mejora biotecnológica de la producción de alcaloides de

UNIVERSIDAD SAN PABLO CEU

FACULTAD DE FARMACIA

Departamento de Ciencias Farmacéuticas y de la Salud

“Mejora biotecnológica de la producción de

alcaloides de Papaver somniferum”

Tesis Doctoral

Alfonso Bonilla Martínez

2017

“Mejora biotecnológica de la producción de alcaloides de

Papaver somniferum”

Memoria presentada por

ALFONSO BONILLA MARTINEZ

para optar al grado de Doctor

VºBº de los Directores

F. Javier Gutiérrez Mañero Beatriz Ramos Solano

Alfonso Bonilla Martínez

Madrid, abril 2017

AGRADECIMIENTOS

Esta memoria ha sido realizada en el grupo de investigación “Biotecnología de la

interacción Planta-Microbioma”, en la Fundación Universitaria San Pablo-CEU. Por ello, el

primer agradecimiento que quiero realizar es al Dr. F. Javier Gutierrez Mañero por permitirme

ser uno más de su grupo de investigación y por codirigir esta memoria. Seguidamente quiero

agradecer la Dra. Beatriz Ramos Solano por ser codirectora de esta tesis y por su paciencia

mostrada conmigo. También les quiero agraecer los conocimientos transmitos tanto a nivel

científico, docente, como personal. Gracias.

En segundo lugar quería agradecer a la empresa ALCALIBER, la posibilidad de poder

haber realizado los diferentes estudios que han resultado en esta memoria. Especialmente, al

Dr. Francisco Javier Muñóz Ledesma, por su disponibilidad a solventar cualquier duda

mostrada en el cultivo de Papaver somniferum, así como su ayuda en la realización de los

diferentes ensayos de campo. También quisiera agradecer a los técnicos que estuvieron

implicados en los ensayos de campo y muestreos de la rizosfera, en especial a José Antonio.

A los compañeros de laboratorio, al Dr. Jose Antonio Lucas y a la Dr. Ana García

Villaraco por su ayuda inestimable en el campo de la estadística, la filogenia y la diversidad, su

apoyo personal y por compartir momentos muy agradebles. A Belén, Enrique, Ángela, Helena

por los buenos momentos en el laboratorio y en la comida. También a todos los compañeros

que ya no están en nuestro laboratorio, Jorge Barriuso, Jorge García, Elena Algar y Daniel

García.

A su vez, quiero agradecer a los integrantes del CEU que me han permitido disfrutar de

agradables conversaciones, de las que siempre se aprenden cosas, al Dr. Emilio Herrera, la

Dra. Nuria Acero, al Dr. José Alfredo, al Dr. Antonio Galán, la Dra. Pilar Pardo, al Dr. Antonio

Pérez, al Dr. Jose Ángel Navarro, y evidentemente otras personas que no me cabrían en esta

lista de agradecimientos.

También quisiera agradecer a la Dra. Mª Isabel García Luque y la Dra. Mª Teresa Serra

Yoldi por sus grandes enseñanzas durante la etapa que pasé en el CIB-CSIC.

A los amigos, compañeros que se han interesado y mostrado su cariño por esta tesis,

que no son pocos.

Quiero agradecer a mi familia, en especial a mis padres y a mi hermana. Gracias por

vuestro amor incondicional, ayuda, y por haberme, de alguna forma, introducido el amor por la

Ciencia. Boni, al final todo llega.

Y finalmente quiero agracer a Elisa,… no tengo palabras… GRACIAS.

Esta memoria está dedicada a un gran Docente-Investigador y Persona, mi Padre

ÍNDICE

1. Introducción General ................................................................................................................................ 1

1. 1 Papaver somniferum ........................................................................................................................ 2

Reseña histórica ................................................................................................................................... 2

La planta y ciclo vegetativo .................................................................................................................. 4

1. 2 Cultivo de adormidera, producción de materia prima y consumo de opioides naturales y

semisintéticos .......................................................................................................................................... 9

1. 3 Metabolismo secundario................................................................................................................ 13

Alcaloides de tipo morfinanos. Definición, estructura y biosíntesis .................................................. 16

Efectos farmacológicos ...................................................................................................................... 24

1. 4 El microbioma y bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetativo (PGPR) .................................. 26

La rizosfera ......................................................................................................................................... 26

Efecto de la planta sobre la rizosfera................................................................................................. 27

Efecto del sistema edáfico sobre la planta ........................................................................................ 28

Mecanismos de acción de las PGPR ................................................................................................... 30

Respuesta defensiva de las plantas ................................................................................................... 32

Activación de la respuesta inmune innata: Reconocimiento y transducción de señal ...................... 34

Resistencia Sistémica Adquirida y Resistencia Sistémica Inducida .................................................... 35

1. 5 Inducción del metabolismo secundario: Elicitación ........................................................................ 39

1. 6 Plan de trabajo y objetivos .............................................................................................................. 42

Estudio de cepas PGPRs como agentes elicitores del metabolismo de Papaver somniferum ................... 46

1. 1 Introducción .................................................................................................................................... 46

2. 2 Plan de trabajo y objetivos ............................................................................................................. 47

2. 3 Materiales y Métodos .................................................................................................................. 48

Material biológico .............................................................................................................................. 48

Diseño Experimental .......................................................................................................................... 51

Medida de fotosíntésis. ..................................................................................................................... 62

Análisis expresión génica ................................................................................................................... 64

Cuantificación de alcaloides .............................................................................................................. 65

Análisis estadístico ............................................................................................................................. 66

II

2. 4 Resultados .................................................................................................................................... 67

Evaluación de la potencialidad de cepas PGPR en la mejora de la germinación y emergencia de

Papaver somniferum. ......................................................................................................................... 67

Evaluación de la capacidad de las cepas PGPR para inducir procesos fisiológicos de interés en

Papaver somniferum en condiciones de invernadero ....................................................................... 71

Ensayos de Campo. Aplicación de cepas PGPR seleccionadas en fincas de cultivo de Papaver

somniferum ........................................................................................................................................ 79

2. 5 Discusión ..................................................................................................................................... 123

2. 6 Conclusiones ............................................................................................................................... 143

3. Aislamiento de bacterias con potencial PGPR y Estudio metagenómico de suelos rizosféricos de

cultivo de Papaver somniferum ................................................................................................................ 146

3.1 Introducción .............................................................................................................................. 146

3.2 Plan de trabajo y objetivos ........................................................................................................ 149

3.3 Materiales y Métodos ............................................................................................................... 149

Zonas de muestreo .......................................................................................................................... 149

Diseño experimental ........................................................................................................................ 151

Estudio metagenómico del microbioma rizosférico de Papaver somniferum ................................ 152

Estudio in vitro del potencial de promoción del crecimiento vegetal de las cepas bacterianas ..... 156

Estudio genético de las cepas potencialmente promotoras del crecimiento vegetal ..................... 157

Estudio in vitro del potencial de cepas bacterianas en la promoción de la germinación de semillas

de Papaver somniferum ................................................................................................................... 159

3. 4 Resultados ................................................................................................................................. 160

Estudio metagenómico de Biodiversidad ........................................................................................ 160

Aislamiento y clasificación de rizobacterias .................................................................................... 171

3.5 Discusión .................................................................................................................................... 186

3. 6 Conclusiones .............................................................................................................................. 193

Conclusiones Generales ........................................................................................................................... 196

Bibliografía................................................................................................................................................ 199

Anexos ...................................................................................................................................................... 220

III

ÍNDICE FIGURAS

Figura 1.1 Descripción de la planta Papaver somniferum. a) Raíz pivotante principal de Papaver

somniferum. b) Detalle de la planta en roseta. c) Distribución de las hojas de la base en roseta. d) Tallos

poco ramificados, con cápsula floral. e) Flores de un cultivo comercial de Papaver somniferum. f) Detalle

de una cápsula. g) Detalle del interior de la cápsula seca, donde se aprecia el contenido en semillas. h)

Semilla madura (Fotos: a-g: A. Bonilla; h: J.A. Lucas. USP-CEU). .................................................................. 6

Figura 1.2 Fases durante el periodo de floración de Papaver somniferum. a) Elongación del tallo y

formación del botón floral (entallado). b) Curvatura del botón floral, “enganche”. c) y d) Antesis, donde

se aprecia la apertura del botón floral y la conformación de la flor. e) Cápsula en formación. f) Cápsula

en maduración (fotos A. Bonilla). ................................................................................................................. 8

Figura 1.3. a) Producción mundial de paja de adormidera rica en morfina (M) equivalente en toneladas

de morfina. Periodo 1995-2014. b) Producción mundial de paja de adormidera rica en tebaína (T)

equivalente en toneladas de tebaína. Periodo 2005-2014 (INCB. 2016). .................................................. 10

Figura 1.4 Producción Mundial de paja de adormidera rica en morfina (M) y tebaína (T) en el 2014. a)

Principales países productores de materia prima, en toneladas, rica en morfina durante el año 2014. El

porcentaje representa la producción mundial. b) Principales países productores de materia prima, en

toneladas, rica en tebaína durante el año 2014. El porcentaje representa la producción mundial (INCB,

2016.).......................................................................................................................................................... 10

Figura 1.5 Superficie (ha) destinada al cultivo de Papaver somniferum (M) en España y toneladas (tn)

cosechadas de paja de adormidera rica en morfina, durante el periodo 2007-2014 (INCB, 2016). .......... 12

Figura 1.6. a) Consumo de morfina en toneladas a nivel mundial y en Kg en España, durante el periodo

de tiempo 2010-2014. b) Consumo de codeína en toneladas a nivel mundial y en toneladas en España,

durante el periodo de tiempo 2010-2014 (INCB, 2016). ............................................................................ 12

Figura 1.7 Distribución del consumo en porcentaje de morfina en el año 2014. Las cifras entre

paréntesis indican los porcentajes de la población mundial (INCB, 2016). ................................................ 13

Figura 1.8 Integración del metabolismo primario y secundario ................................................................. 15

Figura 1.9 Representación de las rutas de biosíntesis de los principales grupos de alcaloides (Wink, 2010)

.................................................................................................................................................................... 17

Figura 1.10 Ruta de biosíntesis del alcaloide Norcoclaurina, a través de la transformación de la tirosina

(PMN, 2014) ............................................................................................................................................... 18

Figura 1.11 Ruta de biosíntesis del alcaloide (S)-Reticulina, a través de la transformación de la

Norcoclaurina (PMN, 2014) ........................................................................................................................ 19

Figura 1.12 Ruta de biosíntesis del alcaloide Tebaína, a través de la transformación de la (S)-Reticulina

(PMN, 2014) ............................................................................................................................................... 20

Figura 1.13 Ruta de biosíntesis del alcaloide Morfina, a través de la transformación de la Tebaína (PMN,

2014)........................................................................................................................................................... 22

IV

Figura 1.14 Representación de una haz vascular de Papaver somniferum. Modelo propuesto en la

biosíntesis de la morfina en el haz vascular de adormidera. Se muestran las funciones de las células

acompañantes, elementos cribosos y células laticíferas. Los genes expresados en cada tipo de célula se

muestran en cursiva, mientras que las enzimas se indican en rojo. La flecha horizontal negra sugiere a la

tebaína como el principal alcaloide transportado entre los elementos cribosos y células laticíferas. En

azul se representan los diferentes alcaloides. El tamaño de la fuente es proporcional a la transcripción

relativa y los niveles de las enzimas (Modificado de Beaudoin y Facchini, 2014). ..................................... 23

Figura 1.15 Lugares de unión de la morfina, en el sistema nervioso central. Cuando se inyecta morfina a

una persona, ésta se desplaza rápidamente hacia el cerebro. Se produce la unión a los receptores

opiáceos que se concentran en las áreas del sistema de recompensa. Esta situación indica que la acción

de los opiáceos en el tálamo contribuye a su capacidad para producir analgesia (NIDA, 2014). .............. 25

Figura 1.16. Trilogía del suelo. Representación de la interacción entre la planta, el suelo y los

microorganismos, que conforman la rizosfera (Lynch, 1990) .................................................................... 27

Figura 1.17 Interacciones en la rizosfera entre la planta y las poblaciones microbianas (Pieterse et al

2016)........................................................................................................................................................... 32

Figura 1.18 Clasificación de los elicitores, asociado al tipo de respuesta inmunitaria de la planta. A)

Elicitores generales (no específicos) están asociados a una Inmunidad innata primaria. Incluyen,

Microbe-Associated Molecular Patterns (MAMPs), Damage-Associated Molecular Patterns (DAMPs,

Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs). Los dos últimos elicitores se caracterizan por activar

la respuesta defensiva de la planta, conocida como PTI (PAMP Triggered Inmunity). B) Elicitores

específicos, efectores (proteínas de avirulencia). Al ser reconocidos por la planta, activan una segunda

resistencia denominada ETI (Effector Triggered Inmunity) (Henry et al., 2012) ........................................ 33

Figura 1.19 Modelo en zig-zag que ilustra la respuesta cuantitativa del sistema inmune en plantas. En la

fase 1, la panta detecta MAMPs/PAMPs (rombos rojos), siendo reconocidos por receprotes PRRs,

activando “PTI”. En la fase 2, efectores del patógeno inactivan la PTI, proceso conocido como “effector-

triggered susceptibility” (ETS). En la fase 3, un efector es reconocido por la planta, activando la

Inmunidad inducida por efectores del patógeno (ETI), asociada a la activación de genes R y a una

Respuesta Hipersensible (HR) (Jones y Dangl, 2006). ................................................................................ 34

Figura 1.20 Inducción de la inmunidad innata de la planta, local (A) y sistémica (B). La resistencia

sistémica adquirida (SAR) corresponde a una activación de proteínas de defensa (PRs) a través del

incremento de ácido salicílico después de la precepción de un patógeno. La resistencia sistémica

inducida (ISR) se promueve tras la percepción de un microorganismo no patógeno. Ello con lleva un

estado de defensa potencial, conocido como “priming”, resultando en una activación más rápida y

efectiva, tras la detección de un patógeno (Henry , Thonart et al., 2012) ................................................. 36

Figura 1.21 Vías de transducción de señales que llevan a la SAR inducida por patógenos y a la ISR

inducida por rizobacterias en Arabidopsis thaliana. PAMPs modelo molecular asociado a patógenos, LPS

lipopolisacaridos, MAMPs modelo molecular asociado a PGPRs, JA ácido jasmónico, ET etileno, SA ácido

V

salicílico, PRs proteínas relacionadas con la patogénesis. Flechas sólidas indican estimulación, barras en

T indican represión (Pieterse et al., 1998 y Ton et al., 2006). .................................................................... 39

Figura 1.22 Inducción del metabolismo secundario de las plantas, mediante diversos elicitores, bióticos y

abióticos. Incluyendo microorganismos beneficiosos de la raíz (PGPRs) ................................................... 41

Figura 2.1 Diseño experimental general del estudio. Los diseños experimentales de cada objetivo se

detallan en cada apartado. ......................................................................................................................... 52

Figura 2.2 Selección de cepas PGPR potencialmente capaces de estimular la germinación de semillas de

adormidera cultivadas en condiciones in vitro. .......................................................................................... 53

Figura 2.3. Evaluación de la capacidad de cepas PGPR seleccionadas, para mejorar la germinación y

emergencia de plántulas en suelo, en condiciones controladas, a diferentes temperaturas (20°C y a 6°C).

.................................................................................................................................................................... 54

Figura 2.4 Estudios sobre el crecimiento y la fisiología de la planta en condiciones de invernadero. ....... 56

Figura 2.5 Estudio de la compatibilidad de cepas PGPRs seleccionadas frente a fitosanitarios de uso

común en el cultivo de Papaver somniferum. ............................................................................................ 57

Figura 2.6 Diseño experimental de la primera y segunda campaña de los ensayos de elicitación y

promoción del crecimiento en parcelas experimentales en campo. ......................................................... 58

Figura 2.7 Ubicaciones de parcelas experimentales de Papaver somniferum. Primera campaña: a) Navajo

del Provencio, b) Casa del Pozo. Segunda campaña: c) Casa las Torres, d) La Grajuela. Todas ellas

ubicadas en la provincia de Albacete. Las fincas seleccionadas presentan el área marcada en rosa

(SIGPAC. MAPAMA). ................................................................................................................................... 59

Figura 2.8 Distribución de los diferentes tratamientos en los ensayos de campo. Detalle de la

distribución de los tratamientos (cepas: Aur9, N21.4 y N5.18, 107ufc/mL.; pautas: Inicio de entallado (IE),

final de entallado (FE) e inicio de entallado y final de entallado, split (IE/FE)) realizados en mini-parcelas

de 15/20m2. ................................................................................................................................................ 59

Figura 2.9 Diseño experimental de los ensayos de elicitación y promoción del crecimiento en campo,

durante la tercera campaña. ...................................................................................................................... 61

Figura 2.10 Ubicaciones seleccionadas en la tercera campaña: a) Cherrycoca y b) Villalozano, en la

provincia de Albacete (SIGPAC. MAPAMA). ............................................................................................... 61

Figura 2.11 Ubicación Villalozano: aspecto de los diferentes estadios fenológicos del cultivo. La zona

captada en las fotografías corresponde a la parcela delimitada del ensayo. a) Aspecto fenológico del

cultivo durante la inoculación. b) Aspecto fenológico del cultivo durante la medición de los parámetros

de fotosíntesis (+18 dpi). c) Aspecto fenológico del cultivo en la cosecha (fotos A. Bonilla). .................... 62

Figura 2.12 Programa de Emisión de fluorescencia registrada durante el programa descrito e integrada

con el software MODFL2. ........................................................................................................................... 64

Figura 2.13 Germinación de semillas de adormidera tras el tratamiento con diez cepas PGPR (108 ufc

/mL.), y sus medios de cultivo libres de bacterias al 5% y el 10%, y controles no tratados. Los datos son la

VI

media de 3 réplicas (n=30) ± error estándar. Las diferentes letras indican diferencias significativas entre

los tratamientos de acuerdo a la prueba de LSD (p <0,05) ........................................................................ 68

Figura 2.14 Emergencia (%) de semillas de adormidera tratadas con Aur9, N21.4 y N5.18 a 20°C, en

suelo. Los datos son la media de 3 réplicas (n=30) ± error estándar. Las diferentes letras indican

diferencias significativas entre los tratamientos de acuerdo a la prueba de LSD (p <0,05). ...................... 69

Figura 2.15 Emergencia de semillas (%) en condiciones de frío a lo largo de 42 días post inoculación. a)

Aplicación mediante riego, b) aplicación mediante inmersión. Los datos son la media de 3 réplicas (n=30)

± error estándar. Diferentes letras (a, b, c) indican diferencias significativas entre los tratamientos de

acuerdo a la prueba de LSD (p <0,05). ........................................................................................................ 70

Figura 2.16 Parámetros fotosintéticos de plantas inoculadas con la cepa bacteriana Aur9. Inoculación

radical o foliar y control sin inocular. Fluorescencia mínima (F0) expresada como 10-1. Rendimiento

cuántico máximo del PSII (Fv/Fm). Rendimiento cuántico del PSII (ΦPSII). “Quenching” no fotoquímico

(NPQ). Los datos son la media de tres réplicas (n=6) ± error estándar. Letras diferentes indican

diferencias significativas entre tratamientos para cada parámetro (p < 0,05). ......................................... 71

Figura 2.17 Parámetros fotosintéticos de plantas inoculadas con la cepa bacteriana N21.4. Inoculación










Figura 2.19 Longitud del tallo en plantas inoculadas con la cepa bacteriana Aur9. Inoculación mediante

dos formas de aplicación (radical y foliar) y el control sin inocular. Los datos son la media de tres réplicas

(n=6) ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos para cada

parámetro (p < 0,05). ................................................................................................................................. 73

Figura 2.20 Longitud del tallo en plantas inoculadas con la cepa bacteriana N21.4. Inoculación mediante

dos formas de aplicación y el control sin inocular. Los datos son la media de tres réplicas (n=6) ± error

estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos para cada parámetro (p

< 0,05). ........................................................................................................................................................ 73




< 0,05). ........................................................................................................................................................ 74

VII

Figura 2.22 (a) Peso acumulado de paja y semillas determinando el peso total de las cápsulas de plantas

inoculadas con Aur9; (b) variación del porcentaje del peso acumulado de paja y semillas normalizado al

tratamiento Control. Los datos son la media de tres réplicas (n=6) ± error estándar. Letras diferentes

indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05)..................... 75


inoculadas con N21.4; (b) variación del porcentaje del peso acumulado de paja y semillas normalizado al


indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05)..................... 75




indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El # indica

diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). ................ 75

Figura 2.25 (a) Contenido de alcaloides: Morfina, codeína, tebaína y oripavina en paja de plantas de

adormidera inoculadas con la cepa Aur9 mediante dos pautas: radical y foliar. (b) Variación del

porcentaje en el contenido de alcaloides normalizado al tratamiento Control. Los datos son la media de

tres réplicas (n=6) ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre

tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05 .................................................................................... 76


adormidera inoculadas con la cepa N21.4 mediante dos pautas: radical y foliar. (b) Variación del



tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El * indica diferencias significativas en el contenido

total de alcaloides respecto al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El # indica

diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05) ................. 77





tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El # indica diferencias significativas frente al

tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05) ....................................................................... 77

Figura 2.28 (a) Contenido potencial de alcaloides: Morfina, codeína, tebaína y oripavina en paja de


porcentaje en el contenido potencial de alcaloides normalizado al tratamiento Control. Los datos son la

media de tres réplicas (n=6) ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre

tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). .................................................................................. 78

VIII















Figura 2.31 Nº de plantas/m2, Nº de cápsulas/m2 y Nº cápsulas/Nº plantas en la finca de producción

Navajo Provencio de la 1ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9 (a, b, c), N21.4

(d, e, f) y N5.18 (g, h, i), en tres pautas: inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado (FE). Los

datos son la media ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre

tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). .................................................................................. 81

Figura 2.32 Nº de plantas/m2, Nº de cápsulas/m2 y Nº cápsulas/Nº plantas en la finca de producción Casa

del Pozo de la 1ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9 (a, b, c), N21.4 (d, e, f)

y N5.18 (g, h, i), en tres pautas: inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado (FE). Los datos

son la media ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de

acuerdo a la prueba LSD (p <0,05).............................................................................................................. 82

Figura 2.33 (a, c, e) Peso acumulado de paja y semillas determinando el peso total de las cápsulas/m2;

(b, d, f) variación del porcentaje del peso acumulado de paja y semillas referenciado al tratamiento

Control, en la finca de producción Navajo Provencio en la 1ª campaña. De plantas de adormidera

inoculadas con las cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final

de entallado (FE). Los datos son la media ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias

significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El # indica diferencias

significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05) ................................... 83

Figura 2.34 Peso acumulado de paja y semillas determinando el peso total de las cápsulas/m2 (a, c, e);

variación del porcentaje del peso acumulado de paja y semillas referenciado al tratamiento Control (b,

d, f), en la finca de producción Casa del Pozo en la 1ª campaña. De plantas de adormidera inoculadas

con las cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final de

entallado (FE). Los datos son la media ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias

significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). ................................................... 85

IX

Figura 2.35 Peso acumulado de paja y semillas determinando el peso total de las cápsulas/número de

plantas por metro cuadrado (a, c, e); variación del porcentaje del peso acumulado de paja y semillas

referenciado al tratamiento Control (b, d, f), en la finca de producción Navajo Provencio en la 1ª

campaña. De plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio

de entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado (FE). Los datos son la media ± error estándar. Letras

diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El *

indica diferencias significativas en el peso total de la cápsula respecto al tratamiento Control de acuerdo

a la prueba LSD (p <0,05). El # indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a

la prueba LSD (p <0,05) .............................................................................................................................. 86



referenciado al tratamiento Control (b, d, f), en la finca de producción Casa del Pozo en la 1ª campaña.

De plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio de

entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado (FE). Los datos son la media ± error estándar. Letras



a la prueba LSD (p <0,05). El + indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a

la prueba LSD (p <0,05) .............................................................................................................................. 87

Figura 2.37 Contenido de alcaloides: Morfina, codeína, tebaína y oripavina en paja de adormidera de la

finca de producción Navajo Provencio en la 1ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas

Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio de entallado (IE), inicio y final de entallado (IE/FE), y final de

entallado (FE). Contenido bruto de los morfinanos (a, c, e). Variación del porcentaje en el contenido de

alcaloides normalizado al tratamiento Control (b, d, f). Los datos son la media ± error estándar. Letras

diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El #

indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05) ...... 89


finca de producción Casa del Pozo en la 1ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas





indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05) ...... 90

Figura 2.39 Contenido potencial de alcaloides: Morfina, codeína, tebaína y oripavina en paja de

adormidera de la finca de producción Navajo Provencio en la 1ª campaña. Plantas de adormidera

inoculadas con las cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio de entallado (IE), inicio y final de

entallado (IE/FE), y final de entallado (FE). Contenido potencial de los morfinanos (a, c, e). Variación del

porcentaje potencial de alcaloides normalizado al tratamiento Control (b, d, f). Los datos son la media ±

X

error estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la

prueba LSD (p <0,05). El # indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la

prueba LSD (p <0,05) .................................................................................................................................. 91


adormidera de la finca de producción Casa del Pozo en la 1ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas

con las cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio de entallado (IE), inicio y final de entallado

(IE/FE), y final de entallado (FE). Contenido potencial de los morfinanos (a, c, e). Variación del




prueba LSD (p <0,05) .................................................................................................................................. 93

Figura 2.41 Parámetros fotosintéticos de plantas de adormidera inoculadas durante la 2ª campaña con

Aur9, en tres pautas inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado (FE). Fluorescencia mínima

(F0) expresada como 10-1. Rendimiento cuántico máximo del PSII (Fv/Fm). Rendimiento cuántico del PSII

(ΦPSII). “Quenching” no fotoquímico (NPQ). Los datos son la media de tres réplicas (n=9) ± error

estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba

LSD (p <0,05)............................................................................................................................................... 94


N21.4, en tres pautas inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado (FE). Fluorescencia mínima


(ΦPSII). “Quenching” no fotoquímico (NPQ). Los datos son la media (n=9) ± error estándar. Letras

diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). .. 95





diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). .. 96

Figura 2.44 Nº de plantas/m2, Nº de cápsulas/m2 y Nº cápsulas/Nº plantas en la finca de producción Las

Torres en la 2ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9 (a, b, c), N21.4 (d, e, f) y

N5.18 (g, h, i), en tres pautas: inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado (FE). Los datos son

la media ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de


Figura 2.45 Nº de plantas/m2, Nº de cápsulas/m2 y Nº cápsulas/Nº plantas en la finca de producción La

Grajuela en la 2ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9 (a, b, c), N21.4 (d, e, f)




XI



d, f), en la finca de producción Las Torres en la 2ª campaña. De plantas de adormidera inoculadas con las

cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado (FE).

Los datos son la media ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre

tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El * indica diferencias significativas en el peso total

de la cápsula respecto al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El # indica




d, f), en la finca de producción La Grajuela en la 2ª campaña. De plantas de adormidera inoculadas con

las cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado

(FE). Los datos son la media ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre



diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05) ............... 100



referenciado al tratamiento Control (b, d, f), en la finca de producción Las Torres en la 2ª campaña. De

plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio de entallado

(IE), split (IE/FE), y final de entallado (FE). Los datos son la media ± error estándar. Letras diferentes

indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El * indica

diferencias significativas en el peso total de la cápsula respecto al tratamiento Control de acuerdo a la

prueba LSD (p <0,05). ............................................................................................................................... 102



referenciado al tratamiento Control (b, d, f), en la finca de producción La Grajuela en la 2ª campaña. De






prueba LSD (p <0,05). ............................................................................................................................... 103


finca de producción Las Torres en la 2ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9,

N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio de entallado (IE), inicio y final de entallado (IE/FE), y final de


XII



indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El #

indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). ... 105


finca de producción La Grajuela en la 2ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9,






indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). ... 106


adormidera de la finca de producción Las Torres en la 2ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas


(IE/FE), y final de entallado (FE). Contenido potencial de los morfinanos (a, c, e). Variación del porcentaje

potencial de alcaloides normalizado al tratamiento Control (b, d, f). Los datos son la media ± error


LSD (p <0,05)............................................................................................................................................. 108


adormidera de la finca de producción La Grajuela en la 2ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas





LSD (p <0,05). El # indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba

LSD (p <0,05)............................................................................................................................................. 109

Figura 2.54 Análisis de componentes principales (PCA) realizado con los datos de biomasa, contenido de

alcaloides (morfina, tebaína y codeína) en la 1º y 2º campaña, en cuatro parcelas, con tres cepas (Aur9,

N21.4 y N5.18), y tres pautas de inoculación (IE, IE/FE y FE). .................................................................. 111


alcaloides (morfina, tebaína y codeína), durante la 1ª campaña, en dos parcelas, con tres cepas (Aur9,





XIII

Figura 2.57 Representación de los parámetros fotosintéticos: F0 (expresada como 10-1), Fv/Fm, φPSII y

NPQ, medidos durante la 3ª campaña con N5.18 al final de entallado (FE) en la finca Villalozano (a) y en

Cherrycoca (b). Los datos son la media de seis réplicas (n=3) ± error estándar. Letras diferentes indican

diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). .............................. 115

Figura 2.58 Expresión génica de los genes Ps-T6ODM (GQ500139.1), Ps-CODM (GQ500141.1) y Ps-COR

(FJ624147.1), normalizados con la expresión del gen de la β-actina (AB574418.1). El asterisco (*) indica

diferencias significativas del tratamiento frente al Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). ........ 116


Villalozano en la 3ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con la cepa N5.18 al final del entallado

(FE). Los datos son la media ± error estándar (n=6). Letras diferentes indican diferencias significativas

entre los tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). ................................................................. 117


Cherrycoca en la 3ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con la cepa N5.18 al final del entallado


entre los tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). ................................................................. 117

Figura 2.61 Peso acumulado de paja y semillas de plantas de adormidera inoculadas con las cepas N5.18

al final de entallado (FE) (a); variación del porcentaje del peso acumulado de paja y semillas

referenciado al tratamiento Control (b), en la finca de producción Villalozano en la 3ª campaña. Los

datos son la media ± error estándar (n=6). Letras diferentes indican diferencias significativas entre

tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). ................................................................................ 117

Figura 2.62 Peso acumulado de paja y semillas determinando el peso total de las cápsulas/m2 (a);

variación del porcentaje del peso acumulado de paja y semillas referenciado al tratamiento Control (b),

en la finca de producción Cherrycoca en la 3ª campaña. De plantas de adormidera inoculadas con las

cepas N5.18 al final de entallado (FE). Los datos son la media ± error estándar (n=6). Letras diferentes

indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05)................... 118

Figura 2.63 (a) Peso acumulado de paja y semillas de plantas de adormidera inoculadas con la cepa

N5.18 al final de entallado (FE) en la finca de producción Villalozano en la 3ª campaña. (b) variación del

porcentaje del peso acumulado de paja y semillas referenciado al tratamiento Control. Los datos son la

media ± error estándar (n=6). Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de

acuerdo a la prueba LSD (p <0,05)............................................................................................................ 118


N5.18 al final de entallado (FE) en la finca de producción Cherrycoca en la 3ª campaña. (b) variación del



acuerdo a la prueba LSD (p <0,05)............................................................................................................ 119

Figura 2.65 Contenido de alcaloides de plantas de adormidera inoculadas con la cepa N5.18 al final de

entallado (FE). (a ) Morfina, codeína, tebaína y oripavina en paja de adormidera de la finca de

XIV

producción Villalozano en la 3ª campaña. (b) Variación del porcentaje en el contenido de alcaloides

normalizado al tratamiento Control Los datos son la media ± error estándar (n=6). .............................. 119

Figura 2.66 Contenido de alcaloides en plantas de adormidera inoculadas con la cepa N5.18 al final de


producción Cherrycoca en la 3ª campaña. (b) Variación del porcentaje en el contenido de alcaloides

normalizado al tratamiento Control. Los datos son la media ± error estándar (n=6). Letras diferentes


Figura 2.67 Contenido potencial de alcaloides en plantas de adormidera inoculadas con la cepa N5.18 al

final de entallado (FE). (a) Morfina, codeína, tebaína y oripavina en paja de adormidera de la finca de









Figura 2.69 Producción total de adormidera, peso de las cápsulas, real y potencial, en dos parcelas de

producción. El asterisco (*) indica diferencias significativas del tratamiento frente al Control de acuerdo

a la prueba LSD (p <0,05). ......................................................................................................................... 122

Figura 2.70 Densidad de cultivo: plantas/m2 y cápsulas/m2 en las diferentes parcelas, a lo largo de las

tres campañas de estudio. Letras distintas indican diferencias significativas entre las distintas campañas

para el número de plantas/m2 (a, b, c) y para el número de cápsulas/m2 (m, n, o, p) según el test LSD

(p<0,05). ................................................................................................................................................... 122

Figura 3.1 Distribución de la edad de la población en los diferentes continentes durante el año 2015 y la

estima para el año 2050 (ONU, 2015) ...................................................................................................... 146

Figura 3.2 Localización de las parcelas (área rosa) donde se realizaron los muestreos de la rizosfera de

cultivo de Papaver somniferum. a) Término municipal de Barrax (Albacete). b) Término municipal

Malpica de Tajo (Toledo) (SIGPAC, 2014) ................................................................................................. 150


detallan en cada apartado. ....................................................................................................................... 152

Figura 3.4 Diseño experimental. Estudio metagenómico de la biodiversidad de la rizosfera de Papaver

somniferum de dos zonas de muestreo ................................................................................................... 152

Figura 3.5 Diseño experimental. Se aislaron todas las posibles rizobacterias de las tres réplicas de cada

muestreo. Se realizó estudio in vitro del potencial de promoción del crecimiento vegetal de las cepas

bacterianas y finalmente se realizó un análisis genético de las cepas mediante el gen del 16S (rrs) ...... 156

XV


adormidera cultivadas en condiciones in vitro. ........................................................................................ 159

Figura 3.7 Abundancia relativa (%) de OTUs asociados a la categoría phylum en Barrax y Malpica de Tajo.

.................................................................................................................................................................. 162

Figura 3.8 Diagrama de Venn mostrando los OTUs compartidos y endémicos. La distancia considerada

entre OTUs fue de 0,1 (90% de similitud), de las parcelas de muestreo Barrax y Malpica de Tajo. ........ 163

Figura 3.9 Curvas de rarefacción de Barrax y Malpica de Tajo. La distancia considerada entre OTUs fue de

0,1 (familia). En rojo Barrax (Albacete), en azul Malpica de Tajo (Toledo). ............................................. 163

Figura 3.10 Riqueza relativa (%) de OTUs con una distancia de 0,1, asociados a la categoría taxonómica

familia, en Barrax y Malpica de Tajo. ....................................................................................................... 164


entre OTUs fue de 0,03 (97%), de las parcelas de muestreo Barrax y Malpica de Tajo. .......................... 165

Figura 3.12 Curvas de rarefacción de Barrax y Malpica de Tajo. La distancia considerada entre OTUs fue

de 0,03 (género). En rojo Barrax (Albacete), en azul Malpica de Tajo (Toledo). ...................................... 165


familia, en Barrax y Malpica de Tajo. ....................................................................................................... 166

Figura 3.14 Representación de OTUs con un 90% de identidad de las secuencias obtenidas de Barrax y

Malpica de Tajo. ....................................................................................................................................... 168

Figura 3.15 Árbol filogenético realizado con las secuencias de las rizobacterias de Papaver somniferum

en Barrax. ................................................................................................................................................. 169


en Malpica de Tajo. .................................................................................................................................. 170

Figura 3.17 Rizobacterias aisladas de la rizosfera de cultivos de Papaver somniferum en las provincias de

Albacete y Toledo. Representación gráfica del número de rizobacterias aisladas por réplica y finca de

muestreo. ................................................................................................................................................. 171

Figura 3.18 Distribución porcentual de las cepas que presentaron una o más actividades PGPR

ensayadas, asiladas de los muestreos de Barrax y Malpica de Tajo. ........................................................ 171

Figura 3.19 Porcentaje de las actividades PGPR ensayadas, producción de sideróforos, producción de

fosfatasas, producción de quitinasa y auxinas. a) Barrax. b) Malpica de Tajo ......................................... 172

Figura 3.20 Porcentaje de bacterias con una o diferentes actividades PGPR. a) Barrax. b) Malpica de Tajo.

.................................................................................................................................................................. 173

Figura 3.21 Porcentaje de géneros en las dos parcelas de muestreo. a) Barrax. b) Malpica de Tajo ...... 173

Figura 3.22 Diagrama de Venn, donde se aprecia los géneros endémicos de cada zona y los comunes en

ambas regiones ........................................................................................................................................ 174

Figura 3.23 Árbol filogenético no enraizado construido en base a las secuencias de 1500pb del gen rrs

que codifica para el ARNr 16S de las rizobacterias aisladas de cultivos de Papaver somniferum en la

localidad de Barrax. Entre paréntesis se indica la capacidad PGPR identificada, (P: fosfatasas; AIA:

XVI

auxinas). Una Secuencia del Phylum Cyanobacteria se utilizó como outgrup. El * indica la cepa

seleccionada para el estudio de germinación (Tamura et al., 2013). ....................................................... 176



localidad de Malpica de Tajo. Entre paréntesis se indica la capacidad PGPR identificada, (P: fosfatasas;

AIA: auxinas). Una Secuencia del Phylum Cyanobacteria se utilizó como outgrup. El * indica la cepa

seleccionada para el estudio de germinación Tamura et al., 2013). ........................................................ 177

Figura 3.25 Tasa de germinación acumulada de semillas de adormidera tras el tratamiento con cepas

PGPR aisladas de la rizosfera de Papaver somniferum en la parcela de Barrax, Albacete. Tratamientos

realizados: cepa (108 ufc /mL.) y sus medios de cultivo libres de bacterias al 5% y el 10%, y controles no

tratados. Los datos son la media de 3 repeticiones con 30 semillas cada una ± error estándar. Las

diferentes letras indican diferencias significativas entre los tratamientos de acuerdo a la prueba de LSD

(p <0,05) en cada tiempo de muestreo. ................................................................................................... 183

Figura 3.26 Germinación de semillas Malpica de Tajo, Toledo, Albacete. Tratamientos realizados con la

cepa (108 ufc /mL.) y sus medios de cultivo libres de bacterias al 5% y el 10%, y controles no tratados.

Los datos son la media de 3 repeticiones con 30 semillas cada una ± error estándar. Las diferentes letras

indican diferencias significativas entre los tratamientos de acuerdo a la prueba de LSD (p <0,05) ........ 185

Figura 4.1 Temperatura media (C) durante los meses de desarrollo del cultivo de Papaver somniferum,

en las tres campañas de estudio y durante el periodo comprendido entre 1981-2010 (AEMET, 2016a).

.................................................................................................................................................................. 220

Figura 4.2 Humedad relativa (%) media durante los meses de desarrollo del cultivo de Papaver

somniferum, en las tres campañas de estudio y durante el periodo comprendido entre 1981-2010

(AEMET, 2016a). ....................................................................................................................................... 221

Figura 4.3 Precipitación acumulada (mm) durante los meses de desarrollo del cultivo de Papaver

somniferum, en las tres campañas de estudio y durante el periodo comprendido entre 1981-2010

(AEMET, 2016a). ....................................................................................................................................... 222

XVII

ÍNDICE TABLAS

Tabla 1.1 Número de metabolitos secundarios conocidos. Modificado de Wink, 2010. ............................ 15

Tabla 2.1 Características de las cepas PGPR utilizadas en este trabajo: Morfología, Gram, origen,

actividad biológica, alineamiento más significativo de la secuencia parcial del gen que codifica para el

ARNr 16S en GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). CECT: Colección Española de Cultivos

Tipo. ............................................................................................................................................................ 48

Tabla 2.2 Lista de cebadores utilizados en la técnica de qPCR y sus características. ................................. 65

Tabla 2.3 Compatibilidad cepa PGPR Vs fitosanitarios............................................................................... 80

Tabla 2.4 P-valor proporcionados por Análisis de Redundancia basado en las distancias (db-RDA)

realizado con los parámetros analizados (número de plantas, número de cápsulas, peso cápsula, peso

paja, peso semillas, contenido de alcaloides) obtenidos tras la inoculación de plantas de adormidera en

dos campañas, en cuatro parcelas (Navajo del Provencio, Casa del Pozo, Las Torres, La Grajuela),

mediante tres cepas (Aur9, N21.4 y N5.18) con tres pautas de aplicación (IE, FE, IE/FE). Valores de

p≤0,05 indica diferencias significativas, marcados con asterisco. ............................................................ 111

Tabla 3.1 Caracterización de los suelos procedentes de las zonas de muestreo. .................................... 151

Tabla 3.2 Resultados de la secuenciación de las muestras provenientes de suelo, mediante secuenciación

masiva (454). ............................................................................................................................................ 160

Tabla 3.3 Número total de secuencias y longitud media de cada una de las muestras de suelo, después de

la eliminación de cebadores y filtrado de secuencias a mayores de 250nt. ............................................. 161

Tabla 3.4 Número de OTUs identificados según las diferentes distancias moleculares en las dos parcelas

de muestreo .............................................................................................................................................. 161

Tabla 3.5 Identificación de las secuencias a nivel taxonómico de phylum .............................................. 162

Tabla 3.6 Índices de biodiversidad a nivel de familia ............................................................................... 165

Tabla 3.7 Índices de biodiversidad a nivel de género ............................................................................... 167

Tabla 3.8 P-valor obtenido mediante la herramienta S-Libshuff .............................................................. 167

Tabla 3.9 Asociación de las actividades PGPR con los géneros aislados, en porcentaje, procedentes del

muestreo de Barrax y Malpica de Tajo. .................................................................................................... 175

Tabla 3.10 Cepas seleccionadas de la rizosfera de adormidera aislada de Barrax .................................. 178

Tabla 3.11 Cepas seleccionadas de la rizosfera de adormidera aislada de Malpica de Tajo ................... 179

Tabla 4.1 Valores medios de temperatura, humedad y precipitación acumulada en las tres campañas de

estudio (AEMET, 2016). ............................................................................................................................ 222

I.INTRODUCCIÓN GENERAL

Capítulo 1

1

1. Introducción General

Desde mediados del siglo XIX, la esperanza de vida al nacer se ha incrementado dos años y medio

cada década, situándose en el año 2014 en los 70,4 años a nivel mundial y en 82,8 años en España

(Christensen et al., 2009; OMS, 2016). Este aumento en la esperanza de vida está asociado a una mayor

incidencia de la tasa de morbilidad, lo que conlleva un padecimiento de la sensación de dolor, ya sea

agudo o crónico.

Según la Real Academia Española (RAE), la definición de la palabra dolor es: “Sensación molesta y

aflictiva de una parte del cuerpo por causa interior o exterior”. Según la Asociación Internacional para el

Estudio del Dolor (IASP, “International Association of the Study of Pain”) el dolor se define como "una

experiencia sensorial y emocional desagradable asociada a un daño real o potencial del tejido”. Por ello,

se hace énfasis en que el dolor es una sensación subjetiva compleja, formada por múltiples

componentes (Timoneda, 1996)

Componente sensorial-discriminativo: hace referencia a cualidades estrictamente sensoriales

del dolor, tales como su localización, calidad, intensidad y duración.

Componente cognitivo-evaluativo: analiza e interpreta el dolor en función de lo que se está

sintiendo y lo que puede ocurrir.

Componente afectivo-emocional: por el que la sensación dolorosa se acompaña de ansiedad,

depresión, temor, angustia.

La naturaleza compleja del dolor, así como la interacción de las diferentes categorías, pueden

convertir la presencia del dolor en una experiencia agotadora, unida a un sufrimiento psicológico con

síntomas de ansiedad y depresión que pueden desembocar en repercusiones negativas sobre la calidad

de vida. Por lo que el tratamiento del dolor, de la naturaleza que fuere, es una de las prioridades por

parte de las autoridades sanitarias (OMS, 1996), para mejorar la calidad de vida de los enfermos y a su

vez, del resto de la sociedad.

Actualmente, el tratamiento del dolor por excelencia es la morfina y sus derivados que se extraen

hoy por hoy de la planta de adormidera, amapola blanca, Papaver somniferum.

Su nombre científico Papaver somniferum proviene de la raíz en latín pap “hinchado”, por la

forma globosa del fruto y el epíteto somniferum "induce al sueño”, de aquí su uso justificado para

inducir al sueño, sedar o aliviar el dolor (Font Quer, 1962). Es una planta de gran interés farmacológico,

debido a la formación de alcaloides tipo bencilisoquinoleicos (BIAs), de los cuales los morfinanos tienen

un uso fundamentalmente analgésico, además de otros usos de interés farmacológicos (Bruneton et al.,

2001).

La producción de la planta es estrictamente agronómica, puesto que los alcaloides se sintetizan

principalmente en los frutos, de tipo cápsula, implicando diversos tejidos celulares (Beaudoin y Facchini,

Introducción general

2

2014). Esta especialización extrema ha impedido la obtención de morfinanos mediante la metodología

de cultivo in vitro, técnica que se ha utilizado con éxito en otras especies vegetales de interés medicinal,

con rendimientos altos y, por lo tanto, económicamente rentable (Leonard et al., 2009; Algar et al.,

2012). Por ello, la producción agrícola es la única vía de obtención de morfinanos, y cualquier estrategia

que pueda mejorarla es de extraordinario interés.

Con este objetivo, la aplicación de bacterias beneficiosas para incrementar la producción agrícola

es una de las posibilidades biotecnológicas disponibles, ya que se ha demostrado la capacidad de ciertas

cepas bacterianas para estimular el metabolismo de las plantas (Lugtenberg y Kamilova, 2009; Vejan et

al., 2016). La presencia de determinados elicitores bióticos capaces de mejorar la producción de

alcaloides morfinanos, a través de la modificación de la biosíntesis de estos compuestos, constituyen la

hipótesis fundamental de esta memoria.

1 Papaver somniferum

Reseña histórica

La adormidera es reconocida como una de las primeras plantas utilizadas con fines medicinales

por la humanidad, aunque el lugar y la fecha de su descubrimiento no han podido ser fijados. En las

excavaciones arqueológicas de Unteruhlding, cerca del lago Constance en Alemania, se descubrieron

restos vegetales de semillas y cápsulas, las cuales fueron datadas en más de 6000 años, época

perteneciente al Neolítico. A su vez, existen más datos de la explotación de las cápsulas en diversos

lugares de Europa: Suiza, Cueva de los Murciélagos (Granada, España), Francia y Hungría durante el

mismo periodo (Tétényi, 1997).

Es en el Imperio Sumerio (3500 años a.C.) donde se tiene el primer testimonio de su uso. A través

de la escritura cuneiforme realizada sobre tablillas de arcilla, se describía la forma de recolección del

opio “el jugo de la adormidera fue recolectada muy temprano por la mañana”. En este caso, el nombre

de la planta se designaba como “Hul Gil”, planta de la felicidad (Askitopoulou et al., 2002). A lo largo de

este periodo, la adormidera aparece en la región del Mediterráneo Oriental, extendiéndose por el Norte

de África y Próximo Oriente. Los asirios (1800-600 a.C.), cultura que sucedió a los sumerios en la región,

nombraron al “jugo” de la adormidera “arat-pa-pal”, pudiendo ser el origen etimológico de la palabra

latina “papaver”. Durante este periodo también se han descubierto escritos, en los que se detallaba

como se realizaba la recolección del opio (grasa del león), “muy temprano por la mañana, ancianas y

niños recogen el jugo, tras el raspado de las cápsulas con pequeños cuchillos de hierro, y lo depositan

dentro de un recipiente de barro” (Kritikos y Papadaki, 1967).

En épocas más recientes, la medicina griega la aplicó en el tratamiento de los dolores.

Dioscórides (40-90 d.C.) habla extensamente de la adormidera, distinguiendo el opio, el zumo de la

cápsula y la infusión de la planta troceada, el meconio (Dioscórides, 1570). Según la bibliografía, la

palabra opio, deriva de la palabra griega opos, que significa “jugo”, siendo utilizada desde el siglo I d.C.

Capítulo 1

3

El romano Galeno de Pérgamo (130-200 d.C.), médico en la corte del emperador Marco Aurelio,

describió el uso del opio como tranquilizante, antitusivo y antipirético, siendo uno de los múltiples

compuestos que contenía la Triaca Magna, antídoto y medicamento universal (Puerto, 2009).

Durante la expansión del imperio árabe, el conocimiento del opio y el cultivo de la adormidera se

extendieron por todo el mundo de forma muy temprana, incluido Oriente. Avicena, Abu-Ali-Iba-Sina,

(980-1037 d.C.), médico y filósofo árabe, realizó múltiples estudios de las aplicaciones de la planta.

Tanto Moshé ben Maimón, más conocido como Maimónides (1135-1204 d.C.), médico, rabino y teólogo

cordobés, así como su contemporáneo árabe y también cordobés Ibn Rushd, Averroes (1126-1198 d.C.)

médico y filósofo, recogen en su literatura diferentes aplicaciones y usos de la adormidera (Bernath,

2003).

A mediados del siglo XVI, el alquimista Paracelso (1493-1541), elaboró una tintura alcohólica de

opio, cuyo nombre fue Láudano “algo para ser alabado”. La tintura de Láudano ha tenido un amplio uso

desde el siglo XVII hasta fechas recientes, siendo el Láudano de Sydenham el de mayor uso. Esta fórmula

magistral estaba compuesta de azafrán, clavo, canela, vino de Málaga y opio (Bruneton et al., 2001).

Desde el siglo XVIII, el cultivo de adormidera en Asía, especialmente la India bajo dominio

británico, tuvo una gran importancia. Tal fue su uso que la “East India Company” poseía el monopolio

del comercio de la totalidad del opio producido y comercializado en las colonias inglesas. El comercio

clandestino de opio por parte de Inglaterra hacia China desencadenó en varios conflictos bélicos entre

las dos potencias, Guerras del Opio (1839-1842, 1856-1860). Como resultado China fue derrotada en el

conflicto, firmando el Tratado de Nankín, por el que entre otras concesiones China cedía la soberanía de

Hong Kong a los ingleses, hasta su devolución en 1997 (López-Muñoz y González, 2007).

En 1806, el farmacéutico alemán Friedrich Wilhelm Sertürner, consiguió aislar por primera vez

varios compuestos cristalinos del opio. Uno de ellos presentaba la propiedad de ser un potente

narcótico. Fue la primera vez que se aisló e identificó el principio activo de una sustancia, un alcaloide.

Este compuesto lo denominó morfina, en recuerdo a Morfeo (Dios griego de los sueños) (Brownstein,

1993). Hasta mediado del siglo XIX, el consumo de opio se realizaba mayoritariamente de forma oral, a

través de infusiones, pastillas de opio o mediante la mezcla con tabaco para ser fumado. Pero en el año

1853, Alexander Wood y Charles Pravaz, mejoraron el diseño de la aguja hipodérmica. De esta forma,

Wood inyectó morfina vía intravenosa para aliviar el dolor, publicando el trabajo titulado "A New

Method for Treating Neuralgia by the Direct Application of Opiates to Painful Points" (Edinburgh

Medical and Surgical Journal, 1855).

En 1874, el inglés CR Weight, realizó la síntesis de un nuevo morfinano mediante su acetilación,

obteniendo diacetilmorfina, más conocida como heroína. Aunque su obtención no tuvo gran

repercusión, en 1898, el alemán Heinrich Dreser comercializó para la compañía Bayer, junto con la

aspirina, la heroína, para el tratamiento de la tos y especialmente la sintomatología de la bronquitis. Se

retiró del mercado por su efecto adictivo, comenzando su historia como droga de abuso (Maisto et al.,

2014).


4

Desde mediados del siglo XIX hasta los inicios del siglo XX, Europa sufre una “opiomanía”, a

través del consumo de opio, morfina, heroína. Pero debido al elevado número de problemas causados

por el consumo de opioides; es en el año 1905, cuando se prohíbe su consumo en Estados Unidos,

seguido de Francia en 1908 y finalmente en 1912, en La Convención Internacional del Opio (La Haya),

donde 13 países firman el tratado por el que se comprometen a controlar la producción,

comercialización y consumo del opio y sus derivados (Maisto et al., 2014)

Hasta 1928 la obtención de la morfina y sus derivados se realizaba del opio, pero es el

farmacéutico húngaro János Kabay (Bayer, 1961; Bayer, 1987), quien ideó una metodología que

permitió la extracción de los diferentes alcaloides, de la paja de la adormidera, “método de la paja de

adormidera”, sin necesidad de obtener previamente opio. Dicho método consistió en (Maisto al., 2014)

utilizar las cápsulas de la adormidera seca, como materia prima, la cual una vez separada la paja de las

semillas, era tratada con diferentes solventes y ácidos para la extracción de los diversos alcaloides. En la

actualidad, la extracción de los diferentes morfinanos se basa en esta metodología (FJ. Ledesma.

Comunicación personal).

Convención única de 1961 sobre estupefacientes

En 1961 la Junta Internacional de Fiscalización de Estupefacientes (INCB, en inglés) aprobó la

Convención Única, siendo ampliada por el Protocolo de 1972 (INCB, 1972). La convención sirvió de base

para racionalizar el mecanismo de fiscalización internacional de drogas. La Convención de 1961

establece límites estrictos para el cultivo de adormidera, entre 119 estupefacientes sometidos a

fiscalización, como el opio y sus derivados, morfina, tebaína, codeína, y heroína, aunque también

sustancias sintéticas, como la metadona entre otros. Los 180 países que están acogidos al Convenio se

comprometen a “limitar la producción, la fabricación, la exportación, la importación, la distribución y las

existencias de los estupefacientes sometidos a fiscalización, así como el comercio, el uso y la posesión

de éstos, con objeto de lograr que se utilicen exclusivamente con fines médicos y científicos” (INCB,

1972). A su vez, “la producción y la distribución de las sustancias fiscalizadas deben estar sujetas a

autorización y vigilancia. Los gobiernos deben proporcionar a la INCB previsiones e información

estadística en los formularios suministrados para tal propósito sobre las cantidades de estupefacientes

necesarias, fabricadas, utilizadas y las cantidades incautadas por los funcionarios policiales y aduaneros”

(INCB, 2014). Así el 1 de marzo de 1966, España ratificó la Convención única de 1961. Por ello, el Estado

Español tiene una estricta regulación sobre el cultivo, producción de concentrado de paja de

adormidera, extracción de alcaloides, distribución, uso y posesión; a través del Ministerio de Sanidad,

Servicios Sociales e Igualdad.

La planta y ciclo vegetativo

La planta de adormidera es una herbácea de crecimiento anual. Presenta una raíz principal

pivotante (Figura 1.1.a), hojas alternas, grandes, lampiñas, lobuladas, de color verde glauco (Figura

Capítulo 1

5

1.1.b). En la base, las hojas se distribuyen en forma de roseta, pecioladas; las superiores sésiles (Figura

1.1.c). Tallos de 0,5-1,5m. de altura, fistulosos, poco ramificado (Figura 1.1.d). Flores grandes, solitarias,

actinomorfas, cáliz formado por dos sépalos lampiños, que se desprenden al abrirse los cuatro pétalos

suborbiculares, blancos, rosados, violáceos, dependiendo del cultivar, en general con una mancha basal

oscura (Figura 1.1.e). En el centro de la flor se ve el ovario de forma redondeado u ovoide, sin estilo, con

un disco apical provisto de 8 ó más estigmas radiales. Fruto en forma de cápsula ovoide o esférica, a

veces indehiscente (Figura 1.1.f), falsamente tabicada de 8 a 10 láminas, donde se localizan las semillas

(Figura 1.1.g). Éstas son muy numerosas y pequeñas < 1mm., superficie reticulada, sin arilo (Figura

1.1.h), presentando forma arriñonada (Font Quer, 1962).

En el pasado la taxonomía de Papaver somniferum fue compleja. Esto se ha debido a los cambios

realizados en las últimas décadas en el criterio para la clasificación de esta familia y género. Además, la

presencia de diversas variedades y cultivares ha formado la idea que bajo el punto de vista botánico, es

imposible distinguir variedades precisas. Según el sistema de clasificación Angiosperm Phylogeny Group

(APG) IV, la planta de adormidera se sitúa filogenéticamente en el Orden Ranunculales, formado por 7

familias, incluyendo 199 géneros y 4.445 especies. La familia Papaveraceae, a su vez está formada por

tres subfamilias, Hypecoöideae, Fumarioideae, Papaveroideae; y en éste último se localizaría el género

Papaver (Stevens, 2001). El género Papaver ha sido dividido por diferentes autores de 5 a 11 secciones,

conteniendo más de cien especies. La sección papaver, lo conforman 4 especies, P. glaucum Boiss y

Hausskn; P. gracile Boiss; P. decaisnei Hochst. Steud. Ex Elkan y P. somniferum L. dividida en dos

subespecies ssp. somniferum y spp. Setigerum (Németh, 1998; Stevens, 2001). Aunque el origen de

Papaver somniferum no está claro, gran parte de los botánicos taxónomos estiman que la subespecie

setigerum (2n=11) es la forma ancestral de P. somniferum (2n=22).

