WYDZIAŁ ELEKTROTECHNIKI, AUTOMATYKI,INFORMATYKI I INŻYNIERII BIOMEDYCZNEJ

Praca dyplomowa inżynierska

Projektowanie bioaktywnych materiałów kompozytowych polimerowo-ceramicznych w formie przestrzennych rusztowań przy zastosowaniu metody odlewania z wymywaniem porogenu (SCPL)

Designing of bioactive polymer-ceramic composites by the solvent casting particulate leaching (SCPL method)

Autor: Małgorzata Ul

Kierunek studiów: Inżynieria Biomedyczna

Opiekun pracy: dr inż. Katarzyna Cholewa-Kowalska

Kraków, 2015

Oświadczam, świadomy(-a) odpowiedzialności karnej za poświadczenie nieprawdy, że niniejszą pracę dyplomową wykonałem(-am) osobiście i samodzielnie i że nie korzystałem(-am) ze źródeł innych niż wymienione w pracy.

Dziękuję serdecznie mojej promotorce dr inż. Katarzynie Cholewie-Kowalskiej oraz

mgr. inż. Michałowi Dziadkowi za nieocenioną pomoc, poświęcony czas i okazane wsparcie

podczas przygotowywania niniejszej pracy.

Spis treściWstęp..........................................................................................................................................7

I. Podłoża dla inżynierii tkankowej......................................................................................11

1. Inżynieria tkankowa.......................................................................................................11

2. Przestrzenne rusztowania dla inżynierii tkankowej – skafoldy.....................................11

3. Wymagania stawiane podłożom tkankowym................................................................12

3.1. Biokompatybilność.....................................................................................................13

3.2. Biodegradowalność...................................................................................................13

3.3. Właściwości mechaniczne.........................................................................................13

3.4. Architektura rusztowań.............................................................................................14

3.5. Technologia wytwarzania.........................................................................................15

II. Materiały wykorzystywane w inżynierii tkankowej......................................................17

1. Ceramika........................................................................................................................18

1.1. Szkła wytwarzane metodą topienia............................................................................19

1.2. Szkła żelowe...............................................................................................................19

2. Polimery.........................................................................................................................21

2.1. Polimery syntetyczne.................................................................................................21

2.2. Polimery naturalne......................................................................................................22

3. Kompozyty.....................................................................................................................24

III. Metody wytwarzania porowatych rusztowań dla inżynierii tkankowej........................27

1. Konwencjonalne techniki produkcji rusztowań dla inżynierii tkankowej.....................27

1.1. Odlewanie z roztworu z wymywaniem porogenu......................................................27

1.2 Spienianie gazem........................................................................................................28

1.3. Separacja faz..............................................................................................................29

1.4. Formowanie ze stopu.................................................................................................29

2. Zaawansowane techniki produkcji rusztowań dla inżynierii tkankowej.......................30

2.1. Metody szybkiego wytwarzania (Rapid Prototyping)..............................................30

2.2. Elektroprzędzenie.......................................................................................................30

IV. Charakterystyka materiałów wyjściowych....................................................................35

1. Poli(ε-kaprolakton)........................................................................................................35

2. Bioszkła otrzymywane w syntezie zol-żel.....................................................................35

3. Rodzaje porogenów.......................................................................................................36

V. Otrzymywanie porowatego kompozytu PCL/bioszkło żelowe......................................37

VI. Metody badań.................................................................................................................41

1. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)..............................................................41

2. Skaningowa kalorymetria różnicowa (DSC).................................................................42

VII. Charakterystyka otrzymanych rusztowań......................................................................45

1. Charakterystyka makroskopowa rusztowań..................................................................45

2. Charakterystyka mikroskopowa rusztowań – SEM/EDX..............................................46

3. Charakterystyka właściwości mechanicznych – DSC...................................................52

Podsumowanie i wnioski..........................................................................................................55

Bibliografia........................................................................................................................57

Wstęp

Choroby, urazy i wypadki mogą prowadzić do zniszczeń oraz degeneracji tkanek w

ludzkim ciele, co wymaga leczenia związanego z ich naprawą, zastąpieniem czy regeneracją.

Jeszcze do nie tak dawna leczenie to ograniczało się jedynie do przeszczepów tkankowych,

czy to autograftów (kiedy zarówno biorcą jak i dawcą jest ten sam pacjent) lub też

allograftów. Mimo tego, iż metody te stały się rewolucyjnymi sposobami ratowania życia

jednak nadal istnieją ważne problemy w obu tych technikach popychające naukowców do

dalszych badań. Dzięki temu w ciągu zaledwie 10 lat poczyniono ogromne postępy nad

opracowaniem żywych substytutów tkanek i narządów. Większość z nich nadal jest na etapie

badań, jednak inżynieria tkankowa staje się coraz prężniej rozwijającą dziedziną dążącą do

uzyskania funkcjonalnego materiału biologicznego, który będzie w stanie zastąpić lub

zregenerować uszkodzoną tkankę w organizmie i przywrócić jej funkcje.

Liczne badania pomogły określić cechy jakimi powinny charakteryzować się idealne

materiały dla inżynierii tkankowej. Muszą one cechować się jednocześnie wysoką

biozgodnością jak i odpowiednimi parametrami mechanicznymi . Wszystkie te cechy mogę

być uzyskiwane dzięki odpowiednim materiałom oraz metodom ich otrzymywania. Każda

kolejna próba dostarcza nam nową wiedzę na ten temat dzięki czemu pomału zmierzamy do

uzyskania podłoża tkankowego będącego idealnym rusztowaniem dla rozwoju komórek a co

za tym idzie dalszej regeneracji tkanki.

W niniejszej pracy przedstawiony zostanie procesu otrzymywania przestrzennego

rusztowania przy zastosowaniu metody odlewania z roztworu z wymywaniem porogenu.

Skafold w projekcie otrzymywano z bioaktywnych materiałów kompozytowych polimerowo-

ceramicznych, osnowę kompozytu stanowił polikaprolakton (PCL), natomiast fazą

modyfikującą były cząstki bioaktywnych szkieł żelowych z układu SiO2-CaO-P2O5 o różnym

udziale poszczególnych tlenków. Badano wpływ użytego w procesie porogenu (wykorzystano

NaCl oraz sacharozę) na architekturę otrzymanego podłoża tkankowego oraz wpływ użytych

modyfikatorów na krystaliczność osnowy skafoldu.

7

8

Część literaturowa

9

10

11

I. Podłoża dla inżynierii tkankowej

1. Inżynieria tkankowa

Termin „inżynieria tkankowa” po raz pierwszy został oficjalnie użyty na warsztatach

National Science Foundation w roku 1988 i miał oznaczać stosowanie zasad i metod

inżynierii i nauk przyrodniczych w kierunku fundamentalnego zrozumienia relacji struktury i

funkcji w normalnych i patologicznych tkankach ssaków oraz rozwój biologicznych

substytutów dla odbudowy, utrzymania lub poprawienia funkcji tkanek[1].

Inżynieria tkankowa, zaraz po transplantologii i chirurgii rekonstrukcyjnej, uważana jest

za trzecią z form terapii w medycynie. Dzięki swoim innowacyjnym metodom pozwala na

uniknięcie problemów związanych z tradycyjną transplantologią, takich jak niewystarczająca

liczba organów, czy też leki immunosupresyjne. Nie jest też konieczną implantacja

sztucznych protez, materiałów o dosyć niskiej biozgodności. Wszystkie wymienione dobre

strony inżynierii tkankowej sprawiają, iż coraz realniejszym staje się powodzenie realizacji

procesu regeneracji tkankowej, z jednoczesnym ograniczeniem liczby powikłań [2].

Wyróżniamy trzy podejścia jeśli chodzi o inżynierię regeneracyjną. Dwa pierwsze mają

dość ograniczone zastosowanie i wykorzystuje się je jedynie w przypadku mniejszych

uszkodzeń tkanek. Pierwszym z nich jest zastosowanie wyizolowanych komórek w celu

miejscowej regeneracji odpowiednich tkanek za pomocą wstrzyknięcia zawiesiny

komórkowej w pożądane miejsce i zastąpienie komórek odpowiedzialnych za odpowiednie

funkcje. Natomiast drugim jest dostarczanie czynników wzrostu indukujących różnicowanie

się komórek i wzrost tkanki do konkretnych lokalizacji. Trzecim podejściem, dającym

największe możliwości dotyczy hodowli komórek na trójwymiarowych rusztowaniach, o

których to mówić będzie dalsza część pracy[3,4].

2. Przestrzenne rusztowania dla inżynierii tkankowej – skafoldy

Wyróżniamy skafoldy naturalne oraz syntetyczne używane w zależności od wskazań

medycznych. Inteligentne biomateriały zdolne do zmiany właściwości w odpowiedzi na

zmianę warunków środowiska (np. pH, temperatury) stanowią przyszłość inżynierii

tkankowej. Rusztowania, które stosuje się w inżynierii regeneracyjnej łączy się z różnymi

rodzajami komórek. Coraz częściej jednak stosuje się rusztowania pozbawione komórek.

Główną ideą używania podłoży z osadzonymi na nich komórkami jest pobudzanie procesu

syntezy tkanek. Aby możliwy był dostęp komórek do składników odżywczych i aby zapewnić

odpowiednią powierzchnię wzrostu projektuje się porowate, trójwymiarowe konstrukcje[5].12

Jedna z głównych metod inżynierii tkankowej obejmuje hodowanie odpowiednich

komórek in vitro w celu otrzymania odpowiednich trójwymiarowych (3D) narządów lub

tkanek. Komórki jednak samoistnie nie posiadają zdolności wzrastania w pożądanych przez

nas trójwymiarowych kierunkach odpowiadających za anatomiczny kształt tkanki. Zamiast

tego migrują one losowo tworząc dwuwymiarowe warstwy komórek. W celu osiągnięcia

wymaganych przez nas kształtów wzrostu tkanek wykorzystuje się porowate matryce, tak

zwane rusztowania, do których komórki adherują oraz proliferują. Rusztowania w związku z

tym są bardzo ważnym elementem dla inżynierii tkankowej[6].

