UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE CRAIOVA

TEZ DE DOCTORAT

PROIECTAREA UNEI NOI CLASE DE LIPOZOMI CU POTENIALE PROPRIETI OSTEOTROPE

Conductor tiinific:

Prof. Univ. dr. JOHNY NEAMTU

Doctorand:

GURGUI (IONESCU) CTLINA

CRAIOVA 2013

Cuprins

Abrevieri.1 Introducere......................................................................................................................................................................2

PARTEA I: STADIUL CUNOATERII IN DOMENIUL DE CERCETARE STUDIAT....................................4

CAPITOLUL I : NOIUNI INTRODUCTIVE : NANOPARTICULE, LIPOZOMI, VECTORI MEDICAMENTOI.....................................................................................................................................................5

I.1.NANOPARTICULE...................................................................................................................................5 I.1.1. Ce sunt nanoparticulele?..............................................................................................5

I.1.2.Tipuri de nanoparticule...............................................................................................................6 I.2.3.Aplicaii ale nanoparticulelor n domeniul biomedical...............................................................6 I.1.4.Toxicitatea nanoparticulelor........................................................................................................7

I.2. LIPOZOMII...............................................................................................................................................7 I.2.1. Noiuni introductive...................................................................................................................7 I.2.2. Aplicaii i alte aspecte legate de lipozomi..............................................................................11 I.2.3. Avantaje i limitri ale utilizrii lipozomilor n domeniul terapeutic.....................................12 I.2.4. Aplicaiile lipozomilor n domeniul terapeutic........................................................................14

I.3.VECTORIZAREA PRINCIPIILOR ACTIVE........................................................................................16 I.3.1.Noiuni introductive..................................................................................................................16 I.3.2. Transportul la int al medicamentelor.....................................................................................17

I.4. GENERAII DE LIPOZOMI..................................................................................................................21 I.5 COMPORTAMENTUL LIPOZMILOR IN VIVO....................................................................................23

CAPITOLUL II : PROIECTAREA UNEI CLASE ORIGINALE DE SISTEME OSTEOTROPE...........................................................................................................................................................26

II.1. Sisteme osteotrope de livrare a medicamentelor......................................................................21 II.2. Structura osului.........................................................................................................................27

II.3. Tipuri de grupri osteotrope.....................................................................................................28 II.4. Derivaii acidului tartronic: structuri originale de intire a osului............................................30 II.5. Scopul si originalitatea tezei de doctorat..................................................................................33

CONCLUZII.................................................................................................................................................35

PARTEA A IIa: CONTRIBUII PERSONALE......................................................................................................38

CAPITOLUL III: PARTEA EXPERIMENTAL....................................................................................39 METODE GENERALE.....39 SINTEZE43

REZULTATE I DISCUII........................................................................................................................62 Studii preliminare.62

CAPITOLUL IV. REZULTATE I DISCUII. OBINEREA CONJUGATULUI AHBP-TEG-COLEST (16)................................................................................................................................................67

IV.1. STRATEGIA DE SINTEZA A CONJUGATULUI AHBP-TEG-Colest (16).......................67 IV.1.1. Sinteza alcoolului 8-colesteriloxi-3,6-dioxaoctanol (19)....................................70 IV.1.2. Sinteza acidului 13-colesteriloxi-4,7,10-trioxadodecanoic (21)..........................70 IV.1. 3. Sinteza acidului hidroxibisfosfonic AHBP-TEG-Colest (16)..............................74

IV.2. CARACTERIZAREA COMPUSILOR OBTINUTI IN SINTEZA MULTIETAPE A CONJUGATULUI AHBP-TEG-Colest (16)...................................................................................76

IV.2.1. Colesterolul............................................................................................................76 IV.2.2. p-toluensulfonatul de colesteril (18)......................................................................78 IV.2.3. Alcoolul 8-colesteriloxi-3,6-dioxaoctanol (19)...................................................80 IV.2.4. Esterul 13-colesteriloxi-4,7,10-trioxadodecanoat de ter-butil (20)....................83 IV.2.5. Acidul 13-colesteriloxi-4,7,10-trioxadodecanoic (21)........................................86 IV.2.6. Conjugatul AHBP-TEG-Colest (16)......................................................................90

