praktikum iz opće mikrobiologije

Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku Poljoprivredni fakultet u Osijeku

Gabriella Kanižai Šarić

Praktikum iz opće mikrobiologije

2015.

Recenzent

Prof. dr. sc. Zlata Milaković

Lektor

Valerija Zubak, prof.

ISBN 978-953-7871-53-6

Sadržaj

1. Mikroskop i primjena mikroskopa u mikrobiologiji……………………………………………….. 1

Mikroskopski preparati..................................... …………………………………………………….. 1

2. Boje i postupci bojenja…………………………………………………………………………………………… 3

3. Gramovo bojenje ……………………………………………………………………………………..…………… 5

4. Bojenje spora i kapsula kod bakterija……………………………………………………………………… 7

5. Mjerenje veličine mikroorganizama……………………………………………………………………….. 9

6. Postupci sterilizacije………………………………………………………………………………………………. 11

6.1. Sterilizacija toplinom…………………………………………………………………………………… 11

Sterilizacija suhom toplinom…………………………………………………………………………… 11

Sterilizacija vlažnom toplinom………………………………………………………………………… 11

6.2 Sterilizacija ozračivanjem……………………………………………………………………………… 12

6.3. Sterilizacija filtracijom…………………………………………………………………………………… 12

6.4. Sterilizacija plinovima…………………………………………………………………………………… 12

7. Uzgoj mikroorganizama…………………………………………………………………………………………. 14

Tehnike precjepljivanja mikroorganizama…………………………………………………………. 14

Metode za određivanje broja mikroorganizama…………………………………………………. 16

Uzgoj anaerobnih mikroorganizama………………………………………………………………….. 16

8. Izdvajanje mikroorganizama u čiste kulture……………………………………………………………. 19

Održavanje i čuvanje čistih kultura mikroorganizama………………………………………….. 19

9. Determinacija bakterija………………………………………………………………………………………….. 21

Primjeri pojedinih biokemijskih postupaka u identifikaciji bakterija…………………….. 21

10. Opće osobine i predstavnici gljiva………………………………………………………………………… 24

11. Određivanje osjetljivosti mikroorganizama prema antimikrobnim lijekovima………. 28

12. Mikrobiološka analiza vode za piće………………………………………………………………………. 30

13. Obrada rezultata i praktičan rad…………………………………………………………………………… 32

Literatura…………………………………………………………………………………………………………………… 33

1

1. Mikroskop i primjena mikroskopa u mikrobiologiji

Mikroskop je optički instrument koji služi za promatranje sitnih objekata pa tako i

mikroorganizama. Građen je od mehaničkih i optičkih dijelova. U mehaničke dijelove

ubrajamo tubus s revolverom, postolje, stativ, stolić mikroskopa, makrovijak i mikrovijak.

Optički su dijelovi okular, objektiv, kondenzor i iris. Mikroskopi se mogu podijeliti na

svjetlosne i elektronske. Svjetlosni mikroskopi imaju mogućnost povećanja do 3 000 puta i

služe za promatranje nativnih i obojenih preparata, za određivanje broja stanica,

pokretljivosti mikroorganizama i sl. Postoje različite izvedbe ovih mikroskopa, a neki su od

njih sa svijetlim vidnim poljem, s tamnim vidnim poljem, fazno-kontrastni i fluorescentni.

Elektronski mikroskopi koriste snop elektrona kao izvor svjetlosti, a povećavaju sliku do

1 000 000 puta. U svojoj izvedbi mogu biti transmisijski i pretražni, a koriste se za

proučavanje unutarnje građe i struktura na površini mikroorganizama. Preparati za mikroskopiranje

Za promatranja mikroskopom potrebno je pripremiti preparate za mikroskopiranje

koji mogu biti nativni i fiksirani. Nativni preparati sadrže žive mikroorganizme, a služe za

promatranje krupnijih mikroorganizama (praživotinje, alge i gljive). U ovako pripremljenom

preparatu može se promatrati oblik, veličina, kapsula, spore mikroorganizama i dr. Nativni

preparat može se pripremiti u obliku vlažnog preparata i viseće kapi. Kod fiksiranih su

preparata mikroorganizmi umrtvljeni i obojeni zbog bolje vidljivosti. Fiksiranjem se

mikroorganizmi umrtvljuju što omogućava bojama lakše prodiranje u stanicu.

Zadatak 1.

Pripremite vlažan preparat praživotinja i algi.

Materijal: predmetnica, pokrovnica, špiritusna lampa, mikrobiološka ušica, mikroskop,

suspenzija praživotinja i algi u živom stanju.

Postupak

1. Sterilizirajte predmetnicu na plamenu špiritusne lampe.

2. Na plamenu špiritusne lampe sterilizirajte mikrobiološku ušicu.

3. Na predmetnicu nanesite kapljicu suspenzije praživotinja i algi.

4. S pokrovnicom prekrijte kapljicu suspenzije pod oštrim kutom od 45˚pazeći pri tom da se

u tekućini ne pojave zračni mjehurići.

5. Koristeći suhi objektiv pronađite mikroskopsku sliku.

2

Rezultati i zapažanja

Skicirajte mikroskopsku sliku u dnevnik vježbi.

Navedite koje ste praživotinje identificirali. Opišite građu algi.

Zadatak 2.

Pripremite preparat viseću kap kulture Saccharomyces cerevisiae.

Materijal: predmetnica s udubljenjem, pokrovnica, suspenzija kuture Saccharomyces

cerevisiae, parafinski vazelin, mikroskop.

Postupak

1. Sterilizirajte predmetnicu na plamenu špiritusne lampe.

2. Rubove udubljenja predmetnice premažite parafinskim vazelinom.

3. Na sredinu pokrovnice stavite kapljicu kulture Saccharomyces cerevisiae.

4. Predmetnicu preokrenite i laganim je pritiskom prilijepite za pokrovnicu.

5. Preokrenite predmetnicu s prilijepljenom pokrovnicom tako da kap suspenzije

Saccharomyces cerevisiae na njoj slobodno visi.

6. Pronađite mikroskopsku sliku.


Skicirajte mikroskopsku sliku u dnevnik vježbi.

Opišite morfološku građu Saccharomyces cerevisiae

3

2. Boje i postupci bojenja

Promatranje živih mikroorganizama svjetlosnim mikroskopom može biti otežano jer

su stanice mikroorganizama propusne za svjetlo i praktički bezbojne, a da bi ih mogli

istraživati svjetlosnim mikroskopom možemo se koristiti bojenjem. Bojenje je

najjednostavniji način pri čemu mikroorganizmi tj. njihova unutrašnja građa postaju vidljivi.