Z tego względu stawiane im są ścisłe wymagania. Ponieważ mają one stanowić specyficzne

podłoże dla żywych komórek, muszą być zaprojektowane w ten sposób, aby w jak

największym stopniu przypominały swoją budową oraz właściwościami naturalną macierz

zewnątrzkomórkową, występującą we wszystkich żywych komórkach. Macierz ta, w

naturalnych warunkach organizmu ludzkiego odpowiada za utrzymanie struktur tkankowych,

ich właściwości mechaniczne, a co najważniejsze dzięki swojej porowatej strukturze

odpowiada za odżywianie komórek oraz stanowi dla nich przyczep. Zbudowana jest głównie

z białek kolagenowych i niekolagenowych, hydroksyapatytu, płynu tkankowego, kwasu

hialuronowego, zależnie od tkanki, w której występuje[7].

Wymagania określone jako kluczowe dla wytwarzania rusztowań mówią, iż trójwymiarowe

podłoża powinny posiadać system połączonych ze sobą porów o odpowiedniej wielkości

umożliwiając tkance przerastanie i unaczynienie oraz iż powinny być wykonane z materiału o

kontrolowanej biodegradacji lub bioresorpcji. Ponadto rusztowania mają działać w taki

sposób, aby ostatecznie zostać zastąpione przez przerastającą tkankę, ich parametry

powierzchni (zwilżalność, topografia, łądunek, obecność grup funkcyjnych) musi sprzyjać

przyłączaniu, proliferacji oraz różnicowaniu się komórek. Właściwości mechaniczne muszą

być odpowiednie w zależności od miejsca wszczepienia, skafoldy nie powinny powodować

żadnych niekorzystnych reakcji organizmy oraz powinna je charakteryzować łatwość

wytwarzania w różnorodnych kształtach oraz rozmiarach[6].

3. Wymagania stawiane podłożom tkankowym

Większość rusztowań wytwarzanych z różnych biomateriałów i za pomocą wielu

rozmaitych metod otrzymywania zostały użyte w celach regeneracji odmiennych tkanek oraz

narządów w organizmie człowieka. Jednak niezależnie od rodzaju odbudowywanej tkanki

najistotniejsze parametry charakteryzujące skafold pozostają niezmienne projektowaniu oraz

określaniu przydatności rusztowania do stosowania w inżynierii tkankowej[1].

13

3.1. Biokompatybilność

Pierwszym i najważniejszym kryterium jakie musi spełniać rusztowanie dla inżynierii

tkankowej jest to, że muszą być one biokompatybilne. Komórki muszą adherować,

prawidłowo funkcjonować i migrować na powierzchnię i w końcu wewnątrz rusztowania oraz

zaczynać się rozmnażać zanim ustali się nowa matryca. Po implantacji trójwymiarowe

podłoże komórkowe musi wywołać nieznaczną odpowiedź immunologiczną aby zapobiec

poważnej odpowiedzi zapalnej tkanki mogącej spowodować pogorszenia gojenia się ran lub

odrzucenie wszczepu[1].

3.2. Biodegradowalność

Celem inżynierii tkankowej jest pozwolenie własnym komórkom organizmu, aby po

upływie określonego czasu finalnie zastąpiły skafold. Rusztowania nie mają bowiem w

zamierzeniu być implantami stałymi. Podłoże zatem musi być biodegradowalne w taki

sposób, aby komórki mogły wytworzyć własną matryce zewnątrzkomórkową. Ponadto

produkty uboczne tej degradacji powinny być nietoksyczne oraz zdolne do opuszczenia

organizmu bez wywołania skutków ubocznych. W celu umożliwienia stopniowej degradacji

zsynchronizowanej ze wzrostem tkanki konieczna jest niewielka odpowiedz zapalna

organizmu połączone z kontrolowaną infuzją komórek takich jak makrofagi. Obecnie

strategie inżynierii tkankowej są wprowadzane do praktyki lekarskiej o wiele częściej, a

immunologia odgrywa coraz większą rolę w badaniach[1].

3.3. Właściwości mechaniczne

Idealnym byłoby, aby skafold posiadał właściwości mechaniczne zgodne z

anatomicznym miejscem wszczepu oraz jednocześnie był na tyle wytrzymały, aby umożliwić

chirurgiczne postępowania podczas implantacji. O ile jest to ważne w przypadku wszystkich

tkanek ciała, jednak może stanowić wyzwanie w przypadku implantacji do układu sercowo-

naczyniowego oraz kostnego. Produkcja rusztowań z adekwatnymi właściwościami

mechanicznymi jest jedną z najtrudniejszych zadań w przypadku kości i chrząstki. Dla tych

tkanek, implantowane podłoże musi charakteryzować się odpowiednią odpornością

mechaniczną dla zachowania funkcjonalności przez cały okres od wszczepienia, aż do

całkowitego zastąpienia biomateriału przez tkankę. Kolejny problem stanowi fakt, iż

możliwości regeneracyjne organizmu zmieniają się wraz z wiekiem, na przykład u osób

młodych złamania goją się w około sześć tygodni, natomiast pełne zdolności mechaniczne

kości wracają po około roku, kiedy w przypadku osób starszych tempo samonaprawy kości

jest znacznie spowolnione. To też musi być brane pod uwagę w przypadku projektowania

skofoldów aplikowanych w ortopedii.

14

Jednak, wraz z rozwojem dziedziny można dojść do wniosku, iż zbyt wiele uwagi

poświęcono na próby skonstruowania rusztowań z podobnymi właściwościami

mechanicznymi do kości i chrząstki. Wiele materiałów zostało wyprodukowanych z dobrymi

parametrami mechanicznymi jednak kosztem zmniejszonej porowatości, co skutkowało

fiaskiem w momencie wszczepienia z powodu niewystarczającej zdolności do unaczynienia,

mimo iż materiał wykazywał potencjał w przypadku badań in vitro[1].

Oczywistym zdaje się być fakt, iż równowaga pomiędzy własnościami

mechanicznymi i porowatością umożliwiającą infiltracje komórkową i unaczynienie jest

kluczem do sukcesu każdego rusztowania [1].

3.4. Architektura rusztowań

Ogólnie znanym w materiałoznawstwie i inżynierii jest fakt, iż organizacja

mikrostruktury materiału w sposób kluczowy określa jego właściwości. Podobnie, tkanki

biologiczne charakteryzują się unikalną architekturą odpowiadającymi za określone ich

funkcje [8].

Architektura rusztowań w inżynierii tkankowej ma decydujące znaczenie. Mikrostruktura

podłoży tkankowych powinna charakteryzować się dużą porowatością otwartą, aby zapewnić

komórkom możliwość swobodnego przemieszczania się oraz dyfuzję składników

odżywczych, musi również zapewniać warunki do wytworzenia macierzy

zewnątrzkomórkowej. Co więcej, struktura połączonych ze sobą porów jest konieczna w celu

umożliwienia wydostania się na zewnątrz struktury produktów przemiany materii komórki

oraz produktów degradacji samego rusztowania, aby mogły opuścić organizm człowieka nie

kontaktując się z otaczającymi narządami.

Kwestia degradującego rdzenia wynikającego z niewystarczającego unaczynienia oraz z

usuwania odpadów od środka konstrukcji tkankowej jest jednym z głównych problemów w

dziedzinie inżynierii tkankowej. Innym kluczowym zagadnieniem architektury konstrukcji

jest średnia wielkość porów rusztowania. Komórki oddziaływują z rusztowaniami przede

wszystkim poprzez grupy chemiczne (ligandy) ma powierzchni materiału. Rusztowania

wytwarzana z materiałów budujących naturalną matrycę zewnątrzkomórkową (np. kolagenu)

naturalnie wytwarzają na powierzchni ligandy w postaci sekwencji wiążących Arg-Gly-Asp

(Rys.1), zaś rusztowania wykonane z syntetyczne biomateriałów mogą wymagać celowego

przyłączenia tych ligandów, na przykład poprzez adsorpcję białek. Wpływ na gęstość

upakowania ligandów ma specyficzna powierzchnia właściwa , czyli na porowate

powierzchnia do której mogą przylegać komórki. Zależy to od wartości średniej wielkości

porów rusztowania.

15

Zatem pory muszą być wystarczająco duże, aby komórki mogły migrować do

struktury, gdzie ostatecznie zostają związane do ligandów w obrębie rusztowania, ale

jednocześnie na tyle małe aby zdołały utworzyć dostatecznie dużą powierzchnię właściwą, co

prowadzi do minimalnej gęstości upakowania ligandów co pozwala na sprawne wiązanie

krytycznej ilości komórek do skafoldu. Dlatego też dla każdego rusztowania istnieje

krytyczny zakres rozmiaru porów, który może się różnić w zależności od typu komórek

wiązanych do podłoża oraz rodzaju tkanki jaka nas interesuje[1].

Rys.1 Mikrofotografia konfokalna pokazujące osteoblasty (zielony) przyłączone do

wysoce porowatego rusztowania kolagen-GAG (czerwony). Mechanizm dzięki któremu

komórki przyłączają się do biomateriałów i rusztowań jest bardzo ważne dla udanej

regeneracji komórki [1].

3.5. Technologia wytwarzania

W celu zapewnienia określonemu podłożu przeznaczonego dla zastosowań inżynierii

tkankowej, klinicznej i ekonomicznej realności wykonania, powinna być ona tania oraz

stosunkowo szybka i łatwa w produkcji. Innym ważnym czynnikiem jest określenie sposobu

w jakim produkt będzie dostarczany i udostępniany lekarzowi. Pozwala to ustalić w jaki

sposób skafold powinien być przechowywany. Lekarze zazwyczaj preferują produkty gotowe

do użycia od razu po wyjęciu z opakowania bez potrzeby stosowania dodatkowych zabiegów

chirurgicznych w celu wyhodowania komórek in vitro kilka tygodni przed implantacją.

Jednak, w niektórych typach tkanek nie jest to możliwe i hodowle in vitro przed implantacją

są konieczne[1].

Ostatecznym kryterium w projektowaniu rusztowań dla inżynierii tkankowej i taki, od

którego zależą wszystkie wymienione powyżej, jest wybór odpowiedniego biomateriału z

jakiego skafold powinien być wykonany.

16

17

II. Materiały wykorzystywane w inżynierii tkankowej

Wiele rodzajów biomateriałów może być używanych do produkcji porowatych rusztowań

dla inżynierii tkankowej, pod warunkiem , że technologia ich przetwarzania jest zgodna z

właściwościami biomateriału. Ogólnie, biomateriały używane do wytwarzania porowatych

rusztowań możemy podzielić zależnie od ich źródła na biomateriały naturalne i syntetyczne.

