforcé notre conviction sur la nécessité

de l’intérêt porté sur le bien être de l’homme, en effet du fait de notre responsabilité

quotidienne qui consiste aux analyses biologiques des échantillons des patients dans l’unité

paraclinique de formation et de recherche d’un Centre hospitalier Universitaire

d’Antananarivo, les activités liées à ce stage nous permettent de nous concentrer un peu plus

sur notre obligation et de notre part de responsabilité dans l’élaboration des stratégies plus

efficaces et plus adaptées aux situations réelles dans divers domaines médicaux en vue d’une

participation effective à l’amélioration du concept du développement humain durable.

De plus, la réalisation de ce stage nous a permis d’avancer un peu plus vite dans nos

démarches pratique et surtout académiques car les activités liées à ce stage nous ont permis

de nous rendre compte d’une ouverture sur d’autres moyens de diagnostic plus pertinents.

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VI. CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Pour conclure, ce stage s’est avéré bénéfique pour l’avancement de nos recherches de

thèse car sa réalisation a grandement facilité la suite de nos travaux de recherche aussi bien

sur le plan pratique que sur le plan académique.

En effet, à l’issue de cette étude, la détermination des différentes espèces de staphylocoques

constitue un intérêt majeur en Santé publique et un apport scientifique non négligeable, du fait

de l’identification de nouveaux éléments de diagnostics et de thérapeutiques pouvant être

appliqués en pratique.

Comme la plupart des activités de laboratoire ont été déjà effectuées depuis le début

de l’année, ce stage nous a permis de nous concentrer un peu plus sur les meilleurs moyens

pour innover nos travaux de thèse et pour étoffer les connaissances déjà acquises au cours des

activités précédentes.

Ainsi, nos perspectives consistent à l’utilisation d’autres techniques plus innovantes et

plus spécifiques en termes de diagnostic telles que :

Test de sensibilité aux antibiotiques sur galeries ATB STAP

o Principe : détermination de la sensibilité des staphylocoques aux antibiotiques

en milieu semi-solide dans des conditions très proches de la technique de

référence (dilution en gélose).

o Principal intérêt : amélioration de la détection des mécanismes de résistance

faiblement exprimés

Application des techniques de biologie moléculaire dans l’identification des

espèces de Staphylocoques

o Principe détection de l’ADN et de l’ARN d’un agent infectieux à partir d’une

simple copie d’une séquence particulière d’acides nucléiques qui peut être

spécifiquement amplifiée

o Principal intérêt : méthode rapide, sensible et spécifique

I

Références bibliographiques

1. Courvalin P. et al. Antibiogramme. Ed. Eska 2006 Paris 117-279

2. Denis F. et al. Ed MASSON 2007. Issy -Les - Moulineaux. Bactériologie médicale.

Techniques usuelles.

3. FRENEY J. et al. Précis de bactériologie clinique 2ème édition, éditions ESKA. PAYS

2007, p795-839

4. Joffin J.N., Leyral G. Microbiologie TECHNIQUE. Tome 1. Dictionnaires des

techniques. Centre Régional de Documentation Pédagogique d’Aquitaine. Bordeaux,

2006. p 325

Webographie

1. http://www.ansespro.fr/eurl-staphylococci/

2. http://www.biomerieux.com

II

ANNEXES

Annexe n° 1 : Aspect microscopique des Staphylocoques après coloration de Gram

Annexe n° 2 : Aspect macroscopique des colonies de Staphylocoques

III

Annexe n° 3: Galeries API STAPH mettant en évidence des réactions positives

Annexe n° 4: Antibiogramme mettant en évidence la sensibilité des souches aux antibiotiques testés