Primjena boja omogućava nam proučavanje oblika i građe bakterija. Sve boje koje se koriste

možemo podijeliti na prirodne i umjetne. U prirodne boje ubrajaju se ekstrakti biljaka i

životinja. Najpoznatiji su karmin (crvena boja) dobivena iz lisnih ušiju, lakmus (plava boja)

ekstrakt je iz lišajeva rodova Roccella i Lecanora i safranin iz biljke šafrana (Crocus sativus).

Umjetne boje mogu se podijeliti u kisele, lužnate i neutralne. Kisele boje imaju negativan

naboj pa ne mogu obojiti veći broj bakterija koje također imaju negativan naboj. Ove boje

pokazuju veći afinitet prema citoplazmi bakterija, a u njih ubrajamo eozin (crvena boja),

kiseli fuksin (crvena boja) i nigrozin (crna boja). Lužnate boje imaju pozitivan naboj i bolje

boje bakterijske nukleinske kiseline te druge komponente koje nose negativan naboj, a to su

metilensko modrilo (plava boja), kristal-violet (ljubičasta boja), genciana-violet (ljubičasto-

-plava boja), bazični fuksin (crvena boja). Neutralne boje nastaju reakcijom kiselina i baza

(npr. neutralno crvenilo).

Razlikujemo jednostavna i složena (diferencijalna bojenja). U jednostavnom bojenju

upotrebljava se samo jedna boja pa se svi mikroorganizmi koji je primaju oboje podjednako.

U složenom bojenju upotrebljava se nekoliko boja koje se mogu pomiješati i istodobno

nanijeti na preparat pa takva bojenja nazivamo složeno-simultanim. Boje se mogu nanositi

postupno jedna za drugom pa takva bojenja zovemo složeno-sukcesivnim. Pri nanošenju

nekoliko boja na preparat dijelovi se stanica različito oboje.

Zadatak

U jednostavno obojenom preparatu odredite oblik bakterija izdvojenih s materijala oko zuba.

Materijal: predmetnica, materijal s i oko zuba, čačkalica, špiritusna lampa, fuksin, filter papir,

staničevina, bočica s imerzionim uljem, alkohol, mikroskop.

Postupak

1. Predmetnicu obrišite staničevinom.

2. Sterilizirajte predmetnicu na plamenu (obje strane).

3. Stavite kap vode na predmetnicu.

4. Čačkalicom uzmite malo materijala s i oko zuba koji treba unijeti u kapljicu vode, dobro

homogenizirajte i napraviti razmaz promjera 1 cm.

5. Preparat osušite opreznim mahanjem predmetnice kroz zrak dok voda potpuno ne ispari.

Predmetnica se ne smije zagrijavati jer bi se uslijed povećane temperature izmijenio

sastav bjelančevina, struktura i oblik stanice.

4

6. Fiksirajte tako da predmetnicu s razmazom, koji je okrenut prema gore, prihvatite po

sredini i smjestite ju iznad plamena.

7. Preko fiksiranog preparata prelijte otopinu bazičnog fuksina (1-2 minute).

8. Isperite mlazom vode dok voda ne postane čista.

9. Preparat posušite u filtar-papiru lagano pritiskajući po površini predmetnice tako da

filtar-papir upije suvišnu vodu.

10. Mikroskopirajte objektivom uljne imerzije (vlažni objektiv). Na sredinu preparata

nanesite kap imerzionog ulja a potom gledajući sa strane uronite objektiv u ulje,

mikrovijkom izoštrite vidno polje.


Skicirajte sliku u dnevnik vježbi!

Koje oblike bakterija prepoznajete?

5

3. Gramovo bojenje

Gramovo je bojenje najvažnije složeno sukcesivno bojenje u bakteriologiji. Osnove

bojanja prvi je opisao danski liječnik Hans Christian Gram 1884 godine. Postupak Gramovog

bojenja čine četiri koraka:

1. U prvom koraku koristi se primarna boja (genciana-violet). Nakon bojanja gencianom-

-violet sve se stanice oboje ljubičasto-plavo.

2. Tretiranjem lugol-om (otopina joda u kalij-jodidu) intenzivira se primarna boja i pri čemu

su i dalje sve stanice obojane ljubičasto-plavo.

3. Ispiranjem alkoholom jedna skupina bakterija zadržava primljenu (ljubičasto-plavu) boju

dok druga skupina bakterija nakon ispiranja alkoholom otpušta primljenu boju.

4. Bojenjem fuksinom (kontrastna boja), skupina bakterija koje su se odbojile primaju ovu

boju (crvenu) i to su Gram-negativne bakterije. Skupina bakterija koja je primila ljubičasto-

-plavu boju i dalje ostaje obojena tom bojom i to su Gram-pozitivne bakterije.

Ova je osobina stalna i vezana je uz kemijski sastav bakterija i koristi se u njihovoj klasifikaciji.

Gram–pozitivne i Gram-negativne bakterije razlikuju se u građi stanične stijenke pa se

različito odnose prema bojama. Osnovni je kemijski spoj stanične stijenke bakterija

peptidoglikan murein koji staničnoj stijenci daje čvrstoću. Murein je makromolekula koja se

sastoji od lanaca N-acetilglukozamina i N-acetilmuraminske kiseline međusobno povezanih

1,4-glikozidnom vezom. Gram-pozitivne bakterije sadrže nekoliko slojeva peptidoglikana dok

Gram-negativne bakterije također sadrži peptidoglikan, ali u vrlo maloj količini u

periplazmatskom prostoru (između citoplazmatske membrane i vanjske membrane). Neke

vrste bakterija ne mogu se na osnovu Gramovog bojenja uvrstiti niti u jednu od tih skupina

jer se slabo oboje ili se ne mogu obojiti pa ih nazivamo Gram neosjetljivim bakterijama.

Gram varijabilne bakterije pokazuju osobine i Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija.

Na rezultate Gramovog bojenja može utjecati starost bakterijske kulture, sastav hranjive

podloge, debljina razmaza (predebeo razmaz neće primiti boju), trajanje pojedinih operacija

bojanja i sl.

Zadatak

Postupkom Gramovog bojenja odredite Gram-pozitivnu i Gram-negativnu bakteriju u

suspenziji.

Materijal: kompletan pribor za pripremanje fiksiranog preparata, suspenzija kultura

Escherichia coli i Bacillus mycoides, gencijana-violet, lugol, 96 % etanol, fuksin, pribor za

ispiranje, filtar-papir, imerziono ulje, mikroskop.

6

Postupak

1. Na plamenu špiritusne lampe sterilizirajte predmetnicu.

2. Na ohlađenu predmetnicu nanesite kapljicu suspenzije kultura Escherichia coli i Bacillus

mycoides.