Naturalnie występujące biomateriały można uzyskać z ich naturalnych źródeł, przetwarzając

następnie w celu uzyskania porowatych rusztowań. Materiały te mogą występować w swojej

naturalnej postaci, jak na przykład ECM (matryca zewnątrzkomórkowa) w postaci

przeszczepów kseno- lub allogenicznych lub mogą też być w formie naturalnych

nieorganicznych ceramik (np. fosforany wapnia) i polimerów organicznych takich jak białka,

polisacharydy. Naturalne materiały zazwyczaj charakteryzują się doskonałą

biokompatybilnością, dzięki czemu komórki mogą przyczepiać się i wzrastać na nich z bardzo

dużą efektywnością. Istnieje jednak problem w przypadku naturalnych biomateriałów, a

mianowicie ich ograniczona stabilność fizyczna i chemiczna przez co mogą one nie być

odpowiednie dla niektórych zastosowań inżynierii tkankowej. Jest to powód który skłonił

naukowców używających naturalnych biomateriałów do opracowania technologii

poprawiających ich właściwości mechaniczne oraz stabilność kształtu. Przykładami są

chociażby kompozyty z syntetycznymi materiałami. Kolejnym problemem jest odpowiedź

immunologiczna organizmu, ponieważ naturalne biomateriały pochodzące z przeszczepów

mogą być odrzucone przez gospodarza.

Biomateriały syntetyczne generalnie mogą być podzielone na materiały nieorganiczne,

takie jak bioszkła, oraz organiczne, takie jak syntetyczne polimery. Powszechnie uważa się,

że syntetyczne biomateriały mają stabilniejsze fizyczne i mechaniczne właściwości oraz mogą

być używane w przypadku zarówno tkanek twardych jak i miękkich. Niemniej jednak, dla

materiałów syntetycznych biokompatybilność staje się poważnym problemem, ponieważ

komórki mogą mieć trudności zarówno w zaadherowaniu się jak i wzroście na tych

materiałach. Dlatego też zostało opracowanych wiele sposobów modyfikacji powierzchni

oraz właściwości w celu zwiększenia biokompatybilności. Przykłady obejmują inżynierię

laserową i pokrywanie naturalnymi materiałami biologicznymi, takimi jak kolagen. Wraz z

rozwojem materiałów kompozytowych ilość kombinacji materiałów mogących tworzyć

porowate skafoldy okazała się być ogromna [9].

18

Rys. 2 a-c. Fotografie z mikroskopu skaningowego przedstawiające trzy klasy biomateriałów.

a - Naturalny biomateriał (gąbka kolagenowa), b - macierz zewnątrzkomórkowa, c –polimer

syntetyczny [10].

1. Ceramika

Ceramika stosowana w celach biomedycznych jest klasyfikowana jako ceramika

bioinertna, bioaktywna lub bioresorbowalna. Do ceramiki bioinertnej możemy zaliczyć takie

materiały jak tlenek glinu i cyrkonu, natomiast ceramikę bioaktywną stanowią fosforany

wapnia (HA, TCP i BCP), bioszkła oraz szkło-ceramika. Ceramika bioresorbowalna to przede

wszystkim α-TCP, BCP oraz niektóre szkła fosforanowe. Dodatkowo ceramikę bioaktywną

można podzielić na osteokonduktywną (wspiera wzrost kości) oraz osteoinduktywną

(stymuluje wzrost kości).

Bioceramika na bazie fosforanu wapnia, bioszkła oraz materiały szkło-ceramiczne są

powszechnie stosowane jako podłoża dla wzrostu tkanki kostnej i mają zbliżony skład

chemiczny i/lub fazowy do mineralnej fazy kości [11].

Hydroksyapatyt (HA) oraz fosforan trójwapniowy (TCP) to dwa powszechnie

wykorzystywane materiały ceramiczne w inżynierii tkankowej. TCP jest stosowany jako

składnik ulegającym resorpcji rusztowaniom, podczas gdy HA, który nie jest bioresorbowalny

oraz ma charakter osteokondukcyjny, jest zwykle używany do pokrywania implantów

biomedycznych co wzmaga regeneracje kości integrując tym samym implant z otaczającą go

tkanką, a także w postaci granul i proszków do wypełniania ubytków kostnych. Z tego

powodu HA zyskał dużą popularność jako materiał, z którego wytwarza się rusztowania dla

inżynierii tkankowej [12].

19

1.1. Szkła wytwarzane metodą topienia

Bioaktywne szkła oraz materiały szkło-ceramiczne powstają w procesie topnienia w

temperaturach przekraczających 1500°C [13]. Badania nad materiałami bioaktywnymi

rozpoczęło odkrycie, iż szkła krzemiankowe o określonym składzie mają zdolność wiązania

się z kością.

Pierwszym bioaktywnym szkłem wytworzonym techniką topienia było Bioglass®

45S5, wprowadzone w 1971 roku przez Hencha i wciąż pozostaje jednym z najpowszechniej

wykorzystywanym oraz najbardziej obiecującym bioszkłem w zastosowaniach klinicznych.

Wytwarzane jest ono na drodze fuzji i ma bardzo specyficzny skład : 45% SiO2, 24.5% CaO,

24.5% Na2O, 6% P2O5 (w % wagowych)[14].

W późniejszych latach prowadzono badania nad poprawą właściwości szkła poprzez

zmianę jego składu procentowego co wykazało, iż dodatki tlenków metali mogą zmieniać

właściwości szkła. Zawartość krzemionki dla bioszkieł topionych nie może jednak

przekraczać 60 %, gdyż powoduje to spadek bioaktywności materiału.

1.2. Szkła żelowe

Prace nad materiałami bioaktywnymi pozwoliły na wysunięcie wniosku mówiącego o

tym, iż nie tylko skład fazowy czy chemiczny odpowiada za właściwości materiału, ale

również metoda jego wytwarzania. W przypadku szkieł bioaktywnych zaowocowało to

rozwojem nowej metody produkcji jaką jest metoda zol-żel. (Rys.3)

Rys. 3 Schemat przygotowania roztworów wyjściowych do syntezy biomateriałów A2, T2, S2[13].

20

Wyższość syntezy zol-żel nad tradycyjną metodą topienia polega na możliwości

uzyskania szkieł o większym stopniu rozwinięcia powierzchni (są wysoce porowate) i

zachowaniu powierzchniowych grup silanolowych, co skutkuje większą bioaktywnością

biomateriału, otrzymane tą metodą szkła mogą charakteryzować się również większą

resorbowalnością w organizmie[13].

Metoda ta charakteryzuje się całkowitym pominięciem etapu ogniowego i opiera się

głównie na reakcjach zachodzących równolegle w fazie ciekłej – hydrolizie i polikondensacji.

Warunkują one przejście roztworu wyjściowego w żel, który w wyniku obróbki termicznej w

temperaturach dużo niższych, niż ma to miejsce w przypadku szkieł topionych, może przejść

w szkło. Głównymi surowcami są zwykle alkoholany oraz estry, a także kombinacje

związków organicznych i nieorganicznych (azotany, chlorki). Są one prekursorami

pierwiastków szkłotwórczych oraz modyfikujących.

Rys. 4 Schemat otrzymywania proszków i materiałów spiekanych pochodzenia

żelowego [13].

21

2. Polimery

2.1. Polimery syntetyczne

Kontrolowane właściwości mechaniczne, fizyczne i biologiczne polimerów

syntetycznych czynią je materiałami bardziej przewidywalnymi niż polimery ze źródeł

naturalnych. Ważna zaletą wynikającą ze stosowania syntetycznych polimerów jest

możliwość zmieniania właściwości materiału poprzez dostosowywanie proporcji jednostek

monomerowych oraz przez przyłączanie do łańcuchów odpowiednich grup chemicznych

( np. peptydów RGD, rozpoznawalnych przez komórki). Ponadto, szybkość i produkty

degradacji mogą być kontrolowane przez odpowiedni wybór segmentów, dzięki czemu

możemy uzyskać w wyniku rozkładu składniki metabolizowane do produktów

nieszkodliwych. Wśród wielu polimerów syntetycznych stosowanych w inżynierii tkankowej

najpowszechniejszymi jest kwas polimlekowy (PLA - polilaktyd), kwas poliglikolowy (PGA

– poliglikolid)i ich kopolimery – Poli(laktyd-ko-glikolid) – PLGA. Te polimery degradują w

wyniku mechanizmów hydrolitycznych i są często używane, ponieważ produkty ich

degradacji mogą być usunięte z organizmu jako dwutlenek węgla i woda. Jednak ich wadą

jest to, iż zakwaszają środowisko w obszarze implantacji w wyniku rozkładu do kwaśnych

produktów.

Polikaprolakton (PCL) jest degradowany na drodze hydrolizy w warunkach

fizjologicznych (rys.3). Ponadto, jest on rozkładany enzymatycznie, a otrzymane fragmenty o

niskiej masie cząsteczkowej są najprawdopodobniej pochłaniane przez makrofagi i trawione

wewnątrz komórki. PCL jest najczęściej stosowany jako nośnik leku, ponieważ ma mniejszą

szybkość degradacji niż PGA i PLA. Jednak ostatnio, coraz częściej znajduje zastosowanie w

inżynierii tkankowej [15] .

Rys. 5 Skafold wykonany z kompozytu polikaprolakton/fosforan wapnia[16].

Tradycyjnie poliuretany były stosowane w dziedzinach biomedycyny jako materiały

przeznaczone do kontaktu z krwią oraz były używane w formie niedegradujących powłok. 22

Ostatnio zyskały one biodegradowalność dzięki kombinacji z degradowalnymi

polimerami takimi jak PLA i są stosowane w inżynierii tkankowej i przeznaczone dla tkanek

miękkich [17].

Rys. 6 Struktury chemiczne biodegradowalnych polimerów syntetycznych stosowane

zręby w inżynierii tkankowej[12].

Glikol polietylenowy (PEG) jest biozgodnym, nietoksycznym, rozpuszczalnym w

wodzie polimerem, który występuje w postaci cieczy w niskich temperaturach, natomiast w

temperaturze 37° C przyjmuje formę elastycznego żelu[18]. Kopolimery bazujące na PEG są

używane jako wstrzykiwane rusztowania kości oraz jako nośniki leków.

