puti syahrani (20505015)
DESCRIPTION
Puti Syahrani (20505015). PERUBAHAN ASAM AMINO GLN MENJADI LEU PADA KODON rpoB513 Mycobacterium tuberculosis L1 RESISTEN RIFAMPIN. Pembimbing: A. Saifuddin Noer, Ph.D. Materi Presentasi. Pendahuluan Tinjauan Pustaka Metodologi Penelitian Hasil dan Pembahasan Kesimpulan. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
1
PERUBAHAN ASAM AMINO GLN PERUBAHAN ASAM AMINO GLN MENJADI LEU PADA KODON MENJADI LEU PADA KODON rpoB513 rpoB513
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis L1 L1 RESISTEN RIFAMPINRESISTEN RIFAMPIN
Puti Syahrani(20505015)
Pembimbing:A. Saifuddin Noer, Ph.D
2
Materi Presentasi
• Pendahuluan
• Tinjauan Pustaka
• Metodologi Penelitian
• Hasil dan Pembahasan
• Kesimpulan
3
Latar BelakangData WHO 2006:• Menginfeksi 1/3
populasi dunia• 8 juta kasus TB
aktif/tahun• Tingkat kematian 2
juta orang/tahunIndonesia :• Peringkat ketiga,
tingkat kematian 140.000 orang/tahun
• Jawa Barat peringkat keempat
Pendahuluan
Mycobacterium tuberculosis
Antibiotik
Penderita Tuberkulosis
RESISTEN !!
4
Resistensi M. tuberculosisPendahuluan
SINGLE MDR XDR
Resisten Rifampin & Isoniazid
katG – INHR
(Musser, 1995; Ramaswamy, 1998)
rpoB – RIFR (Telenti, et al., , 1993; Musser, 1995;
Ramaswamy, 1998)
• Mutasi gen rpoB (pengkode RNA polimerase subunit
• Daerah penentu sifat resistensi RIF, 81 pb, kodon 507-533
• Dideteksi dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) multipleks spesifik alel
Mutasi paling umum dan persentasenya
%No
Kodon
42%Ser Leu43%531
23%His Tyr36%526
Mutasi pada gen rpoB
5
Menentukan penyebab resistensi RIF pada isolat klinis M. tuberculosis MDR
selain mutasi pada rpoB526 dan rpoB531
Tujuan Penelitian
Isolat klinis M. tuberculosis MDR, katG- tetapi rpoB+ (tidak termutasi pada kodon rpoB526 dan rpoB531)
(Noviana, 2006)
Pendahuluan
Strategi:Amplifikasi Polymerase Chain Reaction (PCR)
multipleksSekuensing fragmen hasil PCR
Analisis in silico
6
Rifampin
RNA Polimerase - RifampinTinjauan Pustaka
• RNA polimerase (RNAP) berperan pada proses transkripsi, terdiri atas subunit ’
• Target rifampin (RIF), obat anti-TB lini pertama
• RIF berikatan dengan RNAP subunit pada kantung pengikatan RIF
• RIF menghambat proses transkripsi dengan menghalangi jalur perpanjangan RNA (Campbell, et al.2001)
Interaksi RNAP Taq – RIF(Campbell, et al., 2001)
7
Polymerase Chain Reaction (PCR) Multipleks
• Menggunakan sepasang primer luar (forward dan reverse), ditambah primer dalam
• Mengamplifikasi sekaligus dua atau lebih fragmen target
• Dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi pada posisi-posisi tertentu
Tinjauan Pustaka
Fragmen AC
Fragmen BC
Primer forward
Primer reverse
Primer dalam
A B C
8
PCR Multipleks: rpoB526 dan
rpoB531 Isolat L1, L16, R4,
R7 Visualisasi gel
agarosa 1,5%
Metodologi Penelitian
PCR Multipleks
Sekuensing
Analisis in silico
Metodologi Penelitian
Sekuensing: Macrogen Inc., Korea 3730xl DNA analyzer
Salah satu primer Fragmen 249 pb
Analisis in silico: Penjajaran
(alignment) SeqMan dan MegAlign DNA Star
Pemodelan PyMOL
9
Hasil PCR Multipleks rpoB526
M : pUC19/HinfI
C+ : Kontrol + (M. tbc H37Rv)
Hasil & Pembahasan
M C- L1C+ L16 R4 R7
249 pb
181 pb
249 pb
181 pb
RR
RF R526
CAC
5261419 pb
517 pb396 pb214 pb75 pb
Ujung 3’ primer dalam komplemen dengan basa
kedua kodon 526.