3. Sterilnom mikrobiološkom ušicom razmažite kapljicu u krug promjera 1 cm.

4. Mikrobiološku ušicu sterilizirajte na plamenu te odložite.

5. Preparat sušite na zraku.

6. Potpuno suh preparat fiksirajte na plamenu špiritusne lampe.

7. Fiksirani preparat obojite gencijanom-violet u trajanju od 1 minute, isperite vodom.

8. Nanesite lugol u trajanju od 1 minute, isperite vodom.

9. Odbojite 95% etanolom (kap po kap), isperite vodom.

10. Dopunski obojite fuksinom u trajanju od 30 sekundi do 1 minute, isperite vodom.

11. Preparat posušite filtar-papirom, stavite kapljicu imerzionog ulja te mikroskopirajte

objektivom uljne imerzije.


Skicirajte sliku u dnevnik vježbi.

Navedite rezultat Gramovog bojenja ispitivanih bakterija.

7

4. Bojenje spora i kapsula kod bakterija

Neke vrste bakterija imaju sposobnost formiranja otpornih metaboličkih neaktivnih

stanica koje nazivamo bakterijske endospore, a proces njihova nastanka naziva se

sporulacija ili sporogeneza. Iniciranje sporulacije dolazi uslijed pomanjkanja hranjivih tvari (C

i N), pomanjkanja vode ili nagomilavanja štetnih produkata metabolizma. Spore su vrlo

otporne na visoke temperature, smrzavanje, zračenje, sušenje i kemijske agense. Spore se

biokemijski i fiziološki razlikuju od vegetativne stanice. Građene su od krajnjeg sloja spore ili

eksosporiuma, ovojnice, korteksa (koji sadrži peptidoglikane i štiti ovojnicu od djelovanja

litičkih enzima) i srži (koja sadrži DNK, ribosome, enzime i mali sadržaj vode što predstavlja

glavnu ulogu u uspavanosti spore i njenoj rezistenciji na različite agense). U povoljnim

ekološkim uvjetima spore u procesu germinacije mogu prijeći u vegetativnu stanicu. Prva

sinteza bazira se na vlastitim izvorima energije i dolazi do proizvodnje energetski bogatih

molekula (ATP/GTP), a potom sinteze novih enzima, nukleinskih kiselina i bjelančevina.

Budući da je spora jako otporna na kemijske spojeve teško se boji mikrobiološkim bojama.

Da bi spora prihvatila boju mora se fizikalno-kemijskim tretmanom utjecati na izmjenu

strukture opne, spora najprije nagriza raznim kiselinama (kloridnom, sumpornom ili

octenom), a zatim se zagrijava i boji.

Kapsula (čahura ili glikokaliks) želatinozni je vanjski sloj koji izlučuje stanica i koji je

pričvršćen na staničnu stijenku. Kemijski je građena je od polisaharida, glikoproteina ili

polipeptida. Funkcija kapsule zaštita je bakterijske stanice od mehaničkih povreda te od

djelovanja fagocita i bakteriofaga. Stanice koje posjeduju kapsulu općenito su virulentne i

sposobne izazivati bolesti (npr. Clostridium perfringens, Bacillus anthracis i dr. ).

Zadatak 1.

Obojite spore bakterije Bacillus mycoides.

Materijal: kultura Bacillus mycoides stara 4-5 dana, kompletan pribor za pripremanje

fiksiranog preparata, zasićena otopina KMnO4 u 5 % H2SO4, metilensko plavilo, pribor za

ispiranje preparata, filter-papir, imerziono ulje, mikroskop.

Postupak

1. Pripremite fiksirani preparat kulture Bacillus mycoides.

2. Fiksirani i ohlađeni preparat obojite zasićenom otopinom KMnO4 u 5 % H2SO4 u trajanju

od 3 minute uz zagrijavanje.

3. Boju s preparata isperite vodom.

4. Vlažan preparat dopunski obojite metilenskim plavilom u trajanju od 30 sekundi, boju

isperite vodom.

5. Preparat osušite filter papirom, stavite kapljicu imerzionog ulja na preparat i

mikroskopirajte objektivom uljne imerzije.

8



Označite na slici koji dijelovi predstavljaju sporu, a koji vegetativni dio stanice.

Zadatak 2.

Pronađite mikroskopsku sliku gotovog preparata Azotobacter chroococcum.



Označite na slici gdje se nalazi kapsula.

9

5. Mjerenje veličine mikroorganizama

Veličina mikroorganizama može se odrediti uz pomoć svjetlosnog mikroskopa. Za

mjerenja su potrebna okularni i objektni mikrometar. Okularni mikrometar okrugla je

staklena pločica na kojoj se nalazi skala s odjeljcima. Pri mjerenju mikroorganizama okularni

mikrometar stavlja se u okular mikroskopa tako da podjeljci budu okrenuti prema dolje.

Obično se koristi okularni mikrometar sa skalom od 5 mm koja je podijeljena na 50 jednakih

dijelova odnosno svaki dio iznosi 100 µm (0,1 mm). Skala okularnog mikrometra povećava se

samo pomoću okulara mikroskopa dok se veličina mikroorganizama povećava još i

povećanjem objektiva. Iz tog razloga koristimo faktor povećanja kojim se korigira ova razlika.

Za određivanje ovog faktora koristi se objektni mikrometar koji predstavlja staklenu pločicu

sa skalom na kojoj je 1 mm podijeljen na 100 dijelova što znači da je svaki podjeljak jednak

0,001mm tj. 10 m.

Objektni mikrometar stavlja se na stolčić mikroskopa i promatra se kao i preparat.

Okularni mikrometar stavlja se u okular s podjeljcima okrenutima prema dolje. U vidnom

polju potraži se i jedna i druga skala i podese se tako da međusobno budu u paralelnom

položaju. Nakon toga, približe se jedna drugoj na taj način da im se prvi podjeljci preklope a

potom se traži sljedeći podjeljak gdje se mikrometri preklapaju. Izbroje se podjeljci oba

mikrometra i izračunava se faktor povećanja pomoću formule: f = a × 10/b, pri čemu je f-

-faktor povećanja okularnog mikrometra (µm), a - broj podjeljaka objektne skale, b - broj

podjeljaka okularne skale. Npr. ako se jedan podjeljak objektnog mikrometra poklapa sa 12

podjeljaka okularnog mikrometra računa se 1 x 10/12 = 0,8 i to je faktor povećanja okularnog

mikrometra. Ovaj faktor označava razdaljinu od jednog do drugog podjeljka kod okularnog

mikrometra u mikronima za odgovarajući objektiv i okular. Za isti okular, a drugi objektiv biti

će to druga veličina. Ukoliko je uvećanje objektiva veće, koeficijent je manji i obrnuto.