2.2. Polimery naturalne

Polimery naturalne stanowią alternatywę dla układów polimerowych syntetycznych,

ponieważ mają one zdolność imitowania matrycy zewnątrzkomórkowej tkanek. Alginian i

chitozan są to dwa naturalne polisacharydy, które nie występują w organizmie człowieka, ale

znalazłe swoje zastosowanie w inżynierii tkankowej, ponieważ są strukturalnie podobne do

glikozaminoglikanów (GAG) występujących w naturalnych matrycach

zewnątrzkomórkowych tkanek, na przykład skóry, kości i naczyń krwionośnych.

Alginian pochodzi z wodorostów i jest atrakcyjnym materiałem ze względu na niską

toksyczność, dużą rozpuszczalność w wodzie oraz prostym mechanizmem żelowania w

obecności jonów wapniowych. Hydrożele alginianowe stosuje w projektowaniu podłoży dla

regeneracji chrząstki [17], wątroby [18], oraz w produkcji opatrunków[21] .

Chitozan jest pochodną naturalnie występującej chityny, która znajduje się w

szkieletach skorupiaków. Ma niską toksyczność i jest biokompatybilny. Skafoldy zbudowane

z chitozanu są wykorzystywane w regeneracji skóry i kości [22].

23

Na podstawie wcześniej podanego znaczenia GAG w stymulowaniu normalnego

wzrostu tkanek, można dojść do prostego wniosku, iż zastosowanie glikozaminoglikanów

jako składników rusztowań dla inżynierii tkankowej wydaje się być dobrym pomysłem.

Kwas hialuronowy jest jednym z największych elementów GAG występującym w

naturalnej matrycy zewnątrzkomórkowej wszystkich tkanek miękkich oraz w mazi

stawowej[23]. Stosowanie czystego kwasu hialuronowego w inżynierii tkankowej jest

ograniczone z powodu jego dużej rozpuszczalności w wodzie i szybkiej degradacji w

środowisku biologicznym. Jednakże, może być on chemicznie modyfikowany w celu

uzyskania bardziej hydrofobowych cząsteczek zmniejszając w ten sposób jego

rozpuszczalność w wodzie. Rusztowania z kwasu hialuronowego są znane jako biozgodne

oraz komórki chętnie adhezują i prolifeują na tym materiale. Kwas hialuronowy odgrywa

również ważną rolę w preparatach usprawniających gojenie się ran oraz jako nośnik

leków[12].

Białka strukturalne, takie jak fibryna mogą być również wykorzystywane w

zastosowaniach inżynierii tkankowej. Fibryna może być stosowana jako naturalny materiał

wspomagający gojenie się ran oraz znalazł swoją rolę w chirurgii jako spoiwa i środek

wiążący. Może być produkowana z własnej krwi pacjenta i użyta jako autologiczny skafold.

Jednakże trwałość tego materiału jest ograniczona, ponieważ łatwo ulega on rozkładowi

(używa się apronityny – inhibitora białkowego, w celu kontroli stopnia degradacji fibryny).

Hydrożele fibrynowe stosowano do inżynierii tkankowej jako podłoża dla komórek mięśni

gładkich i chondrocytów[24,25] .

Alternatywnie żelatynę (pochodną kolagenu, która jest wytwarzana przez zmianę

struktury spiralnej cząsteczki kolagenu, łamiąc ją do cząsteczek pojedynczych nici) używano

w celu regeneracji tkanki chrzęstnej[26]. Jednakże jedną z głównych wad żelatyny jest jej

słaba wytrzymałość mechaniczna.

Kolagen, główny składnik macierzy międzykomórkowej tkanki łącznej ssaków,

znalazł zastosowanie w dziedzinach inżynierii tkankowej jako składnik substytutów skóry,

rusztowań dla kości, chrząstek, zastosowaniach w regeneracji układu naczyniowego oraz w

systemach dostarczania leków[27]. Jak wszystkie wcześniej wymienione polimery naturalne,

żele kolagenowe również charakteryzują się słabymi właściwościami mechanicznymi.

Jednakże, mogą być one ulepszane przez zastosowanie fizycznego i chemicznego

sieciowania. Fizyczne metody sieciowania obejmują promieniowanie UV oraz zabiegi

dehydrotermalne, podczas gdy środki sieciujące, takie jak glutaraldehyd i karbodiimidy

(EDAC) mogą być stosowane do wytwarzania chemicznie usieciowanych hydrożeli

kolagenowych o polepszonych właściwościach mechanicznych[12].

24

Rys. 7 Struktury chemiczne niektórych polimerów naturalnych stosowane jako rusztowania w

zastosowaniach inżynierii tkankowej [12].

3. Kompozyty

Ze względu na pewne problemy związane ze stosowaniem rusztowań

syntetyzowanych z materiałów jednofazowych (np. słabych właściwości mechanicznych i

biokompatybilności, odpowiednio polimerów naturalnych i syntetycznych oraz słabą zdolność

biodegradacji bioceramiki), naukowcy opracowali rusztowania kompozytowe składające się z

dwóch lub większej ilości faz w celu wykorzystania korzystnych właściwości każdego ze

składników. Na przykład zaczęto używać kompozytu polimer/kompozyty ceramiczne z

PLGA i hydroksyapatytu w inżynierii tkankowej [28].

Jednakże, chociaż złożone rusztowania wykazują pewne obiecujące cechy szczególnie jako

wszczepy do kości lub chrząstki, w przypadku ,gdy każdy z nich składa się z co najmniej

jednej fazy, która nie występuje naturalnie w organizmie skutkuje to problemami zarówno z

biokompatybilnością jak i biodegradacją.

25

Tabela 1 podsumowuje różne rodzaje biomateriałów opisanych powyżej i przeznaczonych do

użytku jako rusztowań w inżynierii tkankowej oraz wymienia zalety i wady każdego z nich.

Tab. 1 Właściwości, zalety i wady biomateriałów stosowanych jako rusztowania w inżynierii

tkankowej [12].

26

27

Bioceramika Właściwości Zalety WadyHydroksyapatyt (HAp)

Naturalny składnik mineralnej części kości

Biokompatybilny, Osteoinduktywny

Nieresorbowalny, Słabe właściwości mechaniczne

Fosforan Wapnia (TCP)

W składzie podobny do mineralnej części kości

Biokompatybilny, Biodegradowalny

Słabe właściwości mechaniczne

Polimery syntetycznePolilaktyd, Poliglikoid i ich kopolimery

Właściwości mechaniczne oraz związane z degradacją mogą być modyfikowane poprzez zmianę segmentów polimerów

Biokompatybilne Produkty degradacji (CO2 i H2O) zakwaszają środowisko

Glikol polietylenowy

Używany jako wstrzykiwalny żel, właściwości mechaniczne oraz związane z degradacją mogą być modyfikowane poprzez zmianę segmentów polimerów

Biokompatybilny, Hydrofilowy

Słaba adhezja komórek

Polimery naturalneKolagen Składnik naturalnej matrycy

zewnątrzkomórkowej (ECM)Biokompatybilny, Dobra zgdoność tkankowa

Słabe właściwości mechaniczne

Kwas Hialuronowy

Odgrywa ważną rolę w procesie gojenia ran, Składnik naturalnej matrycy zewnątrzkomórkowej (ECM)

Biokompatybilny, Dobra zgdoność tkankowa

Słabe właściwości mechaniczne

Alginian Otrzymywany z alg, Strukturalnie podobny do glikozoaminoglikanów (GAG)

Biokompatybilny, Łatwe metody żelowania

Słabe właściwości mechaniczne

KompozytyPolimer - Ceramika

Naturalne bądź syntetyczne polimery w połączeniu z ceramiką, Często używane do regeneracji tkanki kostnej

Zdolność do mechanicznego wiązania, degradacji, posiadają właściwości biologiczne

Zrezygnowanie z "najlepszych" cech poszczególnych materiałów na rzecz ogólnych cech skafoldu

Polimer - Polimer

Możliwe kombinacje syntetyczny - syntetyczny, naturalny - naturalny, syntetyczny - naturalny

Zdolność do mechanicznego wiązania, degradacji, posiadają właściwości biologiczne

Zrezygnowanie z "najlepszych" cech poszczególnych materiałów na rzecz ogólnych cech skafoldu

III. Metody wytwarzania porowatych rusztowań dla inżynierii

tkankowej

Ogólnie rzecz biorąc technologie produkcji skafoldów możemy podzielić na procesy,

których używane są porogeny, metody rapid prototyping oraz techniki z użyciem tkanych lub

nietkanych włókien. W pierwszej kategorii ciała stałe lub rozpuszczone w rozpuszczalnikach

są sprzężone z porogenem, którym mogą być gazy, takie jak dwutlenek węgla, ciecze takie

jak woda lub substancje stałe jak parafina. Mieszanki są przetwarzane, następnie formowane

lub wyciskane. Porogeny są usuwane po procesach produkcyjnych z użyciem metod takich

jak, sublimacja, wymywanie, parowanie lub topnienie w celu otrzymania porowatej struktury

skafoldu. Przykładowymi metodami działającymi na tej zasadzie są: formowanie przez

zanurzenie, odlewanie z wymywaniem porogenu, spienianie gazem, liofilizacja oraz rozdział

faz[29]. W drugiej kategorii, hierarchiczne struktury porowate są wytwarzane poprzez kolejne

dostawy materiałów i/lub energii potrzebnej do łączenia tych materiałów w

zaprogramowanych punktach w przestrzeni. Niektóre z tych technologie, takie jak spiekanie

laserowe, stereolitografia oraz drukowanie 3D zależą od precyzyjnego dostarczenia światła

lub energii cieplnej w systemie skanera do punktów w przestrzeni materialnej podłoża, tak

aby połączyć materiały w celu wytworzenia struktury stałej. Inne, takie jak drukowanie

polegają na jednoczesnym dostarczaniu materiałów stałych i wymiennych materiałów

pomocniczych technologią layer-by-layer (warstwa po warstwie) [30]. W trzeciej kategorii,

tkane lub nietkane struktury włókniste, mogą być ustawiane w sztos i łączone ze sobą za

pomocą energii cieplnej lub klejów, w ten sposób tworząc porowatą strukturę technikami

takimi jak formowanie włókien, lub też włókna mogą być wytwarzane techniką

elektroprzędzenia,w której roztwór polimeru przepuszczany jest zwykle przez dyszę

przędzalniczą, na której utrzymuje się wysokie napięcie. Siły odpychania elektrostatycznego

powodują wypuszczenie cienkiej, włóknistej wiązki. Następnie włókna te gromadzone są na

odbieralniku, który uziemiony lub naładowany przeciwnie gromadzi je zamieniając się w

wypełnioną porami sieć[29].

