Aspectos básicos en la estabilidad físico-

química de los medicamentos

Módulo 4. Aspectos generales de

la estabilidad de proteínas

terapéuticas 20/10/2017

Antonio Salmerón García FEA Farmacia Hospitalaria

HUCS Granada

Complejidad estructural

Características Estructura primaria: Secuencia de AA

Estructura secundaria: Secuencias de AA unidas

por puentes de hidrogeno: estructuras de alfa

hélices, hojas plegadas, etc.

Estructura terciaria: uniones entre regiones que

dan lugar a estructura 3D

Estructura cuaternaria: Proteínas formadas por

mas de una cadena polipeptídica

Modificaciones postraduccionales

Tipos de inestabilidad / mec. degradación

1. Física 1. Desnaturalización estructura 3ª: rotura de puentes 2. Formación de agregados: dímeros, tetrámeros o agregados mayores 3. Adherencia e Interacciones con los materiales del contenedor, tubos, filtros.

2. Química

1. Formación o destrucción de puentes disulfuro. 2. Deamidaciones 3. Isomerización 4. Oxidaciones 5. Formación de reticulaciones o enlaces cruzados irreversibles. 6. Fragmentación: formación de especies acidas y básicas. 7. Interacción con excipientes, L/E

Factores que afectan a la degradación

• Temperatura • Modificaciones de pH • Agitaciones • Dilución de los excipientes • Surfactantes • Congelación/descongelación • Radiación UV • Excipientes • Lixiviables / extraibles • Disolventes • Exposición a Oxigeno • ETC

Ciclo de uso del medicamento en el

hospital durante el transporte,

almacenamiento, conservación,

reconstitución, administración,

1. Temperatura: 1. Aumenta la velocidad de los procesos de degradación química 2. Favorece la desnaturalización que puede conducir a formación de agregados 3. La congelación / descongelación también puede conducir a

desnaturalización 2. Luz UV y oxigeno:

1. Oxidación de residuos de metionina, cisteína, lisina, histidina y triptófano. 2. Ruptura de puentes disulfuro que conduce a desplegamientos.

3. Cambios de pH 1. Oxidación de metionina y triptófano 2. Deamidación de asparragina 3. Isomerización de acido aspártico 4. Formación de ac. Piroglutámico desde glutamina

¿Como actúan algunos de estos factores?

Impacto clínico

Los cambios químico / físicos inducen a cambios conformacionales y agregados

que conducen a una perdida de eficacia y aumentos de toxicidad e

inmunogenicidad

¿Cómo se hace?

Enfoque de estudios de estabilidad

Estabilidad química: Son necesarios 3 métodos de separación complementarios

Estabilidad física: Evaluación minuciosa de agregados

Estabilidad biológica: Evaluación de actividad biológica de las proteínas por relación

3D/actividad

Consideraciones a tener en cuenta

Aunque los estudios publicados sobre anticuerpos monoclonales están mejorando

su calidad y robustez,

• Los datos publicados suelen ser limitados a la necesidad clínica debido a un

rango restringido de técnicas analíticas

• Rango restringido o concentraciones únicas,

• Evaluación insuficiente de los criterios e insuficiente detalle de la metodología

de preparación.

• Los estudios publicados sin una revisión por pares adecuada no deben

utilizarse en la asignación de la vida útil. (posters y comunicaciones a congresos)

Consideraciones a tener en cuenta

La estabilidad de los productos biofarmacéuticos puede verse afectada por

diferentes procedimientos de manipulación y otros factores como la elección del

recipiente final, la cantidad de aire presente en el recipiente final y la cantidad de

aceite de silicona en las jeringas. Generalmente no es apropiado extrapolar los

datos, a menos que los criterios para el manejo del producto estén bien definidos

y puedan ser ajustados con precisión.

Técnicas analíticas Cromatografía de exclusión molecular (SEC)

– Separa moléculas en función de su tamaño

– Útil para Ab monoclonales • Detección de agregados

– No útil para fcos clásicos From monomers to octamers

Cromatografía de intercambio catiónico (Weak Cation Exchange Chormatography (W-CXC)): – Isoformas por glicosidacion,

oxidacion, fosforilaciones, desamidaciones (lisina o arginina), etc.

– Permite separar isoformas de un mismo MAb

Cromatografía de fase reversa (Reverse phase chromatography) – Separar por polaridad

– Útil para cuantificar

Espectroscopia de Dicroísmo circular

Permite conocer la estructura en disolución

• Estructura secundaria: UV-lejano

• Estructura tridimensional: UV-cercano

-20

20

-10

0

10

195 260200 220 240

CD [mdeg]

Wavelength [nm]

Espectros UV-lejano de INF: estudio de estabilidad (10 mg/ml).

CONTINLL CDSSTR

Alfa Hélices

Láminas β

Giros β

E. desordena

da

Alfa Hélic

es

Láminas β

Giros β

E. desordena

da

INF Remica

de® 0.02 0.52

0.11

0.35 0 0.53 0.10

0.34

CT-P13 Remsim

a® 0.01 0.52

0.11

0.36 0 0.55 0.11

0.33

ELISA/Cultivos cel, etc.

• Testar actividad biológica

• Todos los mecanismos implicados

Reconstituted in

10 ml water for injecton

INF

0.5 mg/ml

INF

2.0 mg/ml

at 4º C

Stored

-20 º C

Diluted with

0.9 % NaCl

for injection

INF

10.0 mg/ml

Stability

Chemical instability

Mass spectrometry MALDI-TOF

Size exclusion chromatography

Biological

stability

ELISA

Physical instability

Turbidimetry

Size exclusion chromatography

Dicroismo circular

Ejemplo: Estabilidad de infliximab

Dicroismo circular Estructuras secundaria y 3D Infliximab 10mg/ml; 2mg/ml, 0,5mg/ml

Conclusiónes

• La aplicación de una sola prueba puede ser inadecuado para

evaluar la estabilidad de proteínas.

• Los criterios de aceptación de estabilidad no son tan evidentes y

claros como en los principios activos no proteicos.