~) ELSEVIER Ann. Inst. Pasieur/Virol. Paris 1985 1985, 136 E, 391-403

RAGE ET Gt~NIE GI~NI~TIQUE : D~VELOPPEMENT DE NOUVEAUX VACCINS

par M. P. Kieny e), R. Lathe (1), y . Lemoine (1), R. DriUien (~), T. J. Wiktor (s), H. Koprowski (3) et J. P. Lecocq (~)

(I) Transg~ne S. A., 11, rue de Molsheim, 67000 Strasbourg, (~) lnstitut de Virologie, 1NSERM 74, 67000 Strasbourg (France) el

(3) Wistar Institute, Philadelphia (USA)

INTRODUCTION.

La lut te contre la rage demeure ~ l 'heure actuelle une preoccupation importante dans le monde [4].

Si la rage ~ des rues ,~ a progressivement disparu des pays industfialises gr~cc notamment ~ la vaccination des animaux domestiques et ~ une police sanitaire efficace, la rage ~ sauvage ou sylvatique ~ reste toujours importante et s'est revelee recemment en pleine expansion. Certains animaux sauvages sembleut constituer actuellement les r~servoirs privilegi~s du virus rabique : les renards en Europe, les ratons-laveurs aux t~tats-Unis, les chauve-souris en Amerique du Sud, pour ne citer que quelques exemples. Le contr61e de la maladie est, de ce fait, ext remement difficile et preoccupe de plus en plus les autorit~s de sant~ [21.

D'autre part , dans les pays en vole de developpement, la rage reste un probl~me r~el de sant6 publique. Certes, il existe d'excellents vaccins h usage humain [22] mais leur cofit elev6 constitue toujours un frein fi leur emploi generalis6.

L'elaboration de nouveaux vaccins antirabiques, qui, tou t en ~tant tres efficaces, auraient un prix de revient peu eleve, est donc for tement souhaitee.

Le genie genetique se presente comme l 'approche de choix pour le developpe- ment de tels vaccins. En effet, ces nouvelles techniques permettent , suite au clonage des g~nes correspondants, d exprimer des proteines virales dans differentes cellules hetes (comme revues, voir [7] et [14]). Ces antig~nes, exempts de tout materiel virulent [10, 25] ou inseres dans des systemes biologiques nouveaux [15, 16, 19], peuvent constituer la base de nouveaux vaccins.

Le virus de la rage est un rhabdovirus ; il contient un ARN simple brin (de sens negatif) codant pour 5 proteines differentes : L, N, M1, M2 et G [26]. La glyco- proteine (G) est le seul composant du virus capable d'induire la synth~se d anticorps s4roneutralisants et de eon%rer une protection efficaee.

Un nouveau vaccin devra doric imperat ivement contenir cet antigone viral sur lequel, par consequent, s'est coneentr6 tou t le programme cc g~nie genetique )).

Un tel programme, et c'est le cas pour tous les vaccins approches par cette tech- nologie, est en general long et complexe. L'expression des genes viraux doit en effet 6tre 6tudiee dans differentes cellules hOtes (Escherichia coli, levures ou cellules animales) car il est reguli~rement observe (pour une revue voir [10]) que le rende- ment, la structure et l'antig6nicit6 des proteines virales exprimees varient consi- derablement d'une cellule ~ l 'autre (fig. 1).

Nous decrirons ici la strategie experimentale basee sur l 'utilisation de l 'antigene de surface du virus de la rage. Les r~sultats obtenus demontrent tres clairement que des vaccins antirabiques de nouvelle generation peuvent ~tre developpes grfice aux techniques du genie genetique.

392 M. P. KIENY ET COLL.

STRATEGIE GENERALE

AntigOne viral

1 C]onage de I'ADN ou de I'ADNc

correspondant

1 Expression dans diff~rentes

cellules-h6tes

[Cellules animales I

Purification Virus de I la vaccine

Tests sur animaux 4r-"

(avec ~preuve)

Choix

FiG. 1. - - Straldgie gdndrale utilisde pour l'dlaboration d'un vaccin par [es techniques de gdnie gdndlique.

RESULTATS.

Clonage el expression de I'ADNc codanl pour la glycoproldine rabique dans Escherichia coli.

L'ADNc correspondant h la prot6ine G du virus de la rage (souche ERA) a 6t6 clon~ pour la premiere fois fi l ' Inst i tut Wistar de Philadelphie [1].

Cet ADNc code pour une prot6ine de 524 acides amin6s comportant respective- ment, aux cOt6s NH~- et COOH-terminaux, des s6quences d excr6tion et d ancrage relativeraent classiques (fig. 2).

I~AGE ET GISNIE GI~NI~TIQUE 393

BP M PB

ATG t TGA Signal R~gion

Leu~Pro Transmembranaire FIG. 2. - - Reprdsentation schdmalique de I'ADNc codant pour la glgcoprotdine rabique.