1. Konwencjonalne techniki produkcji rusztowań dla inżynierii

tkankowej

1.1. Odlewanie z roztworu z wymywaniem porogenu

Techniki odlewania z roztworu w wymywaniem cząstek porotwórczych polegają na

stosowaniu roztworu polimeru zmieszanego z cząstkami porogenu o odpowiadającej nam

średnicy. Następnie rozpuszczalnik zostaje odparowany pozostawiając matrycę polimerową z

zatopionymi w niej cząstkami porogenu.

28

W celu pozbycia się porogenu podłoże zanurzamy w roztworze stanowiącym

rozpuszczalnik jedynie dla cząstek porotwórczych (np. w wodzie jeżeli nasz porogen stanowił

NaCl), w celu wymycia porogenu i wytworzenia porowatej struktury[31].

Metoda ta stwarza możliwość wytworzenia silnie porowatych rusztowań, z

porowatością na poziomie 93% i średniej średnicy porów aż do 500 µm.

Rys.8 Schemat techniki odlewania z roztworu z wymywaniem porogenu [32].

1.2 Spienianie gazem

Podczas procesu spieniania gazem, uformowane wcześniej polimery biodegradowalne

sprężane są, w warunkach wysokiego ciśnienia, gazem spieniającym, takim jak dwutlenek

węgla, azotu. Powoduje to zarodkowanie oraz wzrost pęcherzyków gazowych w polimerze o

wielkości w zakresie od 100 do 500 mikrometrów.

Zaletą tej techniki jest brak konieczności stosowania substancji porogennych. Główną

wadę natomiast stanowi brak połączeń między wytworzonymi pęcherzykami oraz

nieporowata powierzchnia zewnętrzna [33].

Rys. 9 Schemat metody spieniania gazem [32].

29

1.3. Separacja faz

Podczas procesu separacji faz, roztwór polimerowy jest ochłodzony i przechodzi

rozdział tworząc dwie fazy. Separację fazową można wywołać w dwojaki sposób:

ochładzając roztwór polimeru lub stosując nierozpuszczalnik dla polimeru. Pierwszą z nich

stanowi fazy bogata w polimer, natomiast drugą jest faza uboga w polimer. Faza bogata w

polimer krzepnie, zaś faza uboga w polimer jest usuwana (na przykład w drodze sublimacji)

pozostawiając silnie porowate podłoże polimerowe[34]. Mikro- i makrostruktura powstałych

skafoldów mogą być modyfikowane poprzez zmiany parametrów procesu, takich jak stężenie

polimeru, czy temperaturę mrożenia.

Proces prowadzi się w niskich temperaturach, dzięki czemu na etapie wytwarzania

można włączać do struktury materiału aktywne biologicznie cząstki. Technika ta umożliwia

formowanie włóknistych nanostruktur , które naśladują naturalną architekturę macierzy

zewnątrzkomórkowej oraz zapewnia lepsza warunki dla przyłączenia się i funkcjonowania

komórek [35].

Rys. 10 Schemat separacji faz [32].

1.4. Formowanie ze stopu

Formowanie ze stopu polega na wypełnianiu formy sproszkowanym polimerem i

składnikiem porogennym, a następnie ogrzewaniu do temperatury powyżej temperatury

zeszklenia polimeru, przy jednoczesnym zastosowaniu nacisku na mieszaninę [36]. W trakcie

procesu wytwarzanie, surowe materiały zwiążą się ze sobą tworząc rusztowanie z

zaprojektowanym specyficznym kształtem wewnętrznym. Po ostygnięciu materiału i

usunięciu go z formy, następnie substancja porotwórcza jest wypłukiwana, a powstałe

porowate rusztowanie suszone.

Proces formowania ze stopu z wypłukiwaniem porogenu jest to proces pozwalający na

niezależną regulacje morfologii i kształtu rusztowania. Dodatkowo nie zachodzi potrzeba

stosowania rozpuszczalników. Jednak wadami tej metody jest możliwość pozostania

szczątkowych ilości porogenu w skafoldzie oraz wysokie temperatury stosowane w trakcie

wytwarzania struktury, które uniemożliwiają przyłączenie bioaktywnych molekuł na etapie

wytwarzania [37].

30

Rys. 11 Schematycznie przedstawiony proces formowania ze stopu[32].

2. Zaawansowane techniki produkcji rusztowań dla inżynierii

tkankowej

2.1. Metody szybkiego wytwarzania (Rapid Prototyping)

Jako alternatywa dla konwencjonalnych metod wytwarzania skafoldów ,

wprowadzono grupę metod opartych na technikach Rapid Prototyping (RP). Techniki oparte

na RP, bazujące na komputerowych technologiach CAM/CAD , ułatwiają kontrolę nad

kluczowymi właściwościami rusztowań, takich jak architektura [38, 39].

Trzy podstawowe systemy typu RP: bazujące na cieczy, ciele stałym, oraz proszku są

oparte na właściwościach różnych materiałów stosowanych do produkcji rusztowań dla

inżynierii tkankowej. Wyróżniamy podstawowe techniki RP stosowane między innymi do

produkcji skafoldów : selektywnego spiekania laserowego (SLS), osadzania topionego

materiału (fused deposition modeling, FDM), drukowania trójwymiarowego (3D). Wybór

materiałów do technik RP obejmuje różne polimery, ceramiki i metale. Ostatnio techniki RP

wykazały również możliwość osadzania na rusztowaniach żywych komórek [40, 41] oraz

czynników wzrostu [42] podczas procesu wytwarzania, co w efekcie udowodniło ich

przydatność w tworzeniu biomimetycznych podłoży tkankowych.

2.2. Elektroprzędzenie

Elektroprzędzenie jest to bardzo wszechstronna metoda, umożliwiająca wytwarzanie

włókien o średnicach rzędu mikro- i nanometrów. Bazuje ona na wykorzystaniu ładunków

elektrycznych w celu wytworzenia włókien. W ciągu ostatnich lat , istotne modyfikacje tej

techniki pozwoliły na stworzenie rusztowań z różnych materiałów, a co za tym idzie

technologia ta zyskała dużą popularność w badaniach inżynierii tkankowej. Architektury

nanowłókniste znane są ze swoich możliwości modulowania właściwości w celu wpływania

na zachowanie komórek. Struktura nanowłóknista może pobudzać przyczepianie i proliferacje

komórek w większym stopniu niż w przypadku struktur mikroporowatych (Rys. 12).

31

Rusztowania z nanowłókien mają większe powierzchnie do adsorpcji białek, stwarzając

więcej punktów wiązania dla receptorów błony komórkowej [43].

Techniki elektroprzędzenia były szeroko wykorzystywane do produkcji porowatych

struktur włóknistych, które mogą naśladować budowę oraz funkcje biologiczne naturalnej

macierzy zewnątrzkomórkowej [44]. Dzięki tej technologii możliwe jest generowanie

włókien o średnicy w zakresie od 2 nm do kilku mikrometrów, z zastosowaniem roztworów

zarówno polimerów syntetycznych jak i naturalnych. Wytwarzane tą metodą rusztowania

charakteryzują się bardzo małą wielkością porów oraz dużym stosunku powierzchni do

objętości[45].

Rys. 12 Wpływ architektury rusztowań na ich właściwości wiążące komórki. (zmienione z [43]).

32

33

Część doświadczalna

34

IV. Charakterystyka materiałów wyjściowych

1. Poli( -kaprolakton)ε

Jako osnowy dla wytwarzanych kompozytów użyto Poli(ε-kaprolaktonu) (PCL) o

masie cząsteczkowej Mn = 80 kDa i polidyspersyjności Mw/Mn < 2. Miał on postać białych,

twardych i nieregularnych granulek o zróżnicowanej wielkości (rys.13).

Rys. 13 Obraz makroskopowy PCL 80 kDa.

2. Bioszkła otrzymywane w syntezie zol-żel

Do wytworzenia kompozytów zastosowano dwa rodzaje bioaktywnych szkieł

żelowych A2 - wysokowapniowe (rys. 14b) i S2 - wysokokrzemionkowe (rys.14a). Użyte w

badaniach oba rodzaje szkieł zostały otrzymane metodą zol – żel, zgodnie z przedstawionym

w części literaturowej schematem otrzymywanie. Ich skład tlenkowy przedstawiono w

Tabeli 2.

Tab. 2 Skład chemiczny bioszkieł A2 i S2.

Tlenek Stężenie [% mol.]

A2 S2

SiO2 40 80

CaO 54 16

P2O5 6 435

Rys. 14 Obraz makroskopowy bioszkła żelowego S2 (a) oraz A2 (b).

3. Rodzaje porogenów

Celem badania było uzyskanie porowatej struktury wytwarzanych materiałów, aby to

osiągnąć użyto dwóch rodzajów porogenów: sacharozy oraz chlorku sodu (NaCl). Odczynniki

zostały uprzednio odpowiednio przygotowane, aby można było uzyskać odpowiednią

wielkość porów. Potrzebna do naszych celów frakcja ziarnowa mieściła się w zakresie 315 –

400 µm. Zarówno chlorek sodu jak i sacharozę wstępnie rozdrobniono w moździerzu, a

następnie przesiano używając zestawu sit.

36

V. Otrzymywanie porowatego kompozytu PCL/bioszkło żelowe

W początkowej fazie procesu otrzymywania kompozytów sporządzono roztwory PCL

o stężeniu 5% wt/vol z rozpuszczalnikiem, którym w naszym przypadku był 1,4-Dioksan

(DIOX). Próbka kontrolna wykonana została jedynie z roztworu polimeru z

rozpuszczalnikiem oraz odpowiednich porogenów, natomiast przygotowanie próbek

kompozytowych polegało dodatkowo na zmodyfikowaniu właściwości polikaprolaktonu

dodatkiem szkieł bioaktywnych A2 i S2. Stężenie polimeru w każdym roztworze wyjściowym

wynosiło 5% wt/vol. Cząstki szkieł A2 i S2 pochodzenia żelowego dodawano do roztworów

w ilości 21% vol. Każdy z wytworzonych roztworów (PCL+DIOX, PCL/21S2+DIOX,

PCL/21A2+DIOX) podzielono w następnej kolejności na pół ze względu na dwojakość

używanych w późniejszych etapach porogenów.