El ciclo vegetativo de la adormidera se puede dividir en 2 estados de desarrollo bien definidos, el

periodo vegetativo y el periodo de floración, a su vez éste se puede subdividir en 5 fases (Mahdavi-

Damghani et al., 2010). El cambio de periodo vegetativo al periodo de floración es dependiente de la

temperatura y especialmente de las horas de luz, ya que la adormidera está considerada como una

planta de ciclo largo. La duración del ciclo vegetativo de la adormidera depende de diversos factores,

como el ecotipo, el cultivar, las condiciones climáticas y especialmente el momento de siembra. Si bien

se puede diferenciar dos momentos de siembra, “Otoño” con una duración de 250-270 días y

“Primavera” con un ciclo de 120-165 días de duración (Bernath, 2003).


6

Figura 1.1 Descripción de la planta Papaver somniferum. a) Raíz pivotante principal de Papaver

somniferum. b) Detalle de la planta en roseta. c) Distribución de las hojas de la base en roseta. d) Tallos

poco ramificados, con cápsula floral. e) Flores de un cultivo comercial de Papaver somniferum. f) Detalle

Capítulo 1

7

de una cápsula. g) Detalle del interior de la cápsula seca, donde se aprecia el contenido en semillas. h)

Semilla madura (Fotos: a-g: A. Bonilla; h: J.A. Lucas. USP-CEU).

El periodo vegetativo de la adormidera se inicia con la germinación de las semillas, que en

condiciones óptimas dura 15-20 días. En siembra de primavera el proceso se puede realizar a

temperaturas 2-3ºC, pero la temperatura adecuada es entre 7 y 10°C; con temperaturas superiores a

20°C se aprecia una baja tasa de germinación. Por el contrario, la temperatura de germinación de la

siembra de otoño debe estar comprendida entre los 15-20°C (Bernath, 2003). Tras la germinación se

produce la aparición y formación de las hojas basales en roseta (Figura 1.1.c). Este periodo abarca,

desde la emergencia de las plántulas hasta la formación del tallo floral, siendo la fase más larga de la

ontogenia de la planta. En siembras de primavera, el periodo es de al menos 50-60 días, pero en

siembras de otoño esta fase puede prolongarse desde los 180 hasta los 220 días. Durante esta fase del

desarrollo las condiciones ambientales y las prácticas de cultivo tienen una gran influencia en la

producción: un exceso de calor, por encima de los 15°C y una baja humedad, pueden resultar en un

menor desarrollo de las hojas de roseta lo que conllevaría a una bajada en el rendimiento del cultivo

(Németh, 1998). Durante el periodo vegetativo, la roseta está conformada por 2-6 hojas, sin sufrir

grandes modificaciones estructurales, pero es un periodo crítico para el correcto desarrollo de las raíces

(Tétényi, 1997).

El periodo de floración se inicia cuando la temperatura es superior a 15 grados centígrados, (16-

18C), y especialmente cuando el fotoperiodo excede de las 15 horas de luz (Wang et al., 1997). Este

periodo se puede dividir en 5 fases, elongación del tallo (entallado) (figura 1.2.a), curvatura del botón

(figura 1.2.b), antesis (figura 1.2.c-d), formación de la cápsula (figura 1.2.e) y maduración de la cápsula

(Figura 1.2.f) (Facchini y De Luca, 1995; Németh, 1998). El periodo que comprende la fase de elongación

del tallo hasta el inicio de la antesis, dura entre 21-30 días. La absorción de nutrientes y agua durante

este periodo es muy activa. A lo largo del crecimiento del tallo, se genera la formación de una única flor

que determina la cápsula principal. Aunque la planta está formada por un tallo principal, desde la base

pueden aparecer tallos secundarios laterales. Una vez que se ha desarrollado el botón floral, este sufre

una curvatura del pedicelo (gancho), hasta el inicio de la antesis. La floración de la adormidera se

produce en poco más de 48 horas, para dar lugar a la conformación de la cápsula y su maduración.

Durante este proceso, la cápsula aumenta de tamaño, varía su color del verde al amarillo e inicia la

desecación, en un proceso que se prolonga 6 semanas desde la floración (Bernath, 2003).


8

Figura 1.2 Fases durante el periodo de floración de Papaver somniferum. a) Elongación del tallo y

formación del botón floral (entallado). b) Curvatura del botón floral, “enganche”. c) y d) Antesis, donde

se aprecia la apertura del botón floral y la conformación de la flor. e) Cápsula en formación. f) Cápsula

en maduración (fotos A. Bonilla).

Capítulo 1

9

1. 2 Cultivo de adormidera, producción de materia prima y consumo de opioides

naturales y semisintéticos

El cultivo de Papaver somniferum está ampliamente distribuido por el mundo, desde las regiones

templadas hasta las subtropicales en ambos hemisferios. Aunque su hábitat natural fue el

Mediterráneo, la capacidad de adaptación de la especie, así como los diferentes híbridos obtenidos para

su mejora ha propiciado una mayor distribución.

El cultivo de adormidera tiene dos objetivos:

1. Obtención de opio y de paja de adormidera, materia prima en la producción de

compuestos farmacológicos.

2. Obtención de semillas, ya sea para su utilización en la industria alimentaria, de forma

directa, o para la extracción de aceite. Al no contener alcaloides, su uso no está regulado por la INCB.

El opio (también denominado opio bruto) es el látex que se obtiene al practicar incisiones en las

cápsulas verdes de la planta de adormidera, el cual es desecado posteriormente. Es una pasta de sabor

picante y amargo, de olor característico y consistencia variable (Bruneton et al., 2001). El contenido de

morfinanos de interés en el opio es: morfina 9,5%-12,0%, codeína 2,5% y tebaína 1,0%-1,5% (INCB,

2016). En la actualidad, la India es el mayor productor de opio lícito del mundo con 283.100 Kg (98%),

siendo el único país con autorización del INCB para la exportación de opio; le siguen China (7.052 Kg);

Corea del Norte (450 Kg) y Japón (1Kg), datos de producción del 2014 (INCB, 2016). El opio se utiliza,

para la extracción de alcaloides morfinanos y su transformación, siendo los Estados Unidos y Japón los

principales importadores de opio. Sin embargo, la mayor producción de se obtiene de paja de

adormidera.

En 2014, aproximadamente el 82% de la morfina y cerca del 96% de la tebaína fabricadas a nivel

mundial se obtuvieron a partir de la paja de adormidera y el resto, se extrajo del opio. Como se ha

descrito anteriormente, la principal fuente de materia prima para la obtención de morfina, codeína,

tebaína y oripavina es la planta de Papaver somniferum, siendo las cápsulas secas, sin las semillas y los

siguientes 10 cm del tallo de la planta, todo ello denominado paja de adormidera. En la actualidad se

utilizan dos cultivares de Papaver somniferum, con alta concentración en morfina (paja de adormidera

M) y en tebaína (paja de adormidera T), con una concentración mínima de morfina, siendo el principal

cultivar en Australia (Millgate et al., 2004; INCB, 2016).

Debido a la demanda mundial de analgésicos opioides naturales y semisintéticos, la producción

de materia prima en la elaboración de alcaloides morfinanos también se ha incrementado, por lo que el

cultivo de Papaver somniferum ha aumentado en los últimos tiempos. La producción de paja de

adormidera rica en morfina, se ha incrementado desde las 200 Tn en 1995 hasta las 503 Tn de 2014. A


10

su vez, la producción de paja de adormidera rica en tebaína, también ha sufrido incrementos, desde las

80 Tn en el 2008 hasta las 360 Tn de 2014 (Figura 1.3) (INCB, 2016).

Figura 1.3. a) Producción mundial de paja de adormidera rica en morfina (M) equivalente en toneladas

de morfina. Periodo 1995-2014. b) Producción mundial de paja de adormidera rica en tebaína (T)

equivalente en toneladas de tebaína. Periodo 2005-2014 (INCB. 2016).

Los principales productores de materia prima, paja de adormidera rica en morfina y rica en

tebaína en el año 2014 se resumen en la figura 1.4. En el caso de la morfina, la producción mundial de

materia prima, paja de adormidera, se elevó hasta las 503 toneladas equivalente a morfina. Siendo

Australia el mayor productor con 176 Tn (35%), seguido de Francia 119 Tn (24%), España 87 Tn (17%) y

Turquía 43 Tn (9%). Otros productores son Hungría, Gran Bretaña, China (Figura 1.4) (INCB, 2016).

Figura 1.4 Producción Mundial de paja de adormidera rica en morfina (M) y tebaína (T) en el 2014. a)

Principales países productores de materia prima, en toneladas, rica en morfina durante el año 2014. El

porcentaje representa la producción mundial. b) Principales países productores de materia prima, en

Producción de materia prima rica en morfina (M) Producción de materia prima rica en tebaína (T))

Australia (35%); 176 Tn

Francia (24%); 119 Tn

España (17%); 87 Tn

Turquía(9%); 43Tn

Otros (15%); 78 Tn

Producción mundial de paja de adormidera (M)a)

Australia (74%); 268 Tn

Francia (3%); 12 Tn

España (21%); 77 Tn

Turquía(1%); 2Tn

Producción mundial de paja de adormidera (T)b)

Capítulo 1

11

toneladas, rica en tebaína durante el año 2014. El porcentaje representa la producción mundial (INCB,

2016.)

Desde el año 2005, en España se está incrementando el cultivo de adormidera rica en tebaína,

paja de adormidera (T). La producción mundial en 2014 de paja de adormidera rica en tebaína, fue de

360 toneladas equivalente a tebaína: Australia 268 Tn (74%), España 77 Tn (21%) y Francia 12 Tn (3%) y

Hungría 2 Tn (<1%) (INCB, 2016)

Este incremento en la producción de materia prima se ha debido a dos situaciones, la mejora

en los rendimientos productivos del cultivo de adormidera, y especialmente en el incremento de la

superficie cultivada de Papaver somniferum. La Junta Internacional de Fiscalización de Estupefacientes

(INCB) es el organismo, dependiente de la ONU, encargado de publicar las previsiones y estadísticas

relativas a la producción, fabricación, existencias y utilización de estupefacientes, información facilitada

por los Estados acogidos a la Convención de 1961. También tiene la función de proporcionar a los países

fabricantes y productores información sobre las tendencias previsibles, a fin de mantener el equilibrio

entre la oferta y la demanda de estupefacientes. Por ello, es la institución encargada de estimar la

superficie de cultivo de Papaver somniferum permitida por cada país productor, siendo de obligado

cumplimiento estas directrices por todos los países productores al firmar el Convenio de 1961 (INCB,

2016).

Debido a los requerimientos del cultivo de Papaver somniferum, así como a las condiciones

climatológicas de la Península Ibérica, España es uno de los principales productores de paja de

adormidera (M) y (T) del mundo. Por ello, el estado lo considera un cultivo estratégico. En España, al

igual que el resto de los países productores de materia prima, la superficie permitida para el cultivo de

Papaver somniferum ha ido en aumento en los últimos años (figura1.5). En el caso del cultivar rico en

morfina se ha ido incrementando desde las 6.439 hectáreas cultivadas en el 2010, hasta las 8.521

hectáreas cultivadas en el año 2014 (INCB, 2016). La superficie de cultivo de adormidera rica en tebaína

ha sufrido muchas variaciones en los últimos años. Desde 1973, Alcaliber S.A. es la única empresa

autorizada en España para garantizar el abastecimiento de Materias Primas Estupefacientes, mediante

el cultivo de la adormidera (Papaver somniferum) y su posterior transformación en Concentrado de Paja

de Adormidera, así como la extracción de sus alcaloides.


12

Figura 1.5 Superficie (ha) destinada al cultivo de Papaver somniferum (M) en España y toneladas (tn)

cosechadas de paja de adormidera rica en morfina, durante el periodo 2007-2014 (INCB, 2016).

Este incremento en la superficie de cultivo, así como en la producción de materia prima a nivel

mundial, se debe a una mayor demanda de analgésicos de tipo morfinanos, especialmente morfina y

codeína, aumentando un 9,4% de morfina y un 11,0% de codeína, durante los últimos cinco años (figura

1.6) (INCB, 2016)

Figura 1.6. a) Consumo de morfina en toneladas a nivel mundial y en Kg en España, durante el periodo

de tiempo 2010-2014. b) Consumo de codeína en toneladas a nivel mundial y en toneladas en España,

durante el periodo de tiempo 2010-2014 (INCB, 2016).

El principal país consumidor de morfina en el año 2014 (figura 1.7), fue Estados Unidos con 23,4

toneladas, lo que supone el 52,7% del consumo mundial, seguido de Canadá con 4,7 toneladas (10,7%

del consumo mundial). A su vez, una cuarta parte (24,3%) del consumo mundial se realizó en Europa,

siendo Inglaterra, con 3,1 toneladas (6,9%), el mayor consumidor, Francia 1,8 toneladas (4%), Austria 1,7

toneladas (3,8%), Alemania 1,1 toneladas (3,1%), seguido de China con 1,4 tonelada (2,5%). A su vez,

España consumió 439 Kg (1%) (figura 1.6) (INCB, 2016). Si se transforman los datos anteriores en

0

1000

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10000

2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014

Ton

ela

da

s (T

n)

Sup

erfi

cie

(Ha

)

Superficie y producción de Paja de adormidera (M) en España

Superficie (ha) Cosecha (Tn)

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2010 2011 2012 2013 2014

KgTnConsumo Morfina

Mundo España

a)

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300

350

2010 2011 2012 2013 2014

TnTnConsumo codeína

Mundo España

b)

Capítulo 1

13

cantidad de dosis diarias consumidas por millón de habitantes (S-DDD), el país con mayor consumo de

morfina es Austria (5.746 S-DDD), seguido de Canadá (3.768 S-DDD); Dinamarca (2.342 S-DDD); Estados

Unidos (2.034 S-DDD); Reino Unido (1.372 S-DDD) y Nueva Zelanda (1.188 S-DDD) (INCB, 2016). Si bien,

los datos mostrados están relacionados con la cantidad de morfina consumida, 44,7 Tn en el mundo, la

producción de morfina se elevó a 463,6 Tn. De los cuales 405,3 Tn, fueron utilizadas para su

transformación, principalmente en codeína (90%) y dos opioides semisintéticos etilmorfina y folcodina

(INCB, 2016). Una situación similar sucedió con la codeína, cuya producción se elevó a 379 Tn,

consumiendo 286,5 Tn a nivel global y transformando 56,4 Tn en dihidrocodeína y hidrocodona. La

tebaína es otro alcaloide natural obtenido de Papaver somniferum con un gran interés por parte de la

industria farmacéutica, ya que es transformado en codeína, dihidrocodeína, etorfina, hidrocodona,

oxicodona, oximorfona. En el año 2014 la producción total de tebaína se elevó a 102,6 Tn, utilizándose

para su transformación 87,1 Tn (INCB, 2016).

Debido a esta situación, la producción de alcaloides morfinanos naturales, como morfina,

codeína y tebaína, presentan un gran interés, no solo por su utilización directa, sino por su posible

transformación en otros opioides semisintéticos de elevado consumo.

Figura 1.7 Distribución del consumo en porcentaje de morfina en el año 2014. Las cifras entre paréntesis

indican los porcentajes de la población mundial (INCB, 2016).

1. 3 Metabolismo secundario

Todos los organismos vivos requieren la transformación de un gran número de compuestos

orgánicos para poder nacer, crecer y reproducirse. La presencia de una extensa red de enzimas integradas,

que desarrollan y regulan reacciones químicas, permite la vida. Esta red, caracterizada por diferentes rutas

Estados Unidos (5,1%)52,7%

Europa (11%)24,3%

Canadá(11%)10,7%

Australia y Nueva Zelanda (0,4%)

2,3%

Japón (2%)0,5%

China (18,9%)3,1% Otros (62%)

6,4%

Distribución del consumo de morfina 2014


14

metabólicas, está denominada como metabolismo primario, siendo los hidratos de carbono, proteínas,

lípidos y ácidos nucleídos las principales moléculas que conforman el metabolismo primario. A pesar de la

gran variedad de características en los organismos vivos, las rutas metabólicas que sintetizan, transforman y

degradan las moléculas descritas son esencialmente las mismas en todos los organismos, a excepción de

pequeñas modificaciones.

En contraste con el metabolismo primario, existe un metabolismo secundario que presenta una

distribución restringida a determinados grupos de organismos (Figura 1.8). Este metabolismo está diseñado

para afrontar las condiciones ambientales cambiantes a las que tiene que hacer frente el organismo durante

su vida. Por lo tanto, es extraordinariamente variado y constituye un arsenal químico. Está especialmente

desarrollado en organismos sésiles, como son las plantas. En la actualidad, se han descrito más de 100.000

metabolitos secundarios, pero se estima que este número en la naturaleza sea mayor, ya que solo se

han estudiado un 20-30% de las plantas a nivel fitoquímico (Wink, 2010). Una especie, es capaz de

producir de 5.000 a 20.000 metabolitos diferentes, incluyendo los primarios y secundarios. Sin embargo,

la gran mayoría se producen y acumulan a niveles de traza, por lo que su estudio y análisis está muy

restringido por las incapacidades técnicas de análisis de la actualidad (Trethewey, 2004). La síntesis de

estos compuestos deriva, principalmente, de moléculas procedentes del metabolismo primario. La segunda

característica fundamental de este metabolismo es que es inducible puesto que solo es necesario en

determinadas ocasiones de estrés. Es, por lo tanto, un metabolismo de adaptación, tremendamente plástico

que persigue asegurar la supervivencia de la planta, en cualquier condición cambiante.

Capítulo 1

15

Figura 1.8 Integración del metabolismo primario y secundario

Desde el punto de vista químico los metabolitos secundarios se suelen agrupar según su

estructura química en: compuestos fenólicos, alcaloides, terpenos, hidrocarburos poliacetilénicos y

oxalatos (Tabla 1.1). La mayoría de estos metabolitos secundarios desempeñan en la planta diversas

funciones. Así, intervienen en relaciones de competencia con otras plantas, actuando como agentes

aleopáticos (terpenos); defensa contra herbívoros (alcaloides y taninos) y contra invasiones de hongos,

bacterias y virus; en relaciones de mutualismo; atracción de los polinizadores (terpenos y antocianos);

como moléculas portadoras de información relacionada con posibles funciones defensivas; como

protección contra radiación ultravioleta; simbiosis (flavonoides); estrés frente a temperaturas extremas;

estrés hídrico y salino (prolina); como reserva de nitrógeno (alcaloides); así como en otras funciones

(Angelova et al., 2010; Wink, 2010; Ahuja et al., 2012).

Tabla 1.1 Número de metabolitos secundarios conocidos. Modificado de Wink, 2010.

METABOLITO SECUNDARIO NÚMERO

Alcaloides 27.000

Aminoácidos no proteicos 700

Aminas 100

Glicósidos Cianogenéticos 60

Glucosinolatos 100

Alcamidas 150

Lectinas, péptidos, polipeptidos 2.000

Terpenoides 22.000

Flavonoides, taninos 5.000

Fenilpropanoides, lignanos, cumarinas 2.000

Poliacetilenos, ácidos grasos, ceras 1.500

Poliquétidos 750

Carbohidratos, ácidos orgánicos 200

La planta adormidera presenta un metabolismo secundario muy activo y específico. Los

metabolitos secundarios de la planta de adormidera con mayor relevancia, especialmente para su uso

farmacológico son alcaloides tipo bencilisoquinoleicos (BIAs). Los principales alcaloides que producen la

adormidera son: la morfina, con una elevada actividad narcótica y analgésica; codeína, por ser

analgésico y antitusivo; sanguinarina y berberina, como agentes antimicrobianos; noscapina, potente

antitusivo y potencialmente antineoplásico; papaverina, usado como vasodilatador; y tebaína, precursor

metabólico de la codeína y morfina (Hagel y Facchini, 2013). Irónicamente las aplicaciones médicas y


16

efectos farmacológicos de este tipo de metabolitos secundarios en humanos y en diversos animales, se

conocen mejor que las funciones que desempeñan en las plantas que los producen.

Alcaloides de tipo morfinanos. Definición, estructura y biosíntesis

Los alcaloides conforman un amplio grupo de moléculas nitrogenadas de bajo peso molecular,

cuya diversidad estructural y variedad de actividades farmacológicas, lo hace uno de los grupos de

metabolitos secundarios de mayor interés terapéutico. Su actividad biológica sugiere que los alcaloides

presentan una función defensiva en las plantas frente a patógenos de diversa naturaleza, aunque

también se ha especulado con un posible papel como reserva de nitrógeno. En la actualidad se conoce la

estructura de más de 27.000 alcaloides, de los cuales aproximadamente 21.000 proceden de las plantas,

el resto proceden de animales y microorganismos (Dewick, 2009). Debido a la diversidad de sus

estructuras, la definición y clasificación de los alcaloides es compleja. Aun así, todos los alcaloides

presentan uno o más átomos de nitrógeno en forma de amina, primaria, secundaria o terciaria, lo que

generalmente les confiere basicidad y permite un fácil asilamiento y purificación al transformarse en

sales solubles en presencia de ácidos inorgánicos (Bruneton et al., 2001). La clasificación de los

alcaloides se basa en el esqueleto estructural que contiene el nitrógeno, y se clasifican según el

aminoácido del que derivan. La mayoría de los alcaloides proceden de aminoácidos, tales como la

tirosina, fenilalanina, triptófano, ornitina/arginina, lisina, histidina (figura 1.9); pero también de

moléculas de otra naturaleza como purinas (cafeína), terpenos, entre otros que no se consideran

alcaloides verdaderos (Bruneton et al., 2001). Los alcaloides de interés en P. somniferum son de tipo

bencilisoquinoleicos derivados de la tirosina, que a su vez, procede de la ruta del ácido sikimico, otra

ruta relevante del metabolismo secundario.

Capítulo 1

17

Figura 1.9 Representación de las rutas de biosíntesis de los principales grupos de alcaloides (Wink, 2010)

Los alcaloides bencilisoquinoleínicos (BIAs) son uno de los principales grupos de alcaloides

derivados de la tirosina. Representan más de 2.500 estructuras conocidas, siendo la morfina y la codeína

los alcaloides con mayor interés social, farmacológico y económico. Papaver somniferum, Eschscholzia

californica, Thalictrum sp., y Coptis japonica han sido las principales especies en las que durante los

últimos 20 años se ha basado la investigación en la elucidación de la ruta de síntesis de la morfina

(Ziegler y Facchini, 2008).

La síntesis de los BIAs comienza con 2 moléculas de tirosina; una de ellas, se transforma en

Dopamina, a través de una hidroxilación y la descarboxilación de la L-Dopa. Por otra parte, otra tirosina

se transforma en 4-hydroxyphenylacetaldehyde (4-HPAA), tras la pérdida de grupo amino y el grupo

carboxilo. Una condensación de tipo Pictet-Spengler, entre la Dopamina y 4-HPAA da como resultado

(S)- Norcoclaurina, siendo catalizado por la norcoclaurina sintetasa (NCS) EC 4.2.1.78 (figura 1.10).


18

Figura 1.10 Ruta de biosíntesis del alcaloide Norcoclaurina, a través de la transformación de la tirosina

(PMN, 2014)

El alcaloide Norcoclaurina deriva en (S)-Reticulina como resultado de una serie de tres

metilaciones y una hidroxilación. Las enzimas que catalizan las reacciones son: norcoclaurina 6-O-

metiltransferasa (6OMT) EC 2.1.1.128, coclaurina N-metiltransferasa (CNMT) EC 2.1.1.140, Citocromo

P450 mono-oxigenasa N-metilcoclaurina 3’-hidroxilasa (CYP80B3) EC 1.14.13.71 y 3’-hidroxi-N-

metilcoclaurina 4’-O-metilltransferasa (4’OMT) EC 2.1.1.116 (figura 1.11). Todas las enzimas se localizan

en el citoplasma salvo CYP80B3, que se encuentra asociada a la membrana del retículo endoplásmico.

Capítulo 1

19

Figura 1.11 Ruta de biosíntesis del alcaloide (S)-Reticulina, a través de la transformación de la

Norcoclaurina (PMN, 2014)

A su vez, (S)-Reticulina es el precursor de las diferentes rutas de síntesis de la mayoría de los tipos

estructurales de BIAs, morfinanos (morfina y codeína), benzofenantridinas (sanguinarina),

tetrahidroberberinas (berberina).


20

Diez transformaciones químicas son necesarias para transformar (S)-Reticulina en morfina. Todas

las enzimas han sido caracterizadas, y se han clonado nueve genes (Ziegler et al., 2006; Liscombe y

Facchini, 2008; Hagel y Facchini, 2010; Lee y Facchini, 2010).

La epimerización de (S)-Reticulina a (R)-Reticulina sucede en dos pasos que involucra la oxidación

de la (S)-reticulina mediante la 1,2-dehidroreticulina sintasa (DRS), y la reducción de 1,2-

dehidroreticulina (DRR) EC 1.5.1.27 a (R)-reticulina. Tras la epimerización, se produce una condensación

intramolecular entre el C2 del bencil y el C4 del motivo isoquinolina para estabilizar la molécula; la

cataliza, la salutaridina sintasa, un citocromo P450 monooxigenasa (SalSyn/Cyp719B1) EC 1.14.21.4,

formando salutaridina (Gesell et al., 2009). Los siguientes pasos requieren de una reducción y una

acetilación, mediante las enzimas salutaridina reductasa (SalR) EC 1.1.1.248 y la salutaridinol

acetiltransferasa (SalAT) EC 2.3.1.150. Seguidamente se produce la transformación a tebaína, tras la

pérdida espontanea del grupo acetilo (figura 1.12).

Figura 1.12 Ruta de biosíntesis del alcaloide Tebaína, a través de la transformación de la (S)-Reticulina

(PMN, 2014)

Capítulo 1

21

La conversión de tebaína a morfina puede ocurrir de dos formas, en las que están involucradas

tres enzimas, Tebaína 6-O-demetilasa (T6ODM) EC 1.14.11.31, Codeinona reductasa (COR) EC 1.1.1.247

y Codeína O-demetilasa (CODM) EC 1.14.11.32 (Hagel y Facchini, 2010) (figura 1.13). Por un lado, la

principal vía de obtención de morfina consiste en la transformación de tebaína en neopinona tras la

demetilación (T6ODM), seguido de una epiemerización espontanea a codeinona, que es reducida a

codeína por la Codeinona reductasa (COR), y se transforma en morfina tras la metilación realizada por

Codeína-O-demetilasa (CODM). Existe una segunda vía alternativa que también se inicia en la tebaína,

siendo demetilada por la CODM transformándola en oripavina. Seguidamente se produce una segunda

demetilación para transformarse en morfinona, catalizada por T6ODM. Finalmente, la morfinona es

reducida a morfina mediante la enzima COR.


22

Figura 1.13 Ruta de biosíntesis del alcaloide Morfina, a través de la transformación de la Tebaína (PMN,

2014)

Capítulo 1

23

Aunque en la actualidad se han caracterizado todas las enzimas responsables de la

transformación de R-reticulina en morfina, el control de la regulación en la ruta de biosíntesis sigue

siendo un misterio. Es una ruta muy compartimentada en el espacio y en el tiempo. Se ha propuesto un

modelo (figura 1.14), en el cual la transcripción y traducción de los genes implicados en la ruta se

localizaría en las células acompañantes del floema, seguido por el transporte de las enzimas funcionales

a los tubos cribosos, donde se produciría la síntesis de los alcaloides hasta la tebaína. Este alcaloide sería

transportado de forma mayoritaria a las células laticíferas, donde se producirían los últimos pasos de la

ruta, hasta obtener morfina. Finalmente, los alcaloides se almacenarían en grandes vesículas de látex en

este último tipo celular (Lee et al., 2013; Onoyovwe et al., 2013; Beaudoin y Facchini, 2014).

Figura 1.14 Representación de una haz vascular de Papaver somniferum. Modelo propuesto en la

biosíntesis de la morfina en el haz vascular de adormidera. Se muestran las funciones de las células

acompañantes, elementos cribosos y células laticíferas. Los genes expresados en cada tipo de célula se

muestran en cursiva, mientras que las enzimas se indican en rojo. La flecha horizontal negra sugiere a la

tebaína como el principal alcaloide transportado entre los elementos cribosos y células laticíferas. En

azul se representan los diferentes alcaloides. El tamaño de la fuente es proporcional a la transcripción

relativa y los niveles de las enzimas (Modificado de Beaudoin y Facchini, 2014).


24

Efectos farmacológicos

Los BIAs se conocen como analgésicos opioides. El término opioide se aplica a toda molécula

endógena, exógena (natural o sintética), capaz de producir efectos similares a los de la morfina y que se

bloquean por moléculas antagonistas como la naloxona.

Los opioides exógenos y sintéticos, han sido utilizados por el ser humano desde hace mucho

tiempo como fármacos analgésicos. Esto se debe a la capacidad de ser agonistas totales y parciales de

los opioides endógenos del propio cuerpo, conformados por cuatro grandes familias: endorfinas,

encefalinas, dinorfinas y endomorfinas (Flórez, 2008). En el caso de la adormidera, el opio, ha sido el

más utilizado, pero su componente principal la morfina, es también agente causante de euforia, sueño,

así como antidiarreico. Actualmente, diversos opioides de naturaleza similar a los morfinanos son

ampliamente utilizados como analgésicos, pudiendo ser agonistas (codeína, diamorfina (heroína),

fentanilo), agonistas parciales (nalorfina, buprenorfina, petidina, levalorfano, tramadol, metadona),

antagonistas como la naloxona, o derivados de naturaleza semi-sintética como la etorfina, derivado del

alcaloide tebaína, presentando una potencialidad 5000 veces superior a la morfina (Rodríguez, 2012).

Receptores opioides

Estudios farmacológicos realizados, hace más de 40 años, pusieron de manifiesto la presencia de

diversos receptores opioides. Hasta la fecha se han clasificado 4 tipos de receptores, µ (mu), δ (delta), κ

(kappa) y ORL1 (opioid receptor-like, subtipo 1). Todos presentan una estructura proteica similar al 70%,

pero muestran diferencias en la funcionalidad, localización y afinidad por los diversos opioides

(Pasternak, 2010).

Cuantitativamente, los receptores µ representan aproximadamente el 22% de todos los

receptores opioides, aunque estos porcentajes varían mucho dependiendo del tejido de estudio. La

ubicación de los receptores a los que se unen los diferentes opioides, incluyendo con mayor o menor

afinidad fármacos opioides, determina el espectro de acción de los receptores una vez activados. Los

receptores µ están presentes principalmente en neuronas de la médula espinal, el mesencéfalo, el

tálamo y la corteza cerebral (figura 1.15). La activación de este receptor produce analgesia supraespinal,

depresión respiratoria, euforia, sedación, reducción de la motilidad gastrointestinal, miosis (contracción

de la pupila) y dependencia física, sintomatología asociada a los efectos de la morfina.

Capítulo 1

25

Figura 1.15 Lugares de unión de la morfina, en el sistema nervioso central. Cuando se inyecta morfina a

una persona, ésta se desplaza rápidamente hacia el cerebro. Se produce la unión a los receptores

opiáceos que se concentran en las áreas del sistema de recompensa. Esta situación indica que la acción

de los opiáceos en el tálamo contribuye a su capacidad para producir analgesia (NIDA, 2014).

Efectos farmacológicos de la morfina

La morfina presenta una elevada afinidad por el receptor opioide µ, principalmente los

localizados en el sistema nervioso central y el aparato digestivo. Por lo tanto, los efectos farmacológicos

de la morfina están intrínsecamente asociados a los efectos funcionales que desencadenan la activación

de los receptores µ y se resumen en los siguientes (Rang, 2008; Rodríguez, 2012):

Analgesia: La morfina es eficaz en la mayoría de los dolores agudos y crónicos, especialmente

los desencadenados por la vía nociceptiva, aunque con menor intensidad en el dolor neuropático

(miembro fantasma). Además, altera el componente emocional-afectivo del dolor, disminuyendo el

componente psicológico del dolor, se cree que debido a la acción euforizante. Dosis superiores a las

requeridas para la producir analgesia, pueden conllevar a la anestesia de la persona.

Euforia: La morfina promueve una sensación de bienestar y felicidad, asociada con la función

analgésica y el componente emocional-afectivo. Se cree que la euforia depende de los receptores µ,

equilibrada a su vez con la disforia que está asociada a la activación de receptores κ. Este efecto es muy

dependiente de la persona y sus características.

Depresión respiratoria: La depresión respiratoria, característica del tratamiento con opioides a

dosis analgésicas, es debida a un efecto directo sobre los centros respiratorios cerebrales, en las

neuronas del bulbo. El efecto depresor se asocia a una reducción de la sensibilidad y de la respuesta

deprimiendo los centros nerviosos que regulan el ritmo respiratorio, promoviendo un incremento de la


26

presión parcial de CO2 (pCO2) en la sangre. Esta situación es compensada con una vasodilatación,

provocando un aumento en la presión del líquido cefalorraquídeo en el cerebro. Siendo ésta la causa

más frecuente de muerte por intoxicación aguda en el uso de los opioides, incluso a dosis terapéuticas.

Náuseas y vómitos: El uso por primera vez de morfina suele ir asociado a la aparición de náuseas

y vómitos. Se puede deber a una activación de la región del bulbo conocida como zona gatillo

quimiorreceptora o a una consecuencia indirecta de la bajada de la presión arterial. Normalmente esta

sensación de náuseas y vómitos se interrumpe tras la administración repetida de opioides.

Miosis: Las pupilas puntiformes son una característica diagnóstica importante en la sobredosis de

opioides. La contracción de la pupila tiene un origen colinérgico, debido a la activación de receptores µ y

κ en el núcleo óculo-motor.

Reducción de la motilidad digestiva: La morfina actúa sobre la musculatura lisa de numerosos

órganos, como el estómago, el intestino, las vías urinarias o las biliares. Su efecto da lugar a una

reducción de la actividad, pero a través de un aumento del tono muscular del músculo liso que llega

hasta el espasmo, disminuyendo su movilidad. Estos espasmos musculares lisos provocan el típico

estreñimiento de los opioides, así como espasmos en las vías urinarias y especialmente biliares,

pudiendo agravar el dolor y sintomatología en caso de sufrir cólicos biliares.

1. 4 El microbioma y bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetativo (PGPR)

La rizosfera

El término “rizosfera” fue utilizado por primera en 1904 por Lorenz Hiltner (1862-1923,

agrónomo alemán, que acuñó el término para hacer referencia al efecto promovido por los exudados de

las raíces de leguminosas, sobre las comunidades microbianas que habitan esa región del suelo

(Hartmann et al-, 2008). Hiltner trabajó con la idea que la calidad de los productos producidos por las

plantas, podría ser dependiente de la composición de las comunidades microbianas de las raíces. Así

como influenciar en la resistencia de las plantas frente a la patogénesis causada por diversos factores.

Hasta finales del siglo XX, ese efecto, no pasó a considerarse como un ecosistema (Lynch, 1990; Pinton

et al., 2007). Por tanto, se puede definir la rizosfera como la porción de suelo íntimamente asociada a las

raíces de plantas en crecimiento, con propiedades físicas, químicas y biológicas diferentes a las del resto

del suelo y con una estructura extraordinariamente compleja en la que inciden gran número de

variables y en la que se establecen multitud de relaciones biológicas. Es una zona de triple interacción

única y dinámica entre las plantas, los microorganismos y el suelo, definida por Lynch como la trilogía

del suelo (Jones, 1992; Hinsinger et al., 2009) (figura 1.16).

Capítulo 1

27

Figura 1.16. Trilogía del suelo. Representación de la interacción entre la planta, el suelo y los

microorganismos, que conforman la rizosfera (Lynch, 1990)

Por todo ello, es de vital importancia conocer los tres componentes que conforman la rizosfera,

planta-suelo-microorganismo, para poder seleccionar cepas de la rizosfera potencialmente beneficiosas

para las plantas.

Efecto de la planta sobre la rizosfera

La densidad bacteriana en la rizosfera es generalmente mucho mayor, 10-1000 veces, que la

encontrada en el resto del suelo (Lugtenberg y Kamilova, 2009), llegando a contabilizarse 1011

microorganismos por gramo de rizosfera, identificándose hasta 30.000 especies de procariotas

(Berendsen et al., 2012). La razón de esta diferencia es la elevada concentración de nutrientes

aportados por la planta en forma de exudados, ya que el crecimiento microbiano, en el suelo, está muy

limitado por la baja disponibilidad de carbono orgánico (Jones et al., 2009). Se estima que

aproximadamente entre un 2%-21% de los fotoasimilados producidos por las plantas se liberan por las

raíces en forma de exudados (Lugtenberg y Kamilova, 2009; Huang et al., 2014). Estos compuestos

orgánicos liberados se pueden dividir en dos grandes grupos, dependiendo de su tamaño: los de bajo

peso molecular, que se liberan a favor de gradiente de concentración, y los de elevado peso molecular,

que se liberan por mecanismos de transporte activo o por lisis celulares (Jones et al., 2009). Entre los de

bajo peso molecular encontramos ácidos orgánicos, azúcares, compuestos fenólicos, aminoácidos y gases

como etileno, CO2 y HCN. La fracción de elevado peso molecular incluye los lisados, procedentes de la

degradación de células epidérmicas y corticales; sustancias insolubles mucilaginosas (Jones et al., 2009); así

como de sustancias secretadas de forma activa mediante proteínas transportadoras de membrana:

proteínas ABC, proteínas MATE, proteínas MFS, proteínas ALMT (Weston et al., 2012). La composición tanto


28

cualitativa como cuantitativa de los exudados es dependiente de la especie y variedad de la planta, su

estado ontogénico, situación de estrés de la planta. Así como de otros factores relacionados con el

ambiente, ya sea en la parte aérea de la planta, como de la parte subterránea (Huang et al., 2014).

La liberación de estos compuestos orgánicos por las raíces tiene una influencia decisiva sobre la

disponibilidad de nutrientes y en consecuencia sobre la actividad microbiana (Zhang et al., 2015). El

significado biológico de esta “pérdida” de energía por parte la planta hace referencia a una relación

inversión-coste-beneficio: la liberación de compuestos orgánicos vía exudación, permite el desarrollo de

los microorganismos edáficos, que a su vez mejoran la nutrición vegetal. Sin embargo, el papel de los

exudados no se reduce a retribuir a los microorganismos con fuentes de carbono sencillas, sino que la

planta es capaz de modificar las pautas y composición de sus exudados para favorecer o seleccionar a

determinadas bacterias que mejoran el desarrollo del vegetal. Por ello, la rizosfera es una zona que

localiza microorganismos potencialmente beneficiosos, ya seleccionados por la planta por diversas

razones (Lambers et al., 2009). Esta “inversión” a la que se hace referencia es una estrategia adaptativa

de las plantas (Pieterse et al., 2016). Además de sustrato para las bacterias, estos compuestos tienen

capacidad modificar la estructura del suelo, mediante la quelación de diferentes iones, formando agregados

edáficos, entre otros (Hinsinger et al., 2009).

Efecto del sistema edáfico sobre la planta

Los factores edáficos que afectan a la fisiología de la planta se pueden agrupar en dos bloques bien

diferenciados: factores abióticos y factores bióticos.

Factores abióticos

En este grupo se encuentran las características fisicoquímicas del suelo, el pH, la concentración de O2

y CO2, la concentración de nutrientes, la estructura del suelo, entre otros (Lynch, 1990). Las características

físicas y químicas de los agregados orgánicos y minerales que constituyen el suelo son factores que influyen

en el desarrollo radicular y en su capacidad de exudación, ya que determinan parámetros como la porosidad

y, por tanto, la aireación, el potencial hídrico, la transferencia de calor, la disponibilidad de nutrientes y el

pH. Además, la textura del suelo está íntimamente relacionada con la nutrición vegetal, ya que los cationes

retenidos por el complejo adsorbente constituyen la fuente principal de nutrientes para la alimentación

mineral de las plantas (Taiz y Zeiger, 2010). El pH es un factor muy importante en el desarrollo radical. Por

debajo de 5,0 y por encima de 7,5 se reduce el crecimiento radical, e influye en la biodisponibilidad de

nutrientes esenciales como el hierro (Azcón-Bieto y Talón, 2008).

Factores bióticos

En la rizosfera conviven una gran cantidad de microorganismos como bacterias, hongos,

protozoos, algas, nematodos, artrópodos, arqueas, virus. Cualquier modificación en la abundancia o en

Capítulo 1

29

las proporciones relativas de estos grupos, afecta a la planta debido a las transformaciones de la materia

orgánica e inorgánica, así como por los metabolitos secundarios liberados por dichos microorganismos,

fundamentalmente en la rizosfera. Principalmente nos referimos a bacterias (microbioma), que son uno

de los principales responsables de las modificaciones fisiológicas de las plantas (Mendes et al., 2013).

Microbioma

El microbioma es un ecosistema de bacterias en continua interacción con su medio: suelo y

planta. Si bien, el estudio de este ecosistema presenta la complejidad de identificar a los integrantes del

mismo. El aislamiento de cepas bacterianas provenientes de la rizosfera genera un sesgo, debido a la

viabilidad de las cepas en las condiciones del cultivo y los medios utilizados. Por ello, se ha estimado que

solo entre el 1%-5% de las especies bacterianas presentes en una muestra se pueden aislar (Schoenborn

et al., 2004). En la actualidad, se estima que se han identificado aproximadamente 11.000 especies de

bacterias, de las posible 106-109 existentes (Yarza et al., 2014). Por lo tanto, el estudio de las poblaciones

microbianas requiere de otras técnicas para poder abordar la gran cantidad de información presente en

un ecosistema. La aparición de las nuevas plataformas de secuenciación masiva (NGS) ha permitido la

secuenciación de ADN aislado directamente del ecosistema de estudio (MacLean et al., 2009). En

especial del gen codificador del ARNr 16S permitiendo la identificación de las unidades taxonómicas

operativas (OTUs) que conforman en sistema de estudio. Por ello, la metagenómica se presenta como

una alternativa para evitar el sesgo de la necesidad de aislar o cultivar los microorganismos, o la

obtención de ADN del suelo para la formación de librerías mediante clonaje y su posterior

secuenciación. Entender la estructura del microbioma de la rizosfera, nos ayudaría a poder implementar

nuevas técnicas en un contexto agronómico, promoviendo nuevas formas de cultivo (Busby et al., 2017).

PGPRs

Aun siendo de vida libre, muchos de las bacterias que habitan el sistema rizosférico están

íntimamente relacionados con el sistema radical mediante una asociación de mutualismo con la planta, o

incluso generando estructuras con las mismas en un proceso de simbiosis. Un ejemplo ampliamente

estudiado serían las bacterias de tipo diazotrofo, bacterias que establecen simbiosis en el proceso de fijación

simbiótica del nitrógeno (Franche et al., 2009). Este es un proceso vital para la producción primaria, ya que

supone la entrada de nitrógeno más importante en los ecosistemas terrestres (Taiz y Zeiger, 2010). Las

relaciones simbióticas más estudiadas corresponden a Rhizobium, Bradhyrhizobium, Azorhizobium,

Sinorhizobium con leguminosas, y a Frankia con angiospermas no leguminosas.

También podemos localizar otros sistemas simbióticos en la rizosfera como son las micorrizas. Éstas

son procesos de simbiosis entre hongos y raíces de plantas superiores, estando la mayoría de las plantas

micorrizadas (Barea et al., 2005; Rillig y Mummey, 2006).

Con respecto a las bacterias de vida libre, nos referiremos básicamente a cepas beneficiosas, que

son conocidas por sus siglas en inglés PGPR “Plant Growth Promoting Rhizobacteria” (rizobacterias


30

promotoras del crecimiento de las plantas) (Kloepper y Schroth, 1978); aunque también junto con estas

cepas aparecen otras que tienen un efecto negativo sobre la planta, conocidas como bacterias deletéreas

(DRBs) (Gutiérrez Mañero et al., 1996). Éstas pueden reducir el crecimiento de la planta, bien causando

daños en los tejidos radicales, o bien produciendo metabolitos tóxicos que inhiban el crecimiento y

desarrollo del sistema radical o de otros miroorganismos.

Dentro de las PGPRs, encontramos bacterias pertenecientes a multitud de géneros bacterianos

como Azotobacter, Acetobacter, Azospirillum, Burkholderia, Pseudomonas y Bacillus (Kloepper et al.,

1989; Barriuso et al., 2005; Lugtenberg y Kamilova, 2009; Babalola, 2010; Berendse). Esta cepas ejercen

su efecto de diferentes maneras, mejorando el estado de la planta, pudiendo en algunos casos modificar

el metabolismo de la planta, proceso conocido como elicitación. La elicitación biológica por PGPRs se

propone como una estrategia útil para mejorar, por un lado, la producción vegetal (biomasa) si la cepa

utilizada induce promoción del crecimiento de la planta a la que se aplica y, por otro lado, por su

potencialidad para alterar el metabolismo secundario de la misma, siendo esto último de especial

interés para la industria farmacéutica y para la agricultura (Zhao et al., 2005; Glick, 2012).

Mecanismos de acción de las PGPR

En la actualidad, los mecanismos de promoción del crecimiento de las plantas por parte de PGPRs

no han sido deducidos completamente. Mayoritariamente las PGPRs actúan de dos formas posibles:

sintetizando un compuesto, metabolito, para la planta; facilitando la disponibilidad de nutrientes a la

planta; así como disminuyendo o previniendo enfermedades causadas por diversos agentes patógenos

(Hayat et al., 2010). Estos mecanismos se pueden dividir en dos: directos o indirectos (Ramos-Solano et

al., 2008b), dependiendo de la implicación de la planta, según se describe a continuación.

Mecanismos indirectos

Se consideran mecanismos de acción indirectos cuando la bacteria libera algún metabolito, que a su

vez, afecta a otros factores rizosféricos que revierten en una mejora o estimulación del crecimiento de la

planta (Kloepper y Metting Jr, 1992; Van Loon, 2007; Martínez-Viveros et al., 2010). No requiere la

participación de la planta.

Producción de sustancias movilizadoras de nutrientes, como ácidos orgánicos o aminoácidos (Jones

et al., 1994; Jones, 1998; Vassilev et al., 2006; Rodríguez et al., 2006).

Producción de sideróforos. Los sideróforos secretados por las PGPR quelan la mayor parte del Fe3+

presente en el suelo permitiendo a las PGPR competir satisfactoriamente contra patógenos (Kloepper et al.,

1980a; Leong, 1986; Weller, 1988;(Radzki et al., 2013).

Control de patógenos edáficos por antagonismos o competencias, mediante la síntesis de

moléculas antifúngicas y antibióticos. (Burr y Caesar, 1984; Schroth et al., 1984; Gaskins et al., 1985;

Davison, 1988; Chin-A-Woeng et al., 2000).

Capítulo 1

31

Bloqueo, hidrólisis, de moléculas de “quórum-sensing” producidas por patógenos, como

lactonas homoserinas (AHLs) (Toyoda y Utsumi, 1991; Lugtenberg y Kamilova, 2009).

Síntesis de enzimas hidrolíticas de pared fúngica, ß-1, 3-glucanasas, quitinasas (Lim et al., 1991;

Bloemberg y Lugtenberg, 2001; Ramos Solano et al., 2010b).

Competencia por nutrientes y nichos ecológicos (Kloepper et al., 1988; O´Sullivan y O´Gara, 1992;

Devliegher et al., 1995; Kamilova et al., 2005).

Síntesis de ácido cianhídrico (HCN). Habitualmente producido por bacterias del género

Pseudomonas, lo que apunta hacia un posible efecto antipatogénico (Voisard et al., 1989; Hayat el al.,

2010).

Mejora del establecimiento de la simbiosis con rizobios o con micorrizas (mycorrhization helper

bacteria, MHBs) (Garbaye, 1994; Merk-Kozackuk y Skorupska, 2001; Lucas García et al., 2004a; Barriuso

et al., 2008a; Estévez et al., 2009).

Mejora en la mineralización de la materia orgánica poniendo a disposición de la planta

nutrientes, así como fijadores de nitrógeno de vida libre (Lugtenberg y Kamilova, 2009)

Mecanismos directos

Son aquellos en los que el microorganismo produce un metabolito que por sí mismo es capaz de

estimular el crecimiento vegetal y requiere la mediación de la planta (Kloepper y Metting Jr, 1992;

Ramos-Solano , Barriuso Maicas et al., 2008; Lugtenberg y Kamilova, 2009). De forma resumida, los

mecanismos de acción directa se muestran a continuación:

Producción de reguladores del crecimiento, fitoestimuladores, como auxinas, ácido abscísico,

ácido giberélico, citoquininas, entre otros (Gutiérrez Mañero et al., 1996 y 2001; Patten y Glick, 2002;

Dey et al., 2004; Spaepen et al., 2008)

La producción de la enzima 1-aminocilclopropano-1-carboxílico (ACC) desaminasa, reduce los

niveles de etileno en las raíces. Esta situación se refleja en un aumento de la longitud radical (Glick et al.,

2007).

Dentro del grupo de mecanismos directos, es de especial relevancia la capacidad de Inducción de

la Resistencia Sistémica (ISR) en la planta, debió al gran potencial de aplicación y en especial por su

estrecha relación con el metabolismo secundario (Conrath, 2009; Pieterse et al., 2012).

Por otro lado, del mismo modo que pueden emplearse determinadas cepas PGPR para inducir o

elicitar determinadas rutas metabólicas, se utilizan directamente elicitores aislados de estas cepas.

Existen multitud de trabajos que demuestran cómo elicitores de distinta naturaleza son capaces de

desencadenar las respuestas defensivas de la planta y llevan a la producción de metabolitos secundarios

(Zhao , Davis et al., 2005; Kloepper et al., 2008).

Por todo ello, comprender como suceden las interacciones localizadas en la rizosfera, entre la

planta, las comunidades microbianas (microbioma) y el sustrato, podría resultar en una mejora de las


32

funciones: nutrición, protección frente a patógenos, crecimiento y desarrollo de la planta, lo que

conllevaría en un beneficio para la sociedad (figura 1.17).

Figura 1.17 Interacciones en la rizosfera entre la planta y las poblaciones microbianas (Pieterse et al

2016)

Respuesta defensiva de las plantas

La presencia de un metabolismo secundario en las plantas, es una respuesta a los diferentes

estreses según los biólogos evolutivos (Wink, 2010). La mayoría de los metabolitos secundarios que

produce una planta están implicados en la adaptación de las plantas con su entorno ya que su

naturaleza sésil no les permite huir del factor de estrés, ya sea abiótico o biótico (Van Loon, 2007). Por

lo tanto, el conocimiento de los factores capaces de iniciar una respuesta defensiva frente al estrés en

una panta es fundamental para el posterior manejo de la misma. No sólo es fundamental conocer estos

factores, sino también cómo ocurre la transducción de la señal a nivel fisiológico en la planta

La gran mayoría de los microrganismos patógénos como son virus, hongos o bacterias, se

detectan mediante el reconocimiento de señales producidas por los propios microorganismos. Estas

señales inducen una respuesta de defensa en la planta y se consideran “elicitores”. Actualmente los

Capítulo 1

33

elicitores se clasifican en dos clases, general o no específicos y elicitores específicos (Montesano et al.,

2003).

Los elicitores generales o no específicos pueden ser de diferente naturaleza, provenientes de

microorganismos no patógenos (Microbe Associated Molecular Patterns, en inglés MAMPs), de

patógenos (Pathogen Associated Molecular Patterns, PAMPs), pero también pueden provenir del propio

hospedador (Damage Associated Molecular Patterns DAMPs) debido a un daño asociado a un patógeno,

lo que promueve una respuesta similar a la realizada por PAMPs figura 1.18). En los dos primeros casos,

los MAMPs/PAMPs son definidos como epítopos localizados en moléculas conservadas, indispensables

para los microorganismos no patógenos y patógenos, ausentes en plantas (Schwessinger y Zipfel, 2008)

Figura 1.18 Clasificación de los elicitores, asociado al tipo de respuesta inmunitaria de la planta. A)

Elicitores generales (no específicos) están asociados a una Inmunidad innata primaria. Incluyen,

Microbe-Associated Molecular Patterns (MAMPs), Damage-Associated Molecular Patterns (DAMPs,

Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs). Los dos últimos elicitores se caracterizan por activar

la respuesta defensiva de la planta, conocida como PTI (PAMP Triggered Inmunity). B) Elicitores

específicos, efectores (proteínas de avirulencia). Al ser reconocidos por la planta, activan una segunda

resistencia denominada ETI (Effector Triggered Inmunity) (Henry et al., 2012)

Cuando la planta detecta este tipo de elicitores, activa el sistema de resistencia basal, primaria,

reconocida como Inmunidad inducida por moléculas asociadas al patógeno “PTI” (PAMP Triggered


34

Inmunity), que resulta en la interrupción del proceso de infección. Por otra parte, y en un intento de

sobrevivir, ciertos patógenos son capaces de secretar “efectores” que inhiben la PTI, lo que resulta en

un eficiente proceso de infección; estos “efectores” se conocen como factores de avirulencia (avr). Las

plantas a su vez, han evolucionado para contrarrestar esta situación, diseñando un sistema de

reconocimiento de los factores de avirulencia mediado por receptores que están codificados por genes

de resistencia (R). El inicio de este proceso, implica la síntesis de proteínas de Resistencia, “Pathogenesis

Related” (PR), que confieren a la planta una resistencia secundaria más rápida y amplia denominada

Inmunidad inducida por efectores del patógeno “ETI” (Effector Triggered Inmunity) (figura 1.19) (Jones y

Dangl, 2006; Henry et al., 2012).

Figura 1.19 Modelo en zig-zag que ilustra la respuesta cuantitativa del sistema inmune en plantas. En la

fase 1, la panta detecta MAMPs/PAMPs (rombos rojos), siendo reconocidos por receprotes PRRs,

activando “PTI”. En la fase 2, efectores del patógeno inactivan la PTI, proceso conocido como “effector-

triggered susceptibility” (ETS). En la fase 3, un efector es reconocido por la planta, activando la

Inmunidad inducida por efectores del patógeno (ETI), asociada a la activación de genes R y a una

Respuesta Hipersensible (HR) (Jones y Dangl, 2006).

Activación de la respuesta inmune innata: Reconocimiento y transducción de señal

Como se ha expuesto anteriormente, la activación del sistema inmune innato de las plantas

puede ser una activación de la resistencia basal inducida por elicitores generales o una activación de

resistencia secundaria inducida por elicitores específicos (Effector triggered immunity (ETI). La activación

de cada tipo de resistencia presenta ciertas divergencias en el proceso de reconocimiento del elicitor.

La activación del sistema inmune de resistencia innato, se produce mediante el reconocimiento

de los elicitores (PAMPs, MAMPs, DAMPs) a través de receptores de membrana. Estas proteínas,

llamadas “pattern recognition receptors” (PRRs), presentan dominios de recepción conservados estando

localizados en la cara externa de las membranas de las células vegetales. Este tipo de receptores

Capítulo 1

35

también se localizan en mamíferos, siendo los Toll-like Receptor (TLRs) la familia de receptores más

estudiados (Kawai y Akira, 2011). En el mundo vegetal, los receptores mejor caracterizados son las

familias pertenecientes a “Receptor-like Kinase” (RLKs) y la familia “Receptor-like Protein (RLPs). En el

caso de receptores de tipo RLK, el receptor presenta un dominio intracelular de tipo quinasa, por el

contrario en la familia RPL, este dominio está ausente (Boller y Felix, 2009). En la actualidad se conocen

más de 600 receptores de tipo RLK y 57 de la clase RLP en Arabidopsis thaliana, no todos están

implicados en el reconocimiento de elicitores, ya que se ha observado que también intervienen en

procesos de desarrollo (Monaghan y Zipfel, 2012). El número de microorganismos que podrían infectar-

interaccionar con una célula vegetal es ilimitado, por lo que la presencia de receptores específicos de

cada elicitor sería imposible. Sin embargo, las plantas han optado por reconocer elicitores comunes,

muy conservados, presentes o liberados por una gran parte de las poblaciones microbianas, pudiendo

ser varios los elicitores desencadenantes de la resistencia sistémica en un mismo microorganismo

(Bakker et al., 2007; Pel y Pieterse, 2013). Entre estos, nos encontramos a moléculas como la quitina,

peptidoglicanos, lipopolisacáridos (LPS), el factor de elongación Tu (EF-Tu) y flagelina (Alabouvette et al.,

1993; Yamaguchi et al., 2000; Al-Tawaha et al., 2005; Ramos-Solano et al., 2008b; Van Wees et al.,

2008).

Por el contrario, la activación del sistema inmune de resistencia innato ETI, requiere de un

reconocimiento específico entre el factor de avirulencia (avr), proveniente del microorganismo, y el

receptor codificado por el gen R. La gran mayoría de genes R codifican una familia de receptores

citoplasmáticos de tipo NB-LRR (Dangl y Jones, 2001). Estos receptores presentan dos dominios bien

definidos, el dominio NB con capacidad para unirse a nucleótidos, y el dominio LRR, región rica en

leucina. La activación de ETI tras el reconocimiento del efector en el citoplasma, conlleva a una

resistencia frente a un patógeno biotrofo o hemitrofo, pero no se activa frente a un patógeno que daña

el tejido del hospedador, necrotrofo, como pudiera ser un herbívoro.

