presentaciÓn señores miembros del jurado dictaminador
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i
PRESENTACIÓN
Señores Miembros del Jurado Dictaminador:
Dando cumplimiento con lo dispuesto en el Reglamento de Doctorado de
la Escuela de Post Grado de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra
consideración el trabajo de tesis para optar el Grado Académico de Doctor en
Ciencias Biológicas, titulado:
“Evaluación de diferentes concentraciones de etanol rectificado en la
producción del “bioaroma” acetato de etilo y proteína unicelular por
Candida utilis var. .major C.E.C.T . 1430”
El mismo que dejo a su criterio para su dictamen, esperando reunir los
requisitos para vuestra aprobación
Trujillo, 06 de marzo del 2008
MsC. Carlos A. León Torres
ii
JURADO DICTAMINADOR
________________________________Dr. FEDERICO GONZÁLES VEINTIMILLA
PRESIDENTE
________________________________DR. FREDDY MEJÍA COICO
SECRETARIO
________________________________DR. JOSÉ MOSTACERO LEÓN
MIEMBRO
iii
DEDICATORIA
A DIOS
iv
A
Sofía Isabel, mi hijita,
motor y motivo de mi
constante superación en mi vida.
v
A
ROSA y VALENTÍN, mis padres
Quienes representan el motivo de mi
constante superación
Con amor y admiración a mi esposa.
BETSY
por compartir su vida, alegría, sueños y
deseos de superación familiar, personal
y profesional.
A mis hermanos, compañeros
incondicionales, quienes con su ejemplo
de lucha y esfuerzo por seguir adelante
me enseñaron el camino del éxito.
A mis sobrinos, por regalarme una
mirada, una sonrisa y todo su amor; en
especial a los más pequeños Mizaki,
Kenshiro, Diego, Rodrigo, Joel,
Estefani, Esther, Fernandito, Claudia,
Renzo, Andrea, Paúl, Ariana, Fabio y
Dieguín con todo cariño.
vi
AGRADECIMIENTO
Al Dr. José Mostacero León, por su invalorable amistad y valiosa
orientación y contribución brindada.
Al maestro, Dr. Julio César Arellano Barragán, por su valiosa, oportuna y
acertada orientación.
A mis maestros y amigos del Departamento de Química Biológica y
Fisiología Animal de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad
Nacional de Trujillo.:
Dr. Marco Salazar Castillo
Dr. Steban Ilich Zerpa
Dr. José Llanos Quevedo
Dra. Margarita Román de Llanos
Dr. Félix Castillo Viera
MsC. Orlando Pretel Sevillano
MsC. Carlos A. Nomberto Rodríguez
MsC. Walter Bautista Cerna
Blgo. Wilson Canchachi Sánchez
De igual manera a mis maestros y amigos:
Dr. Enrique A. Martín Alva, Dr. Freddy Mejía Coico,
MsC. Alfredo Martín Alva, MsC. Miguel Ángel Barrera Gurbillón,
Blgo. Martha Mejía Arocca.
MsC. Carlos A. León Torres
vii
ÍNDICE
PRESENTACIÓN ......................................................................................................i
JURADO DICTAMINADOR ....................................................................................ii
DEDICATORIA ....................................................................................................... iii
AGRADECIMIENTO ...............................................................................................vi
INDICE GENERAL……………… …………………………………………….....vii
ÍNDICE DE TABLAS ................................................…………………………x
ÍNDICE DE FIGURAS ……………………………………………. ..............… xii
RESUMEN .....................................................................…………….. ……… xiv
ABSTRACT……………………………………………………………… .. xv
I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………...…1
II. MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………………….. 11
1 Material……………………………………………………………..…… 11
1.1. Materia prima………………………………………………..………11
1.2. Material biológico………………………………………….….…….11
1. Métodos y Técnicas…………………………………………………..… 11
2.1. Acondicionamiento de los biorreactores………………………..…..11
2.2. Acondicionamiento del sustrato…………………………………….12
2.3. Reactivación de la cepa………………………………………..……12
2.4. Preparación del inóculo…………………………………… ……...12
2.5. Proceso de producción del la biomasa y del “bioaroma” acetato de etilo...13
viii
2.6. Determinación de la influencia de la concentración ………………..13
del etanol rectificado en la producción del acetato de etilo
y proteína unicelular.
2.6.1. Cuantificación de la proteína unicelular…………………….13
2.6.2. Cuantificación del acetato de etilo…………………………..14
2.6.3. Determinación del rendimiento “y” en base al
sustrato suministrado…………………………………………14
2.6.3.1. Rendimiento de proteína unicelular……………........ 14
2.6.3.2. Rendimiento del acetato de etilo……………………..14
2.6.4. Cálculo de la productividad…………………………………..15
2.7. Análisis Estadístico…………………………………………………. 15
III. RESULTADOS………………………………………………………………..16
IV. DISCUSIÓN…………………………………………………………………...36
V. PROPUESTA………………………………………………………………….46
VI. CONCLUSIÓN………………………………………………………………..52
VII. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA……………………………………….......53
ix
ANEXOS:
ANEXO 1. Diseño del biorreactor tipo tanque agitado………………………………...62
ANEXO 2. Cámara de esterilización del sistema de fermentación ……………………63
ANEXO 3. Observación microscópica y proceso de reactivación y
preparación del inóculo de la levadura Candida utilis………………………64
ANEX0 4. Sistema de producción batch del acetato de etilo y proteína
unicelular de candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430 …………..........65
ANEX0 5. Determinación de la proteína unicelular neta producida de
Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430...............................................66
ANEXO 6. Cuantificación del acetato de etilo ………………………………….67
ANEXO 7. Valoración de acetato de etilo por el método de
Saponificación y cuantificación ………………………………………68
ANEXO 8. Valores originales del consumo de diferentes concentraciones
de etanol rectificado “E” (g/l) como fuente de sustrato ……………….69
ANEXO 9. Valores originales de proteína unicelular neta producida ……………..70
ANEXO 10. Valores originales de producción del “bioaroma”
acetato de etilo …………………………………………………………71
ANEXO 11. Valores originales de rendimiento “Y” (%) en relación al
“bioaroma” acetato de etilo y sustrato consumido ………………… ..72
ANEXO 12. Valores originales de productividad “P” (g/L-h) del
“bioaroma” acetato de etilo ………………………………………… 73
ANEXO 13. Valores originales de productividad “P“ (g/L-h) de
proteína unicelular ……………………………………………………74
ANEXO 14. Valores originales de rendimiento “Y” en relación a la proteína
unicelular neta producida y el sustrato consumido …………………..75
ANEXO 15. Análisis de varianza de consumo de Sustrato, Producción
de Proteína Unicelular, rendimiento y productividad ……………… 76
ANEXO 16. Análisis de varianza de consumo de sustrato, producción de
Acetato de Etilo, Rendimiento y Productividad ……………………..77
x
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1. Resultados promedio de la producción, aprovechamiento,
rendimiento y productividad del bioproceso en la evaluación
de diferentes concentraciones de etanol rectificado en la
producción del “bioaroma” acetato de etilo y proteína
unicelular por Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430
durante 60 horas de fermentación a 25ºC. ……………………………….20
Tabla 02: Valores de “t” calculado al comparar promedios (método “t”)
del consumo de diferentes concentraciones de etanol rectificado ……….29
Tabla 03: Valores de “t” calculado al comparar promedios (método “t”)
de la producción de proteína unicelular de
Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430 ………………………………..30
Tabla 04: Valores de “t” calculado al comparar promedios (método “t”)
del rendimiento “Y” en relación a la proteína unicelular neta
producida y el sustrato consumido …………………………………… 31
Tabla 05: Valores de “t” calculado al comparar promedios (método “t”)
de la Productividad “P” de la proteína unicelular producida ……………32
xi
Tabla 06: Valores de “t” calculado al comparar promedios (método “t”)
de la producción del “bioaroma” acetato de etilo por
Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430 ………………………………..33
Tabla 07: Valores de “t” calculado al comparar promedios (método “t”)
del rendimiento “Y” en relación al “bioaroma” acetato de etilo
producido del sustrato consumido ……………………………………….34
Tabla 08: Valores de “t” calculado al comparar promedios (método “t”)
de la productividad “P” del “bioaroma” acetato de
etilo producido …………………………………………………………..35
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1: Consumo del sustrato etanol rectificado y etanol
Absoluto “testigo” (g/L) por Candida utilis. var. major CECT 1430
durante 60 horas de fermentación. ………………………………………20
Figura 2: Producción de proteína unicelular (g/L medio) de
Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430 a diferentes
concentraciones de etanol rectificado y etanol absoluto
“testigo” (g/L) durante 60 horas de fermentación. ……………………….21
Figura 3: Producción de acetato de etilo (g/L medio) por Candida utilis.
var. major C.E.C.T. 1430 a diferentes concentraciones de
etanol rectificado y etanol absoluto “testigo” (g/L) durante
60 horas de fermentación. ………………………………………………..22
Figura 4: Rendimiento de la proteína unicelular producida en relación
al sustrato consumido “Yx/s” por Candida utilis var.major
C.E.C.T. 1430 durante 60 horas de fermentación ………………………..23
Figura 5: Rendimiento “Y” del “bioaroma” Acetato de etilo producido en
relación al sustrato consumido por Candida utilis. var. major
C.E.C.T. 1430 durante 60 horas de fermentación ………………………..24
Figura 6: Productividad de la proteína unicelular neta producida en el
sistema “P” (g/L-h) por Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430
durante 60 horas de fermentación ………………………………………..25
xiii
Figura 7: Productividad “P” del “bioaroma” acetato de etilo en el
Sistema “P” (g/L-h) por Candida utilis. var. major
C.E.C.T. 1430. …………………………………………………………..26
Figura 8: Comparación del Rendimiento “Y” (%) teórico y experimental de
Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430. a diferentes
concentraciones de etanol rectificado en la producción de proteína
unicelular ………………………………………………………………..27
xiv
RESUMEN
El trabajo tuvo como objetivo evaluar diferentes concentraciones de etanol
rectificado en la producción del “bioaroma” acetato de etilo y proteína unicelular
por Candida utilis var.major.
Se construyó un biorreactor de 16 cm de altura tipo tanque agitado con
turbina Rushton. La preparación del inóculo fue realizada a partir de la cepa
Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430. El medio de cultivo fue formulado a
partir de diluciones de etanol rectificado desde 10 hasta 35 g/L en intervalos de
cada 5 unidades. El bioproceso se llevó a cabo a 25ºC, pH de 4.5 – 5.5. y durante
60 horas. Se encontró que la biomasa y la productividad aumentan
progresivamente, de 4.82 a 7.90 g/L y de 0.082 a 0.108 g/L-h respectivamente.
Así mismo se determinó que a medida que aumenta la concentración (g/L) de
etanol rectificado, la producción y la productividad disminuyen.
