projet de norme marocaine - validation request

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ineICS : 07-100-30

Correspondance La présente norme est une reprise intégrale de la norme ISO 16140-5:2020.

Droits d'auteurDroit de reproduction réservés sauf prescription différente aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé électronique ou mécanique y compris la photocopie et les microfilms sans accord formel. Ce document est à usage exclusif et non collectif des clients de l'IMANOR, Toute mise en réseau, reproduction et rediffusion, sous quelque forme que ce soit, même partielle, sont strictement interdites.

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PNM ISO 16140-5IC 08.0.308

2021

Projet de Norme Marocaine

Norme Marocaine homologuée Par décision du Directeur de l’Institut Marocain de Normalisation N°........ , publiée au B.O N° ....

Microbiologie de la chaîne alimentaire

Validation des méthodes

Partie 5: Protocole pour la validation interlaboratoires de méthodes non commerciales par plan factoriel

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PNM ISO 16140-5:2021

Avant-Propos National

L’Institut Marocain de Normalisation (IMANOR) est l’Organisme National de Normalisation. Il a été créé par la Loi N° 12-06 relative à la normalisation, à la certification et à l’accréditation sous forme d’un Etablissement Public sous tutelle du Ministère chargé de l’Industrie et du Commerce.

Les normes marocaines sont élaborées et homologuées conformément aux dispositions de la Loi N° 12- 06 susmentionnée.

La présente norme marocaine NM ISO 16140-5 a été examinée et adoptée par la Commission de Normalisation des méthodes d'analyse, échantillonnage alimentaires (029)

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Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................ivIntroduction ..................................................................................................................................................................................................................................v1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 12 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 13 Termesetdéfinitions ....................................................................................................................................................................................... 24 Principes généraux pour la validation interlaboratoires de méthodes non

commerciales par plan factoriel .......................................................................................................................................................... 34.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 34.2 Validation par rapport à une méthode de référence .............................................................................................. 34.3 Validation sans méthode de référence ............................................................................................................................... 3

5 Méthodes qualitatives — Protocole technique de validation interlaboratoires par plan factoriel ............................................................................................................................................................................................................. 45.1 Étude de validation interne .......................................................................................................................................................... 45.2 Étude de validation interlaboratoires par rapport à une méthode de référence .......................... 4

5.2.1 Considérations générales ......................................................................................................................................... 45.2.2 Protocole de mesure ..................................................................................................................................................... 45.2.3 Sélection des facteurs à étudier .......................................................................................................................... 65.2.4 Plan d’expérience ............................................................................................................................................................ 6

5.3 Calculs et résumé des données ................................................................................................................................................. 75.4 Interprétation des données.......................................................................................................................................................... 9

5.4.1 Étude de méthodes appariées .............................................................................................................................. 95.4.2 Étude de méthodes non appariées ................................................................................................................... 95.4.3 Analyse des effets factoriels en fonction du RLOD ..........................................................................10

6 Méthodes quantitatives — Protocole technique de validation interlaboratoires par plan factoriel ..........................................................................................................................................................................................................106.1 Étude de validation interne ....................................................................................................................................................... 106.2 Étude de validation interlaboratoires par rapport à une méthode de référence .......................10

6.2.1 Considérations générales ...................................................................................................................................... 106.2.2 Protocole de mesure ..................................................................................................................................................116.2.3 Plan d’expérience .........................................................................................................................................................12

6.3 Calculs, résumé et interprétation des données ........................................................................................................126.3.1 Résumé des résultats d’essai .............................................................................................................................. 126.3.2 Données de fidélité .....................................................................................................................................................136.3.3 Profil d’exactitude ........................................................................................................................................................15

6.4 Étude de validation interlaboratoires sans méthode de référence .........................................................15Annexe A (informative) Liste des facteurs et niveaux de facteurs relatifs à la validation par

plan factoriel ..........................................................................................................................................................................................................16Annexe B (informative) Exemple d’étude factorielle interlaboratoires applicable à une

méthode quantitative ...................................................................................................................................................................................18Annexe C (informative) Exemple d’étude factorielle interlaboratoires applicable à une

méthode qualitative .......................................................................................................................................................................................30Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................38

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Sommaire Page

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Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www .iso .org/ directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).

Une liste de toutes les parties de la série ISO 16140 se trouve sur le site web de l’ISO.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.

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http://www.iso.org/directives

http://www.iso.org/directives

http://www.iso.org/brevets

http://www.iso.org/avant-propos

http://www.iso.org/fr/members.html

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Introduction

0.1 Série ISO 16140

La série ISO 16140 a été étendue en réponse à la nécessité de disposer de différents protocoles pour la validation ou la vérification des méthodes d’essai. Elle succède à l’ISO 16140:2003. La série ISO 16140 comprend six parties ayant le titre général, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes:

— Partie 1: Vocabulaire;

— Partie 2: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par rapport à une méthode de référence;

— Partie 3: Protocole pour la vérification de méthodes de référence et de méthodes alternatives validées dans un seul laboratoire;

— Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes dans un seul laboratoire;

— Partie 5: Protocole pour la validation interlaboratoires de méthodes non commerciales par plan factoriel;

— Partie 6: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) pour la confirmation microbiologique et le typage.

L’ISO 17468 est une Norme internationale étroitement liée, qui établit les règles techniques pour le développement et la validation de méthodes normalisées.

En général, deux étapes sont nécessaires avant de pouvoir utiliser une méthode en laboratoire.

— La première étape est la validation de la méthode. Celle-ci est effectuée à l’aide d’une étude dans un seul laboratoire suivie d’une étude interlaboratoires (voir l’ISO 16140-2, l’ISO 16140-6, et le présent document). Dans le cas où une méthode est validée dans un seul laboratoire (voir l’ISO 16140-4), aucune étude interlaboratoires n’est effectuée.

— La deuxième étape est la vérification des méthodes, au cours de laquelle un laboratoire prouve qu’il peut effectuer une méthode validée de manière satisfaisante. Celle-ci est décrite dans l’ISO 16140-3. La vérification est uniquement applicable aux méthodes qui ont été validées à l’aide d’une étude interlaboratoires.

On distingue en général deux types de méthodes: les méthodes de référence et les méthodes alternatives.

Une méthode de référence est définie dans l’ISO 16140-1:2016, 2.59, comme étant une «méthode reconnue internationalement et largement acceptée». La note à l’article clarifie que «ces normes sont des normes ISO et des normes publiées conjointement par l’ISO et le CEN ou d’autres normes régionales/nationales de niveau équivalent».

Dans la série ISO 16140, les méthodes de référence comprennent les méthodes de référence normalisées (ISO et CEN) telles que définies dans l’ISO 17468:2016, 3.5, en tant que «méthode de référence décrite dans une norme».

Une méthode alternative (méthode soumise à validation) est définie dans l’ISO 16140-1:2016, 2.4, en tant que «méthode d’analyse permettant de détecter ou de quantifier, pour une catégorie de produits donnée, le même analyte que celui détecté ou quantifié avec la méthode de référence correspondante». La note à l’article clarifie que: «La méthode peut être commerciale. L’adjectif «alternatif» se réfère à la totalité du «mode opératoire d’analyse et du système réactionnel». Ce terme recouvre tous les éléments nécessaires à la mise en œuvre de la méthode, qu’ils soient matériels ou autres.»

L’ISO 16140-4 traite de la validation dans un seul laboratoire. Par conséquent, les résultats sont uniquement valides pour le laboratoire effectuant l’étude. Dans ce cas, aucune vérification (comme décrit dans l’ISO 16140-3) n’est applicable. Le présent document, l’ISO 16140-5, décrit les protocoles

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applicables aux méthodes non commerciales dans lesquelles une validation plus rapide est nécessaire ou dans lesquelles la méthode à valider est hautement spécialisée, et le nombre de laboratoires participants requis par l’ISO 16140-2 ne peut pas être atteint. L’ISO 16140-4 et le présent document peuvent être utilisés pour la validation avec méthode de référence. L’ISO 16140-4 (pour les méthodes qualitatives et quantitatives) et le présent document (pour les méthodes quantitatives uniquement) peuvent également être utilisés pour la validation sans méthode de référence.

Le logigramme de la Figure 1 donne une vue d’ensemble des relations entre les différentes parties susmentionnées. Il aide également l’utilisateur à choisir la partie appropriée de la série ISO 16140, en tenant compte de l’objectif de l’étude et des remarques énoncées ci-dessus.

Figure 1 — Logigramme relatif à l’application de la série ISO 16140

NOTE Dans le présent document, les termes «catégorie», «type» et/ou «élément» sont parfois associés au terme «(aliment)» pour une meilleure compréhension. Cependant, le terme «(aliment)» peut être remplacé par «(aliment pour animaux)» et par les autres secteurs de la chaîne alimentaire tels que mentionnés à l’Article 1.

L’ISO 16140-6 est quelque peu différente des autres parties de la série ISO 16140 car elle concerne une situation très spécifique dans laquelle seul le mode opératoire de confirmation d’une méthode doit être validé [par exemple, la confirmation biochimique des Enterobacteriaceae (voir l’ISO 21528-2)]. Le mode opératoire de confirmation modifie un résultat suspecté (présomptif) en un résultat positif confirmé. La validation des méthodes alternatives de typage (par exemple, sérotypage de Salmonella) est également couverte par l’ISO 16140-6. L’étude de validation de l’ISO 16140-6 définit clairement la ou les gélose(s) sélective(s) à partir de laquelle/desquelles les souches peuvent être confirmées en utilisant la méthode alternative de confirmation. Lorsque la méthode alternative de confirmation est validée, elle ne peut être appliquée que si les souches sont cultivées sur une gélose utilisée et jugée acceptable lors de l’étude de validation. La Figure 2 illustre les situations dans lesquelles une méthode alternative de confirmation validée conformément à l’ISO 16140-6 peut être appliquée (voir le texte dans les cases).

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Figure2—Utilisationdeméthodesalternativesdeconfirmation(voirISO16140-6)

EXEMPLE Un exemple d’application d’une méthode alternative de confirmation validée est donné ci-après.

Une méthode alternative de confirmation fondée sur un ELISA a été validée (conformément à l’ISO 16140-6) pour remplacer la confirmation biochimique de Salmonella tel qu’il est décrit dans l’ISO 6579-1. Lors de l’étude de validation, la gélose XLD (gélose obligatoire conformément à l’ISO 6579-1) ainsi que la gélose BGA et une gélose chromogène spécifiée (deux géloses facultatives pour le deuxième ensemencement conformément à l’ISO 6579-1) ont été utilisées pour commencer la confirmation. La méthode de confirmation validée peut être utilisée pour remplacer la confirmation biochimique dans les conditions suivantes:

— par des laboratoires utilisant l’ISO 6579-1; ou

— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée de l’ISO 16140-2 faisant référence à l’ISO 6579-1 pour la confirmation; ou

— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée de l’ISO 16140-2 qui commence la confirmation à partir de la gélose XLD et/ou la gélose BGA et/ou la gélose chromogène spécifiée.

La méthode de confirmation validée ne peut pas être utilisée dans les conditions suivantes:

— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 faisant uniquement référence à des géloses autres que celles incluses dans la validation pour commencer la confirmation (par exemple, la gélose Hektoen et la gélose SS uniquement); ou

— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée de l’ISO 16140-2 faisant uniquement référence à un mode opératoire de confirmation ne nécessitant pas d’isolement sur gélose.