Aunque la defensa de tipo ETI es más potente y rápida frente a un patógeno concreto, la

respuesta basal PTI juega un papel muy importante en la defensa de la planta frente a un gran número

de patógenos potenciales (Tao et al., 2003).

Resistencia Sistémica Adquirida y Resistencia Sistémica Inducida

En los últimos años ha habido un creciente interés por conocer cuáles son los mecanismos y las

señales que desencadenan el metabolismo defensivo (Pesello-Cartieaux et al. 2003).

Independientemente del factor desencadenante de la respuesta defensiva, y por tanto, de los

receptores implicados, cuando se establece una resistencia en tejido que rodea el sitio de la infección

inicial, ésta se denomina Resistencia Localizada Adquirida (LAR)(Kombrink y Schmelzer, 2001). Por el

contrario, cuando la transducción de la señal de resistencia ocurre de forma sistémica, ésta se puede

expresar por una de las dos vías descritas hasta la fecha, Resistencia Sistémica Adquirida (SAR, del

inglés, Systemic Acquired Resistance) (Lawton et al., 1995; Ryals et al., 1996) y la Resistencia Sistémica


36

Inducida (ISR, del inglés, Induced Systemic Resistance) (van Loon et al., 1998) Los dos mecanismos se

activan por el reconocimiento de elicitores como se ha explicado anteriormente. Pero, mientras la

respuesta tipo SAR se activa por elicitores de tipo PAMPs, DAMPs y otros compuestos químicos, la ISR se

activa mediante elicitores de origen microbiano no patógeno (MAMPs) (figura 1.20). Además, las dos

respuestas se diferencian claramente por las vías de transducción de señales que utilizan, SAR es

activada mediante ácido salicílico (Parker et al. 2008), mientras que ISR es activada mediada por

jasmonato y etileno (Pietersen et al. 2002, Ton et al., 2002; Doornbos, R F., 2012)

Figura 1.20 Inducción de la inmunidad innata de la planta, local (A) y sistémica (B). La resistencia

sistémica adquirida (SAR) corresponde a una activación de proteínas de defensa (PRs) a través del

incremento de ácido salicílico después de la precepción de un patógeno. La resistencia sistémica inducida

(ISR) se promueve tras la percepción de un microorganismo no patógeno. Ello con lleva un estado de

defensa potencial, conocido como “priming”, resultando en una activación más rápida y efectiva, tras la

detección de un patógeno (Henry , Thonart et al., 2012)

Resistencia Sistémica Adquirida (SAR).

Consiste en la capacidad de las plantas para adquirir resistencia tras el ataque de un patógeno

que sólo causa daños o necrosis localizadas (Ryals et al., 1996). Está inducida por bacterias y hongos

patógenos, por ejemplo, algunas cepas patógenas del género Pseudomonas son capaces de activar

mecanismos de resistencia por parte de la planta activando la respuesta hipersensible (HR) en respuesta

a la invasión microbiana, que además incrementa la velocidad y los niveles de síntesis de compuestos

Capítulo 1

37

antimicrobianos, fitoalexinas, implicados en la defensa de la planta (Lemanceau y Alabouvette, 1993,

Kishi-Kaboshi, 2010, Hamada, 2012). En la respuesta hipersensible, las células que rodean la zona de

infección muren rápidamente, mediante un proceso de muerte celular controlada, lo que bloquea el

acceso a los nutrientes del patógeno, evitando su propagación por el tejido (Boller 1995). A su vez, se

produce una liberación de especies reactivas de oxigeno (ROS), tales como O2-, H2O2, NO, OH-, que

actúan como potentes agentes oxidantes, causando la inactivación de enzimas, peroxidación de lípidos,

degradación de ácidos nucleícos, aparte de su efecto antibacteriano directo (Lamb y Dixon. 1997). A su

vez, se favorece el entrecruzamiento de proteínas ricas en prolina localizadas en la pared celular en

presencia de H2O2, con lo que se endurece la pared, incrementando su resistencia a los

microorganismos. La presencia de óxido nítrico (NO), también puede actuar como un mensajero

secundario y actuar como elemento de transducción de señales para inducir otras respuestas de

defensa (Apel & Hirt 2004), como la activación de MAPK quinasas y cambios en la fosforilación de otras

proteínas (Peck et al. 2001). Finalmente, al cabo de unas horas se produce la deposición de callosa

(Gómez‐Gómez et al. 1999), lo que conlleva a un confinamiento del patógeno en un conjunto de células

incomunicadas.

Estos procesos están mediados por ácido salicílico (SA), produciéndose incrementos locales en los

niveles endógenos de esta hormona; así como la participación del regulador transcripcional NPR1

(Nonexpressor of Pathogenesis Related Protein 1) y, como consecuencia, la activación coordinada de

genes que codifican para proteínas relacionadas con la patogénesis, PRs (Uknes et al., 1993; Lawton et

al., 1995; Durrant y Dong, 2004, van Loon, 2006, Gozzo et al., 2013). El SA y el factor de transcripción

NPR1 son necesarios como intermediarios en la cascada de transducción de señal en la respuesta SAR

(Mukhtar et al., 2009). Este hecho se ha demostrado con diversos mutantes y transgénicos de la planta

modelo Arabidopsis thaliana como los NahG, que expresan la enzima bacteriana SA-Hidroxilasa y no son

capaces de acumular SA, u otros mutantes como los Sid, que también tienen bloqueada la ruta SAR

(Lawton et al., 1995) o los mutantes npr1 (Cao et al., 1994) (figura 1.21).

La expresión de genes de defensa que precede a la percepción del patógeno también incluye la

producción de compuestos fenólicos, algunos con características antimicrobianas como determinadas

fitoalexinas (Thomma et al. 1999).

Resistencia Sistémica Inducida (ISR).

Algunas bacterias no patógenas son capaces de desencadenar en la planta, las mismas respuestas

que una bacteria patógena, pero sin la sintomatología asociada. En contraste con SAR, esta inducción no

está asociada con la expresión de genes PRs, ni a incrementos en los niveles de SA (pietersen et al.

1996). Por el contrario, se aprecia un aumento en las hormonas como JA y ET. Aunque SAR y ISR

presentan un fenotipo muy similar, el establecimiento de la inducción de la respuesta es diferente, y la

expresión de proteínas de defensa denominadas defensinas (pdf), en lugar de las PRs asociadas a la SAR.


38

La activación de ISR puede ser estimulada por determinadas bacterias no patógenas, procedentes

de la rizosfera de las plantas (kloepper et al 1990). Se han descrito numerosas especies bacterianas PGPRs

dentro de los géneros Pseudomonas, Bacillus, Bradyrhizobium (Van Loon, 2007; Kloepper et al., 2004;

Cartieaux et al., 2008). Las primeras descripciones de resistencia sistémica inducida por bacterias PGPRs

se hicieron a partir del inicio de la década de los 90, en distintas especies vegetales como en clavel

frente al hongo causante de la podredumbre de las raices Fusarium oxysporum (Van Peer et al., 1991) o

en judía frente al mismo patógeno (Benhamou et al. 1996). En estos trabajos se demostró que el

patógeno no pudo penetrar en las células de las raíces, debido al fortalecimiento de las paredes

celulares por depósitos de callosa, compuesto fenólicos y producción de fitoalexinas, y que, por lo tanto,

el control de la enfermedad es un fenómeno mediado por la planta. En las últimas décadas, se ha

demostrado la inducción de la resistencia sistémica mediada por rizobacterias en diversas especies

vegetales como judía, rábano, tabaco, tomate, así como en la planta modelo Arabidopsis thaliana,

siendo eficaces contra hongos, bacterias y virus patógenos (Maurhofer et al 1994; Alström 1995;

Leeman et al, 1995; Pieterse et al. 1996; Duijff et al. 1998, Barriuso et al., 2008b, Ramos Solano et al.,

2008b; Ramos Solano et al., 2010b).

El modelo propuesto por Pieterse et al. (1996 y 1998) y van Loon et al. (1998) (figura 1.21) es

ahora mucho más complejo, tras haberse demostrado que otras cepas PGPR son capaces también de

inducir defensas dependientes de SA, rutas de defensa dependientes tanto de SA como de ET/JA al

mismo tiempo y rutas independientes de ambos (Ramos Solano et al., 2008b; van Hulten et al., 2006;

van Wees et al., 2008). Esto demuestra que la inducción de respuesta sistémica depende de los tres

elementos (planta-PGPR-patógeno) y que al variar cualquiera de los tres factores podrán variar las

respuestas y alteraciones metabólicas.

Capítulo 1

39

Figura 1.21 Vías de transducción de señales que llevan a la SAR inducida por patógenos y a la ISR

inducida por rizobacterias en Arabidopsis thaliana. PAMPs modelo molecular asociado a patógenos, LPS

lipopolisacaridos, MAMPs modelo molecular asociado a PGPRs, JA ácido jasmónico, ET etileno, SA ácido

salicílico, PRs proteínas relacionadas con la patogénesis. Flechas sólidas indican estimulación, barras en

T indican represión (Pieterse et al., 1998 y Ton et al., 2006).

El estado metabólico que tiene una planta inducida antes de ser enfrentada al patógeno o factor

de estrés se denomina priming (Martinez-Medina et al., 2016). El estado de priming también puede ser

inducido mediante el tratamiento de la planta con diversos compuestos tanto naturales como sintéticos.

Las plantas en este estado, son capaces de desarrollar una activación más rápida, más fuerte o ambas

cosas a la vez, de las respuestas defensivas tras el ataque de patógenos, insectos o en respuesta a

factores de estrés abióticos (Conrath et al., 2015). Es frecuente que las plantas puedan presentar un

menor crecimiento que las no estimuladas, lo que se debe al desvío de recursos energéticos hacia el

metabolismo secundario en detrimento de la generación de nuevas estructuras (van Hulten et al., 2006).

Sabemos que algunas rutas metabólicas están especialmente relacionadas con la síntesis de

compuestos de defensa, como la ruta del ácido sikímico para la síntesis de flavonoides. La activación de

esta ruta al enfrentar a la planta con el patógeno puede detectarse mediante aumentos en la actividad

de enzimas clave de la ruta, como la fenilalanina amonio-liasa (PAL). Estudios recientes han demostrado

que la resistencia sistémica que algunas cepas PGPR son capaces de inducir en A. thaliana frente a

Pseudomonas syringae DC3000 se acompaña de un aumento de la actividad PAL (Ramos Solano et al.,

2008b). De esta forma, el empleo de cepas PGPR no es sólo de interés por su potencial para aumentar la

resistencia frente a patógenos, sino por su capacidad para inducir rutas metabólicas implicadas en la

síntesis de compuestos defensivos con un valor añadido por tener aplicación farmacéutica o en la

industria alimentaria (Ramos-Solano et al., 2014; Garcia-Seco et al., 2015).

1. 5 Inducción del metabolismo secundario: Elicitación

Tradicionalmente, se habla de inducción del metabolismo secundario defensivo de las plantas

por las implicaciones que tiene en la etapa de producción agrícola, por su repercusión en la disminución

del aporte de fitosanitarios y otros productos como pueden ser los abonos. Es decir, el objetivo de la

inducción del metabolismo secundario suele ser el incremento de la producción primaria con fines

alimentarios. Sin embargo, existe otro objetivo con un fuerte contenido biotecnológico que es la

inducción del metabolismo secundario, con el objeto de conseguir no una mejor cosecha relativa a la

cantidad de biomasa que proporciona la planta, sino una mayor concentración de moléculas con

actividad farmacológica o defensiva (Gutierrez Mañero et al., 2012).


40

Como ya se ha comentado, las rutas de síntesis de metabolitos secundarios son altamente

inducible lo que representa un reto en cuanto a la identificación y manejo de los compuestos o agentes

biológicos responsables de la inducción (Moore et al., 2014). Además, no sólo es importante conseguir

la inducción sino también, que el efecto sea reproducible y por lo tanto estandarizable (Poulev et al.,

2003). La mayoría de los estudios de elicitación realizados se han llevado a cabo en cultivo in vitro,

donde las condiciones son más controlables. Sin embargo y lejos de excluir el uso de microorganismos

beneficiosos como agentes inductores del metabolismo secundario en campo, la elicitación de plantas

con bacterias beneficiosas aparece como un campo novedoso. Así, aunque ya se ha introducido el

término elicitor a lo largo del texto, como un compuesto de distinta naturaleza y origen que puede

desencadenar una respuesta en plantas, dando como resultado la acumulación de metabolitos

secundarios, se puede ampliar esta definición para incluir a los microorganismos beneficiosos. Por lo

tanto, definiremos elicitor como un compuesto químico, una mezcla compleja o aquellos

microorganismos capaces de desencadenar una respuesta en los organismos vivos de origen vegetal.

Los elicitores son herramientas útiles para mejorar la producción de compuestos vegetales de

interés (Zhao et al., 2001; Yu et al., 2002). De esta forma, podemos definir la elicitación como un

proceso de inducción o potenciación de la síntesis de metabolitos secundarios en las plantas para

asegurar su supervivencia, persistencia y competitividad (Namdeo, 2007).

Se han identificado multitud de compuestos o estímulos que potencian la producción de

metabolitos secundarios de interés. En general, los elicitores pueden clasificarse en base a su

“naturaleza” como elicitores bióticos o abióticos (figura 1.22).

Capítulo 1

41

Figura 1.22 Inducción del metabolismo secundario de las plantas, mediante diversos elicitores, bióticos y

abióticos. Incluyendo microorganismos beneficiosos de la raíz (PGPRs)

Los elicitores bióticos son sustancias de origen biológico, de distinta naturaleza química, entre los

que se han encontrado polisacáridos derivados de la pared celular vegetal (pectina o celulosa) y de

microorganismos (quitina o glucanos), o incluso hormonas vegetales como el ácido salicílico (SA) o el

metiljasmonato (MeJA) (Namdeo, 2007). Por otro lado, los elicitores abióticos no tienen un origen

biológico y se agrupan en factores físicos, temperatura, osmótico, luz; y compuestos químicos, como

metales pesados (Mahajan y Tuteja, 2005).

La mejora en la producción de principios activos con interés farmacológico en plantas tiene un

gran interés de cara a la industria farmacéutica. En el caso concreto de Papaver somniferum, el uso de

PGPRs dirigido a la modificación del contenido en alcaloides podría ser muy adecuado por distintos

aspectos. Mediante procesos biotecnológicos de elicitación, en los que se podrían implicar PGPRs,

podría obtenerse un incremento en la producción de morfinanos con el consecuente beneficio, si lo que

se persigue es la obtención de materias primas con alto valor añadido para la fabricación de

medicamentos.

La aplicación de PGPRs además, permitiría amortiguar las fluctuaciones de principios activos

asociadas a los cambios durante el ciclo de producción, como los causados por factores ambientales,

debido a que las rutas metabólicas de síntesis de estos compuestos son altamente inducibles (Moore et

al., 2014; Garcia-Seco et al., 2015). El empleo de elicitores, entre ellos cepas PGPR, podría solucionar

HERVÍBOROSHONGOS

Temperatura

Luz

MICROORGANISMOSFACTORES DE ESTRÉS BIÓTICO Y ABIÓTICO

PLANTA

METABOLISMOSECUNDARIO

METABOLITOS IMPLICADOS EN:- DEFENSA DE LA PLANTA - ADAPTACIÓN DE LA PLANTA A ESTRÉS

Metabolitos relevantes para: ALIMENTACIÓN INDUSTRIA FARMACÉUTICA OTRAS APLICACIONES

BIOTECNOLOGICAS

Humedad

FACTORES AMBIENTALES

ESTRÉS BIÓTICO

BACTERIAS


42

esta problemática de falta de reproducibilidad existente en el contenido de bioactivos en los campos de

cultivo debido a factores ambientales (Poulev et al., 2003).

1. 6 Plan de trabajo y objetivos

Nuestra hipótesis de trabajo se establece sobre la base de que ciertas bacterias PGPR

incrementan los niveles de metabolitos relacionados con los mecanismos defensivos de las plantas y, en

general, afectan al metabolismo secundario. Por lo tanto, el empleo de dichas bacterias podría estimular

la producción de alcaloides bencilisoquinoleicos o alterar el perfil de los mismos. Lo que parece una

buena alternativa para incrementar los morfinanos mediante una producción sostenible. Por todos

estos motivos, la elicitación biológica con PGPR, ha sido la elegida para el desarrollo de los ensayos que

se presentan en este trabajo. De modo que la relación entre la elicitación del metabolismo secundario y

la concentración de alcaloides constituyen la hipótesis fundamental de partida de este estudio. La

adormidera es el material de trabajo elegido para este estudio por su papel crucial en el ámbito

farmacológico debido al notable potencial terapéutico de los morfinanos. Esto explica el gran interés por

parte de los investigadores en la búsqueda de metodologías eficaces de inducción de estos metabolitos

secundarios, ya que Papaver somniferum es la fuente natural de morfina por excelencia.

Basándonos en la hipótesis de trabajo expuesta, los objetivos generales del presente trabajo

fueron:

Evaluar la capacidad de cepas PGPR para mejorar la germinación y emergencia de semillas de

Papaver somniferum.

Mediante cepas PGPR elicitar el metabolismo secundario de Papaver somniferum, para

incrementar el contenido de alcaloides bencilisoquinoleicos de tipo morfinanos, tanto en invernadero

como en campo.

Realizar un estudio metagenómico del microbioma de la rizosfera de Papaver somniferum. Y

posteriormente relacionarlo con un aislamiento e identificación de cepas potencialmente PGPRs

especializadas procedentes de plantaciones de Papaver somniferum.

Para alcanzar los objetivos propuestos se realizaron dos bloques experimentales independientes,

cada uno de ellos descrito en un capítulo de la presente Memoria.

45

II. ESTUDIO DE CEPAS PGPRS COMO AGENTES

ELICITORES DEL METABOLISMO DE PAPAVER

SOMNIFERUM

Estudio de cepas PGPRs como agentes elicitores del metabolismo de Papaver somniferum

46

2. Estudio de cepas PGPRs como agentes elicitores del metabolismo de

Papaver somniferum

2.1 Introducción

La planta de adormidera, Papaver somniferum, es la fuente más importante de alcaloides de tipo

morfinano explotados por la industria farmacéutica como analgésicos, antitusivos y antiespasmódicos

(Liscombe y Facchini, 2008). Así, durante las últimas dos décadas, la demanda de alcaloides naturales

como morfina, codeína y tebaína ha seguido una tendencia al alza, produciéndose 503 toneladas

equivalentes de morfina en el año 2014, frente a las 115 toneladas del año 1993 (INCB, 2016). La

creciente demanda mundial de morfinanos y derivados está sometida al estricto control a través de la

INCB y a las variaciones en los rendimientos de los cultivos, ya que actualmente es la única fuente

económicamente viable de obtención de morfinanos. Hasta la fecha, las únicas formas de mejora de la

producción son técnicas agronómicas, principalmente el uso de cultivares de Papaver somniferum de

alta producción,

El cultivo de Papaver somniferum en campo presenta las peculiaridades de cualquier cultivo bajo

unas condiciones ambientales cambiantes (Acock et al., 1997; Németh, 1998). Los factores como

temperatura, luz, disponibilidad de nutrientes, agua, patogénesis por fitopatógenos, entre otros,

pueden alterar el crecimiento de la planta y por lo tanto, la posterior producción de la cosecha. A su vez,

debido a la naturaleza inducible del metabolismo secundario de las plantas, los niveles de alcaloides

varían de acuerdo a estos factores (Bourgaud et al., 2001; Facchini, 2001; Szabo et al., 2008), y por lo

tanto, el rendimiento puede verse comprometido.

Teniendo en cuenta los condicionantes del cultivo, y que la baja superficie destinada a su

producción a nivel mundial limita el desarrollo de productos agroquímicos por su escaso interés

económico para las empresas productoras, es necesario desarrollar vías alternativas para incrementar y

mejorar la producción de morfinanos.

Aparece entre estas alternativas la fisiología vegetal aplicada, que nos proporciona razones

fundadas para plantearnos el estudio de determinadas cepas bacterianas beneficiosas del grupo de las

PGPRs para alterar la fisiología de las plantas (Pieterse et al., 2014). La aplicación de PGPRs a nivel

radical es capaz de afectar a todos los procesos fisiológicos de ciertas especies como el crecimiento,

fotosíntesis y metabolismo secundario (Radzki et al., 2013; Lucas et al., 2014; Garcia-Seco, 2015). Así,

nos planteamos la mejora de la producción de metabolitos secundarios, no sólo aumentando, sino

intentando estabilizar la producción de metabolitos secundarios mejorando las condiciones de

adaptación al medio a varios niveles: evitando perdidas en el proceso de germinación y emergencia,

aumentando la producción de metabolitos secundarios de interés en condiciones controladas y en

campo, estabilizando la producción entre campañas, objetivo que se han dispuesto como una de las

Capítulo 2

47

prioridades por parte de la industria productora de materia prima para la obtención de morfinanos de

interés: tebaína, codeína y morfina.

En España el cultivo de Papaver somniferum, se realiza en tres grandes regiones: Andalucía (zona

sur), Castilla-La Mancha (zona centro) y Castilla y León (zona norte). El momento de la siembra se adapta

a las condiciones climatológicas y orográficas de cada región. Durante este periodo, los procesos de

germinación y emergencia, son limitantes en el cultivo de la adormidera (F.J. Ledesma, comunicación

personal), siendo la temperatura y la disponibilidad de agua los factores con mayor influencia, y en

determinadas zonas, los vientos, que modulan la humedad ambiental. En la región de Castilla-La

Mancha la siembra se realiza a mediados de febrero, cuando la temperatura media ronda los 6,6°C y la

humedad relativa media es del 70%, según la Agencia Estatal de Meteorología (AEMET, 2016). Durante

este periodo es muy característico la aparición del proceso denominado “self-munching”, característico

de regiones con climas muy secos (Amezketa, 1999). Una disminución de la humedad relativa ambiental

debida al viento y/o bajas temperaturas puede generar la aparición de una costra superficial dura y

seca, conocida como “self mulching”. Si este proceso coincide con la emergencia de las plántulas, la

superficie actúa como una barrera física, impidiendo su emergencia al no poder romper la costra

superficial. Esta situación conllevaría una disminución en la tasa de emergencia de las plántulas,

reflejando uno de los principales problemas del cultivo de adormidera en la región Centro, que

actualmente se compensa aumentando la densidad de semilla por hectárea.2 Plan de trabajo

y objetivos

Por todo ello y por lo expuesto en la introducción general, la elicitación biótica con rizobacterias

promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) se propone como una estrategia útil para obtener un

aumento y normalización del contenido de alcaloides de tipo morfinanos en plantas de Papaver

somniferum, así como una mejora de la emergencia de plántulas cultivadas.

Con base en lo anterior, nos planteamos los siguientes objetivos:

Evaluación de la potencialidad y selección de cepas PGPR en la mejora de la germinación y

emergencia de Papaver somniferum.

Evaluación de la capacidad de las cepas PGPR para estimular la fisiología de Papaver

somniferum en condiciones controladas.


somniferum


48

2. 3 Materiales y Métodos

Material biológico

Material vegetal

El material vegetal utilizado para la realización de los diferentes estudios fue Papaver

somniferum cv. Madrigal. Las semillas de Papaver somniferum cv. Madrigal, rica en morfina, empleadas

en los experimentos fueron cedidas por Alcaliber I+D+i.

El manejo de las plantas de adormidera varió según el estudio a realizar. Dependiendo de las

condiciones de luz, temperatura, humedad y la finalidad del experimento, los estudios se desarrollaron

en cámaras de cultivo in vitro, invernadero y en campo en fincas de producción en Albacete. Las

condiciones de cultivo se especifican en cada diseño experimento. Cuando fue necesario se procedió a la

esterilización de las semillas según el siguiente protocolo: baño de hipoclorito de sodio al 5% durante 5

minutos en agitación, seguido de 5 lavados con agua destilada estéril (Montes-Borrego et al., 2011).

Cepas PGPR

Las cepas bacterianas empleadas en este trabajo fueron aisladas de la rizosfera o micosfera de

poblaciones naturales de distintas especies vegetales. A continuación, se describe cada cepa, su origen y

capacidades beneficiosas demostradas hasta la fecha, citando el trabajo o los trabajos en los que se han

ensayado y se demuestran sus efectos beneficiosos sobre determinadas especies vegetales. En la tabla

2.1. se resume dicha información.

Tabla 2.1 Características de las cepas PGPR utilizadas en este trabajo: Morfología, Gram, origen,

actividad biológica, alineamiento más significativo de la secuencia parcial del gen que codifica para el

ARNr 16S en GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). CECT: Colección Española de Cultivos

Tipo.

Capítulo 2

49

La cepa Aur9 es un bacilo Gram negativo, asilado de la rizosfera de Lupinus albus (Lucas et al.,

2001) identificado mediante secuenciación del gen rrs que codifica el ARNr 16S como Chryseobacterium

balustinum (AY751083). El uso de esta cepa ha sido protegido mediante patente (P200101363). Aur9 es

capaz de producir compuestos auxinoides in vitro (3.7 ppm) (Gutierrez Mañero et al., 2003). También ha

demostrado su capacidad para promover el crecimiento de plántulas de Lupinus albus, así como de

incrementar la velocidad de germinación de sus semillas (Gutierrez Mañero , Probanza et al., 2003).

Además, es capaz de estimular el crecimiento de plantas diferentes a la que fue aislada, entre ellas:

Solanum lycopersicum, Capsicum annuum, (Cezon et al., 2003; Lucas et al., 2003) Pinus pinea, Quercus

ilex (Lucas et al., 2004) y Arabidopsis thaliana (Ramos-Solano et al., 2008a). Por otro lado, esta cepa, así

como los lipopolisacáridos (LPS) de su pared, han demostrado capacidad para inducir resistencia

sistémica en Arabidopsis thaliana y proporcionar protección frente al ataque de Pseudomonas syringae

pv. tomato DC3000 (Ramos-Solano et al., 2008a). También ha demostrado capacidad de biocontrol

frente a diversos hongos patógenos, contra Fusarium oxysporum y Rhizoctonia solani, protege sola y en

combinación con otras cepas en Solanum lycopersicum y Capsicum annuum (Domenech et al., 2007); en

arroz (Oryza sativa); y protege frente al hongo Pyricularia oryzae (Lucas et al., 2009). Por otra parte,

también ha demostrado capacidad para proteger a plántulas de Arabidopsis thaliana frente a estrés

salino, haciendo disminuir en un 52 % la mortalidad en relación al control (datos sin publicar). A su vez,

en plántulas de soja (Glycine max cv. Osumi) modifica el perfil metabólico de isoflavonas de tipo

Cepa M orfología GramNúmero acceso

GenBankOrigen Actividad Biológica Alineamiento

Aur9 • Producción de auxinas (Gutierrez-Mañero et al ., 2003)

CECT 5399 • ISR en Arabidopsis thaliana (Ramos-Solano et al ., 2008)

BB1 • Producción de auxinas y sideróforos (Barriuso et al ., 2005)

CECT 7170 • ISR en Arabidopsis thaliana (Barriuso et al., 2008b)

• Producción de sideróforos y quitinasas (Ramos et al ., 2010b)

• ISR en Arabidopsis thaliana (Domenech et al ., 2007)



N21.4 • Producción de sideróforos y quitinasas (Ramos et al ., 2010b)

CECT 7620 • ISR en Arabidopsis thaliana (Domenech et al ., 2007)





• Producción de sideróforos (Radzki et al ., 2013)

• ISR en Oryza sativa (Lucas et al., 2014)

• Solubilizadora de fosfatos (Barriuso et al .,2005)

• ISR en Arabidopsis thaliana (Barriuso et al ., 2008b)

• Producción de sideróforos (Barriuso et al .,2005)

• ISR en Arabidopsis thaliana (Barriuso et al ., 2008b)

Bacilli -Lupinus

albus

Chryseobacterium

balustinum

Bacilli + Pinus pinea Arthrobacter

oxydans

AY751083

AY307363

N17.35 Bacilli +Nicotiana

glauca

Pseudomonas

fluorescensAY748891

N5.18 Bacilli -Nicotiana

glauca

Stenotrophomonas

maltophiliaAY748888

Bacilli -Nicotiana

glauca

Pseudomonas

fluorescens


glauca

Stenotrophomonas

maltophilia 6B2-1*

AY748893

AY748889

Chryseobacterium


glauca

Pseudomonas

fluorescens

C138 Bacilli - Oryza sativa

AY748892

JQ766044.1

L81 Bacilli + Pinus pinea Bacillus sp.AY307364

M14 Bacilli - Pinus pinea Burkholderia

graminisAY307366


50

daizeina (Ramos-Solano et al. 2010b). También favorece la nodulación cuando se inocula previamente al

rizobio (Lucas et al., 2004).

Las cepas N5.18, N6.8, N17.35, N19.27 y N21.4 fueron aisladas de la rizosfera de Nicotiana

glauca. Son bacilos Gram negativos identificados mediante secuenciación parcial del gen que codifica

para el ARNr 16S como Stenotrophomonas maltophila AY748888 y AY748889, las dos primeras cepas,

Pseudomonas aeruginosa (AY748891), Pseudomonas corrugata (AY748892) y Pseudomonas fluorescens

(AY748893), respectivamente (Ramos-Solano et al., 2010b). El uso de la cepa N21.4 está protegido bajo

patente (P2336758). Estas cepas han demostrado la capacidad in vitro de producir sideróforos y

quitinasas (Ramos-Solano et al., 2010b). N5.18 Induce el crecimiento en Hypericum perforatum, además

de aumentar el contenido de hipericina, junto a N21.4 (Gutierrez Mañero et al., 2012). Además, N5.18,

N6.8, N17.35 y N19.27 promueven el crecimiento de Solanum lycopersicum mientras que N21.4 lo

inhibe, y las cinco cepas estimulan su metabolismo defensivo (Ramos-Solano et al., 2010b). También

inducen resistencia sistémica (ISR) en Arabidopsis thaliana frente a Pseudomonas syringae DC 3000;

además N5.18, N17.35, N19.27 y N21.4 estimulan su crecimiento (Domenech et al., 2007). También se

ha observado que la cepa N21.4 estimula el metabolismo de isoflavonas en plantas y cultivos celulares

de soja Glycine max cv. Osumi; tanto la cepa como los elicitores de N21.4 son capaces de modificar la

ruta de isoflavonas (Algar et al., 2012). Esta cepa también ha demostrado su eficiencia incrementando la

producción de frutos en plantas de zarzamora (Rubus sp.), en invernaderos de producción (García-Seco

et al., 2013). Así como modificar la ruta de fenilpropanoides en mora (Ramos-Solano et al., 2014; Garcia-

Seco et al., 2015).

Las cepas L81, M14 y BB1 son bacilos Gram positivos, identificados mediante secuenciación del

16s ADNr como Bacillus subtilis (AY307364), Burkholderia graminis (AY307366) y Arthrobacter oxydans

(AY307363), respectivamente, aisladas de la rizosfera y micosfera de Pinus pinea y Lactarius deliciosus

(Barriuso et al., 2005). La cepa L81 es productora de sideróforos, M14 es solubilizadora de fosfatos y BB1

produce auxinas y sideróforos (Barriuso et al., 2005). El uso de la cepa BB1 está protegido bajo patente

(P200601909). Las cepas estimulan el crecimiento e inducen resistencia sistémica en Arabidopsis

thaliana frente a Pseudomonas syringae DC3000 (Barriuso et al., 2008). También L81 y BB1 protegen

frente a estrés salino en Arabidopsis thaliana (Barriuso et al., 2008c). Las tres cepas, promueven el

crecimiento en Pinus pinea, y además, BB1 mejora su micorrización (Barriuso et al., 2008b).

La cepa C138 es un bacilo Gram negativo, asilado de la rizosfera de arroz, Oryza sativa, en

cultivos de Badajoz (Lucas et al., 2014). La secuenciación parcial del gen que codifica para el ARNr 16S la

identifica como Chryseobacterium sp. (JQ766044.1). Es capaz de producir gran cantidad de sideróforos,

tanto en medio líquido como en sólido (Radzki et al., 2013). En arroz estimula su crecimiento, y protege

frente a estrés salino (Lucas et al., 2014). En plántulas de tomate, Solanum lycopersicum, C138 estimula

el crecimiento, y mejora en el contenido nutricional (Radzki et al., 2013).

Preparación de los inóculos

Capítulo 2

51

Las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo, se conservaron a –80°C en una solución de

glicerol al 20% en caldo nutritivo.

El inóculo se preparó refrescando cada bacteria en una placa de agar para métodos estándar

(PCA) (Conda/Pronadisa) a 28 °C, durante 24 horas. Tras comprobar la pureza del cultivo mediante

tinción de Gram, se realizó un preinóculo para cada bacteria, resuspendiendo la biomasa bacteriana de

la placa en tampón MgSO4 10 mM y ajustando la densidad óptica (D.O. 600 nm) a un valor de 1,0

(espectrofotómetro UV-Visible Biomate 5, Thermo Electron Corporation). Se realizó un recuento del

número de unidades formadoras de colonias (ufc/mL) de la suspensión bacteriana mediante diluciones

seriadas y siembra en placa. Los inóculos se prepararon en tampón MgSO4 10 mM, hasta obtener la

densidad bacteriana necesaria según el caso. En los experimentos de germinación, también se aplicaron

medios de cultivo sin bacterias. Para ello se procedió a la separación de las bacterias mediante filtración

(0,22 µm). Seguidamente se diluyó el medio mediante MgSO4 10 mM, al 5% y al 10%.

Diseño Experimental

A continuación, se presenta un esquema del diseño experimental general (figura 2.1) para una

mejor comprensión de los diferentes objetivos planteados:


52


detallan en cada apartado.

3 cepas PGPRs

Selección 3 cepas

Objetivo 1. Evaluación de la potencialidad de cepas PGPR en la mejora de la germinación y emergencia de Papaver somniferum.

10 cepas PGPRs

Evaluación de la capacidad de cepas PGPR, y de sus medios de cultivo, para mejorar la germinación de

Papaver somniferum, in vitro

Evaluación de la capacidad de cepas PGPR seleccionadas, para mejorar la emergencia de plántulas, en condiciones

controladas

Emergencia a 6ºC

Emergencia a 20ºC

GERMINACIÓN

GERMINACIÓN y EMERGENCIA

Objetivo 2. Evaluación de la capacidad de las cepas PGPR para inducir procesos fisiológicos de interés en Papaver somniferum en condiciones de invernadero

CRECIMIENTO y ALCALOIDES

Objetivo 3. Ensayos de Campo. Aplicación de cepas PGPR seleccionadas en fincas de cultivo de Papaver somniferum

Ensayos de elicitación y promoción del crecimiento en parcelas experimentales en campo

3 cepas PGPRs

Ensayo de elicitación y promoción del crecimiento en parcelas de producción de campo

1 cepa PGPR

Selección 1 cepa PGPR

ALCALOIDES

ALCALOIDES

Capítulo 2

53

Evaluación de la potencialidad de cepas PGPR en la mejora de la germinación y emergencia de

Papaver somniferum.

En primer lugar, se preseleccionaron cepas PGPRs de la colección de la Universidad San Pablo

CEU por su potencialidad PGPR demostrada que les conferían a priori un mayor potencial para estimular

la fisiología de la planta, y se evaluó el potencial para estimular la germinación de semillas de

adormidera en condiciones in vitro. El diseño experimental de este experimento se resume en la figura

2.2. y se describe a continuación.


adormidera cultivadas en condiciones in vitro.

Las cepas bacterianas seleccionadas para este estudio se han descrito en el apartado de

Materiales y Métodos, son Chryseobacterium balustinum (Aur9), Stenotrophomonas maltophila (N5.18),

Stenotrophomonas maltophila (N6.8), Pseudomonas aeruginosa (N17.35), Pseudomonas corrugata

(N19.27), Pseudomonas fluorescens (N21.4), Bacillus sp. (L81), Curtobacterium sp. (M14), Arthrobacter

oxydans (BB1) y Chryseobacterium sp. (C138). Se realizaron dos series de experimentos, la primera con

las diez cepas en placas de agar, y la segunda con las tres más eficientes, en suelo, en condiciones

controladas.

En la primera serie de experimentos, cada cepa se ensayó en un experimento que se realizó por

duplicado, con los siguientes tratamientos: cepa bacteriana (108 ufc/mL MgSO4 10 mM); medio de

cultivo libre de bacteria al 5% MgSO4 10 mM; medio de cultivo libre de bacteria al 10% MgSO4 10 mM; y

finalmente el tratamiento Control (MgSO4 10 mM). Se utilizaron un total de 90 semillas por tratamiento,

constituidas por 3 réplicas de 30 semillas cada una por tratamiento. Las semillas se esterilizaron y se

sumergieron en los respectivos tratamientos durante 30 minutos. A continuación, se pusieron en placas

y se incubaron en cámaras de cultivo durante 5 días, SANYO (Growth Cabinet MLR-350H), bajo

condiciones controladas de temperatura, 20°C, humedad relativa del 80% y con un fotoperiodo de

14/10 horas luz/oscuridad respectivamente, con una intensidad lumínica de 350 µE/m2s. Se valoró la

Esterilización

Cámara de cultivo

Temperatura: 20ºCHumedad Relativa: 80%Fotoperiodo: 14h (350 µE/m2S)

Tratamiento

Inmersión 30’

• Bacteria: Aur9; N5.18; N21.4

• 5% Medio de cultivo


• Control

Valoración Germinación

48h; 72h; 96h; 120h

Inoculación


54

germinación diariamente como número de semillas germinadas por día; los resultados se expresan

como porcentaje de germinación acumulado.

En el segundo lote de experimentos, se ensayaron las tres cepas que presentaron mayor

potencialidad en el proceso de germinación en placa, para valorar la capacidad de estimular la

emergencia de plántulas en suelo, a diferentes temperaturas, 20°C y 6°C, simulando las condiciones de

la siembra de primavera en Albacete. Sólo se aplican las cepas, y no los medios de cultivo. El diseño

experimental realizado en condiciones de temperatura y humedad controlada se resume en la figura

2.3.

Figura 2.3. Evaluación de la capacidad de cepas PGPR seleccionadas, para mejorar la germinación y

emergencia de plántulas en suelo, en condiciones controladas, a diferentes temperaturas (20°C y a 6°C).

En la valoración de la emergencia a 20°C, se rellenaron placas Petri de un diámetro de 130mm

de sustrato universal y se dispusieron 30 semillas (n=30) esterilizadas y tratadas mediante inmersión en

una suspensión bacteriana de 108 bacterias ufc/mL en tampón MgSO4 10 mM; como tratamiento

Control se utilizó una solución MgSO4 10 mM. Cada tratamiento se realizó por triplicado constituyendo

cada placa una réplica. Seguidamente las placas se dispusieron en una cámara de cultivo a 20ºC y 80%

de humedad relativa, con un fotoperiodo de 14 horas de luz (350 µE/m2s), durante 7 días. Tras finalizar

este periodo de siete días, se realizó un recuento, contabilizando el número de semillas emergidas con

respecto al total de semillas.

Esterilización Inoculación

Inmersión 30’ • Bacteria (108 ufc/mL ): Aur9N5.18N21.4

• Control

Cámara de cultivo



7 días post inoculación

Tratamiento

VALORACIÓN EMERGENCIA A 20°C

Esterilización

Tratamiento

Inmersión (30’) semillas

Riego (20 mL), sustrato

Cámara fría

Temperatura: 6ºCHumedad Relativa: 50%

Inoculación

Valoración emergencia cada 2 días

42 días

•Bacteria: Aur9; N5.18; N21.4 (108 ufc/mL)

•Control

•Bacteria: Aur9; N5.18; N21.4 (108 ufc/mL)

•Control

VALORACIÓN EMERGENCIA A 6°C

Capítulo 2

55

Para simular las condiciones de cultivo de Papaver somniferum en la región centro en

condiciones de frío, se utilizó sustrato obtenido de una finca de producción de adormidera en Albacete,

recogido de tal forma que constituyera una muestra representativa. Para ello se muestreó en seis

puntos diferentes de una finca de cultivo un horizonte de 10 cm de suelo y no menos de 5 Kg por

muestra. Se mezclaron las 6 muestras para homogeneizarla y se utilizaron sin esterilizar para evitar

modificaciones en las propiedades físico-químicas y biológicas del mismo. El sustrato se dispuso en

macetas (n=3, 3 repeticiones por réplica), con un volumen de 450 mL y una superficie de siembra de 110

cm2; 30 semillas estériles por maceta. Los tratamientos fueron las 3 bacterias (108ufc/mL) y dos sistemas

de inoculación, (riego e inmersión); en el tratamiento mediante riego, se aplicaron 20 mL de solución

bacteriana sobre la superficie tras la siembra; los controles se regaron con el mismo volumen de 10 mM

MgSO4. En el tratamiento mediante inmersión, las semillas se mantuvieron en solución bacteriana o

control durante 30 min., sembrándose posteriormente. Todo el experimento se desarrolló en cámara

fría, con una temperatura media de 6°C. El número de plántulas emergidas se evaluó cada dos días a lo

largo de 42 días. Se realizó un seguimiento de la temperatura, humedad de forma paralela, así como un

riego a la semana.

Evaluación de la capacidad de las cepas PGPR para inducir procesos fisiológicos de interés en Papaver

somniferum en condiciones de invernadero

Con las cepas seleccionadas del experimento anterior, se realizaron los ensayos conducentes a

la evaluación del efecto de cada cepa sobre el crecimiento y la fisiología de la planta en condiciones de

invernadero. El diseño experimental se resume en la figura 2.4 y se describe a continuación.


56

Figura 2.4 Estudios sobre el crecimiento y la fisiología de la planta en condiciones de invernadero.

Cada cepa se ensayó por separado en tres experimentos independientes, con el tratamiento

Control correspondiente para cada experimento.

Para cada experimento, las semillas fueron esterilizadas y pre-germinadas en un semillero con

1000 mL de una mezcla turba/arena (3:1 v/v) estéril. Diez días después, 60 plántulas fueron

trasplantadas a macetas de 500 mL rellenas con el mismo sustrato de semillero. Las plantas se

mantuvieron en invernadero en condiciones de fotoperiodo natural y en condiciones controladas de

temperatura (5/20°C.). Durante todo el experimento se aplicaron riegos de solución nutritiva Hoagland

al 50%, una vez a la semana (80 mL) de solución nutritiva desde la semana 3 junto con el aporte

necesario de agua.

Para cada bacteria, se hicieron tres grupos de plantas (n=20), antes de la aplicación de los

diferentes tratamientos. Los tratamientos consistieron en diferentes formas de inoculación de la

bacteria: vía foliar, radical y control no inoculado. Las inoculaciones se realizaron en el estado fenológico

de entallado, al inicio del entallado (IE) (60 días post siembra) y al final del entallado (FE) (75 días post

siembra). Cada inoculación bacteriana se realizó con 50 mL de una suspensión bacteriana (108 ufc/mL)

en tampón MgSO4 10 mM y como tratamiento Control se utilizó una solución MgSO4 10 mM. Catorce

días después de la segunda inoculación, se determinaron los parámetros de fotosíntesis. Tras la

formación y desarrollo completo de la cápsula floral, se interrumpió el riego de las plantas, permitiendo

su desecación. Finalmente se procedió a la determinación de los distintos parámetros biométricos:

longitud del tallo, desde el inicio de la raíz hasta el final de la cápsula. El peso de las cápsulas mediante el

Semillero

Invernadero

Trasplante

Inoculación

Aplicación:• Foliar• Riego

Momento:• Inicio de entallado (+60 días post siembra)

• Final de entallado (+75 días post siembra)

Tratamiento

• Aur 9

• N21.4

• N5.18

• ControlMaceta: Turba:arena 3:1

• Temperatura max. 20ºCmin. 5ºC

• Fotoperiodo natural

• Riego:80 mL/ SemanaHoagland 50%, desde 3ª semana

+10 +60 +90 +135

Medición Fotosíntesis(F0; Fv/Fm; NPQ; φPSII

Cosecha• Medición biométrica (longitud tallo; peso seco) • Cuantificación alcaloides

Inoculación

+20 +30 +40 +50 +70 +80 +100 +110 +120

Germinación Roseta Entallado Gancho Antesis Formación y maduración cápsula

Inoculación

días

Capítulo 2

57

corte de la cápsula y los diez centímetros de tallo sobre los que crece la cápsula. Seguidamente se

separaron las semillas del resto de la paja y se pesaron de forma independiente, determinándose como

peso paja y peso semillas. También se procedió a la cosecha de las cápsulas, para su posterior análisis en

el contenido de alcaloides mediante HPLC.


somniferum en Albacete

Previamente a los ensayos de campo, y como prueba de caracterización específica de estas

cepas, se evaluó la viabilidad de las cepas PGPR frente los productos fitosanitarios (fungicidas) de uso

habitual en el cultivo de Papaver somniferum: Metalaxil, Captan, Mancozeb y Tiram, ensayados en dosis

de campo. El diseño experimental realizado se resume en la figura 2.5 y se describe a continuación:

Figura 2.5 Estudio de la compatibilidad de cepas PGPRs seleccionadas frente a fitosanitarios de uso

común en el cultivo de Papaver somniferum.

Se planteó evaluar la resistencia de las bacterias a la dosis habitual de uso y a dosis más

pequeñas, dilución 1/2, 1/5, 1/10, por si fuera necesario combinar la inoculación de las cepas con dichos

fungicidas. Las cepas bacterias se resuspendieron en MgSO4 10 mM a una concentración de 108 ufc/ml,

y fueron sembradas en placas de agar para métodos estándar (PCA) (Conda/Pronadisa). Los

fitosanitarios, en las concentraciones descritas, se impregnaron en círculos de papel de filtro

esterilizados mediante luz ultravioleta (UV) durante 10 min; a continuación, se distribuyeron sobre la

placa tras sembrar la cepa correspondiente en césped. Las placas se incubaron 24 h a 28C. Tras la

incubación se realizaron las mediciones de los halos de inhibición (diámetro).

Los ensayos de campo se realizaron a lo largo de tres campañas en fincas particulares de cultivo de

Papaver somniferum cv. Madrigal, localizadas en la provincia de Albacete. En la primera campaña se

demostró el efecto de los tratamientos, en la segunda se confirmó el efecto de los mismos a nivel

experimental, y en la tercera, se realizó una prueba a gran escala.

Inoculación bacterias 108 ufc/ml• Aur 9• N5.18• N21.4

Fitosanitarios (antifungicos):• Metalaxil 3,9% + Mancozeb 64%

• Captan 50%• Metalaxil 25%• Tiram 80%

Placa PCA

21

51

101

Dosis:• Concentración de aplicación en campo: 1

• Diluciones: , ,

Incubación(24h, 28ºC)


58

Los ensayos de la 1ª campaña se realizaron en dos ubicaciones, Casa del Pozo y Navajo del

Provencio.

Los ensayos de la 2ª campaña se realizaron en dos ubicaciones, Casas las Torres y La Grajuela.

Los ensayos de la 3ª campaña se realizaron en dos ubicaciones, Cherrycoca y Villalozano.

Las labores de siembra, mantenimiento del cultivo y seguimiento del mismo lo realizó el personal

encargado de la finca bajo el asesoramiento del personal agrónomo de Alcaliber I+D+i. La inoculación y

cosecha de las parcelas de experimentación fueron realizadas en colaboración con el personal técnico

de Alcaliber I+D+i y el personal de la FUSP-CEU.

El diseño experimental de los ensayos realizados en la primera y segunda campaña se resume

en la figura 2.6 y se describe a continuación:

Figura 2.6 Diseño experimental de la primera y segunda campaña de los ensayos de elicitación y

promoción del crecimiento en parcelas experimentales en campo.

El personal de Alcaliber I+D+i seleccionó dos fincas de cultivo de Papaver somniferum por

campaña en la provincia de Albacete. En la primera campaña se seleccionaron las fincas Navazo del

Provencio y Casa del Pozo, en la segunda campaña las fincas fueron Casa de las Torres y La Grajuela

(figura 2.7).

Inoculación:

2 Campañas2 Fincas3 cepas3 Pautas de inoculación10 Tratamientos3 réplicas: (miniparcelas 7,5mx2m)

Cepas PGPRs: Aur9, N21.4, N5.18 (107 ufc/mL) y Control

Aplicación: Foliar (400 mL.)

Pautas de inoculación:• Inicio de entallado (IE) (+90 días post siembra)• Inicio de entallado + final de entallado (IE/FE)• Final de entallado (FE) (+100 días post siembra)

Medición Fotosíntesis(F0; Fv/Fm; NPQ; φPSII

Cosecha (1-15 Julio)

• Medición biométrica:(nº plantas/m2; nº cápsulas/m2; peso seco)

• Cuantificación alcaloides

Siembra10-28 Febrero

Medición Fotosíntesis +10 +60 +90 +140+20 +30 +40 +50 +70 +80 +100 +110 +120

Germinación Roseta Entallado Gancho Antesis Formación y maduración cápsula

+130días

Inoculación(15-31 Mayo)

Tratamientos

• Aur 9 (IE)• Aur9 (IE/FE)• Aur9 (FE)• N21.4 (IE)• N21.4 (IE/FE)• N21.4 (FE)• N5.18 (IE)• N5.18 (IE/FE)• N5.18 (FE)

Capítulo 2

59

Figura 2.7 Ubicaciones de parcelas experimentales de Papaver somniferum. Primera campaña: a) Navajo

del Provencio, b) Casa del Pozo. Segunda campaña: c) Casa las Torres, d) La Grajuela. Todas ellas

ubicadas en la provincia de Albacete. Las fincas seleccionadas presentan el área marcada en rosa

(SIGPAC. MAPAMA).

El inicio del cultivo se realizó con la siembra de las semillas en la segunda quincena de febrero.

El cuidado y seguimiento del cultivo fue realizado por el personal encargado, bajo la supervisión del

personal de Alcaliber I+D+i. Dentro de la finca de producción, se delimitaron 30 mini-parcelas, evitando

los bordes de la finca, con un tamaño de 15 m2/mini-parcela en la primera campaña y 20 m2/mini-

parcela en la segunda campaña; que se distribuyeron en diez tratamientos planteados, y de cada

tratamiento se realizaron tres réplicas (figura 2.8).

Figura 2.8 Distribución de los diferentes tratamientos en los ensayos de campo. Detalle de la distribución

de los tratamientos (cepas: Aur9, N21.4 y N5.18, 107ufc/mL.; pautas: Inicio de entallado (IE), final de

Control

Control

ControlAur 9

IEAur 9

IEAur 9

IEAur 9 IE /FE

Aur 9 IE /FE

Aur 9 IE /FE

Aur 9 FE

Aur 9 FE

Aur 9 FE

N21.4IE

N21.4IE

N21.4IE

N21.4IE /FE

N21.4IE/FE

N21.4IE/FE

N21.4FE

N21.4FE

N21.4FE

N5.18IE

N5.18IE

N5.18IE

N5.18IE/ FE

N5.18IE /FE

N5.18IE /FE

N5.18FE

N5.18FE

N5.18FE

2 m.


60

entallado (FE) e inicio de entallado y final de entallado, split (IE/FE)) realizados en mini-parcelas de

15/20m2.

Durante el periodo del entallado, periodo que abarcó la segunda quincena de mayo, se

procedió a la inoculación de las cepas PGPRs. Los tratamientos se realizaron mediante inoculaciones de

las tres cepas bacterianas seleccionadas, Aur9, N21.4 y N5.18, de forma independiente. A su vez, se

realizaron tres pautas de inoculación inicio de entallado (IF), final de entallado (FE) y la combinación de

ambas, al inicio y final del entallado (IE/FE), por cada cepa PGPR. La distribución de las mini-parcelas se

detalla en la figura 2.8. Las inoculaciones se realizaron mediante pulverización foliar manual, con un

volumen de inóculo de 400-600 mL., 1ª campaña y 2ª campaña respectivamente, a una concentración

final 107 u.f.c/ml y 1 ml de mojante (Nonilfenol Polietilenglicol 20%, Probelte).

Durante la segunda campaña, tras 14 días de la última inoculación, final de entallado, se realizó

la medida de los parámetros fotosintéticos (F0, Fv/Fm, φPSII y NPQ), según se indica en el apartado

“Medición de fotosíntesis”.

Tras la floración y formación del fruto (cápsula), se esperó a la desecación de la planta por

completo, momento en el que se realizó la cosecha, primera quincena de Julio. La cosecha de las micro-

parcelas experimentales se realizó mediante la delimitación de un metro cuadrado dentro de cada

micro-parcela. Esta recolección se realizó por duplicado en cada microparcela, distribuyendo las

cápsulas de cada toma a la empresa Alcaliber y a la USP-CEU, para realizar los posteriores análisis de

forma independiente. En cada metro cuadrado cosechado se contabilizó el número de plantas y de

cápsulas totales in situ. Los parámetros biométricos medidos fueron peso total de las cápsulas, peso del

grano (semillas) y peso de la paja. Los análisis de cuantificación de los alcaloides totales, así como de los

alcaloides de interés: morfina, codeína, tebaína y oripavina, fueron realizados mediante HPLC.

Tras los resultados obtenidos en la primera y segunda campaña, se procedió a la selección del

tratamiento de mayor potencialidad para realizar una tercera campaña a nivel de campo, fuera del

manejo experimental. El diseño experimental realizado se resume en la figura 2.9 y se describe a

continuación:

Capítulo 2

61

Figura 2.9 Diseño experimental de los ensayos de elicitación y promoción del crecimiento en campo,

durante la tercera campaña.

El ensayo se desarrolló en dos fincas de producción en Albacete, Cherrycoca y Villalozano

(figura 2.10), donde se delimitó una parcela de 1.482 m2 y 1.050 m2 respectivamente. A su vez, cada

parcela se dividió en dos zonas: Control y Tratamiento, las cuales se subdividieron en 6 subparcelas,

para un mejor análisis de los diferentes parámetros valorados.

Figura 2.10 Ubicaciones seleccionadas en la tercera campaña: a) Cherrycoca y b) Villalozano, en la

provincia de Albacete (SIGPAC. MAPAMA).

Inoculación (30 Mayo):

N5.18 107 ufc/mL. 300L/haFinal de Entallada (FE)

Siembra10-28 Febrero

Medición Fotosíntesis

Villalozano: 1.050 m2

Cherry-Coca: 1.482 m2

Fincas

Parcela: Control (741m2)Parcela: Tratamiento (741m2)

Parcela: Control (525m2)Parcela: Tratamiento (525m2)

+10 +60 +90 +143+20 +30 +40 +50 +70 +80 +100 +110 +120

Germinación Roseta Entallado GanchoAntesis Formación y maduración cápsula

Cosecha (11 Julio)

• Medición biométrica: (nº plantas/m2; nº cápsulas/m2; peso seco)

• Cuantificación alcaloides

Medición Fotosíntesis (30 Mayo y 16 Junio)

(F0; Fv/Fm; NPQ; φPSII

Inoculación:

+130días

Muestreo: ARN (qPCR)


62

Se realizó una única inoculación mediante el tratamiento N5.18 al final del entallado (FE),

tratamiento que había resultado más efectivo en las campañas previas. La aplicación del tratamiento se

realizó a final de entallado (30 de mayo), con un fumigador autopropulsado automatizado con una

relación de 300 litros por hectárea con una concentración bacteriana de 107 u.f.c/ml de N5.18, con el

mojante correspondiente.

Se realizó una medición de fotosíntesis a los 18 días post inoculación (dpi), valorándose los

parámetros fotosintéticos, F0, Fv/Fm, φPSII y NPQ.

A su vez, a los 18 dpi se realizó un muestreo de material vegetal (hojas) para su posterior

análisis de la expresión de los genes T6ODM, CODM y COR, mediante la técnica de Reacción en Cadena

de la Polimerasa cuantitativa (qPCR). Este muestreo se realizó en seis puntos, correspondientes a las seis

subparcelas de cada tratamiento. En cada punto se seleccionaron 4 plantas de forma aleatoria, tomando

la segunda hoja empezando desde el meristemo caulinar apical (Mishra et al., 2013). Inmediatamente se

procedió a la congelación de las muestras en nitrógeno líquido para su posterior conservación a -80ºC,

hasta su análisis.

Tras finalizar el ciclo fenológico de la planta, se realizó la cosecha de las cápsulas (11 de julio),

desecadas. Se realizó por duplicado, en dos parcelas de un metro cuadrado, donde se hizo el recuento

del número de plantas y de cápsulas in situ. Este doble marco de cosecha se realizó en cada una de las

seis subparcelas delimitadas en las parcelas Control y tratada. La cosecha de cada parcela se repartió

entre Alcaliber I+D+i y FUSP-CEU, para los posteriores análisis independientes de los diferentes

parámetros y en el contenido de alcaloides. Finalmente, se realizó la cosecha total de las parcelas

ensayadas, mediante maquinaria específica, con el fin de obtener valores del rendimiento en kg por

hectárea.