CAPITOLUL V. REZULTATE I DISCUII. OBTINEREA CONJUGATULUI AT-TEG-Colest (15).................................................................................................................................................................93

V.1. STRATEGIA DE SINTEZ A CONJUGATULUI AT-TEG-Colest (15)..............................93 V.1.1. Sinteza alcoolului 11-colesteriloxi-3,6,9-trioxaundecan-1-ol (23)....................................................95 V.1.2. Sinteza derivatului iodat 11-colesteriloxi-1-iodo-3,6,9-trioxaundecan (26).....................................95 V.1.3. Sinteza compusului 2-(11-colesteriloxi-3,6,9-trioxaundecil)malonat de dietil (27)............................96

V.1.4. Sinteza compusului 2-(11-colesteriloxi-3,6,9-trioxaundecil)-2-bromomalonat de dietil (28) ..........................................................................................................................................................96

V.1.5. Sinteza conjugatului AT-TEG-Colest (15) .........................................................................................96 V.1.5.1. ncercri de optimizare a reaciei chimice de sintez a conjugatului AT-TEG-Colest(15)...........................................................................................................................96 V.1.5.2. Purificarea conjugatului AT-TEG-Colest(15)....................................................100

V.1.6. Cai alternative de preparare a conjugatului AT-TEG-Colest (15).....................................................104

V.2. CARACTERIZAREA COMPUSILOR OBTINUTI IN SINTEZA MULTIETAPE A CONJUGATULUI AT-TEG-Colest (15)..............................................................................................106 V.2.1. Alcoolul 11-colesteriloxi-3,6,9-trioxaundecan-1-ol (23).........................................................106 V.2.2. Tosilatul 11-colesteriloxi-3,6,9-trioxaundecil-1-p-toluensulfonat (25)....................................106 V.2.3. Derivatul iodat 11-colesteriloxi-1-iodo-3,6,9-trioxaundecan (26)............................................109 V.2.4. Compusul 2-(11-colesteriloxi-3,6,9-trioxaundecil)malonat de dietil (27)..................................110 V.2.5. Compusul 2-(11-colesteriloxi-3,6,9-trioxaundecil)-2-bromomalonat de dietil (28)..................114 V.2.6. Acidul hidroxibiscarboxilic AT-TEG-Colest (15)......................................................................115

CONCLUZII SI PERSPECTIVE.............................................................................................................116

CAPITOLUL VI: CONCLUZII FINALE SI PERSPECTIVE............................................................................117

Bibliografie.................................................................................................................................................................121 Anexa

Cuvinte cheie: lipozomi, intire activ, os, hidroxiapatit, acid hidroxibisfosfonic, acid hidroxibiscarboxilic

REZUMAT

Nanotehnologia a permis creearea unor sisteme de transport specific la locurile de actiune a principiilor active, mrindu-le eficacitatea terapeutic i diminundu-le toxicitatea sistemic. Dintre nanoparticule, atenia ne-a fost captat de lipozomi, vezicule lipidice nanostructurate ce pot fi decorate cu grupri funcionale n vederea dirijrii lor ctre un anumit situs biologic. Ideea central a acestei teze de doctorat vizeaz proiectarea unui nou tip de lipozomi, funcionalizai cu grupri de acid tartronic, ce ar putea fi capabili s recunoasc specific oasele, n vederea tratrii afeciunilor caracteristice acestora. Lucrarea este structurat n dou pri:

1. Partea inti descrie stadiul cunoaterii n domeniul de cercetare abordat i cuprinde dou capitole:

Capitolul I este intitulat Nanoparticule, lipozomi, vectori medicamentoi. n acest capitol sunt expuse generaliti cu privire la nanoparticule, accentul fiind pus pe lipozomi, cu o scurt trecere n revist a aplicaiilor, avantajelor i limitrilor utilizrii lipozomilor n domeniul terapeutic. Sunt prezentate de asemenea cteva noiuni cu privire la conceptul de vectorizare a medicamentelor, intirea pasiv i activ, generaiile de lipozomi i soarta acestora in vivo.

Capitolul II, numit Proiectarea unei clase originale de sisteme osteotrope, introduce subiectul tezei de doctorat, obtinerea a doua molecule amfifile ce vor servi la prepararea de lipozomi capabili s recunoasc selectiv hidroxiapatita (HA) din os.