Odczynniki (PCL, A2, S2) odważano na szalkach Petri’ego, a następnie umieszczane

w szklanych butelkach z nakrętką, do których za pomocą cylindra miarowego pod

dygestorium dodawano lotny rozpuszczalnik. Po umieszczeniu w butelkach teflonowych

elementów mieszających, zostały one szczelnie zamknięte praz umieszczone na mieszadłach

magnetycznych. Proces mieszania roztworów trwał 24 h.

Następnym etapem było dodawanie do każdego z roztworów przypisanego mu

porogenu w ilościach , która miała zapewnić porowatość materiałów na poziomie 85 %.

Proces ten dokonywał się na szalkach Petri’ego za pomocą bagietki. Mieszanie było

długotrwałe, miało bowiem na celu odparowanie lotnego rozpuszczalnika (DIOX) w celu

uzyskania gęstej pasty. Opisane wyżej procesy zostały schematycznie przedstawione na rys.

15 i 16. Po uzyskaniu odpowiedniej konsystencji, każdą z próbek umieszczano w

przygotowanych wcześniej polietylenowych cylindrycznych formach. W tabeli 3

przedstawiono oznaczenia próbek wraz z parametrami ich wytwarzania.

Tab. 3 Oznaczenie próbek wraz z parametrami otrzymywania.

Próbka Porogen Modyfikacja

PCL/DIOX/NaCl NaCl -

PCL/DIOX/Sach. sacharoza -

PCL/DIOX/21A2/NaCl NaCl szkło A2

PCL/DIOX/21A2/Sach. sacharoza szkło A2

PCL/DIOX/21S2/NaCl NaCl szkło S2

PCl/DIOX/21S2/Sach. sacharoza szkło S2

37

W ten sposób po całkowitym odparowaniu rozpuszczalnika metodą suszenia

próżniowego otrzymano walcowe kształtki. Po wyciągnięciu materiałów z form pocięto go

następnie na próbki o grubości około 3 mm, które następnie wielokrotnie płukano w wodzie

destylowanej z pomocą mieszadła magnetycznego w celu wypłukania porogenu do uzyskania

przewodności właściwej wody <10 µS/cm, a następnie ponownie suszono w temp. 37 °C

przygotowując ostatecznie do badań.

Rys. 15 Schemat przygotowywania próbek polimerowych.

38

Rys. 16 Schemat przygotowywanie próbek kompozytowych.

Ostatecznie otrzymano 6 rodzajów porowatych materiałów polimerowych :

PCL/DIOX/NaCl

PCL/DIOX/Sach.

PCL/A2/DIOX/NaCl

PCL/A2/DIOX/Sach.

PCL/S2/DIOX/NaCl

PCL/S2/DIOX/Sach.

39

40

VI. Metody badań

1. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)

Skaningowy mikroskop elektronowy jest jednym z najbardziej użytecznych urządzeń

umożliwiających badanie mikrostruktury oraz morfologii powierzchni materiałów. Jego idea

polega na skanowaniu powierzchni materiału zogniskowaną wiązką elektronów. Podczas tego

procesu odpowiedni detektor zbiera sygnały emitowane z zeskanowanego punktu próbki. W

tym samym czasie steruje się wiązką monitora. Intensywność obrazu jest modulowana przez

wzmacnianie sygnału wybranego detektora. Powiększenie mikroskopu jest stosunkiem

wielkości pola jednotonalnego obrazu składającego się z drobnych kropek (rastra) monitora

do wielkości pola rastra próbki – uzyskane powiększenie nie wymaga stosowania soczewek.

Mikroskop skaningowy składa się z (rys. 17) :

działa elektronowego, gdzie wytwarzana jest wiązka elektronów,

kolumny, w której następuje przyspieszanie i ogniskowanie wiązki elektronów,

komory próbki, gdzie ma miejsce interakcja elektronów wiązki z próbką,

zestawu detektorów odbierających różne sygnały emitowane przez próbkę,

systemu przetwarzania sygnałów na obraz.

Rys. 17 Schemat skaningowego mikroskopu elektronowego.

Do tworzenia obrazu wykorzystuje się sygnały wtórne, generowane w wyniku

oddziaływania wiązki pierwotnej elektronów z próbką:

elektrony wtórne SE – powstają w wyniku niesprężystych zderzeń elektronów

bombardujących próbkę z elektronami powłok zewnętrznych, a ich ważną cechą

jest zależność ich emisji od kąta padania elektronów pierwotnych, co wykorzystuje

się w badaniach topologii powierzchni;

41

elektrony wstecznie rozproszone BSE - powstają w wyniku zderzeń sprężystych,

do obrazowania powierzchni używa się stosunek ich emisji od liczby atomowej,

dzięki czemu możliwe jest rozróżnianie obszarów o różnym składzie chemicznym;

promienie rentgenowskie – w wyniku wybicia elektronu z wewnętrznej powłoki i

przeskoku elektronu z poziomu o wyższej energii na miejsce tego z powłoki

zewnętrznej wydzielana jest energia, czemu towarzyszy emisja promieniowania

rentgenowskiego; energia i długość fali tego promieniowania są charakterystyczne

dla poszczególnych pierwiastków, co umożliwia analizę składu chemicznego w

mikroobszarach.

Badanie mikrostruktury otrzymanych próbek z wykorzystaniem SEM przeprowadzono

w Laboratorium Mikroskopii Skaningowej i Mikroanalizy Wydziału Inżynierii Materiałowej i

Ceramiki AGH. Próbki przeznaczone do badania napylono cienką warstwą węgla. Analiza

powierzchni próbek została wykonana za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego

NanoSEM FEI, USA z analizatorem EDS (EDAX).

2. Skaningowa kalorymetria różnicowa (DSC)

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC – differentia scanning calorimetry) to

obecnie najpowszechniej wykorzystywana technika termoanalityczna. Istotą pomiaru jest

uzyskanie różnicy pomiędzy ciepłem przepływającym przez komorę z próbką oraz przez

drugą komorę z materiałem wzorcowym, poddanym tym samym temperaturom.

Oznaczenia techniką DSC dostarczają danych odnośnie efektów termicznych

opisywanych zmianą entalpii oraz zmianami temperatury, jak topnienie, krystalizacja,

przejście fazowe solid-solid oraz reakcje chemiczne.

W różnicowych kalorymetrach skaningowych obie próbki umieszczane są w

jednakowych naczynkach pomiarowych symetrycznie we wspólnym piecu, którego

temperatura jest regulowana w sposób niezależny od zmian właściwości próbek w czasie

pomiaru, zgodnie z założonym programem temperaturowym. Gdy piec kalorymetru jest

ogrzewany, a układ jest symetryczny cieplnie, do obu próbek płynie taki sam strumień ciepła,

różnica ich temperatur wynosi wówczas zero.

Gdy stan równowagi termodynamicznej zostaje zakłócony przemianą w próbce lub

gdy istnieje asymetria cieplna układu powodowana różnicą pojemności cieplnej próbek,

obserwujemy różnicę temperatur proporcjonalną do różnicy strumieni cieplnych do próbki i

do próbki odniesienia.

42

Rys. 18 Schemat skaningowego kalorymetru różnicowego.

Z każdego z otrzymanych materiałów przygotowano próbki o wadze 10 mg, które

następnie umieszczono w aluminiowych, jednorazowych tyglach do badań DSC zamykając za

pomocą specjalnej prasy. Pomiary przeprowadzono przy temperaturze początkowej równej

20°C, z szybkością grzania 10°C/min osiągając temperaturę końcową równą 80°C. Analiza

została wykonana przy użyciu kalorymetru różnicowego Perkin Elmer DSC 7.

43

44

VII. Charakterystyka otrzymanych rusztowań.

1. Charakterystyka makroskopowa rusztowań.

Otrzymano dwa rodzaje rusztowań dla inżynierii tkankowej – skafoldy z czystego

polimeru (PCL) oraz skafoldy kompozytowe, o osnowie polimerowej z dwoma rodzajami

szkła żelowego (wysokowapniowego - A2, wysokokrzemionkowego - S2). Pomiędzy

obiema grupami rusztowań nie występowały istotne różnice dające się zaobserwować na

poziomie makroskopowym (Rys. 19). Dalsza analiza pozwoliła jednak stwierdzić, iż

materiały wytworzone z czystego polimeru są bardziej sprężyste oraz mniej spójne od

tych z dodatkiem bioszkieł (niezależnie od rodzaju bioszkła), a co za tym idzie

charakteryzowały się mniejszą od nich wytrzymałością mechaniczną (bardzo łatwo

ulegały zniszczeniu).

Otrzymane skafoldy różniły się również użytymi do ich produkcji porogenami. Jednak

obserwując jedynie budowę makroskopową nie było możliwym stwierdzenie

jakichkolwiek różnic wynikających z tego faktu.

45

Rys. 19 Obraz makroskopowy otrzymanych rusztowań z PCL bez dodatku bioszkła oraz

kompozytowych, w których matryce stanowi PCL.

2. Charakterystyka mikroskopowa rusztowań – SEM/EDX.

Przeprowadzone badanie z wykorzystaniem skaningowego mikroskopu elektronowego

miało na celu analizę zmian mikrostruktury otrzymanych skafoldów w zależności od

zastosowanych materiałów (dodatki szkieł żelowych) oraz rodzaju porogenu. Dokonano

również analizy składu pierwiastkowego próbek kompozytowych, co pomogło nam określić

miejsce występowania cząstek bioszkła, dokonano ich zarówno dla określonych punktów jak i

całych obrazów (rys.20-26).

Z analizy porównawczej przedstawionych w tabeli nr 4 mikrofotografii możemy

stwierdzić, iż zarówno dodatek szkła jak i rodzaj zastosowanego porogenu miały duży wpływ

na wielkość oraz kształt porów jak i na ogólne rozwinięcie powierzchni skafoldów.

