Experienţe pe preparat neuromuscular 7

EXPERIENŢE PE PREPARAT NEUROMUSCULAR Dr. Metz Júlia, Dr. Szilágyi Tibor

PRINCIPII TEORETICE Mişcarea este o manifestare elementară a vieţii. Muşchiul striat de tip scheletal asigură

mişcarea şi/sau fixarea articulaţiilor, dar acest tip de muşchi găsim şi la sfincterul extern al anusului şi a tractului urinar, la musculatura orofaringeană şi treimea superioară a esofagului, la diafragmă şi la muşchii mimici.

În mod normal muşchiul striat scheletal nu are activitate spontană. Singura modalitate de contracţie fiziologică este prin activarea nervilor motorii periferici. Un motoneuron şi celulele musculare inervate de acesta constituie unitatea motorie. Celulele musculare din cadrul unei unităţi motorii se contractă sincron.

Depolarizarea până la prag a motoneuronului alfa din măduva spinării declanşează un potenţial de acţiune, care se propagă de-a lungul axonului spre periferie. Propagarea este autoregenerativă, deci impulsul nervos nu este atenuat de-a lungul axonului. Transmisia excitaţiei de la motoneuron la celulele musculare are loc la joncţiunea neuromusculară. În terminaţiile presinaptice ale axonului se găsesc multe vezicule cu conţinut ridicat de acetilcolină. Potenţialul de acţiune cauzează depolarizarea membranei, deschiderea canalelor de calciu voltaj dependente şi creşterea concentraţiei de calciu intracelular, care cauzează eliberarea acetilcolinei din vezicule. Acest neurotransmiţător traversează foarte repede fanta sinaptică şi se leagă de receptorii postsinaptici de pe celula musculară. La muşchiul striat scheletal se găsesc receptori nicotinici ai acetilcolinei. Acest receptor este un canal ionic dependent de liganzi. În cazul legării acetilcolinei se deschide canalul şi permite curgerea unui curent cationic mixt (preponderent curent de Na+), care depolarizează membrana. Când celula musculară ajunge la prag, se declanşează potenţialul de acţiune, deschiderea canalelor de calciu, intrarea calciului în citosol, creşterea concentraţiei de Ca2+ şi contracţia consecutivă a muşchiului. Detaliile cuplării electro-contractile este aceeaşi ca la inimă (cursul din primul semestru).

Contracţia muşchiului scheletal se poate declanşa experimental prin stimulare electrică. Pe baza celor prezentate mai sus, există două modalităţi de stimulare:

− stimulare directă, când electrodul este aşezat direct pe muşchi şi cauzează depolarizarea acestuia

− stimulare indirectă, când nervul periferic este excitat şi impulsul nervos generat va declanşa contracţia.

Scopul acestei lucrări este studierea fenomenelor electrice şi mecanice legate de

activitatea nervilor motorii şi a muşchiului striat scheletal.

PREGĂTIREA PREPARATULUI NEUROMUSCULAR IN VITRO După anestezie şi decapitare, broasca imobilizată, eviscerată, tăiată în două va fi

jupuită. După spălarea planşetei se taie longitudinal bontul coloanei vertebrale şi se prepară nervul sciatic până la trecerea sa prin gaura obturată. Se taie apoi centura pelviană, având grijă ca nervul sciatic să nu fie lezat. Între timp pentru împiedicarea uscării nervului udăm preparatul cu soluţie Ringer. După tăierea centurii pelviene se desface musculatura coapsei cu ajutorul degetelor pe partea dorsală până ce apare nervul între muşchi. Continuăm apoi prepararea nervului cu foarfeca până ce ajungem la articulaţia genunchiului, secţionăm transversal muşchii coapsei deasupra articulaţiei, secţionăm şi osul femurului lăsând un bont de 2 cm. Introducem apoi un fir de aţă sub tendonul lui Achile, pe care îl legăm şi îl secţionăm dedesubtul ligaturii şi preparăm muşchiul până la capătul superior, apoi secţionăm

8 Lucrări practice de fiziologie tibia. Preparatul neuromuscular este deci alcătuit din bontul coloanei vertebrale, nervul sciatic, bontul osului femur, articulaţia genunchiului şi muşchiul gastrocnemian.

PREGĂTIREA PREPARATULUI NEUROMUSCULAR IN SITU După anestezie şi decapitare se imobilizează broasca prin distrugerea măduvei

spinării. Se culcă animalul pe abdomen şi se face o incizie pe pielea gambei, se caută tendonul lui Achile şi se introduce un fir de aţă sub tendon. Se leagă tendonul şi se taie sub ligatură. Se face apoi o incizie pe pielea coapsei, se caută nervul sciatic şi se introduce sub nerv o pereche de electrozi.

Excitarea preparatului se face cu curent electric (impulsuri rectangulare de curent, cu

intensitate şi durată reglabilă). Excitarea se poate face pe două căi: - excitarea directă: se aşează o pereche de electrozi pe suprafaţa muşchiului, - excitarea indirectă: se aşează o pereche de electrozi sub nervul sciatic.