0.2 Protocoles de validation dans la série ISO 16140

Une étude de validation interlaboratoires, conformément à l’ISO 16140-2, requiert au moins huit laboratoires pour les méthodes quantitatives et dix laboratoires pour les méthodes qualitatives.

Le présent document fournit un protocole applicable au cas particulier dans lequel le nombre de laboratoires requis lors d’une validation interlaboratoires d’une méthode selon l’ISO 16140-2 ne peut pas être atteint. Le protocole comprend une validation des méthodes fondée sur au moins quatre laboratoires. Il s’applique, par exemple, dans les cas où il est urgent de disposer d’une méthode validée mais où la réalisation des études internes et interlaboratoires selon l’ISO 16140-2 prend trop de

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temps. Le présent document concerne également le problème de validation des méthodes hautement spécialisées, pour lesquelles seuls quelques laboratoires peuvent être disponibles pour une étude de validation. Le présent document ne peut être utilisé que pour des méthodes non commerciales. Le Tableau 1 donne une vue d’ensemble des différents protocoles.

Tableau 1 — Vue d’ensemble des différents protocoles de validation décrits dans la série ISO 16140

Nombre de laboratoires participants Avec la méthode de référence Sans la méthode de référence

1 ISO 16140-4 ISO 16140-4

4 à 7 (méthode quantitative)/ 4 à 9 (méthode qualitative)

Le présent document: pour les méthodes non commerciales

uniquement

Le présent document: pour les méthodes quantitatives non commerciales uniquement

≥ 8 (méthode quantitative)/ ≥ 10 (méthode qualitative)

ISO 16140-2: pour la partie de l’étude interlaboratoires

Non applicable

Pour réduire le nombre de laboratoires requis à un minimum de quatre tout en conservant la validation applicable à tous les laboratoires, le protocole repose sur un plan d’expérience factoriel. Dans le plan factoriel, plusieurs facteurs tels que le technicien ou le milieu de culture sont simultanément modifiés et la méthode est utilisée dans une gamme de différentes configurations de facteurs. Cette approche permet d’analyser plus en détails les paramètres de fidélité de la méthode tout en ayant recours à un nombre moins élevé de laboratoires et d’essais.

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NORME INTERNATIONALE ISO 16140-5:2020(F)

Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes —

Partie 5: Protocole pour la validation interlaboratoires de méthodes non commerciales par plan factoriel

1 Domaine d’application

Le présent document établit les principes généraux ainsi que les protocoles techniques (fondé sur des études factorielles orthogonales) de validation de méthodes non commerciales, dans le domaine de la microbiologie de la chaîne alimentaire.

Le présent document est applicable à la validation de méthodes utilisées pour l’analyse (détection ou quantification) de micro-organismes présents dans:

— les produits destinés à la consommation humaine;

— les produits destinés à l’alimentation animale;

— les échantillons environnementaux dans les domaines de la production et de la manutention de produits alimentaires;

— les échantillons au stade de la production primaire.

Le présent document est notamment applicable aux bactéries et aux champignons. Certains articles peuvent être applicables à d’autres (micro-)organismes ou à leurs métabolites, qui doivent être déterminés au cas par cas.

Le présent document spécifie des protocoles pour la validation de méthodes quantitatives et qualitatives par rapport à une méthode de référence. Il établit également un protocole pour la validation de méthodes quantitatives sans méthode de référence. Les méthodes qualitatives ne peuvent pas être validées sans méthode de référence conformément au présent document.

NOTE L’ISO 16140-2 spécifie le principe général et le protocole technique pour la validation de méthodes alternatives, majoritairement commerciales, par rapport à une méthode de référence.

Le présent document est uniquement applicable à la validation de méthodes dont les paramètres pertinents sont intégralement spécifiés (notamment les tolérances sur les températures et les spécifications sur les milieux de culture) et qui ont déjà été optimisées.

Les méthodes qui ont été validées conformément au présent document peuvent être utilisées par les laboratoires de la population de laboratoires spécifiée.

2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).

ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations

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ISO 16140-1:2016, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 1: Vocabulaire

ISO 16140-2:2016, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 2: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par rapport à une méthode de référence

3 Termesetdéfinitions

Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 16140-1 ainsi que les suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/

3.1facteurparamètre qualitatif ou quantitatif de la méthode, qui peut être modifié à deux niveaux ou plus, dans les limites de la méthode spécifiée

EXEMPLE Technicien.

Note 1 à l'article: à l’article Dans le présent document, seuls les facteurs conformes au protocole de la méthode sont pris en compte.

3.2niveau de facteurvaleur des facteurs (3.1) du plan d’expérience

EXEMPLE Technicien «a», technicien «b», etc.

Note 1 à l'article: à l’article Dans le présent document, chaque facteur est modifié à deux niveaux de facteurs: «a» et «b».

Note 2 à l'article: à l’article Cette définition repose sur la façon dont l’ISO 3534-3:2013, 3.1.12, définit le «niveau de facteur». Dans l’ISO 3534-3:2013, 3.1.12, la définition est plus générale, mais la signification statistique est la même.

3.3plan orthogonalplan factoriel, dans lequel pour chaque paire de facteurs (3.1), chaque combinaison de niveaux de facteur (3.2) apparaît autant de fois parmi les niveaux de facteur possibles

Note 1 à l'article: à l’article Cette définition repose sur la façon dont l’ISO 3534-3:2013, 3.1.31, définit l’«arrangement orthogonal», mais pour le «plan orthogonal», une définition plus générale et plus théorique est utilisée.

3.4valeur de référence<une méthode de référence est disponible> niveau de concentration estimé obtenu avec la méthode de référence

3.5valeur de référence<aucune méthode de référence n’est disponible, pour les échantillons artificiellement contaminés uniquement> niveau de concentration estimé obtenu à partir du niveau de concentration de l’inoculum

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https://www.iso.org/obp/ui

http://www.electropedia.org/

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3.6configurationcombinaison de niveaux de facteurs (3.2)

EXEMPLE Technicien «a» + milieu de culture «b» + température «a» + etc.

Note 1 à l'article: à l’article Ces conditions peuvent être décrites par la combinaison des niveaux de facteurs modifiés lors de l’étude.

4 Principes généraux pour la validation interlaboratoires de méthodes non commerciales par plan factoriel

4.1 Généralités

Le présent document utilise un protocole reposant sur des études orthogonales factorielles. Une haute certitude est obtenue pour les paramètres de validation des méthodes déterminés, en ciblant des facteurs appropriés (par exemple, technicien, milieu de culture, préparation des échantillons, température, durée de l’essai) et susceptibles d’influencer le résultat d’essai. Cela permet de réduire le nombre de laboratoires requis à un minimum de quatre. Les concepts généraux et considérations donnés dans l’ISO 16140-2 doivent s’appliquer, sauf s’ils sont explicitement exclus. La validation peut être effectuée par rapport à une méthode de référence ou, dans le cas d’une méthode quantitative, sans méthode de référence.

Le résultat de l’étude de validation s’applique à:

— tout laboratoire: si les quatre laboratoires peuvent être considérés comme un «échantillon aléatoire» de laboratoires indépendants provenant de différents organismes;

— tous les laboratoires d’un organisme: si les quatre laboratoires peuvent être considérés comme un «échantillon aléatoire» de laboratoires sur différents sites d’un organisme.

4.2 Validation par rapport à une méthode de référence

Le protocole de validation comprend deux étapes:

— une étude de validation interne de la méthode non commerciale par rapport à la méthode de référence réalisée dans le laboratoire organisateur (voir l’ISO 16140-1:2016, 2.45);

— une étude interlaboratoires de la méthode non commerciale par rapport à la méthode de référence réalisée dans des laboratoires différents.

Le protocole technique pour la réalisation de l’étude de validation interne et de l’étude interlaboratoires est donné dans les Articles 5 et 6, en fonction de la nature qualitative ou quantitative de la méthode d’essai.

Il convient que les facteurs choisis pour l’étude factorielle interlaboratoires soient pertinents et appliqués à la méthode de référence et à la méthode alternative.

4.3 Validation sans méthode de référence

Le protocole de validation s’applique uniquement à la validation de méthodes quantitatives. Il comprend deux étapes:

— une étude de validation interne de la méthode non commerciale par rapport à la valeur de référence, réalisée dans le laboratoire organisateur;

— une étude interlaboratoires de la méthode non commerciale par rapport à la valeur de référence, réalisée dans des laboratoires différents.


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Le protocole technique pour la réalisation de l’étude de validation interne et de l’étude interlaboratoires pour les méthodes quantitatives est donné dans l’Article 6.

5 Méthodes qualitatives — Protocole technique de validation interlaboratoires par plan factoriel

5.1 Étude de validation interne

L’étude de validation interne est la partie du processus de validation qui est effectuée dans le laboratoire organisateur. Elle peut être réalisée conformément à l’approche conventionnelle ou à l’approche factorielle, comme décrit dans l’ISO 16140-4.

Une étude de validation interne peut être utilisée pour démontrer la performance de la méthode pour le laboratoire ayant effectué l’étude. Elle constitue la première étape dans le cadre général de la validation de méthodes. L’étude de validation interne évalue la performance de la méthode pour des catégories (d’aliments), types (d’aliments) et éléments (d’aliments), alors que l’étude interlaboratoires évalue la performance de la méthode par des laboratoires.

5.2 Étude de validation interlaboratoires par rapport à une méthode de référence

5.2.1 Considérations générales

L’objectif de l’étude interlaboratoires est de comparer la performance de la méthode de référence avec celle de la méthode alternative en termes de RLOD obtenu par différents laboratoires. Les résultats du même ensemble d’échantillons examinés dans des conditions de reproductibilité sont comparés avec des critères préétablis pour la différence acceptable entre la méthode de référence et la méthode alternative. Chaque fois que cela est possible, il convient que les conditions d’étude reflètent la variation normale entre laboratoires.

L’étude interlaboratoires est planifiée par le laboratoire organisateur. Le laboratoire organisateur prépare les échantillons et une fiche de données pour consigner toutes les données expérimentales et les conditions expérimentales déterminantes utilisées par chaque laboratoire. Chaque laboratoire doit démontrer ses compétences pour l’utilisation de la méthode alternative et de la méthode de référence conformément à l’ISO 7218 avant de participer à l’étude.

Les techniciens, impliqués dans la préparation des échantillons utilisés dans l’étude interlaboratoires, ne doivent pas prendre part aux essais des échantillons de l’étude interlaboratoires.

5.2.2 Protocole de mesure

Un minimum de quatre laboratoires indépendants sont requis pour effectuer les séries d’essais.

Les laboratoires doivent appartenir à des organismes différents ou doivent être situés à des emplacements différents.

Si tous les laboratoires appartiennent à un même organisme ou réseau, les résultats de l’étude de validation ne peuvent être utilisés que par les laboratoires appartenant à cet organisme ou réseau.

EXEMPLE 1 Laboratoires appartenant à un organisme public ou privé.

EXEMPLE 2 Réseau de laboratoires fédéraux, nationaux et/ou provinciaux.