Objektni mikrometar zatim zamijenimo s preparatom i mjerimo veličinu mikroorganizama

pomoću okularnog mikrometra. Potrebno je napraviti više mjerenja bakterijske stanice a

potom prosječnu duljinu stanica pomnožiti s koeficijentom kako bi dobili stvarnu veličinu

mikroorganizama.

Zadatak

U jednostavno obojenom preparatu odredite veličinu bakterija Bacillus mycoides i

Escherichia coli.

Materijal: kompletan pribor za pripremanje jednostavnog preparata, suspenzija kultura

Bacillus mycoides i Escherichia coli stara 24 h, fuksin, okularni mikrometar, mikroskop.

10

Postupak:

1. Pripremite jednostavno obojeni preparat suspenzije kultura Bacillus mycoides i

Escherichia coli.

2. U okular mikroskopa umetnite okularni mikrometar.

3. Preparat dovedite u paralelan položaj sa skalom okularnog mikrometra.

4. Izvršite 10 mjerenja za svaku bakteriju te izračunajte veličinu bakterija pomoću formule:

V = zbroj mjerenja / broj mjerenja *f.



Napišite koja je prosječna veličina svake istraživane bakterije.

11

6. Postupci sterilizacije

Osnovni je uvjet za mikrobiološki rad sterilnost. Sav pribor i hranjive podloge koje se

koriste za mikrobiološki rad moraju u trenutku upotrebe biti sterilne. Sterilizacija je postupak

kojim se uništavaju svi vegetativni i sporogeni mikroorganizmi. Postoji više fizikalnih i

fizikalno-kemijskih metoda pomoću kojih se obavlja postupak sterilizacije, a to su sterilizacija

toplinom, ozračivanjem, filtracijom i plinovima. 6.1. Sterilizacija toplinom

Toplina se može upotrijebiti kao suha i vlažna, a one se međusobno razlikuju po

načinu djelovanja.

Sterilizacija suhom toplinom

Suha toplina djeluje letalno na mikroorganizme denaturacijom njihovih bjelančevina i

oksidacijom (izgaranjem) organske tvari. Učinak suhe topline osniva se i na toksičnom

djelovanju povećane količine elektrolita u materijalu kao posljedica isparavanja vode. U

ovom obliku suha toplina podrazumijeva sterilizaciju žarenjem i sterilizaciju vrućim suhim

zrakom. Sterilizacija žarenjem primjenjuje se u laboratoriju pri sterilizaciji sitnijeg metalnog

mikrobiološkog pribora (mikrobiološka ušica). Na ovaj se način postiže uglavnom djelomična

sterilnost. Sterilizacija vrućim suhim zrakom izvodi se u suhom sterilizatoru - Pasteurovoj

peći. To je aparat u obliku ormarića dvostrukih stijenki između kojih se nalazi toplinski

izolator. Električna grijaća tijela spojena su s termostatom koji automatski uključuje i

isključuje struju i tako održava stalnu temperaturu u sterilizatoru. Sterilizacija se izvodi pri

temperaturi od 150 ˚C do 170 ˚C u trajanju od jednog do dva sata. Mogu se primijeniti i više

temperature pogotovo ako se sumnja da je materijal kontaminiran bakterijskim sporama.

Suhi sterilizatori primjenjuju se za sterilizaciju metalnog pribora, praznog i čistog staklenog

posuđa i drugog pribora otpornog na ovakve temperature. Sterilizacijom na ovaj način

postiže se potpuna sterilnost, uništavaju se svi vegetativni oblici i spore.

Sterilizacija vlažnom toplinom

Štetno djelovanje vlažne topline na mikroorganizme sastoji se u denaturaciji i

koagulaciji bjelančevina i pucanju stanične stijenke mikroorganizama. Vlažna toplina

djelotvornija je od suhe jer omogućuje ravnomjernije i brže zagrijavanje materijala. Ovaj

način sterilizacije obuhvaća primjenu vodene pare pod tlakom. Sterilizacija vodenom parom

pod tlakom najsigurniji je način sterilizacije toplinom. Ako se ispravno provede tada ugibaju

sve vrste mikroorganizama (vegetativni oblici i spore). Ovaj način sterilizacije provodi se u

autoklavu. Autoklav ima dvostruke stijenke koje podnose visoki tlak i teški poklopac kojim se

može hermetički zatvoriti. Sterilizacija u autoklavu traje od 15 minuta do jedan sat i nadtlaku

12

od jednog do dva bara. Većina hranjivih podloga i kemikalija te predmeti od gume, porculana

i običnog stakla steriliziraju se 15 do 30 minuta pri 120 ˚C i nadtlaku od jednog bara. 6.2. Sterilizacija zračenjem

Ionizirajuće zrake (β i γ zrake) imaju izrazito baktericidno djelovanje. Na ovaj način

dolazi do prekida sinteze DNK što uzrokuje oštećenje i ugibanje mikroorganizama. Koristi se

za sterilizaciju predmeta za jednokratnu promjenu (brizgalice za injekcije, igle, kateteri,

implantati i sl.) 6.3. Sterilizacija filtracijom

Filtracijom se steriliziraju tekućine (otopine) koje ne podnose sterilizaciju toplinom ili

nekim drugim načinom. Na ovaj se način mikroorganizmi mehanički uklanjaju iz tekućine.

Tekućina se protiskuje pod tlakom u aseptičnim uvjetima kroz specijalne filtre od azbestnih

vlakana (Seitzovi filtri), biološki inertnih estera celuloze (membranski filtri) i drugih koji imaju

toliko sitne pore da propuštaju hranjivu otopinu, a zadržavaju bakterije. Ovaj način

sterilizacije naročito je pogodan za hranjive podloge koje sadrže šećer, vitamine i druge

materijale koji se pri tome ne mijenjaju. Sterilizacija bakteriološkom filtracijom nije uvijek

sigurna jer se može dogoditi da kroz filtar prođu bakteriofagi koji su mnogo sitniji od

bakterija. 6.4. Sterilizacija plinovima

Materijali osjetljivi na visoke temperature, poput gumenih i plastičnih predmeta,

mogu se sterilizirati hladnim postupkom tj. primjenom plinova etilen-oksida i formaldehida

uz povišenu temperaturu. Oba su plina izrazito toksična, kancerogena i mutagena te je

njihova primjena ograničena kada se materijal ne može sterilizirati toplinom ili ozračivanjem.

Nadzor sterilizacije provodi se fizikalnim, kemijskim i biološkim postupcima. Fizikalni

postupci obuhvaćaju mjerenje temperature, tlaka, vremena sterilizacije. Kemijski obuhvaćaju

primjenu kemijskih indikatora koji promjenom boje ukazuju na pravilno provedenu

sterilizaciju. Biološki postupci obuhvaćaju primjenu spora bakterija koje mogu preživjeti

izloženost visokim temperaturama.

