projeto de pesquisa - teses.usp.br · desenvolvimento do projeto, que saibam que sem seu auxílio...
TRANSCRIPT
JOANA MONA E PINTO
Avaliação de Parâmetros Imunológicos Inatos e Morfologia Intestinal de Trutas Arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792),
Alimentadas com Ácido Ascórbico e Flavonoides Após Aplicação de Glicocorticoide Exógeno
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Ciências.
São Paulo 2014
JOANA MONA E PINTO
Avaliação de Parâmetros Imunológicos Inatos e Morfologia Intestinal de Trutas Arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792),
Alimentadas com Ácido Ascórbico e Flavonoides Após Aplicação de Glicocorticoide Exógeno
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Biologia Celular e Tecidual Orientador: Prof. Dr. José Roberto Machado Cunha da Silva Versão corrigida. A versão original eletrônica encontra-se disponível tanto na Biblioteca do ICB quanto na Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP (BDTD);
São Paulo 2014
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
© reprodução total
Pinto, Joana Mona e. Avaliação de parâmetros imunológicos inatos e morfologia intestinal de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792), alimentadas com ácido ascórbico e flavonoides após aplicação de glicocorticoide exógeno / Joana Mona e Pinto. -- São Paulo, 2014. Orientador: Prof. Dr. José Roberto Machado Cunha da Silva. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento. Área de concentração: Biologia Celular e Tecidual. Linha de pesquisa: Nutrição e Imunologia. Versão do título para o inglês: Evaluation of innate immune parameters and intestinal morphology of fed ascorbic acid and flavonoids rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1972), after exogenous glucocorticoids application. 1. Aditivos dietários 2. Nutracêutica 3. Estresse 4. Imunoestimulantes 5. Polifenóis 6. Fagocitose I. Silva,Prof. Dr. José Roberto Machado Cunha da II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual III. Título.
ICB/SBIB0168/2014
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
______________________________________________________________________________________________________________
Candidato(a): Joana Mona e Pinto.
Título da Tese: Avaliação de parâmetros imunológicos inatos e morfologia intestinal de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792), alimentadas com ácido ascórbico e flavonoides após
aplicação de glicocorticoide exógeno.
Orientador(a): Prof. Dr. José Roberto Machado Cunha da Silva.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão
pública realizada a ................./................./................., considerou
( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................... Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Presidente: Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
A Diogo Nader Palermo, meu
marido e melhor amigo, com quem
amo compartilhar a vida. Por seu
apoio incondicional, e por acreditar
em mim... mais do que eu mesma.
Dedico!
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Professor José Roberto Machado Cunha da Silva, que me
recebeu em seu laboratório e colaborou para o meu crescimento profissional, mas
principalmente agradeço por ter colaborado com o meu crescimento pessoal durante
este processo.
Ao Professor Francisco Javier Hernandez Blazquez que cedeu seu laboratório para
realização dos experimentos, e também me auxiliou com suas orientações durante o
doutorado.
Ao Marcos Rigolino (in memorian) e a Yara Aiko Tabata que me receberam também
em sua casa, ofereceram seu tempo, atenção e por fim sua amizade. Obrigada
pelas longas conversas na hora do cafezinho e pelo clima de felicidade, que fizeram
o trabalho ser também lazer.
Aos colaboradores do projeto, Andrews Krupinski Emerenciano, Karina Fernandes
Oliveira Rezende, Douglas Amaral dos Santos, Willian Reina Joviano, Beatriz
Moreira Calixto da Cruz e Miriam Zibordi, por todo o auxílio nas coletas em Campos
do Jordão, ajuda com os experimentos, e também pela amizade e bons momentos
proporcionados no desenvolvimento do projeto.
À Emilia Ribeiro, que auxiliou com o projeto, nas coletas em Campos do Jordão, que
sempre me ajudou no laboratório, que sempre esteve disposta a colaborar em tudo,
mas principalmente que se tornou uma grande amiga.
Aos Profs. Francisco Javier Hernandez Blazquez, Patrícia Gama e Renata
Guimarães Moreira, por sua atenção e sugestões no exame de qualificação.
Ao Professor Salvador Arijo da Universidade de Málaga, que me recebeu em seu
laboratório e proporcionou o treinamento de técnicas para o aprimoramento do
trabalho.
Ao Kenio de Gouvêa Cabral e a Quinabra, que forneceram o Biocitro Aqua® para a
realização dos experimentos, colaborando também com o desenvolvimento do
estudo.
A Rosana, Pulga e Lé, que também nos receberam tão bem na estação, que
estavam sempre prontos para nos ajudar, e por sua importante colaboração no
desenvolvimento do projeto, que saibam que sem seu auxílio não seria possível
realizar este projeto.
Ao meu marido Diogo, que contribuiu comigo em todos os sentidos, no
desenvolvimento de meu projeto de doutorado, também no meu próprio
desenvolvimento como pessoa, e que sempre me apoia perante qualquer
dificuldade.
Aos meus pais Ellen Mona e Rogério Franceschelli, por todo seu exemplo, apoio e
inspiração durante minha vida, por contribuírem com minha formação em todos os
sentidos, e por acreditarem em mim.
Aos meus pais José Francisco e Sandra Sanches, por me apoiarem, possibilitarem
minha vinda à São Paulo, onde pude dar início a minha vida acadêmica, e descobrir
que fazer ciência é a minha vida.
Aos meus irmãos, Luiza, Gabriel e Breno, que amo tanto e que me motivam a ser
uma pessoa melhor a cada dia.
A minha família, sou muito grata por ter tantos familiares, por ter tanto amor em
minha vida, sem minha família para me apoiar as vitórias não fariam sentido.
A minha segunda família, a de meu marido, que me acolheu sempre e que já
considero como minha, sem o apoio de vocês nada seria possível.
Aos meus grandes amigos Andrews, Karina, Emília, e Luciana, que merecem
destaque nos agradecimentos, pois foram meus amigos para toda hora, trabalhar
com vocês é o melhor trabalho, fico feliz por ter conhecido pessoas com quem me
identifico tanto.
Aos alunos de iniciação científica Willian, Beatriz e Letícia, que contribuíram muito
para meu crescimento pessoal, e se tornaram meus amigos.
Aos meus colegas do Laboratório de Histofisiologia Evolutiva, pelo suporte e todos
os momentos juntos: Alfonso, Andrews, Camila, Débora, Douglas, Gabriel, João,
Karina, Leandro, Lígia, Luciana, Paola, Paula, Renan, Renata, Ricardo, Tânia e
Yoel, são todas amizades que levarei para vida toda.
Aos meus amigos da veterinária, Juliana, Renann, Fernanda, João, Simone,
Cristiane, Eduardo e Thierry.
Aos professores do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, por
seus ensinamentos em aulas, contribuições e auxílio durante o desenvolvimento do
doutorado.
Aos secretários do Departamento Celiana, Paulo, Eloize e Ana Lúcia, por toda a
ajuda. Em especial à Regina Valbom, por sua atenção, por estar sempre disposta a
ajudar e pelo apoio sempre.
A todos os alunos do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento.
Aos funcionários da biblioteca e a todos os funcionários do ICB.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa
concedida (2010/19284-0).
Enfim, à todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram com o presente
trabalho, MUITO OBRIGADA!
RESUMO
PINTO, J. M. Avaliação de parâmetros imunológicos inatos e morfologia intestinal de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792), alimentadas com ácido ascórbico e flavonoides após aplicação de glicocorticoide exógeno. 2014. 97 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2014. A criação intensiva dos peixes possui diversos fatores que ocasionam estresse, desde o manejo envolvido nos métodos zootécnicos até alteração de parâmetros de qualidade da água. Os teleósteos submetidos ao estresse apresentam rápido aumento dos níveis de glicocorticoides circulantes, esse desencadeia uma reorganização metabólica, resultando muitas vezes na imunossupressão dos animais. Desta maneira, o estresse deixa os animais suscetíveis a potenciais organismos patogênicos e ao surgimento de doenças. Em pisciculturas os antibióticos são comumente utilizados no controle das enfermidades bacterianas, porém, o seu uso indiscriminado pode provocar a seleção de cepas patogênicas resistentes, criando um ciclo de doenças, que afeta a produtividade da piscicultura. Uma alternativa viável é atuar na prevenção, através do uso de aditivos com ação imunoestimulante. Os flavonoides e o ácido ascórbico (AA) são conhecidos por suas atividades anti-inflamatória, antioxidante e antiestresse; esses ainda foram descritos por atuar sinergicamente nestes processos e na absorção intestinal. Por esta razão, o estudo em questão visou avaliar a influência de um aditivo dietário contendo flavonoides e AA no desempenho, morfologia do intestino e parâmetros de imunidade inata de trutas arco-íris em condições ideais e após aplicação de glicocorticoide exógeno (dexametasona). Para tanto, foram realizados dois experimentos diferentes: 1 - Contendo dois grupos experimentais, o controle (GC) e o aditivo (GA), tratados por noventa dias; 2 - Contendo quatro grupos, controle (GC), aditivo (GA), dexametasona (GD) e aditivo + dexametasona (GAD), por trinta dias. No primeiro experimento o aditivo proporcionou o aumento da altura do epitélio no início do intestino, além da diminuição da densidade de células de muco nos cecos pilóricos, e o aumento no início do intestino. No segundo experimento, o glicocorticoide exógeno causou perda de massa dos animais, e o aditivo compensou este efeito. No intestino, o aditivo (GA) causou a diminuição da altura do epitélio nos cecos pilóricos e início do intestino, e não afetou a densidade de células de muco. O glicocorticoide exógeno causou diminuição da altura do epitélio em todas as porções intestinais, comparado aos grupos que não receberam a aplicação. O aditivo foi diferencial e compensou as alterações intestinais. A densidade de células de muco aumentou nos cecos pilóricos de GAD, e no inicio do intestino de GD. As análises da contagem diferencial de leucócitos mostraram que GAD, teve um aumento no número de neutrófilos. Após a aplicação intraperitoneal de glicogênio de ostra GAD teve um aumento no número de monócitos e neutrófilos, além de não ter tido diminuição do número de linfócitos, como os demais grupos, mantendo números similares aos dos animais que não receberam aplicação do glicogênio de ostra. Os resultados indicam que o uso de ácido ascórbico e flavonoides apresentam vantagens em situações de estresse. Palavras-chave: Aditivos dietários. Nutracêutica. Estresse. Imunoestimulantes. Polifenóis. Fagocitose.
ABSTRACT
PINTO, J. M. Evaluation of innate immune parameters and intestinal morphology of fed ascorbic acid and flavonoids rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792), after exogenous glucocorticoids application. 2014. 97 p. Ph. D. thesis (Science) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2014. The intensive fish culture has several factors that lead to stress, from the handling involved in farming methods to water quality parameters alterations. Teleosts subjected to stress show rapid increase in circulating glucocorticoids levels, this triggers a metabolic reorganization, often resulting in the animal immunosuppression. Therefore, the stress let animals susceptible to potential pathogens and disease emergence. In fish culture, the antibiotics are commonly used to control bacterial diseases, but their indiscriminate use can lead to selection of resistant pathogenic strains, creating a cycle of disease that affects the fish farming productivity. A viable alternative is to work on prevention, through the use of additives with immunostimulant action. Flavonoids and ascorbic acid (AA) are known for their anti-inflammatory, antioxidant and anti-stress activity; also these were reported to act synergistically in these processes, and intestinal absorption. For this reason, the present study aimed to evaluate the influence of a dietary additive containing flavonoids and AA in growth performance, gut morphology and innate immunity parameters in rainbow trouts in ideal conditions and after an exogenous glucocorticoid application (dexamethasone). For assessing these parameters, two different experiments were performed: the first one with two groups control (GC) and the additive (GA), for ninety days, and the second one with four groups, control (GC), additive (GA), dexamethasone (GD) and additive + dexamethasone (GAD) lasting thirty ninety days. In the first experiment, the additive increased epithelial height at the initial intestine, in addition to decreased mucus cell density of the pyloric caeca, and the increase in the initial intestine. In the second experiment, the exogenous glucocorticoid caused animal weight loss, and the additive did compensate this effect. In the intestine, the additive (GA) decreased epithelial height in pyloric caeca and initial intestine, mucus cell density was not affected. The exogenous glucocorticoid caused epithelial height decrease in all intestinal portions compared to groups that did not receive the application. The additive was differential and to compensate intestinal disorders. The mucus cells density increased in GAD pyloric caeca and GD initial intestine. The analysis of the differential leukocyte counts showed that GAD had an increase in the number of neutrophil. After intraperitoneal application of glycogen oyster, GAD had an increase in the number of monocytes and neutrophil, and showed no decrease in the number of lymphocytes, like other groups, maintaining similar values of the animals that did not received glycogen oyster application. The results indicate that the use of ascorbic acid and flavonoids has advantages in stress situations. Keywords: Food Additives. Nutraceutical. Stress. Immunostimulant. Polyphenols. Phagocytosis.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Unidades produtivas de trutas no Brasil em 2008. Exibido
em verde as unidades produtivas de truta. As áreas claras
mostram os municípios onde não foi feito recenseamento.
Fonte: Censo Aquícola Nacional – 2008 (BRASIL, 2013)....... 26
Figura 2 – Órgãos endócrinos e reação ao estresse em peixes.
Hormônio Adrenocorticotrófico (ACTH); Hormônio
melanotrófico (MSH); Hormônio Concentrador de Melanina
(MCH). Modificado de Ross; Ross (2008)............................... 29
Figura 3 – O sistema imune dos teleósteos. A primeira barreira
imunológica é a física, representada pelo muco presente na
pele, que ainda possui componentes humorais,
complemento, lisozima e proteína C reativa. A segunda
barreira é representada pelas células fagocíticas,
monócitos/macrófagos e neutrófilos, que são produzidos no
rim cefálico e estão presentes no peritônio, sangue, baço e
rim. A comunicação entre sistema imune inato e adquirido
ocorre pelas células apresentadoras de antígenos (APC),
que possuem complexo principal de histocompatibilidade
(MHC), esses induzem a maturação dos linfócitos B e T em
células produtoras de antígenos, criando a memória
imunológica. Antígeno (Ag); Imunoglobulina M de superfície
(sIgM); Interleucina (IL); Linfócito T helper.............................. 33
Figura 4 – Núcleo básico dos flavonoides................................................ 36
Figura 5 – Anestesia e medidas de O. mykiss. A) O. mykiss sob efeito
do anestésico, animais apresentam diminuição de batimento
opercular e perda de equilíbrio. B) Medidas de comprimento
total; C) e comprimento padrão dos animais........................... 43
Figura 6 – Fluxograma dos experimentos................................................ 44
Figura 7 – Morfologia do trato intestinal de O. mykiss. A) Vista ventral
mostrando o trato gastrointestinal de O. mykiss, Estômago
(E), Intestino anterior (IA) e posterior (IP). Porções
coletadas para análises histológicas: Cecos pilóricos (CP);
porção inicial do intestino (seta); porção média do intestino
(cabeça de seta vazia); porção final do intestino (cabeça de
seta). B) Fotomicrografias de corte histológico da porção
média do intestino, moléculas de ferritina aparecem em
azul, coloração de Perls. C) Porção média do intestino,
Células caliciformes (cc); epitélio (e); Lamina própria (lp);
linfócito intraepitelial (li); vacúolos absortivos (va);
leucócitos associados ao intestino (seta vazia); medida de
altura do epitélio (em vermelho), coloração de HE. D)
Porção inicial do intestino mostrando células de muco,
histoquímica de PAS.............................................................
48
Figura 8 – Ensaios de fagocitose in vitro. A) Injeção intraperitoneal de
solução fisiológica contendo 1% de glicogênio de ostra. B)
Fotomicrografia de lamina de teste de fagocitose corada
com Rosenfeld, mostrando macrófagos em microscopia de
campo claro; C) Mesmo campo fotografado em microscopia
de fase. Levedura internalizada (cabeça de seta) e levedura
não fagocitada (seta). Barra equivale a 10µm......................... 51
Figura 9 – Esfregaços sanguíneos de O. mykiss. A) Eritrócitos
nucleados, seta mostra os linfócitos. B) Seta mostra
neutrófilo. C) Seta mostra monócito Coloração de HE............ 53
Figura 10 – Parâmetros de desempenho de O. mykiss durante os 90
dias de experimento. Barras mostram média ± DP. Não
houve diferença significativa entre os grupos (p>0,05)........... 56
Figura 11 – Análise comparativa da altura do epitélio intestinal das
diferentes porções do intestino de O. mykiss. A) Cecos
pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final
do intestino; E) Altura do epitélio das quatro porções
intestinais, com linha de tendência (polinômio de três fases).
Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção média (IM),
porção final do intestino (IF). Barras mostram média ± DP,
valores expressos em µm. (*) = p<0,05...................................
58
Figura 12 – Análise comparativa da densidade de células de muco nas
diferentes porções intestinais de O. mykiss. A) Cecos
pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final
do intestino; E) Densidade de células de muco das quatro
porções intestinais, com linha de tendência (polinômio de
três fases). Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção
média (IM), porção final do intestino (IF). Barras mostram
média ± DP, valores expressos em número de células por
mm2. (*) = p<0,05....................................................................
59
Figura 13 – Avaliação ultraestrutural do intestino de O. mykiss. Ambos
os grupos mostraram morfologia similar. A) GC 4000x. B)
GC 15000x. C) GA 7500x. D) GA 20000x. E) GA 7500x. F)
GA 20000x. A, C) Os enterócitos apresentam a cutícula
estriada característica deste epitélio, abundância de
mitocôndrias, uma faixa bem definida, com ausência de
organelas logo abaixo à projeção das microvilosidades. B,
D) Presença de junções celulares bem definidas. E)
Granulócitos da submucosa apresentam características
típicas. F) Mitocôndrias com cristas evidentes comprovam a
integridade da fixação do material examinado........................ 60
Figura 14 – Análises comparativa da atividade fagocítica de macrófagos,
de O. mykiss dos dois grupos, aos 90 dias de experimento.
A) Índice fagocítico; B) Capacidade fagocítica; C)
Capacidade fagocítica X índice fagocítico (CF X IF). Barras
mostram média ± DP. Não houve diferença significativa
entre os grupos (p>0,05)......................................................... 61
Figura 15 – Contagem diferencial de leucócitos em extensões
sanguíneas de O. mykiss. Barras mostram média ± DP,
valores expressos em unidades. Letras mostram diferença
entre os grupos (p<0,05)......................................................... 62
Figura 16 – Parâmetros de desempenho de O. mykiss, dos quatro
grupos experimentais, aos 30 dias de experimento. Barras
mostram média ± DP. Letras mostram diferença entre os
grupos (p<0,05).......................................................................
64
Figura 17 – Comparação do ganho de massa dos grupos GD e GAD. A)
Ganho de massa aos 24 dias de experimento; B) Massa
durante os sete dias de aplicação de dexametasona C)
Ganho de massa durante os sete dias de aplicação de
dexametasona. Barras mostram média ± DP. (*)= p<0,05...... 65
Figura 18 – Análise comparativa da altura do epitélio intestinal das
diferentes porções do intestino de O. mykiss. A) Cecos
pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final
do intestino; E) Altura do epitélio das quatro porções
intestinais, com linha de tendência (polinômio de três fases).
Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção média (IM),
porção final do intestino (IF). Barras mostram média ± DP,
valores expressos em µm. Letras mostram diferença entre
os grupos (p<0,05)..................................................................
66
Figura 19 – Análise comparativa da densidade de células de muco nas
diferentes porções intestinais de O. mykiss. A) Cecos
pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final
do intestino; E) Densidade de células de muco das quatro
porções intestinais, com linha de tendência (polinômio de
três fases). Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção
média (IM), porção final do intestino (IF). Barras mostram
média ± DP, valores expressos em células por mm2. Letras
mostram diferença entre os grupos (p<0,05).......................... 68
Figura 20 – Avaliação ultraestrutural do intestino de O. mykiss. Os
grupos mostraram morfologia intestinal similar, os
enterócitos apresentam a cutícula estriada característica,
abundância de mitocôndrias, uma faixa bem definida, com
ausência de organelas logo abaixo à projeção das
microvilosidades, presença de junções celulares (C) bem
definidas. A) GAD, 1000x. B) GC, 1000x. C) GD, 10000x.
D) Fibras colágenas do estrato compacto, 15000x. E)
Granulócitos eosinófilos da submucosa do GC, 2000x. F)
Granulócitos eosinófilos da submucosa do GD com
morfologia indicativa de degranulação, 2500x........................
69
Figura 21 – Análises comparativa da atividade fagocítica de O. mykiss.