Descrieţi fenomenele implicate în cazul stimulării indirecte (direcţia propagării potenţialului de acţiune, funcţionarea joncţiunii neuromusculare, răspunsul celulei musculare, mecanisme intracelulare de semnalizare).

Răspunsul muşchiului dat la excitarea electrică unică (indiferent de calea

stimulării: directă sau indirectă) este o secusă musculară cu formă caracteristică. Ea se compune din perioada de latenţă cu o durată de 0,005 - 0,01 sec (5 - 10 msec), care începe din momentul aplicării excitantului şi se sfârşeşte la începutul contracţiei (Figura 1).

Figura 1. Secusa musculară.

Explicaţi fenomenele care contribuie la perioada de latenţă.

Contracţia este înregistrată ca o pantă ascendentă cu o durată de aprox. 0,04 sec (40

msec). Ea este urmată de porţiunea descendentă, produsă de relaxarea muşchiului. Acest segment are durată de aprox. 0,05 sec (50 msec). Secusa musculară a unui muşchi de broască la o temperatură de 20°C are o durată totală de 0,1 sec (100 msec). Durata secusei depinde de temperatura la care se lucrează, de starea actuală a muşchiului (în cazul oboselii durata secusei este mai mare) şi de dezvoltarea filogenetică a animalului (Figura 1).

Determinarea pragului de excitaţie: se numeşte prag de excitaţie intensitatea minimă

a curentului, care produce o secusă musculară. După obţinerea pragului de excitaţie mărind treptat intensitatea curentului, obţinem

răspunsuri din ce în ce mai ample, până la atingerea unei valori maxime, după care amplitudinea curbelor rămâne constantă. Fenomenul poate fi explicat în felul următor: fibrele care alcătuiesc muşchiul (respectiv nervul) au praguri de excitaţie diferite. În cazul unui

Experienţe pe preparat neuromuscular 9

curent slab am atins pragul numai la câteva fibre musculare, ca atare răspunsul va fi slab. Mărind intensitatea curentului, atingem pragul la mai multe fibre, iar la o intensitate dată toată fibrele se vor contracta simultan şi secusa musculară va fi de amplitudine maximală (Figura 2). Legea totul sau nimic care şi-a dovedit valabilitatea pentru miocard, nu mai este valabilă la muşchiul scheletic integral, fiind valabilă la muşchi numai pentru o singură fibră musculară.

Figura 2. Determinarea pragului de excitaţie.

Fenomenul de superpoziţie: aplicând două excitanţi succesivi în cazul când intervalul

este mare, obţinem două secuse musculare. Dacă scădem intervalul astfel ca aceasta să fie mai mic de 0,1 sec, muşchiul încă nu va fi complet relaxat după primul excitant şi începe o secusă nouă, care se suprapune peste prima şi vom înregistra o secusă dublată cu un aspect caracteristic (Figura 3).

Figura 3. Fenomenul de superpoziţie.

10 Lucrări practice de fiziologie

Explicaţi, de ce contracţia a doua are amplitudine mai mare. Explicaţi de ce nu se poate obţine superpoziţie la miocard.

Tetanos incomplet şi complet: excitând preparatul neuromuscular cu stimuli repetaţi,

cu o frecvenţă mare, înregistrăm o contracţie care nu mai este urmată de relaxarea muşchiului. Această formă de contracţie este denumită contracţie tetanică sau tetanos complet. Ea este forma obişnuită, naturală a contracţiei musculare. În mod normal, în organism mişcările sunt nişte contracţii tetanice ale unităţilor motorii (Figura 4).

Dacă excităm preparatul cu o frecvenţă nu prea mare, obţinem un tetanos incomplet,

forma de contracţie la care muşchiul prezintă şi tendinţe de relaxare, dar relaxarea completă nu poate să aibă loc, fiindcă urmează contracţia următoare. Frecvenţa excitării pentru obţinerea unui tetanos complet depinde de starea de excitabilitate a preparatului, de temperatură şi de intensitatea curentului aplicat. Amplitudinea contracţiei tetanice creste cu frecvenţa stimulării până la o valoare optimă (Figura 4)

Figura 4. Tetanos incomplet şi complet.

Studiul oboselii musculare: înregistrăm o secusă musculară, după care stimulăm

preparatul cu o frecvenţă subtetanică. După un timp observăm scăderea amplitudinii secuselor şi alungirea duratei. Scăderea amplitudinii se datorează relaxării incomplete, iar următoarea contracţie porneşte de la o stare semicontractată a muşchiului (Figura 5).

Explicaţi fenomenele observate.

După terminarea demonstraţiei se trece la analiza traseelor cu ajutorul sistemului de calculatoare. Urmaţi indicaţiile date de mai jos şi completaţi Fişa de lucru.

