preparação de amostras biológicas para microscopia eletrônica · » manter relações espaciais...
TRANSCRIPT
Preparação de Amostras Biológicas para Microscopia Eletrônica
Patricia Massara Martinelli
Coordenadora
Laboratório de Preparação de Amostras Biológicas
CM-UFMG
Amostras BiológicasKeith Porter, Albert Claude, and Ernest Fullam. 1945. "A Study of
Tissue Culture Cells by Electron Microscopy”. Journal of Experimental
Medicin.
http://www.biologicalelectronmicroscopy.com/a-brief-history-of-micorscopy.html
http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/memb/membrane.jpg
Robertson, JD. 1959. Estrutura
trilaminar da membrana plasmática
Amostras Biológicas• Tipos
– Para MET: amostras de órgãos/tecidos, células em cultivo, microorganismos, vesículas (lipossomas, micelas, etc)
• Amostras finas
• Análise de detalhes na secção da amostra
– Para MEV: amostras de tecidos, células em cultivo, microorganismos, vesículas (lipossomas, micelas, etc), organismos de pequena dimensão (insetos, conchas, sementes, etc), órgãos e fragmentos de órgãos
• Amostras espessas
• Análise de superfície
– Preservação• ~80% de H2O; enzimas; elementos orgânicos
Exposição ao ar
AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão
– Resistência ao vácuo• ~80% de H2O
vácuo
H2OH2O
H2O H2O
H2O
H2O H2O H2O
AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão
• Espessura da amostra
– Permitir passagem do feixe eletrônico
– Promover resolução
˜50nm
AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão
Elementos orgânicos
Baixa densidade de elétrons
Baixo contraste
H
O
C
N
AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão
• Contraste na amostra
• PREPARAÇÃO– Manutenção próxima da organização in vivo
» Preservação da arquitetura e composição celular
» Manter relação espacial na célula» Impedir a liberação e ação de enzimas líticas (autólise)» Impedir ação de microorganismos (putrefação)
– Permitir produção de secções ultrafinas– Conferir resistência ao vácuo– Conferir contraste
• FIXAÇÃO, DESIDRATAÇÃO, INCLUSÃO, ULTRAMICROTOMIA, CONTRASTAÇÃO– Efeitos sobre a amostra:
• Endurecimento• Retração• Perda discreta da estrutura
AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão
AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão
• FIXAÇÃO
– Estabilização da estrutura molecular
– Não desnaturante
– Permite etapas seguintes
– Fixação química
• Aldeídos (pontes intra e interprotéicas)
• Tetróxido de ósmio (lipídeos)
• Mais usada
Máximo 2mm
Aldeído
Tetróxido de ósmio
• DESIDRATAÇÃO – Resistência ao vácuo
– Permite inclusão em resina
• INCLUSÃO EM RESINA– Permite ultramicrotomia
– Resitência ao feixe de elétrons
Etanol50%1x10'
Etanol70%2x15’
Etanol95%2x15
Etanol100%
3x15'
Acetona100%
2x15'
AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão
• ULTRAMICROTOMIA– Cortes ultrafinos (50-60nm)
– Telas de cobre, níquel ou ouro
AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão
• CONTRASTAÇÃO– Deposição de metais pesados (tetróxido de
ósmio, acetato de uranila, citrato dechumbo)
– Positiva: detalhes internos
– Negativa: contorno da amostra (vírus,bactérias, vesículas, liposomas,macromoléculas)
NegativaPositiva Nakajima et al 2010http://freegreenbee.blogspot.com.br/2014/04/influenza.html
AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão
DIAFRAGMA DE CAMUNDONGO
MASTÓCITO EM COLON HUMANO
LIPOSOMA
ME de transmissãoTomografia
Subramaniam et al., 2003
EDS (Espectroscopia de X-ray porenergia dispersiva)
a) Electron micrograph showing the microstructure of a wheat seed aleurone cell. EDS maps of (b) Os Mα, (b) P Kα and (d) N Kα. (e) Layered image combining all 3 maps.