Suzbijanje mikrobnog rasta također obuhvaća i proces dezinfekcije, a to je postupak

kojim se smanjuje broj vegetativnih oblika mikroorganizama, ali ne obavezno i spora.

Dezinfekcija se provodi mehaničkim, fizikalnim i kemijskim postupcima.

Mehanički postupci obuhvaćaju čišćenje i pranje s površine predmeta.

Fizikalni postupci obuhvaćaju primjenu vlažne topline primjenom vruće vode tj.

predmeti se drže u vodi koja ključa (100˚C) najmanje pola sata. U kipućoj vodi većina

13

mikroorganizama ugiba za nekoliko sekundi. Pojedini virusi i spore gljivica uginu za 15-20

minuta. Spore pojedinih vrsta klostridija mogu preživjeti kuhanje i u trajanju od nekoliko sati.

Potom ultraljubičaste zrake oštećuju i inhibiraju sinteze mikrobne nukleinske kiseline koja ih

lako apsorbira, a primjenjuju se za smanjivanje broja mikroorganizama u zraku zatvorenih

prostora (operacione dvorane i laboratoriji). Povišenje hidrostatskog i osmotskog tlaka kao i

ultrazvučni valovi visokih frekvencija mogu mehanički oštetiti mikroorganizme u toj mjeri da

oni ugibaju. Potom, u fizikalne postupke ubraja se i pasterizacija koja se provodi na

temperaturama nižim od 100 °C pri čemu su vegetativni oblici mikroorganizama uništeni, ali

ne i spore bakterija i termorezistentniji mikroorganizmi. Djelotvornost pasterizacije može se

povećati postupkom tindalizacije – trokratne pasterizacije u razmaku od 24 h.

Kemijski postupci dezinfekcije obuhvaćaju primjenu kemijskih sredstava (kiselina,

lužina, alkohola, aldehida, fenola i halogenih elemenata).

Zadatak

Pripremite i sterilizirajte gotovu krutu hranjivu podlogu.

Materijal: hranjiva podloga, tikvica, pH-metar, autoklav.

Postupak

1. Prema uputama na etiketi hranjive podloge potrebno je pripremiti 500 ml hranjivog

agara.

2. U 1 l Erlenmeyerovu tikvicu uspite 1/3 potrebne vode.

3. Izvažite potrebnu količinu podloge i prenesite ju u tikvicu i dobro promiješajte.

4. Dodajte ostatak vode i isperite stijenke tikvice.

5. Namjestite pH uz pomoću 10 % HCl ili NaOH.

6. Sterilizirajte u autoklavu na 121 °C 15 minuta (ovaj će korak odraditi voditelj vježbi).

7. Koristite fizikalne i kemijske postupke nadzora sterilizacije.

8. U aseptičnim uvjetima razlijte podlogu u sterilne Petrijeve zdjelice, ohladite i pohranite

na odgovarajući način.

Zapažanja

Navedite zapažanja o radu autoklava. Navedite rezultate kontrole nadzora sterilizacije.

14

7. Uzgoj mikroorganizama

Uzgoj mikroorganizama u laboratorijskim uvjetima obuhvaća procese rasta, razvoja,

razmnožavanja i obavljanje ostalih životnih funkcija mikroorganizama izvan njihove prirodne

sredine u umjetno stvorenim uvjetima. Za uzgoj mikroorganizama potrebno je osigurati

hranjive sastojke, stalnu i optimalnu temperaturu, odgovarajuću reakciju sredine i aerobne

odnosno anaerobne uvjete. Svaka hranjiva podloga koja se upotrebljava za uzgoj

mikroorganizama mora sadržavati sve spojeve i elemente koji su neophodni za život

mikroorganizama (bjelančevine, ugljikohidrate, vitamine, purine, pirimidine i druge organske

spojeve kako bi zadovoljila metaboličke potrebe mikroorganizama te anorganske spojeve tj.

mineralne soli, elemente u tragovima i vodu). Hranjiva podloga u trenutku upotrebe mora

biti sterilna. Prema podrijetlu hranjive podloge mogu biti prirodne, sintetičke i

polusintetičke.

Prirodne hranjive podloge sadržavaju tvari biljnog i životinjskog podrijetla (plodovi

voća, povrća, sok zrelog voća, sok svježih zelenih dijelova biljaka, meso, mlijeko, krvni serum,

krv i dr.).

Sintetičke hranjive podloge sadrže kemijske spojeve koji su točno uravnoteženi.

Polusintetičke hranjive podloge čine kombinaciju prirodnih i sintetičkih hranjivih

podloga.

Hranjive podloge mogu biti organske i mineralne, a mogu se pripravljati u obliku

tekućih, polukrutih i krutih podloga.

Prema sastavu hranjive podloge mogu biti: podloge za izdvajanje mikroorganizama iz

materijala koje sadrže mnoge hranjive tvari jer im je namjena omogućiti rast i

razmnožavanje različitih mikroorganizama; selektivne podloge koje omogućuju rast nekih

mikroorganizama dok inhibiraju rast ostalih; diferencijalne podloge koje sadržavaju

indikatore uz pomoć kojih je omogućeno razlikovanje jedne bakterijske vrste od druge vrste;

podloge za određivanje biokemijskih svojstava koje sadrže tvari (bjelančevine, ugljikohidrate,

amide, masti, aminokiseline) kako bi se omogućila njihova eventualna razgradnja uz pomoć

prisutnih specifičnih enzima; podloge za posebne namjene pomoću kojih se dokazuje

osjetljivost bakterija prema antibakterijskim lijekovima i dr.

Tehnike precjepljivanja mikroorganizama

Precjepljivanje mikroorganizama na krute hranjive podloge može biti:

a) na kosi agar

Postupak:

1. U lijevu ruku uzmite epruvetu s kulturom razvijenom na kosoj hranjivoj podlozi.

2. U desnu ruku uzmite mikrobiološku ušicu te ju sterilizirajte u plamenu špiritusne

lampe.

15

3. Malim prstom desne ruke skinite čep s epruvete, otvor epruvete sterilizirajte u

plamenu.

4. Sterilnu mikrobiološku ušicu unesite u epruvetu, ohladite lagano ju pritiskajući o

stijenku epruvete, zahvatite kulturu i izvucite ušicu iz epruvete, sterilizirajte otvor

epruvete i čep, epruvetu začepite i odložite.

5. U lijevu ruku uzmite epruvetu sa sterilnom kosom hranjivom podlogom.

6. Malim prstom desne ruke skinite čep epruvete, a otvor epruvete sterilizirajte u

plamenu.

7. Mikrobiološkom ušicom zahvaćenu kulturu unesite u epruvetu do dna kosine kosog

agara te izvlačeći ušicu u potezu nacijepite kulturu na površinu kosog agara.