El rendimiento de acetato de etilo, fue máximo a la concentración de 15 g/L
de etanol rectificado (5.7%) y mínimo a 35 g/L y (1.97%) respectivamente.
Se concluye que el incremento de la concentración de etanol rectificado no
influye aumentando la producción y rendimiento del “bioaroma” acetato de etilo
y de la proteína unicelular de Candida utilis var. major.
xv
ABSTRACT
The present research was carried out with the purpose to evaluate the differents
concentration of rectificated ethanol in the production of “bioscent” acetate etyle
and the single cell protein Candida utilis var.major for it a stirred – tank reactor
of 16 cm of height with turbina Rushton was built.The preparation of the inoculo
was carried out starting from Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430. The
médium of culture was formulated starting from rectificated etanol dilutions from
10 to 35 g/L each 5 units.The bioprocess was carried out at 25ºC to
pH 4.5 – 5.5 and during a time of 60 hours. It was found that the biomasa
productivity increase progressively from4.82 to 7.90 g/L and from0.082 a 0.108
g/L-h) respectively. Such as increase the rectificated ethanol concentration (g/L)
the production and the yield was down. The yield acetate etyle was top to
concentrations of 15 g/L of rectificated ethanol (5.7%) and smallest to
concentrations of 35 (g/L) of rectificated ethanol (1.97%). Finally the increase of
rectificated ethanol concentrations do not influence increasing the production of
acetate etyle and the single cell protein Candida utilis var.major.
1
INTRODUCCION
Según Brown (1998) en los últimos tiempos se ha presentado
un desmedido crecimiento poblacional en el mundo; situación que
unida al patrón decreciente que ha seguido la producción agrícola ha
originado un importante déficit de alimentos en los diversos países del
mundo, sobretodo en aquellos subdesarrollados, por lo que la
Organización Mundial de la Salud (O.M.S, 2000 ) estima que 12
millones de personas mueren de inanición y enfermedades
relacionadas con la malnutrición cada año, causadas principalmente
por la baja ingesta de alimentos especialmente de aquellos alimentos
formadores o constitutivos como las proteínas.
Esta demanda insatisfecha de proteínas pone de manifiesto la
necesidad de un incremento de la productividad agrícola. Sin embargo,
esto requiere urgentemente la modernización de la agricultura, lo cual,
se ha convertido en una misión casi imposible debido a la falta de
inversión para implementar técnicas apropiadas, escasez de agua,
fenómenos climatológicos adversos y empobrecimiento gradual del
suelo. Además, la necesidad por explotar medios no agrícolas de
producción de proteínas, como la pesca, no pueden ser sobre
explotados, debido a que estos recursos renovables debido a su
explotación intensiva pueden ser depredados ocasionando un gran
desequilibrio ecológico (Miller, 1985 y Box, 1993 ).
Por ello Scragg (1996), frente a esta situación, propone diversas
propuestas para producir proteínas de consumo humano y animal por
métodos no convencionales. Una de las más prometedoras para
incrementar la disponibilidad de proteínas en el mundo es la
2
producción de proteínas microbianas o unicelulares mediante
fermentación de residuos industriales y agrícolas.
Frazier y Westhoff, (1991) y García y et al. (1993). La proteína
unicelular está constituída por células muertas y deshidratadas de
microorganismos tales como levaduras, bacterias, hongos y algas, los
que previamente crecieron en diferentes fuentes de carbono y se
producen con fines alimenticios debido a su gran valor proteico (55%).
En la mayoría de los países ex-socialistas, la proteína unicelular es
usada como un concentrado proteico importante en la preparación de
alimentos balanceados para animales y en los Estados Unidos, la
producción se destina casi exclusivamente al campo de los aditivos y
saborizantes para consumo humano (Crueger y Crueger, 1993, De La
Torre y Flores-Cotera, 1993).
Comercialmente se cultivan a partir de sustancias tales como: el
licor de cocción al sulfito o lactosuero; especies de los géneros
Saccharomyces, Candida y Kluyveromyces, los últimos poseen una
gran importancia económica en la producción de alimentos,
saborizantes o alcohol (Lee, 2000). Siendo C. utilis y S. cereviseae las
que mayormente producen las empresas, tanto en Estados Unidos,
como en la Unión Europea y Japón. En el período 1992 – 2000, estas
levaduras representaron en los mercados de Estados Unidos, Unión
Europea y Japón el 80.63%, 80% y 65.20% de la producción total
respectivamente. Los precios de venta en dicho período oscilaron entre
2.20 – 2.75 dólares el Kg. en los Estados Unidos, mientras que en el
mercado de la Unión Europea entre 1.78 – 2.23 dólares el Kg. y en el
mercado japonés entre 2.58 – 2.83 dólares el Kg. (Exebio, 2003), lo
cual representa un gran valor comercial con respecto a otras fuentes de
proteínas convencionales (Israelidis y Coduonis, 1982).
3
Ahora se conocen que existen tres razones principales de tipo
comercial para la producción de proteína unicelular: el rápido
crecimiento de los microorganismos, la alta eficiencia o productividad
alimenticia y el bajo costo de la materia prima o sustrato.Las dos
primeras razones dadas están en relación directa con el corto tiempo de
generación que presentan la mayoría de los microorganismos; con un
tiempo de generación de 20 minutos y sin ningún factor limitante, (una
sola bacteria con una biomasa de solamente 10-12g. puede producir 2,2
x 1025 toneladas de biomasa es decír 4,000 veces la masa de nuestro
planeta en un período de 2 días). Esto significa que, una sola bacteria
puede, en un ambiente no restringido producir 1011 veces su propia
biomasa de proteína en un solo día (Israelidis y Evangelopoulos,
1980); a parte que la productividad depende de una acertada selección
de una cepa adecuada capaz de crecer y sacar provecho de los
diferentes componentes del sustrato (Quintero, 1981).
Las especies que han demostrado mayor productividad industrial
son Saccharomices. cereviseae y Candida. utilis; sin embargo la que
mayormente se utiliza en la producción de proteína unicelular es
C. utilis conocida como “torula” y cuya composición química es
aproximadamente 9.0% de nitrógeno, 55% de proteína, 7% de grasas,
5% de fibra y 8% de cenizas, además contiene elevada cantidad de
lisina y vitaminas de complejo B (Marchand, 1997; Farmland, 1999).
Actualmente vienen usando dos variedades especiales de C.
utilis variedad major y termophila. Debido a que las células de C. utilis
variedad termophila, son por lo general pequeñas y que dificultan la
separación; por lo tanto el rendimiento resulta muy escaso, por lo que
4
resulta mejor utilizar la variedad major de células más grandes
(Frazier y Westhoff, 1991; Wainwright, 1995).
Además C. utilis tiene la capacidad de crecer en una amplia
variedad de sustratos carbonados, como: azúcares derivados de la caña
de azúcar, almidones de desperdicios de papa, granos y yuca
(García, Quintero y López, 1993). Asimismo, se ha observado
crecimiento en sustratos como etanol, metanol y en desechos o
subproductos industriales como licores sulfíticos y melazas (De La
Torre y Flores-Cotera, 1993); así como también en ácidos como el
acético, acetoacético, fumárico, málico, láctico, pirúvico, succínico; y
derivados celulósicos (Fennema, 1982; Wainwright, 1995).
La factibilidad económica de la producción de proteína
unicelular depende básicamente del uso eficiente de un sustrato barato
por el microorganismo, el cual debe proceder de actividades
industriales propias de la zona en donde se desea producir la proteína
unicelular (Nigan, 2000), esto logra que el sustrato empleado sea de
bajo costo, disponible durante todo el año y sobretodo el proceso
contribuye a limpiar el medio ambiente de los desechos industriales; lo
cual hace de esta actividad una alternativa económica, social y
ecológica (Carter, 1996).
A pesar de su costo relativamente elevado, el etanol ha sido
utilizado como sustrato para la producción de proteína unicelular
proveniente de C. utilis. El proceso ha sido desarrollado por la Amoco
Company en los Estados Unidos y el producto obtenido ha sido
aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) en Estados
Unidos; siendo comercializado bajo el nombre de “TORUTEIN”
5
obteniendo licencia para ser comercializada en Canadá, Suecia y
Alemania (PAG, 1987). La levadura obtenida mediante este proceso
contiene alrededor de 52% de proteína y debido a su relativamente
bajo contenido de metionina, posee una alta tasa de asimilación
protéica aproximadamente de 1.7 comparada con la del trigo que va
desde 1.1 hasta 2.0 (Watteeuw, et al., 1979).
La razón del relativo éxito de este proceso a pesar de que el
sustrato es costoso, radica en la calidad del producto, de ser un
excelente mejorador del sabor y de alto valor nutricional (Skinner,
1995); razón por la cual se usa para mejorar las características
organolépticas de carnes procesadas, embutidos, quesos y los
concentrados de proteína de huevo. Esto ha conducido a que estas
proteínas compitan en el mercado con los saborizantes químicos, los
cuales en muchos casos están prohibidos por la FDA debido a sus
propiedades cancerígenas. Todo esto ha generado que la levadura tenga
un mercado establecido y potencialmente atractivo en el futuro
(García, et al. 1993).
Como se sabe, el etanol es un sustrato relativamente costoso, por
ello en los últimos años se han dado diversas propuestas para obtener
por acción de C. utilis productos derivados del mismo tales como los
denominados bioaromas, lo cual hace más rentable el proceso.
El aroma en un alimento puede ser definido como la fracción
volátil percibido por receptores ubicados en las fosas nasales
(Montes, 1966). El aroma tiene que ser diferenciado del aceite
esencial constituido por la fracción no volátil del alimento y que está
compuesto por moléculas más pesadas.
6
La investigación relacionada con la producción de aromas por
vía biotecnológica se inició hace aproximadamente cuarenta años en
base a observaciones realizadas a principios de siglo por
Omelianski (1922); quien fue el primero en realizar una síntesis
bibliográfica de los diferentes aromas observados durante el cultivo de
microorganismos (bacterias, levaduras y hongos filamentosos) a los
cuales denominó bioaroma. En el transcurso de las últimas tres
décadas, los enormes avances logrados en el campo de la química
analítica (cromatografía en fase gaseosa, cromatografía líquida de alta
resolución y espectrometría de masa principalmente), así como la
creciente demanda por parte del público de aditivos alimentarios
naturales, han hecho resurgir el interés por la biotecnología y
su aplicación en la producción de bioaromas alimenticios
(Christen, 1995).
El primer avance en la obtención de bioaroma por C. utilis, fue al
ser inoculada en ajo picado, produciendo bioaromas a partir de la
síntesis de diversos compuestos volátiles, particularmente ésteres
(Olesen et al, 2000).