EXEMPLE 3 Réseau de laboratoires nationaux de référence coordonnés par un laboratoire de référence de l’Union européenne.

Si possible, il convient que plus de quatre laboratoires participent, afin de pouvoir analyser les résultats d’au moins huit techniciens même si, pour une quelconque raison, certaines données ne pouvaient pas être utilisées.


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Le protocole est le suivant:

— dans le cas où plusieurs protocoles d’enrichissement existent pour la méthode alternative, le protocole d’enrichissement le plus «challenging» doit être sélectionné, par exemple le protocole présentant la plus courte durée d’incubation ou les conditions d’enrichissement les plus sélectives. Le type (d’aliment) sélectionné doit être adapté au protocole d’enrichissement choisi. Il convient que l’élément (d’aliment), qui est utilisé pour préparer les échantillons pour essai, contienne un microbiote annexe naturel;

— l’élément (d’aliment) sélectionné doit être artificiellement contaminé avec l’organisme cible. Le protocole d’ensemencement des échantillons doit être approprié pour l’élément (d’aliment) sélectionné. Les échantillons doivent être préparés par le laboratoire organisateur pour assurer l’homogénéité entre et au sein des échantillons en utilisant les protocoles de préparation contenus dans l’ISO 16140 2:2016, Annexe C. En général, les échantillons liquides (en comparaison avec les échantillons solides) donnent de meilleures garanties quant à l’obtention de l’homogénéité. Il convient que l’homogénéité des échantillons soit démontrée par le laboratoire organisateur. Des essais d’homogénéité et des critères d’acceptabilité sont décrits dans l’ISO 22117;

— au moins trois niveaux de contamination différents doivent être utilisés: un blanc (L0) et deux niveaux (L1 et L2). Il convient que le niveau L1 soit compris entre le LOD50 de la méthode de référence (LOD50,ref) et le LOD50 de la méthode alternative (LOD50,alt = RLOD · LOD50,ref). Il convient que le niveau L2 soit 1 log10 au-dessus du niveau L1. Le niveau L1 doit produire des résultats positifs partiels;

— il convient de dénombrer les inoculums à l’aide d’un milieu non sélectif. Le dénombrement doit être effectué conformément à l’ISO 7218;

— pour l’élément (d’aliment) sélectionné, pour chaque configuration et pour chaque laboratoire, quatre réplicats doivent être effectués au niveau L1. Un réplicat est réalisé aux deux autres niveaux L0 et L2;

— selon le plan factoriel orthogonal, huit configurations doivent être effectuées par chaque laboratoire pour les deux méthodes d’essai (alternative et référence) et pour tous les niveaux de contamination (L0, L1 et L2). Au total, 96 essais (1 + 4 + 1 réplicats × 8 configurations × 2 méthodes) sont réalisés dans chaque laboratoire;

— il convient que tous les échantillons soient codés de manière à travailler en aveugle pour s’assurer que les techniciens ne peuvent pas déduire leur niveau de contamination;

— les configurations doivent être communes aux deux méthodes d’essai (méthodes appariées et méthodes non appariées). Des résultats appariés sont obtenus lorsque l’enrichissement primaire est le même pour la méthode alternative et pour la méthode de référence. Ainsi, une prise d’essai est utilisée pour effectuer les essais avec la méthode alternative et la méthode de référence. Des résultats non appariés sont obtenus lorsque la méthode alternative et la méthode de référence sont réalisées à partir d’enrichissements primaires différents. Ainsi, deux séries de prises d’essai sont requises: une prise d’essai est analysée par la méthode alternative et l’autre prise d’essai est analysée par la méthode de référence;

— les données sont reportées dans deux tableaux donnant les résultats émanant de la méthode de référence et de la méthode alternative avant et après confirmation des résultats:

— si les résultats de la méthode alternative et de la méthode de référence ont été obtenus à partir du même bouillon d’enrichissement de départ (données appariées), il n’est pas nécessaire de confirmer les résultats présomptifs de la méthode alternative si les résultats sont en accord avec ceux de la méthode de référence. Cependant, une confirmation du résultat positif est requise dans le cas où la méthode de référence donne un résultat négatif et la méthode alternative donne un résultat positif;

— si les résultats de la méthode alternative et de la méthode de référence ont été obtenus à partir d’enrichissements différents (données non appariées), alors tous les enrichissements obtenus


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avec la méthode alternative doivent être soumis à confirmation. Les méthodes de confirmation sont décrites dans l’ISO 16140-2:2016, 5.1.3.3;

— le laboratoire organisateur peut indiquer que les bouillons, les boîtes et/ou isolats doivent être conservés pendant un certain temps afin de pouvoir confirmer les résultats obtenus par un laboratoire, si nécessaire;

— l’analyse des échantillons doit être effectuée par chaque laboratoire à la date stipulée.

5.2.3 Sélection des facteurs à étudier

Il convient de prendre l’avis des experts avant de choisir les facteurs appropriés à l’étude en particulier. Par exemple, les conditions optimales sont spécifiées dans chaque méthode, par exemple, la température et la durée d’incubation à 37 °C et 24 h, et celles-ci donneront les meilleurs résultats. Toutefois, les gammes situées autour de ces valeurs, en raison des inexactitudes de l’instrument, mais qui donnent encore des conditions acceptables (par exemple, 37 °C ± 1 °C, 24 h ± 1 h), sont autorisées et il convient que le plan d’étude soumette à essai les extrêmes de ces gammes. Les conditions de fonctionnement acceptables pour le matériel sont décrites dans l’ISO 7218. D’autres influences telles que les conditions de stress peuvent également être prises en compte.

Pour estimer l’exactitude dans des conditions de routine, des facteurs pertinents pour la méthode et difficiles à contrôler, doivent être choisis et modifiés systématiquement, par exemple les techniciens, les milieux et les conditions d’incubation. Du choix de ces facteurs et des niveaux de facteurs dépend la fiabilité du résultat d’essai. Pour les études de méthodes non appariées, les configurations choisies biaisées par rapport à la méthode de référence ne peuvent pas être utilisées.

Cinq facteurs pertinents pour la méthode doivent être modifiés simultanément, chacun sur deux niveaux.

Pour les méthodes applicables aux micro-organismes cultivables, les facteurs «techniciens» et «milieux de culture» ont la plus grande importance et doivent être inclus dans toutes les études comme suit:

— techniciens: les essais doivent être effectués dans chaque laboratoire par deux techniciens de façon indépendante;

— milieux de culture: utiliser deux milieux de culture provenant de deux fabricants différents, ou deux lots différents de milieux de culture, ou des milieux préalablement préparés contre des milieux préparés à partir de milieux déshydratés. Si possible, il convient que chaque laboratoire utilise des fabricants/lots différents de ceux utilisés dans les autres laboratoires.

Trois autres facteurs doivent être inclus dans l’étude. Une liste non exhaustive de facteurs potentiels est fournie à l’Annexe A. Selon la méthode, un facteur de chacun des principaux groupes doit être choisi.

Les facteurs et niveaux de facteurs doivent refléter la variation normale observée dans les laboratoires d’essai de routine. Les facteurs sont étudiés simultanément à l’aide du plan d’expérience décrit en 5.2.4.

5.2.4 Plan d’expérience

Chaque configuration est une combinaison de niveaux de cinq facteurs de la méthode. À chaque configuration, chacun des laboratoires effectue (1 + 4 + 1) essais aux niveaux L0, L1 et L2 pour les deux méthodes d’essai. Huit configurations différentes (1 à 8) doivent être prises en compte. Le plan d’expérience est indiqué dans le Tableau 2, «a» et «b» représentant les niveaux des facteurs respectifs.

NOTE Ce plan d’expérience (5 facteurs) est différent du plan utilisé dans l’ISO 16140-4 relative aux études de validation dans un seul laboratoire (4 facteurs).


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Tableau 2 — Plan d’expérience applicable aux méthodes quantitatives à effectuer par chacun d’au moins quatre laboratoires

Configuration Facteur 1: technicien

Facteur 2: milieu de

culture

Facteur 3: par exemple pro-

cessus de décongélation

Facteur 4: par exemple

condition d’incubation

Facteur 5: par exemple microbiote

annexe1 a a a a2 a b b b b3 a a b b4 b b a a5 a b a b6 b b a b a7 a b b a8 b a a b

Avec quatre laboratoires, huit configurations, trois niveaux de contamination et deux méthodes d’essai (référence et alternative), le nombre minimal d’essais individuels est de 4 × 8 × (1 + 4 + 1) × 2 = 384.

Le laboratoire organisateur doit examiner les données brutes et les autres informations requises dans la feuille de données, afin de s’assurer que tous les laboratoires ont effectué les analyses conformément aux instructions écrites de la méthode alternative et de la méthode de référence. Si la preuve est faite que les résultats peuvent avoir été obtenus dans des conditions inappropriées et/ou que les instructions des méthodes n’ont pas été suivies scrupuleusement, les résultats concernés ou la totalité des résultats émanant du laboratoire concerné sont exclus des analyses subséquentes.

L’Annexe C présente un exemple d’étude factorielle interlaboratoires pour une méthode qualitative.

5.3 Calculs et résumé des données

Les résultats obtenus par chaque laboratoire dans le cadre de l’étude interlaboratoires sont récapitulés dans les Tableaux 3 et 4.

Tableau 3 — Fraction de résultats positifs par la méthode de référence

LaboratoireNiveau de contamination

L0 L1 L2Laboratoire 1 /8 /32 /8Laboratoire 2 /8 /32 /8Laboratoire 3 /8 /32 /8Etc…. /8 /32 /8Total


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Tableau4—Fractionderésultatspositifs(avantetaprèsconfirmation)parlaméthodealternative

LaboratoireNiveau de contamination

L0 L1 L2Présomptif Confirmé Présomptif Confirmé Présomptif Confirmé

Laboratoire 1 /8 /8 /32 /32 /8 /8Laboratoire 2 /8 /8 /32 /32 /8 /8Laboratoire 3 /8 /8 /32 /32 /8 /8Etc…. /8 /8 /32 /32 /8 /8Total

Les calculs ultérieurs, réalisés à l’aide des données du niveau fractionnel L1 uniquement, sont effectués conformément à l’ISO 16140-2:2016, 5.2.3. Ces calculs doivent être réalisés pour toutes les configurations de facteurs, de 1 à 8, et également séparément pour chaque sous-groupe de configurations de facteurs qui appartient à l’un des cinq facteurs et à l’un des deux niveaux de facteurs, comme indiqué dans le Tableau 5.

Tableau 5 — Résumé des résultats

Niveaux de facteurs Configurations PA NA ND PD FP Na SE(alt) %

SE(ref) %

RT %

SP(alt) %

SP(ref) %

FPRb %

Toutes les configurations 1 à 8

Facteur 1 (technicien) «a» – voir NOTE 2 1,2,3,4

Facteur 1 (technicien) «b» – voir NOTE 2 5,6,7,8

Facteur 2 (milieu de culture) «a» 1,3,5,7

Facteur 2 (milieu de culture) «b» 2,4,6,8

Facteur 3 (par exemple processus de décongélation) «a» 1,3,6,8

Facteur 3 (par exemple processus de décongélation) «b» 2,4,5,7

Facteur 4 (par exemple condition d’incubation) «a» 1,4,5,8

Facteur 4 (par exemple condition d’incubation) «b» 2,3,6,7

Facteur 5 (par exemple microbiote annexe) «a» 1,4,6,7

Facteur 5 (par exemple microbiote annexe) «b» 2,3,5,8

Légende

PA: accord positif, NA: accord négatif, ND: déviation négative, PD: déviation positive, FP: faux positif, N: somme, SE(alt): sensibilité de la méthode alternative, SE(ref): sensibilité de la méthode de référence, RT: justesse relative, SP(alt): spécificité relative de la méthode alternative, SP(ref): spécificité relative de la méthode de référence, FPR: pourcentage de faux positifsa N = NA + PA + PD + ND.b FPR = FP/NA × 100 %.