A) Índice fagocítico; B) Capacidade fagocítica; C)
Capacidade fagocítica X índice fagocítico. (CF X IF). Barras
mostram média ± DP. Não houve diferença significativa
entre os grupos (p>0,05)......................................................... 70
Figura 22 – Contagem diferencial de leucócitos em extensões
sanguíneas de O. mykiss. Barras mostram média ± DP,
valores expressos em unidades. Letras mostram diferença
entre grupos (p<0,05).............................................................. 71
Figura 23 – Atividade de lisozima das amostras de soro sanguíneo dos
quatro grupos experimentais. Diluição ¼, leitura em 570nm.
Linhas mostram média ± DP, valores expressos em U. Não
houve diferença significativa entre os grupos
(p>0,05)...................................................................................
72
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Massa corpórea e medidas de O. mykiss, durante os 90
dias de experimento. Valores expressos em média ± DP.
Massa em gramas (M); Comprimento total em cm (CT);
comprimento padrão em cm (CP)............................................ 55
Tabela 2 – Ferritina presente no tecido intestinal. Valores referentes à
porcentagem de ferritina presente na área do tecido, em
relação ao total de área de tecido fotografados...................... 57
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µm – Micrômetros
ºC – Graus centígrados
AA – Ácido ascórbico
ACTH – Hormônio Adrenocorticotrófico
Ag – Antígeno
APC – Células apresentadoras de antígenos
cc – Células caliciformes
CDL – Contagem diferencial de leucócitos
CEUA – Comissão de ética no uso de animais
CF – Capacidade fagocítica
CO2 – Dióxido de carbono
CP – Cecos pilóricos
CP – Comprimento padrão
CT – Comprimento total
D – Dias de experimento
DP – Desvio padrão
e – Epitélio
ec – Estrato compacto
E – Estômago
FAO – Food and Agriculture Organization of the United Nations
FBS – Soro fetal bovino
FGF – Fator de crescimento de fibroblastos
G – Força gravitacional
g – Grama
GA – Grupo Aditivo
GAD – Grupo Aditivo Dexametasona
GALT – Tecido linfoide associados ao intestino
GC – Grupo Controle
GD – Grupo Dexametasona
GP – Ganho de peso
HE – Hematoxilina & Eosina
HHI – Hipotálamo-hipófise-interrenal
IA – Intestino anterior
If – Índice fagocítico
IF – Intestino final
IgM – Imunoglobulina de classe M
IHS – Índice hepatossomático
IL - Interleucina
IM – Intestino médio
IP – Intestino posterior
K – Fator de condição
Kg – Kilograma
li – Linfócito intraepitelial
lp – Lâmina própria
M – Molar
M(g) – Massa
Mɸ - Macrófago
MCH – Hormônio Concentrador de Melanina
MET – Microscopia eletrônica de transmissão
mg – Miligramas
mg/L – Miligrama por litro
MHC – Complexo principal de histocompatibilidade
min – Minutos
mL – Mililitro
mm3 – Milímetros cúbicos
MSH – Hormônio melanotrófico
NK – Linfócito natural killer
nm – Nanômetro
OsO4 – Tetróxido de ósmio
PAS – Periodic acid shiff
PBS – Tampão fosfato-salino
pH – Potencial Hidrogeniônico
ppm – Partes por milhão
qsp – Quantidade suficiente para
RC – Rendimento de carcaça
S – Sobrevivência
SBCAL – Sociedade Brasileira de Ciências de Animais de Laboratório
sIgM – Imunoglobulina M de superfície
t – Tonelada
Tc-cell – Linfócito T citotóxico
TCE – Taxa de crescimento específico
Th-cell – Linfócito T helper
U – Unidade de lisozima
va – Vacúolos absortivos
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 22
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................... 25
2.1 O modelo experimental................................................................................. 25
2.2 Efeitos do estresse no desempenho animal............................................... 27
2.3 O sistema imune inespecífico dos teleósteos............................................ 30
2.4 O trato intestinal dos salmonídeos............................................................. 34
2.5 Porque usar imunoestimulantes em pisciculturas..................................... 34
2.6 Os flavonoides e suas ações....................................................................... 35
2.7 O acido ascórbico e suas ações.................................................................. 37
2.8 Sinergismo entre flavonoides e acido ascórbico....................................... 38
3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 39
3.1 Manutenção.................................................................................................... 39
3.2 Experimento 1................................................................................................ 40
3.3 Experimento 2................................................................................................ 41
3.4 Avaliação dos parâmetros zootécnicos....................................................... 42
3.5 Avaliação do trato digestório........................................................................ 45
3.5.1 Microscopia de luz...................................................................................... 45
3.5.2 Microscopia eletrônica de transmissão (MET)......................................... 45
3.5.3 Absorção de macromoléculas................................................................... 46
3.5.4 Altura do epitélio absortivo........................................................................ 46
3.5.5 Densidade de células de muco.................................................................. 47
3.6 Avaliação do sistema imune inespecífico................................................... 49
3.6.1 Avaliação de fagocitose in vitro................................................................ 49
3.6.2 Contagem diferencial de leucócitos.......................................................... 52
3.6.3 Atividade de lisozima.................................................................................. 54
3.7 Análises estatísticas....................................................................................... 54
4 RESULTADOS.................................................................................................... 55
4.1 Experimento 1................................................................................................ 55
4.1.1 Avaliação dos parâmetros zootécnicos.................................................... 55
4.1.2 Avaliação do trato digestório..................................................................... 57
4.1.2.1 Absorção de macromoléculas.................................................................... 57
4.1.2.2 Altura do epitélio absortivo......................................................................... 58
4.1.2.3 Densidade de células de muco.................................................................. 59
4.1.2.4 Avaliação ultraestrutural............................................................................. 60
4.1.3 Avaliação do sistema imune inespecífico................................................ 61
4.1.3.1 Avaliação de fagocitose in vitro.................................................................. 61
4.1.3.2 Contagem diferencial de leucócitos........................................................... 62
4.2 Experimento 2................................................................................................ 63
4.2.1 Avaliação dos parâmetros zootécnicos.................................................... 63
4.2.2 Avaliação do trato digestório..................................................................... 65
4.2.2.1 Altura do epitélio absortivo......................................................................... 65
4.2.2.2 Densidade de células de muco.................................................................. 67
4.2.2.3 Avaliação ultraestrutural............................................................................. 69
4.2.3 Avaliação do sistema imune inespecífico................................................ 70
4.2.3.1 Avaliação de fagocitose in vitro.................................................................. 70
4.2.3.2 Contagem diferencial de leucócitos........................................................... 70
4.2.3.3 Atividade de lisozima................................................................................. 72
5 DISCUSSÃO....................................................................................................... 73
6 CONCLUSÃO..................................................................................................... 83
REFERENCIAS...................................................................................................... 84
P á g i n a | 22
1 INTRODUÇÃO
A ocorrência de doenças em piscicultura é consequência de diversos fatores
envolvidos nos métodos zootécnicos da criação e de variações nas condições
ambientais, como por exemplo, as mudanças das condições adequadas de
concentração de oxigênio dissolvido, pH, temperatura, salinidade, ainda pode
ocorrer o aumento de concentrações de amônia, ou de CO2, bem como a presença
de poluentes na água e o próprio manejo zootécnico empregado, que
frequentemente envolve a captura e transporte dos animais, adicionalmente pode
haver elevada densidade populacional. Essas são algumas das características
zootécnicas que fazem parte da ampla variedade de situações capazes de induzir o
estresse em peixes (ALKAHEM, 1994; ALMAZÁN-RUEDA; SCHARMA; VERRETH,
2004; KRASNOV et al., 2005; PETRELL; ANG, 2001; SMART, 1981;
WEDEMEYER,1969; YADAV; AKELA, 1993). A severidade do estresse varia com o
tipo, intensidade e o tempo de duração do fator estressante e ainda da espécie de
peixe considerada (STOSKOPF, 1993; WOO; BRUNO, 1998).
Os peixes teleósteos submetidos ao estresse apresentam aumento dos níveis
sanguíneos de corticosteroides, seguido pela redução do número de linfócitos
circulantes, e de reorganização metabólica, que acarretam prejuízos em algumas
funções, em especial, as imunológicas, o que resulta na imunossupressão dos
animais (TORT, 2011; WENDELAAR BONGA, 1997). Os corticosteroides participam
na regulação do equilíbrio hidromineral, metabolismo energético, imunidade e
capacidade reprodutiva dos animais. Em termos de respostas imunológicas e
inflamatórias, traços característicos do estresse são: a redução do tamanho do timo,
do baço e de outras estruturas linfáticas, mudanças no número e distribuição dos
leucócitos, assim como de suas atividades no organismo, além do aparecimento de
hemorragias e de úlceras no canal alimentar (TORT, 2011; WENDELAAR BONGA,
1997). Desta forma, a criação intensiva de peixes pode, através do estresse, afetar a
homeostase tornando-os mais suscetíveis à potenciais organismos patogênicos
(PAVANELLI; EIRAS; TAKEMOTO, 1998). A dexametasona é um glicocorticoide
sintético, que apresenta uma potente ação anti-inflamatória, podendo ser utilizada
para mimetizar o efeito do estresse nos animais, sem alterar outros parâmetros,
como os de qualidade de água e/ou densidade populacional (KHOR; SOGA;
PARHAR, 2013; LE et al., 2005; POTTINGER, 1990).
P á g i n a | 23
Para o controle das enfermidades bacterianas, os antibióticos são comumente
utilizados, porém, o uso inapropriado desses quimioterápicos pode provocar a
seleção de algumas cepas patogênicas resistentes, além de ser fonte de poluição
ambiental. Na Europa, desde 2006, baniu-se completamente o uso de antibióticos,
como aditivos dietários em pecuária, devido aos riscos de gerar uma microbiota
resistente aos antibióticos utilizados em terapias humanas e animais. Visando
mitigar o uso de antibióticos no tratamento de doenças, temos a implementação da
ração com aditivos fitogênicos, incluindo-se aqui os flavonoides e
imunoestimulantes, como o acido ascórbico (BOYD; MASSAUT, 1999; PLANAS;
CUNHAS; MUNILLA, 1995; CLARKE, 2006; WINDISCH et al., 2008).
Os flavonoides são pigmentos biológicos naturais, responsáveis pelas
atrativas cores presentes nas frutas, flores e folhas dos vegetais, estão presentes
também nas sementes, cascas de árvores, raízes, talos, e em seus subprodutos,
tais como chás e vinhos. Os flavonoides representam um dos grupos fenólicos mais
importantes e diversificados entre os produtos de origem natural, e mais de cinco mil
já foram identificados e classificados (BEECHER, 2003; HAVSTEEN, 2002;
NARAYANA et al., 2001; NIJVELDT et al., 2001; SIMÕES et al., 2004). Suas
atividades estão principalmente relacionadas aos efeitos antioxidantes, anti-
inflamatórios e antitumorais (CAZAROLLI et al., 2008; HAVSTEEN, 2002). Em
humanos são tratados como nutracêuticos, e na aquicultura, vêm sendo aplicados
para incrementar a imunidade e aumentar a resistência às doenças (TRICHET,
2010). Outra atividade conhecida é a inibição de inflamações crônicas em diferentes
modelos animais, alguns dos mecanismos responsáveis por suas ações estão
ligados à atividade antioxidante e de eliminação de radicais livres (KIM et al., 2004).
Diversos flavonoides afetam especificamente a função de enzimas envolvidas em
processos inflamatórios (HUNTER, 1995), tornou-se evidente que estas enzimas
estão intimamente envolvidas na transdução de sinais e processos de ativação
celular envolvendo células do sistema imune (MIDDLETON; KANDASWAMI;
THEOHARIDES, 2000).
O ácido ascórbico (AA) é essencial para a síntese de colágeno, formação
óssea, hematopoiese, maturação de eritrócitos, manutenção da hemoglobina no
sangue, utilização do ferro, detoxificação de compostos, bem como para uma série
de funções metabólicas, incluindo-se aqui atuações como parte do sistema
antioxidante e imunoestimulante em peixes (HURST; BARRETTE, 1989; LALL,
P á g i n a | 24
2000; NAVARRE; HALVER, 1989).
O AA também tem sido apresentado como capaz de amenizar os impactos
negativos em peixes, causado pela contaminação da água e por estresse induzido
por manejo em peixes saudáveis, modulando a resistência dos mesmos às doenças.
A associação do AA com flavonoides, apresenta uma atuação sinérgica,
amplificando a imunidade entérica, tanto pelo aumento da fagocitose por células
imunes, como pela eficiência dos capilares intestinais, envolvidos no processo de
absorção de nutrientes (BATISTA, 2005; LALL, 2000).
Devido aos conhecidos efeitos benéficos dos flavonoides e AA, hipotetizou-se
que estes, administrados oralmente, poderiam auxiliar a resposta imune intestinal e
ainda influenciar parâmetros de desempenho e imunidade inata das trutas arco-íris
(Oncorhynchus mykiss). Para tanto, o estudo em questão visou avaliar o efeito da
administração oral destes no desempenho zootécnico, parâmetros do sistema imune
inespecífico e trato digestório de juvenis de trutas arco-íris, a curto (30 dias) e longo
(90 dias) prazo; sob condições de manutenção adequadas e após aplicação de
glicocorticoide exógeno. Sendo assim, esses dados são de extrema relevância para
a melhor compreensão do efeito do uso destes agentes como aditivos dietários em
pisciculturas.
P á g i n a | 25
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O modelo experimental
A truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) é um peixe teleósteo, da família
Salmonídae, sua carne possui excelentes qualidades nutricionais, é fonte de
vitaminas, sais minerais e Ômega 3 (AGREN et al, 1988; CHEN et al., 2006). A truta
arco-íris foi incorporada a técnica da piscicultura, sendo uma das espécies mais
antigas a ser cultivada na indústria aquícola mundial. Sua distribuição natural se
estende do sul do Alasca até o norte do México e devido as suas boas
características, tanto para aquicultura quanto para a pesca esportiva, encontra-se
amplamente distribuída em todas as águas frias do mundo, exceto no continente
Antártico (FAO, 1988; SCHMIDT, 2000).
Segundo dados do documento “The state of world fisheries and aquaculture
2012”, produzido pela Food and Agriculture Organization of the United Nations
(FAO), as trutas arco-íris são a terceira espécie de peixe diádromos – que ao longo
do ciclo de vida migram entre água doce e salgada – mais produzidos no mundo,
estando atrás apenas do salmão do Atlântico (Salmo salar) e do peixe-leite (Chano
chanos) (FAO, 2012). Estes dados demonstram a relevância de estudos com a
espécie, que visem contribuir com o melhoramento da produtividade das
pisciculturas.
No Brasil, a espécie foi introduzida por volta de 1949, por iniciativa do
Ministério da Agricultura, com objetivo de povoar os rios das regiões serranas do
Sudeste brasileiro, pobres em fauna aquática nativa. No entanto, somente em 1974
que a truticultura comercial começou no Brasil, por iniciativa do empresário Evaristo
Comolatti e participação do técnico Kiyoshi Koike, em Campos de Jordão (DIAS,
1996; FARIA, 19711 apud SATO, 2011). No último Censo Aquícola Nacional
realizado em 2008, foram recenseadas 91 unidades produtivas de truta, sendo
destas, 53% na região Sul e 47% na Sudeste (Figura 1). Em relação à produção
nacional, segundo o último Boletim estatístico da pesca e aquicultura, 3.277,2 t de
pescado de truta foram produzidas em 2011 (BRASIL, 2011).
1 FARIA, A. Aclimatação da truta arco-íris no Brasil. Revista Nacional da Pesca, v. 13, n. 106, p. 14-15, jul,
1971.
P á g i n a | 26
Figura 1 – Unidades produtivas de trutas no Brasil em 2008.
Exibido em verde as unidades produtivas de truta. As áreas claras mostram os municípios onde não foi feito recenseamento. Fonte: Censo Aquícola Nacional – 2008 (BRASIL, 2013).
Segundo a FAO (2012), 60% dos peixes consumidos no mundo ainda são
provenientes da pesca. Considerando-se que a pesca é um recurso natural limitado,
os estudos que beneficiem o desenvolvimento da piscicultura, particularmente, da
truticultura, são relevantes não somente do aspecto econômico, mas também para a
sustentabilidade ambiental. Ainda levando em consideração à importância científica,
a truta arco-íris é considerada um bom modelo alternativo para estudos (BAILEY;
WILLIAMS; HENDRICKS, 1996). A truta arco-íris surge como importante espécie
para estudos, pois há ampla informação disponível na literatura especializada,
iniciando na década de 40 (WALD, 1941), sendo assim sua fisiologia é
extensivamente conhecida (DEMERS; BAYNE, 1997).
P á g i n a | 27
2.2 Efeitos do estresse no desempenho animal
A ocorrência de doenças em piscicultura é consequência direta de diversos
fatores envolvidos nos métodos zootécnicos de criação e/ou de variações nas
condições ambientais. Mudanças nas condições adequadas da água como
concentração de oxigênio dissolvido, pH, temperatura, salinidade, concentrações de
amônia e de CO2, presença de poluentes, bem como no manejo zootécnico,
principalmente em relação à densidade populacional, captura e transporte, fazem
parte da ampla variedade de situações capazes de induzir estresse em peixes
(ALKAHEM, 1994; ALMAZÁN-RUEDA; SCHARMA; VERRETH, 2004; KRASNOV et
al., 2005; PETRELL; ANG, 2001; SMART, 1981; WEDEMEYER, 1969; YADAV;
AKELA, 1993). Na presença de um estressor, uma reorganização metabólica é
induzida na tentativa de retornar a homeostase. A resposta de luta ou fuga,
associada à ativação do sistema nervoso simpático, envolve alteração de vários
sistemas e órgãos sensoriais: aumento da percepção, mudança das funções
cardiovasculares e o status dos sistemas efetores de imunidade inata. Estresses
agudos, mas suficientes para provocar a resposta de luta ou fuga, nem sempre têm
consequências fisiológicas negativas (DEMERS; BAYNE, 1997; KIECOLT-GLASER
et al., 1992). O problema ocorre quando os estressores são diversos ou crônicos,
fazendo com que o organismo estafe sua reservas metabólicas, impedindo assim
que este retorne a homeostase, isso afeta a eficiência de diversas funções,
retardando o crescimento, alterando a osmorregulação, afetando o processo
reprodutivo, e principalmente impactando o sistema imune. Assim, o estresse agudo
pode melhorar componentes imune inatos e humorais, enquanto que o estresse
crônico geralmente causa a imunossupressão (DEMERS; BAYNE, 1997). Desta
forma, o estresse crônico ocasiona comprometimento da defesa imunológica e
consequentemente, resulta em uma menor resistência a patógenos (SCHRECK,
2010; TAKAHASHI; SAKAMOTO, 2013; TORT, 2011).
Os peixes respondem ao estresse através do aumento de catelcolaminas e
dos níveis de cortisol, que é o principal corticosteroide em peixes e humanos. O
cortisol regula diversos sistemas, como o metabolismo de glicose, função
osmorregulatória, comportamento e ainda parâmetros de imunidade. Em teleósteos,
o cortisol é sintetizado e secretado pelas células esteroidogênicas, presentes no
tecido inter-renal, que são intercaladas por células cromafins, que sintetizam
P á g i n a | 28
adrenalina. Desta forma, o tecido interrenal é análogo ao córtex adrenal de
mamíferos. Aa resposta ao estresse em peixes ocorre pelo eixo hipotálamo-hipófise-
interrenal (HHI) (ALSOP; VIJAYAN, 2009a,b, 2008; GRASSI-MILANO; BASARI;
CHIMENTI, 1997; RAMSAY et al., 2009; WENDELAAR BONGA, 1997). A figura 2A
mostra os órgãos e tecidos endócrinos envolvidos na resposta ao estresse. Na figura
2B é apresentado um esquema da sequência da resposta ao estresse em peixes,
com suas vias alternativas de controle.
Em termos de respostas imunitárias e inflamatórias, traços característicos do
estresse são a retração do timo, do baço ou outras estruturas linfáticas no corpo;
mudanças no número e distribuição dos leucócitos no organismo; ou aparecimento
de hemorragias ou úlceras no canal alimentar (TORT, 2011). Outros efeitos também
encontrados em animais sob estresse são alterações intestinais como: função dos
enterócitos prejudicada; dano dos complexos juncionais devido à dissociação de
desmossomos e nexus (RINGØ et al., 2014), que são estruturas responsáveis pela
coesão e comunicação das células do tecido (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2010).
