3. Conceptos (Mentefacto)

¿Se cumplió la Ley de Michaellis

en este experimento? Porqué?

¿Cuál es el valor de la cons-

tante de Michaellis, la velo-

cidad Máxima y el coeficien-

te de correlación ( R), de la

cinética estudiada

¿Cual es la ecuación

de Michaellis en este

experimento?

Caracterización enzimática

de Ureasa, proveniente de

un suelo del Sumapaz

Dimensión Metodológica

10. Conclusiones:

1. El Problema

Interacción

2. Preguntas centrales Fundamentación conceptual

TCA y colisiones 5. Teorias:

4. Principios:

El complejo activado y las colisiones

moleculares, Describen el comportamiento

cinético molecular de la enzima Ureasa

sobre los enlaces Qcos de la urea (sustrato).

Michaellis-Menten

Establece relación entre V de la RBE y la

Concentración del sustrato (urea).

9. interpretación y discusión:

• La constante de Michaelis ó de afinidad, Km,

corresponde a una conc. de 0.0103 mol de urea

por litro de solución.

• La gráfica de la doble recíproca presentó una

correlación lineal altamente significativa (p<0.01).

7. Transformacion de datos (Cálculos) • Hallar: 1/[S| y 1/V (doble recíproca)

• Graficar 1/[S| y 1/V y linealizar

• Aplicar Regresión lineal por mínimos cuadrados

• Mediante esta técnica se obtiene:

• b = 0.9874 min/mol; m= 0.0102min/L; R2 = 0.999

• Se calcula Km y Vmax; así

• Km = m / b ; Vmax = 1 / b

1 / b m / b

UREASA

V max. [S|

V = --------------

Km + [S|

cumple

Cinética Michaelliana

Desdobla

la

Urea

produciendo

NH4OH CO2

V [S]

relaciona

V

[S|

Puede

ser es

Donde

aparece

así

Vmax Km

es es

6.Procedimiento yTabla de Datos

Velocidad

(mol/min)

0,0050 0,330

0,0100 0,500

0,0200 0,670

0,0500 0,830

0,1000 0,910

Indicador Valor

Km 0,0103 mol/L

Vmáx 1,013 mol / min

R2 0,999

Ecuación cinética de Michaelis

8.Tabla de Resultados 8.1 Gráficas

y = 0,0102x + 0,9874R² = 0,9999

0

1

2

3

4

-100 0 100 200 300

1/V

(m

in/m

ol)

1/ [S](L/mol)

Gráfica 2: Doble Recíproca para la cinética ureásica

• La cinética de la Ureasa, proveniente del suelo

de Sumapaz, cumplió la Ley de M-M, debido

a la alta correlación lineal entre los recíprocos de

[s | y la V.

Jairo Granados., MSc

DETERIORO DE

SUELOS

PROBLEMA

Manejo

cultural Monocultivos

Sobrepastoreo

Intensivo

Labranza

Tradicional

Calidad de la

MO

CAUSAS

CAUSAS

Fertilización

arbitraria

Productividad

Desgaste

Nutrientes

Desertificación

Microbiota

Actividad

Enzimática

Fijación Biológica

del Nitrógeno

.

Jairo Granados., MSc

2

Quemas

Erosión

Agricultura

intensiva

Actividad

Microbiológica

Bioactividad

NNP

Actividad

Ureásica

Muestreo Pesada Extracción Titulación ¿Viraje de

color?

Finalizar Resultados Datos

No

Si

Cuantificación Actividad Ureásica (AU)

Jairo Granados., MSc 3

Jairo Granados., MSc 4

Ureasic Activity

Carbon Dioxide

(CO2) Optimun

Temperatura:

37°C

Relates to

NPN in plants

and soils Organic

Matter

Ammonio

(NH3)

Optimun pH:

7,0

(H2N-CO-NH2)

Characteristics

Is based on

:

Ammonium

Hydroxide

NH4OH

Microbial Activity

in Soils

Molecular

kinetic theory

Activated

complex theory

Biochemical

reactions

of hydrolysis

their

products are

The enzyme is

urease

(amidohydrolase)

Urea is the

substrate

Biological Fixation

of Nitrogen

Jairo Granados., MSc

5

Gráfica 1 : Curva Cinética de Michaelis-Menten

Ley Cinética de Michaelis-Menten para una RBE

Jairo Granados., MSc 6

Ecuación Cinética de Michaelis-Menten:

V= 𝑉𝑚á𝑥.[𝑈𝑅𝐸𝐴]

𝐾𝑚+ [𝑈𝑅𝐸𝐴]

Ecuación Cinética de la Doble Recíproca de Linneweaver and Burk

1

𝑉=

𝐾𝑚

𝑉𝑚á𝑥×

1

[𝑢𝑟𝑒𝑎]+

1

𝑉𝑚á𝑥

Ecuaciones Cinéticas de una RBE

Jairo Granados., MSc 7

E + S (E--S)*K1

K2

K3 P + E

Teoría del Complejo Activado(TCA)

Gráfica 2: Curva energética del avance de una RBE, según TCA Jairo Granados., MSc 8

Indicador Significado Valor

Km

Constante de Afinidad ó

de Michaelis 0,0103 mol/L

Vmáx Velocidad ó Actividad

Máxima 1,013 mol / min

R2 Coeficiente de

correlación de Pearson 0,999

Ecuación cinética de Michaelis-Menten

Tabla 1:Parámetros cinéticos para la RBE de la ureasa

Jairo Granados., MSc 9

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

Velo

cid

ad

de R

BE

(m

ol/

min

)

Concentración de la Urea (mol/L)

Gráfica 3: Gráfica cinética de Michaelis para la RBE de la ureasa

V= 1,013.[𝑈𝑅𝐸𝐴]

0,0103+ [𝑈𝑅𝐸𝐴]

Gráfica cinética de Michaelis-Menten

Jairo Granados., MSc 10

1/ V

(min/ mol)

200 3,03

100 2,00

50 1,49

20 1,20

10 1,09

y = 0,0102x + 0,9874 R² = 0,9999

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 50 100 150 200 250

1/V

(m

in/m

ol)

1/ [S](L/mol)

Gráfica 4: Gráfica de la doble recíproca para la RBE de la ureasa

Tabla 2: Datos para Doble recíproca

Gráfica Cinética de la Doble Recíproca de Linneweaver and Burk

1

𝑉= 0,0102 ×

1

[𝑢𝑟𝑒𝑎]+ 0,9874

Jairo Granados., MSc 11

1. En este experimento, Se cumplió la Ley de Michaellis-Menten, debido a que se presentó un comportamiento

hiperbólico en la curva cinética de Velocidad contra Concentración de Urea y también a la alta correlación lineal

entre los recíprocos de [s | y la V.

2. La constante de Michaelis para la ureasa extraída fue de 0,0103 mol/L, lo cual significa que la enzima

mostró una buena afinidad por el sustrato: Urea

3. La velocidad ó actividad máxima de la RBE fue de 1,013 mol/ min, lo cual indica que por cada minuto se

produjeron 1,013 moles de Hidróxido de amonio

4. El coeficiente de correlación ( R2), de la cinética estudiada fué de 0,999, lo que demuestra que se presentó

una alta dependencia lineal entre el recíproco de la velocidad de RBE y el recíproco de la concentración

de sustrato

5. La ecuación de Michaellis de este experimento es: la cual corresponde a una

curva hiperbólica

Conclusiones

V= 1,013.[𝑈𝑅𝐸𝐴]

0,0103+ [𝑈𝑅𝐸𝐴]

Jairo Granados., MSc 12