8. Sterilizirajte u plamenu otvor epruvete i čep, začepite epruvetu i odložite ju.

9. Sterilizirajte mikrobiološku ušicu u plamenu.

b) u duboki agar

Postupak:

1. Mikroorganizme u duboki agar precjepljujemo ubodom u sredinu dubokog agara.

c) na agarnu ploču Na agarnu ploču mikroorganizme nacjepljujemo mikrobiološkom ušicom ili pipetom.

Postupak:

1. Mikrobiološkom ušicom zahvatite kulturu i nacijepite ju na površinu agarne ploče

u potezima npr. cik-cak (metoda zasijavanja potezom, eng. streak plate).

2. Pipetom zahvaćeni inokulum (mikroorganizmi u sterilnoj fiziološkoj otopini)

ispustite na površinu agarne ploče te razmažite inokulum sa sterilnim staklenim

štapićem. Precjepljivanje mikroorganizama u tekuću hranjivu podlogu

Postupak:

1. Mikrobiološkom ušicom zahvatite kulturu, unesite u epruvetu s tekućom

hranjivom podlogom, dodirujući stijenke epruvete nastojte skinuti sav materijal.

2. Pipetom zahvaćeni inokulum ispustite u epruvetu s tekućom hranjivom

podlogom.

16

Metode za određivanje broja mikroorganizama

Dvije su osnovne grupe metoda za određivanje broja mikroorganizam u nekom

materijalu. To su neposredne i posredne metode. Neposredne metode uključuju direktno

brojanje stanica (živih i mrtvih) pod mikroskopom uz pomoć komorica određenog volumena

(Petroff-Hauserova, Thoma, Bűrker-Tűrck i dr.). Kod posredne metode uzorak u kojemu

želimo odrediti broj mikroorganizam nacjepljuje se na hranjive podloge (krute ili tekuće) a

potom se određuje broj poraslih kolonija ili se ocjenjuje zamućenje podloge. Ovaj postupak

obuhvaća više metoda:

1. Kochova metoda agarnih ploča obuhvaća brojanje kolonija na agarnoj ploči. Na ovaj se

način određuje broj živih aerobnih, mikroorganizama. Izražava se u CFU (eng. colony

forming units) jedinicama pri čemu je CFU = broj kolonija/volumen uzorka *recipročna

vrijednost decimalnog razrjeđenja. Nacjepljivanje uzorka na agarnu ploču moguće je

napraviti na sljedeće načine:

a) razmazivanjem uzorka po površini agara uz pomoću staklenog štapića savinutog pod

kutom od 90° (eng. spread plate)

b) prelijevanjem otopljenog agara preko uzorka (eng. pour plate).

2. MPN metoda (eng. Most Probable Number) služi za određivanje najvjerojatnijeg broja

bakterija. Ovo je statistička metoda zasnovana na teoriji vjerojatnosti.

3. Turbidimetrijska metoda u kojoj se broj mikroorganizama određuje usporedbom

izmjerene optičke gustoće bakterijske suspenzije sa standardnom krivuljom.

Uzgoj anaerobnih mikroorganizama

Anaerobni mikroorganizmi koriste kisik u vezanom obliku. Prisustvo minimalne količine kisika

onemogućava im rast i razvoj. Za uzgoj anaeroba potrebno je iz podloge odstraniti sav kisik, a

to se može postići na slijedeće načine: 1. Fizikalnim metodama:

a) Zagrijavanjem. Podlogu u kojoj želimo uzgojiti anaerobne mikroorganizme

zagrijavamo do ključanja. Ovim načinom iz podloge izlazi zrak, a time i slobodan O2.

Podlogu zatim ohladimo na 50 °C, a potom nacijepimo bakterijsku kulturu.

b) Vakuumom. Iz aparata (termostat, McIntosh posuda, vakuum eksikator) u kojima

uzgajamo anaerobne mikroorganizme, vakuum-pumpom izdvajamo zrak, a time i

slobodan kisik.

17

c) Zamjenom zraka inertnim plinom. Iz aparata u kojem uzgajamo anaerobne

mikroorganizme vakuum-pumpom izvučemo zrak a zatim ubacimo inertni plin npr.

N2, H2, CO2, helij (anaerobna komora). 2. Kemijskim metodama

U aparatu ili u epruveti izazovemo kemijsku reakciju između pirogalola i NaOH koja će

potrošiti slobodan O2. Može se koristiti i GasPak sustav koji predstavlja posudu iz koje se

kisik uklanja uz pomoć paketića koji sadrži s NaBH4 i NaHCO3 koji se navlaže s nekoliko

mililitara vode i potom se komora hermetički zatvori. U reakciji ovih tvari stvara se vodik i

ugljik-dioksid. Katalizator (paladij) veže zaostali kisik i vodik u komori pri čemu se u

kratkom vremenu stvaraju uvjeti za uzgoj anaeroba.

3. Kombinacijom fizikalne i kemijske metode

U aparat za uzgoj anaerobnih mikroorganizama stavimo anaerobne kulture

nacijepljene na odgovarajuće hranjive podloge te vakuum-pumpom izvučemo zrak. Poslije

toga izazovemo kemijsku reakciju između pirogalola i NaOH koja će vezati zaostali O2

4. Biološkom metodom

Ova se metoda bazira na metabiozi između aerobnih i anaerobnih mikroorganizama.

Kod ove metode koristimo Fortnerovu zdjelicu s dva polja. U jedno polje ulijemo hranjivu

podlogu za uzgoj aerobnih bakterija, a u drugu za uzgoj anaerobnih bakterija. Nacijepimo

aerobnom tj. anaerobnom kulturom te rubove Fortnerove zdjelice zalijemo parafinom.

Pod optimalnom temperaturom prvo se razviju aerobne bakterije koje troše O2 i stvaraju

uvjet za razvoj anaerobnih bakterija.

5. Smanjivanjem redoks potencijala

Anaerobne mikroorganizme nacjepljujemo na hranjive podloge u koje smo prije

sterilizacije dodali tvari koje imaju veliku redukcijsku sposobnost (smanjuju

oksidoredukcijski potencijal) npr. natrij-tioglikolat, cistein koji kemijski veže sav O2 iz

hranjive podloge. U podlogu se stavlja i indikator (resazurin) koji u prisustvu kisika mijenja

boju podloge u ružičastu boju. Kulture potom uzgajamo u aparatima.

Zadatak 1.

Određivanje mikroflore zraka Kochovom metodom.

Materijal: hranjivi agar u Petrijevim zdjelicama.

Postupak

1. Otvorite Petrijevu zdjelicu u kojoj se nalazi čvrsta hranjiva podloga u trajanju od 5

minuta. Mikroorganizmi koji se nalaze u stupcu zraka iznad zdjelice past će na podlogu.