Dup o scurt prezentare a structurii osului, sunt trecute n revist gruprile osteotrope

raportate pn n prezent. Dintre acestea, atenia ne-a fost atras de hidroxibisfosfonai. Trei lucrri tiinifice au raportat prepararea de lipozomi decorai cu aceste grupri chimice, lipozomi care au afinitate fa de partea anorganic a oaselor.

Originalitatea acestei teze const n propunerea gruprii de acid tartronic ca grupare osteotrop pentru funcionalizarea lipozomilor. Alegerea acestei grupri este motivat de asemnrile structurale dintre acizii hidroxibisfosfonici i acizii hidroxibiscarboxilici, precum i de o serie de lucrri tiinifice care raporteaz faptul c derivaii acidului tratronic influeneaz metabolismul oaselor i au afinitatea fa de HA.

Aceast lucrare i propune obinerea a doi compui amfifili ce vor servi la prepararea de lipozomi capabili s recunoasc i s se lege specific de hidroxiapatit:

a) Noul tensioactiv propus de noi: Acidul 1-hidroxi-(12-colesteriloxi-4,7,10-trioxa)dodecan-1,1-biscarboxilic, denumit netinific, pentru o desemnare mai uoar, conjugat Acid tartronic-trietilenglicol-Colesterol sau (AT-TEG-Colest). El va servi la prepararea de lipozomi a cror afinitate fa de HA urmeaz a fi evaluat. AT-TEG-Colest

are o stuctur original (Figura 1-compusul 15) b) Un tensioactiv martor pozitiv: Acidul 1-hidroxi-(12-colesteriloxi-4,7,10-

trioxa)dodecan-1,1-bisfosfonic, denumit netinific, pentru o desemnare mai uoara conjugat Acid hidroxibisfosfonic-trietilenglicol-Colesterol (AHBP-TEG-Colest) (Figura 1-compusul 16). El are o strutur similar compuilor deja raportai, prezentai n tez, a cror capacitate de a lega lipozomii de hidroxiapatit a fost deja demonstrat. Rolul su este acela de a valida testele de afinitate i de a face o comparaie ntre afinitatea noului compus AT-TEG-Colest i cea a unui compus cu grupri de acid hidroxibisfosfonic

n aceleai condiii experimentale.

Figura 1: Structura chimic a celor dou substane amfifile sintetizate

Interaciunea dintre lipozomii decorai cu grupri osteotrope (n cazul nostru, AHBP i, sperm noi, AT) cu hidroxiapatita i, implicit, osul, este redat schematic n Figura 2. Pentru mrirea timpului de circulaie n snge, suprafaa lipozomilor poate fi acoperit de PEG, nereprezentat n aceast figur pentru simplificare.

Figura 2: Reprezentare schematic a interaciunii dintre lipozomii decorai cu grupri osteotrope cu hidroxiapatita i osul.

2. Partea a doua este reprezentat de contribuiile personale i este structurat n trei

capitole: partea experimental i doua capitole de rezulate i discuii..

Partea experimental reprezint capitolul III al tezei.

Partea de rezultate si discuii debuteaz cu prezentarea unor studii preliminare de evaluare comparativ a geometriei, distribuiei de sarcin i potenialului generat de cei doi compusi 15 i 16, din care rezult c acetia au structur i proprietai fizico-chimice similare.

Capitolul IV prezint prepararea compusului AHBP-TEG-Colest (16), printr-o sintez realizat n 5 etape plecnd de la colesterol, cu un randament global de 15 %. Toi compuii intermediari au fost purificai si analizai prin SM, RMN 1H i RMN 13C. Compusul 16 a fost analizat prin RMN 1H, 31P si HPLC/MS, confirmndu-i-se structura.

Compusul sintetizat are o structur similar cu a altor derivai de acid hidroxibisfosfonic raportai in literatur. Conjugatul prezentat in aceasta teza este nou (contine o grupoare metilen suplimentar faa de omologul sau, raportat de Hengst V. et al.), iar sinteza sa aduce un element de originalitate faa de metodele raportate anterior pentru prepararea acestui tip de compui, ce

corespunde elongrii linkerului alcoolic, polioxigenat, cu 3 atomi de carbon i introducerea unei grupari de acid carboxilic n captul catenei. Aceste doua etape pot fi monitorizate prin cromatografie in strat subtire si pot fi puse cu usurinta in practica, deoarece nu necesita montaje sau conditii experimentale deosebite.

