DR RADMILA GLII Asistent Jasmina Obradovi

DOBRO NAM DOLI!

PRIPREMNE RUTINSKE METODE ZA MIKROSKOPSKO IZUAVANJE ELIJA I TKIVA

Zadatak

citologije

i

histologije

je

da

razjasne

mikroanatomiju elija, tkiva i organa, kao i njihove funkcije. Osnovni pribor za posmatranje elije je... Postoje sledee vrste mikroskopa: - svetlosni - elektronski

MIKROSKOP

Preparat u citologiji je obino iseak tkiva posebno obraen i pripremljen za posmatranje pod mikroskopom. Trajni preparat za svetlosni mikroskop je presek tkiva privren na predmetno staklo i obino obojen posebnim hemijskim reagensom (hematoksilinom i eozinom). Trajni preparat elektronske mikroskopije je elektronska mikrografija.Elektroska mikrografija GER-a Trajni preparat za svetlosni mikroskop

Predmetno staklo

Pokrovna ploica

Pribor koji se koristi u histologiji

Primeri elektonskih mikrografija

Elektronska mikrografija jedra

Elektronska mikrografija mitohondrije

Mikrografija granuliranog endoplazmatinog retikuluma/retuirana slika (obojena naknadno)

?

Elektronski snimak polena Obojena mikrografija

Elektronski snimak polena

Elektronski snimak polena

Snimak virusa HIV elektronskim skening mikroskopom

Priprema tkiva za parafinske preseke bojene eozinom i hematoksilinom (H&E) (za svetlosnu mikroskopiju)Pod mikroskopom se u najveem broju sluajeva prouavaju preseci mrtvih tkiva; da bi se napravio kvalitetan presek, tkivo mora biti vrsto, prozirno i obojeno ili kontrastirano. 1.IZOLACIJA I FIKSACIJA TKIVA: Tkivo - veoma brzo odstraniti iz ivotinje (koja nije opijena), (odnosno biljke) rastvor fiksativ (formaldehid (formalin)) FIKSACIJA FIKSACIJA je brzo ubijanje elija (da ne bi dolo do osmotskog bubrenja, isparavanja, autolize ili pucanja membrane, bakterijskih i gljivinih infekcija...). Autoliza samoubistvo elije putem aktiviranja enzima katepsina koji razlau proteine, ugljene hidrate, amino kiseline (proteinaze, aminopeptidaze i karboksipeptidaze)... Fiksiranje se vri na niskim temperaturama ... ?

Fiksacija moe biti: hemijska (upotrebom reagenasa koji e precipitirati, denaturisati ili povezati strukturne komponente elije) fizika (toplotom, smrzavanjem). Izbor fiksativa se bazira na: prirodi fiksativa, vrsti tkiva i histolokim detaljima koje treba pokazati i kasnije analizirati.

Na proces fiksacije utie vie faktora vremenski period od izolacije tkiva do njegovog stavljanja u fiksativ, osmotska vrednost, pH i puferacija fiksativa (puferi su fosfatni, bikarbonatni, kakodilatni i veronal) , temperatura, koncentracija, (formaldehid je najbolja koncentracija od 10%, a za glutaraldehid od 0,25%-4%), zapremina fiksativa u odnosu na zapreminu uzorka tkiva. Ovaj odnos bi trebao da bude 10:1 u korist fikstiva. i sposobnost prodiranja u tkivo. Tkivo se see na tanke preseke (2-3 mm debljine), jer u njih fiksativi bre prodiru

Prema tome da li izazivaju ili ne koagulaciju albumina fiksativi se dele u dve grupe: koagulantne i nekoagulantne Prema njihovom dejstvu fiksativi su klasifikovani u pet glavnih grupa: 1.aldehidi (formaldehid i glutaraldehid) 2.merkuriali (sadre ivin hlorid) 3.alkoholi (metanol i etanol) 4.oksidirajui agensi obuhvataju: permanganatne fiksative (kalijum permanganat), dihromatne fiksative (kalijum dihromat) i osmijum tetraoksid. Oni unakrsno povezuju proteine, ali izazivaju jaku denaturaciju. Uglavnom imaju specijalizovane primene. 5.pikrati - fiksative sa pikrinskom kiselinom (Buenov fiksativ)

2. DEHIDRATACIJA Iz umrtvljenih tkiva se ispira fiksativ, ali da bi u njega mogao da prodre parafin, mora se odstraniti voda. Zato se u tkivo postepeno uvodi u rastvor alkohola sve vee koncentracije - do 100 %. 3. PROSVETLJAVANJE TKIVA Uzorak tkiva stavlja se u organski rastvara, npr. ksilol, koji poveava prozirnost tkiva i vidljivost elijskih struktura pod mikroskopom. 4. PROIMANJE TKIVA U tkivo se uvodi rastopljeni parafin. Ostavlja da se ohladi i ovrsne parafin. Posle toga, uzorci u parafinu se oblikuju u kalupe radi lakeg seenja. 5. MONTIRANJE I SEENJE Gotovi kalupi montiraju se na mikrotom, aparat sa metalnim seivom koje daje tkivne preseke debljine 3-10 m. Pre seenja se vri trimovanje.