Uma vez que o intestino esteja comprometido, o processo digestório e a
absorção de nutrientes serão afetados. Além disso, já que o intestino constitui uma
das maiores portas de entrada para patógenos, alterações deste tipo poderiam
facilitar a entrada de patógenos oportunistas na circulação, o que, associado aos
efeitos imunossupressores ocasionados pelo estresse, facilita em muito o
estabelecimento de doenças. Estes fatores, em conjunto, acarretam perdas
significativas para a produção em pisciculturas, deixando clara a importância dos
estudos voltados para o uso de imunoestimulantes e aditivos dietários, que podem
auxiliar a diminuir os impactos ocasionados pelo estresse.
A dexametasona é um glicocorticoide sintético, que apresenta uma potente
ação anti-inflamatória, esta pode ser utilizada para mimetizar o efeito do estresse
nos animais, sem alterar outros parâmetros de qualidade de água e/ou densidade
populacional (KHOR; SOGA; PARHAR, 2013; LEATHERLAND, 1987; LE et al.,
2005; POTTINGER, 1990). Ainda, a aplicação de glicocorticoide exógeno
(dexametasona) permite uma padronização do estudo, já que em peixes a resposta
ao estresse apresenta variações individuais (POTTINGER; MORAN; MORGAN,
1994; POTTINGER; PICKERING; HURLEY, 1992; POTTINGER; CARRICK, 1999;
WEIL; BARRY; MALISON, 2001).
P á g i n a | 29
Figura 2 – Órgãos endócrinos e reação ao estresse em peixes.
Hormônio Adrenocorticotrófico (ACTH); Hormônio melanotrófico (MSH); Hormônio Concentrador de Melanina (MCH). Modificado de Ross; Ross (2008).
Tireoide
Hormônio do Crescimento
Tecido Interrenal Cortisol
Cortisona Aldosterona
Tecido Cromafim Adrenalina
Noradrenalina
Hipotálamo – Hipófise
ACTH
Prolactina
Hormônio do Crescimento
Hormônio Tireotrófico
Hormônio Gonadotrófico
MSH e MCH
Gônadas Hormônios Sexuais
Sistema Nervoso Central
Resposta Motora Nervo-
Mediada
Liberação de Outros
Hormônios
Estressor Externo Atuando Sobre
Receptores Primários
Células Inter-renais Liberam Hormônios
Esteróides
Tecido Cromafim Liberam
Catecolaminas
Hipotálamo-Hipófise
Liberam ACTH
Resposta do Animal
Distribuição Via Circulação Sanguínea
A
B
P á g i n a | 30
2.3 O sistema imune inespecífico dos teleósteos
Existem em torno de 28 mil espécies diferentes de peixes, fazendo deste o
maior grupo em número e diversidade dentre os vertebrados. Os peixes são
tradicionalmente divididos nos grupos Osteichthyes, que compreende os peixes
ósseos; Chondrichthyes, que são os peixes cartilaginosos como tubarões e raias; e
grupos Agnatha e Cyclostomata de peixes sem maxilas, como as lampreias
(NELSON, 2006).
A imunologia apresenta variações especificas inerente a cada classe, no
entanto similaridades existem. Diversas características imunológicas dos peixes
foram preservadas até aos grupos mais recentes, como por exemplo os mamíferos
(ZAPATA; CHIBA; VARAS, 1996). Por esta razão, a descrição referente a
imunologia será abordada com enfoque na infraclasse teleostei, neste grupo,
integram-se a maioria dos peixes comuns e formas mais derivadas, incluindo-se aqui
a família das trutas e salmonídeos e utilizaremos a comparação com os mamíferos
para melhor elucidar a imunologia dos peixes.
O sistema imune pode ser classificado do ponto de vista funcional em duas
classes: o sistema imune inato, inespecífico ou natural; e o sistema imune
adaptativo, específico ou adquirido. Como nos mamíferos, os peixes possuem
mecanismos de defesa inespecíficos e os específicos. Este último requer longo
período de tempo para a síntese de anticorpos e ativação de células específicas,
principalmente devido a natureza ectotérmica dos peixes. Assim, em peixes, o
sistema imune inespecífico é de principal importância para combater as infecções
(ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2010; ANDERSON; JENEY, 1992; MAGNADÓTTIR,
2006).
O sistema inato atua como primeira linha de defesa do organismo contra a
presença de um agente patógeno e no controle de muitas infecções sem recorrer ao
sistema específico, ou seja, ele não tem memória imunológica. Os mecanismos de
defesa inespecíficos são representados basicamente pela inflamação local, cuja
principal característica é o acúmulo de leucócitos no tecido invadido. Desta forma, o
organismo tenta eliminar o agente agressor via fagocitose e/ou secreção de enzimas
líticas, ou isola-lo por meio de uma barreira de leucócitos e tecido conjuntivo
(ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2010; GARCIA-LEME, 1989; LEVRAUD; BOUDINOT,
2009; MAGNADÓTTIR, 2006).
P á g i n a | 31
O sistema imune inespecífico é constituído por parâmetros físicos, humorais e
celulares. Os parâmetros físicos são as escamas, e a superfície mucosa que recobre
a pele, brânquias e epitélio gastrointestinal. O muco além de constituir uma barreira
física, ainda apresenta uma série de fatores, que possibilitam o combate de
substâncias estranhas de maneira inespecífica.
Os parâmetros humorais existentes nos peixes são proteínas solúveis como
lisozima, interferons e complemento. A lisozima é uma enzima hidrolítica encontrada
em secreções mucosas, que é capaz de clivar a camada de peptidoglicano da
parede celular bacteriana. Os interferons são um grupo de proteínas produzidas por
células infectadas por vírus, que têm a capacidade de se ligar as células vizinhas e
induzir um estado antiviral generalizado. Complemento é um grupo de proteínas
séricas que circulam num estado inativo. Uma variedade de mecanismos
imunológicos específicos e não específicos pode converter as formas inativas de
proteínas de complemento para um estado ativo, com a capacidade de danificar as
membranas dos organismos patogénicos, ou destruí-los ou de facilitar a sua ruptura
(MAGNADÓTTIR, 2006). Adicionalmente os peixes possuem parâmetros humorais
como a transferrina, que é um inibidor do crescimento bacteriano, atua como
quelante de ferro disponível, essencial para a manutenção bacteriana; Inibidores de
protease, realizam a defesa contra patógenos, que secretam enzimas proteolíticas;
Enzimas líticas, agindo individualmente ou em uma cascata, são elementos
importantes de defesa especialmente contra bactérias; Aglutininas como pentraxinas
e lectinas também estão presentes no soro e muco, possuem especificidade de
ligação para diferentes carboidratos como manose, N-acetil glucosamina ou fucose
(MAGNADÓTTIR, 2006). A interação destas proteínas com os carboidratos conduz a
opsonização, fagocitose e ativação do sistema complemento. Uma variedade de
tipos de leucócitos está envolvida nas defesas celulares não específicas do peixe,
incluindo monócitos/macrófagos, granulócitos e células citotóxicas não específicas e
ainda, células dendríticas e epiteliais (MAGNADÓTTIR, 2006; SECOMBES, 1996).
A classificação dos leucócitos e demais células sanguíneas dos peixes foi
baseada na sua semelhança morfológica com as células dos mamíferos, por esta
razão seus nomes são os mesmos, mas algumas funções são diferenciadas
(AINSWORTH, 1992). As células sanguíneas dos peixes incluem os eritrócitos,
leucócitos e células hemostáticas. Existem algumas diferenças consideráveis entre
elas: assim como na maioria dos vertebrados não mamíferos, os eritrócitos dos
P á g i n a | 32
peixes são nucleados e ovais; ao invés de plaquetas, os peixes possuem
trombócitos nucleados (CLAVER; QUAGLIA, 2009).
Os leucócitos de forma geral podem ser classificados como granulócitos ou
polimorfonucleares e os agranulócitos. Os granulócitos possuem um núcleo irregular
e grânulos envoltos por membrana, estes distinguem-se em três tipos: neutrófilos,
eosinófilos e basófilos. Os agranulócitos possuem uma forma mais regular e seu
citoplasma não possui granulações específicas, distinguem-se em dois tipos: os
linfócitos e os monócitos (CLAVER; QUAGLIA, 2009; JUNQUEIRA; CARNEIRO,
2010).
Em relação aos peixes os leucócitos presentes são: linfócitos B, T e natural
killer (NK), neutrófilos, eosinófilos, além de monócitos/macrófagos e
melanomacrófagos (AFONSO; ELLIS; SILVA, 1997; CLAVER; QUAGLIA, 2009;
HINE, 1992). Os neutrófilos dos peixes possuem uma variedade de formas, estes
podem apresentar um núcleo em forma de rim ou dividido em lóbulos, assim como
dos mamíferos. No entanto podem ser classificados também como heterófilos, isso,
de acordo com o tamanho dos grânulos presentes, alguns autores no entanto
sugerem o uso do termo neutrófilo apenas para mamíferos (CLAVER; QUAGLIA,
2009; HINE, 1992; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2010). Os eosinófilos foram descritos
para algumas espécies de peixes, e estes são morfologicamente similares aos
eosinófilos de humanos, mas sua função ainda não está completamente esclarecida,
parecendo desempenhar papel similar a dos mastócitos. Estes estão presentes
principalmente no trato digestório e brânquias, e foram associados com estimulação
antigênica e infestação por parasitas; Enquanto os basófilos estão ausentes na
maioria das espécies de peixes (CLAVER; QUAGLIA, 2009; HINE, 1992).
A diferenciação morfológica entre alguns leucócitos não é tão simples como
em mamíferos, sendo muitas vezes necessário empregar técnicas histoquímicas ou
imuno-histoquímicas, associadas às colorações, ou mesmo utilizar microscopia
eletrônica de transmissão para diferencia-los, isso porque os peixes apresentam
linfócitos grandes, que podem ser confundidos com monócitos. Os neutrófilos e os
monócitos também podem ser confundidos, pois apresentam tamanho similar e a
morfologia do núcleo de ambos pode variar durante a fase de maturação celular
(AFONSO; ELLIS; SILVA, 1997; CLAVER; QUAGLIA, 2009; HINE, 1992;
SECOMBES, 1996).
Os peixes antecedem os mamíferos filogeneticamente, por isso apresentam
P á g i n a | 33
em um mesmo órgão a função dos tecidos mieloides e linfoides associados, isso é,
desempenham a hematopoiese, filtram a linfa e produzem anticorpos no rim cefálico,
baço e tecidos associados com o intestino. Já os mamíferos tem estas funções
realizadas em distintos órgãos, como a medula óssea e os linfonodos, órgãos
ausentes nos peixes (ELLIS, 1976; ZAPATA, 1979; ZAPATA et al., 2006; ZAPATA;
COOPER, 1990). Estudos ontogênicos em salmão do Atlântico e truta arco-íris
mostram que o rim cefálico é o principal órgão responsável pela hematopoiese
desde o estágio larval, enquanto o baço demonstra ser um órgão muito rudimentar,
comparado ao baço dos mamíferos. Desta maneira, em peixes, este órgão não é
essencial para a maturação imunológica (ESTEBAN et al., 1989; FORERO, 1995;
PADRÓS; CRESPO, 1996; RAZQUIN et al., 1990). A figura 3 sintetiza o sistema
imune dos peixes, mostrando seus principais componentes inatos e adquiridos, além
da comunicação que ocorre entre os dois sistemas.
Figura 3 – O sistema imune dos teleósteos.
A primeira barreira imunológica é a física, representada pelo muco presente na pele, que ainda possui componentes humorais, complemento, lisozima e proteína C reativa. A segunda barreira é representada pelas células fagocíticas, monócitos/macrófagos e neutrófilos, que são produzidos no rim cefálico e estão presentes no peritônio, sangue, baço e rim. A comunicação entre sistema imune inato e adquirido ocorre pelas células apresentadoras de antígenos (APC), que possuem complexo principal de histocompatibilidade (MHC), esses induzem a maturação dos linfócitos B e T em células produtoras de antígenos, criando a memória imunológica. Antígeno (Ag); Imunoglobulina M de superfície (sIgM); Interleucina (IL); Linfócito T helper (Th-cell); Linfócito T citotóxico (Tc-cell); Macrófago (Mɸ). Modificado de Köllner et al. (2002).
P á g i n a | 34
2.4 O trato intestinal dos salmonídeos
O trato intestinal é um complexo ecossistema que combina o epitélio
gastrointestinal, células imunes e a microbiota residente (MCCRACKEN; LORENZ,
2001). O intestino apresenta camadas distintas, sendo que a mais interna é a
camada mucosa, formada por projeções alongadas chamadas dobras intestinais,
constituídas de epitélio e lamina própria. O epitélio é do tipo colunar simples,
apresentando núcleos alongados e a cutícula estriada, característico de epitélio
intestinal, assim como células caliciformes produtoras de muco; a submucosa
constituída de conjuntivo frouxo possui um estrato compacto bem definido, formado
de fibras colágenas e corado de maneira acidófila; finalmente as camadas
musculares, circular interna e longitudinal externa.
Peixes não apresentam tecido linfoide associado ao intestino (GALT) de
forma organizada como observados em mamíferos, placas de Peyer ou linfonodos
mesentéricos, assim como local de residência especifica de linfócitos na mucosa
(ROMBOUT et al., 2010). No entanto os teleósteos apresentam um acumulo difuso
de tecido linfoide ao longo do intestino, contendo muitas células linfoides, como
macrófagos, eosinófilos e neutrófilos (DOGGETT; HARRIS, 1991; ROMBOUT et al.,
2010).
O intestino de teleósteos possui três segmentos distintos, baseados na
anatomia microscópica da mucosa: no primeiro segmento, os enterócitos podem ser
consideradas células absortivas; no segundo segmento, os enterócitos estão
caracterizados por apresentarem diversos vacúolos supranucleares, ocorre alta
atividade pinocítica na porção apical e é onde ocorre a maior absorção de
macromoléculas (KHOJASTEH et al., 2009); já o terceiro segmento é o menos
estudado, mas acredita-se que seus enterócitos possuem função osmorregulatóriae,
por apresentarem menor número de microvilos, acredita-se não ter função
nutricional (STROBAND; MEER; TIMMERMANS, 1979).
2.5 Porque usar imunoestimulantes em pisciculturas
O uso de antibióticos como promotores de crescimento está banido na Europa
desde 2006, devido aos riscos de gerar cepas de microorganismos resistentes a
antibióticos utilizados em terapias humanas e animais. Assim, os aditivos fitogênicos
P á g i n a | 35
tem atraído interesse como uma estratégia alimentar alternativa, para substituir os
antibióticos promotores de crescimento (WINDISCH et al., 2008).
Na piscicultura, a utilização de antibióticos em rações com o objetivo de
diminuir a carga de microrganismos patogênicos, é uma prática usual. Esta prática é
realizada com o objetivo de evitar infecções, geralmente nas fases iniciais da
criação, em razão da baixa resistência dos peixes a agentes agressores nestas
fases. Entretanto, essa prática aumenta a resistência bacteriana contra os
antibióticos, levando ao aparecimento de bactérias cada vez mais difíceis de serem
controladas (CABELLO, 2006). Adicionalmente, como a água das pisciculturas
retorna ao ambiente, os antibióticos também constituem uma fonte de poluição
ambiental (CYRINO et al., 2010).
Sabe-se que a nutrição e a imunidade estão intimamente relacionadas
(FERNANDES, 2008; GRAJEK; OLEJNIK; SIP, 2005; PLAT; MENSINK, 2005;
TRICHET, 2010), por isso bastante atenção tem sido dada ao desenvolvimento de
componentes dietários, que atuem como aditivos e/ou imunoestimulantes em
pisciculturas (DOÑATE et al., 2010; LALL, 2000).
O uso de aditivos fitogênicos (Flavonoides) e de imunoestimulantes (ácido
ascórbico) para a manutenção do desempenho animal e para a prevenção de
doenças vêm se tornando uma prática comum na aquicultura; de fato, e como
relatados têm o potencial de aumentar os mecanismos de defesa inatos dos peixes
frente a patógenos com reflexos positivos na produção de pisciculturas
(BRICKNELL; DALMO, 2005).
2.6 Os flavonoides e suas ações
Os flavonoides representam um dos grupos fenólicos mais importantes e
diversificados entre os produtos de origem natural. Essa classe de metabólitos
secundários são pigmentos biológicos naturais (substâncias polifenólicas), que estão
amplamente distribuídas no reino vegetal (SIMÕES et al., 2004). São encontrados
em frutas, vegetais, sementes, cascas de árvores, raízes, talos e flores. Mais de
cinco mil flavonoides já foram identificados e classificados, sendo muitos deles
responsáveis pelas atrativas cores presentes nas frutas, flores e folhas das plantas.
Ainda estes são responsáveis pelos efeitos benéficos relatados para uma série de
produtos, tais como os chás, vinhos e própolis, onde os flavonoides estão presentes
P á g i n a | 36
em grande quantidade (BEECHER, 2003; HAVSTEEN, 2002; NARAYANA et al.,
2001; NIJVELDT et al., 2001).
A estrutura dos flavonoides é caracterizada pelo seu núcleo básico (C6-C3-
C6), formado de dois anéis benzênicos (A e B), interligados por um anel pirano (C)
(Figura 4). As diferentes classes de flavonoides se dão devido ao nível de oxidação
do anel central, originando assim: chalconas, flavanonas, flavanonóis, flavonas,
flavonóis, isoflavonas, flavan-3-ols, catequinas e antocianidinas (BOOTS; HAENEN;
BAST, 2008; CAZAROLLI et al., 2008; NIJVELDT et al., 2001; ROTELLI et al., 2003;
VEITCH; GRAYER, 2008). A diversidade estrutural dos flavonoides pode ser
atribuída ao nível de oxidação e às variações no esqueleto carbônico básico,
promovidas por reações de alquilação, glicosilação ou oligomerização (TAHARA,
2007). Sendo assim, estes podem ser encontrados como agliconas ou sob a forma
de glicosídeos e/ou derivados metilados e/ou acilados (HAVSTEEN, 2002; SIMÕES
et al., 2004; VEITCH; GRAYER, 2008), e sua forma influencia a sua taxa de
absorção pelo intestino (NIJVELDT et al., 2001).
Figura 4 – Núcleo básico dos flavonoides.
Os flavonoides são conhecidos principalmente por seus efeitos antioxidantes,
anti-inflamatórios e antitumorais. No entanto uma série de atividades já foi descrita
para essas substâncias, como: atividade antiviral, captação de radicais livres,
atividade bactericida, hepatoprotetora, além de atuarem como inibidores de atividade
enzimática, influenciar beneficamente casos de diabetes mellitus, asma, alergias,
doenças coronárias e estresse (CAZAROLLI et al., 2008; GEORGIEV; ANANGA;
TSOLOVA, 2014; HAVSTEEN, 2002; KIM et al., 2004). Em humanos são tratados
como nutracêuticos, e na aquicultura vêm sendo aplicados para incrementar a
imunidade e aumentar a resistência a doenças (GEORGIEV; ANANGA; TSOLOVA,
2014; LIN; WENG, 2006; TRICHET, 2010).
P á g i n a | 37
Os flavonoides foram escolhidos para o presente estudo, por apresentarem
diversas funções benéficas relacionadas a imunidade e ao estresse. Adicionalmente,
o trato digestório é também sensível à atuação dos flavonoides. Em relação à
imunidade, existem diversos relatos de flavonoides que apresentam ações anti-
inflamatórias (BIESALSKI, 2007; CAZAROLLI et al., 2008; KIM et al., 2004;
MIDDLETON; KANDASWAMI; THEOHARIDES, 2000; YOON; BAEK, 2005),
afetando especificamente a função de enzimas envolvidas nesses processos
(HUNTER, 1995), e tornou-se evidente que estas estão intimamente envolvidas na
transdução de sinais e processos de ativação celular, envolvendo células do sistema
imune (MIDDLETON; KANDASWAMI; THEOHARIDES, 2000).
2.7 O acido ascórbico e suas ações
O ácido ascórbico (AA) é o nome comum dado ao ácido 2,3-enediol-L-
gulônico que é uma vitamina hidrossolúvel, essencial para a síntese de colágeno e
reparação de tecidos, atua no organismo como agente redutor no transporte de
hidrogênio no interior das células, está envolvido à síntese de hormônios esteroides
e participa de vários sistemas enzimáticos de hidroxilação, entre os quais a
transformação de prolina em hidroxiprolina (um dos componentes do colágeno e da
matriz extracelular) (NAVARRO, 2008; ROTTA, 2003).
Além disso, o AA é um nutriente essencial para a maior parte das espécies de
peixes e participa como cofator de uma grande variedade de reações químicas
fundamentais para a manutenção da saúde. Além de fazer parte da síntese e do
metabolismo de neurotransmissores, está envolvido na formação dos glóbulos
vermelhos do sangue, produção de corticosteroides, absorção e utilização do ferro e
na manutenção e integridade das paredes capilares. No plasma pode doar
prontamente elétrons para várias espécies reativas, retornando facilmente a seu
estado reduzido, eliminando-as antes que reajam com as membranas e
lipoproteínas biológicas (CHURCH; POND, 1996; KLASING, 1998; WHITEHEAD;
KELLER, 2003).