La mayoría de ésteres naturales tienen un olor muy agradable y
ellos ó los productos sintéticos correspondientes tienen aplicación en
confitería y en la industria de bebidas, perfumes, cosméticos y jabones
(Kirk y Othmer, 1998). El acetato de etilo, es un éster presente en
muchos vinos, coñac, vinagre de vino y algunas frutas como la piña. Se
usa en esencias artificiales de frutas, como disolvente de nitrocelulosa,
barnices y lacas, en la manufactura de piel artificial, películas, placas
fotográficas, seda artificial, perfumes y limpiadores de telas, entre
otros (Wiseman, 1986). En la industria de alimentos es usado como
7
aromatizante. Así, los aromas artificiales para frutas como la manzana
tienen la siguiente composición: 20% acetato de etilo, 30% valerianato
de amilo, 20% malonato de etilo, 10% acetaldehído, 10% glicerina, 5%
cloroformo, 4.5% butirato de geranilo y 0.5% vainilla; mientras que
para el aroma artificial de la frutilla, el acetato de etilo está en una
proporción del 30%. Estos aromas artificiales, son utilizados en la
elaboración de mezclas con aditivos para alimentos, así para helado de
fresa, dicha mezcla contiene 0.4% del aroma artificial. Dichas mezclas
se utilizan en proporción de 1 parte por cada 60 partes de helado
(Montes, 1966).
El acetato de etilo es un líquido incoloro con olor a frutas,
inflamable, tiene un punto de ebullición de 77.2º C, es menos denso
que el agua y ligeramente miscible con ella, 1 mL es miscible con 10
mL de agua (a 25º C), su solubilidad aumenta al bajar la temperatura.
Miscible en etanol, acetona, cloroformo y éter. Sus vapores son más
densos que el aire (Perry, 1993). Industrialmente se obtiene por
destilación lenta de una mezcla de ácido acético, alcohol etílico y ácido
sulfúrico, o bien, a partir de acetaldehído anhidro en presencia de
etóxido de aluminio. Estos procesos son considerados tóxicos razón
por la cual la biotecnología plantea bioprocesos más eficientes y
seguros para la obtención de acetato de etilo a partir de
microorganismos (Tabachnick et al, 1953).
Los bioaromas son una importante alternativa tecnológica en la
bioconversión del etanol, para darle un mayor valor agregado en
acetato de etilo por C. utilis (Domenech et al, 1995).
8
C. utilis utiliza el etanol como fuente de carbono,
transformándolo en CO2 y agua además de asimilarlo para su
crecimiento (Domenech et al, 2002). Cuando el etanol no es usado
únicamente para el crecimiento de C. utilis, también puede seguir la
siguiente ruta metabólica cuyo producto final es acetato de etilo
(Watteeuw et al, 1979).
O2 O2 Etanol
Etanol Acetaldehído Ácido acético Acetato de etilo
Experiencias realizadas por diversos investigadores han
demostrado que el etanol, especialmente el alcohol rectificado se
comportó como un excelente sustrato para C. utilis, debido a que es
un producto carbonado con alto grado alcohólico y libre de impurezas
como aldehídos, ésteres, ácidos y otros compuestos que pueden afectar
el normal desarrollo de la levadura, interfiriendo el proceso
(Vegas y Castro, 2002). Diferentes trabajos muestran una producción
de biomasa entre 2.0 y 2.8 g/L para una concentración inicial de etanol
de 16 g/L de medio; y de 3.3 g/L a partir de una concentración inicial
de 32 g/L de medio (Doménech et al, 1999). En un estudio
comparativo entre la melaza y el etanol rectificado como sustratos para
C. utilis se encontró una producción de biomasa de 6.90 g/L y 5.94 g/L
respectivamente partiendo de una concentración de 22.43 g/L
(Vejarano, 2005); también se ha encontrado una mayor producción de
biomasa 10.25 g/L utilizando melaza a 15 g/L de ART como sustrato
(León, 2005).
Si bien es cierto que los valores de biomasa obtenidos utilizando
melaza como sustrato son mayores que con el etanol; este brinda la
ventaja de obtener un producto de mejor calidad para el mercado de
9
saborizantes; por lo cual su valor económico es mayor. Así también el
etanol brinda la oportunidad de agregar un proceso adicional a la
producción de biomasa por C. utilis con la finalidad de obtener acetato
de etilo, lo cual hace más rentable el proceso.
La bioconversión del etanol a acetato de etilo por C. utilis; es
una importante alternativa biotecnológica para darle mayor valor
agregado al proceso. Así, estudios realizados muestran una producción
de 0.80 g de acetato de etilo/L usando etanol rectificado como
sustrato a una concentración de 32 g/L (Domenech, 2004), también
presentan una producción de 0.44g de acetato de etilo a partir de una
concentración de 22.43g de etanol rectificado por litro
(Vejarano, 2005).
Por lo antes descrito se puede afirmar que C. utilis es la vía más
prometedora en la producción de acetato de etilo (Lee, 2000),
poniendo especial énfasis en los efectos que tiene la concentración del
sustrato etanol rectificado sobre los rendimientos finales, considerando
a este factor un punto crítico a tener en cuenta al inicio del proceso
(Domenech et al, 1995)
Teniendo en cuenta que la información sobre la relación
rendimiento-concentración del sustrato, posee una especial
importancia, ya que desde el punto de vista técnico-económico las
ofertas de instalaciones industriales a nuestra disposición nos sitúan
ante la alternativa de tecnologías de fermentación a altas y bajas
concentraciones y además que la oferta y demanda de proteína
unicelular destinada al consumo humano y animal en el período
1992-2001, estuvo liderada por la levadura C. utilis tanto en Estados
10
Unidos, la Unión Europea y Asia, esto hizo necesario realizar el
presente trabajo de tesis, el cual estuvo orientado a la evaluación de
diferentes concentraciones del etanol rectificado en la producción de
Candida utilis “torula” var. major; así como también en la producción
de acetato de etilo, el mismo que tiene un mercado potencial en nuestro
país a nivel industrial como bioaromatizante de productos alimenticios
tales como el yogurt, helados, bebidas con sabor a frutas y en el rubro
de las golosinas; lo cual puede contribuir a reemplazar los saborizantes
y aromatizantes químicos que son usados actualmente y que en
muchos casos están prohibidos por la FDA por sus propiedades
cancerígenas.
11
II. MATERIALES Y METODOS
1. Material Biológico
1.1. Materia prima
Etanol rectificado grado comercial.
Etanol absoluto grado reactivo pa. Merck .
1.2. Material biológico
Cepa liofilizada de Candida utilis var. major C.E.C.T
1430, adquirida de la Colección Española de Cultivos
Tipo (CECT) Valencia, España.
2. Métodos y técnicas
2.1. Acondicionamiento de los biorreactores
Se emplearon 7 biorreactores tipo tanque agitado
y aireado de 1 L de capacidad; con 16 cm de altura,
10 cm de diámetro y 10 cm de base y se les adaptó una tapa
a presión de jebe Microporoso de 2 pulgadas de grosor
(León, 2005) (Anexo 1).
Cada reactor fue equipado con un sistema de
aireación y agitación previamente desinfectados en la
cámara UV durante tres tiempos de 1 hora con un descanso
de 5 minutos entre ellos (León, 2005) (Anexo 2).
El aire insuflado a los biorreactores fue esterilizado a
través de una solución salina al 20% y se suministró a
42 mL/seg. Los biorreactores fueron colocados en un
ambiente cerrado a una temperatura de 25 – 30º C
(Torres, 1995).
12
2.2. Acondicionamiento del sustrato (etanol rectificado y absoluto)
Al etanol rectificado y absoluto no se les practicó
ningún tratamiento previo; estos fueron agregados a los
biorreactores junto con los nutrientes disueltos en agua
destilada previamente autoclavada, hasta conseguir las
diluciones siguientes: 10, 15, 20, 25, 30, y 35 % (g/L)
(Vejarano, 2005).
A estos caldos de cultivo se les adicionó 0.7 g. de
sulfato de amonio como fuente nitrogenada (Bailon, 2001).
Además se contó con un biorreactor a 30 g/L de alcohol
absoluto, como testigo del bioproceso.
2.3. Reactivación de la cepa
La cepa se reactivó según Bailón (2001) en
caldo sabouraud y medio de mantenimiento
(Difco Manual, 1985).
2.4. Preparación del inóculo
A partir de la cepa de C. utilis var. major
mantenida en refrigeración, se realizó un sembrado en el
medio de mantenimiento y se incubó por 48 horas a
temperatura ambiente (Marchand, 1997). Del desarrollo de
este cultivo se hizó un traspaso al medio de propagación,
compuesto por Caldo Sabouraud – Oxitetraciclina
(Difco Manual, 1985) el cual se mantuvo a temperatura
ambiente durante 48 horas. La pureza del cultivo se verificó
por observación microscópica. El inóculo constó de un
volumen de microbio (3 x 107 cel/mL) al 10% del volumen
de trabajo del biorreactor (Gómez, 1999). (Anexo 3)
13
2.5. Proceso de producción de la biomasa y del “bioaroma”
Acetato de etilo.
En cada biorreactor se adicionó 630 mL del caldo de
cultivo a las concentraciones de estudio (5, 10, 15, 20, 25,
30, 35 g/L de etanol), la fuente nitrogenada (sulfato de
amonio, al 1%) y 70 mL del inóculo previamente
preparado.
El Bioproceso se realizó a un Ph de 4 – 5.5 a la
temperatura de 25 ºC por un tiempo de 58 horas
(Vejarano, 2005).
Además se realizó un ensayo control (630 mL de
caldo fermentativo conteniendo 30 g/L de alcohol absoluto
y 70 mL de inóculo), todo este proceso se repitió 2 veces
(Torres, 1997). (Anexo 4)
2.6. Determinación de la influencia de la concentración del
etanol rectificado en la producción de acetato de etilo y
poteína unicelular de Candida utilis var. major
2.6.1. Cuantificación de la Proteína unicelular.
La producción de proteína unicelular por C. utilis
var. major, C.E.C.T. 1430 se realizó durante 58 horas
(Vejarano, 2005) transcurrido dicho tiempo, se
centrifugaron los caldos fermentativos a 3000 g durante 20
minutos, se eliminó el sobrenadante y el sedimento se lavó
3 veces con agua destilada estéril, los sedimentos fueron
colocados en placas petri de peso conocido y llevados a
estufa a 70ºC hasta peso constante, las cuales luego fueron
pesadas con la finalidad de obtener el peso seco de la
biomasa (Gómez, 1999). (Anexo 5).
14
2.6.2. Cuantificación del Acetato de etilo:
El líquido sobrenadante se utilizó para cuantificar el
acetato de etilo (g/L) de acuerdo a lo estipulado por
(Vega y Castro, 2002). (Anexo 6 y 7).
2.6.3. Determinación del rendimiento “Y” en base al
sustrato suministrado
Se determinó según (Herbert, 1999).