NOTE 1 Les définitions et l’établissement des paramètres sont donnés dans l’ISO 16140-2:2016, 5.2.3.

NOTE 2 Dans la plupart des cas, les niveaux de facteurs du facteur «technicien» sont différents d’un laboratoire à l’autre (sauf cas où le technicien «a» et le technicien «b» représentent des niveaux de formation spécifiques). Ainsi, l’étude de sensibilité ne peut pas être interprétée de façon significative pour ce facteur, et il convient de laisser les lignes correspondantes vides. Cela vaut également pour tout autre facteur lorsque l’étude de sensibilité pour ses niveaux de facteurs ne peut pas être interprétée de façon significative.


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5.4 Interprétation des données

5.4.1 Étude de méthodes appariées

Pour une étude de méthodes appariées, calculer la différence, (ND – PD), et la somme, (ND + PD), pour le niveau fractionnel L1. Les valeurs trouvées pour (ND – PD) et (ND + PD) ne doivent pas dépasser les limites d’acceptabilité (AL) données dans le Tableau 6 en fonction du nombre de laboratoires participants (Nlab).

Tableau 6 — Limites d’acceptabilité pour une étude de méthodes appariées en fonction du nombre de laboratoires participants

NlabLimites d’acceptabilité (AL)

(ND – PD) ND + PD4 3 45 4 56 4 67 5 78 5 89 6 9

Les conditions ne sont pas acceptables lorsque la valeur observée est supérieure à la limite (AL). Dans ce cas, il convient de mener des investigations (par exemple, une analyse des causes) pour fournir une explication à propos des résultats observés. La décision de conformité de la méthode alternative repose sur l’AL et sur le résultat des investigations. Si la méthode alternative est acceptée avec une AL non conforme, les raisons de son acceptation doivent être indiquées dans le rapport d’étude de validation.

5.4.2 Étude de méthodes non appariées

Pour une étude de méthodes non appariées, calculer la différence, (ND – PD) pour le niveau fractionnel L1. La valeur observée ne doit pas dépasser l’AL. Calculer l’AL comme indiqué par la Formule (1):

ALlab ref alt ref alt

= ( ) +( ) − ( ) ×( )( )( )+ + + +4 6 2N p p p p (1)

où

Nlab est le nombre de laboratoires;

(p+)ref est le nombre d’échantillons ayant un résultat positif, obtenus avec la méthode de référence au niveau L1 pour tous les laboratoires, divisé par le nombre d’échantillons soumis à essai au niveau L1;

(p+)alt est le nombre d’échantillons ayant un résultat positif confirmé, obtenus avec la méthode alternative au niveau L1 pour tous les laboratoires, divisé par le nombre d’échantillons soumis à essai au niveau L1.

Les conditions ne sont pas acceptables lorsque la valeur observée est supérieure à la limite (AL). Dans ce cas, il convient de mener des investigations (par exemple, une analyse des causes) pour fournir une explication à propos des résultats observés. La décision de conformité de la méthode alternative repose sur l’AL et sur le résultat des investigations. Si la méthode alternative est acceptée avec une AL non conforme, les raisons de son acceptation doivent être indiquées dans le rapport d’étude de validation.


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5.4.3 Analyse des effets factoriels en fonction du RLOD

De plus, les effets des facteurs individuels (par exemple, technicien) et des interactions entre les facteurs (par exemple, milieu de culture et conditions d’incubation) peuvent être calculés d’après le plan factoriel à partir des valeurs RLOD calculées pour chaque laboratoire.

NOTE Un programme Excel®1) est disponible pour calculer le RLOD à l’adresse https:// standards .iso .org/ iso/ 16140/ -2/ ed -1/ en.

La notation suivante est utilisée: k désigne le laboratoire et p le nombre de laboratoires (1 ≤ k ≤ p). Pour un facteur d’intérêt spécifique, calculer le RLOD à l’aide de tous les résultats d’essai des quatre configurations du laboratoire k dans lequel le facteur est défini au niveau «a», et nommer Yka( ) = ( )( )log

10RLOD niveau a la valeur log10. Calculer le RLOD à l’aide de tous les résultats d’essai des

quatre configurations du laboratoire k dans lequel le facteur est défini au niveau «b», et nommer Yka( ) = ( )( )log

10RLOD niveau b la valeur log10.

Calculer la moyenne de la différence de ces valeurs log10 RLOD dans tous les laboratoires, comme indiqué par la Formule (2):

dp

Y Yk

p

kb

ka= −( )

=

( ) ( )∑1

1 (2)

Si cette différence (d) est inférieure à −0,3 ou supérieure à +0,3, le facteur est considéré comme ayant une influence importante sur le RLOD et doit être consigné dans le rapport d’étude de validation. D’autres techniques d’analyse sont données dans la Référence[9].

6 Méthodes quantitatives — Protocole technique de validation interlaboratoires par plan factoriel

6.1 Étude de validation interne

L’étude de validation interne est la partie du processus de validation qui est effectuée dans le laboratoire organisateur. Elle peut être réalisée conformément à l’approche conventionnelle ou à l’approche factorielle, comme décrit dans l’ISO 16140-4.

Une étude de validation interne peut être utilisée pour démontrer la performance de la méthode pour le laboratoire ayant effectué l’étude. Elle constitue la première étape de la validation générale de méthodes. L’étude de validation interne évalue la performance de la méthode pour des catégories (d’aliments), types (d’aliments) et éléments (d’aliments), alors que l’étude interlaboratoires évalue la performance de la méthode par des laboratoires.

6.2 Étude de validation interlaboratoires par rapport à une méthode de référence

6.2.1 Considérations générales

L’étude interlaboratoires vise à comparer la performance (exactitude et fidélité) de la méthode de référence avec celle de la méthode alternative dans différents laboratoires. Les résultats du même ensemble d’échantillons examinés dans des conditions de reproductibilité sont comparés avec des critères préétablis pour la différence acceptable entre la méthode de référence et la méthode alternative. Chaque fois que cela est possible, il convient que les conditions d’étude reflètent la variation normale entre laboratoires.

1) Excel® est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Microsoft et constitue un exemple d’un produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à l’égard de ce produit.


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https://standards.iso.org/iso/16140/-2/ed-1/en

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L’étude interlaboratoires est planifiée par le laboratoire organisateur. Le laboratoire organisateur prépare les échantillons et une fiche de données pour consigner toutes les données expérimentales et les conditions expérimentales déterminantes utilisées par chaque laboratoire. Chaque laboratoire doit démontrer ses compétences pour l’utilisation de la méthode alternative et de la méthode de référence conformément à l’ISO 7218 avant de participer à l’étude.

Les techniciens, impliqués dans la préparation des échantillons utilisés dans l’étude interlaboratoires, ne doivent pas prendre part aux essais des échantillons de l’étude interlaboratoires.

6.2.2 Protocole de mesure

Un minimum de quatre laboratoires indépendants sont requis pour effectuer les séries d’essais.

Les laboratoires doivent appartenir à des organismes différents ou doivent être situés à des emplacements différents.

Si tous les laboratoires appartiennent à un même organisme ou réseau, les résultats de l’étude de validation ne peuvent être utilisés que par les laboratoires appartenant à cet organisme ou réseau.

EXEMPLE 1 Laboratoires appartenant à un organisme public ou privé.

EXEMPLE 2 Réseau de laboratoires fédéraux, nationaux et/ou provinciaux.

EXEMPLE 3 Réseau de laboratoires nationaux de référence coordonnés par un laboratoire de référence de l’Union européenne.

Si possible, il convient que plus de quatre laboratoires participent, afin de pouvoir analyser les résultats d’au moins huit techniciens même si, pour une quelconque raison, certaines données ne pouvaient pas être utilisées.

Le protocole est le suivant:

— un élément (d’aliment) pertinent est utilisé pour préparer les échantillons pour essai. Il convient que l’élément (d’aliment) contienne un microbiote annexe naturel;

— l’élément (d’aliment) sélectionné peut être artificiellement contaminé avec l’organisme cible. Le protocole d’ensemencement des échantillons doit être approprié pour l’élément (d’aliment) sélectionné. Les échantillons doivent être préparés par le laboratoire organisateur pour assurer l’homogénéité entre et au sein des échantillons en utilisant les protocoles de préparation contenus dans l’ISO 16140-2:2016, Annexes B et C. En général, les échantillons liquides (en comparaison avec les échantillons solides) donnent de meilleures garanties quant à l’obtention de l’homogénéité. Il convient que l’homogénéité des échantillons soit démontrée par le laboratoire organisateur. Les essais d’homogénéité et les critères d’acceptabilité sont décrits dans l’ISO 22117;

— au moins trois niveaux de contamination différents doivent être utilisés. Les concentrations en analyte doivent être choisies pour couvrir au moins les niveaux inférieur, intermédiaire et supérieur de toute la plage de dénombrement de la méthode alternative. Il convient d’inclure également un niveau de témoin négatif, notamment en cas d’utilisation d’échantillons contaminés artificiellement;

— les analyses sont effectuées par chaque laboratoire, pour chaque méthode de dénombrement aux trois niveaux de contamination, selon le plan factoriel orthogonal décrit en 6.2.3;

— il convient que tous les échantillons soient codés de manière à travailler en aveugle pour s’assurer que les techniciens ne peuvent pas déduire leur niveau de contamination;

— l’analyse des échantillons doit être effectuée par chaque laboratoire à la date stipulée.

Les facteurs de la méthode doivent être choisis conformément à 5.2.3. Cinq facteurs sont étudiés simultanément à l’aide du plan d’expérience décrit en 6.2.3.


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6.2.3 Plan d’expérience

Le plan d’expérience applicable aux méthodes quantitatives nécessite la participation d’un minimum de quatre laboratoires. Huit configurations différentes (1 à 8) doivent être prises en compte. Chaque configuration est une combinaison de niveaux de cinq facteurs de la méthode, «a» et «b» représentant les niveaux de facteurs respectifs. À chaque configuration, chaque laboratoire effectue un seul mesurage à chaque niveau de contamination L1, L2 et L3 pour les deux méthodes d’essai. Le plan d’expérience est indiqué dans le Tableau 7 et nécessite 4 laboratoires × 3 niveaux de contamination × 8 configurations × 2 méthodes = 192 essais individuels. Si aucune méthode de référence n’est disponible, le nombre minimal d’essais individuels est de 4 × 3 × 8 = 96. Si possible, ou en cas de contamination artificielle, il convient d’inclure un témoin négatif de chaque laboratoire. Les résultats du témoin négatif peuvent fournir des informations sur le microbiote annexe et peuvent être utilisés pour expliquer des résultats d’essai imprévus.