A atuação do AA no sistema imune dos peixes ocorre em nível celular e está
relacionado à hematopoiese, maturação de eritrócitos, manutenção da hemoglobina
no sangue, proliferação de neutrófilos e aumento na migração de macrófagos
(COMBS, 1998; LIM et al., 2000; NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1993). O AA
P á g i n a | 38
também participa da detoxificação de compostos, bem como do sistema antioxidante
em peixes, atuando assim como um imunoestimulante (HURST; BARRETTE, 1989;
LALL, 2000; NAVARRE; HALVER, 1989). Ainda, o AA também ameniza os impactos
negativos da contaminação ambiental e do estresse induzido por manejo em peixes
saudáveis, e consequentemente na resistência às doenças (BATISTA, 2005; LALL,
2000). Em virtude dos benefícios aqui apresentados, o AA não é apenas um aditivo
nutricional de fundamental importância, mas também uma ferramenta para melhorar
parâmetros zootécnicos na piscicultura.
2.8 Sinergismo entre flavonoides e acido ascórbico
Estudos in vitro indicaram que os flavonoides possuem a propriedade de
retardar a conversão de ascorbato em dehidroascorbato. Um dos mecanismos para
esta proteção envolve a quelação, do cobre e outros traços de metais, pelos
flavonoides, impedindo a oxidação do ácido ascórbico (HAVSTEEN, 2002).
Complementarmente, já foi visto que a auto-oxidação in vitro do flavonoide
quercetina pode ser prevenida utilizando-se baixas concentrações de AA, sugerindo
que a vitamina C da dieta pode prevenir a oxidação dos flavonoides, possibilitando
que essas moléculas estejam biologicamente ativas no organismo, mesmo após o
processo digestivo (DEGÁSPARI; WASZCYNSKYJ, 2004).
Por motivo do seu mútuo poder antioxidante, os flavonoides e o AA
apresentam efeitos sinérgicos em algumas atividades, como por exemplo: na
redução do dano oxidativo na superfície dos fibroblastos, cuja função está
relacionada aos flavonoides, mas que é potencializada na presença do AA; e na
melhora da imunidade entérica, proporcionando aumento da atividade fagocítica e
incrementando a eficiência dos capilares intestinais, durante os processos de
absorção de nutrientes (BATISTA, 2005).
Como antioxidantes, o AA e os flavonoides estão relacionados com o
aumento da imunidade mediada ou não por células, ação ocorrida, em parte, pela
manutenção da estrutura funcional e a integridade estrutural de células importantes
do sistema imunológico (Linfócitos T e B). Essa proteção resulta em uma maior
eficiência produtiva pela diminuição da susceptibilidade dos animais às doenças
causadas pelo estresse e, consequentemente, diminuição das taxas de morbidade e
mortalidade (PETERSON; DWYER, 1998).
P á g i n a | 39
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Manutenção
Todos os peixes utilizados foram fornecidos e mantidos durante os
experimentos, pela Estação Experimental de Salmonicultura “Dr. Ascânio Faria”, da
Apta Regional Vale do Paraíba da Secretaria de Agricultura e Abastecimento do
Estado de São Paulo, localizada dentro do Parque Estadual de Campos do Jordão,
SP, Brasil.
Os grupos experimentais foram mantidos em tanques circulares de fibra de
vidro com 1800 litros de capacidade, contendo cerca de 1500 litros de água em
circulação, abastecimento e escoamento independentes e sob condições naturais de
fotoperíodo. A renovação da água dos tanques foi de aproximadamente duas vezes
o volume total por hora, de modo a suprir a demanda de oxigênio dissolvido. Todos
os grupos foram alimentados três vezes ao dia, com ração comercial padrão
(Laguna Carnívoros Crescimento 45, Socil), contendo 45% de proteína, 10% extrato
etéreo, 4% fibra bruta, 20% matéria mineral, 10% de umidade e 0,06% de vitamina
C. A quantidade de alimento foi corrigida semanalmente, para suprir as
necessidades diárias dos animais de acordo com sua massa e idade.
Todos os animais manipulados experimentalmente foram previamente
anestesiados por imersão em solução de benzocaína a 100 ppm, dissolvida
previamente em álcool etílico (qsp) (SILVA et al., 1997). A manipulação dos peixes
só ocorreu após apresentarem diminuição dos reflexos de batimento opercular,
seguido por perda de equilíbrio (Figura 5A). Os animais foram eutanasiados por
imersão em superdose de anestésico – 150 ppm (COYLE; DURBOROW; TIDWELL,
2004). O protocolo experimental está de acordo com os princípios éticos de
experimentação animal adotado pela Sociedade Brasileira de Ciências de Animais
de Laboratório (SBCAL) e foi aprovado pela comissão de ética no uso de animais
(CEUA) do ICB-USP (nº 93 na fls.90 do livro 02).
O estudo foi conduzido em duas etapas distintas, o Experimento 1 teve
duração de 90 dias, e os animais foram mantidos em condições padrões de
manutenção, como descritas acima. Após os resultados observados neste
experimento optamos por empregar um desafio ao sistema imune dos animais,
organizamos o Experimento 2, que teve duração de 30 dias, com quatro grupos
P á g i n a | 40
experimentais: dois em condições descritas anteriormente e em dois,
adicionalmente, com aplicação de glicocorticoide exógeno (dexametasona).
3.2 Experimento 1
Realizado no período de Fevereiro a Maio de 2011, foram utilizadas 120
fêmeas jovens de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum, 1792), pesando
entre 75,27±4,09 g e tratadas por 90 dias como descrito a seguir:
Grupo Controle (GC): 60 animais que receberam apenas ração;
Grupo Aditivo (GA): 60 animais que receberam ração misturada ao aditivo.
O aditivo (Biocitro®- Aqua, Quinabra, São José dos Campos, SP, Brasil)
contendo 7% AA, 35% extrato de frutas cítricas (5000mg/kg de flavonoides -
naringina, quercetina e rutina) e 5% de ácido lático, foi inicialmente diluído em água.
Em seguida, a solução foi misturada a ração do GA na concentração de 1000 ppm,
segundo indicação do fabricante. Para o GC foi misturada à ração o mesmo volume
de água livre de aditivo.
No primeiro dia (D0) os 120 peixes foram inicialmente anestesiados, pesados
(balança sartorius BP 8100 (0,01)), mensurados e distribuídos aleatoriamente nos
dois tanques experimentais (Figura 5B,C). Para construção de uma curva de
crescimento os animais foram pesados e mensurados nos dias (D) D0, D30, D60 e
D90. Ao término do tratamento (D90), foram eutanasiados dez peixes de cada grupo
experimental, sendo cinco utilizados para os ensaios de fagocitose in vitro; e cinco
para coleta do intestino. O sangue dos dez animais foi coletado para contagem de
leucócitos. Os demais animais foram utilizados apenas para tomada de dados de
ganho de massa e comprimento, sendo devolvidos para os tanques da estação de
Salmonicultura, após o registro destas informações.
P á g i n a | 41
3.3 Experimento 2
Realizado no período de Abril a Maio de 2013, foram utilizadas 80 fêmeas
jovens de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum, 1792), pesando
146±19,54 g e tratadas por 30 dias como descrito a seguir:
Grupo Controle (GC): 20 animais que receberam apenas ração;
Grupo Aditivo (GA): 20 animais que receberam ração misturada ao aditivo;
Grupo Dexametasona (GD): 20 animais que receberam apenas ração +
aplicação de dexametasona por 7 dias (D24 – D30);
Grupo Aditivo Dexametasona (GAD): 20 animais que receberam ração
misturada ao aditivo + aplicação de dexametasona por 7 dias (D24 – D30).
Devido ao tempo de meia-vida da dexametasona ser de 72 horas, a mesma
foi aplicada a cada 72 horas durante os últimos 7 dias do protocolo experimental. A
administração da dexametasona a 0,2% (Azium - Intervet Schering/Plough, São
Paulo, SP, Brasil) foi via intramuscular, na região dorso-lateral direita, com seringa
de insulina e agulha de 8 mm, na dose de 2mg/kg de peixe vivo, seguindo indicação
do fabricante.
No primeiro dia (D0) os 80 peixes foram anestesiados, pesados (balança
(0,01) BP 8100 - Sartorius, Goettingen, Germany), mensurados e distribuídos
aleatoriamente nos quatro tanques experimentais (Figura 5B,C). Aos 30 dias de
tratamento, foram eutanasiados dez peixes de cada grupo experimental, sendo cinco
utilizados para os ensaios de fagocitose in vitro; e cinco para coleta do intestino e
soro sanguíneo. Adicionalmente coletou-se sangue dos dez animais para contagem
de leucócitos. Os demais animais foram utilizados apenas para tomada de dados de
ganho de massa e comprimento, sendo devolvidos para os tanques da estação de
Salmonicultura, após o registro destas informações.
A figura 6 sintetiza os dois experimentos realizados, assim como suas
respectivas análises.
P á g i n a | 42
3.4 Avaliação dos parâmetros zootécnicos
Os parâmetros avaliados foram: ganho de peso (GP), taxa de crescimento
específico (TCE), fator de condição (K), rendimento de carcaça (RC), índice
hepatossomático (IHS) e sobrevivência (S) dos animais. Para tanto foram utilizadas
as seguintes fórmulas:
GP = massa final – massa inicial TCE = massa final – massa inicial x 100 dias de experimento
K = massa do peixe x 100 comprimento total
3
RC = massa eviscerado x 100 massa total
IHS= massa (g) do fígado x 100 massa (g) do peixe
S = total de animais final x 100 total de animais inicial
Após a remoção das vísceras para determinação do rendimento de carcaça
inteira, foram obtidos a massa das mesmas e do fígado separadamente.
P á g i n a | 43
Figura 5 – Anestesia e medidas de O. mykiss.
A) O. mykiss sob efeito do anestésico, animais apresentam diminuição de batimento opercular e perda de equilíbrio. B) Medidas de comprimento total; C) e comprimento padrão dos animais.
P á g i n a | 44
Figura 6 – Fluxograma dos experimentos.
Experimento 1 Experimento 2
GC
Ração
GA
Ração +
Aditivo
GAD
Ração +
Aditivo e
Dexametasona
GD
Ração e
Dexametasona
a
GC
Ração
n= 60
GA
Ração +
Aditivo
n=60
n=20 n=20
n=20 n=20
3
0
d
i
a
s
9
0
d
i
a
s
Parâmetros de
Desempenho(n=20);
Morfologia do Intestino (n=5);
Parâmetros Imunes Inatos (n=5):
Contagem Diferencial de
Leucócitos;
Avaliação de Fagocitose in vitro;
Atividade de Lisozima.
Parâmetros de Desempenho
(n=60);
Morfologia do Intestino (n=5);
Parâmetros Imunes Inatos
(n=5):
Contagem Diferencial de
Leucócitos;
Avaliação de Fagocitose in vitro.
P á g i n a | 45
3.5 Avaliação do trato digestório
Para a avaliação histológica do intestino, foram coletadas amostras de tecido
de diferentes regiões: cecos pilóricos, segmento inicial, médio e final do intestino
(Figura 7), e processados de acordo com protocolo específico para microscopia de
luz e transmissão conforme descrito posteriormente. As diferentes secções do
intestino foram avaliadas da seguinte forma: análises de absorção de
macromoléculas de ferritina; mensuração da altura do epitélio absortivo e
quantificação da densidade de células de muco.
3.5.1 Microscopia de luz
A fixação das amostras de tecido do trato digestório foi feita em solução de
Methacarn (60% metanol, 30% clorofórmio e 10% acido acético glacial). Em seguida
desidratou-se o tecido em gradiente crescente de etanol, de 70% ao absoluto, com
subsequente diafanização em xilol e inclusão em parafina (Paraplast® - Sigma-
Aldrich, Munich, Germany).
3.5.2 Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
Para o processamento das amostras de intestino foi utilizado o protocolo
padrão para MET. Os fragmentos de tecido (1 a 3 mm3) foram fixados em solução de
glutaraldeído 2,5%, em tampão fosfato 0,1M (pH 7,4), pós-fixados em tetróxido de
ósmio (OsO4) 2% em solução tampão de fosfato de sódio. Em seguida foi realizada
a desidratação alcoólica gradual, embebição em solução de óxido de propileno e
posterior inclusão em resina (Araldite® - Sigma-Aldrich). Foram realizados cortes
espessos de 3µm em ultramicrótomo, utilizando navalha de vidro e corados em azul
de toluidina, para avaliação em microscópio de luz e localização de áreas de
interesse. Os cortes ultrafinos de 90nm de espessura foram obtidos com navalha de
diamante e coletados em telas de 200 “mesh”. Em seguida, as telas foram
contrastadas com solução de acetato de uranila a 4% e examinadas no microscópio
eletrônico de transmissão JEOL.
P á g i n a | 46
3.5.3 Absorção de macromoléculas
Para avaliar o efeito do ácido ascórbico e flavonoides na absorção de
nutrientes, os animais receberam diretamente no estômago, por via oral, com auxilio
de agulha para gavagem, 1 mL de solução contendo ferritina de baço de cavalo
(Ferritin Type I, 108 mg/L - Sigma-Aldrich, Munich, Germany), diluída em solução
salina (0,9%), na proporção de 1:1. Após 24 horas, os animais foram eutanasiados e
as amostras de tecidos foram processadas com protocolo padrão para microscopia
de luz.
Para detectar a ferritina do tecido, foi utilizada a técnica histoquímica de Perls,
com contracoloração em solução de safranina O 1%, (Figura 7B) (BANCROFT;
STEVENS, 1982). O segmento médio - por apresentar uma maior absorção – em
relação aos outros segmentos, foi utilizado para quantificar a absorção da ferritina. A
quantificação foi feita utilizando cinco cortes aleatórios e não sequenciais de 5µm de
espessura para cada animal. As lâminas foram observadas na objetiva de 40x
(Olympus, UPlanFl, 40x/0.75 Ph2 ∞/0.17), sob o microscópio (Olympus BX60), sendo
que, para cada lâmina, dez campos aleatórios para cada corte foram fotografados
(Axio Cam HRc – Zeiss, Germany). A quantificação da ferritina foi feita por
identificação de cor, utilizando a mensuração automática do programa Axio Vision
(Axio Vision 4.8 – Zeiss).
3.5.4 Altura do epitélio absortivo
Para mensuração da altura do epitélio, cinco cortes aleatórios e não
sequenciais de 5µm de espessura, para cada porção intestinal, foram corados com
Hematoxilina & Eosina (HE) (Figura 7C). Posteriormente, cinco campos aleatórios
foram fotografados (Axio Cam HRc - Zeiss), na objetiva de 100x (Olympus, UPlanFl,
100x/1.30 Oil Ph3 ∞/0.17) sob microscópio (Olympus BX60). Foram feitas cinco
mensurações de altura do epitélio intestinal para cada campo fotografado,
totalizando cento e vinte e cinco medidas por porção intestinal para cada animal. As
mensurações foram feitas manualmente no programa Axio Vision (Axio Vision 4.8 –
Zeiss). Os dados foram analisados utilizando a média das cinco mensurações, de
cada campo fotografado.
P á g i n a | 47
3.5.5 Densidade de células de muco
Para visualização das células de muco, cinco cortes aleatórios e não
sequenciais de 5µm de espessura, para cada porção intestinal, foram corados com
Periodic Acid Shiff (PAS) (Figura 7D), em seguida foram fotografados (Axio Cam
HRc - Zeiss) na objetiva de 100X do microscópio (Olympus BX60) para
quantificação. Todos os campos fotografados respeitaram os seguintes critérios: 1- a
imagem capturada apresentava apenas o epitélio absortivo; não podendo haver
espaços entre as dobras intestinais, ou espaços vazios (luz do órgão); 2- o campo
também não poderia evidenciar o conjuntivo da camada submucosa. Sendo assim,
os cortes foram percorridos de forma “zig-zag”, e dez campos aleatórios para cada
corte, respeitando as condições descritas, eram fotografados, e todas as células de
muco do campo contadas manualmente, no programa Axio Vision (Axio Vision 4.8 –
Zeiss). Posteriormente, foi feita a relação de células de muco por área, dividindo-se
o total de células contadas nos dez campos, pela área total das dez fotomicrografias.
P á g i n a | 48
Figura 7 – Morfologia do trato intestinal de O. mykiss.
A) Vista ventral mostrando o trato gastrointestinal de O. mykiss, Estômago (E), Intestino anterior (IA) e posterior (IP). Porções coletadas para análises histológicas: Cecos pilóricos (CP); porção inicial do intestino (seta); porção média do intestino (cabeça de seta vazia); porção final do intestino (cabeça de seta). B) Fotomicrografias de corte histológico da porção média do intestino, moléculas de ferritina aparecem em azul, coloração de Perls. C) Porção média do intestino, Células caliciformes (cc); epitélio (e); Estrato compacto (ec); Lamina própria (lp); linfócito intraepitelial (li); vacúolos absortivos (va); leucócitos associados ao intestino (seta vazia); medida de altura do epitélio (em vermelho), coloração de HE. D) Porção inicial do intestino mostrando células de muco, histoquímica de PAS.
e lp
cc
va
li
ec
50 µm 50 µm
P á g i n a | 49
3.6 Avaliação do sistema imune inespecífico
3.6.1 Avaliação de fagocitose in vitro
Foram utilizados seis espécimes por grupo, sendo feitos ensaios em triplicata
para cada espécime. Os ensaios de fagocitose in vitro foram realizados segundo
técnica adaptada de Afonso, Ellis e Silva (1997). Para obtenção de células
fagocíticas, os animais receberam injeção intraperitoneal (Figura 8A) de 20 mL de
solução de glicogênio de ostra (Glycogen from oyster, Type II – Sigma-Aldrich) 1%.
Após 24 horas os animais foram eutanasiados e submetidos a sangria cortando-se a
cauda, para retirar o máximo de sangue possível, evitando assim contaminação do
lavado peritoneal por eritrócitos.
Após a sangria, foram injetados na cavidade peritoneal 20 mL de solução
tampão PBS gelado (0,01 M) e 10 mL de ar, para a formação de bolhas que auxiliam
a suspender as células que migraram para o peritônio. Posteriormente a região
abdominal foi massageada, para promover a suspensão das células presentes nos
tecidos. Em seguida a cavidade abdominal foi aberta e o lavado peritoneal drenado,
com auxílio de pipeta plástica descartável de 3 mL. O lavado peritoneal foi
depositado em tubo falcon de 15 mL, em seguida centrifugado a 600G por 15
minutos em temperatura ambiente. A camada leucocitária coletada foi
ressuspendida em tubo, contendo meio de cultura RPMI 1640 (Sigma-Aldrich), com
gentamicina 50 mg/L, sem soro fetal bovino (FBS). Alíquotas de 200µl de solução de
células foram colocadas sobre lamínulas de vidro redondas, em placa de cultura de
12 poços, e completados com meio de cultura para 1 mL de volume final. Após 2
horas em câmara úmida os poços foram lavados com tampão PBS, para o
isolamento das células aderidas (macrófagos). A mesma solução de células foi
previamente contada em câmara de Neubauer, para cálculo da concentração
celular.
Posteriormente, cada poço recebeu solução de meio de cultura contendo,
Saccharomyces cerevisiae (Meyen, 1883) em suspensão, na concentração de 10
leveduras por macrófago. Após o prazo de 2 horas de incubação em câmara úmida
à temperatura ambiente de 12,0 ± 2,0ºC, o meio de cultura foi retirado e descartado,
os poços foram lavados com PBS e as lamínulas então fixadas com metanol,
coradas com Rosenfeld (ROSENFELD, 1947) e montadas com resina Entelan®.
P á g i n a | 50
As lâminas coradas com Rosenfeld foram observadas sob microscopia de
contraste de fase. Desta maneira, as leveduras aparecem em cor alaranjada e os
macrófagos em rosa ou roxo (Figura 8B, C). As fagocitoses foram posteriormente
quantificadas em aumento de 1000X. Foram contadas 100 células por lâmina e
calculados os seguintes índices de atividade fagocítica: Capacidade Fagocítica (CF),
Índice Fagocítico (If), Capacidade Fagocítica x Índice Fagocítico (CF x If), conforme
as fórmulas abaixo.