I tak w przypadku próbek z czystego PCL na obrazach widzimy wyraźnie duże pory,

jednak ogólne rozwinięcie powierzchni materiału jest o wiele mniejsze niż w przypadku

próbek kompozytowych. W ich przypadku oprócz porów występujących również w czystym

PCL obserwujemy także dużą ilość mniejszych porów występujących na ściankach większych

porów. Świadczy to o pozytywnym wpływie dodatków szklanych na ogólną mikrostrukturę

rusztowań, głównie ze względu na ich funkcjonalność – im większa porowatość, połączenie

porów i rozwinięcie powierzchni materiałów, tym łatwiejsza adhezja, proliferacja oraz

odżywianie komórek. Na podstawie mikrofotografii SEM można różwnież zauważyć, iż

materiały kompozytowe odznaczają się niższą porowatością, a także zmniejszoną wielkością

porów w stosunku do materiałów polimerowych.

Również w przypadku zastosowanych porogenów widać wyraźną różnicę w charakterze

porowatości otrzymanych materiałów. Mianowicie pory uzyskane przez użycie NaCl są o

wiele większe i wyraźniejsze od tych wytworzonych przez sacharozę mimo jednakowej

średnicy początkowej ziaren obu rodzajów porogenów (315-400 µm) Może to świadczyć o

lepszych właściwościach porotwórczych chlorku sodu. Jednak w przypadku materiałów

uzyskanych z użyciem sacharozy można zauważyć znacznie większą porowatość ścian

dużych porów. Ponadto wydaje się, iż materiały uzyskane przez zastosowanie sacharozy jako

porogenu, posiadają wyższe rozwinięcie powierzchni w stosunku do materiałów, w których

porowatość uzyskano stosując chlorek sodu.

Na mikrofotografiach próbek pobranych ze skafoldów kompozytowych widzimy

wyraźnie widoczne ziarna bioszkieł zatopione w matrycy polimerowej. Ma to wpływ na

umocnienie struktury rusztowania. Punkty z widocznymi ziarnami zostały poddane

porównawczej analizie EDX (rys.20-26).

46

Tab. 4 Mikrofotografie SEM próbek wszystkich otrzymanych materiałów.

47

PC

L/D

IOX

/NaC

lP

CL

/DIO

X/S

ach

PC

L/A

2/D

IOX

/NaC

lP

CL

/A2/

DIO

X/S

ach

PC

L/S

2/D

IOX

/NaC

lP

CL

/S2/

DIO

X/S

ach

.

Rys.20 Uśredniona mikroanaliza PCL/A2/DIOX/NaCl

Rys. 21 Mikroanaliza Punktu 1. Rys. 22 Mikroanaliza Punktu 2

48

Rys.23 Uśredniona mikroanaliza PCL/A2/DIOX/Sach.

Rys. 24 Mikroanaliza Punktu 1. Rys. 25 Mikroanaliza Punktu 2.

49

Rys. 26 Mikroanaliza Punktu 1. Rys. 27 Mikroanaliza Punktu 2.

Rys.28 Uśredniona mikroanaliza PCL/S2/DIOX/Sach.

50

Rys. 29 Mikroanaliza Punktu 1. Rys. 30 Mikroanaliza Punktu 2.

Na podstawie analizy składu pierwiastkowego próbek pobranych ze skafoldów

kompozytowych możemy wywnioskować, iż w miejscach w których widzimy podwyższoną

ilość krzemu, wapnia i fosforu (pierwiastki pochodzące od szkła) znajdują się ziarna bioszkieł

żelowych. W przypadku szkła A2 zawartość krzemu jest znacznie mniejsza niż wtedy, gdy

mamy do czynienia ze szkłem S2, co potwierdza różnice składu zastosowanych szkieł. Punkty

o podwyższonej zawartości węgla świadczą o przeważającej obecności polimeru. Na

załączonych mikrofotografiach kompozytów widać, iż cząstki szkieł są równomiernie

rozmieszczone w matrycy polimerowej, a także w niej zatopione (Rys. 28).

51

3. Charakterystyka właściwości mechanicznych – DSC.

Na rysunku 31 przedstawiono termogram DSC wykonany dla każdego otrzymanego w

trakcie badań rodzaju skafoldu. W tabeli 5 zestawiono wielkości wyznaczone na podstawie

zarejestrowanych krzywych termograficznych DSC – temperaturę oraz entalpię topienia, a

także stopień krystaliczności PCL.

Z wyników badań termicznych otrzymanych materiałów wynika, iż dodatek cząstek

szkła do matrycy polimerowej powoduje obniżenie stopnia krystaliczności PCL.

Prawdopodobnie zjawisko to związane było z obecnością cząstek w matrycy polimerowej,

które ograniczają mobilność łańcuchów polimeru, a tym samym zdolność do przegrupowania

i rekrystalizacji. Krystaliczność wszystkich materiałów kompozytowych była na zbliżonym

poziomie, co świadczy o tym, iż skład chemiczny szkła nie wpływa na opisywany parametr.

Porównując stopień krystaliczności zarówno materiałów polimerowych, jak również

kompozytowych wytworzonych z użyciem różnych porogenów, również można stwierdzić, iż

rodzaj porogenu nie wpływa w istotny sposób na krystaliczność PCL. Temperatura topienia,

niezależnie od dodatku i składu cząstek szkła, a także zastosowanego porogenu nie ulega

istotnym zmianom. To z kolei mogło świadczyć o tym, iż cząstki bioaktywnego szkła oraz

porogenów nie wpływają na zmianę długości łańcuchów polimeru (masę cząsteczkową PCL),

a także na wielkość i stopień uporządkowania obszarów krystalicznych PCL.

Rys. 31 Termogramy DSC dla wszystkich próbek.

52

Tab. 5 Temperatura topienia, entalpia topienia oraz stopień krystaliczności osnowy

polimerowej otrzymanych materiałów.

Próbka Temperatura

topnienia

Tm [°C]

Entalpia

(topienia)

ΔHm (J/g)

Stopień

krystaliczności

[%]

PCL/DIOX/NaCl 64 51,46 39,6

PCL/DIOX/Sach. 64,5 59,45 42,6

PCL/A2/DIOX/NaCl 64,2 25,7 18,4

PCL/A2/DIOX/Sach. 63,2 21,48 15,4

PCL/S2/DIOX/NaCl 63,8 27,59 19,8

PCL/S2/DIOX/Sach. 64,2 26,45 19

53

54

Podsumowanie i wnioski

Celem przeprowadzonych badań było wytworzenie było otrzymanie kompozytowych

rusztowań dla inżynierii tkankowej, których osnowę stanowi polimer PCL o masie

cząsteczkowej Mn = 80 kDa. Fazą modyfikującą kompozytu są ziarna wysokowapniowego

bioaktywnego szkła pochodzenia żelowego o składzie SiO2 – 40% mol, CaO – 54% mol, P2O5

– 6% mol oraz wysokokrzemionkowego szkła pochodzenia żelowego o składzie SiO2 – 80%

mol, CaO – 16% mol, P2O5 – 4% mol, stanowiące 21% objętości kompozytu. Materiał

otrzymano w postaci porowatych rusztowań 3D metodą odlewania z roztworu z

wymywaniem porogenu. Pory otrzymano z użyciem dwóch rodzajów porogenów – NaCl i

sacharozy.

Ocena makroskopowa otrzymanych materiałów nie wykazała znaczących różnic

pomiędzy otrzymanymi skafoldami w zależności od użytego szkła, czy też porogenu. Jednak

rusztowania otrzymane za czystego polimeru wyraźnie różniły się od kompozytowych

wytrzymałością oraz elastycznością. Okazały się być znacznie mniej trwałe. Natomiast

badania mikrostruktury, a także stopnia krystaliczności osnowy wykazała istotne różnice

pomiędzy otrzymanymi materiałami, głównie pomiędzy wytworzonymi z czystego PCL, a

kompozytowymi, rodzaj użytego porogenu również okazał się mieć duże znaczenie.

Architekturę (kształt, wielkość, rozmieszczenie i połączenie porów) oraz morfologię

powierzchni otrzymanych materiałów badano metodą skaningowej mikroskopii elektronowej

SEM. Do oceny rozmieszczenia cząstek szkła w matrycy polimerowej dodatkowo użyto

analizatora widma promieniowania rentgenowskiego EDS. Badania mikroskopowe wykazały,

iż zarówno rodzaj użytego szkła do modyfikacji matrycy polimerowej, jak i rodzaj użytego

porogenu mają duży wpływ na architekturę i morfologię powierzchni materiału. Pory

otrzymane za pomocą chlorku sodu okazują się być widocznie większe od tych

pozostawionych po wypłukaniu cząstek sacharozy, co mogłoby sugerować, iż jest on lepszym

porogenem. Jednak przy głębszej analizie widzimy iż rozwinięcie powierzchni materiału,

ilość małych porów w ścianach tych większych oraz połączenie między porami jest znacznie

lepsze w przypadku, gdy substancją porotwórczą była sacharoza. Natomiast w przypadku

użycia szkła o różnym składzie chemicznym (A2 lub S2) mikrostruktura materiałów

kompozytowych nie jest znacząco różna, zarówno w przypadku szkła

wysokokrzemiankowego (S2) jak i wysokowapniowego (A2) widzimy wyraźne cząstki

bioszkła równomiernie rozmieszczone i zatopione w matrycy polimerowej. Potwierdza to, iż

metoda odlewania z roztworu z wymywaniem porogenu pozwala na uzyskanie jednorodnych

materiałów kompozytowych modyfikowanych cząstkami bioszkła o wielkości <50 µm.

Analiza EDS powierzchni skafoldów jednoznacznie pokazuje miejsca występowania ziaren

bioszkła, dzięki znacznie podwyższonej ilości krzemu (w przypadku szkła

wysokokrzemionkowego) oraz wapnia (szkło wysokowapniowe).

55

Badanie termiczne DSC, którym poddano wszystkie otrzymane próbki, nie wykazało

znacznego wpływu dodanych szkieł oraz rodzaju użytego porogenu na temperaturę topnienia

kompozytów. Może to świadczyć o tym, iż zarówno dodatek szkła oraz porogenu nie ma

wpływu na długość łańcuchów polimeru polimeru, a także na zmianę wielkości oraz

uporządkowania obszarów krystalicznych PCL.

Zauważono jednak spadek stopnia krystaliczności PCL pod wpływem modyfikacji

cząstkami bioszkieł. Skład pierwiastkowy użytego szkła oraz rodzaj użytego porogenu nie

miał jednak na to większego wpływu o czym świadczyła zbliżona wartość stopnia

krystaliczności wszystkich badanych kompozytów. Zmniejszenie stopnia krystaliczność PCL

może być skutkiem ograniczenie możliwości do przemieszczania się łańcuchów

polimerowych przez obecność ziaren szkła, co z kolei utrudniało porządkowanie łańcuchów

PCL.