Experienţe pe preparat neuromuscular 11

Figura 5. Studiul oboselii musculare.

12 Lucrări practice de fiziologie

INSTRUCŢIUNI PENTRU COMPLETAREA FIŞEI DE LUCRU

1. Determinaţi amplitudinea medie a secusei, perioada medie de latenţă, durata medie a contracţiei şi a relaxării! Deschideţi fişierul secusa.dat File → Open → secusa.dat Căutaţi pe traseu o secusa musculară Folosiţi butoanele Next şi Previous sau introduceţi momentul dorit în partea dreaptă a ecranului → click Go Calculaţi amplitudinea secusei faţă de linia de bază. Click Cursor measure → poziţionaţi cursorul → citiţi poziţia cursorului în fereastra Measurement results Măsuraţi perioada de latenţă, durata contracţiei şi a relaxării. Click Cursor measure → poziţionaţi cursorul → citiţi poziţia cursorului în fereastra Measurement results Calculaţi media a cinci măsurători. Puteţi folosi calculatorul din Windows Start → Programs → Accessories → Calculator 2. Determinaţi cea mai mare frecvenţă de stimulare, la care nu se observă fenomenul de superpoziţie! Deschideţi fişierul superpos.dat. File → Open → superpos.dat Căutaţi secusele corespunzătoare. Folosiţi butoanele Next şi Previous sau introduceţi momentul dorit în partea dreaptă a ecranului → click Go Calculaţi frecvenţa stimulării. Click Cursor measure →măsuraţi intervalul dintre cele două potenţiale de acţiune → citiţi poziţia cursorului în fereastra Measurement results → calculaţi frecvenţa stimulării. 3. Determinaţi cea mai mică frecvenţă de stimulare la care nu există relaxare după prima contracţie musculară! Căutaţi secusele corespunzătoare. Folosiţi butoanele Next şi Previous sau introduceţi momentul dorit în partea dreaptă a ecranului → click Go Calculaţi frecvenţa stimulării. Click Cursor measure →măsuraţi intervalul dintre cele două potenţiale de acţiune → citiţi poziţia cursorului în fereastra Measurement results → calculaţi frecvenţa stimulării. 4. Determinaţi amplitudinea medie a secusei musculare! Deschideţi fişierul tetanus.dat File → Open → tetanus.dat Căutaţi pe traseu o secusa musculară Folosiţi butoanele Next şi Previous sau introduceţi momentul dorit în partea dreaptă a ecranului → click Go Calculaţi amplitudinea secusei faţă de linia de bază. Click Cursor measure → poziţionaţi cursorul → citiţi poziţia cursorului în fereastra Measurement results

Experienţe pe preparat neuromuscular 13

Calculaţi media a trei măsurători. 5. Determinaţi cum se modifică amplitudinea contracţiei tetanice în funcţie de frecvenţa stimulării! Căutaţi pe traseu un tetanos. Folosiţi butoanele Next şi Previous sau introduceţi momentul dorit în partea dreaptă a ecranului → click Go Măsuraţi amplitudinea contracţiei tetanice faţă de linia de bază. Click Cursor measure → poziţionaţi cursorul → citiţi poziţia cursorului în fereastra Measurement results Calculaţi frecvenţa stimulării. Click Cursor measure →măsuraţi intervalul dintre cele două potenţiale de acţiune → citiţi poziţia cursorului în fereastra Measurement results → calculaţi frecvenţa stimulării. Repetaţi măsurătorile pentru mai multe contracţii tetanice. 6. Reprezentaţi grafic amplitudinea relativă a contracţiei faţă de frecvenţa stimulării. 7. Determinaţi amplitudinea medie a secusei musculare, durata medie de contracţie şi de relaxare! Deschideţi fişierul oboseala.dat File → Open → oboseala.dat Căutaţi pe traseu o secusa musculară Folosiţi butoanele Next şi Previous sau introduceţi momentul dorit în partea dreaptă a ecranului → click Go Calculaţi amplitudinea secusei faţă de linia de bază. Click Cursor measure → poziţionaţi cursorul → citiţi poziţia cursorului în fereastra Measurement results Măsuraţi durata contracţiei şi a relaxării. Click Cursor measure → poziţionaţi cursorul → citiţi poziţia cursorului în fereastra Measurement results Calculaţi media a trei măsurători. 8. Determinaţi cum se modifică amplitudinea secusei, durata fazei de contracţie şi de relaxare sub efectul oboselii musculare! Căutaţi trei secuse musculare după fiecare stimulare subtetanică. Folosiţi butoanele Next şi Previous sau introduceţi momentul dorit în partea dreaptă a ecranului → click Go Calculaţi amplitudinea secusei faţă de linia de bază. Click Cursor measure → poziţionaţi cursorul → citiţi poziţia cursorului în fereastra Measurement results Măsuraţi durata contracţiei şi a relaxării. Click Cursor measure → poziţionaţi cursorul → citiţi poziţia cursorului în fereastra Measurement results