https://www.azonano.com/article.aspx?ArticleID=3701
• PREPARAÇÃO– Manutenção próxima da organização in vivo
» Preservação da estrutura molecular da superfície a ser analisada
» Manter relações espaciais das estruturas» Impedir a liberação e ação de enzimas líticas (autólise)» Impedir ação de microorganismos (putrefação)» Conferir resistência ao vácuo» Aumentar condutividade e dar estabilidade
• FIXAÇÃO, DESIDRATAÇÃO, (CRIOFRATURA), MONTAGEM, E METALIZAÇÃO
• AMOSTRAS: dimensões maiores
AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Varredura
• FIXAÇÃO– Desnecessária em caso de superfícies secas (esqueletos de quitina,
conchas, sementes secas, etc) Secagem comum ao ar
– Fixação química: aldéidos
– Fixação por congelamento ou narcotização (vermes, insetos aquáticos, zooplancton) stress ao entrar em contato com fixador mudança ou perda de ultraestrutura
• Material sobre a amostra, como muco, pode impedir visualização da superfície Lavagem com salina (com leve agitação) Centrifugação leve Álcool, glicerol ou enzimas
AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Varredura
• DESIDRATAÇÃO
– Desnecessária no caso de amostras secas
– Amostras úmidas: secagem sem deformação da superfície mais extensa. Forças de tensão superficial da água durante sua passagem para estado líquido para gasoso
– Secagem em ponto crítico
AMOSTRAS BIOLÓGICAS
ME Varredura
• MONTAGEM
• METALIZAÇÃO:
– Amostras devem tornar-se condutoras (interação com feixe elétrons)
AMOSTRAS BIOLÓGICAS
ME Varredura
CABEÇA ARANHA
CABEÇA MARIPOSA
Através de lentes eletrostáticas é possível mover o feixe de íons em uma área determinada e fazer cortes com resolução nanométrica.
Briggman & Bock, 2012
Karreman et al., 2016
MICROSCÓPIO DE FEIXE
DUPLO: ELÉTRONS + ÍONS (FIB
– focused ion beam)
CRIOTÉCNICAS
CRIOFIXAÇÃO• Congelamento ultrarrápido das células com passagem da água intracelular e
pericelular do estado líquido para o sólido (vitrificação) sem formação de cristais.
• Mantem estado natural da amostra (evita difusão de solutos, deformações
osmóticas e morfológicas, alterações bioquímicas)
• Dispensa fixadores químicos
• CryoEM de amostras hidratadas
SEM CONGELAMENTO CONGELAMENTO NORMAL CONGELAMENTO ULTRARRÁPIDO
CRIOFIXAÇÃO
CRIOFIXAÇÃO
CRIO ULTRAMICROTOMIA
IMUNOMARCAÇÃO
ME TRANSMISSÃO
CRIO FRATURA
CRIO SUBSTITUIÇÃO
FIXAÇÃO QUÍMICA
INCLUSÃO
ME VARREDURA
FIB
RÉPLICA
IMUNOMARCAÇÃO
TEMPERATURA AMBIENTE
High-Pressure Freezing
Congelamento ultrarrápido (-1000ºC/s) com nitrogênio líquido
sob alta pressão (2100 bars);
Única técnica capaz de congelar amostras > 30 µm
Melhor preservação da arquitetura celular e molecular (menos
artefatos);
CRIOFIXAÇÃO
Amostra
Porta-amostra
Porta-amostraFluido extracelular
CRIO-ULTRAMICROTOMIA
Neurofisiona em terminais axônicos(https://www.uthsc.edu/neuroscience/imaging-
center/)
CRIO-FRATURA
https://www.pinterest.co.uk/pin/238690848972886488/
Microscopia Correlativa• Correlação entre imagens de microscopia óptica e eletrônica de
transmissão;
• Identificar moléculas e/ou estruturas imunomarcadas em organelas ouregiões subcelulares;
Market et al., 2016
http://www.ucl.ac.uk/lmcb/users/alexander-agrotis
Microscopia eletrônicaambiental
• Amostra em meio líquido ou gasoso
The original image is the upper epiderml cells of petal in Mazus fauriei and gotten with cryo SEM. Courtesy of Dr. Wann-neng Jane , Institute of Plant and Microbial Biology, Academia Sinica (www.fei.com)
OBRIGADA!