2.6.3.1 Rendimiento de biomasa (Y x/s)
Yfo
oF
SS
YXsx
/
Donde:
Xo = Biomasa inicial g/L
Xf = Biomasa final g/L
So = Sustrato inicial g/L
Sf = Sustrato final g/L
2.6.3.2 Rendimiento del acetato de etilo (Y p/s)
YfooF
SSPP
s/p
Donde:
Po = Producto inicial g/L
Pf = Producto final g/L
So = Sustrato inicial g/L
Sf = Sustrato final g/L
15
2.6.4 Cálculo de la productividad (“P” g/L. h )
Se determinó según (Herbert, 1999)
tPPy
tXP
Donde:
X = Biomasa neta producida g/L
P = Producto neto formado g/L
t = Tiempo del bioproceso en horas
2.7. Análisis estadístico
Los resultados obtenidos de las variables biomasa, acetato
de etilo, rendimiento y productividad fueron evaluados
mediante la estimación de medidas de tendencia central y
dispersión, ANVA y comparación de medidas según el
método “t” (Freese, 1988).
16
III. RESULTADOS
En la tabla 1, se presentan los resultados promedio de la producción de
proteína unicelular y del “bioaroma” acetato de etilo en (g/L)
respectivamente; así mismo sus indicadores de rendimiento y productividad
dentro del sistema; donde se resalta que el consumo de la fuente de sustrato
etanol rectificado va desde 10 hasta 16.67 (g/L) por C. utilis. var. major
C.E.C.T. 1430 durante 60 horas de fermentación y que para mejor detalle se
muestra en la figura 1 y Anexo 8; además se indica también que la proteína
unicelular neta producida la cual va desde 4.82 hasta 7.90 (g/L) y en la que
sobresale la concentración de 15 g/L de sustrato etanol rectificado; hecho que
igualmente se ilustra en la gráfica 2 y Anexo 9 ; donde se destaca dicha
producción.
Y por último también se detalla en dicha tabla que la producción de
acetato de etilo que va desde 0.27 hasta 0.74 (g/L) y en la que destaca la
concentración de 15 g/L de sustrato, tal como se puede apreciar de manera
gráfica en la figura 3 y Anexo 12; respectivamente.
En las figuras 4 y 5 asi como tambien en el anexo 11 se observa el
rendimiento de la producción de la proteína unicelular y acetato de etilo en ( % )
a partir del sustrato etanol rectificado consumido por C. utilis. var. major
17
C.E.C.T. 1430, en donde se puede apreciar un porcentaje de 58% resalta para la
proteína unicelular, es de 58% a la concentración de 10 g/L de etanol rectificado
y para el acetato de etilo un porcentaje de 5.17% a la concentración de 15 g/L de
sustrato, respectivamente.
Del mismo modo en dicha tabla 1se aprecia la productividad del sistema,
en términos de producción de proteínas unicelular, la cual es máxima (0.104
g/L-h) a 15 g/L de etanol rectificado, mostrándose así también la máxima
producción de acetato de etilo (0.013 g/L-h) a la misma concentración de etanol
rectificado. Esto es también graficado en las figuras 6 y 7 y los Anexos 12 y 13,
respectivamente.
La comparación del rendimiento téorico y el experimental de la levadura
Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430. a diferentes concentraciones de etanol
rectificado en la producción de proteína unicelular se presenta en las figura 8 y
Anexo 14.
En las tablas 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 se presentan los valores de “t” calculados
como resultado de la comparación de promedios (método “t”) de los siguientes
indicadores indicador de sustrato consumido, producción de proteína unicelular y
acetato de etilo, así mismo los rendimientos y productividad de Candida utilis
var.major C.E.C.T. 1430 a diferentes concentraciones de etanol rectificado como
18
sustrato, es preciso señalar que todas las tablas y sus respectivos diagramas han
sido trabajados estadísticamente a un nivel de confianza del 95%.
El diagrama 1 en la tabla 2, muestra que las concentraciones de sustrato
10, 15, 30, 35 y testigo “T”, son iguales para la variable consumo de sustrato, del
mismo modo las concentraciones 35, 15 y 20 son iguales entre sí, de tal forma
las concentraciones de 20 y 25 g/L de etanol rectificado respectivamente.
El diagrama 2 en la tabla 3, muestra que las concentraciones 10, 25, 30,
25 y Testigo “T” son iguales estadísticamente para la variable producción de
proteína unicelular, pero la concentración 20 difiere de las anteriores, del mismo
modo la concentración 15 difiere de todos los demás.
El diagrama 3 en la tabla 4, compara el rendimiento de C. utilis var.major
C.E.C.T. 1430 en la producción de proteína unicelular, destacando que el más
alto rendimiento se da en las concentraciones 10 y 15; 58 y 55.113%
respectivamente. Así mismo el diagrama 4 en la tabla 5, destaca que la más alta
productividad se da entre las concentraciones de 15 y 20 g/L de sustrato
El diagrama 5 en la tabla 6, destaca la producción del “bioaroma” acetato
de etilo a la concentración de 15 g/L, diferenciándose de todos los demás
concentraciones sin embargo las concentraciones 10, 25, 30 y “T” son iguales.
El diagrama 6 en la tabla 7, indica que el más alto rendimiento (5.17%) en
la producción del “Bioaroma” acetato de etilo por Candida utilis var.major
19
C.E.C.T. 1430, se da a la concentración de 20 g/L de sustrato etanol rectificado
seguidos de las concentraciones 10 y 20 respectivamente.
Así mismo la misma concentración 15 g/L da la más alta productividad
(0.013 g/L-h ), seguida de la concentración 20 g/L de sustrato etanol rectificado.
20
TABLA 1. RESULTADOS PROMEDIO DE LA PRODUCCIÓN, APROVECHAMIENTO, RENDIMIENTO YPRODUCTIVIDAD DEL BIOPROCESO EN LA EVALUACIÓN A DIFERENTES CONCENTRACIONESDE ETANOL RECTIFICADO EN LA PRODUCCIÓN DEL “BIOAROMA” ACETATO DE ETILO YPROTEÍNA UNICELULAR POR Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430 DURANTE 60 HORAS DEFERMENTACIÓN A 25ºC.
So Sf Sc “X” “AE”[ g/L] X (g/L) A (%) Yx/s(%) Px(g/L-h) AE (g/L) A (%) YAE/s(%) PAE(g/L-h)
101520253035
Testigo
0.000.703.708.3316.0024.3316.00
10.0014.3016.3016.6714.0010.6714.00
5.807.905.965.745.504.825.31
58.0052.6129.8022.9618.3313.7717.71
58.0055.1136.8034.4435.7135.2338.00
0.0980.1040.0990.0970.0920.0800.089
0.420.740.540.440.360.270.35
4.174.932.721.761.200.781.16
4.175.173.332.642.571.972.48
0.0070.0130.0090.0070.0060.0060.006
Leyenda:
Testigo*: Concentración de alcohol absoluto a 30 g/LSo: Concentración inicial de sustrato (g/L)Sf: Concentración final de sustrato (g/L)Sc: Concentración de sustrato consumido (g/L)x: Proteína unicelular = biomasa en (g/L)A: Aprovechamiento de azúcares suministrados (%)yx/s: Rendimiento de la biomasa con relación al sustrato consumido (%)yp/s: Rendimiento del producto “bioetanol” con relación al sustrato consumido (%)AE: Producto “Bioaroma” acetato de etilo (g/L)P: Productividad del sistema en base a “X” y “AE” producido (g/L-h)
21
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
10 15 20 25 30 35 30*
So(g/L)
Consumo deSustrato (g/L)
Figura 1: Consumo del sustrato, etanol rectificado y etanol absoluto como testigo*
(g/L) por Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430 durante 60 horas de
fermentación.
22
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 15 20 25 30 35 30*
[S] g/L
Biomasa g/L
Figura 2: Producción de proteína unicelular (g/L medio) de Candida utilis. var. major
C.E.C.T. 1430 a diferentes concentraciones de etanol rectificado y etanol
absoluto como testigo* (g/L) durante 60 horas de fermentación.
23
00,10,20,30,40,50,60,70,8
10 15 20 25 30 35 30*
[S] g/L
"AE"(%)
Figura 3: Producción de acetato de etilo (g/L medio) por Candida utilis. var. major
C.E.C.T. 1430 a diferentes concentraciones de etanol rectificado y etanol
absoluto como testigo* (g/L) durante 60 horas de fermentación.
24
0102030405060708090
100
10 15 20 25 30 35 30*
So (g/L)
Yx/s%
Figura 4: Rendimiento de la proteína unicelular producida en relación al sustrato
consumido “Yx/s” por Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430 durante 60
horas de fermentación
25
0123456789
10
10 15 20 25 30 35 30*
So (g/L)
"Y"AE/s%
Figura 5: Rendimiento “Y” del “bioaroma” Acetato de etilo producido en relación
al sustrato consumido por Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430
durante 60 horas de fermentación.
26
00,010,020,030,040,050,060,070,080,09
0,10,11
10 15 20 25 30 35 30*
So (g/L)
"PX"(g/L-h)
Figura 6: Productividad de la proteína unicelular neta producida en el sistema “P”
(g/L-h) por Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430 durante 60 horas de
fermentación.
27
00,0020,0040,0060,008
0,010,0120,0140,0160,018
0,02
10 15 20 25 30 35 30*
So (g/L)
"PAE"(g/L-h)
Figura 7: Productividad de “P” del “bioaroma” acetato de etilo en el Sistema “P”
(g/L-h) por Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430.
28
0
10
20
30
40
50
60
10 15 20 25 30 35
[S] g/L
Biomasa g/L
Figura 8: Comparación del Rendimiento “Y” (%) teórico y experimental de
Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430. a diferentes concentraciones de
etanol rectificado en la producción de proteína unicelular “X”.