Tableau 7 — Plan d’expérience applicable aux méthodes qualitatives à effectuer par chacun d’au moins quatre laboratoires

Configuration Facteur 1: technicien

Facteur 2: milieu de

culture

Facteur 3: par exemple processus de

décongélation

Facteur 4: par exemple

condition d’incubation

Facteur 5: par exemple microbiote

annexe1 a a a a2 a b b b b3 a a b b4 b b a a5 a b a b6 b b a b a7 a b b a8 b a a b

Le laboratoire organisateur doit examiner les données brutes et les autres informations requises dans la feuille de données, afin de s’assurer que tous les laboratoires ont effectué les analyses conformément aux instructions écrites de la méthode alternative et de la méthode de référence. Si la preuve est faite que les résultats peuvent avoir été obtenus dans des conditions inappropriées et/ou que les instructions des méthodes n’ont pas été suivies scrupuleusement, les résultats concernés ou la totalité des résultats du laboratoire concerné doivent être exclus des analyses complémentaires. Aucun essai aberrant n’est effectué sur les données sélectionnées.

L’Annexe B présente un exemple d’étude factorielle interlaboratoires relative à une méthode quantitative.

6.3 Calculs, résumé et interprétation des données

6.3.1 Résumé des résultats d’essai

Les résultats d’essai log-transformés des différents laboratoires applicables à la méthode de référence et à la méthode alternative sont saisis dans le Tableau 8. Les calculs sont effectués sous la forme d’une suite d’opérations, en commençant par la transformation logarithmique de tous les résultats d’essai. La notation suivante est utilisée: i désigne le niveau et q est le nombre de niveaux (1 ≤ i ≤ q); j désigne la configuration (1 ≤ j ≤ 8); k désigne le laboratoire et p est le nombre de laboratoires (1 ≤ k ≤ p). Noter les données comme suit:

— xijk est le résultat d’essai log-transformé sur le niveau i pour la configuration j du laboratoire k en utilisant la méthode de référence (le cas échéant);

— yijk est le résultat d’essai log-transformé sur le niveau i pour la configuration j du laboratoire k à l’aide de la méthode alternative.


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Dans le Tableau 8, chaque case représente un résultat d’essai individuel. Les résultats des laboratoires supplémentaires (p > 4) peuvent être ajoutés.

Tableau 8 — Résumé des résultats de l’étude interlaboratoires pour une méthode quantitative

Configuration/méthode 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8

Laboratoire Niveau de contami-

nation

R A R A R A R A R A R A R A R A

1 2 3 Témoin 4 négatif

1 2 3 Faible 4

1 2 3 Moyen 4

1 2 3 Élevé 4

Légende

R: méthode de référence

A: méthode alternative

6.3.2 Donnéesdefidélité

Les données de fidélité (écarts-types de reproductibilité) peuvent être évaluées au moyen d’une estimation par le maximum de vraisemblance restreinte (REML) en utilisant un modèle d’effet aléatoire avec facteurs aléatoires: «laboratoire», «laboratoire × technicien», «laboratoire × milieu de culture», «laboratoire × processus de décongélation», «laboratoire × condition d’incubation», «laboratoire × microbiote annexe». Le calcul peut être effectué avec des progiciels tels que «R». Des détails sur la méthode statistique sont donnés dans la Référence [10].

NOTE «R» est un langage de programmation et un environnement logiciel gratuit destiné aux calculs et représentations statistiques des données, soutenu par la R Foundation for Statistical Computing. Le langage R est couramment utilisé chez les statisticiens. Il peut être téléchargé à l’adresse https:// cran .r -project .org.

Une méthode de calcul alternative relativement simple applicable aux données de fidélité est décrite dans les étapes suivantes. Cette méthode est statistiquement moins efficace et il convient de ne l’utiliser que si la méthode REML n’est pas disponible.


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https://cran.r-project.org

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Étape 1: Si une méthode de référence est disponible, calculer pour chaque niveau i de contamination, la médiane des dénombrements log-transformés Xi obtenus avec la méthode de référence, xijk. Ces médianes sont appelées «valeurs de référence» des échantillons utilisés dans l’étude de validation: Xi = médiane(xijk).

Si aucune méthode de référence n’est disponible, utiliser les dénombrements log-transformés obtenus avec la méthode à valider, Yi = médiane (yijk).

Étape 2: Calculer, pour chaque niveau i (en utilisant yijk), l’écart-type de répétabilité (r), sr, comme indiqué par la Formule (3):

sp

y y y yp

y y yrik

p

i k i k i k i kk

p

i k i k i k2

1

1 2 3 4

2

1

5 6 7

1

8

1

8= + − −( ) + + −

= =∑ ∑ −−( )yi k8

2 (3)

s sri ri= 2

Étape 3: Pour chaque niveau i (en utilisant yijk), l’écart-type intermédiaire, sA, peut être obtenu en effectuant le calcul indiqué dans la Formule (4):

s s s s s s sAi ri i i i i i2 2

12

22

32

42

52= + + + + + (4)

s sAi Ai= 2

avec

sp

y y y y y y y yik

p

i k i k i k i k i k i k i k i k12

1

1 2 3 4 5 6 7 8

21

32

1= + + + − − − −( ) −=∑

44

2

psri

sp

y y y y y y y yik

p


1

1 2 3 4 5 6 7 8

21

32

1= − + − + − + −( ) −=∑

44

2

psri

sp

y y y y y y y yik

p


1

1 2 3 4 5 6 7 8

21

32

1= − + − − + − +( ) −=∑

44

2

psri

sp

y y y y y y y yik

p


1

1 2 3 4 5 6 7 8

21

32

1= − − + + − − +( ) −=∑

44

2

psri

sp

y y y y y y y yik

p


1

1 2 3 4 5 6 7 8

21

32

1= − − + − + + −( ) −=∑

44

2

psri

Si l’un de ces termes s s s s si i i i i12

22

32

42

52, , , , est un nombre négatif, remplacer la valeur négative par 0.

Étape 4: Pour chaque niveau i, l’écart-type résiduel de laboratoire, sB, peut être obtenu en effectuant le calcul indiqué dans la Formule (5):

sp

y y s s s s s sBik

p

ik i ri i i i i i2

1

2 212

22

32

42

52

1

1

1

8

1

2=

−−( ) − − + + + +(

=∑ )) (5)


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s sBi Bi= 2

avec les valeurs moyennes du laboratoire:

y yikj

ijk==∑1

81

8

et la moyenne globale est:

yp

yik

p

ik==∑1

1

Étape 5: Calculer, pour chaque niveau i, l’écart-type de reproductibilité, sR, comme indiqué dans la Formule (6):

s s sRi Ai Bi= +2 2 (6)

6.3.3 Profild’exactitude

Le profil d’exactitude permettant de comparer la méthode alternative avec la méthode de référence peut être calculé conformément à l’ISO 16140-2:2016, 6.2.3: l’intervalle β-ETI (intervalle de valeurs dans lequel une proportion indiquée de la population doit raisonnablement se trouver (voir l’ISO 16140-1:2016, 2.8) est calculé d’après la médiane Xi des valeurs de référence et l’écart-type de reproductibilité ci-dessus. Les paramètres intermédiaires nécessaires G et H sont fondés sur l’écart-type de répétabilité de l’étape 1 et l’écart-type résiduel de laboratoire de l’étape 4. L’intervalle β-ETI définit ainsi les limites d’acceptabilité (AL) supérieure et inférieure.

L’interprétation des résultats est également effectuée conformément à l’ISO 16140-2:2016, 6.2.3: la méthode alternative est considérée comme étant équivalente à la méthode de référence lorsque les valeurs de β-ETI sont comprises entre les AL pour tous les niveaux de contamination. L’AL est établie à ±0,5 log10. Toutefois, si l’une des valeurs se situe en dehors de ces limites, un ajustement de l’AL est effectué conformément à l’ISO 16140-2:2016, 6.2.3 sur la base de l’écart-type de reproductibilité de la méthode de référence calculé dans l’étape 5 ci-dessus pour les résultats d’essai de la méthode de référence. Les résultats sont ensuite réévalués.

6.4 Étude de validation interlaboratoires sans méthode de référence

Des études factorielles interlaboratoires peuvent être effectuées sans méthode de référence. Le calcul des données de fidélité applicables à la méthode alternative ne dépend pas d’une valeur de référence et peut être effectué selon 6.3.

Pour calculer le profil d’exactitude, l’élément (d’aliment) sélectionné doit être artificiellement contaminé de manière à connaître la concentration de référence de la contamination. Les résultats des méthodes de référence sont remplacés par les valeurs de référence correspondantes dans les calculs indiqués en 6.3.


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Annexe A (informative)

Liste des facteurs et niveaux de facteurs relatifs à la validation par

plan factoriel

La liste suivante peut être utilisée pour choisir les facteurs et niveaux de facteurs applicables aux plans d’expérience factoriels fournis dans le présent document. Il convient de choisir, dans la liste suivante, les facteurs et niveaux de facteurs censés avoir un effet notable sur le résultat final:

— milieux de culture et incubation:

— fournisseur de bouillon non sélectif/primaire;

— bouillon préparé contre bouillon non sélectif/primaire prêt à l’emploi;

— fournisseur de bouillon sélectif/secondaire;

— bouillon préparé contre bouillon sélectif/secondaire prêt à l’emploi;

— fournisseur de boîte de gélose;

— boîte de gélose coulée contre boîte de gélose prête à l’emploi;

— durée de stockage des bouillons ou boîtes après incubation avant un repiquage ou un comptage ultérieur (conformément aux spécifications du mode opératoire de la méthode);

— âge du milieu (conforme à la date de péremption du milieu);

— lots de milieux (par exemple, milieux pour Enterobacteriaceae contenant des sels biliaires);

— durée d’incubation des différentes étapes (par exemple, 20 h contre 28 h lorsqu’une durée de 24 h ± 4 h est autorisée);

— microbiote annexe [au moins deux niveaux de microbiote annexe par élément (d’aliment), par exemple date de fraîcheur et date limite de consommation]:

— microbiote annexe associé à la conservation (conservation/non conservation au réfrigérateur/à température ambiante);

— niveaux de contamination (ajout artificiel de différents niveaux);

— organismes interférents;

— lots d’éléments (d’aliments), dans lesquels le microbiote annexe est connu pour varier;

— préparation et conservation des échantillons:

— mélangeur ou vortex;

— mode opératoire de revivification [par exemple, décongélation d’échantillons congelés («a») à température ambiante ou («b») à 4 °C];

— utilisation immédiate ou congélation/décongélation d’échantillons;


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— conditions de transport: conservation ou transport des échantillons;

— matériel et techniciens:

— technicien (utiliser des techniciens ayant différents niveaux d’expérience, si possible);

— différents systèmes de pipettage;

— différentes conditions d’incubation [utiliser deux types d’incubateurs différents, par exemple différents incubateurs à air à 37 °C, incubateur contre bain d’eau; si un seul type d’incubateur est disponible, faire varier les conditions d’incubation à deux niveaux, par exemple niveau «a» = durée minimale autorisée par la tolérance de la méthode et position la plus basse dans l’incubateur (= température minimale), et niveau «b» = durée maximale autorisée par la tolérance de la méthode et position la plus haute dans l’incubateur (= température maximale)];

— ensemencement en surface contre ensemencement en profondeur, le cas échéant;

— facteurs de stress (le cas échéant):

— température basse/normale;

— température élevée/normale;

— stress chimique (par exemple, fumaison et salaison);

— stress dû au pH;

— stress dû à une pression élevée;

— rayonnement à faible dose/pas de rayonnement (faisceau électronique);

— sécheresse/humidité, par exemple aw faible (≤0,60)/aw élevée (≥0,95).