18

2. Stavite na inkubaciju u termostat na 28 °C.

Zadatak 2.

Određivanje mikroorganizama s prstiju i jezika.

Materijal: hranjivi agar u Petrijevim zdjelicama.

Postupak

1. Otvorite Petrijevu zdjelicu u kojoj se nalazi čvrsta hranjiva podloga i ostavite otisak

prstiju.

2. Dezinficirajte ruke i ponovno nanesite otisak prstiju.

3. Otvorite novu sterilnu Petrijevu zdjelicu i na površinu podloge ostavite otisak jezika.

4. Stavite na inkubaciju u termostat na 37 °C.

19

8. Izdvajanje mikroorganizama u čiste kulture

Pod čistom kulturom podrazumijevamo kulturu nastalu razmnožavanjem jedne

stanice koja je na neki način izdvojena u sterilnu hranjivu sredinu. Metode izdvajanja

mikroorganizama u čiste kulture su: 1. Metoda razrjeđivanja (dilucije)

Kod ove metode uzorak tj. mikroorganizme razrjeđujemo kroz niz epruveta sa

sterilnom fiziološkom otopinom da bi se mikroorganizmi prostorno odvojili. Metodu

koristimo uz krute hranjive podloge i zovemo je Kochovom metodom agarnih ploča. 2. Metoda iscrpljivanja

Mikrobiološkom ušicom zahvaćen materijal iscrpljujemo kroz niz agarnih ploča da

bismo dobili prostorno razdvojene kolonije koji predstavljaju čistu kulturu.

3. Lindnerova metoda

Ovu metodu koristimo za izolaciju krupnijih mikroorganizama (kvasci, plijesni).

Metoda se bazira na preparatu viseće kapi. Iz razrijeđenog uzorka napravi se preparat viseće

kapi. Pregleda se mikroskopom i ukoliko se u preparatu nalazi samo jedna stanica presije se

na sterilnu hranjivu podlogu. 4. Metoda pomoću mikromanipulatora

Mikromanipulator dodatak je mikroskopu koji se sastoji od osjetljivih mikrovijaka

kojima pokrećemo mikropipete mikromanipulatora. Iz vlažnog preparata pomicanjem

mikrovijaka, gledajući kroz okular mikroskopa, mikropipete usmjeravamo prema odabranim

stanicama. Stanice usišemo u mikropipetu te prenesemo na hranjivu podlogu.

5. Uzgoj na selektivnim podlogama pogodnim za rast određene vrste mikroorganizma koju

želimo izolirati. Održavanje i čuvanje čistih kultura mikroorganizama

Čiste kulture mikroorganizama mogu se čuvati na hranjivim podlogama koje su

pohranjene na temperaturi od 4 °C kroz kraće vrijeme (30 dana) jer se iscrpljuju sastojci

hranjive podloge, gubi se voda iz hranjive podloge, mijenja se pH podloge i nakupljaju se

toksični proizvodi mikrobnog metabolizma. Mikrobne kulture se mogu čuvati kroz duži

period ako se prirede na odgovarajući način:

20

1. Održavanje mikrobne kulture na krutim hranjivim podlogama (na kosom agaru) s

parafiniranim čepom pri 4 °C pri čemu se životna aktivnost kultura svodi na minimum,

Vrijeme između dva presijavanja može biti i više mjeseci.

2. Održavanje mikrobne kulture u ampuli ili epruveti sa sterilnim pijeskom ili zemljom (ili

zrnom žitarica).

3. Postupkom smrzavanja na -20 do -40 °C mikrobne se kulture, koje se nalaze u otopini ,

mogu čuvati do jedne godine odnosno i više godina ako su pohranjene pri -80 °C.

4. Postupkom liofilizacije mikrobna se kultura može čuvati i više godina. Ovaj postupak

podrazumijeva sušenje mikrobne kulture u vakuumu pri temperaturi od -78 °C u

liofilizatorima. Isušene kulture stavljaju se u staklene ampule iz kojih je potpuno izvučen

zrak.

Zadatak 1.

Pregled materijala s prošle vježbe.

Prema Omeljanskovoj formuli na površini od 100 cm2 za 5 minuta talože se mikroorganizmi

koji se nalaze u 10 l zraka. Aerokontaminacija se računa u broju mikroorganizama/m3 zraka.

Napišite zapažanja koja ste primijetili u Petrijevim zdjelicama s otiskom nečistog i čistog prsta

i otiskom jezika.


Navedite vaša zapažanja i zaključke!

Zadatak 2.

Pripremite čistu kulturu bakterijske kolonije iz Petrijeve zdjelice s aerokontaminacijom.

Materijal: mikrobiološka ušica, špiritusna lampa

Postupak

1. U desnu ruku uzmite mikrobiološku ušicu i držeći je uspravno unesite ju u plamen

špiritusne lampe tako da se žica užari, a ostali dio ušice provucite 2-3 puta kroz plamen.

2. Malo podignite poklopac Petrijeve zdjelice, a mikrobiološku ušicu ohladite prislonivši ju

na površinu podloge gdje nema izraslih kolonija.

3. Ušicom zahvatite malo bakterijske kulture koja je izdvojena od ostalih kolonija.

4. Malim prstom desne ruke skinite čep s epruvete.

5. Mikrobiološkom ušicom unesite kulturu do dna epruvete i povucite jedan cik-cak potez

po kosoj površini agara.

6. Otvor i čep epruvete sterilizirajte u plamenu.

7. Sterilizirajte mikrobiološku ušicu.

8. Na epruvetu napišite ime i prezime i grupu.

9. Epruvete stavite na inkubaciju u termostat na odgovarajuću temperaturu.

21

9. Determinacija bakterija

Determinacija tj. identifikacija mikroorganizama podrazumijeva određivanje roda i

vrste ispitivanjem morfoloških, odgajivačkih, biokemijskih i imunoloških osobina.

U morfološke se osobine ubraja oblik, veličina, bojenje po Gramu, stvaranje endospora,

stvaranje kapsula, pokretljivost i dr.

Odgajivačke se osobine opisuju kao izgled kolonije na agarnoj ploči (oblik, površina, rub,

prozračnost, boja, konzistencija kolonije i dr.), porast na kosom agaru, odnos prema

temperaturi, reakciji sredine, kisiku i dr.

Biokemijskim osobinama dokazujemo sposobnost razgradnje određenih kemijskih spojeva.

Ove se osobine dokazuju tako što se u hranjivu podlogu dodaje tvar (supstrat) na koju djeluje

neki enzim čiju prisutnost dokazujemo. U podlogu se također dodaje i indikator (koji mijenja

boju promjenom pH) kojim dokazujemo razgradnju supstrata ili prisutnost određenog

metabolita koji nastaje zbog djelovanja bakterijskog enzima na supstrat.

