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Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología

Procesos Industriales de Separación

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa


BIOTECNOLOGÍA ENZIMÁTICAY BIOCATÁLISIS

BIOTECNOLOGÍA AGRÍCOLA Y VEGETAL

BIOTECNOLOGÍA DE ALIMENTOS y BEBIDAS

BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL

BIOINGENIERÍA Y FERMENTACIONES

FISIOLOGÍA MICROBIANA

BIOTECNOLOGÍA MARINA

BIOTECNOLOGÍA MÉDICO FARMACÉUTICA

BIOENERGÍA Y BIOCOMBUSTIBLES

BIOLOGÍA SISTEMAS Y CIENCIAS ÓMICAS

BIOMATERIALES NANOESTRUCTURADOS

http://www.smbb.com.mx/


Son procesos basados en la utilización de células vivas (silvestres o sometidas a manipulación genética) o sus subcomponentes (enzimas).

PROCESOS BIOTECNOLÓGICOS

Medio ambiente

Agricultura

Farmacia

MedicinaCiencia de los alimentos


“ UPSTREAM”- formulación de medios- desarrollo de inóculo- esterilización- inoculación

“ DOWNSTREAM ”- extracción de producto, purificación y refinamiento- tratamiento de aguas- recuperación de subproducto

FERMENTACIÓN

Esquema de un bioproceso


Proceso de bioseparación

• Definición: Recuperación, aislamiento, purificación y refinamiento de productos sintetizados por procesos biotecnológicos

• Definición extendida: Etapas de refinamiento final de procesos tales como tratamiento de efluentes y purificación de agua por biotecnología.

El procesamiento de un producto después de la fermentación se denomina “ downstream processing” (procesamiento descendente )


Además, queremos una alta pureza del producto. Para aplicaciones médicas a veces 99.999 %

¡¡¡ El fermentador contiene mucha agua !!!Varía entre 80 % en el caso de la producción de alcohol y 95 % para algunas proteínas

terapéuticas

El producto puede estar dentro de los microorganismos (intracelular). Tenemos que destruir estas células, para obtener el producto.

El caldo de fermentación es una mezcla compleja, que a menudo contiene compuestos que se asemejan a los productos,

Problemas específicos:


¿Por qué necesitamos bioseparación?

• Enriquecimiento del producto objetivo

• Reducción de volumen

• Remoción de impurezas específicas

• Mejoramiento de la estabilidad del producto

• Alcanzar las especificaciones del producto

• Prevención de la degradación del producto

• Prevención de otras catálisis diferentes a las deseadas

• Prevención de envenenamiento del catalizador


Retos en ingeniería de bioseparaciones

•Bajas concentraciones de producto•Gran número de impurezas•Termolabilidad de bioproductos•Estrecho margen de operación de pH y fuerza iónica•Sensibilidad al esfuerzo cortante de bioproductos•Baja solubilidad de bioproductos en solventesorgánicos•Inestabilidad de bioproductos en solventes orgánicos•Estrictos requerimientos de calidad

•Porcentaje de pureza•Ausencia de impurezas específicas

Un proceso ideal de bioseparación debe combinar alta capacidad con alta selectividad, y debe asegurar estabilidad del producto


Efecto del producto en el proceso de separación

Extensión y tipodel proceso de

separación

Naturalezadel producto

Calidadrequerida(Mercado)


The bioseparations needs for tomorrow (Keller et al., 2001)

Material properties have to be considered for the development of bioseparation processes.


Productos biológicosProductoProductoProductoProducto NaturalezaNaturalezaNaturalezaNaturaleza dededede lalalala bioseparaciónbioseparaciónbioseparaciónbioseparación

requeridarequeridarequeridarequeridaBebidas alcohólicas:Cerveza, vino, licores

Clarificación, distilación

Ácidos orgánicos:Ácido acético, ácido cítrico

Precipitación, filtración, adsorción, extracción con solventes

Vitaminas:Vitamina C, vitamina B12, riboflavina


Amino ácidos:Lisina, glicina, fenilalanina


Antibióticos:Penicilinas, neomicina, bacitracina


Carbohidratos:Almidón, azúcares, dextranas

Precipitación, filtración, adsorción

Lípidos:Glicerol, grasas, ácidos grasos



Productos biológicos (cont...)Proteínas:Alimentos y sus aditivosNutracéuticosEnzimas industrialesHormonasEnzimas farmacéuticasProductos derivados de plasmaAnticuerpos monoclonalesFactores de crecimientoTrombolíticosProteínas derivadas de r-DNAProteínas de diagnósticoVacunas