NOTE Une configuration est une combinaison spécifique de niveaux de tous les facteurs. Deux exemples de configuration des facteurs du Tableau A.1 sont:

— configuration 1 (a,a,b,b,a): technicien «a»; boîtes de gélose coulées; conservation au réfrigérateur; condition d’incubation «b»; produit frais;

— configuration 2 (b,b,a,a,b): technicien «b»; boîtes de gélose prêtes à l’emploi; pas de conservation; condition d’incubation «a»; produit conservé.

Tableau A.1 — Exemples de facteurs et niveaux correspondants

Facteur Niveau «a» Niveau «b»Technicien Technicien «a» Technicien «b»

Préparation des boîtes de gélose Préparées en interne Achetées prêtes à l’emploiConservation des échantillons

ensemencés (augmente les bruits de fond)

Aucune Conservés au réfrigérateur pendant 2 jours

Condition d’incubation Condition d’incubation «a» Condition d’incubation «b»Microbiote annexe Produit frais Produit conservé


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Annexe B (informative)

Exemple d’étude factorielle interlaboratoires applicable à une

méthode quantitative

B.1 Général

Cette annexe fournit un exemple illustrant le mode opératoire de calcul des paramètres de validation conformément au paragraphe 6.2.

Vingt-quatre prises d’essai (huit configurations à trois niveaux de contamination) de poudre de lait écrémé (NFMP) instantané naturellement contaminé ont été expédiées à cinq laboratoires situés dans trois pays (Canada, France et États-Unis). Deux techniciens de chaque laboratoire ont mis en œuvre la méthode alternative et la méthode de référence [voir les méthodes normalisées pour l’analyse des produits laitiers (SMEDP)][11] pour le dénombrement de la flore totale aérobie du NFMP. Les durées d’incubation, pour la méthode alternative et la méthode de référence, étaient de 48 h ± 3 h et 72 h ± 3 h, respectivement.

B.2 Plan d’expérience

Cinq facteurs d’influence ont été évalués lors de l’étude:

— technicien (technicien «a»; technicien «b»);

— milieu de culture (milieu gélosé prêt à l’emploi; milieu gélosé préparé à partir de milieux déshydratés);

— pipette (pipette sérologique de 1,0 ml; micropipette de 1 000 µl);

— condition d’incubation (condition d’incubation «a», condition d’incubation «b»);

— durée d’incubation (minimale, maximale).

Voir le Tableau B.1 pour un résumé détaillé des facteurs à évaluer.

Les 24 prises d’essai (pour 8 configurations, 3 niveaux de contamination chacune) ont été toutes évaluées par une étude de méthodes appariées: les mêmes prises d’essai ont été utilisées pour la méthode alternative et la méthode de référence. Les variations au niveau des techniciens, milieux de culture, pipettes, conditions d’incubation et durées d’incubation, effectuées conformément au plan d’expérience du Tableau 7 et résumées dans le Tableau B.1, ont été appliquées à la méthode alternative et à la méthode de référence. Le Tableau B.2 fournit un résumé de l’étude.

Chaque laboratoire a analysé toutes les prises d’essai. Les prises d’essai ont été préparées de façon que le technicien ne connaisse pas le niveau de contamination. Elles ont été randomisées et codées de manière à travailler en aveugle à l’aide d’une référence à 3 chiffres, suivi du numéro de la configuration d’essai. Par exemple, 125-1 ou 145-3. Les échantillons ont été clairement identifiés avec des niveaux de facteurs qui devaient être respectés pour chaque prise d’essai (c’est-à-dire, condition d’incubation, durée d’incubation, etc.). Des instructions détaillées ont été fournies pour l’analyse, notamment un logigramme pour chacun des deux techniciens (voir Figures B.1 et B.2).


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Tableau B.1 — Plan d’expérience

Configuration Facteur 1: Technicien

Facteur 2: Milieu gélosé

Facteur 3: Durée d’incubation

Facteur 4: Condition

d’incubation

Facteur 5: Pipette

Alternative Référence

1 Milieu gélosé (prêt à l’emploi) 45 h 69 h Condition

d’incubation «a»Pipette

sérologique de 1,0 ml

2 «a»Milieu gélosé

(préparé à partir de milieux

déshydratés)51 h 75 h Condition

d’incubation «b»Micropipette de 1 000 µl


d’incubation «b»Micropipette de 1 000 µl

4 Milieu gélosé



d’incubation «a»Pipette



d’incubation «a»Micropipette de 1 000 µl

6 «b»Milieu gélosé (pré-

paré à partir de milieux déshydra-

tés)45 h 69 h Condition

d’incubation «b»Pipette



d’incubation «b»Pipette


8 Milieu gélosé



d’incubation «a»Micropipette de 1 000 µl

Tableau B.2 — Vue d’ensemble du plan d’expérience pour chaque laboratoire participant

Taille de la matrice/prise

d’essai

Niveau de contamination

cibleNombre de

prises d’essai Méthode alternative Méthode de référence

NFMP 11 g

Faible 8 Ensemencement de dilutions appropriées

par prise d’essai incubée à 30 °C ± 1 °C pendant

48 h ± 3 ha

Ensemencement de dilutions appropriées

par prise d’essai incubée à 30 °C ± 1 °C pendant

72 h ± 3 ha

Moyen 8Élevé 8

a Avec des variations au niveau des différentes configurations.


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Figure B.1 — Instructions pour le technicien «a»

NOTE L’ordre des facteurs présenté à la Figure B.1 du haut vers le bas, est l’ordre du logigramme microbiologique et non l’ordre des facteurs numérotés dans l’étude (voir également le Tableau B.1).


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Figure B.2 — Instructions pour le technicien «b»

NOTE L’ordre des facteurs présenté à la Figure B.2 du haut vers le bas, est l’ordre du logigramme microbiologique et non l’ordre des facteurs numérotés dans l’étude (voir également le Tableau B.1).

B.3 Calculs et résumé des données

B.3.1 Résumé des résultats des laboratoires 1 à 5 de l’étude interlaboratoires

Dès réception des données, il a été vérifié que tous les laboratoires ont effectué les analyses conformément aux méthodes indiquées dans le plan d’expérience. Aucun essai aberrant n’a été réalisé sur les données et aucun point de données n’a été exclu.

Tous les points de données (résultats de dénombrement de la flore totale aérobie, par prise d’essai et par méthode, en ufc/g) ont été log-transformés: les résultats sont indiqués dans le Tableau B.3 (à seulement deux décimales pour faciliter la lecture).


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Tableau B.3 — Résultats de l’étude interlaboratoires, données log-transformées

Configuration/méthode1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8

Laboratoire Niveau R A R A R A R A R A R A R A R A1 Faible 2,08 2,11 2,15 2,15 2,04 2,15 2,11 2,20 1,90 2,00 2,04 2,08 2,00 2,00 2,00 2,082 Faible 2,52 2,41 2,41 2,38 2,46 2,41 2,59 2,51 2,34 2,45 2,32 2,30 2,49 2,53 2,45 2,463 Faible 2,69 2,36 2,73 2,38 2,66 2,45 2,53 2,53 2,04 2,53 2,62 2,45 2,49 2,45 2,20 2,484 Faible 2,62 2,40 2,62 2,40 2,58 2,60 2,72 2,45 2,64 2,54 2,78 2,51 2,72 2,41 2,91 2,665 Faible 2,15 2,45 2,57 2,45 2,41 2,60 2,84 2,85 2,26 2,45 2,64 2,45 2,34 2,43 2,75 1,901 Moyen 3,28 3,26 3,20 3,20 3,36 3,18 3,08 3,15 3,26 3,08 3,08 3,15 3,11 3,08 3,38 3,382 Moyen 2,97 2,91 2,94 2,91 2,91 2,93 2,99 2,90 3,08 2,94 2,99 2,97 2,98 2,94 2,99 2,993 Moyen 2,83 2,93 2,91 3,11 2,89 2,88 2,81 2,66 2,38 2,96 2,82 2,95 2,78 2,90 2,85 3,044 Moyen 2,93 2,98 2,96 2,97 2,94 2,86 3,04 3,08 2,98 3,04 2,97 2,99 3,00 3,00 3,08 3,085 Moyen 2,58 2,91 2,70 2,92 2,65 2,79 2,73 2,91 2,66 2,97 2,59 2,97 2,70 2,96 2,85 3,041 Élevé 3,94 3,79 4,08 3,70 4,08 3,79 3,66 3,43 3,95 3,61 3,89 3,58 4,15 3,72 3,98 3,742 Élevé 4,34 4,20 4,15 4,08 4,38 4,08 4,08 3,89 4,34 4,08 4,49 4,18 4,34 4,11 4,30 4,083 Élevé 4,26 4,23 4,56 4,20 4,56 4,36 4,58 4,40 4,00 3,86 4,08 4,00 4,08 3,80 4,04 4,154 Élevé 4,11 3,89 4,52 4,11 4,18 4,04 4,26 4,08 4,49 4,30 4,28 4,08 4,18 4,00 4,26 4,085 Élevé 3,73 3,70 3,80 3,89 3,80 3,58 3,81 3,66 3,60 3,68 3,92 3,97 3,69 3,62 3,97 3,79

Légende

R: méthode de référence

A: méthode alternative

B.3.2 Donnéesdefidélité

Le calcul des données de fidélité a été effectué conformément aux étapes décrites en 6.3. Pour la méthode alternative, les résultats à chaque étape du calcul, sont indiqués ci-dessous. Pour la méthode de référence, les résultats finaux sont fournis.

Étape 1: Médiane des valeurs de la méthode de référence Xi et des valeurs de la méthode alternative Yi, comme indiqué dans le Tableau B.4.

Tableau B.4 — Valeurs médianes

Méthode de référence Méthode alternativeFaible Moyen Élevé Faible Moyen Élevé

X1 X2 X3 Y1 Y2 Y32,490 2,950 4,095 2,450 2,970 3,985

Étape 2: Variance de répétabilité et écart-type pour chaque niveau i (en utilisant yijk), comme indiqué dans le Tableau B.5.

Tableau B.5 — Écarts-types de répétabilité

Méthode alternative Faible Moyen Élevé

sri2 0,020 825 0,008 607 0,016 208

sri 0,144 0,093 0,127

Étape 3: Variance intermédiaire et écart-type pour chaque niveau i (en utilisant yijk), comme indiqué dans le Tableau B.6, avec le Tableau B.7.