Rendimiento teórico: 56.7%
“Y”%
29
TABLA 02: VALORES DE “t” CALCULADO AL COMPARAR PROMEDIOS
(MÉTODO “t”) DEL CONSUMO DE DIFERENTES
CONCENTRACIONES DE ETANOL RECTIFICADO EN LA
PRODUCCIÓN DEL “BIAROMA” DE ACETATO DE ETILO Y
PROTEINA UNICELULAR Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430
Ri 1 2 3 4 5 6 7
[S] 10 T 30 35 15 20 25
R x 10 14 14 14 14,33 16,33 16,667
1 10
2 T 6,9282** -
3 30 9999,1** 0 -
4 35 3,46* 0 0 -
5 15 13** 0,4999 1 0,2774 -
6 20 7,18** 2,21358* 2,646* 1,606 2,1213* -
7 25 20** 3,999* 8 2,219* 4,9497** 0,354 -
Leyenda: * Diferencias significativas (p < 0.05)
DIAGRAMA 1:
Ri 1 2 3 4 5 6 7
[S] 10 T 30 35 15 20 25
x 10 14 14 14 14,33 16,33 16,667
------- ----------------------------------------------------------
----------------
30
TABLA 03: VALORES DE “t” CALCULADO AL COMPARAR PROMEDIOS
(MÉTODO “t”) DE LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA
UNICELULAR DE Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430 EN LA
EVALUACIÓN DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
ETANOL RECTIFICADO
Ri 1 2 3 4 5 6 7
[S] 35 T 30 25 10 20 15
R x 4,82 5,31 5,5 5,74 5,8 5,96 7,893
1 35 -
2 T 0,3522 -
3 30 1.2263 0,52386 -
4 35 1,865 1,70161 0,7495 -
5 15 1,944 1,793 0,8911 0,2705 -
6 20 2,2954* 2,51319* 1,4138 1,0769 0,6981 -
7 25 6,3469* 11,0994* 7,8196* 12,5778* 10,4219* 10,6624* -
Leyenda : * = Diferencias significativas (P < 0.05)
DIAGRAMA 2:
Ri 1 2 3 4 5 6 7
[S] 35 T 30 25 10 20 15
x 4,82 5,31 5,5 5,74 5,8 5,96 7,893
------------------------------------------ ------- -------
31
TABLA 04: VALORES DE “t” CALCULADO AL COMPARAR PROMEDIOS
(MÉTODO “t”) DEL RENDIMIENTO “Y” EN RELACIÓN A LA
PROTEÍNA UNICELULAR NETA PRODUCIDA Y EL SUSTRATO
CONSUMIDO “Y”X/S (%) EN LA EVALUACIÓN DE DIFERENTES
CONCENTRACIONES DE ETANOL RECTIFICADO.
Ri 1 2 3 4 5 6 7
[S] 25 35 30 20 T 15 10
R x 34,44 35,233 35,71 36,797 38 55,113 58
1 25 -
2 35 0,1341 -
3 30 0,8218 0,0808 -
4 20 2,91099* 0,238 0,3829 -
5 T 3,0899* 0,4602 1,98816 0,3928 -
6 15 17,3157* 3,31* 17,3101* 6,0027* 10,6477* -
7 10 13,2348* 3,7022* 12,8691* 6,3772* 9,61597* 1,3992 -
Leyenda: * = Diferencias significativas (P<0.05)
DIAGRAMA 3:
Ri 1 2 3 4 5 6 7
[S] 25 35 30 20 T 15 10
x 34,44 35,233 35,71 36,797 38 55,113 58
---------------------------------------------------------- ---------------
32
TABLA 05: VALORES DE “t” CALCULADO AL COMPARAR PROMEDIOS
(MÉTODO “t”) DE LA PRODUCTIVIDAD “P” DE LA PROTEÍNA
UNICELULAR PRODUCIDA EN LA PRODUCCIÓN DEL
“BIOAROMA” ACETATO DE ETILO POR Candida utilis var.major
C.E.C.T. 1430 A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
ETANOL RECTIFICADO.
Ri 1 2 3 4 5 6 7
[S] 35 T 30 25 10 20 15
R x 0,08 0,089 0,092 0,097 0,098 0,099 0,104
1 35 -
2 T 0,982113 -
3 30 1,2301 0,4966 -
4 25 2,0345 1,9113 0,9666 -
5 10 2,1099 1,99336 1,0951 0,4459 -
6 20 2,3117* 2,422* 1,3794 0,6444 0,3322 -
7 15 2,9107* 3,6329* 2,2729* 2,0494 1,5667 1,341 -
Leyenda: * = Diferencias significativas (P<=.05)
DIAGRAMA 4:
Ri 1 2 3 4 5 6 7
[S] 35 T 30 25 10 20 15
x 0,08 0,089 0,092 0,097 0,098 0,099 0,104
--------------------------------------------------------------------
----------------
33
TABLA 06: VALORES DE “t” CALCULADO AL COMPARAR PROMEDIOS
(MÉTODO “t”) DE LA PRODUCCIÓN DEL “BIOAROMA” ACETATO DE
ETILO POR Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430 EN LA EVALUACIÓN DE
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL RECTIFICADO.
Ri 1 2 3 4 5 6 7
[S] 35 T 30 10 25 20 15
R x 0,273 0,35 0,36 0,417 0,44 0,543 0,74
1 35 -
2 T 2,15862* -
3 30 3,329* 0,3383 -
4 10 6,7155* 1,92368 1,95 -
5 25 5,0767* 2,11564 2,0889 0,6614 -
6 20 7,3334* 4,16881* 4,3895* 3,2466* 2,2314* -
7 15 12,2788* 8,18323* 8,8749* 8,0554* 6,3481* 3,9246* -
Leyenda: * = Diferencias significativas (P<0.05)
DIAGRAMA 5:
Ri 1 2 3 4 5 6 7
[S] 35 T 30 10 25 20 15
x 0,273 0,35 0,36 0,417 0,44 0,543 0,74
------- ---------------------------------- ------- -------
34
TABLA 07: VALORES DE “t” CALCULADO AL COMPARAR PROMEDIOS
(MÉTODO “t”) DEL RENDIMIENTO “Y” EN RELACIÓN AL
“BIOAROMA” ACETATO DE ETILO PRODUCIDO DEL
SUSTRATO CONSUMIDO “Y”AE/S (%) EN LA EVALUACIÓN DE
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL
RECTIFICADO.
Ri 1 2 3 4 5 6 7
[S] 35 T 30 25 20 10 15
R x 1,97 2,48 2,57 2,64 3,33 4,17 5,17
1 35 -
2 T 1,8553 -
3 30 0,2981 0,3692 -
4 25 2,4707* 0,6322 2,0928 -
5 20 5,1777* 3,05189* 2,9928* 2,6963* -
6 10 8,7701* 6,2772* 6,6052* 6,2614* 3,1835* -
7 15 8,9447* 7,26286* 7,3968* 7,1687* 5,0286* 2,8182* -
Leyenda: * = Diferencias significativas (P<0.05)
DIAGRAMA 06:
Ri 1 2 3 4 5 6 7
[S] 35 T 30 25 20 10 15
x 1,97 2,48 2,57 2,64 3,33 4,17 5,17
----------------------------------------- ------- ------- -------
35
TABLA 08: VALORES DE “t” CALCULADO AL COMPARAR PROMEDIOS
(MÉTODO “t”) DE LA PRODUCTIVIDAD “P” DEL
“BIOAROMA” ACETATO DE ETILO PRODUCIDO (g/L-h)
POR Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430 A DIFERENTES
CONCENTRACIONES DE ETANOL RECTIFICADO
Ri 1 2 3 4 5 6 7
[S] 35 T 30 10 25 20 15
R x 0,005 0,006 0,006 0,007 0,007 0,009 0,013
1 35 -
2 T 1,95 -
3 30 2 0 -
4 10 5,6569* 1,95 2 -
5 25 5,6569* 1,95 2 0 -
6 20 6,5* 3,6742* 3,6742* 2,5* 2,5* -
7 15 10,7331* 7,4291* 7,5593* 7,1554* 7,1554* 4,1576* -
Leyenda: * = Diferencias significativas (P<0.05)
DIAGRAMA 7:
Ri 1 2 3 4 5 6 7
[S] 35 T 30 10 25 20 15
x 0,005 0,006 0,006 0,007 0,007 0,009 0,013
----------------------------------------------------------- ------- -------
36
IV. DISCUSION
Según sostiene Estévez (1998), en la producción de proteína unicelular de
Candida utilis. var. major C.E.C.T 1430 es necesaria la adición de sustancias
nitrogenadas y carbonadas al medio de cultivo que puedan ser asimiladas y
transformadas en nutrientes esenciales para el crecimiento; y para estar acorde
con ello, en el presente trabajo, se usó sulfato de amonio 1 g/L tal como también
lo propone Bailón (2001), puesto que si se cultiva en un medio con limitación de
nitrógeno, la producción de C. utilis var major es baja (Israelidis y
Evangelopoulos, 1980). Por otro lado hay que considerar también que la
cantidad de fuente carbonada presente en el medio fermentativo, es un factor
influyente en el rendimiento de proteína unicelular “biomasa” de C. utilis. var.
major.
El consumo de la fuente de carbono que va desde 10 hasta 16.67 (g/L) de
etanol rectificado, nos indica que C. utilis. var. major C.E.C.T. 1430, utilizó
dichos sustratos para su respiración, lo cual significa que la levadura transformó
el etanol rectificado en CO2 y agua, además de asimilarlo para su crecimiento;
hecho que ya fuera puesto de manifiesto por los investigadores de Doménech et
al ( 2002).
Igualmente Doménech et al. (2002) mencionan que en condiciones
adecuadas ésta levadura, puede degradar hasta 0.25 g de etanol por hora y por
37
litro de reactor en sustrato sólido. Otras investigaciones también realizadas por
los mismos autores, demuestran que en cultivo sumergido al evaluar la
producción de metabolitos a partir de etanol por C. utilis, se obtuvieron niveles
de consumo de 0.13 y 0.21 g etanol/Litro-hora a partir de concentraciones
iniciales de 16 y 32 g etanol/L medio respectivamente tras 72 horas de
fermentación (Doménech et al, 1999).
El cálculo de los niveles de consumo de 0.17 y 0.25 g etanol/L-h de
etanol rectificado; nos indica que la levadura trabajó adecuadamente y que los
niveles de consumo de estos sustratos están dentro de los valores reportados por
la literatura existente para fuentes carbonadas de etanol tipo rectificado ya que
éstos alcoholes no contienen sustancias como ácidos, ésteres, aldehídos, entre
otros (Vegas y Castro, 2002). En el presente experimento se trabajó utilizando al
alcohol grado reactivo (etanol absoluto) como testigo, el cual nos permitió
indicar la similitud de asimilación por C. utilis. var. major.
La producción de proteína unicelular (g/L) de C. utilis var. major a
diferentes concentraciones de etanol rectificado en 60 horas de fermentación
donde ésta alcanza la fase estacionaria de crecimiento; también encuentran su
correlato en los resultados de los trabajos de Vejarano (2005).
38
Según Wainwright (1995), C. utilis. alcanza su producción máxima en 24
horas de fermentación al ser cultivada en hidrolizados de papa. En un trabajo
realizado por Bailón (2001), para producir proteína unicelular de C. utilis.
utilizando como sustrato algarrobina diluida, se alcanzó la fase estacionaria de
crecimiento en un lapso de 25 – 28 horas de fermentación; mientras que
Ferrer et al. (2004), trabajando con hidrolizados de bagacillo de caña de azúcar
inoculados con dicha levadura alcanzaron la fase estacionaria a las 20 horas de
fermentación. Esto indica que la degradación y asimilación del etanol es más
lenta; hecho que también se ha demostrado en esta investigación y fue
previamente corroborado por Vejarano, ( 2005).
En ese sentido Doménech et al. (1999), reportan una producción máxima
de biomasa a las 48 horas de fermentación trabajando con C. utilis a partir de
concentraciones iniciales de 16 y 32 g etanol/L. Posiblemente este tiempo
alcanzado se deba a las condiciones del medio, ya que en el experimento no se
utilizaron reguladores de pH, y de acuerdo a resultados, los valores de pH
descienden hasta valores entre 2.50 y 2.80 para los tratamientos con etanol como
fuentes de carbono, lo que puede afectar la actividad respiratoria de la levadura.