Figura 2.11 Ubicación Villalozano: aspecto de los diferentes estadios fenológicos del cultivo. La zona

captada en las fotografías corresponde a la parcela delimitada del ensayo. a) Aspecto fenológico del

cultivo durante la inoculación. b) Aspecto fenológico del cultivo durante la medición de los parámetros

de fotosíntesis (+18 dpi). c) Aspecto fenológico del cultivo en la cosecha (fotos A. Bonilla).

Medida de fotosíntésis.

Para la determinacion de los parámetros fotosintéticos se utilizó un fluorímetro FMS2

(Fluorescence Monitoring System, Hansatech, Norfolk, UK) que permite la medida de emisión de

b) a) c)

Capítulo 2

63

fluorescencia de la clorofila en hojas previamente adaptadas a oscuridad para determinar la eficiencia

de la fotosíntesis y diagnosticar la presencia de factores de estrés (Krause y Weis, 1991; Maxwell y

Johnson, 2000; Baker, 2008).

La evaluación de la fluorescencia de las plantas ubicadas en las fincas de producción de la

segunda campaña se realizó en cuatro plantas de cada parcela experimental, evitando los bordes.

Durante la tercera campaña seleccionaron seis zonas de cada parcela, Control y Tratamiento, evitando

los bordes. A su vez, en cada zona se seleccionaron tres plantas diferentes, midiendo la fluorescencia de

hojas desarrolladas.

El programa se compone de los siguientes pasos que consisten en distintos pulsos de luz que

emite el fluorímetro. En primer lugar, se activa una luz modulada (~4 µmol de fotones/m2s) e

inmediatamente se sigue de un pulso de luz saturante durante 0.7 s (~4200 µmoles de fotones/m2s). A

continuación, se activa luz actínica continua (~90 µmoles de fotones/m2s) y tras 25 s (para que se

produzca la adaptación de las hojas a la luz), se vuelve a emitir un pulso de luz saturante de las mismas

características que el anterior. Tras cada uno de estos pasos el equipo va registrando la emisión de

fluorescencia del PSII (figura 2.12).

Con la primera medida, tras adaptar las hojas a oscuridad y aplicar un pulso de luz suave (luz

modulada), se obtuvo la fluorescencia mínima (Fo). Esta medida nos indica el estado de oxidación de la

quinona A del PSII (QA), pudiendo relacionarse con posibles daños en el fotosistema II. Tras aplicar el

pulso de luz saturante, se registró la fluorescencia máxima (Fm) adaptada de la oscuridad. Con estos

parámetros se calculó el rendimiento cuántico máximo del fotosistema II (PSII) que indica la cantidad

máxima de energía que el PSII podría destinar potencialmente a procesos fotoquímicos y se calcula

como Fv/Fm, donde Fv es la fluorescencia variable, 𝐹𝑣 = 𝐹𝑚 − 𝐹 ∘

En condiciones de luz (luz actínica), se midió la fluorescencia emitida por la hoja adaptada a la

luz (Fs) y la fluorescencia (Fm’) en el momento de ser sometida a un pulso de luz saturante (Fm´:

fluorescencia máxima medida en un estado adaptado a luz). Con estos parámetros se calculó el

rendimiento cuántico del PSII (φPSII), que se calcula como 𝜙𝑃𝑆𝐼𝐼 = (𝐹𝑚′ − 𝐹𝑠) 𝐹𝑚′⁄ . Este parámetro

cuantifica la proporción de energía absorbida por el PSII que es utilizada en el transporte electrónico

fotosintético (Maxwell y Johnson, 2000), y por lo tanto nos informa de la cantidad de energía real que se

destina a procesos fotoquímicos.

Finalmente se calculó el NPQ (quenching no fotoquímico) como 𝑁𝑃𝑄 = (𝐹𝑚 − 𝐹𝑚´) − 1

parámetro que indica la proporción de energía recibida que se disipa en forma de calor y que, por tanto,

no se utiliza para los procesos fotoquímicos (ÖGren y Baker, 1985; Baker, 2008; Rodriguez-Moreno et

al., 2008).

Todos los datos se integran con el software MODFL2. En la figura 2.12 se esquematizan los

parámetros analizados.


64

Figura 2.12 Programa de Emisión de fluorescencia registrada durante el programa descrito e integrada

con el software MODFL2.

Análisis expresión génica

La extracción del ARN total de las hojas de Papaver somniferum se realizó con el kit PureLink TM

Micro-to-Midi Total RNA Purification System (Invitrogen, USA), siguiendo las indicaciones del fabricante.

Todas las muestras fueron tratadas con DNase I, Amplification Grade (1 unit/μl) (Invitrogen, USA), para

la eliminación de posibles restos de ADN que pudieran interferir con la técnica de qPCR. Una vez aislado

el ARN total, se procedió a su cuantificación mediante el espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo

Scientific, USA). Seguidamente se valoró la integridad de las muestras mediante la plataforma

automatizada de electroforesis, Experion™ Automated Electrophoresis System (Bio-Rad, USA). Tras

valorar la cantidad y calidad del ARN total aislado se procedió a la retrotranscripción (RT) del ARN en

cDNA. Para la síntesis del cDNA se utilizaron 1 µg de ARN total usando el kit cDNA iScript synthesis (Bio-

Rad, USA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La técnica de qPCR se realizó utilizando la detección de SYBR Green, mediante iTaq universal

SYBR Green Supermix (Bio-Rad, USA) según las indicaciones del fabricante, en un sistema MiniOpticon

PCR en tiempo real (Bio-Rad, USA). Las características de los cebadores (Wijekoon y Facchini, 2012)

utilizados se recogen en la tabla 2.2

Condiciones luz

Luz saturante4200 μmol fotones/m2 s

F0

Fm

Oscuridad

Luz saturante

Fm’

F’

Condiciones oscuridad

Fv

Fv’

25’’

Rendimiento cuántico máximo del PSII

Rendimiento cuántico del PSII

Luz actínica

Quenching No Fotoquímico

Luz modulada4 μmol μmol fotones/m2 s

Capítulo 2

65

Tabla 2.2 Lista de cebadores utilizados en la técnica de qPCR y sus características.

Las condiciones de la qPCR fueron 3 min de desnaturalización inicial a 95°C, seguido por 40

ciclos de desnaturalización durante 20 s a 95°C, hibridación durante 15 s (CODM: 51,5°C; T6ODM:

51,5°C; COR: 58°C; Actina: 51.5°C) y la extensión durante 20 s a 72°C. La especificidad de los oligos se

verificó mediante un análisis de la curva de “melting” y a través de la realización de una electroforesis

en gel de agarosa, para confirmar el tamaño del amplicón y especificidad.

El valor umbral (Ct) de cada gen fue normalizado frente al valor Ct del gen -actina de Papaver

somniferum, el cual fue usado como referencia constitutiva de los transcritos. La expresión de cada

tratamiento fue analizada mediante el método 2-ΔΔCt (Livak y Schmittgen, 2001) normalizando los valores

de expresión frente al tratamiento Control.

Cuantificación de alcaloides

La determinación de alcaloides se realizó en muestras constituidas por las cápsulas secas y los

diez primeros centímetros del tallo. En cada experimento, se pesó el material vegetal y se dividió en tres

grupos por tratamiento y, cada grupo se valoró como una réplica de cada tratamiento. A continuación,

se separaron las semillas de la paja de adormidera, pesándose por separado. La paja de adormidera se

utilizó para el análisis de alcaloides.

Las muestras se pulverizaron con un molinillo automático y se conservaron a 4°C hasta el

momento del análisis. La extracción de los alcaloides se realizó según la metodología modificada de J.

Kabay (Bayer, 1961). Para la extracción de los alcaloides se partió de un gramo de muestra pulverizada,

en 100 mL ácido acético 1% (v/v) y se mantuvo en un agitador orbital a 250 rpm durante 1 h a 37°C.

Después se centrifugó a 4.500 rpm durante 20 minutos a 20°C. El sobrenadante obtenido se filtró a

través de membrana de nitrocelulosa de 0,2 µm, y el extracto se utilizó para el análisis por HPLC (High-

performance liquid chromatography). El análisis del contenido de los alcaloides se realizó aplicando la

metodología de Yoshimatsu (Yoshimatsu et al., 2005) con modificaciones de Alcaliber SA (F.J. Ledesma

comunicación personal). Las condiciones de la cromatografía fueron las que se especifican a

continuación: detección UV: 284 nm, columna Phenomenex Luna C18 (5 µm, 150mm x 4,6mm),

termostatizador Gecko-2000 30-80°C que mantuvo la columna a 45°C. La fase móvil consistió en:

solvente A: solución ácido fosfórico 0,015 mM pH 6,9 (dietilamina), y solvente B: acetonitrilo; con el

Nombre GenBank Sentido Secuencia 5'-3' Tm Tamaño amplicón

Ps-COR Forward CAAACTGAAGAGTGTCTTGGTGAAGCT 61.8

Ps-COR Reverse GGAGGACAAGATCAGCGTGAGCA 63.4

Ps-T6ODM Forward TTGAGGCACAAATGAGAAAATTGA 57.9

Ps-T6ODM Reverse CACAACGCACTTTCGAGAAATTAC 58.5

Ps-CODM Forward TTGTGCTTAAATTTCGTGGATGAC 57.9

Ps-CODM Reverse TGATTACATCACTTGACCCAAACAG 57.7

B-actina Forward TCTCAACCCAAAGGCTAATCG 57.4

B-actina Reverse CCCCAGAATCCAAGACAATAC 54.2

FJ624147.1

GQ500139.1

GQ500141.1

AB574418.1

125 pb

63 pb

114 pb

150 pb


66

siguiente gradiente: de 0% a 40% de B en 25 minutos y después se incrementó a 50% de B en 5 minutos,

manteniéndose en esta composición 10 minutos, tras lo cual descendió a las condiciones iniciales (0 %

B) durante 10 minuto y se mantuvo 9 minutos para equilibrar la columna. El flujo fue de 1.0 mL/min y el

volumen de inyección de muestra fue de 10 µL. La identificación y cuantificación de los alcaloides

morfina, codeína, oripavina y tebaína se realizó en un cromatógrafo Beckman equipado con dos bombas

125 Solvent Module y un detector Dioide array 168. Los datos fueron transferidos a un integrador 32

Karat 8.0 (Beckman). La cuantificación de los alcaloides se realizó por interpolación de las áreas relativas

dadas por el detector en una recta de calibrado construida para cada principio activo. Las rectas de

calibrado fueron conformadas con alcaloides cedidos por Alcaliber I+D+i: morfina, oripavina, codeína y

tebaína. Los coeficientes de correlación de las rectas de calibrado de los alcaloides fueron 0,9998 a

0,9999.

Análisis estadístico

Se evaluó la influencia del tratamiento sobre cada uno de los parámetros analizados mediante

ANOVA unidireccional o bidireccionales según los casos, a partir de los valores de las réplicas (Sokal y

Rohlf, 1980). Cuando el valor de “p” fue menor a 0,05 (95% de confianza), se consideró que existían

diferencias significativas atribuibles al tratamiento. En este caso, se compararon los valores medios

mediante el estadístico LSD (Least Significant Difference) de Fisher. El programa utilizado fue el

STATGRAPHICS Plus 5.1. (Statistical Graphics Corp.)

Debido al gran número de variables estudiadas en las campañas de campo, fue necesario el uso

de análisis estadísticos multivariantes, utilizando el programa estadístico “CANOCOTM” versión 4.56 (ter

Braak y Smilauer, 2002), para poder describir e interpretar los datos obtenidos. De esta forma se

realizaron análisis de componentes principales (PCA) y análisis de redundancia basados en la distancia

(db-RDA) (Legendre y Gallagher, 2001).

Capítulo 2

67

2. 4 Resultados

Evaluación de la potencialidad de cepas PGPR en la mejora de la germinación y emergencia

de Papaver somniferum.

Los resultados obtenidos en el proceso de germinación se resumen en la figura 2.13. A las 48

horas de la inoculación, la germinación media era del 70% de las semillas en el Control, y tras 120 h

aumentó hasta el 85%. Entre las diez cepas ensayadas, se detectaron cuatro comportamientos

diferentes en función de sus efectos sobre la germinación después de la incubación en una suspensión

bacteriana, o en los medios de cultivo libres de bacterias.

Las cepas de Stenotrophomonas maltophilia N5.18, Chryseobacterium balustinum Aur9 y

Pseudomonas fluorescens N21.4 aumentaron el porcentaje de semillas germinadas entre el 95% y el

100% en las primeras 120 horas, especialmente en los dos primeros casos, frente al tratamiento Control,

que en el mismo periodo de tiempo presentó un porcentaje de germinación que oscilaba entre un 80%-

90%. Resulta interesante observar la aceleración de la velocidad de germinación durante las primeras 72

h, mientras que los Controles no inoculados alcanzaron el máximo a las 96 horas.

Por otra parte, la cepa de Burkholderia graminis M14 activó la germinación, mientras que sus

medios de cultivo la inhibieron, resultando la inhibición dosis-dependiente ya que era mayor en el

tratamiento con el medio de cultivo al 10%.

Las cepas de Chryseobacterium C138 y Stenotrophomonas maltophilia N6.8 no mostraron

efectos sobre la germinación, tampoco lo hicieron sus medios de cultivo, aunque durante las primeras

72 h se observó un incremento no significativo en el porcentaje de germinación con sus medios de

cultivo, efecto que en el caso de N6.8, también se observó con la suspensión bacteriana. A las 120 h, los

porcentajes de germinación se equipararon, por lo que no se observaron diferencias con el tratamiento

Control.

Por último, las cepas de Pseudomonas fluorescens N19.27, Bacillus subtilis L81 y Pseudomonas

aeruginosa N17.35 inhibieron la germinación, pero sus medios de cultivo libres de bacterias propiciaron

un aumento en la germinación de las semillas. Por último, Arthrobacter oxydans BB1, disminuyó la

germinación con todos los tratamientos.

En base a los resultados obtenidos, las cepas seleccionadas para la realización del siguiente

experimento (germinación y emergencia en condiciones controladas) fueron N5.18, Aur9 y N21.4 La

elección de dichas cepas se basó en la capacidad de estas cepas y de su medio de cultivo sin bacterias,

para potenciar un aumento de la tasa de germinación y de la aceleración del proceso.


68

Figura 2.13 Germinación de semillas de adormidera tras el tratamiento con diez cepas PGPR (108 ufc

/mL.), y sus medios de cultivo libres de bacterias al 5% y el 10%, y controles no tratados. Los datos son la

a

wp

f

60

65

70

75

80

85

90

95

100

48 h 72 h 96 h 120 h

% G

erm

inac

ión

N5.18

Control N5.18 N5.18 10% N5.18 5%

bbb

xxx

qqq

ggg

a

w

pf

60

65

70

75

80

85

90

95

100

48 h 72 h 96 h 120 h

% G

erm

inac

ión

Aur9

Control Aur9 Aur9 10% Aur9 5%

bbb

xxx

qqq

ggg

w

60

65

70

75

80

85

90

95

100

48 h 72 h 96 h 120 h

% G

erm

inac

ión

N21.4

Control N21.4 N21.4 10% N21.4 5%

aaaa

xxw

pppp

ffff

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

48 h 72 h 96 h 120 h

% G

erm

inac

ión

M14

Control M14 M14 10% M14 5%

aaaa

xwww

qpqqrr

gfff

60

65

70

75

80

85

90

95

100

48 h 72 h 96 h 120 h

% G

erm

inac

ión

C138

Control C138 C138 10% C138 5%

cbcaa

wwww

pppp

ffff

60

65

70

75

80

85

90

95

100

48 h 72 h 96 h 120 h

% G

erm

inac

ión

N6.8

Control N6.8 N6.8 10% N6.8 5%

aaaa

wwww

pppp

ffff

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

48 h 72 h 96 h 120 h

% G

erm

inac

ión

N19.27

Control N19.27 N19.27 10% N19.27 5%

aaaa

wwww

pppp

ffff

25

35

45

55

65

75

85

95

48 h 72 h 96 h 120 h

% G

erm

inac

ión

BB1

Control BB1 BB1 10% BB1 5%

abcc

wxxx

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ffff

50

55

60

65

70

75

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90

95

100

48 h 72 h 96 h 120 h

% G

erm

inac

ión

L81

Control L81 L81 10% L81 5%

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wwww

pppp

ffff

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

48 h 72 h 96 h 120 h

% G

erm

inac

ión

N17.35

Control N17.35 N17.35 10% N17.35 5%

aaaa

wwww

pppp

ffff

Capítulo 2

69

media de 3 réplicas (n=30) ± error estándar. Las diferentes letras indican diferencias significativas entre

los tratamientos de acuerdo a la prueba de LSD (p <0,05)

Los datos obtenidos en el experimento de germinación realizado en placa con sustrato a

temperatura ambiente (figura 2.14) mostraron una gran diferencia con los porcentajes de germinación

en condiciones in vitro (figura 2.13). A una temperatura de 20°C la emergencia de plántulas en el

tratamiento Control a los siete días fue del 35% de las semillas. A su vez, todos los tratamientos con

bacterias PGPR mostraban una tendencia a aumentar el porcentaje de plántulas emergidas, siendo los

tratamientos con N5.18 (53%) y con N21.4 (50%) los que presentaron diferencias significativas frente al

control (P<0,05). En el caso de Aur9 se detectó un incremento no significativo (40%) frente al control

(35% emergencia).

Figura 2.14 Emergencia (%) de semillas de adormidera tratadas con Aur9, N21.4 y N5.18 a 20°C, en

suelo. Los datos son la media de 3 réplicas (n=30) ± error estándar. Las diferentes letras indican

diferencias significativas entre los tratamientos de acuerdo a la prueba de LSD (p <0,05).

En el estudio de emergencia en condiciones de frío, la temperatura media durante el periodo

experimental fue de 6,1°C ± 1,3°C, así como de 51,0% ± 8,0% la humedad relativa. Los resultados

obtenidos se han representado agrupados en 5 tiempos (14, 21, 28, 35 y 42 días) post inoculación, para

facilitar la interpretación (figura 2.15) aunque durante el periodo del ensayo, se procedió al recuento de

plántulas emergidas cada dos días.

Cuando los tratamientos se aplicaron mediante riego las tres cepas bacterianas Aur9, N21.4 y

N5.18, aumentaron el porcentaje de plántulas emergidas frente al control (figura 2.15.a), siendo la cepa

N5.18 la que presentó un mayor incremento a los 28 días post inoculación (dpi), manteniendo este

incremento a los 35 y 42 dpi, lo que resultó en un 20% más de plántulas emergidas en comparación con

el Control. Por otra parte, Aur9 y N21.4 no presentaron diferencias significativas con el control, aunque

presentaron un mayor número de plántulas emergidas.

a

ab

bc

c

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

Control Aur 9 N21.4 N5.18

% E

mer

genc

ia


70

Las semillas inoculadas mediante inmersión presentaron un periodo de latencia más largo, no

iniciándose la germinación hasta el día 28 dpi (figura 2.15.b). No obstante, el tratamiento con N5.18

presentó un mayor número de plántulas emergidas (90%), siendo la diferencia frente al control (60%)

significativa a los 42 dpi. El resto de los tratamientos Aur9 y N21.4 siguió la misma tendencia que el

Control, alcanzando valores de emergencia cercanos al 60%.

Figura 2.15 Emergencia de semillas (%) en condiciones de frío a lo largo de 42 días post inoculación. a)

Aplicación mediante riego, b) aplicación mediante inmersión. Los datos son la media de 3 réplicas (n=30)

± error estándar. Diferentes letras (a, b, c) indican diferencias significativas entre los tratamientos de

acuerdo a la prueba de LSD (p <0,05).

a

a

b

aa

aa

ab

ab a

a

a

ab

ab

a

a

a

a

b b

0

20

40

60

80

100

120

140

14 dpi 21 dpi 28 dpi 35 dpi 42 dpi

% E

me

rge

nci

a

Riego

Control Aur9 N21.4 N5.18

a a a

b

a

a a a

b

a

a a a

a

a

a a a

c

b

0

20

40

60

80

100

120

14 dpi 21 dpi 28 dpi 35 dpi 42 dpi

% E

me

rge

nci

a

Inmersión

Control Aur9 N21.4 N5.18

b)

a)

Capítulo 2

71

Evaluación de la capacidad de las cepas PGPR para inducir procesos fisiológicos de interés en

Papaver somniferum en condiciones de invernadero

En base a los resultados obtenidos en las pruebas de germinación y emergencia, se procedió a

la evaluación de la capacidad de mejora de la fisiología de la planta de adormidera mediante la

inoculación de las cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en aplicación foliar y radical, tanto al inicio del entallado y

al final del mismo, en condiciones de invernadero.

La aplicación de la cepa Aur 9 redujo significativamente la tasa de fluorescencia mínima (F0)

frente al Control (figura 2.16), tanto aplicada vía radical y foliar. Por el contrario, los parámetros del

rendimiento cuántico máximo del PSII (Fv/Fm) y el rendimiento cuántico del PSII (ΦPSII) no sufrieron

variaciones significativas respecto al control (p>0,05), mientras que sí se observó una disminución

significativa en el valor del “quenching” no fotoquímico (NPQ), en el tratamiento radical.

Figura 2.16 Parámetros fotosintéticos de plantas inoculadas con la cepa bacteriana Aur9. Inoculación




diferencias significativas entre tratamientos para cada parámetro (p < 0,05).

En las plantas inoculadas con N21.4 (figura 2.17), se detectó una disminución significativa de la

fluorescencia mínima (F0) en la inoculación foliar y una tendencia a la baja no significativa en la

inoculación radical. También se apreció un incremento significativo en el rendimiento cuántico del PSII

(φPSII) en la inoculación foliar. El resto de los parámetros no sufrieron variaciones significativas frente al

control (p>0,05).

a

l

q y

b

l

qz

b

l

q y

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

F0 Fv/Fm ΦPSII NPQ

Aur9

Aur 9 Control Aur 9 Radical Aur 9 Foliar


72






Por último, N5.18 (figura 2.18) promovió una disminución significativa de F0, en la inoculación

radical y foliar, asociado a un aumento significativo del rendimiento cuántico máximo del PSII (Fv/fm).

También se apreció una disminución significativa de NPQ con ambas inoculaciones, mientras que no se

apreciaron diferencias significativas en la eficiencia del PSII (φPSII).




a

l

qy

ab

l

qy

b

lr

y

0

0,5

1

1,5

2

F0 Fv/Fm ΦPSII NPQ

N21.4

N21.4 Control N21.4 Radical N21.4 Foliar

a

lq

y

b

m

q

z

b

mq

z

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

F0 Fv/Fm ΦPSII NPQ

N5.18

N5.18 Control N5.18 Radical N5.18 Foliar

Capítulo 2

73



A continuación, se presentan los resultados correspondientes a los efectos de las bacterias

sobre el crecimiento de las plantas. Las plantas control mostraron una altura que oscilaba entre los 50 y

los 80 cm, dependiendo del experimento. En las plantas inoculadas con la cepa Aur9 no se apreciaron

variaciones en la longitud del tallo, en comparación con el Control (figura 2.19).

Figura 2.19 Longitud del tallo en plantas inoculadas con la cepa bacteriana Aur9. Inoculación mediante

dos formas de aplicación (radical y foliar) y el control sin inocular. Los datos son la media de tres réplicas

(n=6) ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos para cada

parámetro (p < 0,05).

Las tratadas con N21.4, mostraron un acortamiento del tallo, tanto la aplicación a nivel radical

(-5 cm) como foliar (-14 cm), siendo significativa la diferencia sólo en esta última forma de aplicación

(figura 2.20).



a a a

0

20

40

60

80

100

Control Radical Foliar

Longitud tallo (cm)

Aur 9

aa

b

0

20

40

60

80

100


Longitud tallo(cm)

N21.4


74


< 0,05).

Por último, las plantas inoculadas con N5.18 presentaron un aumento en la longitud del tallo

tanto en la aplicación radical (+10,1 cm) como foliar (+12,2 cm), en comparación con tratamiento

Control (figura 2.21).




< 0,05).

Seguidamente se procedió al análisis del peso seco de la cápsula floral, tanto de la cápsula en su

totalidad, como segregada en paja y semillas.

El tratamiento con Aur9 incrementó, de forma no significativa, el peso tanto de la paja como de

las semillas, en aplicación radical y foliar presentando un mayor tamaño de las cápsulas de amapola

frente al control (figura 2.22.b). El efecto de la inoculación radical provocó un mayor incremento en el

peso de la paja (+12,7%) y de las semillas (+18,9%), en comparación con la inoculación foliar (+4,9% y

+2,9% respectivamente). Promoviendo un aumento en el peso total de la cápsula mediante la aplicación

radical (+14,3%) (figura 2.22.a).

a

abb

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Longitud tallo (cm)

N5.18

a a a

vv

v

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

Control Aur9 Radical Aur9 Foliar

Peso Cápsula

Peso Paja Peso Semillas

a)a)

-25.0

-15.0

-5.0

5.0

15.0

25.0

35.0

45.0

Aur9 Radical Aur9 Foliar

%

Variación Peso Cápsula


b)

Capítulo 2

75


inoculadas con Aur9; (b) variación del porcentaje del peso acumulado de paja y semillas normalizado al


indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05).

En las plantas inoculadas con N21.4, solo se apreció una tendencia al alza en el peso de las

semillas tras la inoculación a nivel radical (+9,0%) (figura 2.23.b). Por el contrario, se observó un

descenso en el peso de las semillas en la aplicación foliar (-9,1%), así como en el peso de la paja tras la

aplicación radical (-9,3%) y foliar (-5,2%).





En las plantas inoculadas con N5.18, la aplicación foliar aumentó de forma significativa (+40%)

el peso de paja y no afectó a las semillas (figura 2.24.b), lo que promovió un incremento en el peso total

de la cápsula del 22,7% (figura 2.24.a). La aplicación radical aumentó el peso de las semillas (+40,4%),

pero no alteró el peso de la paja.




a a a

v v v

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

Control N21.4 Radical N21.4 Foliar

Peso Cápsula


a)a)

-25.0

-15.0

-5.0

5.0

15.0

25.0

35.0

45.0

N21.4 Radical N21.4 Foliar

%



b)

a ab

v v

v

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00


Peso Cápsula


a)a)

#

-25.0

-15.0

-5.0

5.0

15.0

25.0

35.0

45.0


%



b)


76

indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El # indica

diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05).

La paja de adormidera se utilizó para la extracción y determinación de los alcaloides de la

adormidera (morfina, codeína, tebaína y oripavina) mediante HPLC. El contenido de los diferentes

alcaloides se valoró mediante la relación de mg de alcaloide por gramo de paja.

Las plantas de adormidera inoculadas con Aur9 mostraron una tendencia a aumentar el

contenido de codeína mediante la aplicación radical (+ 22,0%) y foliar (+3,5%). También se apreció un

aumento de tebaína en la aplicación foliar (+6,5%) (figura 2.25). Sin embargo, esta tendencia no

presentó diferencias significativas frente al tratamiento Control.




tres réplicas (n=6) ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos

de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05

La cepa N21.4 mostró un comportamiento diferente sobre el contenido de los alcaloides

dependiendo de la forma de inoculación (figura 2.26). La inoculación radical provocó un aumento de

todos los alcaloides, morfina (+11,0%), codeína (+5,0%), tebaína (+7,3%) y oripavina (+38,8%) (figura

2.26.b). Por el contrario, la inoculación foliar indujo una disminución significativa del contenido de

alcaloides totales (figura 2.26.a), reflejada en una bajada significativa de morfina (-15,0%), codeína (-

16,6%), tebaína (-20,9%) y oripavina (-24,3%).

a a a

e e e

m m m

v v v

0

10

20

30

40

50


Contenido alcaloides

Morfina Codeína Tebaína Oripavina

a)

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25


%

Variación alcaloides


b)

Capítulo 2

77





de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El * indica diferencias significativas en el contenido total de

alcaloides respecto al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El # indica diferencias

significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05)

En plantas tratadas con N5.18 vía radical, se observó un incremento de la morfina (+10,2%)

(figura 2.27) mientras que los demás alcaloides disminuyeron, siendo la variación estadísticamente

significativa para tebaína (-42,1%)y oripavina (-51,7%). La inoculación foliar presentó una tendencia

similar a la inoculación radical, especialmente en el contenido de tebaína (-18,9%) y oripavina (-37,9%).

También se apreció una disminución en el contenido de morfina (-9,6%) sin ser significativa (figura

2.27.b).





de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El # indica diferencias significativas frente al tratamiento Control

de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05)

ab ab

ee

e

mm

m

vv

v

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50




a)

*

#

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50




b)

a aa

ee

e

m nn

v ww

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50




a)

#

#

#

#

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20




b)


78

Seguidamente se procedió a relacionar el contenido de los alcaloides acumulados con la

biomasa total de la paja obtenida. De esta forma, se pudo evaluar de forma neta el contenido de los

alcaloides con cada tratamiento.

El tratamiento con Aur9 mediante la inoculación radical presentó una tendencia al aumento en

el contenido potencial de los diferentes alcaloides, en especial codeína (+37,5%), morfina (+8,9%),

tebaína (+9,6%) y oripavina (+6,2%) (figura 2.28). Las diferencias tampoco fueron significativas en la

inoculación foliar, donde se apreció un incremento en la codeína (+8,6%) y tebaína (+11,8%), y a su vez

una disminución de la morfina (-0,8%), oripavina (-8,6%).





tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05).

La inoculación con la cepa N21.4 promovió una disminución significativa del contenido

potencial en alcaloides, mayoritariamente en la inoculación foliar siendo estadísticamente significativo

en morfina (-50,6%), codeína (-51,6%) y tebaína (-54,1%) (figura 2.29). Esta situación resultó en una

disminución del 51,2% del total de los alcaloides.





a a a

ee

em

mm

vv

v

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0


Contenido potencial alcaloides


a)

-20.0

-10.0

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0


%

Variación potencial alcaloides


b)

a a

b

e e

e

m m

m

v v

v

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0




a)

*

# # #

-80.0

-60.0

-40.0

-20.0

0.0

20.0

40.0




b)

Capítulo 2

79



diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05)

El tratamiento con la cepa N5.18, resultó en un patrón diferente a los observados

anteriormente (figura 2.30). En el caso de la inoculación foliar presentó un aumento significativo de

morfina (+21%) y codeína (+38%), los dos alcaloides de mayor interés en la industria farmacéutica, lo

que resultó en un aumento potencial de los alcaloides totales. Por el contrario, la inoculación radical,

resultó en una disminución significativa de la oripavina (-52,3%) y tebaína (-44,7%), si bien la morfina

aumentó ligeramente frente al control (+7,1%).









somniferum

Previo a los ensayos de campo se evaluó la compatibilidad de las cepas PGPRs con los

fitosanitarios de uso común en el cultivo de adormidera. Los resultados se resumen en la tabla 2.3. En

general, N21.4 resistió casi todos los productos, N5.18 presentaba un comportamiento intermedio y

Aur9 fue la más sensible.

a abb

e e

fm n

mvv

w

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0




a)

*

##

#

#

-60.0

-40.0

-20.0

0.0

20.0

40.0

60.0




b)


80

Tabla 2.3 Compatibilidad cepa PGPR Vs fitosanitarios

+ Compatible (0 cm); --- gran halo de inhibición (>2 cm); -- halo de inhibición medio (1cm-2cm); -

halo de inhibición pequeño (0,5cm-1cm)

La cepa Aur9 sólo fue compatible con el fungicida Metalaxil (25%), mientras que era sensible a

los demás productos; con el resto de los fitosanitarios se registraron halos de inhibición, excepto en la

dilución 1:10 de Captan (50%). Por el contrario, la cepa N21.4 fue compatible con todos los fitosanitarios

a excepción de Thiram (80%) en las concentraciones más elevadas (solución normal de trabajo (1) y

dilución ½). La cepa N5.18 fue compatible con todos los fitosanitarios, a excepción del tratamiento

conjunto Metalaxil (3,9%) y Mancozeb (64%).

Debido a los resultados obtenidos y a las incompatibilidades observadas, el personal de

Alcaliber I+D+i, a través de los técnicos de campo recomendó no aplicar ningún tratamiento fitosanitario

en las parcelas de experimentación.

Los resultados obtenidos en parcelas experimentales en la primera y segunda campaña se

representan a continuación. Recogen el efecto de las 3 cepas bacterianas, con 3 pautas de aplicación

(Inicio de entallado (IE), final de entallado (FE), y ambas en Split (IE/FE)), en las dos campañas.

Los resultados de producción y contenido en alcaloides obtenidos en las dos campañas de campo se

presentan ordenados por cada campaña para discutirlos juntos posteriormente. En primer lugar, se

presentan los datos de producción referentes a número, peso de paja y de semillas de las plantas, y a

continuación, el contenido en alcaloides.

1ª Campaña.

Aur 9 N21.4 N5.18

Dilución de

trabajo

Fitosanitario .

1 1/2 1/5 1/10 1 1/2 1/5 1/10 1 1/2 1/5 1/10

Metalaxil (3,9%) +

Mancozeb (64%) --- --- --- --- + + + + - - - -

Captan (50%) -- - - + + + + + + + + +

Metalaxil (25%) + + + + + + + + + + + +

Tiram (80%) -- -- -- -- - - + + + + + +

Capítulo 2

81

A continuación, se exponen los resultados de los análisis biométricos: número de plantas,

número de cápsulas y ratio número de cápsulas/ número de plantas, cosechados en un metro cuadrado

de las parcelas de experimentación en la finca Navajo del Provencio, tras la aplicación con las cepas

Aur9, N21.4 y N5.18 con tres pautas de inoculación diferentes (figura 2.31).


Navajo Provencio de la 1ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9 (a, b, c),

N21.4 (d, e, f) y N5.18 (g, h, i), en tres pautas: inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado



En la finca Navajo Provencio (figura 2.31), la aplicación de Aur9 al inicio de entallado promovió

un incremento significativo en el número de plantas por metro cuadrado (+12 plantas/m2) (figura

2.31.a), aumentando el número de capsulas por metro cuadrado (+ 39) (figura 2.31.b), lo que resultó en

un aumento significativo en la ratio de cápsulas por planta (figura 2.31.c). Por el contrario, cuando se

aplicó al final del entallado (FE) se produjo una disminución significativa del número de plantas (-11

plantas/m2). Sin embargo, se apreció un aumento en el número de cápsulas (+6 cápsulas/m2), y por lo

tanto un incremento significativo en la ratio de cápsulas por planta (figura 2.31.c). Al aplicar Aur9 en

Split se observó una disminución significativa del número de plantas por metro cuadrado (-3). Si bien,

aumentó en 11 el número de cápsulas por metro cuadrado (figura 2.31.b) sin ser significativo. Por ello,

resultó en un aumento significativo de la ratio de cápsulas por planta (figura 2.35.c). A su vez, los

resultados obtenidos tras la inoculación con la cepa N21.4 (figura 2.31.d, e, f) y con N5.18 (figura 2.31. g,

a

b

a a

0

20

40

60

80

100

120

140

Control Aur9 (IE) Aur9 (IE/FE) Aur9 (FE)

Nº cápsulas/m2

Nº Cápsulas/m²

b)

aa

a

a

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Control N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

Nº plantas/m2

Nº plantas/m²

d)

aa

a

a

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Nº plantas/m2

Nº plantas/m²

g)

a

aa

a

0

20

40

60

80

100

120


Nº cápsulas/m2

Nº Cápsulas/m²

e)

a

a aa

0

20

40

60

80

100

120


Nº cápsulas/m2

Nº Cápsulas/m²

h)

a

b bb

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80


Nº cápsulas/Nº plantas


c)

aa

a

a

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00




f)

a

a aa

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00




i)

a

b

acc

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90


Nº plantas/m2

Nº plantas/m²

a)


82

h, i), mediante las tres pautas de aplicación, no revelaron diferencias significativas en ninguno de los

parámetros observados número de plantas/m2; número de cápsulas/m2 y número de cápsulas/número

de plantas por metro cuadrado. Si bien, se apreció una tendencia al alza en la aplicación al final del

entallado (FE), con las dos cepas, en la relación cápsula/planta.

La figura 2.32 muestra los resultados de los parámetros: número de plantas, número de

cápsulas y ratio número de cápsulas/ número de plantas, cosechados en un metro cuadrado en la

segunda parcela de experimentación, finca Casa del Pozo, tras la aplicación con las cepas Aur9, N21.4 y

N5.18 con tres pautas de aplicación.


Casa del Pozo de la 1ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9 (a, b, c), N21.4 (d,

e, f) y N5.18 (g, h, i), en tres pautas: inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado (FE). Los

datos son la media ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre


La aplicación de la cepa Aur9 en la finca Casa del Pozo mediante las tres pautas descritas, no

mostraron diferencias significativas entre los parámetros analizados (figura2.32.a, b, c). Similares

resultados se obtuvieron de la aplicación de N21.4 al inicio del entallado. Por el contrario, la aplicación

de la cepa N21.4 al final del entallado mostró una disminución significativa del número de plantas (-26

plantas/m2) (figura 2.32.d). Lo que conllevó una disminución significativa en el número de cápsulas (-27

cápsulas/m2) (figura 2.32.e). Aunque esta situación no promovió diferencias significativas en el número

de cápsulas/número de plantas por metro cuadrado (figura 2.32.f) frente al tratamiento Control. Al

aa

aa

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90


Nº plantas/m2

Nº plantas/m²

a)

aa ab

b

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90


Nº plantas/m2

Nº plantas/m²

d)

a

aa a

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90


Nº plantas/m2

Nº plantas/m²

g)

a a aa

0

20

40

60

80

100

120


Nº cápsulas/m2

Nº Cápsulas/m²

b)

aab

bc

c

0

20

40

60

80

100

120


Nº cápsulas/m2

Nº Cápsulas/m²

e)

a

aa a

0

20

40

60

80

100

120


Nº cápsulas/m2

Nº Cápsulas/m²

h)

a

a

aa

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80




c)

a aa

a

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60




f)

a

aa

a

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00




i)

Capítulo 2

83

aplicar N21.4 en split, se apreció una disminución no significativa en el número de plantas (-10

plantas/m2) (figura 2.32.d), al igual que en el número cápsulas (-20 cápsulas/m2) (figura 2.32.e), siendo

éste valor significativo. Pero no se apreciaron diferencias significativas en los valores del número de

cápsulas/número de plantas (figura 2.32.f). La aplicación de la cepa N5.18 en las tres pautas de

inoculación, resultó en un descenso no significativo del número de plantas y de cápsulas, pero no

modificó el ratio cápsula/planta (figuras 2.32.f, g, h).


totalidad, como segregada en paja y en semillas. En la figura 2.33 se aprecian los resultados obtenidos

de la primera campaña en la finca Navajo Provencio.

Figura 2.33 (a, c, e) Peso acumulado de paja y semillas determinando el peso total de las cápsulas/m2;

(b, d, f) variación del porcentaje del peso acumulado de paja y semillas referenciado al tratamiento

Control, en la finca de producción Navajo Provencio en la 1ª campaña. De plantas de adormidera

inoculadas con las cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final

de entallado (FE). Los datos son la media ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias

significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05). El # indica diferencias

significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05)

a b b ab

v

vv

v

0

50

100

150

200

250

300

350

400


Peso cápsula/m2


a)

*

a a a a

vv

v

v

0

50

100

150

200

250

300

350

400


Peso cápsula/m2


c)

a a a a

vv v

v

0

50

100

150

200

250

300

350

400


Peso cápsula/m2


e)

#

#

-20

-10

0

10

20

30

40

Aur9 (IE) Aur9 (IE/FE) Aur9 (FE)

%

Peso cápsula/m2


b)

-20

-10

0

10

20

30

40

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

%

Peso cápsula/m2


d)

-20

-10

0

10

20

30

40

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%

Peso cápsula/m2


f)


84

En la finca Navajo del Provencio (figura 3.33), la pauta de inoculación con la cepa Aur9 al inicio

del entallado (figura 2.33.b) incrementó de forma significativa el peso de la paja (+34,3%) y de las

semillas (+30,3%), lo que conllevó a un aumento significativo del peso total de la cápsula (+31,8%)

(figura 2.33.a). También se apreció una tendencia al alza en la pauta al final del entallado (FE) (figura

2.33.a, b) tanto en el peso de la paja (+12,9%) como de las semillas (+7,9%). En la pauta en split se

apreció un incremento en el peso de las semillas (+15,8) y en la paja (+23,7%) (figura 2.33.b), siendo éste

último significativo, no así en el peso total de la cápsula (figura 2.33.a). La aplicación de la cepa N21.4 al

inicio del entallado provocó una tendencia al aumento del peso de la paja (+14,1%) y de las semillas

(+7,0%) (figura 2.33.d), si bien este incremento no conllevó un incremento significativo del peso total de

la cápsula (figura 2.33.c). La pauta al final del entallado, provocó una tendencia a disminuir el peso de la

cápsula (-9,3%), debido tanto a una bajada del peso de la paja (-5,8%) como de las semillas (-11,4%)

(figura 2.33.d). Al aplicar N21.4 en split, promovió un aumento en el peso de la paja (+27,0%) y semillas

(+20,1%), sin ser significativos dichos valores (figura 2.33.d). Resultados similares se observaron en la

aplicación de la cepa N5.18 al inicio del entallado, un mayor incremento en el peso de la cápsula

(+20,6%) debido al aumento de la paja (+26,1%) y de las semillas (+17,2%) (figura 2.33.f), sin ser

significativos. Por el contrario, no se apreciaron diferencias en la pauta de inoculación al final del

entallado (figura 2.33.f). Si bien, la pauta en split volvió a promover una tendencia al aumento del peso

de las cápsulas (+13%) (figura 2.33.f).


totalidad, como segregada en paja y en semillas en la finca Casa del Pozo. En la figura 2.34 se aprecian

los resultados obtenidos.

Capítulo 2

85


variación del porcentaje del peso acumulado de paja y semillas referenciado al tratamiento Control (b, d,

f), en la finca de producción Casa del Pozo en la 1ª campaña. De plantas de adormidera inoculadas con

las cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado



En la finca Casa del Pozo (figura 2.34), la aplicación de Aur9 al inicio del entallado promovió un

aumento del peso de la paja (+5,2%) y de las semillas (+28%) sin ser significativos (figura 2.34.b). Por el

contrario, la aplicación al final del entallado como en split, promovieron un descenso del peso de las

cápsulas, (-8,8) y (-7,3%) respectivamente, reflejado tanto en la disminución del peso de la paja como de

las semillas (figura 2.34.b). Esta disminución del peso de las cápsulas también se apreció en la

inoculación con N21.4 en sus tres pautas de aplicación (figura 2.34.c), siendo más acusada en la

aplicación al inicio del entallado (-18,4%). Los resultados obtenidos con la cepa N5.18 fueron similares a

la cepa Aur9, un incremento del peso de la cápsula (+6,6%) al inicio de entallado (figura 2.34.e). Si bien,

en la pauta al final del entallado se apreció un ligero aumento del peso de la paja (+29%) (figura 2.34.f).

La aplicación de N5.18 en split tendió a disminuir el peso de las cápsulas (-7,6%) (figura 2.34.e). Sin

a a a a

v vv v

0

50

100

150

200

250

300

350


Peso cápsula/m2


a)

a a a a

vv v

v

0

50

100

150

200

250

300

350


Peso cápsula/m2


c)

a a a a

v vv v

0

50

100

150

200

250

300

350


Peso cápsula/m2


e)

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10


%

Peso cápsula/m2


b)

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)%

Peso cápsula/m2


d)

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%

Peso cápsula/m2


f)


86

embargo, ninguno de los resultados obtenidos en la finca Casa del Pozo fue estadísticamente

significativos.

A continuación, se procedió a relacionar el peso de la cápsula, paja y semillas, con el número de

plantas por metro cosechado (figura 2.35)



referenciado al tratamiento Control (b, d, f), en la finca de producción Navajo Provencio en la 1ª

campaña. De plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio

de entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado (FE). Los datos son la media ± error estándar. Letras



a la prueba LSD (p <0,05). El # indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a

la prueba LSD (p <0,05)

En la finca Navajo del Provencio (figura2.35) la aplicación de Aur9 al inicio del entallo (figura

2.35.a) promovió un incremento del peso de las cápsulas referenciado al número de plantas (+4,9%).

#

###

-10

0

10

20

30

40

50


%

Variación Peso cápsula/Nº Plantas

Peso paja/nº plantas Peso semillas/nº plantas

b)

-10

0

10

20

30

40

50

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

%



d)

-10

0

10

20

30

40

50

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%



f)

a a b b

v vww y

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00


Peso cápsula/Nº Plantas


a)

**

a a a a

v v vv

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00




c)

a a a a

vv v v

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00




e)

Capítulo 2

87

Además, se apreciaron aumentos significativos en las pautas de aplicación al final del entallado (+24,9%)

y en split (+33,9%). Tanto en el peso de la paja (+29.9%) y (+37,4%) respectivamente, así como de las

semillas (+21,8%) y (+31,7%) (figura 2.35.b). Las aplicaciones con la cepa N21.4 y N5.18 (figura 2.35.d,

2.35.e) revelaron tendencias al aumento del peso de las cápsulas, siendo la pauta de aplicación al final

del entallado la que resultó en un mayor incremento +22,0% con N21.4 (figura 2.35.d) y del +29.5% para

la cepa N5.18(figura 2.35.e).

Los resultados al relacionar el peso de la cápsula, paja y semillas, con el número de plantas por

metro cosechado en la finca Casa del Pozo, se expresan en la figura 2.36.



referenciado al tratamiento Control (b, d, f), en la finca de producción Casa del Pozo en la 1ª campaña.

De plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio de

entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado (FE). Los datos son la media ± error estándar. Letras



a la prueba LSD (p <0,05). El + indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a

la prueba LSD (p <0,05)

a a ab

vv

v

w

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00




c)

*

ab b b

v

v v v

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00




e)

a a a a

vv

vv

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00




a)

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60


%



b)

##

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

%



d)

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%



f)


88

En la finca Casa del Pozo (figura2.36) la aplicación de Aur9 al inicio del entallo (figura 2.38.a)

promovió una tendencia al alza del peso de las cápsulas (+19,2%), al igual que la pauta al final del

entallado (+10,6%) (figura 2.36.a). Sin embargo, la pauta de aplicación con Aur9 en split, promovió un

descenso del peso de las cápsulas (-10,7%), sin ser significativos. Por el contrario, la aplicación de N21.4

al final del entallado promovió un incremento significativo del peso de la paja (+53,3%) y de las semillas

(+45,2%) (figura 2.36.d), lo que resultó en un aumento del peso de la cápsula (+48,7%). La aplicación con

la cepa N5.18 al inicio del entallado, resultó en un incremento del peso de las cápsulas (+32,8%) (figura

2.36.e), promovido por el incremento de la paja (+31,0%) y de las semillas (+34,2%) (figura 2.36.f). De la

misma forma, se produjo un incremento en el peso de la paja (+31,9%) y de las semillas (+20,7%) (figura

2.36.f) con la aplicación al final del entallado, resultando en un aumento del peso total (+25,5%) (figura

2.36.e). La aplicación en split de N5.18, promovió el aumento del peso de la paja (+74,9%) y de las

semillas (+61,9%) (figura 2.36.f), lo que resultó en un aumento del peso total de la cápsula (+67,4%)

(figura 2.36.e).

Tras analizar los parámetros biométricos, se procedió al estudio en el contenido de los

diferentes alcaloides de tipo morfinanos: morfina, codeína, tebaína y oripavina, por gramo de paja seca.

En la figura 2.37 se expone el contenido de los alcaloides obtenidos de la paja de adormidera en

la finca Navajo del Provencio.

Capítulo 2

89


finca de producción Navajo Provencio en la 1ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas





indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05)

En la finca Navajo del Provencio se apreció un ligero aumento de la morfina (+1,4%) al aplicar

Aur9 en split (figura 2.37.b). Si bien, el resto de los morfinanos en las tres pautas de aplicación tendieron

a disminuir, principalmente la tebaína (-27,7%) al inicio del entallado con Aur9. La aplicación de la cepa

N21.4 promovió un aumento de morfina (+3,1%) al final del entallado (figura 2.37.d). Al igual que se

incrementó la codeína con las tres pautas de aplicación, siendo al final del entallado la de mayor

aumento (+7,7%). También se apreciaron incrementos en tebaína (+15%) al final del entallado como en

split. La aplicación de N5.18 resultó en un aumento de la morfina (+5,7%) y de codeína (+10,2%) al inicio

del entallado. También se observó un incremento del contenido en morfina al final del entallado (+2,3%)

y ligeramente en la pauta de split (+0,5%).

a a a a

e e e em m m m

v v v v

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00



Mor Co Te Orip

a)

a a a a

e e e em m m mv v v v

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00



Mor Co Te Orip

c)

a a a a

e e e em m

m mv v

v v

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00



Mor Co Te Orip

e)

-35-30-25-20-15-10

-505

101520


%


Mor Co Te Orip.

b)

-30-25-20-15-10

-505

101520

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)%


Mor Co Te Orip.

d)

-30-25-20-15-10

-505

101520

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%


Mor Co Te Orip.

f)


90

Los resultados del contenido de morfinanos de paja de adormidera de la finca Casa del Pozo, se

resumen en la figura 2.38.


finca de producción Casa del Pozo en la 1ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas





indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05)

Al aplicar Aur9 se observó una tendencia al aumento del contenido en codeína en las tres

pautas al inicio del entallado (+10,2%), al final del entallado (+12,7%) y en split (+12,3%) (figura 2.38.b).

Esta tendencia también se apreció en el contenido de tebaína, si bien fue la aplicación al inicio del

entallado (+23,4%) la que mayor incremento registró. La aplicación con N21.4, registró una tendencia al

aumento de la morfina al final del entallado (+1,8%) y en split (+2,0%) (figura2.38.d). También

incrementó el contenido en codeína al inicio del entallado (+10%) y en split (+11,8%). Además de la

oripavina en las tres pautas de aplicación con una media del incremento del 22,0%. La aplicación de

a a a a

e e e e

m m m m

v v v v

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00



Mor Co Te Orip

a)

a a a a

e ee e

m mm m

v vv v

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00



Mor Co Te Orip

c)

ab a b b

ee

e e

m mm m

v vv v

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00



Mor Co Te Orip

e)

-30

-20

-10

0

10

20

30


%


Mor Co Te Orip.

b)

-30

-20

-10

0

10

20

30

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

%


Mor Co Te Orip.

d)

-30

-20

-10

0

10

20

30

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%


Mor Co Te Orip.

f)

Capítulo 2

91

N5.18 al inicio del entallado incrementó el contenido en morfina (+10,3%) (figura 2.38.f). También se

apreció una tendencia al aumento de codeína al aplicar al final del entallado (+14,9%). De la misma

forma, se apreció un incremento de la oripavina en las tres pautas de aplicación siendo del 26,9%.

Debido a las diferencias de peso en las cápsulas, en especial de la materia prima (paja), se

realizó una estima del contenido potencial de alcaloides por unidad de superficie. Para ello, se procedió

a interpolar el contenido de los alcaloides con los valores medios del peso de paja/m2, ya que de esta

forma se pueden obtener valores netos potenciales de contenido total de alcaloides.

En la figura 2.39 se representa el contenido y variación potencial de los alcaloides con las tres

cepas descritas en tres pautas de aplicación.


adormidera de la finca de producción Navajo Provencio en la 1ª campaña. Plantas de adormidera

inoculadas con las cepas Aur9, N21.4 y N5.18, en tres pautas inicio de entallado (IE), inicio y final de

entallado (IE/FE), y final de entallado (FE). Contenido potencial de los morfinanos (a, c, e). Variación del



aa a a

e

ee

em

mm

mv

v vv

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00



AMA Potencial Co potencial Te Potencial Ori Potencial

a)

a a aa

ee

e

em

mm

m

vv

v

v

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00




c)

aa

a a

e

e

e em

m

m mv

v

v v

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00




e)

-40-30-20-10

0102030405060


%


Mor Potencial Co potencial Te Potencial Ori Potencial

b)

-40

-20

0

20

40

60

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

%



d)

-40

-20

0

20

40

60

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%



f)


92


prueba LSD (p <0,05)

En la figura 2.39.a y b. se apreció como la aplicación de la cepa Aur9 potenciaría el contenido de

los diferentes alcaloides con todas las pautas de inoculación frente al tratamiento control. Siendo la

pauta al inicio del entallado la que potenciaría un mayor incremento de alcaloides totales (figura 2.39.a),

principalmente en morfina (+33,6%) y en codeína (+28,1%) (figura 2.39.b). La pauta al final del entallado

tendría un menor incremento potencial, pero sería de alrededor de un 12% de aumento respecto al

Control tanto en morfina como en codeína. La pauta en split también potenciaría el contenido de todos

los morfinanos, morfina (+25,7%), codeína (+16,2%), tebaína (+12,1%) y oripavina (+24,2%). La

aplicación de la cepa N21.4 (figura 2.39.d) en split potenciaría el contenido de todos los morfinanos, por

encima de un 25% respecto al tratamiento Control. A su vez, la pauta al inicio del entallado

incrementaría la morfina (+9,9%) y la codeína (+17,7%). La aplicación de N5.18 (figura 2.40.f) potenciaría

el contenido de morfina al inicio del entallado (+39,2%), al final del entallado (+7,3%) y en split (+12,1%).

También se potenciaría el contenido de codeína (+39,2%) al aplicarlo al inicio del entallado.

Los resultados del contenido y variación potencial de los morfinanos en la finca Casa del Pozo,

se resumen en la figura 2.40.

Capítulo 2

93


adormidera de la finca de producción Casa del Pozo en la 1ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas






LSD (p <0,05)

La aplicación de Aur9 (figrua 2.40.a y b) potenciaría el contenido en codeína en las tres pautas,

al inicio del entallado (+17,0%), al final del entallado (+3,4%) y en split (+3,2%). También se

incrementaría la tebaína al inicio del entallado (+31,6%). Por el contrario, la aplicación de N21.4 solo

promovería el incremento potencial de oripavina en todas las pautas (+20%). La aplicación de N5.18 al

inicio del entallado incrementaría el contenido en morfina (+17,4%) (figura 2.40.f). Al igual que la

codeína (+19,2%), exclusivamente en la pauta al final del entallado. Por el contrario, la oripavina se

incrementaría en más de un 20%.

2ª Campaña

a a a a

e ee e

m mm m

v vv v

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00




a)

aa a a

e

ee

e

m

mm

m

v

vv

v

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00




c)

aa

a a

ee

e e

mm

m m

vv

vv

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00




e)

-30

-20

-10

0

10

20

30


%



b)

-30

-20

-10

0

10

20

30

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

%



d)

-30

-20

-10

0

10

20

30

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%



f)


94

A continuación, se exponen los resultados obtenidos de los diferentes parámetros evaluados a

lo largo de la segunda campaña, en dos parcelas de cultivo, Las Torres y la Grajuela.

Pasados 14 días tras la inoculación al final del entallado y en split se evaluó la fluorescencia del

fotosistema II, cuyos resultados se representan en las siguientes gráficas.


Aur9, en tres pautas inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado (FE). Fluorescencia mínima


(ΦPSII). “Quenching” no fotoquímico (NPQ). Los datos son la media de tres réplicas (n=9) ± error


LSD (p <0,05).

La aplicación de la cepa Aur9 al final del entallado, resultó en un descenso de la fluorescencia

mínima (Fo) (figura 2.41) promoviendo una mejora de este parámetro. Por el contrario, no se apreciaron

diferencias significativas en el resto de los parámetros. A su vez la aplicación en split, también promovió

ab

fm

v

a

fm

v

b

fm

v

cf

m

v

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

Fo Fv/Fm èPSR NPQ

La Grajuela

Control Aur9 IE Aur9 IE/FE Aur9 FE

a)

a

fm

v

a

fm

v

a

fm

v

a

fm

v

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

Fo Fv/Fm èPSR NPQ

Las Torres

Control Aur9 IE Aur9 IE/FE Aur9 FE

b)

Capítulo 2

95

una mejora al descender la fluoresecencia mínima, si bien esta bajada no fue significativa. El resto de las

aplicaciones no mostraron una mejora en el resto de los parámetros analizados.





diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05).

La aplicación de la cepa N21.4 (figura 2.42) no reportó modificaciones en los parámetros

fotosintéticos analizados, excepto en los valores de NPQ en las tres pautas de inoculación, donde se

apreció incrementos no significativos especialmente al final del entallado en la finca La Grajuela.

a

fm

v

a

fm

v

a

fm

v

a

ff

w

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

Fo Fv/Fm èPSR NPQ

La Grajuela

Control N21.4 IE N21.4 IE/FE N21.4 FE

a)

a

fm

v

a

fm

v

a

f

m

v

a

fm

v

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

Fo Fv/Fm èPSR NPQ

Las Torres


b)


96





diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05).