10
M C- L1C+ L16 R4 R7
249 pb
167 pb
Hasil PCR Multipleks rpoB531
M : pUC19/HinfI
C+ : Kontrol + (M. tbc H37Rv)
Hasil & Pembahasan
249 pb
167 pb
1419 pb
517 pb396 pb214 pb75 pb
Ujung 3’ primer dalam komplemen dengan basa
kedua kodon 531.
RR
RF R531
531
TCG
11
Rangkuman Hasil PCR Multipleks
Hanya isolat M. tbc MDR L1 yang tidak termutasi pada rpoB526 dan rpoB531 Sekuensing
Hasil & Pembahasan
Isolat249 pb
167 pb
rpoB531
L1 +
L16 x -
R4 x -
R7 x -
Isolat249 pb
181 pb
rpoB526
L1 +
L16 +
R4 +
R7 +
12
Penjajaran SeqMan DNA StarHasil & Pembahasan
Penjajaran MegAlign :Mutasi A (adenin) T (timin) pada basa kedua kodon
rpoB513 (CAA CTA) menyebabkan Gln (Q) Leu (L)
13
Mutasi rpoB513
Wild type(H37Rv)
Isolat L1
Glutamin (Gln, Q)(Polar/hidrofil, tidak bermuatan)
Leusin (Leu, L)(Non polar/ hidrofob, alifatik)
Hasil & Pembahasan
mutasi
translasi
translasi
14
Interaksi RIF-RNAP
• Gln Leu menyebabkan hilangnya ikatan hidrogen dengan RIF
• Mengganggu interaksi RIF-RNAP & aktivitas inhibisi RIF
• Dapat menyebabkan resistensi RIF
Hasil & Pembahasan
O2
N2
O2
Pemodelan dengan PyMOL
15
Kesimpulan
• Sifat resistensi RIF pada isolat klinis M. tuberculosis MDR L1 disebabkan adanya mutasi A T pada basa kedua kodon rpoB513, yang menyebabkan perubahan asam amino Gln Leu.
• Perubahan ini dapat mengganggu interaksi RIF-RNAP sehingga RIF tidak dapat menginhibisi RNAP dan M. tuberculosis menjadi resisten RIF.
16
SEKIAN
TERIMAKASIH
17
PCR Multipleks
Primer dalam
Urutan 5’ 3’ Ukuran
R526 GTCGGGGTTGACCCA 15 nt
R531 ACAAGCGCCGACTGTC 16 nt
Siklus PCR : Denaturasi awal: 96°C, 3 menit 5 siklus: 95°C, 45 detik - 60°C, 1 menit - 72°C, 30 detik 5 siklus: 95°C, 40 detik - 59°C, 50 detik - 72°C, 30 detik 22 siklus: 94°C, 50 detik - 55°C, 40 detik - 70°C, 30 detik Elongasi akhir pada 72°C selama 3 menit
Metodologi Penelitian
18
Inhibisi RIF terhadap RNAP
Menjadi halangan sterik pada jalur perpanjangan RNA pada ujung 5’, ketika panjang transkrip 2-3 nukleotida
(Campbell, et al., 2001)
Tinjauan Pustaka
19
Daerah resistensi RIFpada RNAP subunit
Tinjauan Pustaka
Daerah resistensi RIF pada rpoB prokariot (E. coli, Taq, M. tbc)(Campbell, et al., 2001)