Slika 1. Rotacioni mikrotom

Slika 2. Automatizovani proces bojenja komplet za bojenje

6. LEPLJENJE Preseci se lepe na ploice sa malom koliinom albumina koji slui za lepljenje. Tkivo je proeto parafinom i presek je bezbojan. Parafin u presecima spreava ulazak histolokih boja rastvorljivih u vodi . 7. IZVLAENJE PARAFINA Parafin se izvlai iz tkiva rastvaranjem u organskim rastvaraima (npr. ksilolom). 8. REHIDRATACIJA TKIVA Tkivo se rehidratie (vraa mu se voda) prolaskom kroz graduisane akoholne rastvore, sve do vode. Ovo treba da omogui bojama da prodru u preseke. 9. BOJENJE Preseci se zatim boje hematoksilinom i eozinom. Viak boje se ispira. Na ovom koraku ploica je jo uvek nepogodna za mikroskopsko ispitivanje i odlaganje radi daljeg uvanja.

10. PONOVNA DEHIDRATACIJA Obojeni tkivni presek mora da se ponovo dehidratie alkoholima. Nakon toga pokrije se pokrovnom ploicom, koja se lepi upotrebom nevodenog medijuma (Canada balsam). Kada se medijum za lepljenje osui, uzorak je obeleen i spreman za mikroskopsko ispitivanje i odlaganje. To je TRAJNI PREPARAT.

elija i ekstracelularna komponenta NukleusHeterohromatin Euhromatin Nukleolus

Bojena reakcija

plava negativna plava Plava ruiasta ruiasta

CitoplazmaErgastoplazma (sa gER) Opta citoplazma Citoplazmatini filamenti

Ekstracelularni matriksKolagena vlakna Elastina vlakna Retikularna vlakna Osnovna supstanca Kotani matriks (dekalcifikovan) Bazalna mambrana ruiasta ruiasta, ali se obino ne razlikuju od kolagenih ruiasta, ali se obino ne razlikuju od kolagenih plava, ali samo ako je prisutna u velikim koliinama, (kao matriks hrskavice) ruiasta ruiasta

Osnovni koraci u pripremi H&E preparata1.Izolacija i fiksacija tkiva 2.Dehidracija tkiva serijom alkohola 3.Prosvetljavanje tkiva u organskim rastvaraima 4.Proimanje tkiva rastopljenim parafinom 5.Montiranje na mikrotom kalupa sa uzorkom tkiva 6.Seenje tkivnih preseka i njihovo lepljenje na staklene ploice 7.Izvlaenje parafina rastvaranjem u ksilolu 8.Rehidratacija tkiva 9.Bojenje preseka sa histolokim bojama 10.Ponovna dehidracija tkivnog preseka 11.Pokrivanje preseka sa pokrovnom ploicom.

Priprema tkiva za elektronsku mikroskopiju1. Izolacija i fiksacija tkiva Fiksatori su uglavnom glutar-aldehid, OsO4, KMnO4, akrolein i dr. Fiksacija traje 1-2 sata. Posle fiksacije glutaraldehidom, tkivo je belo, pa se zato radi postfiksacija tkivo se zatamnjuje sa OsO4. 2. Dehidratacija i prosvetljavanje se vre isto kao i za svetlosnu mikroskopiju 3. Za proimanje tkiva koriste se sintetike epoksidne, monomerne, vetake smole koje polimerizuju u providne blokove boje ilibara i daju potporu elijskim strukturama. Kalupljenje traje 3 dana, a gotovi kalupi zvone kao staklo. 4. Kalupi se montiraju na ultramikrotom, koji ima stakleno ili dijamantsko prizmatino seivo koje se menja na 24 sata. Dobijaju se preseci debljine 0,05 m koji padaju u kadicu sa destilovanom vodom. 5. Savijeni preseci se peglaju parama hloroforma. 6. Koriste se preseci ukaste i sivo-beliaste boje koji se vade iz kadice i montiraju na bakarnu icu.

7. Bojenje preseka, odnosno kontrastiranje preseka solima tekih metala (uranil-acetat, olovo-citrat), jer dobro rasejavaju elektrone. Preparat za elektronsku mikroskopiju nije potrebno oslobaati smole da bi se on obojio. 8. Viak "boje" se ispira, a mreice se nakon suenja montiraju na odgovarajue mesto u elektronskom mikroskopu. 9. Slika tkiva se posmatra na fluorescentnom ekranu, nakon prolaska snopa elektrona kroz mreicu koja nosi preseke. Prolaskom kroz presek, snop elektrona reaguje sa solima tekih metala i menja strukturu elije. Zato je trajanje preseka ogranieno. Slika moe da se zabelei specijalnom kamerom ili fotografie. Na taj nain se dobija crno-beli fotografski snimak uvelianog elijskog lika ili lika elijskih struktura koji se oznaava kao

elektronska

mikrografija i ona predstavlja trajni preparat u elektronskoj mikroskopiji.

Etape u pripremi preparata za elektronsku mikroskopiju1.Izolacija i fiksacija tkiva 2.Dehidracija tkiva serijom alkohola 3.Proimanje tkiva epoksidnim smolama 4.Montiranje kalupa sa uzorkom tkiva na ultramikrotom 5.Seenje tankih tkivnih preseka 6.Montiranje tkivnih preseka na bakarne mreice 7.Peglanje preseka parama hloroforma 8.Kontrastiranje preparata 9.Montiranje bakarne mreice u elektronski mikroskop 10.Posmatranje elijskog lika 11.Fotografisanje uveanog elijskog lika.

Hvala na panji!