Les r~gions correspondant ~ la s~quence signal et ~ la r~gion d'ancrage de la prot~ine sont indiqu~es par des zones hachur~es. Lc changement du 84 acide amin~ est ~galement indiqu~ (voir chapitre (, Le syst~me vaccine ~ p. 394).

L'expression de la glycoprot~ine rabique chez E. coli a maintenant ere rapportee par plusieurs laboratoires [8, 13, 27]. Les t aux de materiel rabique synthetise sont, darts certains cas, tr~s eleves et peuvent at teindre 25 % des proteines totales de la bacterie [11].

Malheureusement ce materiel ne semble pas, suite probablement ~ une mauvaise conformation [13], contenir t ous le s ~pitopes n~cessaires pour induire la synth~se d'anticorps seroneutralisants : aucune protection contre la rage ne peut ~tre obtenue chez l 'animal avec ce materiel.

Expression de la glgcoprot~ine rabique chez la levure.

La levure Saecharomyces eerevisiae est une cellule hete particuli~rement a t t rayante pour la production d'antig~nes viraux.

Certaines proteines virales peuvent, en effet, s'assembler spontanement dans ce microorganisme pour former des par t icules multimeriques hautement immuno- g~nes; le meilleur exemple est 1 antigone de surface du virus de 1 hepati te B ([20, 21] et pour une revue voir [10]).

D'autre part, la levure poss~de la capacite de glycosyler certaines proteines. La glycosylation peut modi fe r la conformation d'une proteine et peut doric ~tre particuli~rement indiquee dans le cas des proteines ~ usage vaccinal.

Nous avons demontre que l 'antigene de surface du virus de la rage synthetise dans la levure est glycosyle (fig. 3). Ce phenom~ne de glycosylation de proteines etrangeres par la levure, observe pour la premiere lois pour la glycoproteine rabique [5], peut ~tre mis en evidence de deux fa~ons : 1) les levures sont soumises, durant leur croissance, ~ l 'action de la tunieamycine, un antibiotique qui bloque la synth~se du precurseur glcNAc-P-P-Dol; 2) des extraits des levures sont traites par un enzyme, l 'endo-H, qui clive le lien di-N-acetylchitibiose. Une diminution du poids moleculaire indique darts les 2 cas la presence d'une glycosylation.

Les proprietes immunologiques du materiel rabique produit chez la levure sont actuellement h l'etude. Cependant, les rendements de glycoproteine rabique apparaissent tr~s faibles et semblent d~s fi present incompatibles avec les qualites recherchees pour un nouveau vaccin antirabique.

Expression de I 'ADNc codant pour la glgcoprotdine rabique dans des ceUules animales.

Une proteine virale synthetisee clans des cellules animales doit posseder, suite des processus de glycosylation et de maturat ion correctes, une structure et par consequent des proprietes immunologiques tr~s proches de celles de la proteine native purifiee fi part i r du virion.

394 M . P . K I E N Y ET COLL.

Les cellules animales se presentent donc h priori comme les cellules hbtes ideales pour l 'obtention d antig~nes viraux de conformation parfaite. Elles apparaissent, vu les resultats obtenus avec les autres syst~mes d hStes (voir chapitres precedents), tout fi fair indiquees dans le cas de la glycoproteine rabique.

Differents vecteurs d'expression peuvent ~tre utilises clans les cellules animales. L~ aussi, suivant les qualites recherchees pour un nouveau vaccin (prix...), une evaluation complete des differents parambtres est n~cessaire.

a) Les sgsl~mes classiques. Les rendements de proteines virales obtenus suite fi l ' integration directe de

I'ADNc dans un chromosome cellulaire ou suite h la transformation des cellules par un virus du papillome bovin (BPV) recombinant par exemple, sont en general tres faibles (de l 'ordre du microgramme pour 106 cellules) ; ces rendements sont, dans la plupart des cas, insuflisants pour la raise en ccuvre d'un pro@de industriel.

La rage ne fair pas exception ~ cette rbgle. La glycoproteine rabique produite en culture de cellules, notamment par le systeme BPV, est reconnue par une serie d'anticorps monoclonaux seroneutralisants et indique bien une structure quasi native et souhaitee pour une proteine vaccinale [11]. Malheureusement, les rende- ments obtenus, particuli~rement faibles dans ce cas, sont incompatibles avec l'elabo- ration d'un nouveau vaccin antirabique qui serait d 'un prix de revient peu eleve [11].