CF = nº de macrófagos fagocitando If = nº total de leveduras no interior dos macrófagos nº total de macrófagos contados nº de macrófagos fagocitando CF x If = nº de macrófagos fagocitando x nº total de leveduras no interior dos macrófagos nº total de macrófagos contados nº de macrófagos fagocitando CF If
Então: CF x If = nº total de leveduras no interior dos macrófagos nº total de macrófagos contados
P á g i n a | 51
Figura 8 – Ensaios de fagocitose in vitro.
A) Injeção intraperitoneal de solução fisiológica contendo 1% de glicogênio de ostra. B) Fotomicrografia de lamina de teste de fagocitose corada com Rosenfeld, mostrando macrófagos em microscopia de campo claro; C) Mesmo campo fotografado em microscopia de fase. Levedura internalizada (cabeça de seta) e levedura não fagocitada (seta). Barra equivale a 10µm.
P á g i n a | 52
3.6.2 Contagem diferencial de leucócitos
Para a Contagem Diferencial de Leucócitos (CDL) sanguíneos, foram
coletadas, com seringas heparinizadas, amostras de sangue da veia caudal dos
animais e em seguida feitos esfregaços sanguíneos, posteriormente corados com
HE. Os esfregaços foram feitos em triplicata por animal.
A CDL consiste em determinar a proporção existente entre as distintas
variedades de leucócitos: neutrófilos, linfócitos e monócitos (Figura 9). Em
microscópio de luz comum, com objetiva de imersão (100X), foram contadas 1000
células no corpo da extensão (englobando eritrócitos e leucócitos), percorrendo-se a
lâmina em “zig-zag”.
Amostras de sangue da veia caudal, das trutas arco íris utilizadas nos ensaios
de fagocitose, também foram coletadas para a confecção de esfregaços sanguíneos.
Estes animais, por terem recebido previamente injeção intraperitoneal de glicogênio
de ostra (agente quimiotático), foram avaliados para proporção de leucócitos
sanguíneos, e analisados separadamente.
P á g i n a | 53
Figura 9 - Esfregaços sanguíneos de O. mykiss.
. A) Eritrócitos nucleados, seta mostra os linfócitos. B) Seta mostra neutrófilo. C) Seta mostra monócito Coloração de HE.
P á g i n a | 54
3.6.3 Atividade de lisozima
A atividade de lisozima foi avaliada apenas nos animais do segundo
experimento. Para tanto, alíquotas de sangue foram retiradas da veia dorsal das
trutas, utilizando seringas de 1 mL não heparinizadas. Em seguida o sangue foi
transferido para eppendorfs estéreis de 1,5 mL. Após 4 horas, as amostras foram
centrifugadas, o coágulo sanguíneo removido, com auxílio de pipeta estéril
descartável e o soro sanguíneo resultante foi congelado em nitrogênio líquido para
posterior análise.
A atividade de lisozima contra células liofilizadas de Micrococcus lysodeikticus
(M3770, Sigma-Aldrich) foi medida em soro puro e em diluições seriadas de ½, ¼, e
⅛, em espectrofotômetro usando 570nm de absorbância, no tempo 0, 6, 16, 31, 61 e
91 minutos. Como controle negativo, o soro foi substituído por tampão PBS 0,05M
pH 6,2 (mesmo tampão em que foram diluídas as amostras de soro). Como controle
positivo, foi utilizado lisozima de clara de ovo (Sigma, Ref. L-7651) ao invés do soro.
A partir das leituras foram então estabelecidos os valores de U (unidade de
lisozima), que corresponde à quantidade de amostra que causa diminuição de
absorbância de 0,001/min.
3.7 Análises estatísticas
Os dados foram analisados através das médias e desvio-padrão dos grupos
pelo software GraphPad InStat versão 3.05 (GraphPad Software, San Diego,
California, USA). Para a escolha do teste estatístico adequado, os dados foram
verificados quanto à sua normalidade por meio do teste Kolmogorov-Smirnov (para
dados com padrão de normalidade, foram utilizados testes paramétricos; quando um
ou mais grupos não apresentaram padrão de normalidade, foram utilizados testes
não-paramétricos). Os testes paramétricos utilizados foram o teste ¨t¨ de Student
(para comparar dois grupos) ou Anova de uma via (para mais de dois grupos) com
pós-teste de Tukey. Os testes não-paramétricos utilizados foram o de Mann-Whitney
(para dois grupos) ou de Kruskal-Wallis (para mais de dois grupos) com pós-teste de
Dunn. Os grupos foram considerados diferentes quando p≤0,05.
P á g i n a | 55
4 RESULTADOS
4.1 Experimento 1
4.1.1 Avaliação dos parâmetros zootécnicos
O ganho de massa e o crescimento dos grupos foram verificados mês a mês
(Tabela 1, Figura 10) e os parâmetros foram todos similares entre GA e GC, durante
os 90 dias de tratamento. O ganho de massa mensal é apresentado na figura 10A, o
ganho total após os 90 dias na figura 10B, a taxa de crescimento específico mensal
pode ser verificada na figura 10C, e na figura 10D o total aos 90 dias. O fator de
condição, rendimento de carcaça e índice hepatossomático, são apresentados na
figura 10E, F e G, respectivamente, os valores para o GC e o GA foram similares
para os três índices. Em ambos os grupos de tratamento não ocorreram mortes dos
animais, sendo assim a taxa de sobrevivência foi de 100% para ambos.
Tabela 1 – Massa corpórea e medidas de comprimento de O. mykiss, durante os 90 dias de experimento.
Mês Grupo Controle Grupo Aditivo
M(g) CT (cm) CP (cm) M(g) CT (cm) CP (cm)
Fevereiro 78,17±16,42 18,06±1,20 15,94±1,08 72,38±9,90 17,80±0,83 15,68±0,77
Março 155,42±28,87 22,03±1,35 19,45±1,24 150,33±23,70 21,82±1,11 19,30±1,01
Abril 236,74±39,96 25,41±1,37 22,50±1,24 232,37±32,55 25,46±1,15 22,59±1,07
Maio 329,88±52,51 28,33±1,48 25,26±1,39 317,86±45,55 28,09±1,25 25,13±1,25
Valores expressos em média ± DP. Massa em gramas (M(g)); Comprimento total em cm (CT); comprimento padrão em cm (CP).
P á g i n a | 56
Figura 10 – Parâmetros de desempenho de O. mykiss durante os 90 dias de experimento.
Barras mostram média ± DP. Não houve diferença significativa entre os grupos (p>0,05).
P á g i n a | 57
4.1.2 Avaliação do trato digestório
4.1.2.1 Absorção de macromoléculas
Na avaliação de absorção de macronutrientes proteicos (ferritina) foi
observada uma grande variação na porcentagem de ferritina presente no tecido,
entre os animais pertencentes ao mesmo grupo (Tabela 2), assim não se observou
diferença entre GC e GA.
Tabela 2 – Ferritina presente no tecido intestinal.
Peixe GC GA
1 0,23 2,17
2 0,33 1,41
3 1,60 2,14
4 3,02 1,81
Média 1,29 1,88
DP 1,31 0,35
Valores referentes à porcentagem de ferritina presente na área do tecido, em relação ao total de área de tecido fotografados.
P á g i n a | 58
4.1.2.2 Altura do epitélio absortivo
Em relação à altura do epitélio intestinal comparamos as quatro porções de
intestino coletadas, entre GA e GC (Figura 11).
Nos cecos pilóricos o epitélio intestinal não apresentou diferença significativa
entre os grupos (P>0,05), a porção inicial do intestino mostrou um aumento na altura
do epitélio extremamente significativo (P<0,0001), a porção média apresentou
tendência ao aumento (P=0,0581) da altura do epitélio no GA em relação ao GC,
enquanto na porção final do intestino os valores foram similares entre os grupos
(P>0,05).
Figura 11 – Análise comparativa da altura do epitélio intestinal das diferentes porções do intestino de O. mykiss.
A) Cecos pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final do intestino; E) Altura do epitélio das quatro porções intestinais, com linha de tendência (polinômio de três fases). Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção média (IM), porção final do intestino (IF). Barras mostram média ± DP, valores expressos em µm. (*) = p<0,05.
P á g i n a | 59
4.1.2.3 Densidade de células de muco
Na análise densidade de células de muco observou-se uma diminuição nos
cecos pilóricos do GA em comparação ao GC com p=0,045 (Figura 12 A). Já na
porção inicial do intestino o número de células de muco aumentou nos animais do
GA em relação ao GC, com p=0,051 (Figura 12 B). Para os demais segmentos
intestinais não foram observadas diferença na concentração de células de muco
entre GA e GC (Figura 12 C e D).
Figura 12 – Análise comparativa da densidade de células de muco nas diferentes porções intestinais de O. mykiss.
A) Cecos pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final do intestino; E) Densidade de células de muco das quatro porções intestinais, com linha de tendência (polinômio de três fases). Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção média (IM), porção final do intestino (IF). Barras mostram média ± DP, valores expressos em número de células por mm
2. (*) = p<0,05.
P á g i n a | 60
4.1.2.4 Avaliação ultraestrutural
Figura 13 – Avaliação ultraestrutural do intestino de O. mykiss.
Ambos os grupos mostraram morfologia similar. A) GC 4000x. B) GC 15000x. C) GA 7500x. D) GA 20000x. E) GA 7500x. F) GA 20000x. A, C) Os enterócitos apresentam a cutícula estriada característica deste epitélio, abundância de mitocôndrias, uma faixa bem definida, com ausência de organelas logo abaixo à projeção das microvilosidades. B, D) presença de junções celulares bem definidas. E) Granulócitos da submucosa apresentam características típicas. F) Mitocôndrias com cristas evidentes comprovam a integridade da fixação do material examinado.
P á g i n a | 61
4.1.3 Avaliação do sistema imune inespecífico
4.1.3.1 Avaliação de fagocitose in vitro
O índice fagocítico, a capacidade fagocítica e o índice fagocítico X
capacidade fagocítica, podem ser observados na figura 14. O GA e o GC
apresentaram valores similares para os três índices.
Figura 14 – Análises comparativa da atividade fagocítica de macrófagos, de O. mykiss dos dois grupos, aos 90 dias de experimento.
A) Índice fagocítico; B) Capacidade fagocítica; C) Capacidade fagocítica X índice fagocítico (CF X IF). Barras mostram média ± DP. Não houve diferença significativa entre os grupos (p>0,05).
P á g i n a | 62
4.1.3.2 Contagem diferencial de leucócitos
A contagem de leucócitos, ilustrada na figura 15, revelou uma diminuição no
número de linfócitos dos animais que receberam aplicação intraperitoneal de
glicogênio, comparados aos que não receberam, com p=0,025. Entretanto,
considerando os grupos GC e GA, não foi observada diferença significativa entre os
animais que receberam glicogênio.
Por sua vez, a contagem de neutrófilos não revelou diferença significativa
entre os animais que receberam ou não glicogênio de ostra, bem como entre os
animais que receberam glicogênio de ostra, considerando os grupos GC e GA.
Entretanto, entre os animais que não receberam glicogênio de ostra, a
contagem de monócitos foi significativamente maior nos animais do grupo GA em
relação ao grupo GC, com p=0,043. Nas demais comparações não foram
observadas diferenças relevantes, com p>0,05.
Figura 15 – Contagem diferencial de leucócitos em extensões sanguíneas de O. mykiss.
Barras mostram média ± DP, valores expressos em unidades. Letras mostram diferença entre os grupos (p<0,05).
Neutrófilos
P á g i n a | 63
4.2 Experimento 2
4.2.1 Avaliação dos parâmetros zootécnicos
Como pode ser observado na figura 16, o GD teve menor ganho de massa e
taxa de crescimento específico que o GC (p<0,001) e o GA (p<0,001), e não diferiu
do GAD. Considerando os mesmos parâmetros, o GAD foi inferior ao GC, com
p<0,01.
O fator de condição do GD foi menor que do GC (p<0,05), e não diferiu entre
GA e GAD (p>0,05). Na comparação entre os grupos GC, GA e GAD não foram
observadas diferenças, com p>0,05.
O rendimento de carcaça foi similar em todos os grupos experimentais (p>0,05).
Por outro lado o índice hepatossomático do GAD foi maior que do GA (p<0,01) e
do GD (p<0,05), mas não diferiu do GC. Entre os demais grupos, GC, GA e GD, o
índice foi similar.
P á g i n a | 64
Figura 16 – Parâmetros de desempenho de O. mykiss, dos quatro grupos experimentais, aos 30 dias de experimento.
Barras mostram média ± DP. Letras mostram diferença entre os grupos (p<0,05).
Em relação à sobrevivência, o GD teve uma taxa de sobrevivência de 80% dos
animais, enquanto os demais grupos apresentaram 100% de sobrevivência.
a
a a,b
b
P á g i n a | 65
Os gráficos apresentados na figura 17 correspondem a tomada de massados
animais para aplicação da dexametasona. Aos 24 dias de experimento (Figura17A)
o GAD havia ganhado mais massa que o GD (p<0,05). Durante os 7 dias de
aplicação os dois grupos apresentaram perda de massa (Figura 17B), e
consequente diminuição do ganho de massa (Figura 17C).
Figura 17 – Comparação do ganho de massa dos grupos GD e GAD.
A) Ganho de massa aos 24 dias de experimento; B) Massa durante os 7 dias de aplicação de dexametasona C) Ganho de massa durante os 7 dias de aplicação de dexametasona. Barras mostram média ± DP. (*)= p<0,05.
4.2.2 Avaliação do trato digestório
4.2.2.1 Altura do epitélio absortivo
A altura do epitélio absortivo dos cecos pilóricos (Figura 18) não diferiu entre
GC e GA, enquanto que no GD ocorreu uma diminuição na altura epitelial, em
relação ao GC (p<0,001) e ao GA (p<0,001). O GAD também apresentou uma
diminuição na altura epitelial em relação ao GC (p<0,001) de GA (p<0,001), no
entanto foi maior que o GD (p<0,01).
No início do intestino ocorreu uma diminuição na altura do GA em relação ao
GC (p<0,01), enquanto que GD e GAD não diferiram entre si, mas foram menores
P á g i n a | 66
que GC (p<0,001) e GA (p<0,001).
Na porção intestinal média ocorreu uma diminuição na altura do epitélio do
GA em relação ao GC (p<0,05), enquanto que no GD ocorreu uma diminuição na
altura epitelial, em relação ao GC (p<0,001) e ao GA (p<0,001). O GAD também
apresentou uma diminuição na altura epitelial em relação ao GC (p<0,001) e ao GD
(p<0,001), no entanto não diferiu do GA.
Na porção intestinal final a altura epitelial foi similar entre GC e GA. Assim
como no GD comparado ao GAD. No entanto ocorreu uma diminuição na altura do
epitélio do GD em relação ao GC (p<0,001), e ao GA (p<0,001), e também no GAD
comparado ao GC (p<0,001) e ao GA (p<0,001).
Figura 18 – Análise comparativa da altura do epitélio intestinal das diferentes porções do intestino de O. mykiss.
A) Cecos pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final do intestino; E) Altura do epitélio das quatro porções intestinais, com linha de tendência (polinômio de três fases). Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção média (IM), porção final do intestino (IF). Barras mostram média ± DP, valores expressos em µm. Letras mostram diferença entre os grupos (p<0,05).
P á g i n a | 67
4.2.2.2 Densidade de células de muco
Em relação a densidade de células de muco (Figura 19) nos cecos pilóricos
não houve diferença entre GC, GA e GD, enquanto que o GAD apresentou um
aumento (p<0,001) em relação a todos os demais.
No início do intestino GA, GD e GAD não diferiram do GC. No entanto, o GA
foi menor que o GD e o GAD (p<0,05).
Já na porção média do intestino GA, GD e GAD não diferiram do GC, com
p>0,05, enquanto que GD apresentou um aumento na densidade de células de
muco em relação ao GAD (p<0,05).
A porção final do intestino apresentou densidade de células de muco similar
entre GC, GA e GAD (p>0,05), já o GD apresentou uma maior densidade em relação
ao GC (p<0,01) e ao GA (p<0,01).
P á g i n a | 68
Figura 19 – Análise comparativa da densidade de células de muco nas diferentes porções intestinais de O.mykiss.
A) Cecos pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final do intestino; E) Densidade de células de muco das quatro porções intestinais, com linha de tendência (polinômio de três fases). Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção média (IM), porção final do intestino (IF). Barras mostram média ± DP, valores expressos em células por mm
2. Letras mostram diferença entre os
grupos (p<0,05).
P á g i n a | 69
4.2.2.3 Avaliação ultraestrutural
Figura 20 – Avaliação ultraestrutural do intestino de O. mykiss.
Os grupos mostraram morfologia intestinal similar, os enterócitos apresentam a cutícula estriada característica, abundância de mitocôndrias, uma faixa bem definida, com ausência de organelas logo abaixo à projeção das microvilosidades, presença de junções celulares (C) bem definidas. A) GAD, 1000x. B) GC, 1000x. C) GD, 10000x. D) Fibras colágenas do estrato compacto, 15000x. E) Granulócitos eosinófilos da submucosa do GC, 2000x. F) Granulócitos eosinófilos da submucosa do GD com morfologia indicativa de degranulação, 2500x.
P á g i n a | 70
4.2.3 Avaliação do sistema imune inespecífico
4.2.3.1 Avaliação de fagocitose in vitro
O índice fagocítico, a capacidade fagocítica e o índice fagocítico X
capacidade fagocítica, podem ser observados na figura 21, os quatro grupos
experimentais apresentaram valores similares para os três índices.
Figura 21 – Análises comparativa da atividade fagocítica de O. mykiss.
A) Índice fagocítico; B) Capacidade fagocítica; C) Capacidade fagocítica X índice fagocítico. (CF X IF). Barras mostram média ± DP. Não houve diferença significativa entre os grupos (p>0,05).
4.2.3.2 Contagem diferencial de leucócitos
Pode-se observar que a proporção de células brancas sanguíneas (Figura 22)
foi similar entre monócitos e linfócitos, entre os 4 grupos experimentais que não
receberam glicogênio. No entanto em relação aos neutrófilos, ocorreu um aumento
significativo no GAD comparado ao GC (p<0,01) e ao GA (p<0,01).
Em relação aos grupos que receberam glicogênio, o GAD apresentou
aumento significativo de monócitos comparado ao GC (p<0,01), ao GA (p<0,01) e ao
GD (p<0,001). Em relação aos linfócitos, o GAD apresentou um aumento comparado
ao GC (p<0,001), ao GA (p<0,001) e ao GD (p<0,001). O número de neutrófilos do
P á g i n a | 71
GAD também foi maior que no GC (p<0,01), no GA (p<0,01) e no GD (p<0,01).
Ao comparar os grupos que receberam a aplicação de glicogênio, com os que
não receberam pode-se observar que a contagem de monócitos, do GAD+glicogênio
foi maior que todos os demais grupos avaliados (p<0,001). Pode-se também
observar a diminuição dos linfócitos sanguíneos do GC+glicogênio, do
GA+glicogênio e do GD+glicogênio, comparados ao GC (p<0,001), ao GA (p<0,05),
ao GD (p<0,001) e ao GAD (p<0,001). O GAD+glicogênio foi o grupo menos afetado,
mostrando valores similares aos grupos que não receberam glicogênio. Em relação
ao número de neutrófilo, ocorreu aumento no GAD+glicogênio comparado ao GC
(p<0,001) e ao GA (p<0,001), no entanto se igualou ao GD e GAD (Figura 22).
Figura 22 – Contagem diferencial de leucócitos em extensões sanguíneas de O. mykiss.
Barras mostram média ± DP, valores expressos em unidades. Letras mostram diferença entre grupos (p<0,05).
Neutrófilos
P á g i n a | 72
4.2.3.3 Atividade de lisozima
O pico da atividade da lisozima (Figura 23) foi maior aos 6 minutos, esta foi
diminuindo gradativamente durante as leituras nos quatro grupos experimentais. A
partir dos 61 aos 91 minutos esta atingiu um platô e não se alterou mais, por esta
razão no gráfico apresentamos a atividade lisozima até os 61 minutos. Não houve
diferença significativa entre os grupos.
Figura 23 – Atividade da lisozima das amostras de soro sanguíneo dos quatro
grupos experimentais.
Diluição ¼, leitura em 570nm. Linhas mostram média ± DP, valores expressos em U. Não houve diferença significativa entre os grupos (p>0,05).
P á g i n a | 73
5 DISCUSSÃO
No presente experimento, os animais foram mantidos em uma ambiência
ideal, com qualidade da água controlada, bem como qualidade e quantidade de
ração ajustada às necessidades da truta. Adicionalmente as trutas arco-íris
utilizadas no experimento eram todas juvenis, portanto ainda não haviam entrado em
fase reprodutiva, quando o ganho de massa diminui devido ao gasto energético com
a gametogênese. A idade dos animais utilizados é considerada ideal para estudos
de imunidade (KÖLLNER et al., 2002).