Filtración, precipitación, centrifugación, adsorción, cromatografía, separacionesbasadas en membranas

Productos basados en DNA:Pruebas de DNA, plásmidos, nucleótidos, oligonucleótidos

Filtración, precipitación, centrifugación, adsorción, cromatografía, separacionesbasadas en membranas


Un buen proceso de separación:

• Asegura la pureza deseada del producto

• Asegura la estabilidad del producto

• Mantiene costos bajos

• Es reproducible

• Es escalable

• Cumple con las regulaciones establecidas


La economía del proceso está determinada por:

• Capital invertido• Costos de operación• Otros factores

– Eficiencia de las operaciones unitarias individuales

– Pérdidas en cada etapa

– Destrucción o degradación del producto durante el proceso

– Estado físico del producto al final de cada etapa

– Costo del tratamiento del efluente


Correlación entre concentración de producto antes de la purificación y precio de venta

Precio de venta ($/kg)

10 -3 10 -1 10 1 10 3 10 5 10 7 10 9 10 1110 -7

10 -5

10 -3

10 -1

10 1

10 3

10 5

Agua

EtanolÁcido cítrico

Factor VIIII

Urokinasa

Luciferasa

PenicilinaTreonina

CefalosporinaGentamicina

Proteasasmicrobianas

Amilasas

Ácido giberélico

Renina

Hormona humana de crecimientoActivador plasminógenode tejido

Vacuna B hepatitis

Glicerofosfatodeshidrogenasa

Insulina

Glucosaoxidasa

Amino ácidos

Antibióticos

Enzimas

Enzimas dediagnóstico Anticuerpos

monoclonales Enzimasterapéuticas

(Knight, 1989)


Importancia económica de la ingeniería de la bioseparación

Costo de bioseparación

ProductoProductoProductoProducto Precio relativo Precio relativo Precio relativo Precio relativo aproximadoaproximadoaproximadoaproximado

Costo del proceso de Costo del proceso de Costo del proceso de Costo del proceso de separación (%)separación (%)separación (%)separación (%)

Etanol 1 15Proteína unicelular 0.8 20

Biomasa de levadura 2 20Ácido cítrico 3.2 30-40

Glutamato monosódico 5 30-40Xantanas 20 50

Penicilina G 60 20-30Enzimas a granel 100 40-65

Proteínas terapéuticas/DNA

>500 60-80


Importancia de los procesos de separacióna diferentes niveles de producción

Nivel de producción Alto1 Medio2 Bajo 3

Fuente m.o.seleccionado

m.o. mutadosy DNA recomb.

m.o.DNA recomb.

Pureza requerida Bajo70 - 99 %

Mediana a alta90 - 99 %

Alta99.95 - 100 %

Eficiencia de recuperación 90 - 100 % 50 – 90 % 5 – 50 %Costo recup./costo de producción 0.1 – 0.2 0.3 – 0.7 0.5 – 0.9Costo recup./(costo de producción+ costo de desarrollo)

0.1 – 0.2 0.1 – 0.5 0.01 – 0.2

1 Ácido cítrico, 300,000 TON/año (1987)2 Insulina, 1 TON/ año (1987)3 Interferon, 10-5TON/año (1987)


Estrategias para bioseparación

Están disponibles un gran número de métodos de bioseparaciónLa estrategia está basada en como estos métodos pueden ser mejor

utilizados para una separación dada

Se necesita tomar en cuenta lo siguiente:• El volumen de la corriente de proceso• La abundancia relativa del producto en esta corriente de

proceso• El uso que se le intenta dar al producto, esto es,

requerimientos de pureza• El costo del producto• Requerimientos de estabilidad


Las tecnologías de separación pueden clasificarse de acuerdo a su principio fundamental(Las barras representan el costo relativo de cada proceso)



Pureza

Etapas

•Purificación inicial•Estabilización•Clarificación•Concentración

Remoción de:proteínas, ácidos nucléicos,

endotoxinas y virus

Pureza final

Captura

Purificaciónintermedia

Refinamiento

Proceso de purificación cromatográfica de macromoléculas


Capacidad

Recuperación

Resolución

Velocidad

Selección y combinación de técnicas de purificación

Cada técnica ofrece un balanceEntre resolución, capacidad,Velocidad y recuperación

