precipitazione frazionata di...
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PRECIPITAZIONE FRAZIONATA DI PROTEINE
Obiettivo:separare proteine sfruttando
differenze di solubilità
SOLUBILITA’ DELLE PROTEINE
• pH• FORZA IONICA• SOLVENTI• POLIMERI ORGANICI
• TEMPERATURA
Effetto del pH
Precipitazione isoelettrica
• Si modifica il pH avvicinandolo al pI
• Può essere utilizzata per allontanare proteine estranee o per purificare la proteina desiderata
Ioni in acqua• Gli ioni interferiscono con la struttura naturale
dei legami idrogeno dell’acqua• L’effetto netto è la riduzione della viscosità• Alcuni ioni si comportanoi come
• agenti chaotropi o denaturanti distruggono le interazioni intramolecolari che stabilizzano le macromolecole
• agenti cosmotropi o stabilizzanti rinforzano la struttura dell’acqua (interazioni idrogeno dell’acqua forti ) così stabilizzando le interazioni intermolecolari tra le proteine
La relazione tra solubilità di un sale e la forza ionica è esponenziale
log S = β - kSμ
Relazione di Cohn, dove:μ = ½ Σ ci zi
2 forza ionicaβ = log S0 solubilità a μ = 0kS costante di “salting-out”
dipende dal sale e dalla proteina
Efficacia precipitante dei sali.La serie di Hofmeister (1888)
Cationi: NH4+ > Cs + > Rb+ > K+ > Na+ > Mg++ > Ca++ > Al3+
Anioni: citrate3- > SO4-- > HPO4
-- > Cl- > I- > NO3- > ClO4
- > SCN-
Effetto chaotropico crescente(denaturanti)
Effetto cosmotropico crescente(stabilizzanti e precipitanti)
Jonathan N. Sachs† and Thomas B. WoolfJ. AM. CHEM. SOC. 2003, 125, 8742-8743
L’effetto chaotropo è legato alla capacità di penetrare il bilayerlipidico
O
CH2OH
OH
OH
OH
OHOH
OH
CH2OH
O
O
Il trealosio (α,α-glucosio) è un agente cosmotropo
Abbondante nell’emolinfa degli insetti
Effetto della forza ionica
Salting-out
Salting-in
Precipitazione frazionata con ammonio solfato
• Sale molto solubile e buon precipitante• La concentrazione si esprime in % saturazione
(soluzione satura: circa 4 M)• Si può aggiungere sale solido oppure una
soluzione satura• Si procede per aggiunte successive• La tecnica non è denaturante• La densità delle proteine è maggiore della
soluzione (non vero per sale di potassio)
Frazionamento con solventi organici
• Si usano solventi polari (acetone, metanolo, etanolo, dimetil-solfossido…)
• Diminuisce la costante dielettrica del mezzo e aumentano le interazioni soluto-soluto
• Occorrono temperature basse (forte rischio di denaturazione)
• Pericoloso su larga scala (infiammabilità)
Precipitazione con solventi.Acetone a 0°C e pH 6.5
Frazionamento con polimeri organici
• Rimuovono acqua di idratazione dalle proteine
• Si utilizzano polimeri idrofili come il poli-etilenglicole (PEG) con massa molecolare 6000-20000
Effetto della temperatura
• In un certo intervallo, parte delle proteine globulari aumentano la solubilità con T
• A T > 40° C, molte proteine tendono a denaturarsi e a precipitare
• L’aumento di temperatura può essere impiegato per precipitare proteine termo-labili, recuperando proteine termostabili
DIALISI eULTRAFILTRAZIONE:
OBIETTIVO
Separare molecole o particelle tramite una membrana semi-permeabile,
sfruttando differenze di dimensioni
Dialisi Passaggio di molecole (cristalloidi) secondo gradiente di concentrazione attraverso le membrane . Le membrane sono impermeabili alle macromolecole (colloidi) e sono dette MEMBRANE DA DIALISI
c c cM M
H2O
h = pressione oncotica,pressione osmotica dovuta allemacromolecole
h
A B A B
a bd
bda bc
da bc
da Ripetere per rimuovere
completamente cEmodialisi (glucosio, NaCl, etc.)
c
Dialisi selettiva
all’equilibrioinizio della dialisi
RL
R-L
L L
Dialisi all’equilibrio.Si può calcolare la costante di affinità di un ligando (L)per il suo recettore (R)
equilibrio
• Microfiltrazione 0.1 - 10 μm
• Ultrafiltrazione 103 – 106 Dalton
• Nanofiltrazione (non interessa)
FiltrazioneLe particelle più piccole si muovono attraverso la membrana assieme al fluidosotto l’azione di una forza
DIALISI e ULTRAFILTRAZIONE:APPLICAZIONI
• Eliminazione di molecole a basso PM (desalting)• Sostituzione del tampone• Concentrazione• Studi di interazioni con ligandi (binding)• Recupero di frammenti di DNA• Rimozione di batteri (sterilizzazione)• Funzioni terapeutiche (emodialisi)
Concentratori per ultrafiltrazione
Per far passare il solvente attraverso la membrana si possono utilizzare:
• Pressione (in genere, azoto)
• Forza centrifuga (provette Centricon)
• Sostanze igroscopiche al di là della membrana
Ultrafiltrazione a pressione
Cella con ilcampione
Azoto
Serbatoio
Valvola
AgitatoreUltrafiltrato
Liquido di lavaggio
In
Out
Membrana filtrante
Diafiltrazione:celle per campioni
Dischi per ultrafiltrazionePer concentrare o desalificare soluzioni diluite, si usano membrane di cellulosa. La microstruttura idrofilica assicura la maggiore ritenzione possibile Con il minore adsorbimento di proteine, DNA o altre macromolecole.
Per campioni più ricchi in proteine (es., siero) si usano membrane in polieteresulfone (PES)
Filtrazione a flusso tangenziale (TFF)
Apparato per TFF
Pompa Filtrato
FiltratoMembrana
Recipiente del campionelunghezza
ingresso recuperato
valvola
Applicazioni della TFF• Concentrare e desalificare proteine e peptidi. • Concentrare e desalificare acidi nucleici [DNA, RNA,
oligonucleotidi]. • Recuperare e purificare anticorpi o proteine recombinanti da
terreni di cellule in coltura. • Recuperare e purificare DNA plasmidici da lisati cellulari o
DNA cromosomico da sangue intero. • Frazionare miscele diluite di proteine. • Chiarificare lisati cellulari o omogenati di tessuti. • Depirogenare (rimuovere endossine) da acqua, tamponi e altre
soluzioni. • Preparare i campioni prima di una cromatografia su colonna. • Raccogliere cellule. • Ricuperare o rimuovere virus.
Concentratore Centricon
Campione
Campione concentrato
Tappo di raccolta
Filtrato
Serbatoio di raccolta
Membrana ultrafiltranteCampo
centrifugo
Sistema Amicon
Concentra 500 ul in 15 ulResa 90%15-30 min a 14.000 g
Concentratore statico
Pozzetti per i campioni
Adsorbente igroscopico
di cellulosa
Membrana
campione
Setto non permeabile
Campione concentrato
Concentratore statico: applicazioni
• Concentrazione di campioni clinici (urina, siero, CSF)
• Concentrazione di campioni per ricerca• Aumento del titolo di anticorpi• Rimozione di sali per ripetuta diluizione/
concentrazione• Concentrazione di enzimi
Concentratore Savant SpeedVac
camera trappola refrigerata trappola per pompacentrifuga per il solvente vapori (opzionale)