La aplicación de la cepa N5.18 al final del entallado, mostró una mejoría en los parámetros de

F0 y de ɸPSII, si bien estos incrementos no fueron significativos (figura 2.43). El resto de los parámetros

analizados no mostraron cambios.

A continuación, se exponen los resultados de los análisis biométricos: número de plantas,

número de cápsulas y ratio número de cápsulas/ número de plantas, cosechados en un metro cuadrado

en la finca Las Torres, tras la aplicación con las cepas Aur9, N21.4 y N5.18 con tres pautas de inoculación

diferentes (figura 2.44).

a

fm

v

a

fm

v

a

fm

v

a

fm

v

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

Fo Fv/Fm èPSR NPQ

La Grajuela


a)

a

fm

v

a

fm

v

a

fm

v

a

fm

v

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

Fo Fv/Fm èPSR NPQ

Las Torres


b)

Capítulo 2

97

Figura 2.44 Nº de plantas/m2, Nº de cápsulas/m2 y Nº cápsulas/Nº plantas en la finca de producción Las

Torres en la 2ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9 (a, b, c), N21.4 (d, e, f) y

N5.18 (g, h, i), en tres pautas: inicio de entallado (IE), split (IE/FE), y final de entallado (FE). Los datos son

la media ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de

acuerdo a la prueba LSD (p <0,05).

La aplicación de la cepa Aur9 en la finca Las Torres mediante las tres pautas descritas, no

promovió ninguna diferencia significativa entre los parámetros analizados referenciado al tratamiento

Control (47 plantas/m2, 56 cápsulas/m2 y 1,13 cápsulas/plantas) (figura 2.44. a, b y c). Similares

resultados se obtuvieron con la cepa N21.4 (figura 2.44. d, e, f). Por el contrario, la cepa N5.18 mostró

una tendencia al aumento en las aplicaciones al final del entallado (+11 plantas/m2) y en split (+18

plantas/m2) (figura 2.44.g). A su vez, tras la aplicación al inicio del entallado se apreció un descenso

significativo en el número de cápsulas (-20 cápsulas/m2) (figura 2.44.h). Lo que en ningún caso resultó

en diferencias significativas en la relación número de cápsulas por número de plantas (figura 2.44.i).

Los resultados de los análisis biométricos: número de plantas, número de cápsulas y

ratio número de cápsulas/ número de plantas, cosechados en un metro cuadrado en la finca Las Torres,

tras la aplicación con las cepas Aur9, N21.4 y N5.18 con tres pautas de inoculación diferentes se

representan en la figura 2.45.

a aa a

0

10

20

30

40

50

60


Nº plantas/m²

Nº plantas/m²

a)

a

a

a a

0

10

20

30

40

50

60

70


Nº plantas/m²

Nº plantas/m²

d)

a a

a a

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Nº plantas/m²

Nº plantas/m²

g)

aa

aa

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Nº Cápsulas/m²

Nº Cápsulas/m²

b)

ab

b

ab

a

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Nº Cápsulas/m²

Nº Cápsulas/m²

e)

a

b

aa

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Nº Cápsulas/m²

Nº Cápsulas/m²

h)

aa a

a

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40




f)

a

a

a

a

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60




i)

a

a a

a

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60




c)


98

Figura 2.45 Nº de plantas/m2, Nº de cápsulas/m2 y Nº cápsulas/Nº plantas en la finca de producción La

Grajuela en la 2ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9 (a, b, c), N21.4 (d, e, f)




En la finca de La Grajuela, la aplicación de la cepa Aur9 al inicio del entallado mostró un

descenso significativo del número de plantas (-13 plantas/m2), al igual que la aplicación en split (-23

plantas/m2) (figura 2.45.a). También se apreció un descenso significativo en el número de cápsulas al

inicio del entallado (-17 cápsulas/m2) y en split (-14 cápsulas/m2) (figura 2.45.b). Si bien, estos resultados

no mostraron diferencias en la relación número de cápsulas entre número de plantas (figura 2. 45.c). La

aplicación mediante N21.4 no mostró diferencias en el número de plantas en ninguna de las pautas

aplicadas (figura 2.45.d). Si bien, se apreció un descenso significativo en el número de cápsulas en todas

las pautas, al inicio del entallado (-15 cápsulas/m2), final del entallado (-12 cápsulas/m2) y en split (-20

cápsulas/m2) (figura 2.45.e). Está situación mostró un descenso significativo en la relación número de

cápsulas entre número de plantas (-12%) en la pauta de inoculación al final del entallado (figura 2.45.f).

Tras la inoculación de N5.18 al final del entallado se observó en un incremento significativo del número

de plantas (+20 plantas/m2) (figura 2.45.g). Resultados similares se apreciaron en el número de cápsulas

(+17 cápsulas/m2) mediante la misma pauta (figura 2.45.h). Sin embargo, los resultados no mostraron

diferencias significativas en la relación número de cápsulas/número de plantas en ninguna de las pautas

de aplicación con N5.18 (figura 2.45.i).

En la figura 2.46 se muestran los resultados del peso de la cápsula, segregados en peso de paja

y semillas, cosechados en un metro cuadrado, en la finca Las Torres.

a

b

c

ab

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Nº plantas/m²

Nº plantas/m²

a)

a

a aa

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Nº plantas/m²

Nº plantas/m²

d)

a a a

b

0

20

40

60

80

100


Nº plantas/m²

Nº plantas/m²

g)

a

bb

ab

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Nº Cápsulas/m²

Nº Cápsulas/m²

b)

a

bb

b

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Nº Cápsulas/m²

Nº Cápsulas/m²

e)

aa a

b

0

20

40

60

80

100


Nº Cápsulas/m²

Nº Cápsulas/m²

h)

a a

a

a

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60




c)

aa a

b

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40




f)

a aa

a

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40




i)

Capítulo 2

99



f), en la finca de producción Las Torres en la 2ª campaña. De plantas de adormidera inoculadas con las






En la finca de Las Torres (figura 2.46), la inoculación de la cepa Aur9 al inicio del entallado

mostró un incremento en el peso de las semillas/m2 (+10,5%) pero no del peso de la paja (figura 2.46.a).

Sin embargo, la pauta al final del entallado mostró un incremento del peso de la paja (+11,8%) y de las

semillas (+12,9%), lo que resultó en un aumento significativo del peso total de la cápsula (+14,5%).

Resultados similares se registraron con la pauta en split, siendo significativos todos los incrementos del

peso de la paja (+25,6%), semillas (+27,9%) y cápsulas (+29,9%). La cepa N21.4 reveló incrementos al

alza en las pautas al inicio del entallado (+17,6%) y en split (+5,0%) del peso total de las cápsulas,

a ab ab

v vw

xw

0

50

100

150

200

250


Peso cápsula/m2


a)a)

*

*

ab a ab

vwv v

w

0

50

100

150

200

250


Peso cápsula/m2


c)

ab abc c

vwv

wx

0

50

100

150

200

250

300


Peso cápsula/m2


e)

**

-25.0

-15.0

-5.0

5.0

15.0

25.0

35.0

45.0


%

Variación Peso cápsula/m2


b)

# #

#

-25.0

-15.0

-5.0

5.0

15.0

25.0

35.0

45.0

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

%



d)

-25.0

-15.0

-5.0

5.0

15.0

25.0

35.0

45.0

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%



f)

#

#


100

producido por los incrementos del peso de la paja y en las semillas (figura 2.46.c y d). Si bien, la pauta al

final del entallado se comportó de manera inversa, promoviendo un descenso del peso de la paja (-

19,7%) y de las semillas (-17,8%) lo que conllevó una disminución del peso total de la cápsula (-16,3%).

Por su parte, la cepa N5.18, mostró un patrón inverso al obtenido con N21.4 en las pautas al inicio y al

final del entallado (figura 2.46.e y f). Al inicio del entallado se observó un descenso del peso total de la

cápsula (-18,3%), pero se apreció un incremento significativo en split (+21,2%) y al final del entallado

(+30,9%). Resultado éste último del aumento significativo del peso de la paja (23,1%) y las semillas

(+42,4%) (figura 2.46.i).

Los resultados de la cosecha en las parcelas de experimentación de la finca La Grajuela, peso de

cápsula, peso de paja y de semillas, se muestran en la figura 2.47.



f), en la finca de producción La Grajuela en la 2ª campaña. De plantas de adormidera inoculadas con las


a a a a

v vw vw

0

50

100

150

200

250


Peso cápsula/m2


a)

a a a a

v v vv

0

50

100

150

200

250


Peso cápsula/m2


c)

a a ab

v vv

w

0

50

100

150

200

250

300


Peso cápsula/m2


e)

*

#

-25,0

-15,0

-5,0

5,0

15,0

25,0

35,0

45,0


%



b)

-25,0

-15,0

-5,0

5,0

15,0

25,0

35,0

45,0

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

%



d)

##

-25,0

-15,0

-5,0

5,0

15,0

25,0

35,0

45,0

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%



f)

Capítulo 2

101





La aplicación de la cepa Aur9, en la finca La Grajuela, mediante la pauta al inicio del entallado

no mostró ningún cambio en referencia al peso de la cápsula (figura 2.47.a). Si bien, se apreció un

incremento tras la pauta al final del entallado en el peso de la paja (+11,9%) y de las semillas (+10,4%). A

su vez, la pauta en split, registró un incremento significativo del peso de las semillas (+14,9%), pero no

de la paja (18,5%) (figura 2.47.b). La inoculación con la cepa N21.4 no mostró cambios significativos en

ninguno de los pesos analizados en las tres pautas realizadas (figura 2.47.c y d). La cepa N5.18 mostró un

incremento del peso de la cápsula tras las pautas al inicio (+9,1%) y también de forma significativa al

final del entallado (+32,2%) (figura 2.47.e). Siendo significativos los incrementos del peso de la paja

(+28,7%) y de las semillas (+34,0%) de ésta última pauta de inoculación (figura 2.47.f).

Tras el análisis de los resultados del peso de las cápsulas por metro cuadrado, se procedió al

estudio del peso de las cápsulas, paja y semillas en relación al número de plantas por metro cuadrado.

En la figura 2.48 se muestran los resultados obtenidos de la finca Las Torres.


102



referenciado al tratamiento Control (b, d, f), en la finca de producción Las Torres en la 2ª campaña. De





prueba LSD (p <0,05).

La aplicación de la cepa Aur9 en las diferentes pautas de inoculación resultó en un incremento

del peso tanto de la paja como de las semillas, lo que incrementó el peso de las cápsulas, en

comparación al tratamiento Control (figura 2.48.a y b). Este incremento fue mayoritario en la aplicación

al inicio del entallado (+40,3) y en split (+38,2%), si bien el incremento no fue significativo en referencia

al tratamiento Control. Sin embargo, la aplicación de N21.4 (figura 2.48c y d) resultó en un aumento

significativo del peso de la cápsula en la pauta en split, debido a un incremento en el peso tanto de la

paja como de las semillas. Por el contrario, la aplicación al inicio y al final del entallo no modificó el peso

de las cápsulas en relación al Control. La aplicación de la cepa N5.18 (figura 2.48.e y f) al inicio del

aa a a

v

v v

v

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00




a)

a a a a

v v

w

v

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00




c)

*

a a a a

vv

v v

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

4.50




e)

-10.0

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0


%



b)

-10.0

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

%



d)

-10.0

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%



f)

Capítulo 2

103

entallado promovió un descenso del peso de la cápsula (-2,3%). Al aplicar la cepa al final del entallado,

se apreció un incremento del peso de las semillas (+5,6%), pero un descenso de la paja (-6,6%) sin que

estos fueran significativos. Resultados similares se obtuvieron en la aplicación en split, tanto en el peso

de las semillas (+3,4%) y de la paja (-2,4%).

Los resultados obtenidos del peso de la cápsula en relación al número de plantas, en la finca la

Grajuela, se muestran en la figura 2.49



referenciado al tratamiento Control (b, d, f), en la finca de producción La Grajuela en la 2ª campaña. De






prueba LSD (p <0,05).

a ab

a

v v

w

v

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00




a)

*

aa a a

v

x wx

vw

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

4.50




c)

a a a a

vv v

v

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00




e)

-10.0

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

Aur9 (IE) Aur9 (IE/FE) Aur9 (FE)%



b)b)

##

-10.0

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

%



d)

#

#

-10.0

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%



f)


104

La inoculación de la cepa Aur9 (figura 2.49.b) en split mostró un incremento significativo del

peso de la paja (+61,1%) y de las semillas (+62,2%), lo que resultó en un aumento significativo del peso

de la cápsula (+61,0%) (figura 2.49.b). También se apreciaron incrementos, pero no significativos, en las

pautas al inicio, como al final del entallado. La cepa N21.4 (figura 2.49.d) al inicio del entallado resultó

en un incremento significativo del peso de las semillas (+36,9%), al igual que la paja (+30,1%) si bien este

resultado no fue significativo. La aplicación al final del entallado incrementó en un 4,8% el peso de la

cápsula, pero no fue significativo (figura 2.49.c). La aplicación en split, mostró valores similares a la

pauta al inicio del entallado en el peso de las semillas (+30,2%) y de la paja (+21,4%), siendo significativo

el peso de las semillas. La cepa N5.18, mostró ligeros aumento del tamaño de la cápsula tanto al inicio

del entallado (+11,5%), como en split (+3,1) debido al aumento del peso de las semillas y de la paja

(figura 2.49.e). Por el contrario, la aplicación al final del entallado resultó en una ligera disminución del

peso de la cápsula (-3,2%) (figura 2.49.f)

Tras analizar los parámetros biométricos, se procedió al estudio en el contenido de los

diferentes alcaloides de tipo morfinanos: morfina, codeína, tebaína y oripavina, por gramo de paja seca.

En la figura 2.50 se expone el contenido de los alcaloides obtenidos de la paja de adormidera en

la finca Las Torres.

Capítulo 2

105


finca de producción Las Torres en la 2ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9,






indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05).

La aplicación de la cepa Aur9 en las diferentes pautas de inoculación, mostró una tendencia a

disminuir el contenido de todos los alcaloides sin ser significativos estos valores (figura 2.50.b). Siendo la

pauta al final del entallado la que reveló una mayor disminución de morfina (-5,2%), codeína (-14,2%),

tebaína (-19,3%) y oripavina (-18,1%). Por el contrario, la inoculación con N21.4 (figura 2.50.d) mostró

un incremento en el contenido de tebaína en todas las pautas de aplicación. También se apreció un

incremento de codeína al final del entallado (+12,9%) y en split (+10,8%) sin ser estadísticamente

significativos. Sin embargo, la inoculación de la cepa N5.18 (figura 2.50.f) solo promovió un incremento

de tebaína al inicio del entallado (+10,5%) y en split (+3,2%), disminuyendo el contenido total de

a a a a

e e e e

m m m m

v v v v

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00



Mor Co Te Orip

a)

a a a a

ee

e e

mm

m m

vv

v v

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00



Mor Co Te Orip

c)

a a a a

ee e

e

mm m m

vwwx

wx

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00



Mor Co Te Orip

e)

-30,0

-25,0

-20,0

-15,0

-10,0

-5,0

0,0

5,0

10,0


%


Mor Co Te Orip.

b)

-30,0

-20,0

-10,0

0,0

10,0

20,0

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

%


Mor Co Te Orip.

d)

#-30,0

-25,0

-20,0

-15,0

-10,0

-5,0

0,0

5,0

10,0

15,0

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%


Mor Co Te Orip.

f)


106

alcaloides en split (-10,1%) (figura 2.50.e) y de oripavina de forma significativa en la pauta al final del

entallado (-24,1%).

Los resultados del contenido y variación de alcaloides en la finca La Grajuela se resumen en la

figura 2.51.


finca de producción La Grajuela en la 2ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con las cepas Aur9,






indica diferencias significativas frente al tratamiento Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05).

En la finca La Grajuela la inoculación de la cepa Aur9 (figura 2.51.a y b) resultó en un

incremento de morfina con las tres pautas, al inicio del entallado (+8,7%), final de entallado (+10,5%) y

en split (+8,6%). También se apreció un incremento en codeína al final del entallado (+8,8%) y en split

a a a a

ee e em m m mvv v v

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00



Mor Co Te Orip

a)

a a a a

e e ee

m mn nn

v vw wx x

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00



Mor Co Te Orip

c)

a a a a

ee e em n mn mv w w

vw

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00



Mor Co Te Orip

e)

-30,0

-25,0

-20,0

-15,0

-10,0

-5,0

0,0

5,0

10,0

15,0


%


Mor Co Te Orip.

b)b)

##

#

#-50,0

-40,0

-30,0

-20,0

-10,0

0,0

10,0

20,0

30,0

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

%Variación alcaloides

Mor Co Te Orip.

d)

##

#-50,0

-40,0

-30,0

-20,0

-10,0

0,0

10,0

20,0

30,0

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%


Mor Co Te Orip.

f)

Capítulo 2

107

(+8,5%), si bien al inicio del entallado disminuyó (-16,5%). Por ello, aumentó el contenido total de

alcaloides totales en todas las pautas, al inicio (+4,1%), al final del entallado (+7,9%) y en split (6,5%). La

aplicación de N21.4 al inicio del entallado, mostró un incremento de morfina (+4,1%), al igual que en

split (+6,7%) (figura 2.51.b). También se apreció un incremento de codeína (+20,5%) al final del

entallado. Pero se mostró un descenso significativo al final del entallado y en split de tebaína (-22,5%), (-

28,1%) y oripavina (-47,2%), (-28,7%) respectivamente. Sin embargo, la cepa N5.18 mostró un

incremento en el contenido de morfina y codeína al inicio (+5,4%; +9,2%), final del entallado (+9,9%;

19,2%) y en split (+6,9%; +6,5%) respectivamente (figura 2.51.f). También se apreció una disminución

significativa de tebaína al inicio del entallado (-33,1%) y de oripavina al inicio (-36,1%) y en split (-40,7%).

Si bien, la pauta al final del entallado mostró un incremento en el contenido total de alcaloides (+7,0%)

(figura 2.51.e).

En la figura 2.52 se representa el contenido y variación potencial de los alcaloides en referencia

al peso total de la paja de la cápsula por metro cuadrado, tras la aplicación de las tres cepas.

a aa a

e e

eem m

mm

v v

vv

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00




a)

aba a

b

e

e e

e

m

m m

m

v

v v

v

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00




c)

aba

b b

e

e

ee

m

m

mm

v

v

vv

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00




e)

-30,0

-20,0

-10,0

0,0

10,0

20,0

30,0


%



b)

-30,0

-20,0

-10,0

0,0

10,0

20,0

30,0

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

%



d)

-40,0

-30,0

-20,0

-10,0

0,0

10,0

20,0

30,0

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%



f)


108


adormidera de la finca de producción Las Torres en la 2ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas





LSD (p <0,05).

La pauta de inoculación de la cepa Aur9 en split, mostró un incremento en el contenido

potencial de la morfina (+24,3%), codeína (+13,8%) y tebaína (+19,2%), lo que resultó en un incremento

de los alcaloides totales (+22,2%) (figura 2.52.a y b). También se apreció un aumento del contenido

potencial de morfina en la pauta al final del entallado (+12,4%). La aplicación de la cepa N21.4 promovió

un aumento potencial de todos los alcaloides en la pauta al inicio del entallado y en split: morfina

+18,5%; +14,2%), codeína (+12,2%; +38,5%), tebaína (+22,9%; +28,8%) y oripavina (13,1%; +12,8%)

respectivamente (figura 2.52.d). Por el contrario, se apreció una disminución de todos los alcaloides en

la pauta al final del entallado, especialmente de morfina (-18,1%). La cepa N5.18 (figura 2.52.e y f)

mostró un aumento potencial de morfina al final del entallado (+28,0%) y en split (+15,2%), al igual que

de codeína ((+5,1%) y (+3,0%) respectivamente. Sin embargo, la pauta al inicio del entallado reveló una

disminución de todos los alcaloides.

Los resultados de contenido y variación potencial de los morfinanos en la fina La Grajuela se

resumen en la figura 2.53.

Capítulo 2

109


adormidera de la finca de producción La Grajuela en la 2ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas






LSD (p <0,05).

La aplicación de la cepa Aur9 (figura 2.52.a y b) reveló un aumento del contenido potencial de

morfina en la pauta al inicio del entallado (+12,5%), siendo significativo al final del entallado (+21,8%) y

en split (+30,1%). También se apreció un aumento significativo de la codeína al final del entallado

(+15,3%) y en split (+15,6%). La cepa N21.4 mostró una tendencia al aumento de la morfina al inicio del

entallado (+9,4%) y en split (+23,0%) (figura 2.52.d). La cepa N5.18 (figura 2.52.e y f) mostró

incrementos significativos en el contenido potencial de morfina en la pauta al inicio del entallado

(+13,6%) y al final del entallado (+42,0%). También se apreció un incremento significativo de codeína al

final del entallado (+47,0%). Sin embargo, se apreció un descenso significativo en la potencialidad de

a abb b

efe

f fm

m

mmv v

vv

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00




a)

a aa

a

ee

e

e

mm

m

m

v vv

v

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00




c)

a ba

c

ee

e

f

mn

m

m

vwx

x

vw

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00




e)

## #

-40,0

-30,0

-20,0

-10,0

0,0

10,0

20,0

30,0


%



b)

#

-50,0

-40,0

-30,0

-20,0

-10,0

0,0

10,0

20,0

30,0

N21.4 (IE) N21.4 (IE/FE) N21.4 (FE)

%



d)

#

##

# ##-50,0

-40,0

-30,0

-20,0

-10,0

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

N5.18 (IE) N5.18 (IE/FE) N5.18 (FE)

%



f)

#


110

tebaína al inicio del entallado (-32,2%) y en split (-32,9%). Al igual que de oripavina (-51,9%) en la pauta

split.

Análisis multivariante

Dados los múltiples factores que afectan al contenido en alcaloides, se realizó un análisis

multivariante, para identificar aquellos factores con mayor incidencia en los parámetros de interés.

En la figura 2.54 se representa el análisis de componentes principales (PCA) de las dos

campañas descritas anteriormente. En la gráfica se representan el primer componente (eje I) que

acumula el 98,1% de la varianza de los datos y el segundo componente (eje II) representa el 1,0% de la

varianza. Por ello, la representación gráfica de los dos primeros componentes, representa el 99,1% de la

varianza. De esta forma, los principales factores que afectan a los datos registrados se pueden clasificar

en tres categorías según magnitud y dirección de los vectores representados: campaña (1ª campaña y 2ª

campaña), finca (Navajo del Provencio, Casa del Pozo, Las Torres, La Grajuela) y cepa (Aur9, N21.4 y

N5.18) con pauta de inoculación: inicio de entallado (IE), final de entallado (FE), inicio/final de entallado

(IE/FE). El factor que más condiciona la producción de la materia prima es la campaña, ya que se pudo

observar en la región positiva del eje I los datos de la primera campaña y en la región negativa del

mismo eje los datos de la segunda campaña, resultando en una clara segregación de las dos campañas.

Si bien, los vectores resultantes son parecidos en magnitud y dirección, son de sentido contrario. En

segundo lugar, las parcelas de producción condicionan los resultados.

Capítulo 2

111


alcaloides (morfina, tebaína y codeína) en la 1º y 2º campaña, en cuatro parcelas, con tres cepas (Aur9,

N21.4 y N5.18), y tres pautas de inoculación (IE, IE/FE y FE).

También se realizó un análisis de redundancia basado en la distancia (db-RDA), para poder

discriminar diferencias significativas (p<0,05) entre las diferentes variables. En la tabla 2.4 se muestran

los valores de p-valor obtenidos, donde se aprecia diferencias significativas entre las diferentes

campañas y parcelas (p=0,001). A su vez, se apreciaron diferencias entre las parcelas de la primera

campaña (p=0,001), pero no así entre las parcelas de la segunda campaña (p=0,076). Finalmente se

observaron diferencias entre los tratamientos (p=0,018), siendo el tratamiento N5.18 al final del

entallado, el único que presentó diferencias significativas (p=0,033).

Tabla 2.4 P-valor proporcionados por Análisis de Redundancia basado en las distancias (db-RDA)

realizado con los parámetros analizados (número de plantas, número de cápsulas, peso cápsula, peso

paja, peso semillas, contenido de alcaloides) obtenidos tras la inoculación de plantas de adormidera en

dos campañas, en cuatro parcelas (Navajo del Provencio, Casa del Pozo, Las Torres, La Grajuela),

mediante tres cepas (Aur9, N21.4 y N5.18) con tres pautas de aplicación (IE, FE, IE/FE). Valores de p≤0,05

indica diferencias significativas, marcados con asterisco.

P-Valor

Campaña y parcela 0,001*

Eje I: 98,1%

Eje II: 1,0%

Campaña 2 Campaña 1


112

2ª Campaña

1ª Campaña: Navajo del Provencio vs. Casa del Pozo 0,001* 2ª Campaña: Las Torres vs. La Grajuela 0,076

Tratamiento 0,018*

Control vs. Aur9 IE 0,182 Control vs. Aur9 IE/FE 0,235 Control vs. Aur9 FE 0,545 Control vs. N21.4 IE 0,854 Control vs. N21.4 IE/FE 0,658 Control vs. N21.4 FE 0,090 Control vs. N5.18 IE 0,059 Control vs. N5.18 IE/FE 0,619 Control vs. N5.18 FE 0,033*

Debido a la influencia ejercida por las campañas en los resultados obtenidos, se procedió a la

realización de un nuevo análisis PCA por campañas para poder eliminar esta variable y así poder

discernir otros factores predominantes en los diversos parámetros observados (figura 2.55 y 2.56).

Eje I: 87,8%

Eje

II: 8

,1%

1ª Campaña

Capítulo 2

113




En la figura 2.55 se muestra la ordenación en dos dimensiones que proporciona el PCA de los

ensayos de campo realizados durante la 1ª campaña. El eje I absorbe una varianza del 87,8% mientras

que el eje II absorbe solo un 8,1%. El análisis muestra una clara diferencia entre las dos parcelas Navajo

del Provencio y Casa del Pozo. También se aprecia una asociación de los pesos de la cápsula, semilla,

paja con el contenido en morfina asociado a las cepas Aur9 y N5.18 con los momentos de inoculación al

inicio del entallado (IE) y al final del entallado (FE). Por el contrario, la cepa N21.4 muestra un

comportamiento parecido al Control, estado relacionados con el contenido en tebaína y morfina.

2ª Campaña


114




La ordenación de la segunda campaña resulta en un cambio en el peso de los ejes. El eje I

absorbe el 72,2% de la varianza, mientras que el eje II absorbe el 21,7%. En esta campaña las parcelas

siguen teniendo una elevada importancia, pero en menor medida que la campaña anterior. De nuevo se

vuelven a asociar los parámetros peso de la cápsula, paja, semillas y cantidad total de morfina; región

donde se han distribuido los tratamientos con N5.18 al final del entallado.

Por todo ello y valorando los resultados expuestos anteriormente se seleccionó la cepa N5.18,

con la pauta de inoculación al final del entallado (FE), para la aplicación de la bacteria de mayor

potencialidad en fincas de adormidera en mayor superficie de cultivo, en una tercera campaña.

Tercera campaña

En base a los resultados obtenidos en las campañas anteriores, para la tercera campaña se

seleccionó la cepa bacteriana N5.18, aplicandola al final del entallado (FE) en dos parcelas de

experimentación Villalozano (1.050 m2) y Cherrycoca (1.482 m2), ambas en la provincia de Albacete

Eje I: 72,2%

Eje

II: 2

1,7

%

Capítulo 2

115

(materiales y métodos). En cada finca, el terreno se dividió en dos zonas: Control no tratado y

tratamiento con la cepa bacteriana. En cada zona se marcaron seis subparcelas, siendo cada una de ellas

una réplica, donde se realizaron las determinaciones y análisis y posteriormente, se cosecharon a mano.

Finalmente, cada tratamiento se cosechó de manera mecanizada para el posterior cálculo de

rendimiento y evaluación.

A los 15 días de la última inoculación, al final del entallado, se valoró la fotosíntesis mediante

emisión de fluorescencia, y se tomaron muestras de hojas para la realización de un análisis de expresión

génica de las enzimas T6ODM, CODM y COR, según se describió en el apartado “materiales y métodos”.

Los resultados de los parámetros fotosintéticos se resumen en la figura 2.57.

Figura 2.57 Representación de los parámetros fotosintéticos: F0 (expresada como 10-1), Fv/Fm, φPSII y

NPQ, medidos durante la 3ª campaña con N5.18 al final de entallado (FE) en la finca Villalozano (a) y en

Cherrycoca (b). Los datos son la media de seis réplicas (n=3) ± error estándar. Letras diferentes indican

diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05).

En la parcela de Villalozano (figura 2.57.a), N5.18 mejoró el rendimiento cuántico del PSII

(φPSII), significativamente asociado a una desiminución no significativa del quenching no fotoquímico

(NPQ). En el resto de los parámetros analizados, se aprecia una tendencia a la mejora, sin que los

cambios sean significativos, disminuyendo el F0, mientras que el rendimiento potencial (Fv/Fm)

permanece constante. En la parcela Cherrycoca (figura 257.b), se aprecia una mejora significativa en tres

parámetros, aumento del rendimiento potencial máximo (Fv/Fm), redimiento cuántico (φPSII) y

disminución del quenching no fotoquímico (NPQ). La pequeña disminución de F0 no es significativa en

referencia al tratamiento Control.

Los resultados obtenidos tras el análisis de la expresión génica de las enzimas CODM, T6ODM y

COR se muestran en la figura 2.58.

a

fm

v

a

fn

v

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

Fo Fv/Fm PSII NPQ

Villalozano

Control N5.18

a)

a

f

m

v

a

gn w

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Fo Fv/Fm PSII NPQ

Cherrycoca

Control N5.18

b)


116

Figura 2.58 Expresión génica de los genes Ps-T6ODM (GQ500139.1), Ps-CODM (GQ500141.1) y Ps-COR

(FJ624147.1), normalizados con la expresión del gen de la β-actina (AB574418.1). El asterisco (*) indica

diferencias significativas del tratamiento frente al Control de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05).

Tras analizar los resultados de la expresión génica, se apreció un comportamiento distinto entre las dos

parcelas de estudio (figura 2.58). En la parcela de Villalozano, el análisis no mostró diferencias en la

expresión de los genes T6ODM, CODM y COR, una vez normalizados. Por el contrario, en la parcela de

Cherrycoca se pudo apreciar un incremento en la expresión de los genes de estudio, siendo significativo

el aumento de la expresión del gen CODM solamente. Este incremento fue del doble en referencia al

tratamiento control tras haber sido normalizado con el gen de referencia β-actina, según el método 2-

ΔΔCt. En el resto de los genes, se pudo apreciar una ligera tendencia al incremento de la expresión, sin

que ésta fuera significativa.

Previo a la cosecha, se realizó un muestreo en seis subparcelas de un m2, en cada tratamiento,

para determinar el número de plantas, cápsulas y su peso medio.

La inoculación con la cepa N5.18 al final del entallado en la finca Villalozano no mostró

diferencias significativas en el número de plantas/m2, cápsulas/m2 y número de cápsulas/número

referenciado al control (figura 2.59)

*

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

CODM T6ODM COR

Exp

resi

ón

no

rmal

izad

a

Expresión génica

Villalozano Cherrycoca

aa

0

25

50

75

100

125

150

175

Control N5.18

Nº plantas/m²

Nº plantas/m²

a)

a a

0

25

50

75

100

125

150

175

200

Control N5.18

Nº Cápsulas/m²

Nº Cápsulas/m²

b)

a a

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

Control N5.18



c)

Capítulo 2

117


Villalozano en la 3ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con la cepa N5.18 al final del entallado


entre los tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05).

En la finca Cherrycoca sucedió lo mismo, no se registraron diferencias significativas tras la

aplicación de N5.18 al final del entallado (FE) (figura 2.60). No obstante, se observó un menor número

de plantas/m2 (-25) y de cápsulas/m2 (-40) en comparación con la finca de producción Villalozano.


Cherrycoca en la 3ª campaña. Plantas de adormidera inoculadas con la cepa N5.18 al final del entallado


entre los tratamientos de acuerdo a la prueba LSD (p <0,05).

En referencia al peso de la cápsula, el tratamiento con N5.18 promovió un aumento del peso de

la paja (+5,1%) y de las semillas (+4,7%) (figura 2.61.b), si bien este aumento no fue estadísticamente

significativo.

Figura 2.61 Peso acumulado de paja y semillas de plantas de adormidera inoculadas con las cepas N5.18

al final de entallado (FE) (a); variación del porcentaje del peso acumulado de paja y semillas referenciado

al tratamiento Control (b), en la finca de producción Villalozano en la 3ª campaña. Los datos son la



a a

0

20

40

60

80

100

120

140

Control N5.18

Nº plantas/m²

Nº plantas/m²

a)

a a

0

25

50

75

100

125

150

Control N5.18

Nº Cápsulas/m²

Nº Cápsulas/m²

b)

a a

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

Control N5.18



c)

a a

v v

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Control N5.18

Peso cápsula/m2


a)

-4,0

-2,0

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0


%

Variación Peso cápsula/m2b)


118

La aplicación de N5.18 mostró un incremento en el peso de la paja (+ 3,2%) y de las semillas

(+9,5%), lo que incrementó el peso de la cápsula (figura 2.62.b). Si bien, este incremento no fue

significativo frente al tratamiento control.

Figura 2.62 Peso acumulado de paja y semillas determinando el peso total de las cápsulas/m2 (a);

variación del porcentaje del peso acumulado de paja y semillas referenciado al tratamiento Control (b),

en la finca de producción Cherrycoca en la 3ª campaña. De plantas de adormidera inoculadas con las

cepas N5.18 al final de entallado (FE). Los datos son la media ± error estándar (n=6). Letras diferentes


Al referenciar el peso total de las cápsulas entre el número total de plantas, se apreció un

incremento en el peso total de las cápsulas (+11,1%) (figura 2.63.a) de las plantas tratadas, debido a un

aumento del peso de la paja (+12,0%) y de las semillas (+13,8%) (figura 2.63.b).


N5.18 al final de entallado (FE) en la finca de producción Villalozano en la 3ª campaña. (b) variación del




a a

v v

0

50

100

150

200

250

300

Control N5.18

Peso cápsula/m2


a)

-4,0

-2,0

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

Peso Paja Peso Semillas%

Variación Peso cápsula/m2b)

a a

vv

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

Control N5.18


peso paja/nº plantas Peso semillas/nº plantas

a)a)

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

peso paja/nº plantas Peso semillas/nº

plantas

%



b)b)

Capítulo 2

119

En la parcela Cherrycoca, también se apreció un incremento no significativo del peso de la

cápsula (+7,8%) (figura 2.64.a), debido más a un aumento en el peso de las semillas (+11,4%), que al de

la paja (+2,2%) (figura 2.64.b).


N5.18 al final de entallado (FE) en la finca de producción Cherrycoca en la 3ª campaña. (b) variación del




En referencia al contenido de alcaloides totales, no se encontraron diferencias significativas en

las plantas tratadas en la finca Villalozano (figura 2.65a.) Sin embargo, si se modificó el contenido

relativo de cada alcaloide analizado con respecto al control, apreciándose un incremento en morfina

(+1,6%) y un descenso en el contenido de codeína (-5,3%) y de tebaína (-10,6%), sin ser significativos

(figura 2.65.b).

Figura 2.65 Contenido de alcaloides de plantas de adormidera inoculadas con la cepa N5.18 al final de


producción Villalozano en la 3ª campaña. (b) Variación del porcentaje en el contenido de alcaloides

normalizado al tratamiento Control Los datos son la media ± error estándar (n=6).

a a

v v

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

Control N5.18



a)

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

peso paja/nº plantas Peso semillas/nºplantas

%



b)b)

a a

e em m

v v

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Control N5.18



a)a)a)

-15,0

-12,5

-10,0

-7,5

-5,0

-2,5

0,0

2,5

5,0


%

Variación alcaloidesb)b)


120

En la finca Cherrycoca, se apreció un perfil similar al resultado en la finca Villalozano, no varió el

contenido en alcaloides totales (Figura 2.66 a) y sin embargo, sí varió el perfil relativo de alcaloides

registrándose un incremento de morfina (+3,8%) y un descenso significativo de codeína (-7,3%) y

tebaína (-13,6%), debido al tratamiento (figura 2.66.b).

Figura 2.66 Contenido de alcaloides en plantas de adormidera inoculadas con la cepa N5.18 al final de





Al calcular el contenido potencial de alcaloides en la finca Villalozano (figura 2.67) se detectó un

aumento no significativo de morfina (+6,8%), codeína (+,9%), de oripavina (+3,5%) y una disminución de

tebaína (-4,6%) (figura 2.67.b).






a a

e f

m n

v v

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

Control N5.18



a)

#

#

-20,0

-17,5

-15,0

-12,5

-10,0

-7,5

-5,0

-2,5

0,0

2,5

5,0

Morfina Codeína Tebaína Oripavina%

Variación alcaloidesb)b)b)

a a

eem m

vv

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

Control N5.18



a)a)

-8,0

-6,0

-4,0

-2,0

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0


%

Variación potencial alcaloidesb)b)

Capítulo 2

121

De forma similar, en la finca Cherrycoca se apreció una tendencia a incrementar el contenido

potencial de morfina (+0,7%), codeína (+3,8%), y disminuir la tebaína (-3,2%) (figura 2.68.b). Si bien

estas variaciones no fueron estadísticamente significativas.






En la figura 2.69 se presentan los datos potenciales esperados y los datos reales obtenidos del

peso total de las cápsulas, incluyendo paja y semillas de las parcelas tratadas con N5.18 al final del

entallado (FE), referenciadas a las parcelas control. En ambas fincas se esperaba un incremento de la

producción total aunque sólo se apreció un incremento de la producción en la finca Cherrycoca (+0,4%).

a a

e e

m m

v v

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

Control N5.18



a)

-5,0

-4,0

-3,0

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

Morfina Codeína Tebaína Oripavina%

Variación potencial alcaloidesb)b)

-3,0

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

Villalozano Cherrycoca

%

Variación peso fincas producción

Producción Potencial Producción Real


122

Figura 2.69 Producción total de adormidera, peso de las cápsulas, real y potencial, en dos parcelas de

producción. El asterisco (*) indica diferencias significativas del tratamiento frente al Control de acuerdo a

la prueba LSD (p <0,05).

Una vez analizados los resultados a lo largo de las tres campañas, se comparó la densidad de

cultivo de plantas y cápsulas en las diferentes parcelas de estudio a lo largo de las tres campañas, en

base a los valores medios de los tratamientos control (figura 2.70). La densidad de las plantas fue similar

en la primera (60,6±1,75) y segunda campaña (53,8±2,15). Sin embargo, en la tercera campaña la

densidad se duplicó (129,7±5,5) siendo esta diferencia estadísticamente significativa. También se

apreciaron datos similares en la densidad de las cápsulas de la primera campaña (84,9±1,85) y segunda

campaña (62,8±2,16), incrementándose en la tercera campaña (144,0±5,8).

Figura 2.70 Densidad de cultivo: plantas/m2 y cápsulas/m2 en las diferentes parcelas, a lo largo de las

tres campañas de estudio. Letras distintas indican diferencias significativas entre las distintas campañas

para el número de plantas/m2 (a, b, c) y para el número de cápsulas/m2 (m, n, o, p) según el test LSD

(p<0,05).

a a a b

cc

m mn o

p

q

0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

250.0

300.0

350.0

Navajo delProvencio

Casa delPozo

La Grajuela Las Torres Villalozano CherryCoca

1ª Campaña 2ª Campaña 3ª Campaña

Densidad de cultivo

Nº plantas/m² Nº Cápsulas/m²

Capítulo 2

123

2. 5 Discusión

El metabolismo secundario de las plantas tiene como resultado la síntesis de compuestos con

una funcionalidad ecológica muy amplia (Wink, 2010; Moore et al., 2014). Los diversos metabolitos

pueden variar a nivel cualitativo y cuantitativo en los tejidos que conforman la planta. Esta variabilidad

depende del estado ontogénico de la planta, condiciones ambientales así como de diversos factores

tanto abióticos como bióticos. En la actualidad el principal factor que afecta a la producción y

acumulación de la morfina y otros morfinanos de interés es el cultivar de la planta; seguidamente la

climatología representa un factor determinante en los rendimientos finales del cultivo (Mahdavi-

Damghani et al., 2010; Matyášová et al., 2011). De esta forma, el contenido de alcaloides totales

asociado a la materia prima de la paja de adormidera puede variar entre 1,5%-2,7%, en términos

generales. Otro de los factores limitantes en el rendimiento del cultivo de adormidera es la disminución

de la germinación y emergencia de las semillas. Este problema está muy asociado a la climatología de

ciertas regiones de cultivo, en especial en las dos mesetas castellanas. Por todo ello, debido al efecto

modulador de diversos factores y a la posible inducción sistémica del metabolismo secundario por

agentes biológicos no patógenos como son las PGPRs, su aplicación en plantas de Papaver somniferum

se ha postulado como la hipótesis de trabajo en el presente estudio, para la normalización e incremento

de alcaloides de tipo morfinano, así como una posible mejora en los procesos fisiológicos de

germinación y emergencia.

A la vista de los resultados, está hipótesis se confirma como cierta, si bien cada cepa bacteriana

produjo un efecto diferente sobre la especie de estudio. Por otra parte, los marcadores fisiológicos y

metabólicos seleccionados para este estudio: porcentaje de germinación y emergencia, eficacia

fotosintética, biomasa y metabolismo de alcaloides morfinanos, han demostrado ser adecuados para

contrastar la hipótesis de partida, revelando abundante información sobre los efectos de las diferentes

cepas en la planta de Papaver somniferum.

La idea de introducir el tratamiento bacteriano persigue estimular el metabolismo de la planta

para alcanzar un mayor rendimiento agronómico y una estimulación controlada del metabolismo

secundario, ya que esta estrategia ha dado resultado en otras especies vegetales tanto en condiciones

controladas en arabidopsis (Domenech et al., 2007), soja (Algar et al., 2013), tomate (Radzki et al.,

2013), como en campo en arroz (Lucas et al., 2009; Lucas et al., 2014), tomate (Ramos-Solano et al.,

2010b), mora (Ramos-Solano et al., 2014). Nos planteamos el estudio de distintas cepas bacterianas con

un buen potencial previo puesto que existe una especificidad en la interacción planta-microorganismo y

cada asociación puede tener una interacción distinta. Esta interacción presenta una elevada

especificidad, ya que implica mecanismos de reconocimiento a través de señales, siendo necesario el

intercambio de moléculas indicadoras entre la planta y el microorganismo en un ambiente donde el

sustrato juega un papel vital aunque estos procesos no están todavía bien definidos en la interacción

PGPR-Planta (Bais et al., 2006; Lambers et al., 2009; Oldroyd et al., 2009; Pieterse et al., 2016). Como se


124

indicó en la introducción, la especificidad de la interacción se basa en los mecanismos de

reconocimiento específico de determinantes microbianos (MAMPs/PAMPs), por parte de los receptores

celulares de la planta (PRRs) (Reimer-Michalski y Conrath, 2016). La interacción desencadena una

respuesta inmune en la planta, PTI, promoviendo modificaciones en la expresión de sustancias

defensivas (Jones y Dangl, 2006; Henry et al., 2012). Si bien, las bacterias con capacidad PGPR, al igual

que algunos patógenos, han debido de desarrollar estrategias para disminuir o suprimir la activación de

elementos que completen la respuesta defensiva, para poder interaccionar de forma directa o indirecta

con la planta (Millet et al., 2010; Pieterse et al., 2014; Conrath et al., 2015). Además, existe una

sensibilidad distinta dependiendo del estado fisiológico de la planta.

Por estas razones, y con el objetivo de ordenar el trabajo, y de dar respuesta a los distintos

problemas agronómicos, en primer lugar se evaluó la germinación y emergencia de semillas de Papaver

somniferum.

La emergencia de la plántula se considera un proceso vital en el desarrollo de la planta, ya que la

superación de la barrera física del suelo implica cambios importantes en la fisiología de la planta

(Bradford y Nonogaki, 2007). Como se ha indicado anteriormente, el cultivo de adormidera presenta

elevadas mermas en la emergencia, 50%-75% (Németh, 1998). Debido a que la cantidad de semillas no

es un punto limitante en la producción, pues su disponibilidad es abundante, y al estricto control del

cultivo de adormidera, lo que condiciona el número de hectáreas de cultivo; el desarrollo de cultivares

que mejoren la emergencia de las plántulas, no es una prioridad en la industria agronómica, la cual

deriva sus recursos a cultivos de mayor interés (FJ. Ledesma, comunicación personal). Por ello, la

aceleración de la germinación y mejora de la emergencia en las condiciones climatológicas de la región

Centro, se ha propuesto como uno de los objetivos del presente trabajo. Para ello, se evaluó el efecto de

diez cepas y de sus medios de cultivo para estimular la germinación de la semilla, en condiciones

controladas. Seguidamente se seleccionaron las tres cepas con mayor potencialidad, para proseguir los

estudios de emergencia en suelo y en condiciones de frío.

Las diez cepas PGPRs de la colección CEU-San Pablo seleccionadas para la evaluación en la

mejora de la germinación y emergencia de semillas de adormidera proceden de sistemas rizosféricos de

distintas especies vegetales que han sido seleccionados por la presión selectiva impuesta por las plantas

en interacción con su ambiente. Las cepas procedentes de estos “screening”, han sido objeto de

numerosos trabajos, y han demostrado su capacidad para modificar el metabolismo de la planta de

origen, o bien poseen alguna capacidad metabólica que las convierten en cepas potencialmente

modificadoras de la fisiología de las plantas (tabla 2.1). El primer estudio plantea el uso de la cepa y de

los medios de cultivo ya que las moléculas responsables de la comunicación planta-microorganismo

pueden ser determinantes estructurales, es decir, estar presente en la pared bacteriana, o bien ser

metabolitos liberados al medio de cultivo, tipo hormonal (Domenech , Ramos-solano et al., 2007), o ser

de otra naturaleza como sideróforos o moléculas no definidas todavía (Gutierrez Mañero et al., 2012;

Algar et al., 2013; Ramos-Solano et al., 2015).

Capítulo 2

125

Las cepas Pseudomonas fluorescens N19.27, Arthrobacter oxydans BB1, Pseudomonas

aeruginosa N17.35 y Bacillus sp. L81 inhibieron la germinación y sin embargo, sus medios de cultivo la

estimularon, lo que pudiera estar relacionado con la liberación de moléculas de tipo hormonal

(Domenech et al., 2007).

Por otra parte, los metabolitos liberados por la bacteria no son necesariamente beneficiosos y

pueden ser incluso perjudiciales evitando la germinación de semillas como en el caso de Burkholderia

graminis M14 que activó la germinación mientras que su medio de cultivo la inhibió proporcionalmente

a la concentración. Entre los mecanismos implicados en este proceso pueden citarse por ejemplo la

producción de ácido cianhídrico como HCN (Gutierrez-Mañero et al., 1996) o moléculas de origen

fenólico, ya que está demostrado que estas moléculas tienen la capacidad de disminuir la germinación,

siendo un mecanismo común de la competencia en los ambientes naturales (Muscolo et al., 2001;

Hernández y Munné-Bosch, 2012). Por otra parte, está demostrado que esta cepa bacteriana tiene la

capacidad de producir N-Acil-homoserina lactonas (AHL), moléculas que tradicionalmente se han

relacionado con la comunicación bacteriana de tipo “quorum-sensing” en bacterias Gram negativas. Por

otra parte, se ha reportado que pueden activar la respuesta ISR en situaciones de estrés salino en

plantas tomate (Barriuso et al., 2008), así como modificar la inducción de genes relacionados con la

expresión de auxinas (Mathesius et al., 2003). Hasta la fecha no se ha demostrado que las AHLs puedan

interferir en el proceso de germinación de las semillas, pero no es descartable que promueva la síntesis

de compuestos que alteren la germinación mediante este mecanismo.

Por otra parte, la especificidad de la interacción se basa en los mecanismos de reconocimiento

específico de determinantes microbianos (MAMPs/PAMPs), por parte de los receptores celulares de la

planta (PRRs) (Reimer-Michalski y Conrath, 2016). Es decir, existe una especificidad en el

reconocimiento de la planta y la bacteria ya que debe existir un efector y un receptor para establecer el

contacto entre ambos organismos. Por ello, encontramos algunas cepas como Stenotrophomonas

maltophilia N6.8 y Chryseobacterium sp. C138 no fueron capaces de interaccionar con las semillas de

adormidera (figura 2.13), aunque otras cepas del mismo género, sí que fueron eficientes estableciendo

la comunicación.

Siguiendo este razonamiento aunque por el otro extremo, en determinadas ocasiones existe

más de un determinante bacteriano capaz de establecer una relación con la planta. Así, tres cepas y sus

medios de cultivo estimularon de la germinación in vitro Stenotrophomonas maltophilia N5.18,

Chryseobacterium balustinum Aur9 y Pseudomonas fluorescens N21.4, todas aumentaron la tasa de

germinación y aceleraron dicho proceso. Es decir, existe al menos un determinante estructural que

estaría representado por la bacteria en sí, y alguno metabólico liberado al medio de cultivo por la

bacteria, capaces de desencadenar este efecto. Entre las moléculas propuestas para alterar el

metabolismo de la planta están los reguladores de crecimiento vegetal. Este trabajo se han valorado la

capacidad de producir auxinas y producción de etileno y sólo Aur9 ha demostrado la capacidad para

producir auxinas (Mañero et al., 2003). Por otra parte, N5.18 y N21.4 comparten la capacidad de


126

producir sideróforos y quitinasas (Ramos-Solano et al., 2010b; Radzki et al., 2013), rasgos que

intervienen en la protección fitosanitaria y la movilización de nutrientes, pero no en la germinación.

Diferentes estudios (Allen et al., 2007; Feurtado y Kermode, 2007) han demostrado que el

potencial hídrico del suelo, la luz, la temperatura y la presencia de diversas hormonas, en especial ácido

abscísico (ABA) y giberelinas (GA) son los principales determinantes en el proceso de germinación y

emergencia de una semilla. La metodología desarrollada en este estudio, así como la elevada proporción

de nutrientes en el endospermo, en comparación con el pequeño embrión basal de las semillas de

adormidera sostienen la idea de distintos determinantes bacterianos responsables del efecto

estimulador de la geminación. Esta molécula elicitora puede ser algún compuesto de tipo hormonal,

como giberelinas (GA), que acelere la germinación y emergencia. Las giberelinas son diterpenos

(Hedden y Thomas, 2012), moléculas del metabolismo secundario, que están involucradas en

numerosos procesos fisiológicos de la planta como la germinación, emergencia, crecimiento del tallo y

hojas, inducción floral, desarrollo de las flores y los frutos, entre otros procesos (Azcón-Bieto y Talón,

2008; Taiz y Zeiger, 2010). En la mayoría de estos procesos las giberelinas actúan tras la inactivación del

complejo DELLA (Asp-Glu-Leu-Leu-Ala) proteína represora de estos procesos, en combinación con otras

fitohormonas y con otros factores de regulación (Hauvermale et al., 2012). En el proceso de

germinación, las giberelinas estimulan la activación de diversos genes implicados en la movilización de

nutrientes, como son amilasas, proteasas y glucanasas (Yamaguchi, 2008). También pueden modificar

las propiedades de la envoltura protectora de las semillas, a través de una acción indirecta en las

expansinas y xiloglucanasas (XTHs) de la pared celular, promoviendo su debilitamiento y posterior

liberación de la radícula (Liu et al., 2005). Aunque la producción de GA por el hongo Gibberella fujikuroi

está bien documentada (Hedden y Sponsel, 2015), no es el caso por parte de PGPRs. Se han reportado

diversos microorganismos, como Azospirillum sp., Rhizobium sp., Acetobacter diazotrophicus,

Herbaspirillum seropedicae, Bacillus sp. (Bastián et al., 1998; Bottini et al., 2004; Gil-Jae Joo et al., 2005),

capaces de producir diferentes tipos de giberelinas. Nuestro grupo ha aislado cepas de Bacillus pumilus y

Bacillus licheniformis, de la rizosfera de A. glutinosa, con la capacidad de producir elevadas cantidades

de GA1, GA3, GA4 y GA20 (Gutiérrez-Mañero et al., 2001). A su vez, Cassan y colaboradores describieron

la capacidad de promover la germinación de maíz y soja mediante la aplicación de las cepas Azospirillum

brasilense y Brayrhizobium japonicum, con capacidad para producir GA3 (Cassan et al., 2009) Por ello, es

posible que las cepas Aur9, N21.4 y en especial N5.18 sean capaces de producir ácido giberélico, el cual

interaccione en el proceso de germinación y emergencia, acelerando dichos procesos en comparación

con el tratamiento Control. A su vez, la proporción de giberelinas y ácido abscísico, mayoritariamente,

juegan un papel predominante en el desarrollo morfogénico de la plántula en el proceso de emergencia

del sustrato. Mientras que un aumento en ABA favorece la latencia de las semillas, una mayor

proporción de giberelinas promueve la germinación de las semillas (Holdsworth et al., 2008). Las GA

activan los factores de transcripción de la familia PIF (“Phytochrome Interacting Factor”), en especial

PIF1, PIF3 y PIF4, que promueven la expresión de genes involucrados en la escotomorfogenesis o

Capítulo 2

127

etiolización, caracterizado por un crecimiento rápido del hipocotilo, desarrollo y mantenimiento del

gancho apical, así como el mantenimiento de los cotiledones cerrados (Alabadí et al., 2008). Esta

morfología favorecería el movimiento de la plántula a través del sustrato, protegiendo el meristemo

apical, hacia la superficie; especialmente en situaciones donde las condiciones ambientales propician la

aparición de una costra superficial en el sustrato (self-mulching), como es característico en el periodo de

siembra en la región de Albacete. Por el contrario, la luz de la superficie promueve la activación del

complejo proteico DELLA, reprimiendo la acción del GA lo que desencadena la activación de complejos

como COP1 (Constitutive Photomorphogenic) y HY5 (Long Hypocotyl 5) que favorecen el proceso de

fotomorfogénesis (Lau y Deng, 2012).

Otras hormonas como auxinas, etileno, citoquininas y brasidosteroides están involucradas en

menor medida en el proceso de germinación (Miransari y Smith, 2014). Aunque la hormona de etileno

(ET) está implicada en procesos de maduración, senescencia y estrés, también interviene en el proceso

de germinación. Se ha observado como el etileno aumenta durante la germinación de muchas semillas

de plantas como Arabidopsis (A. thaliana), trigo (Triticum spp), maíz (Zea mays), soja (Glycine max) y

arroz (Oryza sativa). Este aumento promueve un debilitamiento del endospermo, así como de la ruptura

de la testa, facilitando la emergencia de la radícula de la semilla, afectando a la tasa de germinación

(Linkies et al., 2009; Subbiah y Reddy, 2010). A su vez, se ha determinado como Azospirillum brasilense

es capaz de producir pequeñas cantidades de etileno a través de la carboxilación del ácido 1-

aminociclopropano 1-carboxílico (ACC), su precursor (Yang y Hoffman, 1984; Vacheron et al., 2013).

Aunque cabe reseñar que, en la actualidad, la mayoría de los estudios se centran en la disminución del

etileno por parte de PGPRs capaces de producir la enzima ACC desaminasa (EC. 3.5.99.7), ya que esta

situación promueve un crecimiento y desarrollo de las raíces al aumentar el ratio auxina-etileno (Glick

et al., 2007). Aunque la producción de hormonas por parte de PGPRs ha sido ampliamente descrita en

multitud de trabajos, los determinantes genéticos implicados en su biosíntesis siguen siendo en gran

medida desconocidos. Por consiguiente, la participación de hormonas de origen bacteriano en la

modulación del equilibrio hormonal de la planta sigue sin comprenderse en la actualidad. Por lo tanto,

otros mecanismos deben ser los responsables de esta estimulación de la germinación y queda por

dilucidar otros metabolitos implicados en la mejora de la germinación.