Minimice el manejo de la muestraMinimice el número de etapasUse diferentes técnicas en cada etapa


Propiedades de las técnicas de purificación comúnmente usadas

Precipitación porpH

Carga Alta Muy baja Medio Bajo >1 mg ml-1 Volumen pequeñoConcentración alta

Precipitación con(NH4)2SO4

Hidrofobicidad Alta Muy baja Alto Bajo >1 mg ml-1 I altoVolumen pequeñoConcentración alta

Extracción en dosfases acuosas

MezclaBioafinidad

AltaAlta

Muy bajaAlta

AltoVariable

BajoAlto

Puedecontenersólidos

Concentración depolímero alta (PEG)

Cromatografía deintercambio iónico

Carga Media Media Medio Medio I BajopH correcto

I altopH diferente

Cromatografía deinteracciónhidrofóbica

Hidrofobicidad Media Media Medio Medio I alto I bajopH diferente

Cromatoenfoque Carga / pI Baja Alta Medio Alto I bajo Presencia de anfolitos

Cromatografía deafinidad de teñido

Mezcla Media Alta Medio Medio I bajopH neutral

I altopH diferente

Cromatografía deafinidad de ligando

Bioactividad Media-Baja Muy alta Bajo Alto Dependientesobre elligando

Condiciones dedesnaturalizaciónpotencial

Cromatografía depermeación en gel

Tamaño Muy baja Baja Alto Medio Volumen bajo Diluido

Técnica Propiedadexplotada

Capacidad Resolución Rendimientopromedio

Costo Composiciónmuestra

Composiciónproducto


Estrategia convencional:

• Recuperación, aislamiento, purificación y refinamiento

• Basado en arreglos lógicos de métodos de bioseparación

• Las técnicas de baja resolución, alta capacidad (por ejemplo, precipitación, filtración, centrifugación, cristalización) se usan primero para recuperación y aislamiento

• Las técnicas de alta resolución (por ejemplo, adsorción, cromatografía, electroforesis) son entonces usadas para purificación y aislamiento


Métodos de bioseparaciónBaja resolución – alta capacidad• Ruptura celular• Precipitación• Centrifugación• Extracción líquido-líquido• Percolación• Filtración• Extracción con fluídos supercríticos• Microfiltración• DiálisisAlta resolución – baja capacidad• Ultracentrifugación• Adsorción• Cromatografía de lecho empacado• Separación por afinidad• Electroforesis


Métodos de bioseparación (cont...)

Alta resolución-alta capacidad

• Ultrafiltración

• Cromatografía de lecho fluidizado

• Cromatografía de membrana

• Cromatografía de columna de “Monolith”


Captura

Capacidad

Recuperación

Resolución

Velocidad

� Use una técnica de alta capacidad para reducir el volumen de la muestra� Concéntrese en lo robusto y simple de la primera etapa de purificación

� Definición: Purificación inicial de la molécula objetivo de un material crudo� Meta: Rápido aislamiento, estabilización y concentración


Purificación intermedia

Capacidad

Recuperación

Resolución

Velocidad

� Use diferentes técnicas en cada etapa� Minimice el número de etapas

� Definición: Nueva remoción de contaminantes� Meta: Purificación y concentración


Refinamiento

Capacidad

Recuperación

Resolución

Velocidad

� Use diferentes técnicas en cada etapa

� Definición: Remoción final de contaminantes traza, Ajuste de pH, sales oaditivos para almacenamiento

� Meta: Producto final de alto nivel de pureza requerido


Planeando las estrategias de purificación

Elección de las técnicasCapacidad(C)Resolución(R)Rendimiento de proteínaCosto

Ordenando las técnicasPrecipitación (alta C y baja R)Intercambio iónico (mediana C y mediana R)Cromatografía de afinidad (mediana/baja C y alta R)


Reducción del volumen de operación en cada etapa

Reduccióndel volumen

Precipitación

Centrifugación

DiálisisIntercambio iónico

Filtración en gelSecado Enzima

en polvo

Sobrenadante

Precipitado



In bioseparation, the challenge is to find and adapt the relevant types of separation technologies. Abbreviations: E, evaporation separation process; M, membrane separation process; S, sorption (ab/adsorption) separation process.