Por otro lado Kirk y Othmer (1998), recomiendan mantener el pH entre
4.5 - 5.5, mientras que Lee (2000), recomienda un pH de 7.0 cuando se utiliza
C. utilis. para la producción de acetato de etilo. En cambio en el presente trabajo
39
se ha encontrado mejores resultados; trabajando con etanol rectificado como
fuente de sustrato.
También podría considerarse, como sostiene Doran (1995), el oxígeno
disponible en el medio como otra causa, ya que al no estar en cantidades
suficientes puede actuar como sustrato limitante, y tratándose de un proceso
aeróbico el problema de la transferencia de oxígeno es muy importante Además
de la naturaleza química del etanol, tal como sostiene Lee (2000), en las
fermentaciones de hidrocarburos requieren una mayor entrada de aire que las
basadas en carbohidratos y si bien el etanol, no es un hidrocarburo desde el
punto de vista puramente químico, ésta referencia podría utilizarse para explicar
su más lenta degradación por la levadura.
La tasa específica de crecimiento () varía en relación al tipo de sustrato,
así C. utilis en un medio a base de glucosa presenta una tasa específica de
crecimiento de 0.40 h-1; en melazas 0.15 - 0.38 h-1 y en alcanos 0.28 h-1
aproximadamente. Mientras que los tiempos de generación (tg) son menores en
comparación con otros microorganismos como hongos y algas, de
aproximadamente 100 - 210 minutos (Crueger, 1993 y Quintero, 1999).
40
Lo mencionado en el párrafo precedente posiblemente se deba a alguna
de las condiciones en la fermentación como puede ser el suministro de
oxígeno, como ya se ha mencionado, además para los tratamientos con etanol
puede explicarse por el hecho de que éste a partir de determinadas
concentraciones, empieza a inhibir el crecimiento y metabolismo de la levadura
(Doménech et al, 2002), o sea inhibición por sustrato. Armstrong et al (1984),
reportan que una concentración de etanol a partir de 35 g/L disminuye la
actividad metabólica de la levadura; hechos que se han comprobado en la
presente investigación
La mayor producción de proteína unicelular de Candida utilis. var. major
C.E.C.T. 1430 hallada en este trabajo , se da para la concentración de sustrato de
15 g/L, con un valor de 7.90 g/L medio, puesto que es un valor menor al
reportado por Ferrer et al. (2004), quienes con C. utilis. var. major obtuvieron un
valor de 9.45 g/L medio a partir de hidrolizado de bagacillo de caña de azúcar;
pero que se encuentra dentro del rango reportado por Quintero et al. (1999), cuya
producción de proteína unicelular reportada está entre 6 y 25 g/L medio,
proceso desarrollado en Cuba a partir de melaza de caña de azúcar en cultivo
continuo. Por otro lado Bailón (2001), obtuvo una producción de proteína
unicelular de 2.42 g/L medio tras 40 horas de fermentación a partir de
algarrobita. En cambio León (2005), ha encontrado una mayor producción de
41
proteína unicelular 10.25 g/L utilizando melaza a 35 g/L de ART como sustrato
tras 24 horas de fermentación.
Lo sostenido, puede explicarse por el hecho antes mencionado de la
presencia de ciertos nutrientes en la melaza, además de la disponibilidad de
azúcares más simples en el medio, previamente hidrolizada, han permitdo una
mejor asimilación y metabolismo por parte de la levadura, además de la
suplementación con los minerales necesarios para el crecimiento de C. utilis.
tal como lo indican Thomas et al. (1980).
Domenech et al. (1999), trabajando con C. utilis. obtuvieron una
producción de biomasa de 2.0 – 2.8 g/L medio para una concentración inicial de
etanol de 16 g/L medio; y de 3.3 g/L medio a partir de una concentración inicial
de 32 g etanol/L medio. Los valores obtenidos en el presente trabajo son mayores
a los reportados por dichos autores, lo cual posiblemente se debe al hecho de que
no todas las cepas de la levadura son productoras de biomasa, ya que de acuerdo
al catálogo de la Colección Española de Cultivos Tipo – C.E.C.T., existen cepas
destinadas a la producción de enzimas y otras al desarrollo de otros metabolitos.
(C.E.C.T, 2005).
Los valores de producción de acetato de etilo por Candida utilis. var.
major C.E.C.T. 1430, correspondientes a valores que van de 0.27 a 0.74 g/L a
diferentes concentraciones de etanol rectificado y etanol absoluto como testigo;
42
no dan diferencias significativas respecto al tratamiento testigo 30 g/L y su
respectivo par con etanol rectificado.
Aunque según Watteeuw et al. (1979), cuando el etanol no es utilizado
exclusivamente para el crecimiento de la levadura, también puede seguir otra ruta
metabólica; ruta que implica la participación de enzimas sintetizadas por la
levadura, la cual además produce dichos catalizadores para contrarrestar el efecto
del pH bajo que llega hasta valores de 2.50, y la esterificación hasta acetato de
etilo puede ser una vía para superar estos efectos negativos por la acumulación de
ácido acético (Tabachnick et al 1953).
Los valores de producción de acetato de etilo obtenidos, son menores a los
reportados por Doménech et al (1999), quienes a partir de una concentración
inicial de etanol de 32 g/L medio inoculado con Candida utilis obtuvieron tras 72
horas de operación hasta 0.80 g acetato de etilo/L de medio en el mejor de los
casos, pero coinciden a partir de 16 g etanol/L medio alcanzando producciones
de acetato de etilo de 0.10 — 0.60 g/L medio, indicando los mismos autores que
debido a la alta volatilidad del éster, las cantidades determinadas probablemente
no sean las realmente producidas por la levadura. Además según Zoecklein et al
(2000), otras especies de la levadura, como por ejemplo Candida krusei forma
acetato de etilo a concentraciones desde 0.22 - 0.73 g/L.
43
En base a las referencias de Vejarano (2005), la producción de acetato de
etilo en la presente investigación estaría dentro de los rangos reportados, sobre
todo para el tratamiento con etanol rectificado a 15 g/L, el cual es de 0.74 g
acetato de etilo/L medio; mientras que para el etanol sin rectificar es tan sólo de
0.10 g/L medio. Ello probablemente se deba a la alta volatilidad del acetato y
más aún a la presencia de congenéricos en el etanol sin rectificar lo que pudo
haber afectado la capacidad metabólica de la levadura.
Estadísticamente, utilizando el Análisis de Varianza y la prueba F,
indican la diferencia entre los promedios de producción de acetato de etilo para
los tres tratamientos. Ello motivó la realización de la comparación múltiple de
medias mediante el método “t”, para determinar el mejor tratamiento y
cuantificar dicha diferencia entre los tratamientos; lo cual permite afirmar que la
mejor producción de acetato de etilo corresponde al tratamiento con etanol
rectificado de 15 g/L, mientras que estadísticamente entre los otros tratamientos
sí existe una relativa diferencia significativa, inclusive en el tratamiento control
con su respectivo par no presenta diferencias altamente significativa.
En ese trabajo también se ha encontrado que cuando la levadura consume
el sustrato existe la producción de metabolitos como ácidos orgánicos que hacen
disminuir el pH; hecho que ya fue demostrado por Brock (1994).
44
Igualmente lo sostenido por Hough (1990) Candida utilis. var. major
consume los azúcares presentes en la melaza y los metaboliza por medio de la
ruta glicolítica EMP complementada con el metabolismo aerobio de los
productos de esta ruta por el Ciclo de los ácidos tricarboxílicos, dando como
producto final ácidos orgánicos; además otras veces lo hace por otra ruta, la del
monofosfato de hexosa, no solo para obtener energía, sino produciendo además
pentosas importantes para la síntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos.
A pesar de ello este fenómeno no fue observando en los tratamientos con
etanol, pues el pH disminuyó hasta valores de alrededor de 3.50 – 3.80, lo que
indica que hubo mayor producción de ácidos de acuerdo a la ecuación propuesta
por Watteeuw et al (1979). Por ello sería más fácil para C. utilis. producir ácido
acético por dicha vía a partir del etanol como fuente de carbono, ya que la
conversión del etanol hasta éste ácido implica dos pasos y la acción de dos
enzimas, mientras que en las rutas antes, mencionadas para la melaza, es más
complejo y lo haría en mayor tiempo; ello se traduce en el hecho de que con los
tratamientos con etanol, se produjo mayor cantidad de ácido, razón por la cual el
pH continúo disminuyendo hasta un nivel en que posiblemente la levadura
empezó a regular su medio con la síntesis de acetato de etilo, tal como lo
mencionan Tabachnick et al (1953).
45
El rendimiento y la productividad de acetato de etilo (%) y proteína
unicelular a partir de etanol rectificado, que dan un rendimiento del 4.93% para
el tratamiento con 15 g/L de etanol rectificado, y un menor rendimiento fue el
tratamiento con 35 g/L de etanol rectificado 1.97(%); son resultados que podrían
explicarse por la asimilación de la fuente carbonada ya que a mayor
concentración de la misma esta podría inhibir algunas enzimas de la levadura
imposibilitando su degradación o generando una inhibición por saturación de
sustrato tal como lo sostiene Doménech ( 2004).
Sin embargo el rendimiento para la producción de proteína unicelular
encontrada en ésta investigación está entre 58% y 55% para las concentraciones
de 15 y 10 g/L de etanol rectificado, incluso superan al valor propuesto como
rendimiento teórico 55.67%, por Estévez (1998).
46
V. PROPUESTA
Como ya se ha visto, son muchos los elementos que deterioran el medio
natural, y muchas las actividades del hombre que tienen consecuencias negativas
en los recursos naturales de la Tierra. Entonces, cada vez es mayor el número de
alarmas que alertan de los riesgos, no existe ningún medio que no esté afectado,
o con grandes posibilidades de afectarse, y no existe ninguna solución que
garantice la plena resolución de los peligros.
El vertido de sustancias tóxicas se hace cada año más incalculable, los
organismos nacionales e internacionales publican cifras aproximadas, que
siempre se refieren a millones de toneladas. Esta llegada de miles de compuestos
químicos, creados en laboratorios y utilizados por las diferentes industrias de los
sectores productivos, y sín políticas ni planes de desarrollo más que un afan
netamente lucrativo alteran el funcionamiento de los ecosistemas y atenta contra
la salud de sus habitantes.
Son cada vez mayores las conexiones entre contaminación y salud, ya nadie
duda, que no se puede soslayar el hecho de que un ambiente contaminado
provoca numerosas enfermedades, desde las relacionadas con la piel o el aparato
respiratorio (alergias, dermatitis, asmas), a procesos mucho más graves de tipo
degenerativo. Como consecuencia de esta situación, la comunidad científica y los
47
poderes públicos deben establecer estrategias para luchar contra la contaminación
y su repercusión en nuestra calidad de vida.