C'est pourquoi nous nous sommes orientes vers un systeme d'expression qui semblait tout ~ fait approprie aux problemes de la rage : le virus de la vaccine.

b) Le sysldme vaccine. Le virus de la vaccine a ~te largement utilise chez l 'homme lors des campagnes

de vaccination massives qui ont recemment abouti ~ l 'eradication de la variole. Le genome du virus de la vaccine est un ADN double brin (180 kb) dont la

replication est cytoplasmique ; inaccessible aux systemes de replication et de trans- cn'ption cellulaires, I 'ADN de la vaccine code par consequent, pour la plupart des ~l~ments necessaires ~ l 'expression de ses genes, elements qm se retrouvent pour certains presents dans le virion.

Le virus de la vaccine a ete developpe comme vecteur de clonage et d'expression par les equipes de Paoletti h New York, puis de Moss au NIH [16, 19].

L' integration d'un g~ne codant pour un antigene viral dans le genome du virus de la vaccine permet l 'elaboration de nouveaux vaccins vivants dont le concept est tout ~ fair original.

Nous avons adapt6 cette technologie ~ la glycoprot~ine du virus de la rage et etudie les proprietes immunologiques du virus recombinant.

Les techniques d'integration de gbnes etrangers dans le virus de la vaccine sont maintenant largement d~crites darts la l i t terature [12, 16, 17, 19] : nous nous borne- rons ~ les resumer (fig. 4) en insistant cependant sur quelques points particuliers.

Nous avons tout d 'abord observe que la sequence de I'ADNc isole par Anilionis et coll. [1] ne correspondait pas parfai tement ~ la sequence NH~-terminale de la glycoproteine presente dans le virion : en effet, pour les souches ERA et CVS, le 8e acide amine est une proline [3, 27] tandis que dans notre ADNc (isol~ ~ partir de la souche ERA) le tr iplet correspondant ~ cet acide amine code pour une leu- cine [1].

FIo. 3. - - Expression de la glyeoproldine rabique ehez la levure.

Detection par immunopreeipi tat ion ~ l 'aide d 'ant icorps polyclonaux. Effet de la tunicamycine (a~) r de l 'endo-H (b2).

FIG. 3

RAGE ET GI~,NIE GI~NI~,TIQUE

IN VITRO IN VlVO

397

DNA DU VIRUS DE LA VACCINE

SEGMENT "PORTEUR"

SEQUENCE "PROMOTEUR"

INSERTION DU PROMOTEUR DANS

PO

/ LE SEGMENT PORTEUR PI} cDNA

IN;;ItTI N

I DOUBLE

RECOMBINAISON RECIPROQUE

! ~*p_P_;'|

FIG. 4. - - Schdma d'intdgration fonctionnelle d'un g~ne dtranger darts le gdnome du virus de la vaccine.

La s6quence de I 'ADNc a et5 corrigee par mutagen~se localisee [6]. La compa- raison entre les proprietes immunologiques de I 'ADNc (( leu 8 )) et celles de r A D N c (( pro 8 )) a indique que la presence d 'une leucine en position 8 conduisait h une matura t ion aberrante de la prot, e.'ine [23] ; seule la glycoproteine por tan t une pro- line en position 8 est capable d induire une protect ion (voir ci-dessous).

L 'ADNc (( pro 8 )) (libere de la sequence polyG [6, 18]) a 6te introduit dans un plasmide en aval du promoteur 7,5-Kd de la vaccine, pr~@demment isole et integr6 dans le segment porteur, le g~ne de la thymidine-kinase.

L ' integrat ion dans le genome de la vaccine a 6t6 realisee par recombinaison classique in v ivo (fig. 4), mais le syst~me de selection du virus recombinant a ere am~liore : rut i l isat ion d 'un m u t an t thermosensible de la vaccine, n o t a m m e n t le

398 M . P . K I E N Y E T C O L L .

m u t a n t C o p e n h a g e n - t s 2 6 [6] nous a p e r m i s en e f fe t de r6a l i ser u n e doub le s~lec- t i on ( ts + e t T K - ) , q u i a faci l i t~ f o r t e m e n t l ' i s o l e m e n t des r e c o m b i n a n t s [6].

U n v i r u s r e c o m b i n a n t la v a c c i n e ( V V T G g R A B - 2 6 D 3 ) a 6t6 isol~ e t carac t6r i s~ . Des l ign6es ce l lu la i res en cu l tu re , in fec t6es p a r le v i ru s V V T G g R A B - 2 6 D 3 ,

s y n t h ~ t i s e n t une p r o t 6 i n e (fig. 5) d o n t la c o n f o r m a t i o n es t p r o b a b l e m e n t i d e n t i q u e cel le de la g l y c o p r o t 6 i n e n a t i v e [6, 11].