No sólo es importante mejorar la tasa de germinación para la producción en campo, puesto que

la disponibilidad de semillas es abundante y con bajo coste, y una baja tasa de germinación se puede

solventar con una mayor densidad de semillas por superficie, sino que es importante conseguir la

emergencia temprana para favorecer el rápido establecimiento de la planta. Para este estudio se

seleccionaron las cepas Aur9, N21.4 y N5.18 que fueron las mejores en germinación en placa, y se

evaluó la emergencia en sustrato universal en primer lugar, y después en suelo. La emergencia en

sustrato universal fue menor que en placa, ya que a los 7 días post inoculación solo había emergido el

35% de las semillas en el tratamiento Control (figura 2.14). Las cepas N5.18 y N21.4 fueron capaces de

aumentar significativamente la emergencia, 53% y 50% respectivamente, mientras que con Aur9 sólo se


128

observó una tendencia al alza lo que demuestra que la interacción de elementos físico-químicos del

suelo disminuyen o retrasan la germinación y/o emergencia de las semillas. Aun así, el efecto de

estimulación detectada in vitro se mantiene en sustrato universal. En la siguiente prueba se utilizó el

suelo de parcelas de producción y condiciones de bajas temperaturas para reproducir en la medida de lo

posible las condiciones reales. El sustrato utilizado en este estudio se obtuvo de campos de cultivo de

Albacete (materiales y métodos). A su vez, las condiciones de temperatura (6,1°C) y humedad (51% )

impuestas durante el estudio se determinaron en base a la temperatura media de Albacete durante el

mes de Febrero (6,6°C) (AEMET, 2016), y una humedad relativa media inferior a la registrada en el

histórico, 70% (AEMET, 2016), para favorecer la aparición de una costra superficial “self mulching”,

problema característico de la zona de cultivo de Albacete. De las dos formas de aplicación que se

ensayaron, la aplicación en el riego consiguió mejores resultados, encontrándose una mejora

significativa con N5.18 ya a los 28 días post inoculación, que presentaba un 60% de semillas emergidas

en suelo en condiciones de baja temperatura (figura 2.15). Esta aceleración del proceso es

especialmente interesante ya que podría disminuir los rigores de la estacionalidad (Navarro Blaya y

Navarro García, 2003). Posiblemente este retraso de la germinación con respecto a los estudios in vitro

en cámara de cultivo se deba a la baja temperatura del ambiente, con una media de 6,1°C, siendo

inferior a la temperatura óptima del cultivo de adormidera, situado entre los 7°C-10°C para la variedad

de primavera (Németh, 1998). A su vez, la diferencia observada en la emergencia de semillas al

comparar ambas formas de aplicación del tratamiento (figura 2.15.b), pone de manifiesto la existencia

de un factor que afecta de forma determinante a la misma, posiblemente debido a una diferencia en el

potencial hídrico (ψ) del suelo, ya que la inoculación mediante riego aportó 20 mL de solución

bacteriana acuosa extra, promoviendo un aumento en el potencial hídrico condicionando el proceso de

imbibición por parte de la semilla. Aun así, se pudo observar como a los 35 dpi, el proceso de

emergencia se estabilizó en los diferentes tratamientos con riego (figura 2.15.a). Este valor es muy

similar a los 30 días necesarios para la emergencia de las plántulas de adormidera en condiciones de

campo (F.J. Ledesma, comunicación personal), por lo que validarían los resultados obtenidos mediante

esta metodología, y probablemente acelerarían la emergencia e implantación definitiva del cultivo

Cabe reseñar la existencia de un número mayor de plantas emergidas en la inoculación

realizada mediante riego con N5.18 (122%) frente al número de semillas sembradas, que se justifica

porque el suelo proveniente de las parcelas de cultivo de Albacete no se esterilizó, para no modificar las

propiedades físico-químicas y biológicas del sustrato, y por lo tanto, aportó las semillas de diferente

naturaleza en estado de latencia; cuando éstas germinaron en las condiciones fueron las adecuadas, se

sumaron a la germinación de las propias semillas de adormidera (80% de germinación del Control en el

experimento de germinación in vitro figura 2.13). Puesto que el sustrato utilizado y las condiciones

experimentales fueron las mismas para todos los tratamientos, este incremento se manifestó en todos

los tratamientos en la misma proporción, siendo un error despreciable. Aun así, los resultados obtenidos

confirman la potencialidad de N5.18 para mejorar la germinación y emergencia de Papaver somniferum

Capítulo 2

129

en todas las condiciones experimentadas incrementándose en un 15-20% frente al tratamiento Control,

adelantando la emergencia y, por lo tanto, puede ayudar al establecimiento del cultivo (figuras 2.13;

2.14 y 2.15).

Tras la identificaron de cepas capaces de potenciar el proceso de germinación y emergencia, se

evaluó el posible efecto de estas cepas como elicitores bióticos en la modulación de la fisiología de

adormidera, en especial en el metabolismo secundario de morfinanos. En una primera etapa, se

desarrolló el experimento en condiciones controladas. Para ello se realizaron inoculaciones con las

cepas bacterianas seleccionadas Aur9, N21.4 y N5.18, durante el inicio del entallado, 60 días después del

trasplante, y al final del mismo (74 días). Durante esta fase se produce la elongación del tallo y el inicio

de la formación de la cápsula floral, siendo un periodo muy importante en el desarrollo de la cápsula

floral y su “llenado” debido a la gran absorción de nutrientes y agua (Bernath, 2003). Por otra parte, se

ha definido como los estados más sensibles frente a distintos tratamientos experimentales (F.J.Muñoz,

comunicación personal). Se ensayaron dos formas de administrar el inóculo, mediante pulverización

foliar o riego. Es importante reseñar que la interacción específica entre planta y microorganismo no

tiene por qué producirse con la misma efectividad a nivel radicular y foliar, por lo que es importante el

ensayo en condiciones controladas para una posible implementación del proceso de inoculación en

condiciones de campo.

Dentro de los diversos parámetros valorados, el uso de la fotosíntesis como marcador

metabólico de la inducción sistémica producida por agentes beneficiosos es novedoso. Se ha

demostrado que tras la infección de un fitopatógeno se desencadenan una activación del sistema de

defensa de las plantas, al mismo tiempo que se producen cambios en el metabolismo primario en

especial en el metabolismo de los hidratos de carbono. Diversos estudios han demostrado como la

actividad de la fotosíntesis disminuye (Berger et al., 2007; Rodriguez-Moreno et al., 2008), además se

produce una inducción de la actividad invertasa en la vacuola, lo que conlleva una transformación en la

funcionalidad de hojas, cambiando de hojas “productoras” a hojas “sumidero” (Roitsch, 1999; Berger et

al., 2004; Bonfig et al., 2006). Sin embargo, la información de los cambios que ocurren en el proceso de

fotosíntesis cuando la planta se enfrenta a un agente no patógeno, como las PGPR empleadas en este

trabajo, es limitada. Basándonos en el hecho de que estas cepas se comportan como patógenos

avirulentos sería de esperar que ocurrieran cambios en los procesos fotosintéticos además de la

inducción del metabolismo defensivo y de la resistencia sistémica (van Loon et al., 1998; Barriuso et al.,

2008; Ramos-Solano et al., 2008b). Además, dicha alteración de la fotosíntesis puede repercutir en

cambios asociados a la propia biomasa de la planta, pudiendo reflejarse en el peso de la paja de

adormidera, materia prima de los morfinanos. Por todo ello, la valoración de la fotosíntesis se realizó

siempre que fue posible en invernadero y en las campañas de campo.

El valor medio del rendimiento cuántico máximo del PSII (Fv/Fm) fue de 0,86 en los

tratamientos Control (figura 2.16, figura 2.17 y figura2.18), siendo 0,83 el valor habitual para un gran

número de especies, lo cual indica que las plantas se encontraban en un estado fisiológico normal


130

(Maxwell y Johnson, 2000). Valores inferiores, en la mayoría de las especie vegetales, denota la

presencia de un estrés abiótico o biótico, indicando un proceso de fotoinhibición (Bonfig et al., 2006).

Todos los tratamientos realizados disminuyeron el nivel mínimo de fluorescencia (F0), a excepción de la

inoculación vía radical de N21.4 que no alteró el parámetro. Un aumento en F0, estaría relacionado con

daños sobre los pigmentos del complejo antena, pudiendo estar asociado a un estrés oxidativo

producido por un agente abiótico o biótico, entre otros (Briantais et al., 1996), lo que a su vez se

relaciona con daños en la arquitectura tilacoidal, y por lo tanto, con un transporte de electrones

deficiente (Whalen et al., 1991; Rodríguez-Moreno et al., 2008; Yamane et al., 2008). Por todo ello, no

parece que exista una disminución de la eficiencia en los complejos de captación de la luz. Además, la

disminución del valor de F0 indica que la planta no se siente estresada por las cepas aplicadas, ya que es

uno de los parámetros que se vé más afectado frente a factores de estrés (Osmond y Grace, 1995;

Baker, 2008; Grijalbo et al., 2015).

Sólo la cepa N5.18, tanto en aplicación radical como foliar, afectó de forma positiva más de dos

parámetros de la fotosíntesis (figura 2.18). Además de la disminución de F0, aumentó el rendimiento

cuántico máximo del PSII (Fv/Fm) y disminuyó el quenching no fotoquímico (NPQ). Esta situación sugiere

una mejora de la transferencia de energía dentro de PSII, así como la disminución de la energía disipada

en forma de calor. El parámetro NPQ se relaciona linealmente con el calor disipado, presentando un

intervalo normalizado comprendido entre 0,5 a 3,5 (Maxwell y Johnson, 2000). Diversos estudios han

demostrado una relación de la disminución de NPQ con la mejora de la eficiencia fotosintética y la

producción de isopreno (Monson et al., 1992; Sharkey y Yeh, 2001), molécula precursora de la síntesis

de terpenos en plantas. En plantas capaces de emitir isopreno, como Eschscholzia califórnica (amapola

californiana) perteneciente a la familia Papaveraceae, se ha observado una disminución en los valores

del parámetro NPQ, en comparación con plantas a las cuales se les ha inhibido la capacidad de emitir

isopreno (Pollastri et al., 2014) por lo que se ha atribuido al isopreno un papel como una molécula

reguladora de la homeostasis de las membranas plasmáticas, incluidas las membranas de los tilacoides,

en los cloroplastos (Velikova et al., 2012). Debido a la presencia de dobles enlaces conjugados en su

estructura, tiene la capacidad de neutralizar especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, lo que le

confiere un potente carácter antioxidante. Además, su naturaleza apolar lo capacita para poder

distribuirse fácilmente en las membranas plasmáticas. Y al ser una molécula con una capacidad de

volatilizarse a temperaturas por encima de 30ºC, podría justificar la disminución del parámetro NPQ al

eliminar calor de las membranas del tilacoide, evitando un estrés oxidativo, que conllevaría a una

disrupción de la transformación fotoquímica (Pollastri et al., 2014). Por ello, un incremento de la

molécula de isopreno, promovido por la modificación de la ruta terpenoide por parte de cepas PGPR,

podría generar una disminución del valor NPQ, lo que repercutiría en una mejora de la eficiencia de la

fotosíntesis. Santoro y colaboradores describieron como cepas de Pseudomonas fluorescens fueron

capaces de modificar dicha ruta, a través de compuestos orgánicos volátiles (VOC), promoviendo un

aumento de monoterpenos en plantas de Mentha piperita, (Santoro et al., 2011).

Capítulo 2

131

Diferentes estudios, bajo condiciones controladas, han demostrado como el número de días

con fotosíntesis activa en el periodo comprendido entre la emergencia y la floración es el principal

determinante en el rendimiento del peso de la cápsula de adormidera (Acock et al., 1996; Zając et al.,

2011). Por ello, la mejora del proceso fotosintético mediante cepas PGPR, pudiera aumentar la biomasa

de la planta de adormidera. De forma paralela, la mejora del proceso fotoquímico pudiera ser una de las

estrategias que algunas PGPRs utilizan para mejorar el aporte de fotoasimilados a través de exudados.

Por lo que de forma directa o indirecta esta interacción pudiera incrementar el desarrollo de las plantas.

Zhang y colaboradores demostraron como mediante la interacción de compuestos volátiles (VOCs),

producidos por la cepa bacteriana Bacillus subtilis GB03, se producía una modulación de la sensibilidad a

la glucosa a través del sistema de hexokinasas, reflejándose en un incremento en la eficiencia de la

fotosíntesis promoviendo un aumento de la biomasa de las plantas tratadas (Zhang et al., 2008)

Esta mejora en la eficiencia fotosintética, se refleja en un aumento de la biometría, tanto de la

longitud del tallo como en la biomasa de la cápsula, mayoritariamente en el tratamiento realizado con

N5.18. Sin embargo, la longitud media del tallo en los controles es muy diferente entre experimentos

(figura 2.19, 2.20 y 2.21), probablemente debido al desfase de inicio del experimento con cada bacteria,

ya que las plantas estaban bajo fotoperiodo natural durante el periodo Primavera-Verano y un decalaje

de 3-4 semanas supone un aumento de horas de luz notable. El experimento con N5.18 se realizó en

primer lugar (50 cm) seguido de Aur9 (75 cm) y finalmente se realizó el experimento con N21.4 (84 cm),

cuando las horas de luz eran mayores. Sin embargo, el crecimiento de las plantas fue consistente dentro

de cada experimento y, por lo tanto, los efectos comparables. El tratamiento más efectivo fue la

inoculación foliar mediante N5.18, que aumentó significativamente la altura de la planta en un 12,2%

con respecto a su control (figura 2.21) y el peso seco cápsula, en un 33,3% (figura 2.24). Estudios

realizados previamente en nuestro laboratorio revelaron resultados similares en la planta de hipérico

(Hypericum perforatum), registrando un aumento significativo de biomasa e asociado a un aumento en

la concentración de hipericina, metabolito secundario de tipo policétido (Gutierrez Mañero et al., 2012).

Además de la mejora en eficiencia fotosintética observada, no se puede descartar la posibilidad de la

liberación de factores de regulación del crecimiento por parte de N5.18, como fitohormonas de tipo

auxinas, ácido salicílico, giberelinas o ácido jasmónico, que en combinación con una mejora en la

movilización del hierro a través de la producción de sideróforos (Ramos-Solano et al., 2010b), podría

resultar en un incremento de la biomasa. Este efecto de mejor en la nutrición de hierro tendría lugar en

condiciones de campo, donde la disponibilidad de nutrientes puede estar limitada. Como se describió

anteriormente, la posibilidad de la liberación de factores que modifiquen la biosíntesis de giberelinas en

la planta o la propia capacidad de la cepa en producir giberelinas, podrían estar asociadas a un

incremento en la longitud del tallo de la planta, mecanismo muy bien descrito en plantas de tipo roseta

como la adormidera (Bhattacharya et al., 2010; Taiz y Zeiger, 2010). Aunque la producción de auxinas se

ha mostrado como un mecanismo común de las bacterias de la rizosfera (Gutierrez-Mañero et al., 1996;

Spaepen et al., 2007), la participación del etileno, a través de la degradación del compuesto intermedio


132

ACC mediante la producción de la enzima ACC desaminasa (EC. 3.5.99.7)(Van de Poel y Van Der

Straeten, 2014), podría modificar la relación con las auxinas, en especial en las raíces, donde un

incremento de la relación auxinas/etileno conllevaría un mayor desarrollo de las raíces y una mejora en

la absorción de nutrientes (Glick et al., 2007).

Además de afectar a la longitud del tallo, el inóculo radical afectó a las cápsulas, donde se

acumula el principio activo de interés. La aplicación radical favoreció un aumentó el peso total de las

semillas, en detrimento de la paja, para dos de las tres cepas N21.4 y N5.18, aunque la más eficiente fue

la N5.18. Este comportamiento sugiere una mayor movilización de nutrientes y el desvío de los recursos

energéticos a potenciar el contenido de semillas (Ramos- Solano et al., 2010), que resulta más eficiente

para aumentar la capacidad reproductiva de la planta, pero peor para la acumulación de principios

activos. Por el contrario, Aur 9 aumentó ambos parámetros, es decir, que su aplicación en producción en

principio, resultaría en un aumento en el contenido potencial de alcaloides. Sin embargo, la inoculación

foliar con Aur9 el efecto positivo es muy poco potente, presente un ligero incremento tanto en capsulas

como en semillas; con N21.4 se alcanzan valores más bajos que los Controles en el peso de las semillas y

de la paja del fruto (figura 2.23). Esta situación revela que el metabolismo de la planta se ha modificado

y sugiere un efecto de “priming” De hecho, algunos elicitores pueden desencadenar ISR en la planta sin

cambios aparentes. Sin embargo, frente pruebas posteriores, estas plantas son capaces de responder de

manera más eficiente al factor de estrés con una respuesta más rápida e intensa (Conrath, 2009). Esas

plantas están en un estado de “priming” y, a veces, este estado metabólico puede comprometer el

crecimiento de las plantas ya que los recursos energéticos estarían desviados hacia el metabolismo de

defensa (van Hulten et al., 2006; Conrath, 2009; Vos et al., 2013; Martinez-Medina et al., 2016). Éste

pudiera ser el caso del tratamiento realizado con N21.4, de acuerdo con los efectos de esta cepa sobre

especies como soja (Ramos-Solano et al., 2010a) y mora (Garcia-Seco et al., 2015). Por todo ello, tras los

resultados obtenidos en la fotosíntesis y el crecimiento de las plantas tratadas con las tres cepas

bacterianas, se podría esperar un aumento de los alcaloides de cualquier tratamiento, ya que no

siempre la promoción del crecimiento está relacionado con la inducción del metabolismo secundario

(van Hulten et al., 2006; Ramos-Solano et al., 2010a).

El estudio realizado en el invernadero presentó un perfil de alcaloides sin aumentos

significativos, aunque sí se registran variaciones de los mismos. Es importante reseñar el incremento de

codeína (+22%) obtenido con la cepa Aur9 en aplicación radical (figura 2.25), así como el descenso de los

4 alcaloides con N21.4 foliar, aunque sólo es significativo el de morfina (figura 2.26). Por otra parte, la

aplicación radical de N5.18 solo aumenta la morfina, disminuyendo de forma significativa los demás

alcaloides, mientras que la aplicación foliar aumenta solo la codeína y disminuye los demás,

especialmente tebaína y oripavina (figura 2.27). Estos resultados demuestran que las 3 cepas son

capaces de cambiar el perfil metabolico de la adormidera, puesto que producen cambios con respecto al

control, y sugieren un papel fisiológico de estos alcaloides como precursores de moléculas defensivas, es

decir, como anticipinas (Boué et al., 2008; Algar et al., 2014). En el caso de las cepas N21.4 y N5.18, se

Capítulo 2

133

ha demostrado la capacidad de alterar el perfil metabólico de isoflavonas de tipo daizeina, a través de la

ruta de fenilpropanoides (Ramos-Solano et al., 2010a). Mishra y colaboradores (Mishra et al., 2013) han

identificado un factor de transcripción en adormidera, PsWRKY, que parece estar involucrado en la

activación de la transcripción de diferentes enzimas de la ruta de alcaloides morfinanos entre otros. A su

vez, este factor de transcripción es inducido por heridas en la planta y por metil-jasmonato, hormona

inductora de la respuesta ISR en plantas (Conrath, 2009; Pieterse et al., 2014), por lo que cualquiera de

las cepas pudiera inducir una respuesta de tipo ISR, alterando los niveles de metil-jasmonato

promoviendo la activación de PsWRKY, que pudiera modular la síntesis de codeína entre otros. Por el

contrario, la disminución significativa de los niveles de tebaína tras la inoculación radical de N5.18,

podría deberse a una desviación de los recursos de la ruta hacia la síntesis de sanguinarina, en la raíz, lo

que conllevaría a un descenso del contenido de los alcaloides ruta abajo, tipo morfinanos. Este cambio

puede justificarse por una mayor elicitación de la (S)-norcoclaurina sintetasa NCS (E.C.4.2.1.78) en la raíz

y tallo, lugar donde se ha observado una mayor concentración de transcritos de NCS y del enzima, en

comparación con las hojas y las cápsulas (Lee y Facchini, 2010). Por otra parte, se ha demostrado la

capacidad de modificar el perfil de los alcaloides, mayoritariamente sanguinarina, en cultivos celulares

de Papaver somniferum elicitados con micelios inactivos de Botrytis sp. (Facchini et al., 1996; Alcantara

et al., 2005; Zulak et al., 2008; Oldham et al., 2010). Se observa una reorganización del metabolismo

celular en cultivos elicitados durante las primeras 5-10 horas (Zulak et al., 2008) junto con un aumento

en la transcripción y acumulación de las enzimas Norcoclaurina Sintasa (NCS) y BBE (Berberine Bridge

Enzyme). La elicitación resultó en una acumulación de sanguinarina en la vacuola (Alcantara et al.,

2005). La NCS (CYP80B1) cataliza la condensación de dopamina y 4HPAA, el primer paso en la

conformación de la estructura base de los alcaloides benzilisoquinolínicos, norcoclaurina (Figura 1.10)

(PMN, 2014); es una oxidasa dependiente de P450 asociada al RE. Se ha identificado como PR-10

asociado a la familia Bet v1 de alérgenos, tras la determinación de su estructura (Ilari et al., 2009; Lee y

Facchini, 2010; Fernandes et al., 2013), lo que justificaría el aumento de la transcripción así como de su

actividad, en el lumen del RE, frente a la presencia de microorganismos y hongos (Zulak et al., 2009). El

otro enzima estimulado, la BBE es primera enzima que actúa en la ruta de transformación de (S)-

reticulina a sanguinarina, alcaloide pertenece al grupo de BIAs, de tipo benzofenantridina, que presenta

una actividad antimicrobiana, de uso en productos como colutorios orales (Munro et al., 1999).

Así pues, la disminución de todos los alcaloides inducida por la aplicación foliar de N21.4, y por

N5.18, (figuras 2.26 y 2.27) se podría justificar de la misma forma, es decir, que está induciendo un

desvío de recursos hacia la producción de compuestos defensivos, como sanguinarina, lo que refleja un

estado de “priming” propuesto por los datos obtenidos anteriormente tras la aplicación foliar (Martinez-

Medina et al., 2016).

A continuación, se estimó la producción potencial de alcaloides refiriéndolo a la biomasa de

cada planta (figuras 2.28, 2.29 y 2.30). El comportamiento de las tres cepas fue distinto. Aur 9 aplicado

radicalmente aumentó todos los alcaloides, especialmente la codeína, y la aplicación foliar producia


134

aumento moderado de codeína y tebaína, junto con una disminución de oripavina. N21.4, radical

aumento la oirpavina solamente y la aplicación foliar disminuyó todo de forma significativa, de acuerdo

con lo observado en el contenido de alcaloides por gramo. La aplicación foliar de N5.18 incrementó de

forma significativa la morfina (25,2%) y la codeína (42,7%) (figura 2.30), y la radical disminuyó teaina y

oripavina de forma significativa. Sin embargo, el aumento no se debió a una mayor biosíntesis de

alcaloides totales, sino al aumento de peso en seco de la cápsula (paja) (figura 2.30). Debido a que los

morfinanos, en especial tebaína, codeína, oripavina y morfina, se localizan en vesículas de las células

laticíferas asociadas al floema, de forma mayoritaria en la cápsula (Onoyovwel et al., 2013), el aumento

de peso seco aparece como el factor determinante del aumento de los contenidos de alcaloide (figuras

2.24; 2.27 y 2.30). Estos resultados serían compatibles con diferentes cálculos realizados, ya que cerca

del 43% de la acumulación de los alcaloides depende del incremento de la biomasa en la cápsula, de

donde el 80% es determinado por factores abióticos como luz, temperatura, nutrientes y agua, como se

refleja en los análisis multivariantes (figura 2.54) (Németh, 1998; Matyášová et al., 2011).

En base a estos resultados de invernadero, las bacterias no patógenas empleadas en el trabajo

como elicitores bióticos parecen buenos candidatos para desencadenar respuestas de mejora en la

germinación y emergencia de la planta de Papaver somniferum y además, la aplicación foliar de la cepa

N5.18 presenta resultados prometedores en el aumento del crecimiento de la planta y en el peso seco

de la cápsula, lo que resulta en una mejora del rendimiento total de alcaloides. Por todo ello, la

implementación de este sistema en ensayos de campo, fue el siguiente objetivo para confirmar la

potencialidad de estas cepas, y en especial N5.18, para aumentar la producción de morfinanos en

condiciones de campo.

Tras evaluar los resultados obtenidos en condiciones de invernadero e interpretar la

potencialidad de las cepas inoculadas en plantas de Papaver somniferum, fue necesario la evaluación de

las mismas cepas en condiciones de campo. No sería de extrañar como cepas PGPR que han demostrado

unos resultados prometedores en ensayos realizados en condiciones controladas, ya sea in vitro o en

invernadero, han disminuido su potencialidad bajo condiciones naturales en el campo, debido a la

interacción competitiva por los recursos ente la PGPR inoculada y los propios microorganismos del

nuevo ecosistema. Por lo tanto, realizar los ensayos de campo es un paso importante para evaluar la

eficacia de las cepas, y especialmente con el cultivo de Papaver somniferum, el cual se realiza bajo

condiciones naturales en campo. Por el contrario, se ha reportado que la sobreexpresión de codeinona

reductasa (COR) en plantas de adormidera resultó en un 13% de incremento en alcaloides de tipo

morfinano en ensayos de campo frente a los ensayos realizados en invernadero (Larkin et al., 2007)

Previamente a la realización de los ensayos de campo se procedió a la realización de un estudio

de compatibilidad de los fitosanitarios de uso común en el cultivo de la adormidera, con las cepas

aplicadas. Diferentes estudios han descrito como la aplicación de ciertos fitosanitarios puede

comprometer la viabilidad de cepas bacterianas de interés. También se ha observado como diversos

fitosanitarios tienen la capacidad de modificar la biodiversidad microbiana de los suelos, modificando las

Capítulo 2

135

poblaciones microbianas y su interacción con el sustrato, entre otros el fitosanitario Captan, N-

triclorometiltio-4-ciclohexeno-1,2-dicarboximida (Martinez Toledo et al., 1988; Johnsen et al., 2001;

Sáez et al., 2003; Floch et al., 2011; Jacobsen y Hjelmsø, 2014). Los ensayos determinaron

compatibilidad de los diferentes fitosanitarios con la cepa N21.4, pero N5.18 y especialmente Aur9

resultaron ser sensibles a ciertos fitosanitarios, por lo que no se aplicaron fitosanitarios en las parcelas

de experimentación.

Una vez eliminada esta variable, la selección de los momentos de aplicación de las cepas

elicitoras seleccionadas es de vital importancia, ya que existe una estrecha correlación entre el

crecimiento y el desarrollo de la adormidera con la acumulación de alcaloides. Aunque como se ha

detallado anteriormente, el cultivar de la planta y las condiciones climáticas son los principales

moduladores del contenido de alcaloides, el periodo comprendido entre el inicio del crecimiento del

tallo floral y el inicio de la floración, fase de entallado, es el periodo de mayor biosíntesis de

morfinanos, y cuando la relación tebaína/morfina se desplaza a un aumento de morfina (Németh, 1998)

(FJ. Ledesma. Comunicación personal). Por ello, se seleccionaron dos momentos de inoculación: inicio

de entallado (IE) y final de entallado (FE), en los experimentos realizados bajo invernadero y en los

experimentos de campo se ensayaron los tres posibles momentos de inoculación: inicio de entallado

(IE), final de entallado (FE) y la combinación de ambos momentos (IE/FE), split. Estos momentos de

inoculación se consideraron los más susceptibles en una posible elicitación, por parte de las cepas

inoculadas, de la planta en el contenido de morfinanos de interés. La implementación de los

tratamientos, tres cepas (Aur9, N21.4 y N5.18) y tres momentos de aplicación (IE, IE/FE y FE), en

parcelas de cultivo en el campo, obligó a realizar los tratamientos mediante inoculación foliar, que

venían respaldados por el experimento previo de invernadero.

Es importante reseñar que el momento de la aplicación de los diferentes tratamientos se realizó

durante la fase de entallado, donde la densidad de plantas estaba establecida. Por ello, no se puede

interpretar que el número de plantas/m2 sea una variable dependiente del tratamiento (figura 2.32;

2.44; 2.45; 2.59; 2.60 y 2.61), especialmente si tenemos en cuenta el remanente de semillas de la

campaña anterior, como se puso de manifiesto en los ensayos de germinación y emergencia en suelo. A

su vez, el número de plantas condiciona el número de cápsulas. En condiciones naturales Papaver

somniferum produce la formación de una cápsula principal y dos o tres secundarias. En condiciones de

cultivo una alta densidad de plantas por metro cuadrado genera la formación de una única cápsula, lo

que facilita las labores de cosecha de forma mecanizada (Bernath, 2003) (FJ. Ledesma, comunicación

personal). En los estudios realizados a lo largo de las diferentes campañas, se registró un ratio de

cápsulas/plantas comprendido entre 1,1-1,4, si bien este ratio no indica el tamaño de la cápsula. A

menor densidad de cultivo, los tamaños de las cápsulas son mayores, pudiendo generar tal peso que el

propio tallo se venza (encamado), imposibilitando su cosecha. Y en altas densidades de cultivo, los

tamaños de las cápsulas son menores, promoviendo una disminución de los rendimientos del cultivo,

debido a una competencia por los recursos entre las plantas. Sin embargo, un mayor número de


136

capsulas supone una mayor superficie para desarrollar canales laticífieros, y por lo tanto, incrementa la

producción total de alcaloides, por lo tanto, la práctica agronómica está bien diseñada para alcanzar los

objetivos de maximizar la producción.

El análisis de los datos de fluorescencia durante la segunda campaña (figura 2.41; 2.42 y 2.43), no

mostraron una mejoría de los diferentes parámetros analizados, como sí resultaron los experimentos en

condiciones de invernadero (figura 2.16; 2.17 y 2.18). La evaluación de rendimiento cuántico máximo

del PSII (Fv/Fm) del tratamiento Control, mostró un valor superior (0,92) al descrito por Maxwell y

Johnson (0,82), lo que implicaría una situación de estrés (Maxwell y Johnson, 2000). Hay que indicar que

las mediciones de campo, se realizan a mediados del mes de junio en la provincia de Albacete, donde las

condiciones ambientales son de altas temperaturas e insolación. Estas condiciones pueden afectar de

forma decisiva el correcto funcionamiento de los fotosistemas, promoviendo un efecto de fotoinhibición

en el centro de reacción del fotosistema II (Telfer, 2014).

Sin embargo, los parámetros de rendimiento y contenido de alcaloides variaron

considerablemente entre las parcelas y campañas. Estas variaciones pueden, en cierto modo, atribuirse

a diversos factores, principalmente al meteorológico, seguido de las propiedades fisicoquímicas del

suelo, densidad de las plantas, entre otros.

Al valorar los resultados durante la primera y segunda campaña, se apreció como la inoculación

con la cepa N5.18 al final del entallado, promovía un aumento del peso de la paja en las dos campañas y

en las cuatro parcelas de experimentación, siendo un incremento significativo en la segunda campaña

(figura 2.33; 2.34; 2.46 y 2.47). Fue el único tratamiento capaz de estimular el peso de la paja

independientemente de la climatología de la campaña y de la finca de cultivo. Como ya se ha

comentado, la cepa produciría una mejora en el proceso de fotosíntesis, lo que conllevaría un

incremento en la formación de fotoasimilados, como se ha registrado con Bacillus subtilis CB03 en

plantas de arabidopsis (Zhang et al., 2008), con especies beneficiosas del hongo Tricoderma sp. en

diferentes especies (Shoresh y Harman, 2008; Contreras-Cornejo et al., 2009), con Pseudomonas

fluorescens N21.4 en plantas de zarzamora (Rubus sp.) (García-Seco et al., 2013), entre otros. A su vez,

estos incrementos de los niveles de hidratos de carbono podrían estar asociados a una posible

redistribución de los mismos hacia la futura cápsula floral promoviendo su desarrollo, implicando un

aumento del peso de la cápsula. A través de modificaciones directas o indirectas en el metabolismo

energético (Zulak et al., 2008), mediante el incremento de la actividad invertasa que promueve la

degradación de la sacarosa en glucosa y fructosa (Berger et al., 2004; Lemoine et al., 2013; Rojas et al.,

2014). También puede deberse a una interacción directa por parte de la cepa bacteriana mediante la

producción de auxinas, promoviendo un incremento de la superficie radical que permitiría un aumento

de la capacidad de absorción de los nutrientes y con ello de la biomasa, especialmente en condiciones

de campo donde el aporte de nutrientes no está tan regulado como en condiciones de invernadero

(Glick, 2012; Ljung, 2013; Vacheron et al., 2013). Si bien, solo Aur9 ha demostrado la capacidad de

producir auxinas in vitro (Gutierrez Mañero et al., 2003), no se descarta que en presencia de los

Capítulo 2

137

precursores adecuados o en ciertas condiciones las cepas N21.4 y N5.18 sean capaces de sintetizarlas

(Ramos Solano et al., 2008). A su vez, el estadio fisiológico de la planta en el momento de la inoculación

puede considerarse una variable importante, ya que el inicio del entallado (IE) se caracteriza por un

estado fisiológico de la planta en el que se produce un rápido crecimiento del tallo, consumiendo gran

parte de los fotoasimilados producidos en detrimento del desarrollo de la cápsula y las semillas

(Németh, 1998). A medida que el tallo va finalizando su crecimiento, final del entallado (FE) inicio de

“gancho”, los recursos se redistribuyen a la cápsula floral para su desarrollo y “llenado”. De esta forma,

variaciones en factores que puedan afectar a estos procesos fisiológicos pueden alterar de forma muy

efectiva el rendimiento de la biomasa y consecuentemente el contenido total en alcaloides (Chung,

1987). De esta forma, se podría justificar la elongación del tallo y aumento del peso de la cápsula debido

a la cepa N5.18 en condiciones de invernadero, ya que la inoculación se produjo al inicio y al final del

entallado. Por el contrario, en condiciones de campo solo se registró el parámetro peso, pero no el de

longitud del tallo.

También es importante reseñar el efecto opuesto de N21.4 aplicado al final del entallado en el

peso de la cápsula, paja y semillas, en ambas campañas. De nuevo se vuelven a repetir los resultados

obtenidos con la inoculación foliar en invernadero. Luego se podría asociar esta situación a un efecto de

“priming”, como se describió anteriormente. En los últimos años, el cultivo de Papaver somniferum en

España ha sufrido el ataque de Peronospora arborescens, parásito obligado conocido como Mildiu, que

ha generado una perdida en el rendimiento de las últimas campañas (Landa et al., 2007; Montes-

Borrego et al., 2011). Sería interesante poder estudiar la posible respuesta defensiva del cultivo de

adormidera tras ser inoculado con N21.4 en zonas de una alta incidencia de Mildiu, y valorar el balance

energético en términos de coste/beneficio (Albrecht y Argueso, 2016; Simpson et al., 2016)

En referencia al contenido de los diferentes morfinanos de interés, en especial codeína y

morfina, el análisis de los resultados no reveló de forma evidente qué tratamiento mejoró el contenido

de morfinanos tanto en la primera como en la segunda campaña (figura 2.37; 2.38; 250 y 2.51). Al

valorar el contenido de morfinanos con la producción total de paja se apreciaron diferencias

significativas en el tratamiento realizado con N5.18 al inicio (IE) y al final del entallado (FE) en la segunda

campaña en la finca La Grajuela con un incremento significativo de morfina (figura 2.53), al igual que los

resultados de invernadero. A su vez, se apreció una tendencia a incrementar el contenido de codeína

durante la aplicación de N5.18 (FE) y Aur9 en split (IE/FE) (figuras 2.39; 2.40; 2.52 y 2.53). Y a un

descenso en el contenido de tebaína con N5.18. Esta situación se puede deber a un incremento en la

actividad o en la expresión de las enzimas implicadas en el proceso de transformación de tebaína a

morfina, a través del ramal de la codeína (figura 1.13), como se apreció en la tercera campaña. El equipo

de Facchini JP. Tras analizar el transcriptoma y el proteoma de cultivos celulares de Papaver somniferum

elicitadas con Botrytis cinerea, observaron un incremento en la expresión de enzimas implicadas en la

ruta de biosíntesis de BIAs, del cual el 65% eran enzimas hasta la formación de (S)-reticulina, el 35% en

la conversión de reticulina a sanguinarina y el 2,4% a las enzimas implicadas en morfinanos (Desgagne-


138

Penix et al., 2010). A su vez, el equipo de Unver T. utilizó metil-jasmonato (MeJa), regulador implicado

en la activación del ISR, para elicitar cápsulas de adormidera (Gurkok et al., 2014). Los análisis en la

expresión génica de la ruta de los BIAs y de sus correspondientes alcaloides, así como un amplio estudio

de la transcriptómica de la planta, registraron incrementos en la acumulación de morfina, tebaína y

noscapina, asociado a una disminución de codeína. A su vez, se observó un incremento en la

transcripción de enzimas relacionadas con la ruta BIAs, en especial NCS (PR10/Betv1) (figura 1.10) y

CNMT, enzimas relacionadas con la síntesis de (S)-Reticulina, alcaloide nodo de diferentes rutas de BIAs:

morfinanos, benzofenantridinas, tetrahidroberberinas, entre otros. También se apreció un aumento en

enzimas con actividad metiltransferasas, situación relacionada con la mayor actividad del metabolismo

de la metionina. Simultáneamente, se detectó un incremento en la expresión de transcritos implicados

en el metabolismo de hidratos de carbono, en especial movilización de sacarosa y almidón. Todos estos

experimentos indican que existen varias dianas moleculares en la elicitación, y que,

independientemente del elicitor utilizado, la zona de mayor influencia es en los precurosres de BIAs, y la

menor en los de síntesis de morfinanos, lo que contribuye a la hipótesis de que los morfinanos están

desempeñando un papel como precursores de moléculas de defensa y por lo tanto, el control estricto

de esos enzimas no es la mejor diana para aumentar la concentración de alcaloides. En este sentido,

N5.18 ha contribuido a demostrar el papel de las isoflavonas de soja como fitoanticipinas, es decir,

precursores de los verdaderos metabolitos defensivos, fitoalexinas, que son los pterocarpanos, mientras

que N21.4, demostraba que las isoflavonas eran fitoanticipinas y además, fitoalexinas (Algar et al.,

2014). Esto pone de manifiesto el enorme número de determinantes bacterianos que existen, y el

enorme abanico de estrategias que despliega la planta para defenderse de patógenos, incluso del

mismo patógeno como en el caso de la soja. Desde el punto de vista aplicado, la identificación de los

determinantes bacterianos MAMPs y sus dianas vegetales es de enorme interés para aumentar la

concentración de principios activos, bien estimulando la ruta, o bien bloqueando la degradación de la

molécula de interés, como sería de aplicación en este caso. Es decir, la identificación del gen que

conduce a la ruta divergente de la síntesis de morfina nos permitiría silenciarlo, y obtener una mayor

producción de morfinanos.

Es importante reseñar como las condiciones de temperatura y precipitación acumulada, a lo

largo del periodo de cultivo de la adormidera (Anexo I), pudieron afectar al contenido en alcaloides. La

primera campaña se consideró cálida, si bien mayo y junio se consideraron con temperaturas normales.

Por el contrario, las precipitaciones acumuladas registraron una campaña muy húmeda, con un mes de

mayo seco, junio húmedo y julio seco. Durante la segunda campaña la primavera se consideró muy

cálida y el verano cálido. Respecto a la pluviosidad, la primavera se consideró normal, con la excepción

del final de la misma que se consideró húmeda, y un inicio de verano seco (AEMET, 2016). Por todo ello,

la segunda campaña se presentó con menor pluviosidad, en especial durante los tres primeros meses

del crecimiento vegetativo, y durante el mes de junio, donde el riego se interrumpe y es donde se

produce el desarrollo, maduración y “llenado” de la cápsula, pudiendo afectar al contenido total del

Capítulo 2

139

alcaloides (Németh, 1998). Al analizar el rendimiento de alcaloides totales en las dos campañas, se

apreció una disminución significativa de 9,49% en la segunda campaña (datos no mostrados). Los

análisis de componentes principales (PCA) (figura 2.54), confirmaron como las condiciones

climatológicas fue el principal parámetro que moduló el rendimiento del cultivo, seguido de la finca de

cultivo y finalmente el tratamiento con la cepa bacteriana. Si bien, la inoculación con la cepa N5.18, al

final del entallado en las dos campañas y en las cuatro fincas de cultivo, fue el tratamiento que mostró

una tendencia a la mejora del rendimiento del cultivo, al aumentar el peso de la paja y

consecuentemente el contenido de alcaloides en especial morfina y codeína.

En la última campaña analizada, se amplió la escala del experimento y se aplicó N5.18, al final del

entallado, en una mayor superficie, una parcela de producción.

Los resultados del análisis de la fotosíntesis mostraron una mejora en el parámetro Fo en ambas

parcelas, así como en el rendimiento cuántico del PSII (ϕPSII) y el NPQ en la finca Cherrycoca (figura

2.57). De nuevo se volvieron a repetir los resultados obtenidos en invernadero (figura 2.18). Esta

situación podría desencadenar una mejora en la eficiencia fotosintética favoreciendo un incremento en

la biomasa de la planta, como se describió anteriormente.

Los resultados obtenidos en la tercera campaña mostraron una tendencia al aumento del peso

total de la cápsula, paja y semillas en ambas fincas (figura 2.62 y 2.63). Y aunque estos resultados no

fueron estadísticamente significativos se repitieron las tendencias observadas durante las campañas

anteriores, un aumento del peso de la paja en referencia al tratamiento control.

Al valorar el contenido de alcaloides se apreció una tendencia similar en ambas parcelas, un

incremento de la morfina, y un descenso de la codeína y tebaína, siendo significativos en la finca

Cherrycoca (figura 2.65 y 2.66). Esta situación podría estar relacionada con la expresión génica de las

tres enzimas encargadas de transformar tebaína en morfina, T6ODM, CODM y COR (figura 2.58). En la

finca Cherrycoca se apreció un aumento significativo de la expresión de la enzima Codeina-O-Demetilasa

(CODM). Este aumento de la expresión pudo favorecer la transformación de tebaína a oripavina, en el

segundo ramal, promoviendo una disminución de tebaína. Y en el ramal principal pudo aumentar la

transformación de codeína a morfina, disminuyendo la concentración de la codeína y aumentando los

de morfina (Beaudoin y Facchini, 2014).

Los resultados obtenidos no cumplieron con las expectativas y tras analizar los resultados se han

podido determinar dos posibles factores que hayan influido negativamente. Por una parte, la densidad

del cultivo, y por otra, se detectó una aplicación de fitosanitarios previamente a la aplicación de la cepa

N5.18. La densidad de plantas fue de más del doble, y por lo tanto, habría sido necesario una mayor

cantidad de inóculo, es decir, la dosis fue insuficiente, tal y como se ha demostrado que la densidad del

cultivo en plantas de adormidera puede alterar el rendimiento tanto en materia prima, como en el

contenido de los diferentes morfinanos, debido a una competencia por los recursos del suelo y de la luz

actínica (Chung, 1990; Muchova et al., 1993; Németh, 1998; Bernath, 2003). Asimismo, se ha observado

una disminución del número de cápsulas por planta y de tamaño de las mismas cuando se aumenta la


140

densidad de plantas/m2 10 veces (Chung, 1990). Estos estudios apoyan los resultados obtenidos, donde

en la primera campaña el número medio de cápsulas fue de 1,40 frente a 1,11 de cápsulas por planta en

la tercera campaña cuando el peso de paja/cápsula disminuyó en un 40,12% de media. Este

comportamiento de la planta en cuanto a la densidad del cultivo y rendimiento también se ha

observado en diferentes cultivos como trigo (Whaley et al., 2000), maíz (Sangoi, 2001), algodón (Carmi,

1986), arroz (Gravois y Helms, 1992). Por último, también se ha descrito que la elevada densidad de

cultivo puede promover una disminución del contenido de total de alcaloides(Laughlin, 1987; Chung,

1990), como ocurre en nuestro estudio, en el que registramos una disminución potencial de morfina de

un 2,26% entre la primera y tercera campaña en las plantas no tratadas; por lo tanto, la disminución de

rendimiento en alcaloides se traslada a los tratamientos y dado que el mecanismo propuesto es

aumentar la superficie vegetal disponible para la acumulación de alcaloides, la alta densidad de plantas

compromete el resultado.

Con respecto al segundo factor negativo, la aplicación de fitosanitarios, como se indicó

anteriormente, la aplicación de estos productos puede comprometer la efectividad de las cepas PGPR

(Martınez-Toledo et al., 1998). Por todo ello es importante realizar estudios de viabilidad de las cepas

PGPR, o en su defecto evitar el uso de fitosanitarios, en la medida de lo posible, que pudieran tener

alguna interacción negativa con los inoculantes. Aunque previo a los experimentos de campo se realizó

un estudio de compatibilidad con productos frecuentes (tabla 2.3) resultando que la cepa N5.18 era

resistente a todos los proucts salvo al Metalaxil(3,9%) + Mancozeb (64%), en la tercera campaña se

aplicaron otros productos de reciente aparición en el mercado para el cultivo en estudio, el bactericida-

fungicida Kdos (Cu(OH)2 35%) con número de registro fitosanitario #22002 (MAGRAMA); y el fungicida

Equation Pro (famoxadona 22.5% + cimoxanilo 30%) con número de registro fitosanitario #22198

(MAGRAMA). La aplicación de los fitosanitarios se realizó en la parcela Cherrycoca 12 días antes de la

aplicación de la cepa N5.18; y 8 días antes en la parcela Villalozano. Por ello, la aplicación de los

fitosanitarios, en especial Kdos al ser bactericida, pudo resultar en una disminución de la población de

la cepa N5.18, mayoritariamente en la parcela Villalozano, contribuyendo a la hipótesis de una cantidad

de inóculo insuficiente y además mermado por el fitosanitario. Los datos de fotosíntesis reflejan una

menor eficiencia de la bacteria en Villalozano, donde solo se refleja una mejora significativa del

quenching fotoquímico (φPSII), mientras que en la finca Cherrycoca no sólo mejora de forma

significativa la eficiencia máxima potencial (Fv/Fm), sino que aumenta el quenching fotoquímico y

disminuye el no fotoquímico (NPQ) (figura 2.57). Así pues, esperaríamos que este aumento en la

fotosíntesis se tradujera en un aumento en la biomasa o bien en un aumento de alcaloides. La relación

de este equilibrio en la planta se pone de manifiesto cuando se comparan los resultados de alcaloides

totales y alcaloides potenciales en cualquiera de las campañas, ya que, al referirlo a la biomasa total de

paja obtenida, el balance es aumento de morfina y codeína y disminución de tebaína y oripavina, en

general, en respuesta a la aplicación de N5.18 al final del entallado.

Capítulo 2

141

Si tenemos en cuenta la ruta de biosíntesis de alcaloides (figura 1.13) y los enzimas implicados,

podremos relacionar los cambios en el contenido en alcaloides inducidos por la bacteria N5.18 con los

cambios en expresión génica de los mismos (figura 2.58). De los alcaloides analizados, la tebaína es el

primero que se sintetiza; por este sustrato compiten dos enizmas, la tebaína-o-demetilasa, que da lugar

a oripavina, y la tebaína-6-O-demetilasa (T6ODM), para dar lugar a nopinona-codeinona. La codeinona

es sustrato de la codeinona reductasa (COR), produciéndose codeína, que a su vez es sustrato de la

codeinona-O-demetilasa, para producir morfina. Por la otra vía, una vez formada la oripavina, se

produce la morfinona y sobre ella actúa la COR produciendo morfina. Al existir dos rutas alternativas, es

normal que los cambios en la concentración de alcaloides estén relacionados, y una disminución en

tebaína y codeína o tebaína y oripavina, se correspondan con un aumento en la morfina, ya que este es

el producto final; esta es la tendencia de los alcaloides cuando se inoculan con N5.18. Los enzimas

analizados reflejan una rama de la ruta, y el efecto coordinado de T6ODM, COR y CODM, debería

resultar en un aumento de morfina. Las 3 se ven estimuladas tanto en Villalozano como en Cherrycoca,

aunque sólo la CODM aumenta su expresión de forma significativa bajo la influencia de N5.18. Este

efecto a nivel genético queda reflejado en el contenido potencial de alcaloides, con disminuciones

significativas en el contenido potencial de codeína y tebaína en Cherrycoca; la mínima disminución no

significativa de oripavina indica que la ramificación sobre la que actúa la bacteria es la de tebaina-

codeina-morfina. Sin embargo, el aumento en morfina no es significativo, lo que apunta al ya

mencionado hecho de que los alcaloides estarían desempeñando un papel como fitoanticipinas, para

transformarse en otros compuestos de defensa tipo sanguinarina, que sería la molécula con un papel

fisiológico. Al transformarse en otro compuesto, el incremento en morfina no es tan acusado.

Por otra parte, los análisis de expresión génica se han realizado en las hojas, mientras que el contenido

en alcaloides se ha determinado en las cápsulas, lo que sugiere que la síntesis de alcaloides que se

acumulan en las capsulas también está ocurriendo en hojas, y que los productos se traslocan hacia las

zonas de acumulación, como ya se ha demostrado en otras especies vegetales diferentes como la mora

(Gutierrez Albanchez et al., 2017).

En base a la hipótesis planteada, la alternativa biotecnológica para mejorar el contenido en

alcaloides en cultivos de Papaver somniferum pasaría por identificar los enzimas implicados en la

transformación de morfina en otros compuestos, para posteriormente, bloquearlos con las técnicas

disponibles como el silenciamiento génico, microRNAs, CRISPR o cualquier otra técnica que sirva para

alcanzar dicho objetivo.

En conclusión, de los 3 agentes biológicos ensayados, dos de ellos, Aur9 y en especial N5.18, han

demostrado la capacidad de estimular el contenido alcaloides totales de Papaver somniferum,

aumentando la cantidad de biomasa de la materia prima la paja de la adormidera en condiciones de

campo. Por ello, sería deseable la realización de una cuarta campaña, para poder repetir la inoculación

de la cepa N5.18 al final del entallado, bajo unas condiciones de cultivo determinadas.


142

Capítulo 2

143

2. 6 Conclusiones

De las diez cepas ensayadas, Chryseobacterium balustinum (Aur9), Pseudomonas fluorescens

(N21.4) y Stenotrophomonas maltophila (N5.18), aceleraron el proceso de germinación y

emergencia de semillas de Papaver somniferum en condiciones in vitro, aunque solo N5.18

aceleró la emergencia en condiciones de baja temperatura y en presencia de una capa seca

superficial del sustrato, “self-munching”.

En condiciones de invernadero, la aplicación de las bacterias a nivel radicular estimula la

producción de semillas en detrimento del contenido de alcaloides, mientras que la aplicación

foliar favorece el desarrollo de la “paja” de adormidera. Sólo Chryseobacterium balustinum

(Aur9) y Stenotrophomonas maltophila (N5.18) estimulan el contenido potencial en alcaloides

En campo, el momento de aplicación del tratamiento bacteriano (IE, Split, FE) condiciona la

producción potencial de alcaloides y el momento adecuado depende de la bacteria y de

factores ambientales. Considerando todos los factores de variación Stenotrophomonas

maltophila N5.18 aplicada al final del entallado era el tratamiento más eficiente para aumentar

el contenido en morfinanos.

La cepa Stenotrophomonas maltophila N5.18 mejora la eficiencia fotosintética de Papaver

somniferum, mejorando el quenching fotoquímico (φPSII) y disminuyendo el quenching no

fotoquímico (NPQ). Esta mejora se traduce en un incremento en el peso de las cápsulas o en un

incremento de alcaloides o en la mejora de ambos.

La cepa Stenotrophomonas maltophila N5.18 activa la expresión génica de la enzima

codeinona-O-demetilasa (CDMR), produciendo una disminución en los alcaloides tebaína y

codeína en favor del aumento de morfina. Sin embargo, el aumento de morfina no es

equivalente, por lo que se propone una derivación metabólica de este alcaloide hacia

metabolitos con otras funciones, como la defensa.

La cepa Pseudomonas fluorescens N21.4 aplicada al final del entallado afecta de forma acusada

a la fisiología de la planta comprometiendo su crecimiento y disminuyendo el contenido en

alcaloides, lo que indica que es capaz de inducir un estado de “priming” en Papaver

somniferum, apoyando el posible papel de estos alcaloides como fitoanticipinas.

En base al posible papel fisiológico propuesto para los morfinanos, se plantea como alternativa

biotecnológica para la mejora del contenido en alcaloides en adormidera la identificación de los

genes responsables de la transformación de morfina en otros metabolitos para conseguir su

bloqueo y así aumentar el rendimiento agronómico.

III. Estudio metagenómico del microbioma de

suelos rizosféricos de cultivo de Papaver

somniferum y Aislamiento de bacterias con

potencial PGPR

III. Estudio metagenómico del microbioma de suelos rizosféricos de cultivo de Papaver somniferum y Aislamiento de bacterias con

potencial PGPR

146

3. Aislamiento de bacterias con potencial PGPR y Estudio metagenómico de

suelos rizosféricos de cultivo de Papaver somniferum

3.1 Introducción

Según los datos disponibles por la Organización de las Naciones Unidas (ONU), la población

mundial en el año 2014 se estimó en 7.265.786 millones de habitantes (ONU, 2016). Esta población se

irá incrementando según las previsiones realizadas en el 2015, por ello en el 2030 se espera una

población de 8.501.000 millones de habitantes, y para el 2050 la población mundial se habrá

incrementado hasta los 9.725.000 millones de habitantes (ONU, 2015). Uno de los retos para el futuro

será el poder alimentar a toda la población mundial. Según la FAO, será necesario aumentar la

producción de alimentos en un 70% (FAO, 2009). La producción anual de cereales habrá que

incrementarla en 900 millones de toneladas, mientras que la producción de carne debería

incrementarse hasta los 470 millones de toneladas, 200 millones de toneladas más que la actualidad,

según el modelo de alimentación actual.

A su vez, se estima que la población mundial mayor de 60 años será del 22%, con excepción de

África (figura 3.1), debido a un incremento en la esperanza de vida (ONU, 2015).

Figura 3.1 Distribución de la edad de la población en los diferentes continentes durante el año 2015 y la

estima para el año 2050 (ONU, 2015)

En Europa, la población en 2015 fue de 738,4 millones de habitantes en Europa, con un 24% de la

población mayor de 65 años. Para el año 2050 se estima una población de 706,8 millones de habitantes,

Capítulo 3

147

con un 30,3% de población mayor de 65 años (ONU, 2015). Esta situación se debe a una baja tasa de

fertilidad dentro de la Unión Europea, con una media de 1,55 nacimientos por mujer en 2013, estando

muy lejos del 2,1 considerada la tasa de remplazo (UE, 2015). Este aumento de la población mundial,

asociado a un mayor envejecimiento implicará una mayor tasa de morbilidad, como se indicó en la

introducción general de la presente memoria. Por lo que el uso de medicamentos y en especial el uso de

analgésicos, como la morfina, para tratar el dolor, presentará una elevada demanda, como ya sucede en

la actualidad (INCB, 2015).

Por todo ello, es necesario incrementar y mejorar los rendimientos de los cultivos relacionados

con la alimentación y con la salud humana. Este reto deberá alcanzarse afrontando la escasez de

recursos naturales, los efectos del cambio climático y con unas prácticas agrícolas que respeten el medio

ambiente (Vermeulen et al., 2012). Esta prioridad es uno de los objetivos específicos del programa

Marco de investigación e innovación de la Unión Europea, a través del plan Horizonte 2020. Ya que en el

punto 2.1.1 del citado plan se pretende “Incrementar la eficacia productiva y hacer frente al cambio

climático al tiempo que se garantizan la sostenibilidad y la capacidad de recuperación” de los sistemas

agrícolas (Horizonte 2020, 2016). A su vez, en 2009 el Parlamento Europeo aprobó la Directiva

2009/128/CE y el Reglamento (CE) nº 1107/2009, por la que se establece el marco de la actuación

comunitaria para conseguir un uso sostenible de los fitosanitarios y el reglamento de su

comercialización, limitando el uso de los mismos (MAGRAMA, 2016). Debido a esta situación, en junio

de 2016 el parlamento europeo aprobó la resolución “Soluciones tecnológicas para una agricultura

sostenible en la Unión (2015/2225(INI))” , donde en su punto O se incluye “Considerando que la ciencia

del suelo nos muestra que los suelos vivos y sanos alimentan y protegen los cultivos gracias a especies

beneficiosas que los defienden de los patógenos y las plagas, y además, les aportan nutrientes y agua a

cambio de los azúcares que exudan sus raíces; considerando que las prácticas agrícolas pueden afectar

negativamente a la calidad biológica, química y física de los suelos, con repercusiones como la erosión

de los suelos, la degradación de sus estructuras y la pérdida de fertilidad” resultó en las siguientes

recomendaciones, entre otras:

“39. Opina que las sustancias de bajo riesgo, incluidas las alternativas no químicas a los

productos fitosanitarios, como los controles biológicos, deben ser objeto de una evaluación con carácter

prioritario por los Estados miembros ponentes y la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA)

para contribuir a alcanzar los objetivos de la Directiva 2009/128/CE en lo relativo a la gestión integrada

de plagas y el uso sostenible de los plaguicidas, especialmente para el uso de los productos en cultivos

menores o especializados;

40. Subraya que los agricultores necesitan contar con más herramientas para proteger sus

cultivos y decidir cuáles serán las medidas más eficaces para ello; exhorta, por tanto, a una utilización

más generalizada de las distintas alternativas existentes a los plaguicidas tradicionales, incluidos los

bioplaguicidas, en el marco de la gestión integrada de plagas, y pide que se redoblen los esfuerzos

destinados a desarrollar alternativas más rentables, apoyando la investigación de campo y


potencial PGPR

148

documentando en mayor medida las alternativas no químicas y las medidas de bajo riesgo, así como los

plaguicidas más respetuosos con el medio ambiente”

En esta línea, en las últimas décadas se han redoblado esfuerzos en el estudio de rizobacterias

con capacidad PGPR, y está demostrado que su uso puede resultar en una mejora del crecimiento de la

planta, su nutrición y su salud, como se ha indicado en la introducción general de la presente memoria

(Lugtenberg y Kamilova, 2009; Lucas et al., 2014; Chauhan et al., 2015; Garcia-Seco et al., 2015). Como

resultado de estos estudios, se ha incrementado la comercialización de algunas especies como

Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter, Klebsiella, Azobacter, Variovorax, Azosprillum y Serratia que han

mejorado el rendimiento de diversos cultivos agrícolas (Glick, 2012; Vejan et al., 2016). Por todo ello, el

aislamiento, análisis, selección y aplicación de rizobacterias con capacidad PGPR, aparece como

alternativa que contribuya a la mejora de los cultivos, en unas condiciones de recursos cada vez más

limitados (Heinze et al., 2015), de forma segura, en contexto con unas normas regidas por la Unión

Europea.