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Tableau B.6 — Écarts-types intermédiaires


sAi2 0,037 876 0,015 615 0,040 516

sAi 0,195 0,125 0,201

Tableau B.7 — Composantes des variances intermédiaires

Méthode alternativeFacteur Faible Moyen Élevé

i = 1 i = 2 i = 3

Technicien s1i2 0,008

7510,001

6670,012

418Milieu de culture s2i

2 0,000 026

0,000 762

0,005 855

Durée d’incubation s3i

2 0,004 314

0,001 367

0,003 968

Condition d’incubation s4i

2 0,000 011

0,001 419

0,000 653

Pipette s5i2 0,003

9490,001

7940,001

415

Étape 4: Valeurs moyennes, variance résiduelle, écart-type résiduel pour chaque niveau i, comme indiqué dans les Tableaux B.8 et B.9.

Tableau B.8 — Valeurs moyennes de laboratoire et valeurs moyennes globales

Méthode alternative Faible Moyen Élevé i = 1 i = 2 i = 3

yi1 2,096 3,185 3,670

yi2 2,431 2,936 4,088

Valeurs moyennes de laboratoire

yi3 2,454 2,929 4,125

yi4 2,496 3,000 4,073

yi5 2,448 2,934 3,736

Moyenne globale yi 2,385 2,997 3,938

Tableau B.9 — Écart-type résiduel de laboratoire


sBi2 0,015 503 0,007 35 0,032 803

sBi 0,125 0,086 0,181

Étape 5: Variance de reproductibilité et écart-type pour chaque niveau i, comme indiqué dans le Tableau B.10.


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Tableau B.10 — Écart-type de reproductibilité


sRi2 0,053 379 0,022 961 0,073 320

sRi 0,231 0,152 0,271

Résumé: Comme indiqué dans le Tableau B.11.

Tableau B.11 — Résumé

Méthode de référence Méthode alternative Faible Moyen Élevé Faible Moyen ÉlevéValeur log10 médiane 2,490 2,950 4,095 2,450 2,970 3,985Écart-type de répétabilité, sr 0,114 0,093 0,109 0,144 0,093 0,127 s1 0,114 0,051 0,144 0,094 0,041 0,111 s2 0,135 0,049 0,080 0,005 0,028 0,077 s3 0,023 0,052 0,079 0,066 0,037 0,063 s4 0,082 0,049 0,062 0,003 0,038 0,026 s5 0,055 0,054 0,057 0,063 0,042 0,038Écart-type intermédiaire, sA 0,234 0,147 0,229 0,195 0,125 0,201Écart-type résiduel de laboratoire, sB

0,189 0,188 0,179 0,125 0,086 0,181

Écart-type de reproductibilité, sR

0,301 0,239 0,291 0,231 0,152 0,271

Écart-type de reproductibilité moyen pondéré

0,278 0,223

NOTE Pour faciliter la lecture du texte, l’indice i n’est pas utilisé dans ce tableau.

B.3.3 Profild’exactitude

Le calcul du profil d’exactitude a été effectué conformément aux étapes décrites dans l’ISO 16140-2:2016, 6.2.3.

Étape 1: Moyenne des valeurs de référence Xi pour chaque niveau i, comme indiqué dans le Tableau B.12.

Conformément à 6.3, la médiane respective sera utilisée comme moyenne des valeurs de référence.

Tableau B.12 — Valeurs médianes de la méthode de référence

Méthode de référenceFaible Moyen Élevé

X1 X2 X32,490 2,950 4,095

Étape 2: Variance de reproductibilité sRi2 pour chaque niveau i, comme indiqué dans le Tableau B.13.

Extraite de l’étape 5 (voir 6.3) calculée ci-dessus.


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Tableau B.13 — Variances de reproductibilité pour la méthode de référence

Méthode alternativeFaible Moyen Élevé

sR1

2 sR22 sR3

2

0,053 379 0,022 961 0,073 320

Étape 3: Moyenne globale yi des mesures obtenues avec la méthode alternative, comme indiqué dans le Tableau B.14.

Tableau B.14 — Valeurs moyennes de la méthode alternative

Méthode alternativeFaible Moyen Élevé

y1 y2 y3

2,385 2,997 3,938

Étape 4: Biais absolu y Xi i− , comme indiqué dans le Tableau B.15.

Tableau B.15 — Biais de la méthode alternative

BiaisFaible Moyen Élevé

y X1 1− y X2 2− y X3 3−

−0,105 0,047 −0,157


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Étapes 5 et 6: Limites de l’intervalle β-ETI, comme indiqué dans le Tableau B.16.

Tableau B.16 — Limites de l’intervalle β-ETI

Faible Moyen Élevé i = 1 i = 2 i = 3n 8 8 8p 5 5 5

sri2 0,020 8 0,008 6 0,016 2

s s sLi Ri ri2 2 2= − 0,032 5 0,014 3 0,057 1

sRi2 0,053 4 0,022 9 0,073 3

H (paramètre intermédiaire) 0,744 0,853 2,024G (paramètre intermédiaire) 0,501 0,487 0,419

sTIi2 0,058 7 0,025 4 0,083 7

v 14,432 13,151 7,773kMi 1,343 1,349 1,400

Limites de l’intervalle β-ETI

Ui 2,695 3,201 4,317

Li 2,075 2,793 3,559

NOTE Le Tableau B.16 fournit les valeurs kMi correctes. Un programme Excel® 2) ne permet pas de calculer les quantiles corrects pour des degrés de liberté non entiers. Seule une approximation grossière est possible.

Étape 7: Représentation graphique des résultats calculés (voir Figure B.3), comme indiqué dans le Tableau B.17.

TableauB.17—Limitesduprofild’exactitude

Faible Moyen Élevé i = 1 i = 2 i = 3

Li − Xi −0,415 −0,157 −0,536Ui − Xi 0,205 0,251 0,222



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LégendeX valeur de référence (log10)Y exactitude: différence log10(alt) – log10(ref)

biais absolu

β-ETI supérieur et inférieurligne du biais zérolimites d’acceptabilité supérieure et inférieure

FigureB.3—Profild’exactitudedelaméthodealternativeenutilisantβ = 80 % et λ = 0,5 log10

Étape 8: Mode opératoire d’évaluation supplémentaire.

Pour le niveau de contamination cible élevé, l’intervalle β-ETI inférieur chute en dehors de l’AL de ±0,5 log10. Par conséquent, un mode opératoire d’évaluation supplémentaire est suivi.

Écart-type de reproductibilité moyen pondéré de la méthode de référence, comme indiqué par la Formule (B.1):

sR ,,

ref=0 278 (B.1)

Étape 9: Nouvelles AL (voir Figure B.4), comme indiqué par la Formule (B.2):

ALs ref

= ⋅ =3 3 0 918, ,,

sR (B.2)


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Résumé: Comme indiqué dans le Tableau B.18.

Tableau B.18 — Résumé

Étape Faible Moyen Élevé i = 1 i = 2 i = 31 Xi 2,490 2,950 4,095

2 sRi2 0,053 4 0,022 9 0,073 3

3 yi 2,385 2,997 3,938

4 y Xi i− −0,105 0,047 −0,157

n 8 8 8 p 5 5 5

sri2 0,020 8 0,008 6 0,016 2

s s sLi Ri ri2 2 2= − 0,032 5 0,014 3 0,057 1

5/6 H 0,744 0,853 2,024 G 0,501 0,487 0,419

sTli2 0,058 7 0,025 4 0,083 7

v 14,432 13,151 7,773 kMi 1,343 1,349 1,400

Limites de l’intervalle β-ETI

Ui 2,695 3,201 4,317

Li 2,075 2,793 3,5597 Li − Xi −0,415 −0,157 −0,536 Ui − Xi 0,205 0,251 0,2228 sR,ref 0,278 9 AL 0,918


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LégendeX valeur de référence (log10)Y exactitude: différence log10(alt) – log10(ref)

biais absolu

β-ETI supérieur et inférieurligne du biais zérolimites d’acceptabilité supérieure et inférieure

FigureB.4—Profild’exactitudedelaméthodealternativeenutilisantβ = 80 % et les AL corrigées fondées sur l’écart-type de reproductibilité de la méthode de référence conformément

aux étapes 8 et 9

Ui − Xi ≤ ALs et Li − Xi ≥ −ALs pour tous les i du profil d’exactitude. Par conséquent, la méthode alternative est acceptée comme étant équivalente à la méthode de référence.


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Annexe C (informative)

Exemple d’étude factorielle interlaboratoires applicable à une

méthode qualitative

Cette annexe fournit un exemple illustrant le mode opératoire de calcul des paramètres de validation conformément à 5.2. Le plan d’expérience indiqué dans le Tableau 2 est mis en œuvre. Les essais avec la méthode alternative et la méthode de référence sont effectués dans cinq laboratoires participants, avec huit configurations et à trois niveaux de contamination. Les facteurs «technicien», «milieu de culture», «processus de décongélation», «condition d’incubation» et «microbiote annexe» ont été utilisés. Alors qu’un seul résultat d’essai est obtenu aux niveaux de contamination L0 et L2, quatre réplicats sont obtenus au niveau de contamination L1.

Les résultats d’essai sont fournis dans les Tableaux C.1 et C.2.


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TableauC.1—Résultatsdelaméthodealternative(aprèsconfirmation)

Laboratoire 1 Laboratoire 2 Laboratoire 3 Laboratoire 4 Laboratoire 5Niveau de contamination

ufc/prise d’essaiConfi-gura-tion

A1 A2 A3 A4 A1 A2 A3 A4 A1 A2 A3 A4 A1 A2 A3 A4 A1 A2 A3 A4

Blanc 1 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —2 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —3 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —4 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —5 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —6 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —7 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —8 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —

0,8 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 02 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 13 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 04 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 15 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 06 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 07 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 08 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1

10 1 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — —2 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 0 — — —3 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — —4 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — —5 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — —6 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — —7 1 — — — 1 — — — 0 — — — 1 — — — 1 — — —8 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — —

Légende

A1, …, A4: désignent les résultats d’essai, 0: cible non détectée, 1: cible détectée

NOTE Voir le Tableau 2 pour les niveaux de facteurs correspondant à chaque configuration.


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Tableau C.2 — Résultats de la méthode de référence

Laboratoire 1 Laboratoire 2 Laboratoire 3 Laboratoire 4 Laboratoire 5Niveau de contamination

ufc/prise d’essaiConfiguration R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4

Blanc 1 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —2 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —3 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —4 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —5 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —6 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —7 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —8 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —

0,8 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 02 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 13 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 14 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 15 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 16 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 17 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 18 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1

10 1 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — —2 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — —3 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — —4 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — —5 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — —6 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — —7 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — —8 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — — 1 — — —

Légende

R1, …, R4: désignent les résultats d’essai, 0: cible non détectée, 1: cible détectée

NOTE Voir le Tableau 2 pour les niveaux de facteurs correspondant à chaque configuration.


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Les Tableaux C.3 et C.4 fournissent des vues d’ensemble des deux méthodes effectuées dans les laboratoires (voir le Tableau 3).

TableauC.3—Fractionderésultatspositifspourlaméthodealternative(aprèsconfirmation)


Laboratoire L0 = Blanc L1 = 0,8 ufc/prise d’essai L2 = 10 ufc/prise d’essai

Laboratoire 1 0,000(0/8)a

0,594(19/32)a

1,000(8/8)a


0,688(22/32)a

1,000(8/8)a


0,250(8/32)a

0,875(7/8)a


0,281(9/32)a

1,000(8/8)a


0,344(11/32)a

0,875(7/8)a

Tous 0,000(0/40)a

0,431(69/160)a

0,950(38/40)a

a Nombre de prises d’essai positives/nombre total de prises d’essai.