The bioseparation needs of tommorrow: (a) selective separation methods; (b) scale-up of separation technologies to meet technical and economic requirements; (c) the combination of traditional and novel methods and (d) cost-effective large-scale processes.


Producción de celulasas (Ghose y Pathak, 1973)

Cultivo sumergido

Cultivo sólido(Técnica koji)


Producción de enzimas

Cultivo microbiano

Fermentador para siembra

Cultivo sumergido Cultivo sólido

Extracto crudo

Adición deestabilizantes

Enzima en solución

Precipitación

Cromatografía

Secado

Enzima en polvo


Ubicación de las enzimas

Centrifugación o filtración

Rompimientocelular

Centrifugacióno filtración

Precipitación Cromatografía

Secado Ultrafiltración

Extracciónlíquido-líquido

Enzimasextracelulares

Enzimasintracelulares


Estrategia de purificación

Calidad

Cantidad

Economía

Producción

Enzima


Preservando la actividadMinimizar

a) Desnaturalización

c) Inactivación

b) Proteólisis


El problema más común es la pérdida de actividad repentina, debida a:

• Falla del ensayo• Composición incorrecta del buffer• Impureza de los reactivos• Proteólisis• Precipitación• Presencia de un inhibidor• Pérdida de un inhibidor o cofactor


Conceptos de purificación de proteínas

• Factor de purificación– Es la relación entre la actividad específica después de una

técnica de purificación y la actividad específica en el extracto crudo

• Rendimiento– Es la evaluación de la cantidad de actividad o proteína

activa obtenida después de una técnica de purificación. Generalmente es reportada en %.

Siendo el 100% la actividad del extracto crudo


Frecuentemente se necesitan muchas etapas de separación en un proceso

En cada etapa puede perderse producto y resultar en una gran pérdida

Por ejemplo:Si esperamos una pérdida del 10 % del producto de cada etapa. El rendimiento en 5 etapas sería: 0.59 %

• Otro problema en biotecnología es la gran cantidad de residuos, principalmente contaminación del agua.

• Podemos reducir las pérdidas de producto y desechos mediante una elección inteligente de las fases del proceso y la forma de ordenarlos en la cadena de proceso.

No. de EtapasRendimiento

Por etapa (%)Rendimiento

global

Después de 1 etapa 0.90 0.90

Después de 2 etapas 0.90 0.81



Después de 5 etapas 0.90 0.59Esto significa que el número de etapas es muy importante !!!


Etapa

Volumen

(mL)

Actividad

Total

(U)

Proteina

Total

(mg)

Actividad

Específica

(U/mg)

Factor de

purifcación Rendimiento

(%)

EC (1) 500 3,000 15,000 1.00 100

SA (2) 100 2,400 4,000

CII (3) 45 1440 500

FG (4) 50 1000 125

Etapas: (1) Extracto crudo. (2) Precipitación con Sulfato de amonio.(3) Cromatografía de intercambio iónico. (4) Filtración en gel

Construcción de una tabla de purificación


Intensificación de procesosLa definición de intensificación de procesos (PI) incluye: equipos novedosos,técnicas de procesamiento y métodos de desarrollo de procesos que, encomparación con los convencionales, ofrecen mejoras sustanciales en la fabricacióny procesamiento de productos (bio) químicos.(Moulijn et al. Process intensification and process systems engineering: A friendly symbiosis. Computers and Chemical Engineering 32 (2008) 3–11)

PI como objetivo y área de habilidad.

El objetivo para la ingeniería de los sistemas de proceso (PSE), es mejorar la toma de decisiones para la creación y funcionamiento del descubrimiento, diseño, fabricación y distribución de productos (bio) químicos.


Objetos y escalas de estudio en PI y PSE

Moulijn et al. (2008) Process intensification and process systems engineering: A friendly symbiosis.Computers and Chemical Engineering, 32: 3–11.


Moulijn et al. (2008) Process intensification and process systems engineering: A friendly symbiosis.Computers and Chemical Engineering, 32: 3–11.


Comparación de un proceso de extracción de tres fases con el proceso de extracción convencional

La intensificación de procesos es una de las tendencias más importantes en la ingeniería química actual y en las industrias de procesos .

(Hui Zhou et al. 2010. Challenges and innovations in green process intensification. Sci. China-Chemistry, 53: 1470-1475).

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