Según lo expuesto anteriormente, la aplicación de diversas cepas PGPR podría resultar en una

mejora de los cultivos agrícolas. Sin embargo, es necesario tener en cuenta que la planta no vive en un

ambiente esteril sino que mantiene una relación constante con el medio, y más directamente con el

suelo y los microorganismos que lo habitan, el conocido microbioma. Además, para ejercer su efecto, las

PGPR inoculadas deben de ser capaces de establecer una relación con la planta y también deben

colonizar la rizosfera de una forma respetuosa con las comunidades existentes para poder ejercer su

efecto beneficioso sobre la planta. Está demostrado que una cepa con buen potencial beneficioso puede

dejar de ejercerlo (Ramos et al., 2003a), dependiendo del suelo en el que crezca dicha especie (Ramos et

al., 2003b) y esta falta de efecto se debe a que provoca cambios muy acusados en las comunidades

existentes en dicho suelo que perduran a lo largo del tiempo. El estudio de las comunidades microbianas

que habitan la rizosfera mediante las nuevas metodologías de secuenciación masiva (NGS) (Loman et al.,

2012), podría ayudarnos a entender las complejas relaciones existentes entre los tres elementos de la

rizosfera. La “metagenómica” se define como el análisis del ADN obtenido de comunidades microbianas

procedentes de diversos ecosistemas sin la necesidad de aislar y cultivar los componentes de dicha la

comunidad. La aparición de la metodología de secuenciación masiva o next-generation sequencing

(NGS), ha revolucionado el campo de la ecología microbiana. La secuenciación masiva de marcadores

genéticos, como el gen rrs (16S ARNr), ha permitido un mayor conocimiento de la estructura de los

sistemas. A su vez, esta distribución taxonómica se puede asociar con variables ambientales específicas

del ecosistema de estudio, ayudando a entender las interacciones existentes entre la comunidad

microbiana, el ecosistema y todo ello bajo unas condiciones ambientales específicas del sistema. El

estudio de las comunidades microbianas, conocido como microbioma, está demostrando el papel que

juegan dichas comunidades en la modulación de la fisiología tanto en animales (Amirkia y Heinrich,

2014; Schutz et al., 2014), como en plantas (Berendsen et al.; Bric et al., 1991; Unno y Shinano, 2013;

Capítulo 3

149

Bakker et al., 2013). Los primeros estudios se centraron en ecosistemas tan diferentes como una mina,

la flora intestinal humana y el mar de los Sargazos, pero cualquier ecosistema microbiano puede ser

estudiado (Oulas et al., 2015). Por lo tanto, es recomendable conocer la diversidad biológica de una

determinada especie vegetal, puesto que nos dará información valiosa de la estructura y diversidad

biológica, de las especies predominantes, que podría ser interpretada a la luz de los efectos registrados.

Por otra parte, este planteamiento se alinéa con la iniciativa internacional del microbioma de

plantas (Busby et al., 2017). Diversos grupos plantearon la necesidad de estudiar microbiomas de

distintas plantas de interés agronómico a nivel mundial, con el fin de proponer uno o varios modelos de

microbioma general, para poder manejarlo, dentro del marco dictado por la ONU. En el caso de la

adormidera, estaríamos contribuyendo con información de un “cultivo huérfano” debido a la limitación

de la supercifie de cultivo y el fuerte control del mismo por parte de las administraciones. Especialmente

relevante en un cultivo minoritario de gran importancia farmacológico y social como es Papaver

somniferum.

3.2 Plan de trabajo y objetivos

A la vista de las necesidades del cultivo, el potencial de las PGPRs y el marco regulativo existente,

nos planteamos los siguientes objetivos:

1. Conocer la diversidad biológica y biodiversidad de las comunidades rizosféricas de Papaver

somniferum en dos ubicaciones, en parcelas de producción.

2. Aislar e identificar cepas especializadas cultivables del mismo material, caracterizando su

potencial PGPR in vitro e in vivo para poder desarrollar productos biológicos específicos para este

cultivo.

3.3 Materiales y Métodos

Zonas de muestreo

El aislamiento de bacterias y ADN se llevó a cabo en la rizosfera de Papaver somniferum en dos

parcelas de cultivo durante la 2ª campaña. Estas parcelas se localizaron en la finca Casa las Torres, en el

término municipal de Barrax provincia de Albacete, y en la finca Casa de la Ventilla Malpica del Tajo,

Toledo (Figura 3.2).


potencial PGPR

150

Figura 3.2 Localización de las parcelas (área rosa) donde se realizaron los muestreos de la rizosfera de

cultivo de Papaver somniferum. a) Término municipal de Barrax (Albacete). b) Término municipal

Malpica de Tajo (Toledo) (SIGPAC, 2014)

El término municipal de Barrax se caracteriza por ser eminentemente agrícola. En la actualidad

la accesibilidad al agua ha convertido un 40 % de las hectáreas cultivables en prósperas tierras de

regadío donde los cultivos principales son el maíz, la alfalfa y la remolacha. El 60 % restante de cultivos

de secano está dedicado en su práctica totalidad por cereales, cebada y trigo (Barrax, 2014). El clima de

la región está clasificado como Bsk, clima seco estepa fría, según la clasificación de Köppen (Nunes,

2011). La finca Casas las Torres es una parcela donde durante los últimos años se ha cultivado

adormidera, Papaver somniferum, en condiciones de regadío. Se caracteriza por presentar suelos Franco

arcillosos arenoso, calizos y medio en materia orgánica (tabla 3.1).

El término municipal de Malpica de Tajo, al igual que el municipio de Barrax, es principalmente

agrícola, mayoritariamente cereal, olivar y cultivo de regadío. El clima de la comarca está clasificado

como Csa, templado con verano caluroso seco (Nunes, 2011), si bien la finca de muestreo se encuentra

en una vega del río Tajo, por lo que se aprecia un aumento en la humedad relativa (J. Seseña,

comunicación personal). La elevada humedad asociada con temperaturas suaves favorece la presencia

del hongo Mildiu (Peronospora arborescens y P. cristata) en los últimos años, principal enfermedad de

este cultivo en España (Landa et al., 2007). La parcela Casa de la Ventilla cultiva adormidera en

condiciones de regadío y presenta un suelo caracterizado por ser arcilloso, calizos y medio en materia

orgánica (tabla 3.1).

Los análisis fisicoquímicos del sustrato de las parcelas de muestreo se resumen en la tabla 3.1

Capítulo 3

151

Tabla 3.1 Caracterización de los suelos procedentes de las zonas de muestreo.

Barrax (Ab) Malpica de Tajo (To)

Tamaño partícula

Arena (%) 60 22.5

Limo (%) 20 22.5

Arcilla (%) 20 55

Textura (USDA) Franco arcillosos arenoso Arcillosa

pH 8,56 8,38

CE (mS/cm) 0,43 0,25

Materia orgánica total (%) 2,57 1,86

Nitrógeno total (%) 0,11 0,11

Relación C/N 14 9,81

Fósforo asimilable (ppm) 35 9,4

Potasio asimilable (ppm) 269,10 584,67

Muestreo de rizosferas

En el momento del muestreo el cultivo de P. somniferum ambas ubicaciones presentaron un

ligero desfase, en Barrax inicio del entallado, mientras que en Malpica del Tajo se encontraba al final de

entallado. En el centro de cada parcela de cultivo se definieron tres puntos, siendo cada uno una réplica.

En cada réplica se seleccionaron tres puntos distanciados dos metros, donde se cogieron 4 plantas por

punto. Las plantas se conservaron en frío durante su traslado al laboratorio, donde se procedió a la

separación del suelo rizosférico. Se recogió y mezcló el suelo íntimamente asociado a las raíces de las

diferentes plantas que conformaban una réplica, para el posterior aislamiento de rizobacterias y

extracción del ADN total de la rizosfera según las objetivos planteados (Lucas et al., 2014).

Diseño experimental

A continuación, se presenta un esquema del diseño experimental general (figura 3.3).


potencial PGPR

152


detallan en cada apartado.

Estudio metagenómico del microbioma rizosférico de Papaver somniferum

El diseño experimental de este experimento se resume en la figura 3.4 y se describe a

continuación.

Figura 3.4 Diseño experimental. Estudio metagenómico de la biodiversidad de la rizosfera de Papaver

somniferum de dos zonas de muestreo

Extracción del ADN total de la rizosfera

El aislamiento del ADN total de la rizosfera se realizó mediante el Kit " PowerMax® Soil DNA

Isolation Kit” (MoBio), según las indicaciones del fabricante. Seguidamente se procedió a la

cuantificación y evaluación de las muestras mediante el espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo

Scientific, USA). Los valores se indicaron en ng/μl y la calidad de la muestra se evaluó en base a la

relación de las absorbancias a las longitudes de onda 260 y 280. La integridad del ADN se verificó por

electroforesis en gel de agarosa al 0,7% (p/v) en tampón Tris-Acetato-EDTA (TAE), teñidos mediante

Rizosfera

Muestreo: Malpica de Tajo (Toledo)Barrax (Albacete)

Estudio Metagenómico de Biodiversidad

Aislamiento e identificación de cepas con capacidad PGPR

Plantación Papaver somniferum

Aislamiento de ADN total

Plataforma 454

Pirosecuenciación

(Metagenómica)

Estudio metagenómico dos zonas de muestreo

(MOTHUR; SILVA; KRONA)

Índices de Biodiversidad

Capítulo 3

153

GelredTM (Biotium). Las bandas se visualizaron con luz ultravioleta en analizador de imágenes

GelDoc2000TM 170-8126 (Biorad). Una vez confirmados los parámetros de calidad necesarios de las

muestras de ADN tras lo cual se conservaron a -20ºC, para su posterior estudio metagenómico.

Secuenciación masiva mediante pirosecuenciación 454 GS FLX+ Titanium (Roche) del gen rrs (ADNr

16S) de muestras de ADN total de la rizosfera.

Preparación de librerías

Previo a la secuenciación se construyeron dos librerías, mediantes cebadores específicos

357F/926R (357F - CCTACGGGAGGCAGCAG, 926R - CCGTCAATTCMTTTRAGT), que fueron utilizadas en el

proceso de secuenciación. Cada una de estas librerías se marcó independientemente con un

identificador molecular (MID), lo que permitió el reconocimiento de las secuencias provenientes de una

misma librería al realizar los análisis bioinformáticos posteriores. Cada una de los amplificados se

cuantificó individualmente para conocer la cantidad exacta de DNA amplificado usando el sistema

Quant-iTTM (Invitrogen). Seguidamente se ajustó la equimolar de las dos librerías para su usó en la

secuenciación. Con ello se obtuvo una cantidad equitativa de secuencias para cada una de las muestras

que evite desviaciones en las conclusiones.

Secuenciación masiva

La secuenciación masiva de la región hipervariable V3-V5 del gen rrs (ADNr 16S) de muestras de

ADN total obtenidas de la rizosfera de los muestreos realizados en Albacete y Toledo, se realizó

mediante pirosecuenciación con la plataforma 454 GS FLX+ Titanium de Roche, a través de la empresa

“Life Sequencing” (Parc Científic Universitat de Valencia, Paterna. Valencia) (Baker et al., 2003).

Análisis bioinformáticos

Una vez obtenidos los archivos en formato “*.sff” (standar flowgram format), tras la

secuenciación masiva de la región V3-V5 del 16S, se procedió al tratamiento de las secuencias, para la

eliminación de los adaptadores utilizados, así como la selección de secuencias mayores de 250 nt. Para

ello se utilizó el paquete informático de libre acceso MOTHUR 1.35.0 (Schloss et al., 2009).

Seguidamente se procedió a la realización del alineamiento de las secuencias, cribado del alineamiento

y matriz de distancias mediante el mismo programa

Para la anotación taxonómica de las secuencias se utilizó la base de datos SILVA “rRNA

Database Project” V128 (https://www.arb-silva.de) (Quast et al., 2013). Este programa primero alinea

cada secuencia usando la herramienta SILVA Incremental Aligner (SINA V1.2.10) (Pruesse et al., 2012),

contra la secuencia de referencia SILVA SSU rRNA SEED (Quast et al., 2013). Descartando las secuencias

con más de un 2% de ambigüedades o de homopolímeros. Seguidamente se lleva a cabo un control de

calidad para eliminar posibles contaminaciones y artefactos junto con las secuencias con un


potencial PGPR

154

alineamiento de baja calidad, una identidad de alineamiento menor de 50 y una puntuación menor de

40 según SINA. A continuación, se identifican las secuencias con una similitud del 100% (redeplication) y

se agrupan en “Operational Taxonomic Units” (OTU) similar, mediante la herramienta “cd-hit-est”

(version 3.1.2; http://www.bioinformatics.org/cd-hit) (Li y Godzik, 2006). La clasificación de los

diferentes OTUs se realiza mediante una búsqueda en BLAST contra la base de datos de SILVA 128

aplicando los parámetros estándares (Camacho et al., 2009). Las secuencias que no son clasificadas o

que según la función: (% 𝑖𝑑𝑒𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎)+ (% 𝑑𝑒 𝑎𝑙𝑖𝑛𝑒𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜)

2 son menores del 93%, se asignan al

grupo “No Relative” (Ondov et al., 2011).

Diversidad y estructura

Análisis de biodiversidad

El calculó de la diversidad se realizó mediante el programa MOTHUR 1.35.0, calculando los

siguientes parámetros.

Riqueza de especies (S):

Este parámetro indica el número de unidades taxonómicas (OTUs) (n) que conforman la

población (N).

Curvas de rarefacción:

La riqueza de las muestras depende del tamaño de la muestra, por ello las curvas de rarefacción

calculan el número esperado de OTUs, si todas las muestras fueran reducidas a un tamaño estándar

(n<N) (Sanders, 1968; Hurlbert, 1971).

𝐸(𝑆) = ∑ ⌊1 −

(𝑁 − 𝑁𝑖)𝑛⁄

𝑁𝑛⁄

⌋

𝑖=1

E(S): Número esperado de especies

N: Número total de individuos en la muestra

Ni: Número en la iésima especie

n: Tamaño de la muestra estandarizado

Índice de Chao:

El índice de Chao es un estimador del número de OTUs “raros”, poco frecuentes, en la muestra

(Chao, 1984).

Capítulo 3

155

𝐶ℎ𝑎𝑜 1 = 𝑆 +𝑓1

2

2𝑓2

S: Número de OTUs en una muestra

f1: Número de OTUs representados por un solo individuo “singletons”

f2: Número de OTUs representados por dos individuos “doubletons”

Análisis de la estructura:

Un segundo concepto de diversidad de especies es la heterogeneidad de la comunidad, que

relaciona la riqueza de las especies presentes con la abundancia relativa o la proporción de las mismas

en la comunidad.

Índice de Shannon-Wiener

Este parámetro representa la biodiversidad específica de una comunidad (Krebs, 1986). El

índice combina dos componentes de la diversidad el número de especies presentes y su abundancia

relativa reflejando la heterogeneidad de una comunidad

𝐻 = − ∑(𝑝𝑖)(log2 𝑝𝑖)

𝑖=1

H: Índice de diversidad del sistema

pi: Proporción del total de la muestra que corresponde a la especie i (ni/N)

Para la representación jerárquica se utilizó la aplicación informática libre Krona

(http://krona.sourceforge.net), que crea una ilustración completa del análisis clasificatorio de los

diferentes OTUs (Ondov et al., 2011).

Para la elaboración de los árboles filogenéticos se utilizó el software de libre acceso MAFFT

“Multiple Alignment using Fast Fourier Transform” http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/, y de la

aplicación (Phylo.io 1.0.0).


potencial PGPR

156

Aislamiento e identificación de cepas con potencialidad PGPR

El diseño experimental del objetivo 2 se muestra en la figura 3.5 y se describe a continuación.

Figura 3.5 Diseño experimental. Se aislaron todas las posibles rizobacterias de las tres réplicas de cada

muestreo. Se realizó estudio in vitro del potencial de promoción del crecimiento vegetal de las cepas

bacterianas y finalmente se realizó un análisis genético de las cepas mediante el gen del 16S (rrs)

El aislamiento de las rizobacterias de la rizosfera de adormidera se realizó partiendo de dos

gramos de suelo rizosférico de cada réplica. Se homogenizó el sustrato con 20 mL 10mM MgSO4,

mediante agitación a 150 rpm durante 30 min. Seguidamente se realizaron diluciones seriadas 1:10

desde 10-1 a 10-9 con 10mM MgSO4 y se procedió a la siembra en placas de PCA (Conda, España). Tras

una incubación de 24 horas a 28°C se aislaron colonias independientes de aquellas placas que

presentaban crecimiento abundante y colonias separadas, con el fin de seleccionar colonias de

crecimiento rápido (Barriuso et al., 2005; Lucas et al., 2014). La nomenclatura utilizada para la

identificación de las cepas seleccionadas fue la siguiente: P (Papaver somniferum); seguido de una M

(Malpica) o A (Albacete), un número del 1 al 3 para indicar la réplica, y finalmente el número

correspondiente a la cepa aislada. Tras la identificación se procedió al resembrado de todas las colonias

bacterias aisladas para su posterior conservación en glicerol al 20% a -80°C y estudio posterior.

Estudio in vitro del potencial de promoción del crecimiento vegetal de las cepas bacterianas

Una vez aisladas las rizobacterias de la rizosfera se realizaron diferentes pruebas para

comprobar su potencial PGPR: producción de sideróforos en medio CAS (Alexander y Zuberer, 1991),

producción de fosfatasas (de Freitas et al., 1997), producción de quitinasas (Frändberg y Schnürer, 1998)

y producción de auxinas (Sergeeva et al., 2007). La composición y obtención de los médios específicos se

detallan en el anexo II.

Aislamiento de rizobacteriasPruebas

potencialidad PGPR

Productoras de sideróforos

Solubilizadoras de fosfato

Productoras de quitinasas

Productoras de auxinas

Identificación cepa: 16S

Capítulo 3

157

Producción de sideróforos (Alexander y Zuberer, 1991)

La detección de cepas capaces de producir sideróforos se realizó según Alexander y Zuberer (1991). Se

determinó el halo de decoloración, midiendo el diámetro del halo. Se consideraron positivas aquellas

con un diámetro superiores a 5mm (Ramos-Solano et al., 2010b).

Solubilización de fosfato: (de Freitas et al., 1997)

Para poner de manifiesto la capacidad de producir fosfatasas (EC 3.1.3.16) se cultivaron las

bacterias en el medio descrito por De Freitas et al. (1997) (PDYA) con fosfato cálcico precipitado. Se

midió el halo de hidrólisis en mm alrededor de las colonias tras 24 h y 72 h. Se consideró como positivo

la presencia de halo de hidrólisis, mayor de 2 mm.

Producción de quitinasas (Frändberg y Schnürer, 1998)

La producción de enzimas quitinasas (EC 3.2.1.14) se valoró según la degradación de quitina

coloidal (Rodriguez-Kabana et al., 1983) según describió Frändberg y Shcüner (1998). La presencia de

quitinasas bacterianas hidroliza la quitina coloidal insoluble en sus componentes oligo y monoméricos,

formando un halo de hidrólisis en el medio de cultivo, considerándose positivos los halos mayores de

2mm.

Producción de auxinas (Bric et al., 1991)

Para determinar la producción de auxinas (AIA) por parte de las bacterias, se procedió según

Bric et al. 1991 con modificaciones de Sergeeva et al. 2007. Para ello, tras crecer de forma aisladas las

cepas bacterianas, el medio de cultivo se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Hybond

Amersham, GE Healthcare). A continuación, se reveló con el reactivo de Salkowski, y se incubó una hora

a temperatura ambiente en oscuridad. La formación de una mancha rojiza-anaranjada manifestó la

producción de auxinas, considerándose positiva, la presencia de la mancha.

Estudio genético de las cepas potencialmente promotoras del crecimiento vegetal

Aislamiento del ADN genómico de la bacteria

Las bacterias que presentaron una o más actividades PGPR fueron seleccionadas para su

identificación. Para ello, cada cepa fue incubada en medio de caldo nutritivo (Conda) en agitación a 28ºC

16h. El aislamiento de su ADN genómico se realizó mediante el kit comercial Ultraclean™ Microbial DNA

Isolation Kit (MoBio), según las indicaciones del fabricante. La extracción e integridad del ADN se verificó

por electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) en tampón Tris-Acetato-EDTA (TAE), teñidos mediante

GelredTM (Biotium). Las bandas se visualizaron con luz ultravioleta en analizador de imágenes

GelDoc2000TM 170-8126 (Biorad).


potencial PGPR

158

Amplificación del gen rrs (ADNr 16S)

Mediante la técnica de PCR “Polimerase Chain Reaction” se amplificó la región correspondiente

a 1500 pb. del gen rrs que codifica al ARNr 16S, mediante los cebadores E8F/E1541R: Forward 5’-

AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’ y Reverse 5’-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3’ (Edwards et al.,

1989; Baker et al., 2003). La mezcla de reacción se realizó a una concentración de 0,5µM de cada

uno de los cebadores, en una reacción de 25 L, 1X de 10X PCR Buffer (Biotools), 2,5 mM MgCl2, 250

M de cada DNTP, 1,25 U de ADN polimerasa (Biotools DNA Polymerase), 100 ng de ADN bacteriano.

La amplificación se realizó en un termociclador GeneAmp 2700 (Applied Biosystems) con las

siguientes condiciones: 94ºC 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 ºC 30 s, 50 ºC 45 s y 72 ºC 1 min,

finalizando con 7 min a 72 ºC.

Los productos de PCR se comprobaron en gel de agarosa al 1% (p/v) en tampón Tris-Acetato-

EDTA (TAE) teñidos mediante GelredTM (Biotium) 1X y se visualizaron en un analizador de imagen

GelDoc 2000TM 170-8126 (BioRad).

Secuenciación y análisis del ADN amplificado

Una vez comprobada la amplificación, los productos de PCR se aislaron y purificaron mediante

UltraClean™ PCR Clean-up DNA Purification Kit (MoBio), según instrucciones del fabricante.

Seguidamente se procedió a la secuenciación mediante un equipo Applied Biosystems 3730xl DNA

Analyzer (Macrogen Europe). Se utilizaron los mismos cebadores empleados en la amplificación, para

obtener una secuencia de 1500pb.

Las secuencias pertenecientes al gen rrs (16S) fueron corregidas y ensambladas con el

programa Bioedit Sequence Alignment 7.2.5., y analizadas mediante la aplicación nBLAST (NCBI), para su

identificación.

Análisis filogenético de las secuencias

Una vez identificadas las cepas se procedió a la realización del alineamiento de las secuencias

mediante el programa MAFFT versión 7 (Katoh y Standley, 2013).

Seguidamente se realizó la construcción de un árbol filogenético, por muestreo, utilizando el

programa MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013), aplicando el algoritmo neighbor-joining, con unos valores de

bootstrap calculados a partir de 500 repeticiones, utilizando las opciones estándar del software MEGA.

Una Secuencia del Phylum Cyanobacteria (NR 117712.2) se utilizó como outgrup.

Capítulo 3

159

Estudio in vitro del potencial de cepas bacterianas en la promoción de la germinación de

semillas de Papaver somniferum

Una vez identificadas las cepas aisladas con potencial PGPR, se procedió a la selección de cepas

representativas de los diversos géneros con capacidades PGPR de interés para la evaluación de la

mejora de la germinación de semillas de adormidera en condiciones in vitro. Esta selección se realizó en

base a dos criterios, abarcar la máxima diversidad genética, así como la selección de rizobacterias con

mayor potencial PGPR.

El diseño experimental se resume en la figura 3.6. y se describe a continuación.


adormidera cultivadas en condiciones in vitro.

Para evaluar la potencialidad de las cepas PGPR seleccionadas en promover la germinación, se

procedió de forma similar a la realizada en el objetivo 1 del capítulo 2. Cada cepa se ensayó en un

experimento que se realizó por duplicado, con los siguientes tratamientos: cepa bacteriana (108 ufc/mL

MgSO4 10 mM); medio de cultivo libre de bacteria al 5% MgSO4 10 mM; medio de cultivo libre de

bacteria al 10% MgSO4 10 mM; y finalmente el tratamiento Control (MgSO4 10 mM). Se utilizaron un

total de 90 semillas por tratamiento, constituidas por 3 réplicas de 30 semillas cada una. Las semillas se

esterilizaron y se sumergieron en los respectivos tratamientos durante 30 minutos. A continuación, se

pusieron en placas y se incubaron en cámaras de cultivo durante 5 días, SANYO (Growth Cabinet MLR-

350H), bajo condiciones controladas de temperatura, 20°C, humedad relativa del 80% y con un

fotoperiodo de 14/10 horas luz/oscuridad respectivamente, con una intensidad lumínica de 350 µE/m2s.

Se valoró la germinación diariamente como número de semillas germinadas por día; los resultados se

expresan como porcentaje de germinación acumulado.

Esterilización

Cámara de cultivo


Tratamiento

Inmersión 30’

• Rizobacteria 108 ufc/mL



• Control


48h; 72h; 96h; 120h

Inoculación


potencial PGPR

160

Análisis estadístico

La comparación estadística de las dos parcelas se llevó a cabo con el sowtfare S-LIBSHUFF

Versión 1.22.

La comparación estadística entre categorías taxonómicas provenientes de cada zona de

muestreo, se realizó con la aplicación LIBCOMPARE de la plataforma Ribosomal Database Project (RDP).

Se evaluó la influencia de las cepas seleccionadas en la germinación de las semillasl mediante

ANOVA unidireccional, a partir de los valores de las réplicas (Sokal y Rohlf, 1980). Cuando el valor de “p”

fue menor a 0,05 (95% de confianza), se consideró que existían diferencias significativas atribuibles al

tratamiento. En este caso, se compararon los valores medios mediante el estadístico LSD (Least

Significant Difference) de Fisher. El programa utilizado fue el STATGRAPHICS Plus 5.1. (Statistical

Graphics Corp.)

3. 4 Resultados

Estudio metagenómico de Biodiversidad

En primer lugar se procedió al estudio de las secuencias obtenidas mediante pirosecuenciación

con la plataforma 454 GS FLX+ Titanium de Roche, del gen 16S del ADN asilado de la rizosfera de los

muestreos descritos anteriormente. La tabla 3.2 muestra los resultados de las secuencias “crudas”

obtenidas en el proceso de secuenciación masiva. En el muestreo realizado en Barrax se obtuvo un

mayor número de secuencias (5269), que en Malpica de Tajo (4933). A su vez, la longitud media de las

secuencias fue mayor en Barrax (504,87 nt) frente a la longitud de las secuencias de Malpica de Tajo

(374,24 nt).

Tabla 3.2 Resultados de la secuenciación de las muestras provenientes de suelo, mediante secuenciación

masiva (454).

Muestra Número de secuencias Longitud media (nt) Total Mb (Mb)

Barrax (Albacete) 5269 504,87 2,66

Malpica de Tajo (Toledo) 4933 374,24 1,85

Mediante el programa Mothur (Schloss et al., 2009) se procedió a la obtención de los archivos

fasta, flow y qual. Seguidamente se realizó la eliminación de los cebadores de amplificación de las

secuencias, de los identificadores de las muestras (bardcode), así como de las secuencias con más de un

2% de ambigüedades. Seguidamente, se seleccionaron secuencias de una longitud mayor a 200 nt para

el posterior proceso de identificación de las mismas. El número de secuencias y su tamaño medio se

refleja en la tabla 3.3.

Capítulo 3

161

Tabla 3.3 Número total de secuencias y longitud media de cada una de las muestras de suelo, después de

la eliminación de cebadores y filtrado de secuencias a mayores de 250nt.

Muestra Número de secuencias Longitud media (nt)

Barrax (Albacete) 4843 480,57

Malpica de Tajo (Toledo) 4779 331,47

A continuación, se llevó a cabo la asignación taxonómica de cada una de las secuencias filtradas

con el programa Mothur Silva (Quast et al., 2013). De esta forma se pudo identificar el número de OTUs,

de cada parcela, según la distancia molecular: 0,03 género; 0,1 familia; y 0,3 Phylum (tabla 3.4).

Según la clasificación taxonómica, Barrax presentó menor número de OTUs asignados al grupo

nivel (20), frente a los 21 de Malpica de Tajo. Esta situación se repitió en la asignación de OTUs al nivel

de familia, 120 en Barrax y 132 en Malpica de Tajo. Sin embargo, el número de OTUs asignados al nivel

de género en Barrax fue de 351, superior al número de OTUs en Malpica de Tajo (312).

Tabla 3.4 Número de OTUs identificados según las diferentes distancias moleculares en las dos parcelas

de muestreo

OTUs Phylum Familia Género

Barrax 20 120 351

Malpica de Tajo 21 132 312

Análisis de la estructura de las rizobacterias a nivel de phylum

En la tabla 3.5 se muestran los diferentes phyla identificados en cada zona de muestreo. En la

parcela de Barrax se identificaron 20 phyla. En la parcela de Malpica de Tajo identificaron con 21 phyla.

El phylum mayoritario del muestreo, tanto en Barrax como en Malpica de Tajo, fue Proteobacterias con

un 54,5% de las secuencias identificadas en Barrax y un 50,4% en Malpica de Tajo. En Barrax el siguiente

phylum más representativo fue Actinobacteria, con un 22,6%, seguido de Bacteroidetes (9,4%) y

Acidobacterias (6,9%). Por le contrario en Malpica de Tajo fue Acidobacterias con un 20,2%, seguido de

Actinobacterias (9,6%) y Bacteroidetes (6,6%). En la figura 3.8 se comparan la abundancia de los OTUs

en cada zona de muestreo.


potencial PGPR

162

Tabla 3.5 Identificación de las secuencias a nivel taxonómico de phylum. El * indica diferencias

significativas

Figura 3.7 Abundancia relativa (%) de OTUs asociados a la categoría phylum en Barrax y Malpica de

Tajo.

Phylum Nº secuencias Abundancia relativa % Libcompare Phylum Nº secuencias Abundancia relativa %

* Acidobacterias 333 6.9 6.00E-14 * Acidobacterias 967 20.2

* Actinobacteria 1092 22.6 6.00E-14 * Actinobacteria 459 9.6

Aquificae 1 0.0 2.95E-01 Aquificae 4 0.1

* Armatimonadetes 0 0.0 4.51E-4 * Armatimonadetes 11 0.2

* Bacteroidetes 454 9.4 1.16E-7 * Bacteroidetes 316 6.6

Chloroflexi 43 0.9 1.25E-2 Chloroflexi 69 1.4

Crenarchaeota 1 0.0 3.27E-01 Crenarchaeota 1 0.0

* Cyanobacteria 86 1.8 5.74E-7 * Cyanobacteria 31 0.6

Elusimicrobia 1 0.0 3.27E-01 Elusimicrobia 0 0.0

Fibrobacteres 4 0.1 1.49E-02 Fibrobacteres 0 0.0

* Firmicutes 38 0.8 4.01E-03 * Firmicutes 185 3.9

* Gemmatimonadetes 48 1.0 8.36E-2 * Gemmatimonadetes 23 0.5

Hydrogenedentes 3 0.1 3.83E-01 Hydrogenedentes 0 0.0

Ignavibacteriae 6 0.1 5.74E-02 Ignavibacteriae 14 0.3

Latescibacteria 0 0.0 4.81E-01 Latescibacteria 1 0.0

Nitrospinae 1 0.0 3.19E-01 Nitrospinae 1 0.0

* Nitrospirae 12 0.2 6.00E-05 * Nitrospirae 38 0.8

Planctomycetes 3 0.1 6.46E-02 Planctomycetes 17 0.4

* Proteobacteria 2638 54.5 1.16E-7 * Proteobacteria 2406 50.4

Spirochaetes 0 0.0 2.95E-01 Spirochaetes 1 0.0

Synergistetes 0 0.0 6.07E-02 Synergistetes 2 0.0

Thermodesulfobacteria 6 0.1 4.11E-01 Thermodesulfobacteria 3 0.1

Thermotogae 12 0.2 4.93E-01 Thermotogae 23 0.5

Verrucomicrobia 6 0.1 6.46E-2 Verrucomicrobia 1 0.0

Barrax Malpica de Tajo

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00

Acidobacterias

Actinobacteria

Aquificae

Armatimonadetes

Bacteroidetes

BRC1

Chloroflexi

Crenarchaeota

Cyanobacteria/Chloroplast

Elusimicrobia

Fibrobacteres

Firmicutes

Gemmatimonadetes

Hydrogenedentes

Ignavibacteriae

Latescibacteria

Nitrospinae

Nitrospirae

Planctomycetes

Proteobacteria

Spirochaetes

Synergistetes

Thermodesulfobacteria

Thermotogae

Verrucomicrobia

Abundancia relativa de OTUs (phylum)


Capítulo 3

163

Análisis de la estructura de las rizobacterias a nivel de familia

Una vez analizados las asignaciones de OTUs a una distancia de similitud de 0,3 (phylum) se

procedió analizarlo al nivel de familia, distancia de 0,1 (10%). De esta forma se asignaron 120 OTUs en

Barrax y 132 en Malpica de Tajo (tabla 3.8), de los que compartieron 118 OTUs como se aprecia en el

diagrama de Venn (figura 3.8).


entre OTUs fue de 0,1 (90% de similitud), de las parcelas de muestreo Barrax y Malpica de Tajo.

Seguidamente se procedió a representar las curvas de rarefacción, para valorar la riqueza del

muestreo realizado. De esta forma se pudo apreciar que la curva iniciaba su proceso de “saturación”

(figura 3.9).


de 0,1 (familia). En rojo Barrax (Albacete), en azul Malpica de Tajo (Toledo).

Barrax

2 OTUs

Malpica de Tajo

14 OTUs

118OTUs


potencial PGPR

164

En la figura 3.10 se representa la riqueza relativa de los diferentes OTUS a nivel de familia. Se

han representado todas las familias que presentaron una mayor representación (>2%). Se pueden

identificar 12 familias que cumplen esta condición en Barrax, conformadas por 1839 secuencias, y siete

familias en Malpica de Tajo, pertenecientes a 2242 secuencias. De todas ellas la familia

Sphingomonadaceae (-proteobacterias) se identificó como la más numerosa en ambas parcelas, siendo

similar su distribución en ambas parcelas, 17,1% en Barrax y un 17,3% en Malpica de tajo. También se

apreciaron dos familias que se identificaban en ambas parcelas, Veillonellaceae (Firmicutes)

representando un 2,4% en Barrax y un 10,3% en Malpica. Cytophagaceae (Bacteroidete) fue la tercera

familia en común en ambas parcelas, que representó el 2,8% de las secuencias en Barrax y el 2,2% en

Malpica de Tajo.


familia, en Barrax y Malpica de Tajo.

Los índices de biodiversidad obtenidos para los OTUs al nivel de familia en las parcelas de

Barrax y Malpica de Tajo, se muestran en la tabla 3.6. El índice de Shannon-Wiener en ambas parcelas es

alto, mayor de tres, y muy similares 3,48 en Barrax y 3,57 en Malpica de Tajo. A su vez, el índice de

Chao, presenta unos valores altos.

0 10 20 30 40 50 60

Acidobacteriaceae

Cytophagaceae

Flavobacteriaceae

Gemmatimonadaceae

Geodermatophilaceae

Microbacteriaceae

Micrococcaceae

Micromonosporaceae

Nocardioidaceae

Oxalobacteraceae

Pseudomonadaceae

Rhizobiaceae

Rhodospirillaceae

Sphingomonadaceae

Veillonellaceae

Xanthomonadaceae

No asociado (Actinobacteria)

Otros

Abundancia relativa OTUs (Familia)

Barrax Malpica

Capítulo 3

165

Tabla 3.6 Índices de biodiversidad a nivel de familia

Familia OTUs Shannon Chao

Barrax 120 3,48 135,38

Malpica de Tajo 132 3,57 154,00

Análisis de la estructura de las rizobacterias a nivel de género

Al analizar los diversos OTUs a una distancia molecular de 0,03 (97% de similitud),

correspondiente a la categoría taxonómica de “género”, se apreció un incremento en el número de

OTUs, alcanzando los 351 en Barrax y 312 en Malpica de Tajo, de los cuales 193 OTUs fueron comunes a

ambas parcelas (figura 3. 11).


entre OTUs fue de 0,03 (97%), de las parcelas de muestreo Barrax y Malpica de Tajo.

La representación de las curvas de rarefacción, considerando una distancia de 0,03 entre OTUs,

mostró un número suficiente de OTUs, en ambas parcelas, para poder realizar los análisis de

biodiversidad (figura 3.12).


de 0,03 (género). En rojo Barrax (Albacete), en azul Malpica de Tajo (Toledo).

Barrax

158 OTUs

Malpica de Tajo

119 OTUs

193OTUs


potencial PGPR

166

En la figura 3.13 se representa la riqueza relativa de los diferentes OTUS a nivel degenero. Se

han representado todos los géneros que presentaron una mayor representación (>2%). Se identificaron

nueve familias en Barrax con una representación mayor del 2% (1962 secuencias). En Malpica de Tajo se

identificaron siete OTUs (1606 secuencias), de las cuales sólo se pudieron asociar cinco con el nivel

taxonómico de género (figura 3.25). El género Sphingomonas (Sphingomonadaceae) fue el de mayor

distribución en ambas parcelas, 9,9 % en Barrax y 11,0% en Malpica de Tajo. También se presentó en

género Kaistobacter (Sphingomonadaceae) en la rizosfera de ambas parcelas, con un 6,1% en Barrax y

un 4,0% en Malpica de Tajo. En Barrax se identifica al género Pseudomonas, con una riqueza relativa del

3,5%


familia, en Barrax y Malpica de Tajo.

En la tabla 3.7se muestran los índices de biodiversidad obtenidos para los OTUs al nivel de

género en las parcelas de Barrax y Malpica de Tajo. El índice de Shannon-Wiener presenta valores muy

similares en ambas rizosferas, 4,47 en Barrax y 4,55 en Malpica de Tajo, indicando una alta diversidad. El

índice de Chao presenta valores similares en ambas parcelas.

0 10 20 30 40 50 60 70

Acidicapsa

No asignado (Actinobacteria)

Arthrobacter

Blastococcus

No asignado (Firmicutes)

Flavobacterium

Gemmatimonas

Kaistobacter

Massilia

Ohtaekwangia

Otros

Pseudomonas

Rhizobium

Selenomonas

Sphingomonas

Abundancia relativa OTUs (Genero)

Barrax Malpica

Capítulo 3

167

Tabla 3.7 Índices de biodiversidad a nivel de género

Genero OTUs Chao Shannon

Barrax 351 415,70 4,47

Malpica de Tajo 312 405,19 4,55

Una vez analizada la estructura generada a diferentes distancias, se procedió a realizar un

análisis estadístico de las dos poblaciones, Barrax y Malpica de Tajo, con una distancia entre OTUs del

0,1, a nivel de familia. Para ello se aplicó la herramienta S-Libshuff de MOTHUR.

Tabla 3.8 P-valor obtenido mediante la herramienta S-Libshuff

Barrax Malpica

Barrax 0 0,003276*

Malpica 0,002032* 0

Los resultados mostraron diferencias significativas (p-valor<0,05) entre las poblaciones de las

dos zonas de muestreo.

Una vez analizados y valorados la clasificación de las secuencias según los diversos porcentajes

de identidad, se procedió a la realización de una representación de los OTUs con un 90% de identidad

(familia), mediante la aplicación informática KRONA (figura 3.14) (Ondov , Bergman et al., 2011).


potencial PGPR

168

Figura 3.14 Representación de OTUs con un 90% de identidad de las secuencias obtenidas de Barrax y

Malpica de Tajo.

Capítulo 3

169

Arboles filogenéticos

Mediante el programa MAFFT, se representaron los árboles filogenéticos de las secuencias

identificadas (figura 3.15 y 3.16). Debido al elevado número de secuencias se incluye una dirección url,

donde se puede apreciar con más detalle la identidad de los OTUs.

Barrax: http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/spool/_phyloio1704010853s2485897.html


en Barrax.

Los grupos mayoritarios están conformados por:

A: Alfaproteobacterias, orden Sphingomonadales

B: Betaproteobacterias, orden Nitrosomonadales

C: Deltaproteobacterias, orden Myxococcales

D: Fibrobacteres, orden Fibrobacterales

E: Bacteroidetes, orden Bacteroidetes

F: Chloroflexi

G: Firmicutes, orden Costridia

H: Actinobacteria, orden Actinobacteria

Barrax

0,15

A

B

C

D

E

F

G

H

http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/spool/_phyloio1704010853s2485897.html


potencial PGPR

170

Malpica de tajo: http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/spool/_phyloio1704020004s2481129.html


en Malpica de Tajo.

Los grupos mayoritarios están conformados por:

I: Alfaproteobacterias, orden Sphingomonadales

J: Firmicutes, orden Clostridia

K: Verrucomicrobia orden Verrucomicrobiae

M: Betaproteobacterias, orden Burkholderiales

N: Bacteroidetes, orden Bacteroidetes

Malpica de Tajo

0,15

I

J

K

M

N

http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/spool/_phyloio1704020004s2481129.html

Capítulo 3

171

Aislamiento y clasificación de rizobacterias

En el muestreo de Barrax se aislaron un total de 265 cepas (figura 3.17). El muestreo de Malpica

del Tajo resultó en un aislamiento con menor número de cepas, un total de 141 cepas (figura 3.9).

Figura 3.17 Rizobacterias aisladas de la rizosfera de cultivos de Papaver somniferum en las provincias de

Albacete y Toledo. Representación gráfica del número de rizobacterias aisladas por réplica y finca de

muestreo.

Se seleccionaron todas las cepas que crecieron en la dilución 10E-4, ya que se encontró una

abundancia bacteriana de cepas cultivables menor de lo esperado, especialmente en Malpica de Tajo.

Del total de las cepas aisladas, 86 (32,5±3,2%) presentaron alguna actividad PGPR; y 49 (34,4±10,1%) en

el muestreo de Malpica de Tajo (figura 3.18), siendo porcentajes similares de distribución en ambas

parcelas.

Figura 3.18 Distribución porcentual de las cepas que presentaron una o más actividades PGPR

ensayadas, asiladas de los muestreos de Barrax y Malpica de Tajo.

0

20

40

60

80

100

120

Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3Nú

me

ro d

e r

izo

bac

teri

as a

isla

das

Rizobacterias aisladas


0

5

10

15

20

25

30

35

40

Barrax Malpia de Tajo

%

% Rizobacterias con actividad PGPR


potencial PGPR

172

En la figura 3.19, se aprecia una distribución diferencial de las actividades PGPR de cada zona

de muestreo. Ambas fincas se caracterizan por la presencia de rizobacterias donde la principal actividad

PGPR es la formación de sideróforos, un 61,2% (52 cepas) en Barrax y un 43,3% (21 cepas) en Malpica de

Tajo. A continuación, la actividad más abundante es la solubilización de fosfatos (producción de

fosfatasas), un 23,5% (20 cepas) de Barrax frente a un 29,9% (15 cepas) en Malpica de Tajo. En

referencia a la actividad de producción de quitinasas, los porcentajes son muy similares en ambas fincas,

aproximadamente un 12%, diez cepas en Barrax y seis en Malpica de Tajo. Por el contrario, en referencia

a la formación de auxinas, se aprecia un mayor porcentaje en el muestreo realizado en Malpica de Tajo

14,9% (siete cepas), frente a Barrax, con un escaso 3,5% (tres cepas) (figura 3.20)

Figura 3.19 Porcentaje de las actividades PGPR ensayadas, producción de sideróforos, producción de

fosfatasas, producción de quitinasa y auxinas. a) Barrax. b) Malpica de Tajo

Al clasificar las bacterias según el número de actividad/es PGPR de cada aislado (figura 3.20), se

apreciaron mayores diferencias. La producción de bacterias capaces de producir fosfatasas solo fue del

26% en Barrax, frente al 10% en Malpica de Tajo. La producción de sideróforos en ambas parcelas fue

muy similar, ya que prácticamente el 30% de las cepas aisladas solo produjeron este tipo de moléculas.

Se apreciaron grandes diferencias en el porcentaje de bacterias que únicamente producían auxinas, un

1% en Barrax frente a un 11% en Malpica de Tajo. En la producción de quitinasas se apreció una mayor

abundancia en Malpica de Tajo (13%) frente al Barrax (8%). La proporción de cepas productoras de

fosfatasas y sideróforos fue muy similar en ambas parcelas (31%). El resto de las combinaciones de las

diferentes actividades, sideróforos más auxinas, fosfatasas más auxinas y fosfatasas más sideróforos

más auxinas presentaron una baja proporción (1%-2%). Si bien, es reseñable que en Barrax el porcentaje

de cepas asociadas a multiples actividades fueron del 1% y en Malpica de Tajo del 2%. La presencia de

bacterias con capacidad para producir simultáneamente quitinasas y fosfatasas fue exclusiva de Barrax

(2%). Y, por el contrario, en Malpica de Tajo se aislaron de forma exclusiva bacterias con la capacidad de

producir quitinasas y auxinas (1%).

11.9%

29.9%

43.3%

14.9%

Malpica de Tajo

Quitinasas Fosfatasas Sideróforos Auxinas

b)

11.8%

23.5%

61.2%

3.5%

Barrax

Quitinasas Fosfatasas Sideróforos Auxinas

a)

Capítulo 3

173

Figura 3.20 Porcentaje de bacterias con una o diferentes actividades PGPR. a) Barrax. b) Malpica de Tajo.

Una vez aisladas e identificadas las cepas con al menos una actividad PGPR se procedió a su

identificación rianas, mediante secuenciación del gen rrs que codifica al ARNr 16S. En la figura 3.22 se

observan los porcentajes de los distintos géneros en las dos zonas muestreadas. En ambos casos, el

género mayoritario es Pseudomonas, bacterias Gram negativas pertenecientes al phylum

Proteobacterias, con un 77% de presencia en Barrax y un 65% en Malpica de Tajo. En el caso de Barrax,

el segundo género más abundante fue Bacillus (10%), bacterias Gram positivas pertenecientes al Phylum

Firmicutes. Por el contrario, en Malpica de Tajo, el segundo género predominante fue

Stenotrophomonas, bacterias Gram negativas pertenecientes al phylum Proteobacterias, con un 10%.

En referencia al número total de géneros aislados se apreció un mayor número en Malpica

(figura 3.21.b) once, frente a los cinco en Barrax (figura 3.21.a), de los cuales Pseudomonas, Bacillus,

Chryseobacterium y Arthobacter aparecieron en las dos ubicaciones (figura 3.22). A su vez,

Acinetobacter solo apareció en Barrax. Mientras que Stenotrophomonas, Aeromonas, Brevundimonas,

Microbacterium, Paenibacillus, Pantoea, Variovorax, se identificaron exclusivamente en Malpica de Tajo

(3.22).

Figura 3.21 Porcentaje de géneros en las dos parcelas de muestreo. a) Barrax. b) Malpica de Tajo

Quitinasa13% Fosfatasas

10%

Sideróforos28%Auxinas

11%

Quitinasas + Auxinas

2%

Fosfatasas + Auxinas

2%

Sideróforos + Auxinas

2%

Fosfatasas + Sideróforos

30%

Fosfatasas + Sideróforos +

Auxinas2%

Malpica de Tajob)

Quitinasa8%

Fosfatasas26%

Sideróforos29%

Auxinas1%

Quitinasa + Fosfatasas

2%

Fosfatasas + Auxinas1%

Fosfatasas + Sideróforos

31%

Sideróforos + Auxinas

1%

Quitinasas + Fosfatasas + Sideróforos

1%

Barraxa)

0,010,020,030,040,050,060,070,0

Po

rce

nta

je

Malpica de Tajob)

0,010,020,030,040,050,060,070,080,0

Po

rce

nta

je

Barraxa)


potencial PGPR

174

Figura 3.22 Diagrama de Venn, donde se aprecia los géneros endémicos de cada zona y los comunes en

ambas regiones

Tras identificar las cepas aisladas de las dos zonas de muestreo, se procedió a la asociación de

las principales actividades PGPR con los diferentes grupos taxonómicos identificados (tabla 3.9). La

formación de quitinasas estuvo claramente diferenciada en las dos zonas de muestreo, en Barrax el

género Bacillus sp. (6,6%) fue el único con esta capacidad. Por el contrario, en la zona de Malpica de

Tajo, se distribuyó entre Stenotrophomonas (5,4%), Pseudomonas (2,7%), Chryseobacterium (2,7%),

Aeromonas (2,7%), y Paenibacillus (2,7%). La producción de fosfatasas en Barrax recaía exclusivamente

en el género Pseudomonas sp. (24,4%), mientras que en Malpica de Tajo se distribuyó entre

Pseudomonas sp. (2,7%) y Microbacterium sp. (2,7%). La producción de sideróforos también estuvo

distribuida de forma similar, en Barrax sólo Pseudomonas sp. (31,1%) fue capaces de producirlas;

mientras que en Malpica de Tajo, estaba distribuida entre Pseudomonas sp. (21,6%), Arthobacter sp.

(2,7%), Bacillus sp. (2,7%), Pantoea sp. (2,7%) y Variovorax sp. (2,7%). Ninguna Pseudomonas sp. en las

dos ubicaciones Barrax (22,2%) y Malpica de Tajo (28,0%). El resto de las actividades estuvieron

distribuidas principalmente en Pseudomonas sp. con excepción de la producción de auxinas, ninguna

Pseudomonas sp. presentó la capacidad de producir auxinas, recayendo esta actividad en

Chryseobacterium sp. en Barrax (2,2%) y en Malpica (2,7%), y Stenotrophomonas sp. (2,7%) y

Brevundimonas sp. (2,7%) En Malpica de Tajo (tabla 3.4). También es llamativo, que solo Pseudomonas

sp. fue el único género capaz de mostrar tres capacidades PGPR en ambas parcelas de muestreo.

Barrax

• Acinetobacter sp.

Malpica de Tajo• Stenotrophomonas sp.• Aeromonas sp.• Brevundimonas sp.• Microbacterium sp.• Paenibacillus sp.• Pantoea sp.• Variovorax sp.

Pseudomonas sp.Bacillus sp.Arthrobacter sp.Chryseobacterium sp.

Capítulo 3

175

Tabla 3.9 Porcentaje de géneros capaces de realizar una o más actividades PGPR de Barrax y Malpica de

Tajo.

Una vez identificadas las diferentes cepas con potencialidad PGPR se procedió a la construcción

de árboles filogenéticos, como se indica en el apartado de materiales y métodos, uno por cada parcela

de muestreo.

El árbol filogenético correspondiente a las cepas aisladas de la rizosfera de plantas de

adormidera de la finca de Barrax (figura 3.23), muestra cuatro phyla: Actinobacterias, Bacteroidetes,

Firmicutes y Proteobacterias (-Proteobacterias). Proteobacterias fue el phylum con mayor

representación, formado mayoritariamente por Pseudomonas, con capacidad para producir sideróforos

y fosfatasas, y, minoritariamente por el género Acinetobacter, también con la capacidad de producir

sideróforos y fosfatasas. Seguidamente el phylum Firmicutes fue el segundo con mayor número de

cepas. Todos los integrantes de este grupo taxonómico fueron Bacillus con capacidad de producir

quitinasas. Seguidamente el phylum Actinobacteria estuvo representado por dos cepas de Arthobacter,

y finalmente una cepa de Chryseobacterium que pertenece al phylum Bacteroidetes.

Barrax Pseudomonas sp. Chryseobacterium sp. Acinetobacter sp. Arthrobacter sp. Bacillus sp.

Quitinasa - - - - 6,6

PDYA 24,4 - - - -

Sideróforos 31,1 - - - -

Auxinas - 2,2 - - -

Quitinasa + PDYA 2,2 - - - -

PDYA + Auxinas 2,2 - - - -

PDYA + Sideróforos 22,2 - 4,4 - -

Sideróforos + Auxinas 2,2 - - - -

Quitinasas + PDYA + Sideróforos 2,2 - - - -

Malpica de Tajo

Pse

udo

mo

nas

sp

.

Sten

otr

oph

omon

as

sp.

Ch

ryse

oba

cter

ium

sp

.

Aer

om

ona

s sp

.

Art

hro

ba

cte

r sp

.

Ba

cillu

s sp

.

Bre

vun

dim

ona

s sp

.

Mic

roba

cter

ium

sp

.

Pae

nib

aci

llus

sp.

Pan

toea

sp

.

Va

riov

ora

x sp

.

Quitinasa 2,7 5,4 2,7 2,7 - - - - 2,7 - -

PDYA 2,7 - - - - - - 2,7 - - -

Sideróforos 21,6 - - - 2,7 2,7 - - - 2,7 2,7

Auxinas - 2,7 2,7 - - - 2,7 - - - -

Quitinasas + Auxinas 2,7 - - - - - - - - - -

PDYA + Auxinas 2,7 - - - - - - - - - -

Sideróforos + Auxinas 2,7 - - - - - - - - - -

PDYA + Sideróforos 28,0 - - - - - - - - - -

PDYA + Sideróforos + Auxinas 2,7 - - - - - - - - - -


potencial PGPR

176



localidad de Barrax. Entre paréntesis se indica la capacidad PGPR identificada, (P: fosfatasas; AIA:

auxinas). Una Secuencia del Phylum Cyanobacteria se utilizó como outgrup. El * indica la cepa

seleccionada para el estudio de germinación (Tamura et al., 2013).

El árbol filogenético obtenido de las cepas aisladas del muestreo de Malpica de Tajo (figura

3.24), muestra un resultado similar en referencia a los phyla representados: Actinobacterias,

Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacterias. Si bien, Proteobacterias presenta mayor variabilidad al

estar representados las clases -proteobacterias, -proteobacterias y -proteobacterias. El grupo con

mayor representación fue Proteobacterias, en especial -proteobacterias, seguido de Firmicutes.