No primeiro experimento, todos os parâmetros zootécnicos analisados foram
similares entre os dois grupos experimentais (GC e GA), tanto mês a mês, como ao
final dos 90 dias de experimento. Isso indica que, do ponto de vista zootécnico, a
utilização de aditivo a base de AA e flavonoides, para ganho de massa apenas, seria
irrelevante nos prazos analisados.
Enquanto o segundo experimento demonstrou que sob condições ideais (GC
e GA), o uso do aditivo não apresenta vantagens em ganho de massa em 30 dias, já
que este não alterou os parâmetros zootécnicos dos animais, como visto também no
primeiro experimento mais longo. No entanto, ao observarmos o ganho de massa
dos grupos GD e GAD aos 24 dias de experimento, quando se iniciou a aplicação de
glicocorticoide, o GAD havia ganhado mais massa que GD indicando que o uso de
AA e flavonoides como aditivo em períodos mais curtos proporciona o aumento do
ganho de massa.
A absorção da vitamina C ocorre na membrana apical do enterócito e é
realizada através de transportadores específicos dependentes de íons sódio, que
são substrato-dependentes, de maneira que quanto maior a suplementação desta
vitamina, mais eficiente será sua absorção (DABROWSKI; MATUSIEWICZB; BLOM,
1994). Como os animais são alimentados com ração contendo quantidades
suficientes de AA (600 mg/Kg), o ácido ascórbico do aditivo foi apenas uma
suplementação desta vitamina, já que a maioria das espécies de peixes não é capaz
de produzir ácido ascórbico a partir de outros elementos da dieta. A ausência ou
quantidade insuficiente da vitamina C interfere no ganho de massa e em parâmetros
relacionados a imunidade. No entanto, diversos autores apontam que a
suplementação de ácido ascórbico, geralmente não ocasiona alteração no ganho de
P á g i n a | 74
massa em peixes (AKSOY et al., 2008; AZAD et al., 2007; CHAGAS; VAL, 2003;
EO; LEE, 2008; HARDIE; FLETCHER; SECOMBES, 1991; LI; WISE; ROBINSON,
1998; LIU et al., 2008; LYGREN et al., 1999). Contudo estudos com pré e probióticos
demonstram que estes aditivos podem auxiliar no crescimento dos animais
(ANADÓN; MARTÍNEZ-LARRAÑAGA; MATÍNEZ; 2006; FULLER, 1989; SCOTT-
WEESE; SHARIF; RODRIGUEZ-PALACIOS, 2008). Como os flavonoides já foram
descritos por exercer influencia na microbiota intestinal (MOCO; MARTIN; REZZI,
2012; SAURA-CALIXTO, 2011) e os ácidos orgânicos que compões o aditivo em
questão podem favorecer a microbiota residente, agindo como prebióticos (HEO et
al., 2013), este aumento de massa em 24 dias possivelmente esta relacionado não
somente com a atividade deste componentes per se, mas também com sua ação de
coadjuvante na microbiota residente.
Após a aplicação do glicocorticoide exógeno, os animais do grupo GD e GAD
perderam massa. Apesar da perda de massa ter sido similar entre os dois grupos, a
massa média dos animais que ao dia 24 eram equivalentes, passaram a se
distanciar, assim aos 27 e 30 dias o GD tinha uma massa média significativamente
menor que GAD. Com isso pode-se constatar que, devido esta perda de massa, o
GD teve um menor ganho de massa total em relação ao GC e GA, enquanto o GAD
teve um ganho de massa similar ao GA. Estes dados evidenciam que o aditivo pode
compensar a perda de massa proporcionada por glicocorticoide.
Contrastando os resultados do presente estudo com outros disponíveis na
literatura especializada, pode-se ver que a suplementação com AA em salmão do
Atlântico não altera o ganho de massa após estresse de manejo (THOMPSON et al.,
1993). Por outro lado, em trutas desafiadas com Vibro anguillarum o AA foi
diferencial no ganho de massa, a partir da décima semana de tratamento
(NAVARRE; HALVER, 1989). No entanto, os animais utilizados no estudo eram mais
jovens que do presente estudo, com massa inicial de apenas 1g. Similarmente aos
resultados obtidos no presente estudo, Deng e colaboradores (2009) observaram
que a dieta com polifenóis de chá por sete dias, aliviou a perda de massa em leitões
sob estresse oxidativo e ainda promoveram a proliferação e ativação de linfócitos T.
É sabido que uma das ações dos glicocorticoides é a mobilização das
reservas energéticas, induzindo a lipólise e gliconeogênese a partir de aminoácidos,
disponibilizando assim energia para as funções necessárias no momento do
estresse. Desta forma, causa a perda de massa dos animais, o que geralmente
P á g i n a | 75
ocorre em situações de estresse crônico (PICKERING, 1981; VIJAYAN;
BALLANTYNE; LEATHERLAND, 1991; WENDELAAR BONGA, 1997). Visto que, no
presente estudo, o grupo que consumiu aditivo compensou a perda de massa após
a aplicação da dexametasona, uma possível explicação para este ocorrido é que os
flavonoides aturam de forma similar a insulina. Em modelos animais e humanos com
diabetes tipo 2, os flavonoides auxiliam na diminuição da glicose sanguínea, tanto
através do aumento da captação da glicose pelas células, como também induzindo
seu armazenamento, estimulando a síntese de glicogênio, quanto a glicose está em
altos níveis sanguíneos (CAZAROLLI et al., 2008). Desta maneira, os flavonoides
podem ter agido de maneira compensatória, em relação a atuação do glicocorticoide
no presente estudo. Ainda, os flavonoides podem ter tido uma atuação inibitória
direta, pois estes também foram descritos por atuar diretamente nos receptores
glicocorticoides in vitro (NISHIZAKI et al., 2009).
O fator de condição reflete a proporção entre a massa e o comprimento dos
animais, é bem específico e possui uma variação mínima (MORGAN et al., 2008) No
entanto, a perda de massa do GD foi significativa para os animais, de forma que
refletiu no fator de condição. Assim, o GD apresentou valores menores comparado
ao GA. Contudo, o rendimento de carcaça dos animais não foi afetado, indicando
que as alterações no ganho de massa total não afetaram a porção muscular, que é
de fato o que será consumido. Este resultado apresentou-se oposto ao esperado,
uma vez que a atuação de glicocorticoides, em geral, induz a gliconeogênese do
tecido muscular. Assim, supõe-se que a variação do ganho de massa ocorreu no
conteúdo visceral dos animais. Corroborando com isso, é sabido que o aumento dos
níveis de corticoide, induzem também a atividade aminotransferase hepática, assim
como a lipólise de tecido adiposo (DAVIS et al., 1985; JENTOFT et al., 2005;
MOMMSEN; VIJAYAN; MOON, 1999; PICKERING, 1981; VAN DER BOON; VAN
DEN THILLART; ADDINK, 1991; VIJAYAN et al., 1994). No presente estudo, o índice
hepatossomático realmente apresentou alterações entre os grupos GA, GD e o
GAD, entretanto todos foram similares ao do GC que é o controle do experimento.
Outro dado importante foi a mortalidade dos animais. As trutas do GD
apresentaram maior sensibilidade ao manuseio, quando os animais eram retirados
dos tanques, para pesagem observou-se perda de equilíbrio e aumento dos
batimentos operculares, indicando taquipnéia. Nos dias que se seguiram as
aplicações de glicocorticoide, houve então morte dos animais do GD após o
P á g i n a | 76
manuseio dos mesmos. Este fato não foi observado nos animais do GAD, que
aparentavam não sentir influência da aplicação do glicocorticoide, durante o
manuseio. Barton e Iwama (1991) obtiveram resultados similares, e observaram que
após o estresse, os peixes apresentam o aumento da captação de oxigênio e taxa
metabólica quando comparados aos animais não estressados. Assim, é possível que
as trutas tenham utilizado grande parte de suas reservas metabólicas, e ao serem
manuseadas, não tinham mais reservas energéticas para enfrentar o estresse do
manejo. Estes dados mostram que o uso do aditivo é vantajoso diante de situações
desfavoráveis as trutas arco-íris, como por exemplo, o aumento dos níveis de
corticoide ocasionados em situações de estresse.
Ao comparar o resultados referentes à altura do epitélio intestinal, entre os
dois experimentos realizados, podemos inferir que no experimento 1 o aditivo
causou o aumento da altura do epitélio intestinal da porção inicial do intestino.
Enquanto, no experimento 2, ocorreu justamente o oposto, a altura do epitélio, no
inicio do intestino do GA diminuiu em relação ao GC. Ainda, no experimento 1, foi
somente esta porção intestinal que diferiu entre os grupos, as outras três porções
intestinais avaliadas apresentaram a altura do epitélio intestinal similar entre GC e
GA . Ao passo que, no experimento 2, além da porção inicial do intestino, o aditivo
também causou a diminuição da altura do epitélio na porção média do intestino
comparado ao GC. Estes dados sugerem que é provável que ocorra um pico de
atividade do aditivo, nos primeiros 30 dias de tratamento, e que o tratamento mais
longo (90 dias) induz um acondicionamento dos animais. Assim, a morfologia
intestinal retornaria aos parâmetros similares aos dos animais do grupo controle.
Em relação à aplicação do glicocorticoide, esta em geral causou a diminuição
da altura do epitélio intestinal em todas as porções analisadas do GD, comparado
aos GC e GA. O aditivo pareceu ser diferencial nestes resultados, pois nos cecos
pilóricos e no intestino médio o GAD apresentou altura epitelial maior que o GD.
Adicionalmente, o GAD chegou a se equiparar ao GA no intestino médio. No inicio
do intestino o aditivo por si já havia causado a diminuição da altura do epitélio (GA),
possivelmente por esta razão a altura do epitélio do GAD se equiparou a do GD
nesta porção intestinal. Fabregat (2006) também observaram que o aditivo
Flavofeed®, causou uma diminuição na altura do epitélio absortivo da porção média
do intestino tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) não desafiadas, e sugeriram que
a diminuição da altura do epitélio poderia ser devido ao aumento da altura das
P á g i n a | 77
vilosidades também ocorridas em seu experimento. Isto também pode ter ocorrido
no presente experimento, no entanto a altura das dobras intestinais não foi
verificada. Mas o aumento da altura de dobras intestinais proporcionaria uma maior
área de absorção ao intestino, o que seria vantajoso para a nutrição dos animais.
Assim como discutido em relação a perda de massa, novamente o aditivo pareceu
ter uma ação compensatória em relação a ações do glicocorticoide, minimizando a
atuação deste nos segmentos iniciais intestino.
Na porção final do intestino o aditivo não teve influência local, pois a altura do
epitélio dos grupo aditivo e controle foram similares entre si, assim como do grupo
GD comparado ao grupo GAD. Alguns autores mencionam que a porção final do
intestino não têm função absortiva, como as demais porções do intestino, estando
mais relacionada com função osmorregulatória (STROBAND; MEER;
TIMMERMANS, 1979). Isso poderia explicar os resultados observados nesta porção
intestinal. Também existe a possibilidade do aditivo ter sido absorvido quase
completamente nas porções anteriores, pois é sabido que 70-80% da absorção
intestinal ocorre nos cecos pilóricos e início do intestino (BUDDINGTON; DIAMOND,
1986), por esta razão podemos supor que sua ação local seja mesmo menor no final
do intestino.
Avaliando a densidade de células de muco no primeiro experimento, o aditivo
causou a diminuição da densidade nos cecos pilóricos, e o aumento na porção inicial
do intestino. No experimento 2, o aditivo não causou alteração na densidade de
células de muco. Assim, GA e GC foram similares para todas as porções intestinais.
Entretanto, a associação do aditivo com a aplicação de glicocorticoide causou o
aumento na densidade de células de muco nos cecos pilóricos. Por outro lado, no
inicio do intestino a aplicação de glicocorticoide ocasionou o aumento da densidade
de células de muco, e o aditivo não influenciou, tanto no GA, como no GAD. Na
porção média do intestino, o GD apresentou uma densidade de células de muco
maior que GAD, mas ambos não diferiram significativamente de GC e GA. Alguns
estudos demonstram que os flavonoides afetam a progressão do ciclo celular por
meio de diferentes mecanismos, dentre eles a inibição de enzimas de replicação e
reparo (MACHADO, 2006). Sua ação ocorre através de diferentes mecanismos,
dentre eles a inibição da produção de interleucinas, fator de necrose tumoral e
fatores de crescimento (BRUNETTI; COLASANTE; MASCETRA, 1998). Algumas
classes de fatores de crescimento tais como o fator de crescimento de fibroblasto
P á g i n a | 78
(FGF), são capazes de induzir a proliferação de células epiteliais ao longo do trato
gastrointestinal e influenciar na diferenciação de células de muco (HAN et al., 2000) .
Desta maneira, as alterações morfológicas apresentadas no presente estudo podem
estar associadas à utilização de dexametasona como agente de ação inibitória sobre
alguns tipos de fatores sinalizadores do crescimento e diferenciação epitelial. Além
disso, tanto os glicocorticoides, como os flavonoides, atuam no metabolismo de
homeostase da glicose e insulina (CAZAROLLI et al., 2008), e sabe-se que estas
vias estão envolvidas no equilíbrio da proliferação celular. Desta maneira, poderiam
induzir a proliferação das células intestinais.
Corroborando com os resultados encontrados para altura epitelial no final do
intestino, o aditivo não influenciou esta porção, como influenciou as demais, já que a
densidade de células de muco do GA foi similar a GC, e o GAD se igualou aos
outros segmentos intestinais. A aplicação de glicocorticoide, no entanto, agiu nesta
porção intestinal, como pode ser observado pelo aumento de células de muco no
GD comparado ao GC e GA. A ação do glicocorticoide no intestino ocorre devido a
presença de receptores para glicocorticoide, que estão presentes no intestino dos
teleósteos (CHAKRABORTI; WEISBART, 1987; SANDOR; DIBATTISTA; MEHDI,
1984). Estes receptores de glicocorticoide possuem alta afinidade com
dexametasona (LEE et al., 1992). Novamente, o aditivo parece compensar a ação
do glicocorticoide de forma sistêmica, pois no final do intestino o GAD apresentou a
densidade de células de muco em uma concentração intermediária entre a
concentração dos GC, GA e GD, não diferindo de nenhum dos três grupos. As
alterações na concentração de células de muco podem ser ocasionadas por
diversos fatores. A camada de muco age como meio de proteção, lubrificação e
transporte entre o conteúdo luminal e o epitélio, podendo ser influenciada por uma
série de fatores bioativos, incluindo hormônios, neuropeptídios e mediadores
inflamatórios (BLASER et al., 1995; LABOISSE et al., 1996; VILLALOBO, 1998).
Na literatura esta caracterizado que a diminuição de células de muco ocorre
em inflamações agudas e o aumento em inflamações crônicas. Porém muitos
estudos tem mostrado que fatores dietários também afetam o número de células de
muco (GANESSUNKER et al., 1999; MCCRACKEN et al., 1995; SHARMA et al.,
1995; SHARMA; SCHUMACHER, 1995 a,b), sem ocasionar lesões teciduais ou
sistêmicas. Durante as avaliações histológicas em microscopia óptica, não foram
encontradas lesões teciduais aparentes no intestino em nenhum experimento ou
P á g i n a | 79
grupo. Na microscopia eletrônica, a ultraestrutura das células encontrava-se
conservada, entre todos os grupos experimentais. A presença de células
eosinofílicas/eosinófilos foi constatada tanto na microscopia óptica, como na
eletrônica. Estas células estão normalmente associadas aos intestinos em peixes
(AINSWORTH, 1992; ELLIS, 1985) e desempenham função similar a dos mastócitos
de mamíferos (CLAVER; QUAGLIA, 2009; REITE, 1997). Entretanto, os eosinófilos
do GD observados em MET aparentavam morfologia alterada, comparado aos dos
demais grupos, estes apresentavam menos grânulos e consequentemente um maior
espaçamento entre estes. Este aspecto pode indicar que a degranulação tenha
ocorrido (ELLIS, 1985). De fato, os corticosteroides causam degranulação de
mastócitos em mamíferos (KING et al., 1985), ainda a hidrocortisona já demonstrou
induzir a degranulação de células eosinofílicas em truta marrom, sendo os possíveis
motivos além de alterações em parâmetros imunes, perturbação de processos
osmorregulatórios (REITE, 1997).
Assim vemos diferentes resultados em relação às alterações morfológicas do
tecido nos cecos pilóricos e porções inicial, média e final do intestino, acreditamos
que a alteração mostrada no presente estudo possa estar relacionada com
alterações na absorção intestinal destas porções. Existem algumas hipóteses
possíveis para justificar as alterações encontradas: 1 – Como o aditivo composto por
ácidos orgânicos e flavonoides possui um pH baixo, ao entrar na porção inicial do
intestino poderia causar algum tipo de irritação local devido a sua acidez e
desencadear uma resposta protetora do tecido, ou ainda, os flavonoides do
composto poderiam estar exercendo toxicidade as células ou organismo. No
entanto, nos grupos avaliados, a barreira epitelial não foi afetada pelo tratamento e
não apresentou sinais de inflamação ou dano, com ausência de infiltrados
inflamatórios nas laminas analisadas, bem como contagem de leucócitos
sanguíneos em proporções normais. Ainda, os componentes da formula do aditivo
não apresentaram toxidade em outros estudos (PLAKAS et al., 1985); 2 – É possível
que alterações nas dobras intestinais tenham causado alterações de altura do
epitélio, similar ao estudo de Fabregat e colaboradores (2008). Adicionalmente, em
tilápia, a administração de imunoestimulantes dietários, como Ergosan, aumentou a
altura das vilosidades, assim como dos enterócito, e da área de superfície da
mucosa do intestino (MERRIFIELD et al., 2011); 3 – É sabido que alimentos com
diferentes componentes vegetais também influenciam nos processos de
P á g i n a | 80
diferenciação e maturação dos enterócitos em regiões intestinais afetadas
(JOHNSON et al., 1989; PUSZTAI, 1991). Sendo assim, é possível que devido a
alterações na dinâmica das populações celulares do intestino, um aumento
populacional ou uma maior taxa de renovação tenham colaborado com as alterações
epiteliais; 4 – Alguns estudos demonstram que as bactérias influenciam na absorção
e biodisponibilidade dos flavonoides no trato gastrointestinal, e que flavonoides,
como quercetina, podem exercer ação bactericida em bactérias patológicas de
peixes (PETERSON; DWYER, 1998; RATTANACHAIKUNSOPON;
PHUMKHACHORN, 2007). Assim, devido a íntima relação entre microbiota e epitélio
intestinal, esses dados podem indicar também possíveis influências do aditivo na
microbiota residente, que é responsável diretamente ou indiretamente, pelas
modificações ocorridas no microambiente onde esta microbiota está inserida.
A avaliação dos parâmetros de imunidade inata mostrou que a atividade
fagocítica dos macrófagos in vitro não foi alterada em nenhum dos grupos
experimentais. Assim como a atividade de lisozima do experimento 2, que não
diferiu entre os grupos. Com relação ao AA, estes resultados são contraditórios, pois
este já foi descrito por estimular parâmetros imunes, como proliferação de
leucócitos, aumento da fagocitose e ainda a atividade hemolítica do complemento
(VERLHAC; GABAUDAN, 1997). Contudo, a ação do AA em relação a parâmetros
de respostas imunológicas em salmonídeos, nem sempre são consistentes, isso
varia de acordo com as espécies e métodos empregados (LALL, 2000). Hardie e
colaboradores (1991) também não obtiveram alteração em parâmetros de imunidade
inata, como eritrofagocitose e atividade hemolítica do complemento, em trutas com
ração suplementada com acido ascórbico, por 20 semanas de experimento. No
entanto, ao desafiarem os animais com Aeromonas salmonicida, os animais
deficientes em AA tiveram uma maior mortalidade, que aqueles com níveis ideais ou
suplementação de AA. Por sua vez, Lygren e colaboradores (1999) concluíram que
o AA não influencia o status imunológico inato de salmão, pois não encontraram
diferenças, na atividade de lisozima, fagocitose ou atividade hemolítica do
complemento em salmão do Atlântico alimentados por 19 dias, com dieta de 150 ou
1000 mg de ácido ascórbico. Ainda, ao desafiarem os animais com A. salmonicida
(furunculose) ou com o vírus de anemia infecciosa de salmão, o nível de AA na dieta
não influenciou a taxa de mortalidade dos peixes. Contudo, os animais receberam a
dieta com suplementação de AA apenas antes do desafio empregado. Assim, é
P á g i n a | 81
possível que os resultados observados sejam devido a falta do AA durante o período
de desafio sanitário, já que a reserva tecidual de AA é dependente de seu consumo
e seus níveis diminuem nos tecidos quando o AA é eliminado da dieta (VERLHAC et
al., 1998).