Para lograr estas metas, tanto la Organización Mundial de la Salud (OMS)
como la Agencia Europea del Medio Ambiente, y la FAO han establecido
programas conjuntos a escala mundial que propugnan un ambiente más sano,
propiciando la generación y desarrollo de tecnologías limpias y tecnologías para
limpiar así mismo de aditivos y colorantes de origen animal, vegetal o
microbiano tratando de reemplazar los aditivos y saborizantes químicos ya que
por su origen causan un gran impacto negativo sobre el medio ambiente. Para tal
caso se vienen analizando los distintos bioprocesos del medio natural, y su
relación con la deposición de residuos peligrosos. Entre estos medios está la
atmósfera, el agua, tanto superficial como subterránea, y el suelo.
Por ello, este trabajo pretende dar un aporte a las soluciones que se están
estudiando, para la recuperación de ambientes contaminados producto de la gran
explosión industrial que ha experimentado todo el mundo, pero en especial
nuestro país, en uno de sus sectores con más auge en los ultimos años como es la
industria de la alcoquímica y sus derivados así también incursionar en una área
prioritaria para la humanidad, como es la generación de elementos estructurales
para la dieta como son las proteínas, muy escasas en países en desarrollo como el
nuestro, más aún cuando las áreas para el desarrollo de la agricultura son cada
48
vez menores. Por ello urge la generación de la utilización de técnicas
biorremediadoras y tecnologías que nos permitan producir mas y mejor alimento
por vías más accesibles y baratas a nuestra realidad., es decir, generar un
ambiente determinado mediante procesos biológicos.
Dentro de ese contexto, los hallazgos de la presente investigación, sobre la
evaluación de diferentes concentraciones de etanol rectificado en la producción
del “bioaroma” acetato de etilo y proteina unicelular por Candida utilis var
major C.E.C.T. 1430. A pesar de ser obtenidos a nivel de laboratorio, generan la
posibilidad de realizar un escalamiento a nivel de planta piloto y así escalar en el
bioproceso final, hasta optimizar sus variables. Una vez conseguido estos
propósitos , se podría plantear la idea de bionegocios con la generación de
nuevas tecnologías y bioprocesos para obtener bioproductos, los cuales no dañen
al medio en el cual se producen, y puedan ser fuente de ingresos por
exportación y venta de productos no tradicionales, como son los aditivos,
colorantes y saborizantes muy empleados en diversos sectores industriales como
son el sector de la industria cosmética, alimenticia, farmacéutica etc En tal
sentido se plantea el desarrollo de planes y políticas a la generación de un
programa de desarrollo de la biotecnología y bioingeniería articulando a los
sectores productivos estatales, privado ,universidad y gobiernos regionales,
evaluando potencialidades para desarrollar dichas tecnologías que permitan
identificar a una localidad como pionera y líder en uno de los bioprocesos.
49
Objetivo:
Evaluar y analizar las potencialidades “FODA” para desarrollar un
programa piloto de producción de proteína unicelular y de bioaromas.
Aprovechar los residuos lignocelulósicos de la agroindustria abundante en
nuestra localidad .
Alcance:
Producir proteína unicelular a gran escala tanto para la alimentación
humana y animal.
Mitigar el impacto de la sobrecarga de material lignocelulósico en
nuestra región y convertir a nuestro departamento en una zona potencial
en el desarrollo de nuevas biotecnologías y bioproductos; tales como los
aditivos y saborizantes de origen microbiano.
Infraestructura requerida:
Reactor de 1000 L. de capacidad un zona estratégica a la zona de generación de
matéria prima para el bio proceso.
50
Beneficios esperados:
Complementar la dieta con un alimento rico en proteínas de fácil
asimilación, bajo costo de producción y accesibilidad para su consumo
masivo.
Generar el interés de núcleos familiares y pequeños empresarios para
hacer uso de las tecnologías limpias y tecnologías para limpiar,
consiguiendo satisfacción económica.
Metas:
Alcanzar altos valores de rendimiento y productividad haciendo un
bioproceso económicamente rentable.
Despertar el interés para incursionar en los bioprocesos y bionegocios.
Realizar eventos científicos de trascendencia mundial para intercambiar
experiencias en el área de estudio.
Involucrar al gobierno, universidad y empresa para generar planes de
desarrollo estratégicos
El reactor air loop sería el utilizado para la generación de proteína
unicelular ya que es de fácil construcción, equipamiento, y económico en
su operación. Ya que no lleva turbinas que demandan mucha energía.
La cual genera la demanda de energía y el en carecimineto del
bioproducto. Este reactor, estaría ubicado en laboratorio de Tecnología
51
enzimática del Departamento de Química Biológica y Fisiología Animal,
Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo; y
se plantea comprometer a las diferentes empresas agroindustriales par el
suministro de material lignocelulósico, el gobierno regional, la
Municipalidad Provincial de Trujillo y sus consejos menores a fin de
realizar un trabajo interinstitucional y multidisciplinario con los colegios
profesionales.
52
VI. CONCLUSIONES
La mayor producción de proteína unicelular de Candida utilis. var. major
C.E.C.T. 1430 se obtiene en la concentración de 15 g/L de etanol rectificado
correspondiendo a un valor de 7.90 g/L; seguida de la concentración de 10
g/L de etanol rectificado donde se encontró una producción de proteína
unicelular de 5.80 g/L; así mismo el tratamiento con menor producción de
proteína unicelular fue el de 35 g/L de etanol rectificado con un valor de 4.82
g/L de medio.
La mayor producción de acetato de etilo por Candida utilis var major
C.E.C.T. 1430 se obtuvo en el tratamiento de 15 g/L de etanol rectificado
dando una producción de 0.74 g/L; seguido del tratamiento de 20 g/L de
etanol rectificado con una producción de 0.54 g/L de acetato de etilo, así
mismo el tratamiento con menor producción de acetato de etilo fue el de 35
g/L de etanol rectificado con un valor de 0.27 g/L.
Estadísticamente, no existe diferencia significativa entre el control de etanol
absoluto 30 g/L y su par etanol rectificado; tanto para la producción de
proteína unicelular como para acetato de etilo
53
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Council of Canada. Canada. Journal of Bacteriology. Vol. 141.
p: 1-9.l
Torres, A. 1995. Producción de K. fragilis ATCC8556 con
concentraciones diferentes de lactosuero de vacuno y estiércol de
cerdo a temperatura y pH óptimos. Tesis para optar el grado de
Maestro en Microbiología Industrial y Biotecnología. Universidad
Nacional de Trujillo. Perú.
Torres, B.C. 1997. Metodología de la investigación científica. 5ª ed.
Edit. “San Marcos”. Lima – Perú.
Vegas, R. Y W. Castro. 2002. Evaluación de la calidad de alcohol
etílico a diferentes valores de reflujo en una columna rectificadora
de una destilería prototipo, con una altura equivalente al plato
teórico determinada experimentalmente. Tesis. U.N.T. Trujillo.
Perú.
Vejarano, R. 2005. Estudio comparativo de la producción de biomasa
con acetato de etilo por Candida utilis CECT 10704 a partir de
melaza de caña de azúcar (Saccharum officinarum), etanol
rectificado y etanol sin rectificar como fuentes de carbono. Tesis
para optar el título profesional de Ingeniero Agroindustrial.
Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de
Trujillo. Trujillo. Perú.
60
Wainwright, M. 1995. Introducción a la biotecnología de los hongos.
2da edic. Edit. Acribia. España.
Watteeuw, C. W. Armiger; D. Ristroph y A. Humphrey. 1979.
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Wiseman, A. 1986. Principios de Biotecnología. Editorial Acribia S.A.
Zaragoza. España.
Zoecklin, B.; K. Fugelsang; B. Gump y F. Nury. 2000. Análisis y
producción de vino. Editorial Acribia S.A. Zaragoza. España.
61
62
ANEXO 1. DISEÑO DEL BIORREACTOR TIPO TANQUE AGITADO
63
ANEXO 2. ESTERILIZACIÓN DEL SISTEMA DE FERMENTACIÓN EN
CÁMARA UV SE APRECIA EL FLUORESCENTE DE LUZ UV EN “ON”
EN LA PARTE SUPERIOR DE LA CÁMARA Y TODOS LOS
ACCESORIOS DEL SISTEMA DE FERMENTACIÓN EN LA PARTE
INFERIOR DE LA CÁMARA DE ESTERILIZACIÓN
64
ANEXO 3. OBSERVACIÓN MICROSCÓPCA Y PROCESO DE
REACTIVACIÓN Y PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE LA
LEVADURA Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430
Foto A : Observación miscroscópica de Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430.
Foto B : Proceso de reactivación y preparación del inóculo de la cepa de
levadura Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430.
FOTO A
FOTO B
65
ANEX0 4. SISTEMA DE PRODUCCON BATCH DE ACETATO DE
ETILO Y PROTEINA UNICELULAR DE Candida utilis.
var. major C.E.C.T. 1430
66
ANEX0 5. DETERMINACIÓN DE LA PROTEÍNA UNICELULAR NETA
PRODUCIDA DE Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430
67
ANEXO 6. CUANTIFICACIÓN DEL ACETATO DE ETILO
La cuantificación del acetato de etilo se realizó tomando como referencia la
NTP 030:2002. Norma Técnica Peruana para Caracterizar el Alcohol Etílico
Rectificado.Todo para determinar el contenido de ésteres (Vegas y Castro, 2002).
NTP tiene como fundamento la saponificación del acetato de etilo por una
base,OH.
Neutralización y cuantificación de ácido acético:
- Se tomarón 25 mL de muestra examen.
- Se agregó 3 gotas de fenolftaleína al 0.5% como indicador.
- Se tituló la muestra con solución de NaOH 0.1N, hasta que el color
ligeramente grosella permaneciera por 20 segundos dando por finalizada la
titulación, y si esto no sucedía se seguiría titulando hasta mantener dicha
coloración.
- Se anotó el gasto (mL NaOH) y se procedió a calcular el contenido de ácido
acético:
Saponificación y cuantificación de acetato de etilo:
- A la muestra utilizada anteriormente se le agregó un exceso de 10 mL NaOH
0.1 N.
- Se calentó por 30 minutos para saponificar el éster, luego se enfrió.
- Se tituló con HCl 0.1N, pasando de color grosella a incoloro.