Proteobacterias

Firmicutes

Bacteroidete

Actinobacteria

PA2-18:Pseudomonas sp. R2SsM3P1C2 (Sideroforos: ++)

PA3-39:Pseudomonas koreensis strain Ps 9-14 (Sideroforos: ++) *

PA1-36: Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Fosfatasas: + Sideroforos: +++)

PA1-32:Pseudomonas koreensis strain Ps 9-14 (Fosfatasas: +)

PA1-27:Pseudomonas koreensis strain Ps 9-14 (Fosfatasas: + Sideroforos: ++)

PA1-11:Pseudomonas koreensis (Fosfatasas:+ Sideroforos: ++)

PA1-21:Pseudomonas sp. L1-44-08 (Sideroforos: ++)

PA1-30:Pseudomonas koreensis (Fosfatasas: +)

PA1-71:Pseudomonas brassicacearum subsp. brassicacearum NFM421 (Fosfatasas: +)

PA3-51:Pseudomonas orientalis strain CFML 96-170 (Sideroforos: ++)

PA2-50: Pseudomonas gessardii strain CIP 105469 (Sideroforos: ++) *

PA2-53:Pseudomonas gessardii strain CIP 105469 (Sideroforos: ++)

PA1-10:Pseudomonas poae RE*1-1-14 (Sideroforos: ++)

PA2-1:Pseudomonas trivialis strain P 513/19 (Fosfatasas: + Sideroforos: ++)

PA1-93: Pseudomonas viridiflava strain ATCC 13223 (Sideroforos: +++)

PA1-4: Pseudomona viridiflava (Quitinasas: + Fosfatasas: + Sideroforos: ++)

PA1-28:Pseudomonas viridiflava strain CECT 458 (Fosfatasas: + Sideroforos: +++)

PA1-31:Pseudomonas viridiflava (Fosfatasas: +)

PA1-42: Pseudomonas viridiflava (Fosfatasas: + Sideroforos: +)

PA1-43:Pseudomonas viridiflava strain ATCC 13223 (Fosfatasas: + Sideroforos: +) *

PA1-40:Pseudomonas viridiflava strain RMX23.1a (Sideroforos: ++)

PA3-42:Pseudomonas viridiflava strain CECT 458 (Sideroforos: +)

PA2-43:Pseudomonas sp. SR56 (Fosfatasas: + Siderforos: +++)

PA1-6:Pseudomonas extremaustralis (Sideroforos: +) *

PA1-14: Pseudomonas putida F1 (Fosfatasas: +)

PA1-17:Pseudomonas putida F1 (Fosfatasas: +)

PA1-29:Pseudomonas putida strainNBRC14164 (Fosfatasas: +) *

PA1-108:Pseudomonas putida strain NBRC 14164 (Sideroforos: +)

PA3-8:Pseudomonas putida F1 strain F1 (Fosfatasas: +)

PA1-7:Pseudomonas moraviensis (Fosfatasas: + Sideroforos: ++) *

PA3.18:Pseudomonas sp. clone 165-10 (Sideroforos: +)

PA3-2:Acinetobacter calcoaceticus strain ATCC 23055 (fosfatasas: + Sideroforos: ++ Quitinasas) *

PA3-11:Acinetobacter calcoaceticus strain JCM 6842 (Fosfatasas: +)

PA3-36:Acinetobacter calcoaceticus strain JCM 6842 (Fosfatasas: + Sideroforos: ++)

PA2-3:Bacillus simplex strain LMG 11160 (Quitinasas)

PA3-32:Bacillus simplex strain LMG 11160 (Quitinasas) *

PA1-95:Bacillus endophyticus strain 2DT (Quitinasas + Fosfatasas: ++) *

PA2-4:Bacillus axarquiensis strain LMG 22476 (Fosfatasas: +) *

PA2-24:Bacillus subtilis strain RGRI1 (Quitinasas) *

PA2-45:Bacillus axarquiensis strain LMG 22476 (Quitinasas: +)

PA2-46:Bacillus subtilis subsp. inaquosorum (Quitinasas: +)

PA2-55:Bacillus subtilis subsp. inaquosorum strain BGSC 3A28 (Quitinasas)

PA3-17:Bacillus sp. Z17 (Quitinasas: +)

PA1-23:Arthrobacter phenanthrenivorans strain Sphe3 (Fosfatasas: +) *

PA3-20:Arthrobacter aurescens TC1 strain (Auxinas) *

PA3-33:Chryseobacterium indoltheticum strain LMG 4025 (Auxinas: ++) *

NR 117712.2 Calochaete cimrmanii strain RKST551

100

100

100

57

99

72

10056

99

99

14

64

99

94

97

91

85

33

97

54

35

33

45

51

80

0.05

Capítulo 3

177



localidad de Malpica de Tajo. Entre paréntesis se indica la capacidad PGPR identificada, (P: fosfatasas;

AIA: auxinas). Una Secuencia del Phylum Cyanobacteria se utilizó como outgrup. El * indica la cepa

seleccionada para el estudio de germinación Tamura et al., 2013).

Se seleccionaron las cepas con el objeto de absorber la máxima variabilidad gnética y la máxima

funcionalidad en cada región, 15 cepas en Barrax y 12 cepas en Malpica e Tajo. Las cepas bacterianas

seleccionadas, tanto del muestreo de Barrax (tabla 3.10), como de Malpica de Tajo (tabla 3.10) fueron

las siguientes:

Bacteroidete

Actinobacteria

Proteobacterias

PM3-28:Pseudomonas viridiflava strain CECT 458 (Sideroforos: ++)

PM3-32:Pseudomonas viridiflava (Fosfatasas: + Sideroforos: ++)

PM3-8:Pseudomonas viridiflava strain CECT 458 (Sideroforos: +++)

PM3-7:Pseudomonas viridiflava strain CECT (Sideroforos: +++)

PM2-40:Pseudomonas viridiflava strain CECT (Sideroforos: +++)

PM2-39:Pseudomonas viridiflava strain CECT 458 (Fosfatasas: + Sideroforos: +++)


PM2-20:Pseudomonas viridiflava strain CECT 458 (Fosfatasas: + Sideroforos: +)


PM1-42:Pseudomonas viridiflava strain CECT 458 (P: + Sideroforos: +++) *

PM3-33:Pseudomonas viridiflava strain CECT 458 (Sideroforos: ++)

PM2-17 Pseudomonas sp. (Fosfatasas: + Auxinas: +++) *

PM2-18:Pseudomonas fluorescens (Sideroforos:+)

PM2-7:Pseudomonas teessidea strain NBGD34 (Fosfatasas: + Sideroforos: ++)

PM2-14:Pseudomonas baetica strain a390 (Fosfatasas: + Sideroforos: ++)

PM3-43:Pseudomonas brassicacearum subsp. brassicacearum NFM421 (Fosfatasas: + Sideroforos:++ Auxinas: +) *

PM2-37:Pseudomonas brassicacearum subsp. neoaurantiaca strain CIP 109457 (Fosfatasas: +)

PM2-41:Pseudomonas brassicacearum subsp. brassicacearum (Sideroforos: +++)

PM3-4:Pseudomonas fluorescens Pf0-1 strain (Sideroforos: +++ Auxinas: +) *

PM3-31:Pseudomonas brassicacearum subsp. brassicacearum (Fosfatasas: + Sideroforos: ++)

PM3-40:Pseudomonas brassicacearum subsp. brassicacearum NFM421 (Kitinasa: + Auxinas: ++) *

PM3-41:Pseudomonas brassicacearum subsp. brassicacearum (Fosfatasas: + Sideroforos: ++)

PM3-24:Pseudomonas punonensis strain LMT03 (Sideroforos: ++)

PM3-46:Pseudomonas punonensis strain LMT03 (Kitinasa: +)

PM3-39:Aeromonas veronii B565 strain B565 (Kitinasa: +)

PM3-44:Pantoea agglomerans strain DSM (Sideroforos: ++)

PM1-9:Variovorax paradoxus S110 strain S110 (Sideroforos: ++) *

PM2-26:Stenotrophomonas maltophilia R551-3 strain (Kitinasa: +) *

PM2-27:Stenotrophomonas chelatiphaga strain LPM (Kitinasa: +)

PM3-48:Stenotrophomonas chelatiphaga strain LPM-5 (Auxinas: ++) *

PM2-2:Brevundimonas intermedia strain ATCC 15262 (Auxinas: +) *

PM3-37:Chryseobacterium indoltheticum strain LMG 4025 (Auxinas: ++) *

PM3-47:Chryseobacterium indoltheticum strain LMG 4025 (Kitinasa: +)

PM1-10: Paenibacillus purispatii strain ES MS17 (Kitinasa: +) *

PM3-6:Bacillus muralis strain LMG 20238 (Sideroforos: +++)

PM1-1: Arthrobacter oryzae strain KV-651 (Sideroforos: +) *

PM1-43: Microbacterium arborescens strain DSM 20754 (P: +)

NR 117712.2 Calochaete cimrmanii strain RKST551

100

100

100

45

70

99

47

60

25

32

94

100

100

57

68

52

37

36

71

72

100

0.05

Firmicutes


potencial PGPR

178

Tabla 3.10 Cepas seleccionadas de la rizosfera de adormidera de Barrax

CEPA ESPECIE PROPIEDADES Nº ACCESO

GENEBANK

PA1-4 Pseudomonas viridiflava (-

Proteobacterias)

Productora de

sideróforos, quitinasas y

fosfatasas

JQ3005751

PA1-6 Pseudomonas extremaustra (-

Proteobacterias) Productora de sideróforos JQ3005753

PA1-7 Pseudomonas moraviensis (-

Proteobacterias)

Productora de sideróforos

y fosfatasas JQ3005754

PA1-23 Arthrobacter phenanthre

(Actinobacterias) Productora de fosfatasas JQ3005770

PA1-29 Pseudomonas putida (-

Proteobacterias) Productora de fosfatasas JQ3005776

PA1-43 Pseudomonas viridiflava (-

Proteobacterias)



PA1-95 Bacillus endophyticus (Firmicutes) Productora de fosfatasas y

quitinasas JQ3005842

PA2-4 Bacillus axarquiensis (Firmicutes) Productora de fosfatasas JQ3005861

PA2-24 Bacillus subtillis (Firmicutes) Productora de quitinasas JQ3005881

PA2-50 Pseudomonas gessardii(-

Proteobacterias)

Productora de

sideróforos, JQ3005907

PA3-2 Acinetobacter calcoaceticus (-

Proteobacterias)

Productora de

sideróforos, quitinasas y

fosfatasas

JQ3005927

PA3-20 Arthrobacter aurescens

(Actinobacterias) Productora de auxinas JQ3005945

PA3-32 Bacillus simplex (Firmicutes) Productora de quitinasas JQ3005957

PA3-33 Chryseobacterium indoltheticum

(Bacteroidetes) Productora de auxinas JQ3005958

PA3-39 Pseudomonas koreensis (-

Proteobacterias)



Capítulo 3

179

Tabla 3.11 Cepas seleccionadas de la rizosfera de adormidera de Malpica de Tajo

CEPA ESPECIE POTENCIALES PGPR Nº ACCESO

GENEBANK

PM1-1 Arthrobacter oryzae (Acinetobacteria) Productora de sideróforos JQ3005634

PM1-9 Variovorax paradoxus (-

Proteobacterias) Productora de sideróforos JQ3005612

PM1-10 Paenibacillus purispatii (Firmicutes) Productora de AIA JQ3005613

PM1-42 Pseudomonas viridiflava (-

Proteobacterias)



PM2-2 Brevundimonas intermedia (-

Proteobacterias) Productora de auxinas JQ3005694

PM2-17 Pseudomonas lini (-Proteobacterias) Productora de fosfatasas

y auxinas JQ3005709

PM2-26 Stenotrophomonas maltophila (-

Proteobacterias) Productora de quitinasas JQ3005718

PM3-4 Pseudomonas fluorescens (-

Proteobacterias)


y auxinas JQ3005731

PM3-37 Pseudomonas brassicacearum (-

Proteobacterias) Productora de fosfatasas JQ3005762


Proteobacterias)

Productora de quitinasas

y auxinas JQ3005765


Proteobacterias)

Productora de

sideróforos, fosfatasas y

auxinas

JQ300578

PM3-48 Stenotrophomonas chelatiphaga (-

Proteobacterias) Productora de auxinas JQ300581

Evaluación de la potencialidad de cepas PGPR aisladas en la mejora de la germinación de Papaver

somniferum

Una vez identificadas las diversas cepas aisladas con potencial PGPR, y tras realizar los árboles

filogenéticos de cada muestreo se procedió a la selección de cepas representativas para la realización de

los ensayos de promoción de germinación de las semillas de adormidera. La selección de cepas PGPR se

ha indicado en el apartado de resultados.


potencial PGPR

180

La germinación acumulada de semillas tratadas con cepas de Barrax se resume en la figura 3.25.

A las 48 horas de la inoculación, la germinación media era del 63%% de las semillas en el Control, y tras

120 h aumentó hasta el 80%. Entre las 15 cepas ensayadas, se detectaron siete comportamientos

diferentes.

Las cepas PA1-7 (Pseudomonas moraviensis, (-Proteobacterias), PA1-95 (Bacillus endophyticus,

Firmicutes) y PA3-2 (Acinetobacter calcoaceticus, -Proteobacterias) y sus medios libres de bacteria en

las dos concentraciones ensayadas, aumentaron el porcentaje de germinación de las semillas de

adormidera. PA1-7 y PA3-2 y sus medios aceleraron la germinación significativamente desde el inicio,

mientras que PA1-95 sólo es significativo el efecto de la cepa, quedando los medios de cultivo en un

estado intermedio.

Un segundo grupo está formado por PA1-43 (Pseudomonas viridiflava, γ-Proteobacterias), PA3-

32 (Bacillus simplex, Firmicutes) y PA3-39 (Chryseobacterium indoltheticum, Bacteroidetes), siendo las

cepas bacterianas las únicas que incrementaron la tasa de germinación de forma significativa. La cepa

PA1-43 a las 48 horas presento una tasa de germinación similar al control, pero a las 72 horas

incrementó la tasa (6%) de forma significativa, manteniéndola superior al control a lo largo del

experimento. Por su parte, los medios libres de bacterias deceleraron la germinación durante las

primeras 72 horas, pero igualaron al control a las 120 horas. La cepa PA3-32 incrementó

significativamente la tasa de germinación en todos los momentos valorados, presentando un

incremento total acumulado del 13% a las 120 horas, mientras que los medios libres de bacterias

retrasaron la germinación a las 48 horas y 72 horas, el medio libre de bacteria al 10% se normalizó su

tasa de germinación, mientras que el medio al 5% mantuvo la inhibición significativamente menor hasta

las 120 horas. Por su parte la cepa PA3-39 incremento la germinación en un 19% y 17% a las 96 horas y a

las 120 horas respectivamente siendo estos incrementos significativos, mientras que lLos medios libres

de bacterias no modificaron el comportamiento de la germinación.

La cepa PA1-29 (Pseudomonas putida, γ-Proteobacterias) no presentó diferencias en las

primeras 96 horas, pero se apreció una deceleración significativa, de la germinación a las 120 horas (-

6%). A su vez, el medio libre de bacterias al 10%, incrementó la germinación en un 7% respecto al

control a las 120 horas. La cepa PA2-50 (Pseudomonas gessardii, -Proteobacterias) se comportó de

forma similar a PA1-29 (Pseudomonas gessardii, γ-Proteobacterias), sin embargo, el medio libre de

bacterias al 5% incrementó la tasa de germinación mientras que el medio al 10% no modificó la

germinación de las semillas.

La cepa PA2-4 (Bacillus axarquiensis, Firmicutesinhibió la germinación, tanto la propia cepa,

como los medios libres de bacterias. En todos los tratamientos se apreció una menor tasa de

germinación a partir de las 72 horas, con una media del 9% a las 120 horas.

El medio de cultivo de la cepa PA1-6 (Arthrobacter phenanthre, Actinobacterias) inhibió la

germinación de las semillas, sobre todo al 10%, mientras que la cepa no mostró diferencias con el

tratamiento control.

Capítulo 3

181

Por otra parte, la cepa PA3-20 (Arthrobacter aurescens, Actinobacterias) promovió una

aceleración de la germinación en las primeras 72 horas (+7%), manteniendo este incremento hasta las

120 horas (+6%). Por su parte, los medios libres de bacterias se comportaron de forma irregular, el

medio al 5% incrementó de forma significativa la tasa de germinación de adormidera, resultando en un

aumento del 23% a las 120 horas, mientras que el medio al 10% inhibió la tasa de germinación en todos

los tiempos valorados.

Finalmente, las cepas PA1-4 (Pseudomonas viridiflava, γ-Proteobacterias), PA1-23 (Arthrobacter

phenanthre, Actinobacterias), PA2-24 (Bacillus subtillis, Firmicutes) y PA3-33 (Chryseobacterium

indoltheticum, Bacteroidetes) no mostraron efectos sobre la germinación, tampoco lo hicieron sus

medios de cultivo. Solo los medio de cultivo de PA1-23 afectaron negativamente a la tasa de

germinación a las 120 horas.

Por todo ello, las cepas cepas PA1-7 (Pseudomonas moraviensis, (-Proteobacterias), PA1-95

(Bacillus endophyticus, Firmicutes), PA3-2 (Acinetobacter calcoaceticus, -Proteobacterias), y sus

medios, y las cepas PA1-43 (Pseudomonas viridiflava, γ-Proteobacterias), PA3-32 (Bacillus simplex,

Firmicutes) y PA3-39 (Chryseobacterium indoltheticum, Bacteroidetes), presentan una buena

potencialidad para promover la germinación de semillas de Papaver somniferum en condiciones in vitro.


potencial PGPR

182

a

a

aa

a

a

aa

a

aa

a

ab

aa

a

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

nPA1-4

Control PA1-4 PA1-4 5% PA1-4 10%

a

a

aa

a

a

a a

b

c

c

c

b

b

bb

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PA1-6


a

a

a

a

b

b

bc

b

bb

b

b

b

bc b

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PA1-7


a

a

aa

a

a

aa

b

aab

b

ab

a b

b

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PA1-23

Control PA1-23 PA1-23 5% PA1-23 10%

a

a

a a

aa

a cab

ba

a

b

bb b

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PA1-29

Control PA1-29 PA1-29 5% PA1-29 10%

a

aa

a

a

cb

b

b

b

a a

b

ba

a

30

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PA1-43

Control PA1-43 PA1-43 5% PA1-43 10%

a

a

ababc

b

c b

b

b

bc ab

a

aa

ab

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PA1-95

Control PA1-95 PA1-95 5% PA1-95 10%

a

aa a

a

ab abb

ab

abb

ab

b b

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PA2-4

Control PA2-4 PA2-45% PA2-4 10%

a

a

a a

a

a b a

ab

a

bb

b

abc

a

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PA2-24

Control PA2-24 PA2-24 5% PA2-24 10%

a

a

aa

a

a

a

ab

bab

b

ab

aa a

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PA2-50

Control PA2-50 PA2-50 5% PA2-50 10%

Capítulo 3

183

Figura 3.25 Tasa de germinación acumulada de semillas de adormidera tras el tratamiento con cepas

PGPR aisladas de la rizosfera de Papaver somniferum en la parcela de Barrax, Albacete. Tratamientos

realizados: cepa (108 ufc /mL.) y sus medios de cultivo libres de bacterias al 5% y el 10%, y controles no

tratados. Los datos son la media de 3 repeticiones con 30 semillas cada una ± error estándar. Las

diferentes letras indican diferencias significativas entre los tratamientos de acuerdo a la prueba de LSD

(p <0,05) en cada tiempo de muestreo.

Los resultados obtenidos en el proceso de germinación mediante rizobacterias aisladas de

Malpica de Tajo, se resumen en la figura 3.26. A las 48 horas de la inoculación, la germinación media era

del 65% de las semillas en el Control, y tras 120 h aumentó hasta el 84%. Entre las 12 cepas ensayadas,

se detectaron seis comportamientos diferentes en función de sus efectos sobre la germinación después

de la incubación en una suspensión bacteriana, o en los medios de cultivo libres de bacterias.

Las cepas PM2-26 (Stenotrophomonas maltophila, γ-Proteobacterias) y PM3-40 (Pseudomonas

brassicacearum, γ-Proteobacterias) aumentaron la tasa de germinación tanto las cepas bacterianas

como los medios libres de bacterias. PM2-26, mostró una aceleración de la germinación en todos los

tiempos valorados, a las 48 horas (+15%) y a las 120 horas (+13%). Los medios libres de bacterias

a

a

aa

b

bcb

c

b b

bb

b

bb b

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

48h 72h 96h 120h

% G

erm

inac

ión

PA3-2


a

aa a

ab

c

c cd

d

d d

b

bb

b

40

50

60

70

80

90

100

110

48h 72h 96h 120h

% G

erm

inac

ión

PA3-20

Control PA3-20 PA3-20 5% PA3-20 10%

aa

aa

ba

a a

a

a

a a

ab

a

a

a

40

50

60

70

80

90

100

110

48h 72h 96h 120h

% G

erm

inac

ión

PA3-33

Control PA3-33 PA3-33 5% PA3-33 10%

a

a

a a

b

b

bb

aa

a

a

a

aa

a

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

inac

ión

PA3-39

Control PA3-39 PA3-39 5% PA3-39 10%

a

a

a ac

cc

c

b

b

ab

b

b

b

aa

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

48h 72h 96h 120h

% G

erm

inac

ión

PA3-32

Control PA3-32 PA3-32 5% PA3-32 10%


potencial PGPR

184

promovieron un incremento en la germinación (+5%) sin ser estadísticamente significativos. La cepa

PM3-40 tuvo un comportamiento similar que PM2-26, si bien el medio libre de bacterias al 5% aumentó

(+9%) de forma significativa la tasa de germinación a las 120 horas.

Las cepas PM3-37 (Pseudomonas brassicacearum, γ-Proteobacterias), PM3-43 (Pseudomonas

brassicacearum, γ-Proteobacterias) y PM3-48 (Stenotrophomonas chelatiphaga, γ-Proteobacterias)

también promovieron la tasa de germinación de las semillas de Papaver somniferum. En este caso solo

las cepas fueron capaces de incrementar la germinación, un 7% con PM3-37, un 9% con PM3-43 y un 5%

con PM3-48. Por el contrario, los medios libres de bacterias, inhibieron la tasa de germinación

significativamente solo en los casos de PM3-43 y PM3-48. El medio libre de bacterias al 5% de PM3-37,

promovió un incremento de la germinación (+10%), pero finalmente se normalizó con el control a partir

de las 96 horas, por lo tanto aceleró la germinación.

En una situación inversa se mostraron las cepas PM1-1 (Arthrobacter oryzae, Acinetobacteria) y

PM2-2 (Brevundimonas intermedia, α-Proteobacterias) al incrementar la germinación con los medios

libres de bacterias y no afectar la cepa bacteriana el proceso de germinación. PM1-1 mostró una

aceleración de la germinación a las 72 horas, que se mantuvo a lo largo del experimento, con la

excepción de la cepa que se normalizó con el tratamiento control. El medio libre de bacterias de PM2-2

al 10% fue el tratamiento que aumentó de forma significativa la tasa de germinación, acelerando la

germinación desde las 48 horas (+6), hasta las 120 horas (+5%).

Por otra parte, la cepa PM1-42 (Pseudomonas viridiflava, γ-Proteobacterias) disminuyó la tasa

de germinación de un -19% a las 48 horas hasta un -14% a las 120 horas. Por el contrario, los medios sin

bacterias no modificaron el comportamiento de las semillas.

También las cepas PM2-17 (Pseudomonas lini, γ-Proteobacterias) y PM3-4 (Pseudomonas

fluorescens, γ-Proteobacterias) promovieron en un descenso de la germinación, al igual que sus medios

sin bacterias. En el caso de PM2-17 se apreció una inhibición del 10% por parte de la cepa,

incrementándose el efecto de inhibición con los medios a un -17% de media. La cepa PM3-4 se

comportó de forma similar a PM2-17, si bien el resultado del medio libre de bacterias al 5% fue similar al

tratamiento con la cepa.

Finalmente, PM1-9 (Variovorax paradoxus, β-Proteobacterias) y PM1-10 (Paenibacillus

purispatii, Firmicutes) no afectaron a la germinación de las semillas de Papaver somniferum. Aunque

PM1-10 incrementó la tasa de germinación durante las primeras 96 horas, tanto la cepa (9%), el medio

de cultivo 5% (+3%) y el medio al 10% (+7%), finalmente se normalizaron a las 120 horas.

De esta formas, las cepas PM2-26 (Stenotrophomonas maltophila, γ-Proteobacterias) y PM3-40

(Pseudomonas brassicacearum, γ-Proteobacterias) y sus medios, así como las cepas PM-37

(Pseudomonas brassicacearum, γ-Proteobacterias), PM3-43 (Pseudomonas brassicacearum, γ-

Proteobacterias) y PM3-48 (Stenotrophomonas chelatiphaga, γ-Proteobacterias), promovieron la

germinación de las semillas de Papaver somniferum en condiciones in vitro.

Capítulo 3

185

Figura 3.26 Germinación de semillas Malpica de Tajo, Toledo, Albacete. Tratamientos realizados con la

cepa (108 ufc /mL.) y sus medios de cultivo libres de bacterias al 5% y el 10%, y controles no tratados. Los

datos son la media de 3 repeticiones con 30 semillas cada una ± error estándar. Las diferentes letras

indican diferencias significativas entre los tratamientos de acuerdo a la prueba de LSD (p <0,05)

a

b

a

b

a

a aa

a

aa

a

a

a

a ab

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PM1-1

Control PM1-1 PM1-1 5% PM1-1 10%

a

a

a a

a

a

a a

aa

bb

a

a

ab

a

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PM1-9


a

b

a

a

b

a

b a

baa

a a

a

a

ab a

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PM1-10

Control PM1-10 PM1-10 5% PM1-10 10%

a b

ab

b

a

ab

a

a ab

a

ab

aa

a

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PM1-42

Control PM1-42 PM1-42 5% PM1-42 10%

b

b a

aa a a

b

a

a

b a

a

bc aa

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PM2-2


b

b

ab

a

ac

a

c

c

cc

c

c

bc

40

45

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55

60

65

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75

80

85

90

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PM2-17

Control PM2-17 PM2-17 5% PM2-17 10%

a

bc

a

a

a bc

bc b

a

c c

c

b

a

bc

ab

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PM3-4


a

b

a

b

ca

b a

ba a

a

a

a

aa

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PM3-37

Control PM3-37 PM3-37 5% PM3-37 10%

b b a

b

b

b abc

b

aa

a

a

a

ab

a

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PM3-40

Control PM3-40 PM3-40 5% PM3-40 10%

b

c

a a

a

a

b b

b

d

cc

c

b

cc

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PM3-43

Control PM3-43 PM3-43 5% PM3-43 10%

a

b a

c

a

a

a a

a

a

ab

a

a

aa

40

50

60

70

80

90

100

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PM3-48

Control PM3-48 PM3-48 5% PM3-48 10%

a

bb

b

a

aba

a

a

aa ab

aa

a

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

48h 72h 96h 120h

% G

erm

ina

ció

n

PM2-26

Control PM2-26 PM2-26 5% PM2-26 10%


potencial PGPR

186

3.5 Discusión

El grupo de investigación “Biotecnología de la interacción planta-microbioma” de la FUSP-CEU,

tiene como objetivos “el desarrollo de procedimientos biotecnológicos sobre la interacción planta-

microbioma para modificar el metabolismo de las plantas con distintos fines: mejorar la capacidad

productiva, incrementar sus propiedades nutricionales de cara a mejorar la salud humana, y potenciar

su capacidad defensiva contribuyendo a una producción sostenible conservando los recursos

productivos de los ecosistemas terrestre”. Para ello, se basa en dos premisas:

Las plantas interaccionan con su medio, desarrollando toda una serie de mecanismos

adaptativos fuertemente condicionados por su estilo de vida inmóvil. Esta característica esencial obliga

a la planta a desarrollar un metabolismo especial denominado metabolismo secundario, que produce

toda una serie de moléculas especializadas para mejorar la adaptación al medio en el que viven,

facilitando la vida de la planta. Muchas de estas moléculas tienen la función de proteger a la planta

frente a distintos tipos de agresiones bióticas (infecciones de distinta naturaleza) o frente a situaciones

ambientales adversas (falta de agua, exceso de calor etc.). Muchas de estas moléculas son

extraordinariamente útiles para la sociedad (por ejemplo medicamentos o vitaminas). Uno de los

objetivos fundamentales del grupo es mejorar la producción de estas moléculas y conseguir alimentos

con mejores propiedades nutritivas, o, en plantas medicinales, un mayor contenido en principios

activos.

También como consecuencia de su inmovilidad, las plantas alteran fuertemente el sustrato en

el que se desarrollan durante toda su vida. Esta alteración afecta al microbioma que se desarrolla en el

suelo y que es el responsable directo de su fertilidad y conservación. Los microorganismos ocupan desde

hace millones de años (antes de que aparecieran las plantas) los ecosistemas que ahora comparten.

Como resultado de esta convivencia, las plantas han integrado como parte de ellas mismas a los

microorganismos que habitan alrededor de sus raíces y su supervivencia y productividad depende en

gran medida de ellos. Por tanto, conservar la biodiversidad microbiana del suelo y controlar su

interacción con la planta puede ayudarnos a mejorar aspectos cuantitativos y cualitativos de los cultivos,

así como mantener la capacidad productiva de los suelos.

Debido a este contexto una de las prioridades de nuestro grupo ha sido el aislamiento de cepas

bacterianas con potencialidad PGPR de rizosferas donde se haya producido una presión de selección por

parte de la planta y/o de posibles condiciones de estrés, tanto abióticos como bióticos (Gutierrez-

Mañero et al., 1996; Barriuso et al., 2005; Lucas et al., 2013). La metodología que realizamos para aislar

cepas bacterianas tiene varios objetivos, obtener cepas de rápido crecimiento, que crezcan en medios

de cultivo microbiológicos no selectivos, que presenten capacidades potenciales de PGPR (producción

de sideróforos, producción de fosfatasas, producción de quitinasas, degradación de ACC) y que sean

Capítulo 3

187

representativas de los grupos taxonómicos aislados (Barriuso et al., 2008). De esta forma, la aplicación

de las cepas con capacidad PGPR en los sistemas de interés, presenta la ventaja de su fácil producción y

manejo (Ramos Solano et al., 2008; Algar et al., 2012; Gutierrez Mañero et al., 2012; García-Seco et al.,

2013; Lucas et al., 2013). Debido a la manera de seleccionar las cepas bacterianas, han surgido dudas en

el posible sesgo realizado mediante la metodología seguida. Y ello conlleva la pregunta de si estaremos

perdiendo riqueza microbiana. Por ello, el objetivo del presente capítulo es relacionar el estudio

metagenómico del microbióma de la rizosfera de Papaver somniferum, con un aislamiento de cepas con

potencial PGPR procedente de las mismas muestras del estudio anterior.

Las localizaciones del muestreo fueron Barrax (Albacete) y en Malpica de Tajo (Toledo), donde

las condiciones climatológicas son similares, si bien, el terreno presentó diferencias en su composición

físico-química, Barrax se clasificó como un suelo Franco arcillosos arenoso y Malpica de Tajo arcilloso,

ambos con pH básicos (8,6 y 8,4 respectivamente) (tabla 3.1).

Las curvas de rarefacción muestran la acumulación del número de OTUs identificados (Silva et al.,

2010). La cobertura completa de estos datos se encontraría en la zona en forma de meseta de la curva.

En las curvas de rarefacción, se aprecia como al nivel de familia y género cumple dicha condición, por lo

que podemos afirmar que el número de secuencias analizadas es suficiente para poder obtener los

diferentes índices de diversidad.

En ecología microbiana la unidad funcional no está determinada por la especie, sino por “Unidad

Taxonómica Operacional” (OTUs). Para determinar la diversidad total, la observada y la no observada, la

ecología ha distinguido tres estadios de diversidad, denominadas , y (Whittaker, 1960; Tuomisto,

2010). La primera () correspondería con la diversidad localizada dentro de una comunidad o sistema.

La segunda () compararía la diversidad entre comunidades. La tercera representaría la diversidad

abarcando la diversidad y . A su vez, existen diferentes factores que afectan a la diversidad de una

población (), la riqueza o número de especies que la conforman (S), y la abundancia relativa o

proporción de cada especie dentro de la comunidad (E o J) (Bunge et al., 2014).

Según se aprecia en la estructura del microbioma a nivel de familia, se observa una mayor

riqueza (S) en Malpica de Tajo que en Barrax, junto con una mayor diversidad según el índice de

Shannon, presentando valores elevados. Pero cuando esta observación se hace a una distancia de

similitud del nivel taxonómico de género se invierten los valores, y se observa una mayor riqueza y

diversidad en Barrax en comparación con Malpica de Tajo, que son estadísticamente significativos según

indica S-Libshuff.

El grupo más frecuente en ambas rizosferas fue el perteneciente al phylum Proteobacterias,

representando un 54,5% de las secuencias identificadas en Barrax y un 50,4% en Malpica de Tajo,


potencial PGPR

188

encontrando diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos. Esta predominancia de

Proteobacterias se observa también en las cultivables, que también son las más abundantes en Barrax.

Ofek-Lalzar y colaboradores observaron que las comunidades de la rizosfera de tomate, maíz, trigo y

pepino divergían significativamente, pero el grupo taxonómico que predominaba en todos los casos era

Proteobacterias (70%). El segundo phylum más frecuente en Barrax fue Actinobacterias (22,6%), seguido

de Bacteroidetes (9,4%) y Bacteroidetes (9,4%) y Acidobacterias (6,9%), encontrando diferencias

significativas en estos grupos. Por el contarrio, en Malpica de Tajo el phylum predominante después de

proteobacterias fue Acidobacterias (20,2%), Actinobacterias (9,6%), seguido de Bacteroidetes (6,6%) y

Firmicutes (3,9%). Estudios metagenómicos realizados en otras rizosferas, confirman esta distribución

mayoritaria (Bulgarelli et al., 2013). El cambio de la prevalencia de Firmicutes se ha observado en

plantas que presentan una transición a la floración (De-la-Peña et al., 2010), lo que coincide con el

pequeño desfase fisiológico del cultivo ya que en Barrax el cultivo está iniciando el entallado y en

Malpica de Tajo se está finalizando el entallado, iniciando la floración. Al inicio del entallado el

meristemo apical se transforma en una zona de consumo elevado de los fotosimilados, lo que puede

reducir la cantidad y consecuentemente variar la composición de los exudados por la raíz, alterando la

estructura de la comunidad rizosférica. Por otra parte, se ha observado la liberación de compuestos de

defensa por la raíces en este periodo de transición en A. thaliana (Edwards et al., 2013), y todo ello,

podría justificarun cambio en la diversidad del Phylum Firmicutes. El cambio den los Firmicutes a nivel

general se observa también en los cultivables, respaldando la validez de ambas aproximaciones, ya que

los resultados obtenidos mediante ambas estrategias, revelan frecuencias relativas de los principales

Phyla, similares, incluso reflejando la fluctuación de los Firmicutes.

La presencia de una biomasa de origen vegetal, ya sea viva o en forma de biomasa en

degradación modifica la presencia de microorganismos, especialmente en la zona denominada rizosfera,

debido al aporte de sustancias originadas en las plantas que pudieran ser metabolizadas por parte de los

microorganismos como nutrientes entre otras funciones (Bulgarelli et al., 2013; Schlaeppi et al., 2014,

Edwards et al., 2015). La influencia de la planta sobre la estructura del ecosistema microbiano es

ampliamente reconocible y se ha puesto de manifiesto en el presente trabajo. Sin embargo, solo es uno

de los factores de la triple interacción que definen la rizosfera, y es necesario dedicar algo de atención al

tercer elemento que es el suelo.

Mediante NGS se ha demostrado que el suelo es determinante para la composición de la

microbiota, posiblemente debido a que es el primer “inoculante” de la semilla (Bulagerelli et al., 2013).

Entre las características físico-químicas que conforman un sustrato se pueden mencionar la naturaleza

del sustrato, el tamaño de agregación de las partículas, la fracción acuosa, la fracción gaseosa, la presión

parcial de O2, pH, temperatura, disponibilidad de nutrientes entre otras, y entre ellos, la naturaleza del

suelo y el pH son los principales determinantes de la estructura de ecosistema microbiano (Lambers et

al., 2009).

Capítulo 3

189

Papaver somniferum presenta un gran interés farmacológico por ser la única fuente natural,

económicamentente rentable, para la obtención de alcaloides bencilisoquinoleicos (BIAs) de tipo

morfinano, como morfina, codeína, tebaína y oripavina. También es la fuente de otros alcaloides como

sanguinarina y berberina, compuestos antimicrobianos; noscapina, potente antitusivo y potencialmente

antineoplásico y papaverina, usado como vasodilatador (Hagel y Facchini, 2013). Así pues, P.

somniferum presenta un metabolismo secundario complejo y como se indicó en la introducción general,

susceptible de ser modificado por agentes bióticos especializados y por factores ambientales (Angelova

et al., 2010; Wink, 2010). Uno de los componentes bióticos es la interacción de los microorganismos

(microbioma) de la rizosfera con la planta, pudiendo promover cambios en el perfil de los metabolitos

del metabolismo secundario (Kloepper y Schroth, 1978; Lugtenberg y Kamilova, 2009). Dada la fuerte

capacidad de selección de la planta, y la fuerte presión que debe ejercer Papaver somniferum con un

metabolismo secundario muy activo, nos planteamos aislar cepas con potencialidad PGPR, fuertemente

especializadas a las condiciones de alta presión selectiva que tiene lugar en la rizosfera de Papaver

somniferum. Esta estrategia ha rendido buenos resultados en otros cultivos como arroz (Lucas et al.,

2014), Pinus pinaster y Pinus pinea (Barriuso et al., 2005), entre otros, en los que se obtuvieron entre el

40-50% de aislados con potencialidad PGPR, como ha ocurrido en adormidera (33%).

Al identificar las bacterias mediante la secuenciación del gen rss, que codifica para el ARNr 16S

(Woese, 1987), se observó una mayor proporción de Pseudomonas sp. (Proteobacterias), bacterias con

morfología bacilo, Gram-negativas, aerobias estrictas y Bacillus sp. (Firmicutes), bacterias Gram-

positivas, aerobios o anaerobios facultativos, formadores de esporas en la rizosfera de Barrax (Garrity et

al., 2004). En la rizosfera de Malpica de Tajo, también se apreció como el principal género aislado fue

Pseudomona sp y Stenotrophomona sp. (Proteobacterias), Gram-negativo, no esporulado. Según un

meta-análisis de 19 librerías obtenidas de 14 rizosferas diferentes identificó al phylum Proteobacterias

como el más abundante (Hawkes et al., 2007), otros estudios confirman estos resultados, seguido de los

phyla Bacteroidetes, Actinobacterias, Acidobacterias y Firmicutes como los más abundantes (Bric et al.,

1991). Además de los géneros descritos se apreció una mayor presencia de otros géneros, en especial el

suelo de Malpica de Tajo, lo que podría indicar una mayor riqueza.

Las cepas con potencial PGPR se aislaron en base a ciertas actividades bioquímicas, formación

de sideróforos, formación de quitinasas y fosfatasas, síntesis de auxinas. Estas actividades han sido

utilizadas por otros autores como buenos indicadores para la selección de cepas con potencial PGPR

(Lucas et al., 2004; Barriuso et al., 2005; Domenech et al., 2006; Ramos-Solano et al., 2010b).

La principal actividad PGPR de las cepas aisladas en ambos muestreos fue la producción de

sideróforos (figura 3.20) (Lucas et al., 2014), posiblemente debido a la baja movilidad del apH básico. La

disponibilidad de hierro en el suelo suele ser muy baja, ya que en condiciones aerobias el Fe2+ se

transforma a Fe3+ , y a pH superiores a 7 precipita rápidamente como óxido o hidróxido, siendo su


potencial PGPR

190

solubilidad muy baja (10-18 M) (Neilands, 1995), lo que limita la disponibilidad de hierro por parte de las

plantas. Hay bacterias capaces de producir sideróforos que quelan el Fe3+, reduciéndolo y haciéndolo

disponible para la planta (Schalk et al., 2011; Radzki et al., 2013). Por otra parte, aunque de forma

indirecta, la planta puede beneficiarse de una elevada concentración de sideróforos en la rizosfera, ya

que el hierro quelado que queda a su disposición no puede ser utilizado por otros microorganismos

potencialmente perjudiciales que en estas condiciones no tienen posibilidad de asentarse en su raíz.

(Miethke y Marahiel, 2007). Ejerciendo de esta forma un cierto biocontrol en el ecosistema.

Las cepas capaces de producir fosfatasas, eran muy abundantes en ambas parcelas (27%)

siendo la segunda capacidad más frecuente (figura 3.20). Estas enzimas, producidas por plantas y

microorganismos, son necesarias para aumentar la disponibilidad de fósforo para la planta. El fósforo

asimilable está presente en bajas concentraciones 1-10µM, y éste, a pH superiores a 7,5 se inmoviliza

con cationes, principalmente aluminio, hierro y calcio, lo que conlleva una baja disponibilidad para la

planta (Unno y Shinano, 2013). Según el análisis de los suelos, el fósforo asimilable en Barrax es de 35

ppm, no presentando problemas de asimilación, pero en Malpica de Tajo es de 9,4 ppm, siendo un valor

bajo-muy bajo (Navarro B. 1984). Esta situación explicaría la mayor preencia de cepas capaces de

producir fosfatasas en Malpica de tajo (+6,4%), frente a Barrax.

La producción de auxinas presentó una distribución muy desigual en ambas parcelas, 4% en

Barrax y 15% en Malpica de tajo. La producción de auxinas se ha asociado con un mayor desarrollo de la

raíz, posibilitando un mayor absorción de nutrientes y una mayor producción de biomasa (Ljung, 2013;

Vacheron et al., 2013). Como se ha descrito anteriormente, la estructura del suelo de Barrax es arcilloso,

por lo que la planta necesitaría de un mayor desarrollo de las raíces para poder introducirse en el

terreno y captar los nutrientes necesarios. Además, con la baja disponibilidad de fósforo, la planta

necesita desarrollar mayor superficie radical para promover una mayor captación del mismo (Santoro et

al., 2011). Aunque la producción de hormonas por parte de PGPRs ha sido ampliamente descrita en

multitud de trabajos, los determinantes genéticos implicados en su biosíntesis siguen siendo en gran

medida desconocidos.

La distribución de las actividades descritas anteriormente están claramente sesgadas entre

géneros en ambas parcelas. Mientras que en Barrax la mayoría de las actividades las realiza

Pseudomonas sp. en Malpica de Tajo se aprecia una mayor distribución de las mismas entre varios

géneros. Un claro ejemplo de esta situación es la actividad quitinasa. En la zona de Barrax está

mayoritariamente distribuida al Phylum Firmicutes. El género Bacillus se ha caracterizado por la

producción de quitinasas (Cody, 1989), y en esta zona de Barrax toda la actividad la realiza el género

Bacillus. Sin embargo, en la zona de Malpica de Tajo, esta actividad está distribuida principalmente en -

Proteobacterias (Pseudomonas sp.) y minoritariamente en Bacteroidetes. Se ha descrito como la

presencia de Pseudomonas fluorescens y Paenibacillus macerans en la rizosfera de plantas de garbanzo

han sido capaces de limitar la presencia de Fusarium oxysporum (Telfer, 2014). A su vez, se ha

observado una mayor incidencia de “Mildiu” (Peronospora arborescens y Fusarium oxysporum) en la

Capítulo 3

191

finca de Malpica de Tajo (Comunicación personal Javier Seseña). Esta situación podría justificar una

mayor selección por parte de la planta de bacterias con una mayor actividad quitinasa para mejorar su

capacidad para enfrentarse al hongo causante de mildiu, lo que revela la capacidad de selección de la

planta, priorizando la funcionalidad de las bacterias más que el género.

Independientemente de las actividades potencialmente PGPR demostradas in vitro, el genoma

de cada cepa puede encerrar la información necesaria para realizar otras actividades. Además se ha

demostrado que los genes bacterianos implicados en la mejora de la nutrición vegetal son inducibles en

las condiciones naturales de la rizosfera (Rainey, 1999), y por tanto, con el ciclo fenológico de la planta

(Barriuso et al., 2005; García-Seco et al., 2015).

No obstante el hecho de que una cepa demuestre que contiene la información para desarrollar una

actividad potencialmente PGPR, no garantiza que vaya a tener efecto sobre la planta, debido a que esta

bacteria tiene que sobrevivir y colonizar la rizosfera (Goddard et al. 2001; Wiehe and Hoflich, 1995). Otro

requisito para que una bacteria sea efectiva en la rizosfera es que se establezca con las comunidades

presentes en el suelo sin romper su equilibrio; se ha demostrado que cuanto más rápido se recupere el

sistema tras la inoculación más eficaz es la bacteria en el desarrollo de sus funciones (Ramos et al., 2002), y

si no se recupera tras la perturbación inicial, no hay efecto biológico (Ramos et al., 2003).

Una vez que la diversidad fue estudiada, la selección de las cepas para las posteriores pruebas

biológicas en plantas se realizaron con un doble criterio, primero testar la máxima diversidad disponible

(Barriuso et al., 2005), y segundo su potencialidad en la actividades PGPR estudiadas (Ramos-Solano et

al., 2010b). Para ello se utilizaron los arboles filogenéticos de ambas parcelas (figura 3.15 y 3.16),

resultando en una lista de cepas potenciales PGPR (tabla 3.2 y 3.3).

La mejora y aceleración de la germinación y emergencia de las semillas de Papaver somniferum

se ha propuesto como uno de los objetivos planteados en el capítulo anterior de la presente memoria,

proporcionando una información valiosa para detectar el efecto biológico en campo. Por ello, se

procedió a seguir la misma metodología para evaluar el papel de las cepas con potencialidad PGPR

aisladas de la rizosfea de Papaver en dicho proceso fisiológico. Como primera aproximación al efecto

biológico. Las cepas PA1-7 (Pseudomonas moraviensis, -Proteobacterias), PA1-95 (Bacillus

endophyticus, Firmicutes), PA3-2 (Acinetobacter calcoaceticus, -Proteobacterias) PM2-26

(Stenotrophomonas maltophila, γ-Proteobacterias) y PM3-40 (Pseudomonas brassicacearum, γ-

Proteobacterias) y sus medios libres de bacteria aumentaron el porcentaje de germinación de las

semillas de adormidera. Como se indicó en detalle en el capítulo 2, esta situación puede ser debida a la

liberación de moléculas al medio de tipo hormonal, especialmente giberelinas, que aceleren el proceso

de germinación (Gutiérrez-Mañero et al., 2001), y aunque en menor medidad, también se ha

relacionado con la presencia de auxinas y el ácido abscísico (Miransari y Smith, 2014). Entre estas cepas,

PM3-40 (Pseudomonas brassicacearum) era capaz de sintetizar auxinas.

La elección de estas bacterias para realizar futuros experimentos, como los descritos en el

capítulo anterior, presentan varias ventajas frente a otras cepas con potencial PGPR; al ser rizobacterias


potencial PGPR

192

de la propia planta de adormidera la interacción planta-microorganismo puede ser más óptima. Y al ser

cepas de géneros muy comunes en otras rizosferas, Pseudomonas, Bacillus, Acinetobacter y

Stenotrophomonas, podría facilitar la integración de las mismas en las comunidades autóctonas.

Resulta llamativo que de las tres cepas seleccionadas procedentes de otras especies vegetales

utilizadas en el segundo capítulo, Chryseobacterium, Pseudomonas y Stenotrophomonas, se

hayan identificado en la rizosfera de Papaver somniferum (figura 3.24). Mientras que

Chryseobacterium y Pseudomonas aparecen en las dos zonas, Stenotrophomonas, la más

eficiente, solo se encuentra en Malpica de Tajo.

Capítulo 3

193

3. 6 Conclusiones

Las Proteobacterias son el grupo con mayor frecuencia relativa en la rizosfera de

Papaver somniferum, seguido Actinobacterias y Bacteroidetes tanto en cultivables

como en el estudio metagenómico. Lo que sugiere que el sesgo introducido en el

aislamiento de bacterias cultivables afecta básicamente a grupos de baja frecuencia

pero no a los grupos más representativos del microbioma rizosférico de Papaver

somniferum.

El análisis de las comunidades microbianas en las dos parcelas de cultivo muestreadas

indican una clara predominancia de la planta sobre la estructura de dichas

comunidades, siendo la biodiversidad alta en ambas parcelas.

Las fuertes diferencias estructurales y fisicoquímicas de los dos suelos muestreados se

reflejan en las potencialidades PGPR de las cepas cultivables aisladas, sin embargo no

se aprecian fuertes diferencias a nivel taxonómico entre ambos sistemas, lo que

refuerza la hipótesis del fuerte efecto de selección por parte de la planta.


potencial PGPR

194

195

CONCLUSIONES GENERALES

Conclusiones

196

Conclusiones Generales

1. Las cepas PGPR N21.4 (Pseudomonas fluorescens), N5.18 (Stenotrophomonas maltophila), Aur9

(Chryseobacterium balustinum) ensayadas son capaces de acelerar la germinación de las semillas de

Papaver somniferum.

2. La cepa N5.18 N5.18 aceleró la emergencia en condiciones de baja temperatura y en presencia de una

capa seca superficial del sustrato, “self-munching”.

3. En condiciones de invernadero, la aplicación de las bacterias a nivel radicular estimula la producción

de semillas en detrimento del contenido de alcaloides, mientras que la aplicación foliar favorece el

desarrollo de la “paja” de adormidera.

4. Considerando todos los factores de variación Stenotrophomonas maltophila N5.18 mediante

aplicación foliar al final del entallado es el tratamiento más eficiente para aumentar el contenido en

morfinanos.

5. La cepa Stenotrophomonas maltophila N5.18 mejora la eficiencia fotosintética de Papaver

somniferum. A su vez, activa la expresión génica de la enzima codeinona-O-demetilasa (CDMR). Esta

situación se traduce en un incremento en el peso de las cápsulas y/o en un incremento de alcaloides.

6. La cepa Pseudomonas fluorescens N21.4 aplicada al final del entallado afecta de forma acusada a la

fisiología de la planta comprometiendo su crecimiento y disminuyendo el contenido en alcaloides, lo

que indica que es capaz de inducir un estado de “priming” en Papaver somniferum.

7. Los grupos con mayor frecuencia relativa en el microbioma de la rizosfera de cultivos de Papaver

somniferum son Proteobacterias, Actinobacterias y Bacteroidetes. Los estudios metagenómicos

comparados con el aislamiento de cepas cultivables, no muestras sesgos en los principales grupos

identificados

8. Papaver somniferum ejerce un efecto predominante en la selección de rizobacterias, según las

propiedades físico-químicas del sustrato.

198

BIBLIOGRAFÍA

199

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219

ANEXOS

Anexo I

220

ANEXO I

Registro de condiciones meteorológicas en las diferentes campañas

En este anexo se reflejan, de forma gráfica, tres factores que afectan de forma directa al

desarrollo y posterior rendimiento del cultivo de Papaver somniferum, temperatura media, humedad

relativa y precipitación acumulada (Mahdavi-Damghani , Kamkar et al., 2010; Matyášová , Novák et al.,

2011). Los datos han sido obtenidos de la estación meteorológica 8175, localizada en la base aérea de

Los Llanos, Albacete (AEMET, 2016). Se ha representado el periodo de cultivo de adormidera en la

región, de febrero a julio, de las correspondientes campañas.

Temperatura media:

En la figura 4.1 se aprecia el aumento de temperatura media desde que se inicia el cultivo de

adormidera, con la plantación de las semillas en febrero, hasta la recolección de las cápsulas secas en

julio. Las diferentes campañas registraron una tendencia similar referenciado a las temperaturas medias

del periodo 1981-2010, si bien la tercera campaña difirió principalmente en febrero (-3,9 C) y en los

meses de mayo (+2,1 C) y junio (+2,5 C).

Figura 4.1 Temperatura media (C) durante los meses de desarrollo del cultivo de Papaver somniferum, en las tres

campañas de estudio y durante el periodo comprendido entre 1981-2010 (AEMET, 2016a).

Humedad relativa media:

En la figura 4.2 se pueden observar los valores medios de la humedad relativa (%) registrado en

los diferentes meses de las tres campañas y del histórico entre 1981 -2010. Los datos muestran un

descenso progresivo según el registro histórico. Si bien, se aprecian incrementos en los meses de marzo

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

Febrero Marzo Abril Mayo Junio Julio

ºCTemperaturas medias

1ª Campaña 2ª Campaña 3ª Campaña Media 1981-2010

221

(+8,9%) y mayo (+7,5%) en la segunda campaña. Por el contrario, se aprecia un descenso en la humedad

relativa en los meses de febrero (-18,6%), marzo (-9,5%), mayo (-6,3%), junio (-11,4%) y julio (-7,2%) de

la tercera campaña.

Figura 4.2 Humedad relativa (%) media durante los meses de desarrollo del cultivo de Papaver somniferum, en las

tres campañas de estudio y durante el periodo comprendido entre 1981-2010 (AEMET, 2016a).

La figura 4.3 muestra la precipitación (mm) acumulada durante las tres campañas de estudio,

así como durante el histórico registrado entre 1981 y 2010 (AEMET, 2016a). En este parámetro se

aprecia una gran variación de los datos registrados a lo largo de las campañas en referencia al registro

histórico. Si bien, podemos resumir que la primera campaña se podría resumir como una campaña

húmeda, debido a los aportes de lluvia los meses de febrero (+37,2 mm), marzo (+33,8 mm) y

especialmente junio (+29,5 mm). La segunda campaña se podría dividir en dos periodos, la primera

etapa abarcaría desde marzo (-7,2 mm) a abril (-23,8 mm), la cual correspondería a un periodo seco.

Pero debido a las lluvias de mayo (+11,9 mm) hasta el momento de la cosecha se transformaría a una

segunda fase normal. Por el contrario, la tercera campaña se inició con un mes de febrero (-19,4 mm)

seco, seguido de un mes de marzo normal, pero con un resto de campaña con una precipitación

acumulada inferior al registro histórico. Por ello, la tercera campaña está considerada como seca.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0


%Humedad relativa media


Anexo I

222

Figura 4.3 Precipitación acumulada (mm) durante los meses de desarrollo del cultivo de Papaver somniferum, en las

tres campañas de estudio y durante el periodo comprendido entre 1981-2010 (AEMET, 2016a).

Al valorar el promedio de los tres parámetros, temperatura media, humedad relativa y

precipitación acumulada, a lo largo de las campañas de estudio, se podría definir la primera campaña:

como fría-húmeda; segunda campaña: templada-normal; tercera campaña: Templada-seca (AEMET,

2016a; AEMET, 2016b).

Tabla 4.1 Valores medios de temperatura, humedad y precipitación acumulada en las tres campañas de estudio

(AEMET, 2016).

1ª Campaña 2ª Campaña 3ª campaña Media 1981-

2010

Temperatura media (°C) 12.3 13.6 13.0 13.2

Humedad (%) 64.4 62.6 50.7 59.6

Precipitación (mm) 55.5 30.8 16.9 34.0

Fría Húmeda

Templada Normal

Templada Seca

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0


mmPrecipitación acumulada


223

ANEXO II

Médios de cultivo

- Solución nutritiva Hoagland (Sigma H2395).

Por litro:

NH4H2PO4........................................... 0,115 g

H3BO................................................... 0,0286 g

Ca(NO3)2............................................. 0,656 g

CuSO4................................................. 0,008 g

Fe2(C4H4O6)3....................................... 0,0053 g

MgSO4................................................ 0,240 g

MnCl2.................................................. 0,0018 g

Mo2O3................................................. 0,000016 g

KNO3................................................... 0,6066 g

ZnSO4.................................................. 0,00022 g

-Agar para métodos estándar PCA (Conda Cat.1056).

Por litro:

Triptona…………………………… 5,0 g

Extracto de Levadura……………… 2,5 g

Dextrosa……………………………1,0 g

Agar bacteriológico……………….. 15,0 g

- Caldo Nutritivo (Conda Cat.1216).

Por litro:

Peptona de Gelatina……………… 5,0 g

Extracto de Carne………………… 3,0 g

-Medio para la detección de bacterias solubilizadoras de fosfato: PDYA con fosfato recién precipitado

(de Freitas et al., 1997)

Por litro:

PDA…………………………… 39 g

Extracto de Levadura………... 2 g

CaCl2…………………………... 5 g

K2 HPO4……………………….. 2,5 g

Preparar el medio PDYA disolviendo el PDA junto con el extracto de levadura en 850 mL de

agua y llevar a ebullición. Una vez enfriado con agitación suave llevar a ph 7 con NaOH.

Preparar dos soluciones por separado:

100 mL CaCl2 10%

50 mL K2 HPO4 10%

Anexo II

224

Esterilizar mediante un ciclo de autoclave por separado el medio y las dos soluciones. Enfriar el

PDYA con agitación suave. Una vez en frio añadir la solución de K2HPO4 10% sobre la de CaCl2 10% en

agitación suave y en condiciones estériles. Después y manteniendo la agitación suave y las condiciones

estériles añadir al PDYA la solución resultante (fosfato precipitado).

-Medio para la detección de la producción de sideróforos (Alexander y Zuberer, 1991)

Solución 1 o solución indicadora de Fe-CAS: consta de 3 soluciones a su vez.

Solución A: 10 mL de cloruro férrico 1 mM en clorhídrico 10 mM.

Solución B: solución acuosa de CAS (cromo azurol S) 1,21 mg/mL.

Solución C: solución acuosa de HDTMA 1,82 mg/mL

Solución 1: Añadir A sobre B despacio, y queda una solución púrpura. Añadir esta solución sobre la C,

agitando suavemente para que no se formen burbujas. Esterilizar mediante un ciclo de autoclave.

Solución 2 o solución tampón:

700 mL agua miliQ

KH2PO4………………….. 0,3 g

NaCl……………………... 0,5 g

NH4Cl……………………. 1,0 g

PIPES…………………….. 30,24 g

Llevar a pH 6,8 con KOH 50%. Llevar a 800 mL

Añadir 15 g de agar purificado y esterilizar mediante un ciclo de autoclave.

Solución 3 o solución de oligoelementos:

CuCO4.5H2O……………. 0,4 g L-1.

Estos elementos están 10X; se resuspenden en 60 mL de agua miliQ.

MnSO4.H2O…………….. 0,0117 g

H3BO3…………………... 0,014 g

ZnSO4.7H2O……………. 0,012 g

Na2MoO4.2H2O………… 0,01 g

Añadir a (10 mL) sobre b (60 mL) y llevar a 700 mL con agua miliQ y esterilizar mediante un ciclo de

autoclave.

A estos 700 mL añadirles

MgSO4.7H2O…………… 0,493 g

CaCl2…………………… 0,011 g

Glucosa………………... 2 g

Manitol………………... 2 g

Solución 4: CAS aminoacids al 10%. Esterilizar por filtración.

Preparación del medio: En condiciones estériles y agitación añadir la solución 3 sobre la 2.

Filtrar 30 mL de la solución 4 sobre lo anterior. En agitación más suave añadir la solución 1 poco a poco.

mejora biotecnológica de la producción de alcaloides de

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