Na podstawie otrzymanych wyników badań można stwierdzić, iż porowate

rusztowanie kompozytowe PCL/bioaktywne szkło żelowe, jest obiecującym materiałem,

który potencjalnie może zostać użyty w zastosowaniach inżynierii regeneracyjnej. Wymagają

one jednak dalszych badań między innymi wytrzymałościowych, a także stopnia

bioaktywności i odpowiedzi komórkowej w celu określenia konkretnej użyteczności

materiału.

56

Bibliografia[1] Fergal J. O’Brien „Biomaterials and scaffolds for tissues engineering”, Materials Today,

March 2011, vol.14, no. 3.

[2] Y.Tabata “Recent progress in tissue engineering” DrugDiscovery Today, Vol.6, Issue 9,

(2001), p. 483-487.

[3] R. Langer, J.P. Vacanti “Tissue engineering” Science Vol. 260, no. 5110, (1993), p.920-

926

[4] Rui L. Reis “Tissue engineering: The essential elements” 3B’s Research

GroupBiomaterials, Biodegradables and Biomimetics. University of Minho, Campus de

Gualtar. Posrtugal.

[5] Anna Kaznica, Romana Joachimiak, Tomasz Drewa, Tomasz Rawo, Jaroslaw

Deszczynski, „New trends in tissue engineering” , Arthroscopy and Joint Surgery, 2007; 3(3):

11-16.

[6] E. Sachlos and J.T. Czernuszka “Making tissue engineering scaffolds work. Review on the

application of solid freeform fabrication technology to the production of tissue engineerings

scaffolds.” European Cells and Materials Vol. 5. 2003 (pages 29-40).

[7] Yang S., Leong K.F., Du Z., Chua C., The Design of Scaffolds for Use in Tissue

Engineering. Part I.

Traditional Factors, Tissue Eng, 2001, vol.7, pp.679- 689.

[8] Brett C. Isenberg and Joyce Y. Wong “Building structure into engineered tissues” ,

Materials Today, December 2006, vol.9 , no. 12.

[9] B. P. Chan, K. W. Leong “Scaffolding in tissue engineering: general approaches

and tissue-specific considerations” Eur Spine J (2008) 17 (Suppl 4):S467–S479.

[10] Byung-Soo Kim, Carlos E. Baez, Anthony Atala, “Biomaterials for tissue engineering”

, World J Urol (2000) 18: 2±9.

[11] K. A. Hing,” Bioceramic bone graft substitutes:Influence of porosity and chemistry”,

Int. J. Appl. Ceram. Technol., 2 (2005), 184-199.

[12] S. Partap, F. Lyons, F.J. O’Brien, “Scaffolds & Surfaces” , Chapter 5. Biomaterials and

Tissue Engineering

[13] Blażewicz J. i inni: „Biocybernetyka i inżynieria biomedyczna”, 2000, tom 4.

Akademicka Oficyna Wydawnicza Elit, Warszawa 2003

[14] Koch W, Holthausen MC. A Chemist’s guide to Density Functional Theory, Wiley-VCH,

2000.

57

[15] L. Savarino, N. Baldini, M. Greco, O. Capitani, S. Pinna, S. Valentini, B. Lombardo, M.

T. Esposito, L. Pastore, L. Ambrosio, S. Battista, F. Causa, S. Zeppetelli, V. Guarino and P.

A. Netti, “The performance of poly-epsilon-caprolactone scaffolds in a rabbit femur model

with and without autologous stromal cells and bmp4” Biomaterials 28 (2007), 3101-9.

[16] M. J. Mondrinos, R. Dembzynski, L. Lu, V. K. Byrapogu, D. M. Wootton, P. I. Lelkes

and J. Zhou, “Porogen-based solid freeform fabrication of polycaprolactone-calcium

phosphate scaffolds for tissue engineering” Biomaterials 27 (2006), 4399-408.

[17] A. S. Rowlands, S. A. Lim, D. Martin and J. J. Cooper-White,

“Polyurethane/poly(lactic-co-glycolic) acid composite scaffolds fabricated by thermally

induced phase separation”, Biomaterials 28 (2007), 2109-21.

[18] P. J. Martens, S. J. Bryant and K. S. Anseth, “Tailoring the degradation of hydrogels

formed from multivinyl poly(ethylene glycol) and poly(vinyl alcohol) macromers for cartilage

tissue engineering “, Biomacromolecules 4 (2003), 283-92.

[19] W. J. Marijnissen, G. J. van Osch, J. Aigner, S. W. van der Veen, A. P. Hollander, H. L.

Verwoerd-Verhoef and J. A. Verhaar,” Alginate as a chondrocyte-delivery substance in

combination with a non-woven scaffold for cartilage tissue engineering”, Biomaterials 23

(2002), 1511-7.

[20] J. Yang, M. Goto, H. Ise, C. S. Cho and T. Akaike, “Galactosylated alginate as a scaffold

for hepatocytes entrapment” Biomaterials 23 (2002), 471-9.

[21] D. Bettinger, D. Gore and Y. Humphries, “Evaluation of calcium alginate for skin graft

donor sites”, J Burn Care Rehabil 16 (1995), 59-61.

[22] C. Mao, J. J. Zhu, Y. F. Hu, Q. Q. Ma, Y. Z. Qiu, A. P. Zhu, W. B. Zhao and J. Shen,”

Surface modification using photocrosslinkable chitosan for improving hemocompatibility”,

Colloids Surf B Biointerfaces 38 (2004), 47-53.

[23] J. L. Drury and D. J. Mooney, “Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design

variables and applications”, Biomaterials 24 (2003), 4337-4351.

[24] C. L. Cummings, D. Gawlitta, R. M. Nerem and J. P. Stegemann, “Properties of

engineered vascular constructs made from collagen, fibrin, and collagen-fibrin mixtures”,

Biomaterials 25 (2004), 3699-706.

[25] C. J. Hunter, J. K. Mouw and M. E. Levenston,” Dynamic compression of chondrocyte-

seeded fibrin gels: Effects on matrix accumulation and mechanical stiffness”, Osteoarthritis

Cartilage 12 (2004), 117-30.

[26] M. S. Ponticiello, R. M. Schinagl, S. Kadiyala and F. P. Barry, “Gelatin-based resorbable

sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells in cartilage regeneration

therapy”, J Biomed Mater Res 52 (2000), 246-55.

58

[27] V. Yannas and J. F. Burke, “Design of an artificial skin. I. Basic design principles”, J

Biomed Mater Res 14 (1980), 65-81.

[28] S. S. Kim, M. Sun Park, O. Jeon, C. Yong Choi and B. S. Kim, “Poly(lactide-co-

glycolide)/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering”, Biomaterials 27

(2006), 1399-409.

[29] Yang S, Leong KF, Du Z, Chua CK.” The design of scaffolds for use in tissue

engineering: Part II. Rapid prototyping techniques.” ,Tissue Eng. 2002;8(1):1–11.

[30] Hollister SJ. “Porous scaffold design for tissue engineering.” Nat Mater. 2005;4(7):518–

524. doi: 10.1038/nmat1421.

[31] Mikos AG, Thorsen AJ, Czerwonka LA, Bao Y, Langer R, Winslow DN, “ Preparation

and characterization of poly(L-lactic acid) foams.” , Polymer 1994 1994;35(5):1068-1077.

[32] Puppi D, Chiellini F, Piras AM, Chiellini E., “ Polymeric materials for bone and cartilage

repair.” Progress in Polymer Science 2010 Apr;35(4):403-440.

[33] Quirk RA, France RM, Shakesheff KM, Howdle SM.” Supercritical fluid technologies

and tissue engineering scaffolds.” Current Opinion in Solid State & Materials Science 2004

Jun-Aug;8(3-4):313-321.

[34] Lee KWD, Chan PK, Feng XS.” Morphology development and characterization of the

phase-separated structure resulting from the thermal-induced phase separation phenomenon in

polymer solutions under a temperature gradient.”, Chemical Engineering Science 2004

Apr;59(7):1491-1504.

[35] Ma PX, Zhang RY. “Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix.” Journal of

Biomedical Materials Research 1999 Jul;46(1):60-72.

[36] Thomson RC, Wake MC, Yaszemski MJ, Mikos AG.” Biodegradable polymer scaffolds

to regenerate organs.” Advances in Polymer Science 1995: 245-274.

[37] Prof. Xiongbiao Chen "Advances in Biomaterials Science and Biomedical Applications",

book edited by Rosario Pignatello, ISBN 978-953-51-1051-4, Published: March 27, 2013

under CC BY 3.0 license. © The Author(s).

[38] Peltola SM, Melchels FPW, Grijpma DW, Kellomaki M.” A review of rapid prototyping

techniques for tissue engineering purposes.” Annals of Medicine 2008;40(4):268-280.

[39] Yeong WY, Chua CK, Leong KF, Chandrasekaran M. ”Rapid prototyping in tissue

engineering: challenges and potential. “, Trends in Biotechnology 2004 Dec;22(12):643-652.

[40] Khalil S, Sun W. “Bioprinting endothelial cells with alginate for 3D tissue constructs.”,

Journal of Biomechanical Engineering-Transactions of the ASME 2009 Nov;131(11).

59

[41] Mironov V, Kasyanov V, Drake C, Markwald RR. “Organ printing: promises and

challenges.”, Regenerative Medicine 2008 Jan;3(1):93-103.

[42] Yu D, Li Q, Mu X, Chang T, Xiong Z., “ Bone regeneration of critical calvarial defect in

goat model by PLGA/TCP/rhBMP-2 scaffolds prepared by low-temperature rapid-prototyping

technology.” , International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 2008 Oct;37(10):929-

934

[43] Stevens MM, George JH.,” Exploring and engineering the cell surface interface.”,

Science 2005 Nov 18;310(5751):1135-1138.

[44] Huang ZM, Zhang YZ, Kotaki M, Ramakrishna S., “ A review on polymer nanofibers by

electrospinning and their applications in nanocomposites.”, Composites Science and

Technology 2003 Nov;63(15):2223-2253.

[45] Pham QP, Sharma U, Mikos AG., “ Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue

engineering applications: A review. “, Tissue Engineering 2006 May;12(5):1197-1211.

60