PRODUCCIÓN BIOTECNOLÓGICA DE ÁCIDO CÍTRICO

El ácido cítrico es un producto químico que puede ser utilizado en varios ámbitos

cuya producción industrial se lleva a cabo preferentemente mediante el uso de

un microrganismo llamado Aspergillus Niger,

El ácido cítrico es un producto intermedio del ciclo de Krebs, es producido a partir de

glucosa según la vía de Embden-Meyerhof (o glucolisis o glicolisis, diferentes nombres

para la misma vía metabólica), que en ambiente aeróbico da como resultado la

producción de acetil-coenzima A. Esta coenzima entra en el ciclo de Krebs en donde

reacciona con el ácido oxalacético para formar ácido cítrico.

Materias Primas

Como materia prima, a nivel industrial se puede utilizar la melaza de caña de azúcar o

de remolacha azucarera, sustancias amiláceas del maíz, o soluciones de glucosa

y sacarosa.

Pre-tratamiento:

1. Filtración y tratamiento de la materia prima con resinas de intercambio iónico. (con el

objetivo de eliminar iones metálicos como el magnesio, el zinc, el hierro y sobretodo el

manganeso que favorece la producción de ácido oxálico.)

2. Esterilización e inmisión en el fermentador en donde también se introduce el inóculo

incubado apropiadamente.

pH comprendido entre 2,8 y 1,5

temperatura comprendida entre 28oC y 33oC

Rendimiento: 70 – 80% del carbohidrato inicial.

Duración:

Entre 6 y 15 días. (Según la materia prima utilizada)

Recuperación de ácido cítrico:

1. Filtración (para remover células y otros residuos sólidos)

2. Precipitación del citrato de calcio agregando hidróxido de calcio.

3. Filtración para separar el precipitado que luego se disuelve con ácido sulfúrico.

4. Formación de ácido cítrico y sulfato de calcio, separados por filtración

Purificación: Columnas con carbón activado, columnas con resinas de intercambio

iónico.

Concentración, cristalización, centrifugación, secado.

A continuación el esquema de esta producción:

Producción de insulina

Las bioseparaciones para la producción de insulina por el método de la

proteína intracelular, constan de las siguientes etapas de recuperación,

concentración, purificación y acabado.

Recuperación

Cosecha celular. El primer paso de la ruta de bioseparación consiste en la

recuperación de las células por centrifugación.

Rompimiento celular y recuperación de cuerpos de inclusión (CI). En

este caso, el producto es intracelular y se requiere el rompimiento de las

células por el medio de homogeneizadores de alta presión para liberar los CI.

Solubilización de CI. La suspensión que contiene los CI se transfiere a un

reactor recubierto de vidrio, donde se hace reaccionar con urea y 2-

mercaptoetanol. La urea es un agente caotrópico que disuelve las proteínas

desnaturalizadas de los CI y el 2-mercanoptoetanol es un agente que reduce

los enlaces disulfuro. Las partículas finas remanentes se eliminan en el filtro

para evitar problemas en los equipos de cromatografía.

Concentración.

Cromatografía de intercambio iónico. La proinsulina (S-SO3) se hace pasar

por tres columnas de intercambio catiónico de S-sefarosa. En la elución de la

columna se utiliza una solución de urea para prevenir el replegamiento.

Replegamiento. Esta operación permite la remoción de los grupos sulfito (SO -

23), la formación de los enlaces disulfuro y el plegamiento correcto de la

proinsulina en su forma nativa.

Conversión enzimática. La remoción de la cadena C de la proinsulina que

conecta las cadenas A y B, se realiza enzimáticamente utilizando tripsina y

carboxipeptidasa.

Purificación

Cromatografía de intercambio iónico. La insulina se purifica mediante una

secuencia cromatografía multimodal basada en diferencias de carga,

hidrofobicidad y tamaño entre la insulina y sus contaminantes.

Cromatografía de fase reversa. La purificación continúa utilizando la

columna de cromatografía de alta resolución de fase reversa de ácido fenil

borónico.

Cromatografía de filtración en gel. La purificación se completa en una

columna de filtración en gel en donde la insulina se obtiene prácticamente

pura.

Acabado

Cristalización. La solución obtenida se alimenta a un cristalizar

enchaquetado, donde se mezcla con acetato de amonio y cloruro de zinc.

Secado. Finalmente, los cristales se secan en el liofilizador (3).

Produccion de penicilina

La producción de penicilina G o V es llevada a cabo por fermentación en medios

líquidos. En una fermentación de penicilina típica, la mayoría de la masa celular

es obtenida durante las primeras 40 horas de fermentación. Durante la

fermentación se debe controlar si el suministro de oxígeno es el requerido para

mantener el valor deseado de qp. Otro parámetro importante es la temperatura, y

en este caso el diseño y operación del reactor es importante por el calor generado

por el crecimiento y la agitación. Actualmente la extracción con solventes es la

base para la separación y purificación de la penicilina. El primer paso consiste en

separar el micelio del medio de cultivo empleando un filtro rotatorio a vacío tipo

cilíndrico. El filtrado rico en penicilina es luego enfriado en un intercambiador de

calor a 0 – 4 °C con el objeto de disminuir la degradación enzimática y química

durante las etapas de extracción posteriores. Las penicilinas G y V son ácidos

fuertes. Las formas ácidas son solubles en muchos solventes orgánicos y se

pueden extraer con un alto rendimiento en acetato de amilo o de butilo a pH 2.5 –

3.0. La extracción se puede realizar en operaciones continuas, a contracorriente en

extractores centrífugos en etapas múltiples, a temperaturas de 0 – 3 °C. Otra

posibilidad es el empleo de mezcladores estáticos o decantadores, los cuales

tienen en menor costo de inversión.

Se debe tener en cuenta que tanto la penicilina G como la V se degradan en medio

ácido con una cinética de primer orden a una velocidad proporcional a la

temperatura y recíproca con respecto al pH. La extracción de penicilina se puede

realizar en una o más etapas sucesivas, con una acidificación del caldo filtrado con

H2 SO4 o H3PO 4 al 10% P/V y con el agregado de un agente surfactante (0,003 –

0,1% P/P, en el solvente), realizándose la extracción y concentración en

extractores centrífugos. Dependiendo de las especificaciones de uso final, el

solvente conteniendo penicilina se puede tratar con carbón para separar

pigmentos y otras impurezas. Esta etapa actualmente no se realiza debido a las

bajas impurezas de los caldos y a los altos rendimientos obtenidos.

La cristalización se puede realizar desde la fase acuosa si se desea, siendo los

valores críticos las concentraciones de sodio o potasio, la temperatura, la

concentración de penicilina y el pH. En caso de hacerse la cristalización a partir de

un solvente se requiere también un exceso de Na + o K+ , siendo los cristales

recuperados en un filtro rotatorio a vacío. Estos cristales son lavados y presecados

con un solvente volátil que también separa impurezas coloreadas. El secado

definitivo se puede realizar con aire caliente, vacío o calor radiante.

La penicilina cristalina G o V así obtenida puede ser empleada como tal o como

intermediario que es convertido a 6-APA para obtener nuevas penicilinas

semisintéticas, cuidando en todos los casos que los productos deberán tener un

grado farmacéutico.

Fuente: Apuntes de Microbiología Industrial del Programa Regional de Desarrollo

Científico y Tecnológico de la OEA

Análisis

Ácido Citrico Penicilina Insulina