Quando os peixes teleósteos apresentam aumento dos níveis sanguíneos de
corticosteroides devido ao estresse, há redução do número de linfócitos circulantes,
(TORT, 2011; WENDELAAR BONGA, 1997). No entanto, a aplicação exógena de
glicocorticoide no presente estudo, não apresentou o mesmo resultado, já que
proporção de linfócitos, monócitos e neutrófilo sanguíneos de GD permaneceu
similar a do GC e GA. Por outro lado, os valores de neutrófilos aumentaram
significativamente, no GAD. Sendo assim, o glicocorticoide exógeno pode não
ocasionar alteração no número de leucócitos circulantes. No entanto, nos animais
que consumiram ração com aditivo, após a aplicação do glicocorticoide, estes
responderam com aumento de neutrófilos, demonstrando que o aditivo pode ter
ação sobre o status imunológico inato em situações de aumento dos corticoides. O
estresse crônico geralmente resulta na imunossupressão (TORT, 2011;
WENDELAAR BONGA, 1997). Considerando que os neutrófilos são células de alta
atividade fagocítica, seu aumento proporcionado pelo aditivo poderia favorecer o
combate aos patógenos oportunistas, que são favorecidos pela imunossupressão
dos peixes.
Dentre os animais que receberam aplicação intraperitoneal de glicogênio de
ostra, para os ensaios de fagocitose, os do GAD apresentaram aumento significativo
na proporção de todos os leucócitos sanguíneos, em relação aos outros três grupos
experimentais (GC, GA e GD). Similarmente, a aplicação intraperitoneal de diquat
(herbicida), como modelo de estresse oxidativo em leitões, demonstrou que, em
animais com dieta de polifenóis de chá, ocorre proliferação e ativação de linfócitos T
(DENG et al., 2009). Ainda, o AA também pode aumentar a proliferação de
leucócitos de trutas arco-íris como visto em ensaios in vitro de proliferação induzida,
agindo de maneira dose dependente na proliferação (HARDIE et al., 1993).
A aplicação do glicogênio causa o recrutamento de leucócitos sanguíneos,
atraindo-os para a cavidade celomática. Os resultados observados demonstram, que
os animais que consumiram o aditivo tiveram uma resposta maior ao estímulo do
glicogênio de ostra, caracterizando-o como imunoestimulante, comprovando a
hipótese de que a resposta dos animais alimentados com aditivo, frente a patógenos
P á g i n a | 82
oportunistas, seria maior que a dos animais que não consumiram aditivo.
De fato, o uso de aditivos fitogênicos (Flavonoides) e de imunoestimulantes
(ácido ascórbico) para a manutenção do desempenho animal e para a prevenção de
doenças vem se tornando prática comum na aquicultura; e como relatados estes têm
o potencial de aumentar os mecanismos de defesa inatos dos peixes frente a
patógenos com reflexos positivos na produção de pisciculturas (BRICKNELL;
DALMO, 2005).
P á g i n a | 83
6 CONCLUSÃO
A utilização dos flavonoides associados a ácidos orgânicos, como aditivos
dietários, promove o incremento de massa em trutas arco-íris saudáveis, quanto
utilizados a curto prazo (até 24 dias); Sua administração oral a curto (30 dias) e
longo prazo (90 dias), influenciam beneficamente o intestino de trutas; A
administração constante de ácido ascórbico e flavonoides, desempenha atividades
compensatórias em relação a danos ocasionados por glicocorticoide exógeno,
amenizando a perda de massa e alterações intestinais, indicando vantagens
zootécnicas e imunológicas no uso destes diante de situações que possam
ocasionar estresse.
P á g i n a | 84
REFERÊNCIAS2
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H; PILLAI, S. Cellular and molecular immunology. 6th ed. Saunderd: Elsevier, 2010. ISBN: 978-1-4160-3123-9. AFONSO, A.; ELLIS, A. E.; SILVA, M. T. The leukocyte population of the unstimulates peritoneal cavity of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish and Shellfish Immunology, v. 7, p. 335-348, 1997. AGREN, J. J.; HANNINEN, O.; LAITINEN, M.; SEPPANEN, K.; BERNHARDT, I.; FOGELHOM, L.; HERRANEN, J.; PENTTILA, I. Boreal freshwater fish diet modifies the plasma lipids and prostanoids and membrane fatty acids in man. Lipids, v. 23, n. 10, p. 924–929, 1988. AINSWORTH, A. J. Fish granulocytes: morphology, distribution, and function. Annual Reviews of Fish Diseases, v. 2, p. 123-148, 1992. AKSOY, M.; LIM, C.; LI, M. H.; KLESIUS, P. H. Interaction between dietary levels of vitamins C and E on growth and immune responses in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Aquaculture Research, v. 39, p. 1198-1209, 2008. ALKAHEM, H. F. The toxicity of nickel and the effects of sublethal levels on haematological parameters and behaviour of the fish, Oreochromis niloticus. Journal of University of Kwait Science, v. 21, n. 2, p. 243-252, 1994. ALMAZÁN-RUEDA, P.; SCHARMA, J. W.; VERRETH, J. A. J. Behavioural responses under different feeding methods and light regimes of the African catfish (Clarias gariepinus) juveniles. Aquaculture, v. 231, p. 347-359, 2004. ALSOP, D.; VIJAYAN, M. M. Development of the corticosteroid stress axis and receptor expression in zebrafish. American Journal of Physiology, v. 294, n. 3, p. 711–719, 2008. ALSOP, D.; VIJAYAN, M. M. Molecular programming of the corticosteroid stress axis during zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part A, Molecular & integrative physiology, v. 153, n. 1, p. 49-54, 2009a. ALSOP, D.; VIJAYAN, M. M. The zebrafish stress axis: Molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event. General Comparative Endocrinology, v. 161, p. 62-66, 2009b. ANADÓN, A.; MARTÍNEZ-LARRAÑAGA, M. R.; MARTÍNEZ, M. A. Probiotics for animal nutrition: regulation and safety assessment. Regulatory Toxicology and Pharmacology, v. 45, p. 91-95, 2006.
2 De acordo com:
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 6023: informação e documentação:
referências: elaboração. Rio de Janeiro, 2002.
P á g i n a | 85
ANDERSON, D. P.; JENEY, G. Immunostimulants added to injected Aeromonas salmonicida bacterin enhance the defense mechanisms and protection in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 34, p. 379-389, 1992.
AZAD, I. S.; SYAMA, J.; POORNIMA, M.; ALI, S. A. Supra dietary levels of vitamins C and E enhance antibody production and immune memory in juvenile milkfish, Chanos chanos (Forsskal) to formalin-killed Vibrio vulnificus. Fish & Shellfish Immunology, v. 23, n. 1, p. 154-163, 2007. BAILEY, G. S.; WILLIAMS, D. E.; HENDRICKS, J. D. Fish models for environmental carcinogenesis: the rainbow trout. Environmental Health Perspectives, v. 104 p. 5-21, 1996. BANCROFT, J. D.; STEVENS, A. Theory and practice in of histological technicians. 2th ed. London: Chruchill, 1982. 662 p. BARTON, B. A.; IWAMA, G. K. Physiological changes in fish from stress in aquaculture with emphasis on the response and effects of corticosteroids. Annual Reviews of Fish Diseases, v. 1, p. 3-26, 1991. BATISTA, S. L. Flavonóides e mananoligossacarídeos em dietas para frangos de corte. 2005. 54 f. Dissertação (Mestrado) – Curso de Pós-Graduação em Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2005. BEECHER, G. R. Overview of dietary flavonoids: nomenclature, occurrence and intake. The Journal of Nutrition, v. 133, n. 10, p. 3248-3254, 2003. BIESALSKI, H. K. Polyphenols and inflammation: basic interactions. Curr. Opin. Clinical Nutrition and Metabolic Care, v. 10, n. 6, p. 724-728, 2007. BLASER, M. J.; SMITH, P. D.; RAVDIN, J. I.; GREENBERG, H. B.; GUERRANT, R. L. Infections of the gastrointestinal tract. New York: Raven Press, 1995. ISBN: 0-7817-0226-7 BOOTS, A. W.; HAENEN, G. R.; BAST, A. A. Health effects of quercetin: from antioxidant to nutraceutical. European Journal of Pharmacology, v. 585, p. 325-337, 2008. BOYD, C.E.; MASSAUT, L. Risks associated with the use of chemicals in pond aquaculture. Aquaculture Engineering, v. 20, p. 113-132, 1999. BRASIL. Ministério da Pesca e Aquicultura. Boletim Estatístico da Pesca e Aquicultura 2011. São Paulo, 2011. 60 p. BRASIL. Ministério da Pesca e Aquicultura. Censo Aquícola Nacional: Ano 2008. São Paulo, 2013. 336 p. BRICKNELL, I.; DALMO, R. A. The use of immunostimulants in fish larval aquaculture. Fish & Shellfish Immunology, v. 19, p. 457-472, 2005.
P á g i n a | 86
BRUNETTI, M.; COLASANTE, A.; MASCETRA, N. IL-10 Synergizes with dexamethasone in inhibiting human T cell proliferation 1. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, v. 285, p. 915-919, 1998. BUDDINGTON, R. K.; DIAMOND, J. M. Aristotle revisited: The function of pyloric caeca in fish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 83, n. 20, p. 8012-8014, 1986. CABELLO, F. C. Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: a growing problem for human and animal health and for the environment. Environmental Microbiology, v. 8, n. 7, p. 1137-1144, 2006. CAZAROLLI, L. H.; ZANATTA, L.; ALBERTON, E. H.; FIGUEIREDO, M. S. R. B.; FOLADOR, P.; DAMAZIO, R. G.; PIZOLATTI, M. G.; SILVA, F. R. M. B. Flavonoids: Prospective Drug Candidates. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, v. 8, p. 1429-1440, 2008. CHAGAS, E. C.; VAL, A. L. Efeito da vitamina C no ganho de peso e em parâmetros hematológicos de tambaqui. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 38, n. 3, p. 397-402, 2003. CHAKRABORTI, P. K.; WEISBART, M. High affinity cortisol receptor activity in the liver of the brook trout, Salvelinus fontinalis (Mitchill). Canadian Journal of Zoology, v. 65, p. 2498-2503, 1987. CHEN, Y. C.; NGUYEN, J.; SEMMENS, K.; BEAMER, S.; JACZYNSKI, J. Enhancement of omega-3 fatty acid content in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fillets. Journal of Food Science, v. 71, p. 383–889, 2006. CHURCH, D. C.; POND, W. G. Vitaminas hidrosolubles: fundamentos de nutrición y alimentación animal. 5. ed. México: Baldeiras, 1996. CLARKE, C. R. Antimicrobial reisistance. The Veterinary clinics of North America. Small animal practice, v. 36, p. 987-1001, 2006. CLAVER, J. A.; QUAGLIA, A. I. E. Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine, v. 18, n 2, p. 87–97, 2009. COMBS, G. F. The vitamins: fundamental aspects in nutrition and health. 2th ed. San Diego: Academic Press, 1998. 618 p. COYLE, S. D.; DURBOROW, R. W.; TIDWELL, H. J. Anaesthetics in aquaculture. SRAC publication, southern regional aquaculture center, USA, n. 3900, 2004. CYRINO, J. E. P.; BICUDO, A. J. A.; SADO, R. Y.; BORGHESI, R.; DAIRIKI, J. K. A piscicultura e o ambiente – o uso de alimentos ambientalmente corretos em piscicultura. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 39, p. 68-87, 2010.
P á g i n a | 87
DABROWSKI, K.; MATUSIEWICZB, M.; BLOM, J. H. Hydrolysis, absorption and bioavailability of ascorbic acid esters in fish. Aquaculture, v. 124, p. 169-192, 1994. DAVIS, K. B.; TPRRANCE, P.; PARKER, N. C.; SUTTLE, M. A. Growth, body composition and hepatic tyrosine aminotransferase activity in cortisol fed channel catfish, Ictalurus punctatus Rafinesque. Journal of Fish Biology, v. 27, p. 177– 184, 1985. DEGÁSPARI, C. H.; WASZCZYNSKYJ, N. Antioxidants properties of phenolic compounds. Visão Acadêmica, v. 5, n. 1, 2004. Disponível em: <http://ojs.c3sl.ufpr.br/ojs2/index.php/academica/article/view/540>. Acesso em: 22 jun. 2013. DEMERS, N. E.; BAYNE, C. J. The immediate effects of stress on hormones and plasma lysozyme in rainbow trout. Developmental & Comparative Immunology, v. 21, n. 4, p. 363-373, 1997. DENG, Q.; XU, J.; YU, B.; HE, J.; ZHANG, K.; DING, X.; CHEN, D. Effect of dietary tea polyphenols on growth performance and cell-mediated immune response of post-weaning piglets under oxidative stress. Archives of Animal Nutrition, v. 64, n. 1, p. 12-21, 2009. DIAS, J. L. S. O futuro da truticultura no Brasil. Revista Panorama da Aquicultura Ltda, Rio de Janeiro, n. 36, 1996. DOGGETT, T. A.; HARRIS, J. E. Morphology of the gut-associated lymphoid tissue in Oreochromis mossambicus and its role in antigen absortion. Fish & Shellfish Immunology, v. 1, p. 213-228, 1991. DOÑATE, C.; BALASCH, J. C.; BOBE, A. C. J.; TORT, L.; MACKENZIE, S. The effects of immunostimulation through dietary manipulation in the rainbow trout; evaluation of mucosal immunity. Marine Biotechnology, v. 12, p. 88–99, 2010. ELLIS, A. E. Eosinophilic granular cells (EGC) and histamine response to Aeromonas salmonicida toxins in Rainbow Trout. Developmental and Comparative Immunology, v. 9, p. 251-260, 1985. ELLIS, A. E. Leucocytes and related cells in the plaice, Pleuronectes platessa. Journal Fish Biology, v. 8, n. 2, p. 143-156, 1976. EO, J.; LEE, K.J. Effect of dietary ascorbic acid on growth and non-specific immune responses of tiger puffer, Takifugu rubripes. Fish & Shellfish Immunology, v. 25, p. 611-616, 2008. ESTEBAN, M. A.; MESEGUER, J.; GARCIA AYALA, A.; AGULLEIRO, B. Erythropoiesis and thrombopoiesis in the head-kidney of the sea bass (Dicentrarchus labrax L.): an ultrastructural study. Archives of histology and cytology, v. 52, n. 4, p. 407-419, 1989.
P á g i n a | 88
FABREGAT, T. E. H. P. Utilização do prebiótico Flavofeed® como suplemento dietário para juvenis de tilápia do nilo Oreochromis niloticus. 2006. 42 f. Dissertação (Mestrado) – Centro de Aquicultura, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2006. FABREGAT, T. E. H. P.; FERNANDES, J. B. K.; RODRIGUEZ, L. A.; BORGES, F. F.; PEREIRA, T. S.; NASCIMENTO, T. M. T. Digestibilidade aparente da energia e da proteína de ingredientes selecionados para juvenis de pacu Piaractus mesopotamicus. Revista Acadêmica : Ciências Agrárias e Ambientais, Curitiba, v. 6, n. 4, p. 459-464, 2008. FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO). International introductions of inland aquatic species, Roma, 1988. FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO). The State of World Fisheries and Aquaculture 2012. Roma, 2012. 209p. ISBN: 978-92-5-107225-7 FERNANDES, G. Progress in nutritional immunology. Immunologic research, v. 40, p. 144-261, 2008. FORERO, A. R. Determinacion de algunos aspectos hematológicos de O. mykiss. Revista de Biologia Tropical, v. 43, p. 283-288, 1995. FULLER, R. Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology, Oxford, v. 66, n. 5, p. 365-378, 1989. GANESSUNKER, D.; GASLINS, H. R.; ZUCKERMANN, F. A.; DONOVAN, S. M. Total parenteral nutrition alters molecular and cellular indices of intestinal inflammation in neonatal piglets. Journal Parenteral and Enteral Nutrition, v. 23, p. 337–344, 1999. GARCIA-LEME, J. Hormones and inflammation. Boca Raton: CRC Press, 1989. GEORGIEV, V.; ANANGA, A.; TSOLOVA, V. Recent advances and uses of grape flavonoids as nutraceuticals. Nutrients, v. 6, p. 391–415, 2014. doi: 10.3390/nu6010391 GRAJEK, W.; OLEJNIK, A.; SIP, A. Probiotics, prebiotics and antioxidants as functional foods. Acta Biochimica Polonica, v. 52, n. 3, p. 665–671, 2005. GRASSI-MILANO, E.; BASARI F.; CHIMENTI C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. General and comparative endocrinology, v. 108, n. 483, p. 96, 1997.
P á g i n a | 89
HAN, D. S.; LI, F.; HOLT, L.; CONNOLY, K.; HUBERT, M.; MICELI, R.; OKOYE, Z.; SANTIAGO, G.; WINDLE, K.; WONG, E.; SARTOR, B. Keratinocyte growth factor 2 (FGF-10) promotes healing of experimental small intestinal ulceration in rats. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology, v. 279, n. 5, p. 1011-1022, 2000. HARDIE, L. J.; FLETCHER, T. C.; SECOMBES, C. J. The effect of dietary vitamin C on the immune response of the Atlantic salmon (Salmo salar L.). Aquaculture, v. 95, p. 201-214, 1991. HARDIE, L. J.; MARSDEN, M. J.; FLETCHER, T. C.; SECOMBES, C. J. In vitro addition of vitamin C affects rainbow trout lymphocyte responses. Fish & Shellfish Immunology, v. 3, p. 207-219, 1993. HAVSTEEN, B. H. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacology & Therapeutics, v. 96, p. 67-202, 2002. HEO, J. M.; OPAPEJU, F. O.; PLUSKE, J. R.; KIM, J. C.; HAMPSON, D. J.; NYACHOTI, C. M. Gastrointestinal health and function in weaned pigs: a review of feeding strategies to control post-weaning diarrhoea without using in-feed antimicrobial compounds. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, v. 97, p. 207–237, 2013. HINE, P. M. The granulocytes of fish. Fish & Shellfish Immunology, v. 2, p. 79-98, 1992. HUNTER, T. Protein kinases and phosphatases: the yin and yang of protein phosphorylation and signaling. Cell, v. 80, p. 225-236, 1995. HURST, J. K.; BARRETTE, W. C. Leukocytic oxygen activation and microbicidal oxidative toxins. Critical Reviews In Biochemistry and Molecular Biology, v. 24, p. 271-328, 1989. JENTOFT, S.; AASTVEIT, A. H.; TORJESEN, P. A.; ANDERSEN, Ø. Effects of stress on growth, cortisol and glucose levels in non-domesticated Eurasian perch (Perca fluviatilis) and domesticated rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Comparative Biochemistry and Physiology, v. 141, p. 353 – 358, 2005. JOHNSON, I. T.; GEE, J. M.; PRICE, K. R.; FENWICK, G. R. Gastrointestinal effects of some membranolytic plant constituents. In: RECENT ADVANCES OF RESEARCH IN ANTINUTRITIONAL FACTORS IN LEGUME SEEDS PROCEEDINGS OF THE FIRST INTERNATIONAL WORKSHOP ON "ANTINUTRITIONAL FACTORS ANF IN LEGUME SEEDS". November 23-25, 1988, Wageningen, Netherlands. Anais… Wageningen, Netherlands, 1989. p. 206-209. JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia Básica. 10th ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. 488 p. ISBN: 85-277-0906-6
P á g i n a | 90
KHOJASTEH, S. M. B.; SHEIKHZADEH, F.; MOHAMMADNEJAD, D.; AZAMI, A. Histological, histochemical and ultrastructural study of the intestine of Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). World Applied Science Journal, v. 6, p. 1525-1531, 2009. KHOR, Y. M.; SOGA, T.; PARHAR, I. S. Caffeine neuroprotects against dexamethasone-induced anxiety-like behavior in the Zebrafish (Danio rerio). General and Comparative Endocrinology, v. 181, p. 310-315, 2013. KIECOLT-GLASER, J. K.; CACIOPPO, J. T.; MALARKEY, W. B.; GLASER, R. Acute psychological stressors and short-term immune changes: what, why, for whom, and to what extent? Psychosomatic Medicine, v. 54, p. 680–685, 1992. KIM, H. P.; SON, K. H.; CHANG, H. W.; KANG, S. S. Anti-inflammatory plant flavonoids and cellular action mechanisms. Journal of Pharmacological Sciences, v. 96, p. 229-245, 2004. KING, S. J.; MILLER, H. R. P.; NEWLANDS, G. F. J.; WOODBURY, R. G. Depletion of mucosal mast cell protease by corticosteroids: effect on intestinal anaphylaxis in the rat. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 82, p. 1214-1248, 1985. KLASING, K. C. Vitamins: comparative avian nutrition. New York: Cabi Publishing, 1998. ISNB: 0-85199-219-6 KÖLLNER, B.; WASSERRAB, B.; KOTTERBA, G.; FISCHER, U. Evaluation of immune functions of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)—how can environmental influences be detected? Toxicology Letters, v. 131, n. 1-2, p. 83–95, 2002. KRASNOV, A.; KOSKINEN, H.; PEHKONEN, P.; REXROAD III, C. E. Gene expression in the brain and kidney of rainbow trout in response to handling stress. BMC Genomics, v. 6, n. 3, 2005. LABOISSE, C.; JARRY, A.; BRANKA, J. E.; MERLIN, D.; BOU-HANNA, C.; VALLETTE, G. Recent aspects of the regulation of intestinal mucus secretion. The Proceedings of the Nutrition Society, v.55, p. 259–264, 1996. LALL, S. P. Nutrition and Health of fish. In: CRUZ -SUÁREZ, L.E.; RICQUE-MARIE, D.; TAPIA-SALAZAR, M.; OLVERA-NOVOA, M. A.; CIVERA-CERECEDO, R. Avances en Nutrición Acuícola V. Memorias del V Simposium Internacional de Nutrición Acuícola. Mérida, Yucatán, Mexico, 2000. p. 19-22. LE, P. P.; FRIEDMAN, J. R.; SCHUG, J.; BRESTELLI, J. E.; PARKER, J. B. Glucocorticoid receptor-dependent gene regulatory networks. Plos Genetics, v. 1, n. 2, 2005. LEATHERLAND, J. F. Thyroid response to ovine thyrotropin challenge in cortisol- and dexamethasone-treated Rainbow Trout, Salmo gairdneri. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 86, n. 2, p. 383-387, 1987.