- Se anotó el gasto (mL HCl) y se cuantificó mediante la siguiente fórmula:
muestramL60*NaOHNormalidad*NaOHmL)medioL/g(acéticoÁcido
muestramL)HClmL10(*40*NaOHNormalidad)medioL/g(etilodeÁcido
68
ANEXO 7. VALORACIÓN DE ACETATO DE ETILO POR EL MÉTODO DE
SAPONIFICAICÓN Y CUANTIFICACIÓN
69
ANEXO 8. VALORES ORIGINALES DEL CONSUMO DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL
RECTIFICADO “E” (g/L) COMO FUENTE DE SUSTRATO EN LA PRODUCCIÓN DEL “BIOAROMA”
ACETATO DE ETILO Y PROTEÍNA UNICELULAR DE Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430 DURANTE
60 HORAS DE FERMENTACIÓN A 25ºC; Y SUS ESTIMADORES ARITMETICOS
SEr(g/L)Xni
10 15 20 25 30 35 Testigo
1
2
3
10
10
10
15
14
14
16
18
15
16
17
17
14
14
14
14
12
16
13
15
14
30.00 43.00 49.00 50.00 42.00 42.00 42.00
10.00 14.30 16.30 16.67 14.00 14.00 14.00
0 0.33 2.33 0.33 0.00 4.00 1.00
0 0.57 1.53 0.58 0.00 2.00 1.00
0 0.33 0.88 0.33 0.00 1.15 0.58
xi
x
S2
S
E.S.
C.V. 0 4.03 9.35 3.46 0.00 14.29 7.14
70
ANEXO 9. VALORES ORIGINALES DE PROTEÍNA UNICELULAR NETA PRODUCIDOS “X” (g/L) DE Candida utilis.
var.major C.E.C.T. 1430 EN LA EVALUACIÓN DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL
RECTIFICADO SOBRE LA PRODUCCIÓN DEL “BIOAROMA” ACETATO DE ETILO Y PROTEÍNA
UNICELULAR DURANTE 60 HORAS DE FERMENTACIÓN A 25ºC; Y SUS
ESTIMADORES ARITMETICOS
SEr(g/L)Xni
10 15 20 25 30 35 Testigo
1
2
3
5.50
5.80
6.10
7.99
7.69
8.00
5.96
5.70
6.22
5.50
5.78
5.74
5.00
6.00
5.50
4.00
5.64
4.82
4.91
5.42
5.61
17.40 23.68 17.88 17.22 16.50 14.46 15.94
5.80 7.90 5.76 5.74 5.50 4.82 5.31
0.09 0.03 0.07 0.06 0.25 0.67 0.13
0.30 0.18 0.26 0.24 0.50 0.82 0.36
0.17 0.10 0.15 0.14 0.29 0.47 0.21
xi
x
S2
S
E.S.
C.V. 5.17 2.23 4.36 4.18 9.09 17.01 6.81
71
ANEXO 10. VALORES ORIGINALES DE PRODUCCIÓN DEL “BIOAROMA” ACETATO DE ETILO “AE” (g/L) POR
Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430 A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL
RECTIFICADO COMO FUENTE DE SUSTRATO DURANTE 60 HORAS DE FERMENTACIÓN A 25ºC; Y
SUS ESTIMADORES ARITMETICOS
S (g/L)Xni
10 15 20 25 30 35 Testigo
1
2
3
0.39
0.45
0.41
0.72
0.69
0.81
0.48
0.60
0.55
0.42
0.40
0.50
0.36
0.40
0.32
0.25
0.28
0.29
0.35
0.40
0.29
1.25 2.22 1.63 1.32 1.08 0.82 1.04
0.42 0.74 0.54 0.44 0.36 0.27 0.35
0.0009 0.004 0.0004 0.028 0.016 0.0004 0.003
0.003 0.006 0.006 0.05 0.04 0.021 0.055
0.002 0.003 0.003 0.03 0.023 0.012 0.0317
xi
x
S2
S
E.S.
C.V. 7.332 8.439 11.093 12.02 11.11 7.6158 15.88
72
ANEXO 11. VALORES ORIGINALES DE RENDIMIENTO “Y” (%) EN RELACIÓN AL “BIOAROMA” ACETATO DE
ETILO Y SUSTRATO CONSUMIDO “Y”P/S POR Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430 EN LA
EVALUACIÓN DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL RECTIFICADO COMO FUENTE
DE SUSTRATO DURANTE 60 HORAS DE FERMENTACIÓN A 25ºC; Y SUS
ESTIMADORES ARITMETICOS.
SEr(g/L)Xni
10 15 20 25 30 35 Testigo
1
2
3
3.90
4.50
4.10
4.80
4.93
5.79
3.00
3.33
3.67
2.63
2.35
2.94
2.57
2.86
2.29
1.79
2.33
1.81
2.69
2.67
2.57
12.5 15.52 10.00 7.92 7.72 5.93 7.43
4.17 5.17 3.33 2.64 2.57 1.97 2.48
0.093 0.289 0.111 0.087 0.0812 0.093 0.1241
0.305 0.537 0.335 0.0290 0.0285 0.030 0.3523
0.176 0.3106 0.193 0.1685 0.0164 0.176 0.2034
xi
x
S2
S
E.S.
C.V. 7.33 10.399 10.05 10.97 11.07 15.48 14.22
73
ANEXO 12. VALORES ORIGINALES DE PRODUCTIVIDAD “P” (g/L-h) DEl “BIOAROMA” ACETATO DE ETILO
“AE” (g/L) EN LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA UNICELULAR Y ACETATO DE ETILO POR
Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430 A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL
RECTIFICADO COMO FUENTE DE SUSTRATO DURANTE 60 HORAS DE FERMENTACIÓN A 25ºC; Y
SUS ESTIMADORES ARITMETICOS.
SEr(g/L)Xni
10 15 20 25 30 35 Testigo
1
2
3
0.007
0.008
0.007
0.012
0.012
0.014
0.008
0.010
0.009
0.007
0.007
0.008
0.006
0.007
0.005
0.004
0.005
0.005
0.006
0.007
0.005
0.022 0.038 0.027 0.022 0.018 0.014 0.018
0.007 0.013 0.009 0.007 0.006 0.006 0.006
0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
0.000 0.001 0.001 0.000 0.001 0.000 0.001
0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
xi
x
S2
S
E.S.
C.V. 7.872 9.116 11.11 7.87 16.66 12.37 16.66
74
ANEXO 13. VALORES ORIGINALES DE PRODUCTIVIDAD “P“ (g/L-h) DE PROTEÍNA UNICELULAR “X” (g/L) EN
LA PRODUCCIÓN DEl “BIOAROMA” ACETATO DE ETILO Y PROTEÍNA UNICELULAR DE Candida
utilis. var.major C.E.C.T. 1430 A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL RECTIFICADO COMO
FUENTE DE SUSTRATO DURANTE 60 HORAS DE FERMENTACIÓN A 25ºC; Y SUS
ESTIMADORES ARITMETICOS.
S (g/L)XNi
10 15 20 25 30 35 Testigo
1
2
3
0.092
0.100
0.102
0.100
0.104
0.108
0.099
0.095
0.104
0.092
0.099
0.100
0.083
0.100
0.092
0.067
0.094
0.080
0.082
0.090
0.094
0.294 0.312 0.298 0.291 0.275 0.241 0.266
0.098 0.104 0.099 0.097 0.092 0.080 0.089
0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
0.005 0.004 0.005 0.004 0.008 0.013 0.006
0.003 0.002 0.003 0.002 0.005 0.008 0.004
xi
x
S2
S
E.S.
C.V. 5.399 3.846 4.539 4.494 9.278 16.809 6.89
75
ANEXO 14. VALORES ORIGINALES DE RENDIMIENTO “Y” EN RELACIÓN A LA PROTEÍNA UNICELULAR NETA
PRODUCIDA Y EL SUSTRATO CONSUMIDO “Yx/s” (g/L) DE EN LA EVALUACIÓN DE DIFERENTES
CONCENTRACIONES DE ETANOL RECTIFICADO SOBRE LA PRODUCCIÓN DEL “BIOAROMA”
ACETATO DE ETILO Y PROTEÍNA UNICELULAR POR Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430 DURANTE
60 HORAS DE FERMENTACIÓN A 15ºC; Y SUS ESTIMADORES ARITMETICOS.
SOX
Ni10 15 20 25 30 35 Testigo
1
2
3
55.00
58.00
61.00
53.27
54.93
57.14
37.25
31.67
41.47
34.38
35.18
33.76
35.71
35.71
35.71
28.57
47.00
30.13
37.77
36.13
40.10
174.00 165.34 110.39 103.32 107.13 105.70 114.00
58.00 55.11 36.80 34.44 35.71 35.23 38.00
9.00 3.77 24.16 0.51 0 104.45 3.98
3.00 1.94 4.92 0.71 0 10.22 1.99
1.73 1.12 2.84 0.41 0 5.90 1.15
xi
x
S2
S
E.S.
C.V. 5.17 3.52 13.36 2.87 0 29.00 5.25
76
ANEXO 15. ANÁLISIS DE VARIANZA DE CONSUMO DE SUSTRATO
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA UNICELULAR, RENDIMIENTO Y
PRODUCTIVIDAD EN LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA
UNICELULAR POR Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430 A
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL
RECTIFICADO.
Variables F.V. S.C. g.L C.M: Fc Probabilidad
Consumo desustrato
Concentrac.
Error
Total
85.111
14.000
99.111
5
12
17
17.022
1.167
14.590
***
9.600E-05
p < 0.01
Producción deproteína
unicelular
Concentrac.
Error
Total
15.968
2.337
18.305
5
12
17
3.194
0.195
16.396
***
5.341E-05.
p < 0.01
Rendimiento
Concentrac.
Error
Total
1787.196
283.779
2070.975
5
12
17
357.439
23.648
15.115
***
8.049E-05
p < 0.01
Productividad
Concentrac.
Error
Total
1.0169E-03
6.7600E-04
1.6929E-03
5
12
17
2.0339E-04
5.633E-05
3.610
***
0.0318
p < 0.01
Leyenda: *** Diferencias altamente significativas (p < 0.01)
77
ANEXO 16. ANÁLISIS DE VARIANZA DE CONSUMO DE SUSTRATO
PRODUCCIÓN DE ACETATO DE ETILO RENDIMIENTO Y
PRODUCTIVIDAD EN LA PRODUCCIÓN DE “BIOAROMA”
ACETATO DE ETILO POR Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430
A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL
RECTIFICADO.
Variables F.V. S.C. g.L C.M: Fc Probabilidad
Consumo desustrato
Concentrac.
Error
Total
85.111
14.000
99.111
5
12
17
17.022
1.167
14.590
***
9.600E-05
p < 0.01
Producción deproteína
unicelular
Concentrac.
Error
Total
0.397
0.027
0.424
5
12
17
0.079
2.2167E-03
35.848
***
8.239E-07
p < 0.01
Rendimiento
Concentrac.
Error
Total
20.914
1.508
22.422
5
12
17
4.183
0.126
33.276
***
1.243E-06
p < 0.01
Productividad
Concentrac.
Error
Total
1.1583E-03
6.5557E-06
1.2450E-04
5
12
17
2.3167E-05
7.2222E-07
32.077
***
1.521E-06
p < 0.01
Leyenda: *** Diferencias altamente significativas (p < 0.01)