Capitolul V prezint prepararea compusului AT-TEG-Colest (15) printr-o sintez n 7 etape plecnd de la colesterol. Toi compuii intermediari au fost izolai i caracterizai prin SM,

RMN 1H i RMN 13C, ns o serie de probleme au intervenit n ultima etap, de hidroliz bazic a bromomalonatului 23 descris in teza. n afar de conjugatul dorit 15, aceast reacie conduce la obinerea unor produi secundari de decarboxilare i de eliminare, care fac foarte dificil purificarea compusului 15. Dup numeroase ncercri de purificare prin cromatografie pe

coloana de gel de silice, conjugatul dorit 15 a fost purificat prin cromatografie preparativ in strat subire. Solidul obinut conine i silice, compusul organic urmand sa fie extras ntr-un solvent adecvat. Rezultatele analizei solidului obinut prin LC/MS i analizarea sa prin cromatografie n strat subire au artat c produsul dorit a fost separat cu succes de ceilali compui organici

prezeni n amestec, aceasta fiind de fapt etapa cea mai dificil a purificrii.

Perspective

Dup caracterizarea complet a celor doi compusi 15 i 16, pot fi realizate teste in vitro de determinare a afinitii dintre lipozomi i HA. HA utilizat n aceste teste poate fi pulbere

comercial sau poate fi obinut n laborator prin diferite metode. n scopul determinrii afinitii dintre lipozomi i HA pot fi utilizate metode raportate deja sau pot fi puse la punct noi metode experimentale. Testele de afinitate vor viza interaciunea dintre:

- lipozomi decorai cu grupri de AT i hidroxiapatit;

- lipozomi decorai cu grupri de AHBP (rol de martor) i hidroxiapatit; - lipozomi cu colesterol n loc de ligand, ce au rol de control.

n vederea studierii interaciunii lipozomi funcionalizai-HA, testele de afinitate pot fi realizate cu varierea procentelor de liganzi ncorporai, a concentraiei de HA, de lipozomi.

Realizarea testelor de afinitate dintre lipozomii funcionalizai cu grupri de AT i hidroxiapatit este important i pentru elucidarea rspunsului la intrebarea ridicat de Hengst V.

(Hengst, et al. 2007), i anume dac interaciunea lipozomilor decorai cu AHBP cu hidroxiapatit este cauzat de sarcina negativ de pe suprafaa lipozomilor sau efectiv gruprii de acid hidroxibisfosfonic.

Dac testele de afinitate cu HA se dovedesc a confirma afintatea noului compus fata de HA, atunci cercetrile pot trece la etapele urmatoare: (a) teste in vivo, pentru determinarea procentului de lipozomi care se fixeaz pe os; (b) utilizarea gruprii de acid tartronic pentru crearea altor sisteme osteotrope. Acestea pot rezulta n urma conjugrii principiilor active cu gruparea de acid tartronic, cu rol n intirea osului, urmat de eliberarea la int a principiului activ prin activarea unei grupri clivabile n anumite condiii (de ex. condiii acide la situsul tumoral). Alte aplicaii pot consta n utilizarea AT pentru pilotarea altori tipuri de nanoparticule: nanosfere, nanocapsule.

Conjugatul AHBP-TEG-Colest 16 poate fi utilizat ntr-o serie de teste individuale. Acestea pot viza: (a) determinarea interaciunii cantitative dintre lipozomii decorai cu AHBP i HA printr-o metod care nu a fost utilizat pn n prezent pentru acest tip de teste. n acest sens ar putea fi utilizat tehnologia SPR (Surface Plasmon Resonance). Rezultatele ar permite compararea afinitii determinate prin aceast nou metod cu afinitile raportate anterior; (b) studiul interaciunii cantitative dintre lipozomii decorai cu AHBP i HA n absena i prezena unor procente variate de PEG, ce stabilizeaz steric suprafaa lipozomilor n vederea prelungirii timpului lor de circulaie n snge.