Des l a p i n s e t des sour is qu i o n t requ une i n j e c t i o n i n t r a d e r m i q u e du v i rus r e c o m - b i n a n t v i v a n t poss~den t , apr~s 14 jours , un t a u x d ' a n t i c o r p s a n t i - g l y c o p r o t e i n e r a b i q u e t r~s 61ev~ ; ces a n t i c o r p s s o n t s ~ r o n e u t r a l i s a n t s e t p r o t ~ g e n t les a n i m a u x lo r squ ' i l s s o n t s o u m i s ~ l ' 6 p r e u v e du v i ru s r a b i q u e s a u v a g e [6, 9, 11, 23] ( t a b l e a u I).

r&istance

TABLEAU I. - - Taux d'anticorps antirabiques s6roneutralisants aprbs vaccinat ion (A) et

des souris immunis6es soumises ~ l'fipreuve du virus de la rage (B) .

Vaccine A) VVTGgBAB-26D3 (type sauvage)

Jour 0 < 10 < 10

Jour 11 10.000 ~ 10

Jour 14 ~ 30.000 ~ 10

I,es lapins ont re~u une injection intradermique de 2 • 108 PFU de VVTGgRAB-26D3 ou de virus de la vaccine type sauvage, en 3 points, sur le (los. l.a prdsence d'anticorps antirabiques s~roneutralisanis est testde aux jours 0, 11 et 14 comme cela a d6jh 6td d~crit [6[.

Protection B) Agent immunisant %

- - 0 Vaccine type sauvage 0 VVTGgRAB-26D3 100

Les souris ont 6t6 scarifl6es (jour 0) avec 5 x 10 T PFU de VVTGgRAB- 26D3 ou de virus de la vaccine type sauvage. Au jour 15, elles ont 6t6 soumises ~ l'6preuve du virus rabique (souche CDC adapt6 en culture de tissu~ par injection intrae6r6brale de 2.400 LDso.

Reproduit avec l 'aulorisation de ~c M a c M i l l a n Journal Lid ~, Nalure, 312, 163-166, Copyrighl 1984.

FI6. 5. - - Immunoprgcipi lat ion des proldines synthgtisges apr~s infection par le virus de la vaccine recombinant V V T G g R A B - 2 6 D 3

et marqudes par la 35S-m~thionine~

a=ant icorps polyclonal H215 (Wistar Institute) dirig6 contre la glycoprot6ine purifi~e du virion. b e t e~anticorps monoclonaux dirig6s eontre la glycoprot6ine et antieorps s6roneutralisants. Les cellules ont 6t6 infect6es (1) par le virus VVTGgBAB-26D3, (2) par le virus de la vaccine

type sauvage (souche Copenhagen) ou (3) n 'ont pas 6t~ infect6es. Les chiffres sur la gauche indiquent les poids mol6culaires standards (• 10-8). Reproduit avec l 'autorisation de ~ MacMi l l an Journal Lid ,,, Nature, 312, 168-166, Copyright 1984.

FIG. 5

RAGE ET Gt~NIE GI~Nt~TIQUE 401

Nous avons 6galement montr~ [231 que le virus recombinant de la vaccine, purifie et inactive, ainsi que la glycoprot,~ine purifi6e ~ partir de cellules infect6es peuvent 6galement induire la synth~se d anticorps s6roneutralisants protecteurs.

CONCLUSIONS,

Nos resultats montrent que de nouveaux vaccins antirabiques peuvent gtre 61abores grfice aux techniques de genie, gen6tique.

Ces vaccins, basts sur 1 utilisation d u n virus recombinant de la vaccine, sont particuli6rement efficaces ; des anticorps protecteurs peuvent en effet ~tre induits chez l'animal par une seule inoculation du virus recombinant vivant, mais ~galement par injection du virus recombinant inactivS, et mgme, gr~ce h la glycoprot~ine rabique purifi6e de cellules infect6es in v i t ro .

L'utilisation de la vaccine est encore tr6s controvers6e ; neanmoins, il apparait clairement que ce syst~me, amelior~ par les moyens du g6nie g6n6tique, pr6sente un vaste potentiel d'applications, h la fois v~t~rinaires et humaines.

Le fair que ce nouveau vaccin vivant peut gtre administr~ par vole orale le rend particuli~rement approprie pour r~soudre les probl~mes actuels de la rage dans le monde.

KEY-WORDS: Rabies, Genetic engineering, Glycoprotein, Vaccine; Note.

REMERCIEMENTS.

Nous exprimons toute notre gratitude h Mmes D. SCHMITT, S. SKORY et D. SPEHNER pour leur excellente assistance technique.

Nous remercions A. KIRN, P. CURTIS et B. DIETZCHOLD pour leurs suggestions, et P. CHAMBON, E. EISENMANN et Ph. KOURILSKY pour les nombreuses discussions et encouragements qui ~)nt contribu6 largement au suc@s de ce projet.

Les figures de ce rapport ont 4te r~alisees par F. DAUL ; le texte a ete mis en forme par N. MONFRINI que nous remercions egalement.

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