NOTE Sur huit résultats totaux pour L0 et L2, et 32 résultats totaux pour L1.

Tableau C.4 — Fraction de résultats positifs pour la méthode de référence


Laboratoire L0 = Blanc L1 = 0,8 ufc/prise d’essai L2 = 10 ufc/prise d’essai


0,406(13/32)a

1,000(8/8)a


0,344(11/32)a

1,000(8/8)a


0,625(20/32)a

1,000(8/8)a


0,406(13/32)a

1,000(8/8)a


0,563(18/32)a

1,000(8/8)a

Tous 0,000(0/40)a

0,469(75/160)a

1,000(40/40)a

a Nombre de prises d’essai positives/nombre total de prises d’essai.

NOTE Sur 8 résultats totaux pour L0 et L2, et 32 résultats totaux pour L1.


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Les résultats de l’étude de sensibilité pour le niveau fractionnel L1 (voir le Tableau 5) sont indiqués dans le Tableau C.5. Voir l’ISO 16140-2:2016, 5.2.3, pour le calcul de l’étude de sensibilité.

Tableau C.5 — Étude de sensibilité

Niveaux de facteurs

Configurations PA NA ND PD FP Na SE(alt) %

SE(ref) %

RT %

SP(alt) %

SP(ref) %

FPRb %

Toutes les configurations 1 à 8

25 41 50 44 0 160 58,0 63,0 41,3 100 100 0

Technicien «a» 1 à 4 Technicien «b» 5 à 8 Milieu de culture «a» 1,3,5,7

6 22 31 21 0 80 46,6 63,8 35,0 100 100 0

Milieu de culture «b» 2,4,6,8

19 19 19 23 0 80 68,9 62,3 47,5 100 100 0

Processus de décongélation «a» 1,3,6,8

10 25 25 20 0 80 54,5 63,6 43,8 100 100 0

Processus de décongélation «b» 2,4,5,7

15 16 25 24 0 80 60,9 62,5 38,8 100 100 0

Condition d’incubation «a» 1,4,5,8

12 23 24 21 0 80 57,9 63,2 43,8 100 100 0

Condition d’incubation «b» 2,3,6,7

13 18 26 23 0 80 58,1 62,9 38,8 100 100 0

Microbiote annexe «a» 1,4,6,7

16 20 22 22 0 80 63,3 63,3 45,0 100 100 0

Microbiote annexe «b» 2,3,5,8

9 21 28 22 0 80 52,5 62,7 37,5 100 100 0

Légende

PA: accord positif, NA: accord négatif, ND: déviation négative, PD: déviation positive, FP: faux positif, N: somme, SE(alt): sensibilité de la méthode alternative, SE(ref): sensibilité de la méthode de référence, RT: justesse relative, SP(alt): spécificité relative de la méthode alternative, SP(ref): spécificité relative de la méthode de référence, FPR: pourcentage de faux positifsa N = NA + PA + PD + ND.b FPR = FP/NA × 100 %.

NOTE Étant donné que les niveaux de facteurs pour le facteur «technicien» diffèrent d’un laboratoire à l’autre (et ne sont pas spécifiés, par exemple, en termes de statut de formation), l’étude de sensibilité ne peut pas être inter-prétée de façon significative pour ce facteur. Les lignes correspondantes sont donc vides dans ce tableau.


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L’étude étant une étude de méthodes non appariées, l’AL doit être calculée conformément à 5.4.2. Le calcul des AL est résumé dans le Tableau C.6.

Tableau C.6 — Limites d’acceptabilité

Paramètre RésultatNombre d’échantillons ayant un résultat positif, obtenus avec la méthode de référence au niveau L1

75

Nombre d’échantillons ayant un résultat positif, obtenus avec la méthode alternative au niveau L1

69

Nombre d’échantillons soumis à essai au niveau L1 160(p+)ref 75/160 = 0,469(p+)alt 69/160 = 0,431Nombre de laboratoires, Nlab 5

ALlab ref alt ref alt

= + + + +( ) +( ) − ( ) ×( )( ) 4 6 2N p p p p 15,4

ND 50PD 44ND – PD 6Limite d’acceptabilité atteinte

Les résultats de l’étude factorielle en fonction du RLOD sont indiqués dans les Tableaux C.7 et C.8.

Tableau C.7 — Étude factorielle pour les deux méthodes applicables au RLOD

Laboratoire FacteurNiveau de fac-

teurLOD50,alt LOD50,ref

log10 RLOD

Différence logarithmique de RLOD

(niveau b – niveau a)

1

Technicien a 0,46 1,43 −0,490,41

b 0,65 0,80 −0,09Milieu de culture

a 0,79 1,43 −0,260,00

b 0,44 0,80 −0,25Processus de décongélation

a 0,98 0,96 0,01−0,64

b 0,27 1,16 −0,63Condition d’incubation

a 0,65 1,18 −0,26−0.06

b 0,46 0,96 −0,32Microbiote annexe

a 0,25 1,77 −0,841,18

b 1,43 0,67 0,33NOTE 1 Les valeurs log10 RLOD pour chaque laboratoire et chaque niveau de facteur sont fournies avec les différences correspondantes et les valeurs LOD50 sous-jacentes (résultats intermédiaires).

NOTE 2 La déviation des derniers chiffres est due à l’erreur d’arrondissement.


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Laboratoire FacteurNiveau de fac-

teurLOD50,alt LOD50,ref

log10 RLOD

Différence logarithmique de RLOD

(niveau b – niveau a)

2

Technicien a 0,67 0,96 −0,16 −0.57b 0,33 1,77 −0,73

Milieu de culture

a 0,40 1,77 −0,65 0,42b 0,56 0,96 −0,23

Processus de décongélation

a 0,47 1,81 −0,58 0,27b 0,47 0,96 −0,31

Condition d’incubation

a 0,56 1,18 −0,32 −0,23b 0,40 1,43 −0,55

Microbiote annexe

a 0,47 0,80 −0,23 −0,44b 0,47 2,22 −0,67

3

Technicien a 1,43 0,67 0,33 0,56b 3,65 0,47 0,89

Milieu de culture

a 3,57 0,54 0,82 −0,41b 1,43 0,56 0,40


a 1,77 0,67 0,43 0,35b 2,76 0,47 0,77


a 2,22 0,44 0,70 −0,17b 2,29 0,67 0,53

Microbiote annexe

a 2,76 0,80 0,54 0,11b 1,77 0,40 0,65

4

Technicien a 1,43 1,43 0,00 0,36b 1,77 0,77 0,36

Milieu de culture

a 2,22 0,66 0,53 −0,72b 1,16 1,81 −0,19


a 2,22 1,43 0,19 −0,01b 1,16 0,77 0,18


a 1,77 1,16 0,18 −0,01b 1,43 0,96 0,17

Microbiote annexe

a 1,16 0,56 0,31 −0,31b 2,22 2,22 0,00

5

Technicien a 1,88 0,96 0,29 0,33b 1,98 0,47 0,62

Milieu de culture

a 3,65 0,67 0,74 −0,60b 0,91 0,67 0,14


a 1,46 0,56 0,41 0,02b 2,15 0,80 0,43


a 1,04 0,96 0,03 0,77b 3,05 0,47 0,81

Microbiote annexe

a 2,24 0,80 0,45 −0,07b 1,36 0,56 0,38

NOTE 1 Les valeurs log10 RLOD pour chaque laboratoire et chaque niveau de facteur sont fournies avec les différences correspondantes et les valeurs LOD50 sous-jacentes (résultats intermédiaires).

NOTE 2 La déviation des derniers chiffres est due à l’erreur d’arrondissement.

Tableau C.7 (suite)


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Tableau C.8 — Étude factorielle pour les deux méthodes effectuées dans les laboratoires

Facteur Valeur dTechnicien Milieu de culture −0,26Processus de décongélation 0,00Condition d’incubation 0,06Microbiote annexe 0,09NOTE Vue d’ensemble des valeurs d pour les différents facteurs.

NOTE 1 Les valeurs d sont obtenues en appliquant l’approche décrite en 5.4, par exemple la valeur d pour le facteur «milieu de culture» est obtenue en prenant la moyenne des différences correspondant à ce facteur dans le Tableau C.6, c’est-à-dire en calculant la moyenne des laboratoires. Il est important de noter que ce processus d’établissement de moyennes ne peut pas être interprété de façon significative si les niveaux de facteurs sont différents d’un laboratoire à l’autre, comme c’est le cas, dans cet exemple, pour le facteur «technicien». Pour cette raison, la valeur d correspondant à ce facteur n’a pas été calculée.

NOTE 2 Les valeurs d peuvent être calculées à l’aide du programme Excel®3) mentionné en 5.4.3. Cependant, pour la version actuelle de ce programme Excel®, ce type de calcul nécessiterait une importation séparée pour chaque laboratoire, facteur et niveau de facteur. Pour cette raison, les résultats ci-dessus ont été calculés dans «R».

Comme expliqué en 5.4, un facteur est considéré comme ayant un effet important sur le LOD50 si la valeur d correspondante est supérieure à ±0,3.

Par exemple, la valeur d pour le facteur «milieu de culture» de −0,26 signifie que, en moyenne dans les laboratoires, le rapport RLODNiveau b/RLODNiveau a est de 10 0 550 26− ≅, , , c’est-à-dire que le RLOD au niveau «b» du facteur «condition d’incubation» est approximativement la moitié de la valeur au niveau «a». Cela correspondrait, par exemple, à une diminution de 50 % de la valeur LOD50 de la méthode alternative alors que celle de la méthode de référence est restée constante. En d’autres termes, la méthode alternative est nettement plus sensible que la méthode de référence au niveau «b» qu’au niveau «a» que la méthode de référence. Cela corrobore les résultats de l’étude de sensibilité indiqués dans le Tableau C.5.



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Bibliographie

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[2] ISO 6579-1, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche, le dénombrement et le sérotypage des Salmonella — Partie 1: Recherche des Salmonella spp.

[3] ISO 16140-3, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 3: Protocole pour la vérification de méthodes de référence et de méthodes alternatives validées dans un seul laboratoire

[4] ISO 16140-4, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes dans un seul laboratoire

[5] ISO 16140-6, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 6: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) pour la confirmation microbiologique et le typage

[6] ISO 17468:2016, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et recommandations techniques pour le développement ou la révision d’une méthode de référence normalisée

[7] ISO 21528-2, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement des Enterobacteriaceae — Partie 2: Technique par comptage des colonies

[8] ISO 22117, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences spécifiques et recommandations relatives aux essais d’aptitude par comparaison interlaboratoires

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[10] Uhlig S., Gowik P. Efficient estimation of in-house reproducibility and reproducibility standard deviation in factorial validation studies. Journal of Consumer Protection and Food Safety. 2018, 13, pp. 315 –322. Disponible à l’adresse: https:// doi .org/ 10 .1007/ s00003 -018 -1157 -x

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https://doi.org/10.1007/s00003-017-1130-0

https://doi.org/10.1007/s00003-018-1157-x

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