P á g i n a | 91
LEE, P. C.; GOODRICH, M.; STRUVE, M.; YOON, H. I.; WEBER, D. Liver and brain glucocorticoid receptor in Rainbow Trout, Oncorhynchus mykiss: down-regulation by dexamethasone. General and Comparative Endocrinology, v. 87, p. 222-231, 1992. LEVRAUD, J. P.; BOUDINOT, P. The immune system of teleost fish. Medical Science, v. 25, n. 4, p. 405-411, 2009. LI, M. H.; WISE, D. J.; ROBINSON, E. H. Effect of dietary vitamin C on weight gain, tissue ascorbate concentration, stress response, and disease resistance of Channel Catfish Ictalurus punctatus. Journal of the World Aquaculture Society, v. 29, n. 1, p. 1-8, 1998. LIM, C.; KLEYSIUS, H. P.; LI, H. M.; ROBINSON, H. E. Interaction between dietary levels of iron and vitamin C on growth hematology, immune response and resistance of Channel Catfish (Ictalurus punctatus) to E. ictaluri challenge. Aquaculture, v. 185, p. 313-327, 2000. LIN, J.K.; WENG, M.S. Flavonoids as nutraceuticals: the science of flavonoids. Berlin: Grotewold Springer, 2006. LIU, H.; XIE, S.; ZHU, X.; LEI, W.; HAN, D.; YANG, Y. Effects of dietary ascorbic acid supplementation on the growth performance, immune and stress response in juvenile Leiocassis longirostris Gunther exposed to ammonia. Aquaculture Research, v. 39, p. 1628-1638, 2008. LYGREN, B.; SVEIER, H.; HJELTNES, B.; WAAGBØ, R. Examination of the immunomodulatory properties and the effect on disease resistance of dietary bovine lactoferrin and vitamin C fed to Atlantic salmon (Salmo salar) for a short-term period. Fish & Shellfish Immunology, v. 9, p. 95–107, 1999. MACHADO, H. Atividade dos flavonoids rutina e naringina sobre o tumor ascítico de Ehrlich “in vivo”. 2006. 122 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica Agrícola) – Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, 2006. MAGNADÓTTIR, B. Innate immunity of fish (overview). Fish & Shellfish Immunology, v. 20, n. 2, p. 137–151, 2006. MCCRACKEN, V. J.; LORENZ, R. G. The gastrointestinal ecosystem: a precarious alliance among epithelium, immunity and microbiota. Cellular Microbiology, v. 3, p.1–11, 2001. MCCRACKEN, B. A.; GASKINS, H. R.; RUWE-KAISER, P. J.; KLASING, K. C.; JEWELL, D. E. Diet-dependent and diet-independent metabolic responses underlie growth stasis of pigs at weaning. Journal Parenteral and Enteral Nutrition, v. 125, p. 2838–2845, 1995.
P á g i n a | 92
MERRIFIELD, D. L.; HARPER, G. M.; MUSTAFA, S.; CARNEVALI, O.; PICCHIETTI, S.; DAVIES, S. J. Effect of dietary alginic acid on juvenile tilapia (Oreochromis niloticus) intestinal microbial balance, intestinal histology and growth performance. Cell Tissue, v. 344, p. 135–146, 2011. MIDDLETON, E. J.; KANDASWAMI, C.; THEOHARIDES, T. C. The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and câncer. Pharmacological Reviews, v. 52, n. 4, p. 673-751, 2000. MOCO, S.; MARTIN, F. J.; REZZI, S. Metabolomics view on gut microbiome modulation by polyphenol-rich foods. Journal of Proteome Research, v. 11, p. 4781−4790, 2012. MOMMSEN, T. P.; VIJAYAN, M. M.; MOON, T. W. Cortisol in teleosts: dynamics, mechanisms of action, and metabolic regulation. Reviews in Fish Biology and Fisheries, v. 9, p. 211-268, 1999. MORGAN, A. L.; THOMPSON, K. D.; AUCHINACHIE, N. A.; MIGAUD, H. The effect of seasonality on normal haematological and innate immune parameters of Rainbow Trout Oncorhynchus mykiss L. Fish & Shellfish Immunology, v. 25, p, 791-799, 2008. NARAYANA, K. R.; SRIPAL, R.; CHALUVADI, M. R.; KRISHNA, D. R. Bioflavonoids classification, pharmacological, biochemical effects and therapeutic potential. Indian Journal of Pharmacology, v. 33, p. 2-16, 2001. NATIONAL RESEARCH COUNCIL. Nutrient Requirements of Fish. Washington, DC: The National Academies Press, 1993. v. 2, 114 p. NAVARRE, O.; HALVER, J. E. Disease resistance and humoral antibody production in Rainbow Trout fed high levels of vitamin C. Aquaculture, v. 79, p. 207-221, 1989. NAVARRO, R. D. Suplementação de vitaminas E e C para tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus). 2008. 51 f. Tese (Doutorado em Nutrição Animal) – Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, 2008. NELSON, J. S. Fishes of the world. 4th ed. New York: John Wiley & Sons, 2006. 601p. NIJVELDT, R. J.; NOOD, E.; HOORN, D. E. C.; BOELENS, P. G.; NORREN, K.; LEEUWEN, P. A. M. Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications, American Journal of Clinical Nutrition, v. 74, p. 418-425, 2001. NISHIZAKI, Y.; ISHIMOTO, Y.; HOTTA, Y.; HOSODA, A.; YOSHIKAWA, H.; AKAMATSU, M.; TAMURA, H. Effect of flavonoids on androgen and glucocorticoid receptors based on in vitro reporter gene assay. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, v. 19, p. 4706–4710, 2009.
P á g i n a | 93
PADRÓS, F.; CRESPO, S. Ontogeny of the lymphoid organs in the turbot Scophthalmus maximus: a light and electron microscope study. Aquaculture, v. 144, p. 1-16, 1996. PAVANELLI, G. C.; EIRAS, J. C.; TAKEMOTO, R. M. Doenças de peixes: profilaxia, diagnóstico e tratamento. 2th ed. Maringá: Eduem, 1998. 305 p. PETERSON, J.; DWYER, J. Flavonoids: dietary occurrence and biochemical activity. Nutrition Research, v. 18, n. 12, p. 1995-2018, 1998. PETRELL, R. J.; ANG, K. P. Effects of pellet contrast and light intensity on salmonid feeding behaviours. Aquacultural Engineering, v. 25, n. 3, p. 175-186, 2001. PICKERING, A. D. Stress and Fish. In: PROCEEDINGS OF AN INTERNATIONAL SYMPOSIUM OF THE FISHERIES SOCIETY OF THE BRITISH ISLES. Norwich, 9th-12th September 1980. Anais… University of East Anglia, Academic Press, 1981. p. xiv + 367 p. PLAKAS, S. M.; LEE, T.; WOLKE, R. E.; MEADE, T. L. Effect of Maillard browning reaction on protein utilization and plasma amino acid response by Rainbow Trout (Salmo gairdneri). The Jornal of Nutrition, v. 115, p. 1589-1599, 1985. PLANAS, M.; CUNHAS, I.; MUNILLA, R. Utilización de antibióticos para la mejora del cultivo larvario del rodaballo con fines experimentales. Actas V Congreso Nacional Acuicultura, San Carles de la Rápita: Universitat de Barcelona, 1995. PLAT, J.; MENSINK, R. P. Food components and immune function. Current Opinion in Lipidology, v. 16, p. 31–37, 2005. POTTINGER, T. G. The effect of stress and exogenous cortisol on receptor-like binding of cortisol in the liver of Rainbow Trout, Oncorhynchus mykiss. General And Comparative Endocrinology, v. 78, p. 194-203, 1990. POTTINGER, T. G.; CARRICK, T. R. Modification of the plasma cortisol response to stress in Rainbow Trout by selective breeding. General And Comparative Endocrinology, v. 116, p.122-132, 1999. POTTINGER, T. G.; MORAN, T. A.; MORGAN, J. A. W. Primary and secondary indices of stress in the progeny of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) selected for high and low responsiveness to stress. Journal of Fish Biology, v. 44, p. 149-163, 1994. POTTINGER, T. G.; PICKERING, A. D.; HURLEY, M. A. Consistency in the stress response of individuals of two strains of Rainbow Trout Oncorhynchus mykiss. Aquaculture, v. 103, p. 275–289, 1992. PUSZTAI, A. Plant lectins: chemistry & pharmacology of natural products. New York: Cambridge University Press, 1991.
P á g i n a | 94
RAMSAY, J. M.; WATRAL, V.; SCHRECK, C. B.; KENT, M. L. Husbandry stress exacerbates mycobacterial infections in adult zebrafish, Danio rerio (Hamilton). Journal of Fish Disease, v. 32, p. 931–941, 2009. RATTANACHAIKUNSOPON, P.; PHUMKHACHORN, P. Bacteriostatic effect of flavonoids isolated from leaves of Psidium guajava on fish pathogens. Fitoterapia, v. 78, n. 6, p. 434-436, 2007. RAZQUIN, B. E.; CASTILLO, A.; LÓPEZ-FIERRO, P.; ÁLVAREZ, F.; ZAPATA, A.; VILLENA, A. J. Ontogeny of IgM-producing cells in the lymphoid organs of rainbow Trout, Salmo gairdneri, Richardson: an immuno and enzyme-histochemical study. Journal of Fish Biology, v. 36, p. 159-173, 1990. REITE, O. B. Mast cells/eosinophilic granule cells of salmonids: staining properties and responses to noxious agents. Fish & Shellfish Immunology, v. 7, p. 567- 584. 1997.
RINGø, E.; ZHOU, Z.; HE, S.; OLSEN, R. E. Effect of stress on intestinal microbiota
of Arctic Charr, Atlantic Salmon, Rainbow Trout and Atlantic Cod: A review. African Journal of Microbiology, v. 8, n. 7, p. 609-618, 2014. doi: 10.5897/AJMR2013.6395 ROMBOUT, J. H.; ABELLI, L.; PICCHIETTI, S.; SCAPIGLIATI, G.; KIRON, V. Teleost intestinal immunology. Fish & Shellfish Immunology, v. 5, n. 31, p. 616-626, 2010. ROSS, L. G.; ROSS, B. Defining stress in aquatic animals. In: ________. Anaesthetic e sedative techniques for aquatic animals. 3th ed. Oxford: Blackwell Publishing Ltd. 2008. p. 7-20. ISBN: 978-1-4051-4938-9 ROSENFELD, G. Corante pancromico para hematologia e citologia clínica, nova combinação dos componentes do May-Grunwald e do Giemsa num só corante de emprego rápido. Memórias do Instituto Butantan, v. 20, p. 329-334, 1947. ROTELLI, A. E.; GUARDIA, T.; JUÁREZ, A. O.; ROCHA, N. E.; PELZER, L. E. Comparative study of flavonoids in experimental models of inflammation. Pharmacological Research, v. 48, p. 601–606, 2003. ROTTA, M. A. Utilização do ácido ascórbico (vitamina C) pelos peixes. EMBRAPA, v. 1, p. 15-20, 2003. SANDOR, T.; DIBATTISTA, J. A.; MEHDI, A. Z. Glucocorticoid receptors in the gill tissue of fish. General and Comparative Endocrinology, v. 53, n. 3, p. 353-364, 1984. SATO, S. G.; TABATA, A. Y.; TAKAHASHI, S. N. Truta de Campos do Jordão, valorização do produto local através da indicação geográfica do turismo e da gastronomia. Informações Econômicas, v. 41, n. 3, 2011. SAURA-CALIXTO, F. Dietary fiber as a carrier of dietary antioxidants: an essential physiological function. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 59, p. 43–49, 2011.
P á g i n a | 95
SCHMIDT, C. Truticultura. Revista Panorama da Aquicultura, Rio de Janeiro, n. 57, 2000. Disponível em: <http://www.panoramadaaquicultura.com.br/Paginas/Revistas/57/truticultura.asp>. Acesso em: 15 Jul. 2014. SCHRECK, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology, v. 165, p. 549-556, 2010. SCOTT-WEESE, J.; SHARIF, S.; RODRIGUEZ-PALACIOS, A. Probiotics in veterinary medicine. In:________. Therapeutic microbiology: probiotics and related strategies. 2008. p. 341-356. ISBN: 978-1-55581-403-8. SECOMBES, C.J. The fish immune system – the nonspecifis immune system: celular defenses. San Diego, California, USA, Academic Press Inc, p. 63-103, 1996. SHARMA, R.; SCHUMACHER, U. Morphometric analysis of intestinal mucins under different dietary conditions and gut flora in rats. Digestive Diseases and Sciences, v. 40, p. 2532–2539, 1995a. SHARMA, R.; SCHUMACHER, U. The influence of diets and gut microflora on lectin binding patterns of intestinal mucins in rats. Journal Laboratory Investigation, v. 73, p. 558–564, 1995b. SHARMA, R.; SCHUMACHER, U.; RONAASEN, V.; COATES, M. Rat intestinal mucosal responses to a microbial flora and different diets. Journal Gut, v. 36, p. 209-214, 1995. SILVA, J. R. M. C.; HERNANDEZ-BLAZQUEZ, F. J. H.; PARRA, O. M.; PORTO-NETO, L. Histophisiology of the Hepatic Inflammatory Response in the Antarctic Fish Notothenia neglecta, CNPq (Project, 67004-94 XX Symposium on Polar Biology, 4 e 5 /12/97), National Institute of Polar /Research, Tokyo, Japan, 1997. SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R.; Farmacognosia – da Planta ao Medicamento. 5. ed. Santa Catarina: Editora da UFSC, 2004. SMART, G. R. Aspects of water quality producing stress in intensive fish culture. In: PICKERING, A. D. (Ed.). Stress and fish. London: Academic Press, 1981. p. 277-293. STOSKOPF, M. K. Fish medicine. Philadelphia: Saunders, 1993. p.269-277. STROBAND, H. W. J.; MEER, H. V. D.; TIMMERMANS, L. P. M. Regional functional differentiation in the gut of the grasscarp, Ctenopharyngodon idella. Histochemistry, v. 64, p. 235-249, 1979. TAHARA, S. A journey of twenty-five years through the ecological biochemistry of flavonoids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, v. 71, n. 6, p. 1387-1404, 2007.
P á g i n a | 96
TAKAHASHI, H.; SAKAMOTO, T. The role of ‘mineralocorticoids’ in teleost fish: Relative importance of glucocorticoid signaling in the osmoregulation and ‘central’ actions of mineralocorticoid receptor. General and Comparative Endocrinology, v. 181, p. 223-228, 2013. THOMPSON, I.; WHITE, A.; FLETCHER, T. C.; HOULIHAN, D. F.; SECOMBES, C. J. The effect of stress on the immune response of Atlantic salmon (Salmo salar L. ) fed diets containing different amounts of vitamin C. Aquaculture, v. 114, p. 1-18, 1993. TORT, L. Stress and immune modulation in fish. Developmental and Comparative Immunology, v. 35, p. 1366-1375. 2011. TRICHET, V. V. Nutrition and immunity: an update. Aquaculture, v. 41, p. 356-372, 2010. VAN DER BOON, J.; VAN DEN THILLART, G.E.E.J.M.; ADDINK, A.D.F. The effects of cortisol administration on intermediary metabolism in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 100, p. 47-53, 1991. VEITCH, N. C.; GRAYER, R. E. Flavonoids and their glycosides, including anthocyanins. Natural Product Reports, v. 25, p. 555-611, 2008. VERLHAC, V.; GABAUDAN J. The effect of vitamin C on fish health. Roche Vitamins, n. 51002, 1997. VERLHAC, V.; OBACH, A.; GABAUDAN, J.; SCHÜEP, W.; HOLE, R. Immunomodulation by dietary vitamin C and glucan in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). Fish & Shellfish Immunology, v. 8, p. 409–424, 1998. VIJAYAN, M. M.; BALLANTYNE, J. S.; LEATHERLAND, J. F. Cortisol-induced changes in some aspects of the intermediary metabolism of Salvelinus fontinalis. General and Comparative Endocrinology, v. 82, p. 476–486, 1991. VIJAYAN, M. M.; REDDY, P. K.; LEATHERLAND, J. F.; MOON, T. W. The effects of cortisol on hepatocyte metabolism in rainbow trout: a study using the steroid analogue. General and Comparative Endocrinology, v. 96, p. 75–84, 1994. VILLALOBO, A.; GABIUS, H. J. Signaling pathways for transduction of the initial message of the glycocode into cellular responses. Acta Anatomica, v. 161, p. 110–129, 1998. WALD, G. The visual systems of euryhaline fishes. The Journal of General Physiology, v. 25, n. 2, p. 235–245, 1941. WEDEMEYER, G. Stress induced ascorbic acid depletion and cortisol production in two salmonid fishes. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 29, p. 1247-1251, 1969.
P á g i n a | 97
WEIL, L. S.; BARRY, T. P. MALISON, J. A. Fast growth in rainbow trout is correlated with a rapid decrease in post-stress cortisol concentrations. Aquaculture, v. 193, p. 373– 380, 2001. WENDELAAR BONGA, S. E. The Stress Response in Fish. Phisiological Review, v. 77, n. 3, p. 591- 625, 1997. WHITEHEAD, C. C.; KELLER, T. An update on ascorbic acid in poultry. World´s Poultry Science Journal, v. 59, p. 161-184, 2003. WINDISCH, W.; SCHEDLE, K.; PLITZNER, C.; KROISMAYR, A. Use of phytogenic products as feed additives for swine and poultry. Journal of Animal Science, v. 86, p. 140-148, 2008. WOO, P. T. K.; BRUNO, D. W. Fish Diseases and Disorders: viral, bacterial and fungal infections. CABI, v. 3, p. 479-511, 1998. YADAV, J.; AKELA, B.P. Aldrin induced haematological changes on the common indian catfish, Clarias batrachus (Linn). Comparative Biochemistry and Physiology, v. 18, n. 4, p. 156-159, 1993. YOON, J.; BAEK, S. J. Molecular targets of dietary polyphenols with anti-inflammatory properties. Yonsei Medical Journal, v. 46, n. 5, p. 585-596, 2005. ZAPATA, A. G.; CHIBA, A.; VARAS, A. Cells and tissues of the immune system of fish. In: IWAMA, G.; NAKANISHI, T. (Ed.). The fish immune system. London: Academic, 1996. ZAPATA, A. Ultrastructural study of the teleost fish kidney. Developmental and Comparative Immunology, v. 3. p. 55-56, 1979. ZAPATA, A.; DIEZ, B.; CEJALVO, T.; GUTIÉRREZ-DE FRÍAS, C.; CORTÉS, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & Shellfish Immunology, v. 20, p. 126-136, 2006. ZAPATA, A. G.; COOPER, E. L. The immune system: Comparative Histophysiology. Cjinchester: John Wiley and Sons, 1990. 335 p.