Imunološkim osobinama utvrđujemo antigene osobine i serološke specifičnosti.

Primjeri pojedinih biokemijskih postupaka u identifikaciji bakterija:

1. Katalaza test

Ovim testom se identificiraju mikroorganizmi koji imaju sposobnost razgradnje vodikovog

peroksida (na vodu i kisik) uz pomoć enzima katalaze. Bakterije koje posjeduju ovaj enzim su

obično aerobne ili fakultativno anaerobne. Dodatak 3% vodikovog peroksida u uzorak, a pri

čemu dolazi do stvaranja mjehurića kisika indikacija je pozitivne reakcije. 2. Oksidaza test

Enzim citokrom oksidaza katalizira prijenos elektrona od citokroma c do molekularnog kisika.

Oksidaznu aktivnost pokazuju aerobne i neke fakultativno anaerobne bakterije. Sposobnost

bakterija da proizvode citokrom oksidazu određuje se pomoću reagensa (p-

aminodimetilanilin oksalata) koji služi kao donor elektrona pri čemu mijenja boju iz ružičaste

u crnu što predstavlja pozitivnu reakciju. 3. Fermentacija ugljikohidrata

Određivanje sposobnosti mikroorganizama da razgrade i fermentiraju ugljikohidrate i pri

tome proizvode kiselinu ili kiselinu i plin. Enzimska razgradnja dovodi do stvaranja kiselih

produkata pri čemu indikator koji se nalazi u podlozi mijenja boju zbog promjene pH. Neke

bakterije pri razgradnji ugljikohidrata osim kiseline tvore i plinove (CO2 i H2). Sposobnost

tvorbe plinova dokazuje se uz pomoć Durhamove epruvetice koja se postavlja u obrnutom

položaju pod površinu tekuće podloge, plin se nakuplja u epruvetici i iz nje istiskuje podlogu.

22

Zadatak 1.

Pripremite jednostavno obojen preparat iz čiste kulture (iz aerokontaminacije zraka).

Identificirajte morfološke osobine i opišite porast kolonije na kosom agaru.

Materijal: kosi agar iz prethodne vježbe, materijal za Gramovo bojenje, špiritusna lampa,

mikroskop.

Postupak

1. Preparat obojite Gramovim bojenjem.

2. Mikroskopirajte imerzionim objektivom.

3. Nacrtajte.


Zadatak 2.

Katalaza-test

Materijal: kosi agar iz prethodne vježbe, 3% H2O2, predmetnica, špiritusna lampa.

Postupak

1. U sterilnim uvjetima prenesite poraslu kulturu na površinu predmetnice i dodajte kapljicu

3% H2O2.

2. Stvaranje mjehurića indikacija je pozitivnog testa.


Zadatak 3.

Oksidaza-test.

Materijal: Petrijeva zdjelica s test-mikroorganizmima, reagens.

Postupak

1. Nanesite nekoliko kapi reagensa na površinu bakterijske kolonije.

2. Promjena boje u tamno-ljubičasto indikacija je pozitivnog testa, a ukoliko ne dođe do

promjene boje test je negativan.

23


Zadatak 4.

Utvrdite fermentaciju ugljikohidrata.

Materijal: kosi agar iz prethodne vježbe, epruveta s ALPV (andrade laktoza peptonska voda)

tekućom podlogom, sterilna pipeta od 1 ml, špiritusna lampa.

Postupak

1. Sterilnom mikrobiološkom ušicom zahvatite malo bakterijskog materijala s kosog

agara i prenesite u epruvetu s fiziološkom otopinom, suspendirajte.

2. Pipetom prebacite 1 ml suspenzije u epruvetu s ALPV tekućom podlogom.

3. Inkubirajte 48 h pri 37 oC.


24

10. Opće osobine i predstavnici gljiva

Gljive obuhvaćaju kvasce, plijesni i mesnate gljive. Plijesni su velika skupina gljiva

nitaste građe a niti (hife) rastu kao isprepletena masa koja se naziva micelij. Djelomično se

plijesni klasificiraju i identificiraju i prema tome jesu li im hife septirane (pregrađene) ili nisu.

Septirane su hife poprečno pregrađene nitima nazvanim septa koje hifu pregrađuju u

pojedinačne stanične dijelove. Najveći je broj hifa vegetativan, one aktivno rastu i oblikuju

tijelo plijesni u koloniju. Zračne hife na ostalim dijelovima nose strukture za razmnožavanje.

Na tvorevinama za razmnožavanje koje se nalaze na kraju zračne hife izrastaju posebne

stanice nazvane spore od kojih svaka može stvoriti novu koloniju plijesni u povoljnim

okolišnim uvjetima. Spore se proizvode u velikom broju, lagano se šire, mnoge su otporne na

uvjete pri kojima se uništavaju vegetativne stanice. Plijesni mogu tvoriti i spolne i nespolne

spore. Kvasci se prema morfologiji potpuno razlikuju od ostalih gljiva. To su su nemicelijske,

jednostanične gljive koje imaju tipičan kuglast ili jajolik oblik. Osnovni tip stanice na koji

uvijek nailazimo jest blastospora koja se razmnožava nespolnim načinom - pupanjem.

Zadatak 1.

Očitavanje rezultata i zapažanja iz prethodne vježbe.

Zadatak 2.

Pripremite i mikroskopirajte nativni preparat plijesni.

Materijal: špiritusna lampa, pinceta, mikrobiološke igle, predmetno i pokrovno stakalce,

kulture plijesni, destilirana voda, mikroskop, zaštitna maska.

Postupak

1. Stavite zaštitnu masku na lice.

2. Na dobro očišćenu predmetnicu stavite kap destilirane vode.

3. Uz upaljeni plamenik uzmite Petrijevu zdjelicu s poraslom plijesni i pažljivo otvorite

poklopac samo onoliko koliko je potrebno da pomoću sterilne pincete uzmete dio

micelija plijesni s čvrste hranjive podloge i odmah zatvorite Petrijevu zdjelicu.

4. Pažljivo prenesite uzorak micelija plijesni u kapljicu vode na predmetnici te s dvije,

prethodno u plamenu sterilizirane mikrobiološke igle, razvucite micelij u što tanjem sloju,

a potom igle ponovno sterilizirajte u plamenu i odložite.

5. Predmetnicu poklopite pokrovnicom, a potom lagano pritisnite pokrovno stakalce da se

micelij još više razvuče ispod pokrovnice.

6. Preparat stavite na stolić mikroskopa i mikroskopirajte .

7. Nacrtajte mikroskopske slike, uz njih napišite ime mikroskopirane plijesni i ukupno

povećanje.

25


Carstvo: Fungi Razred: Zygomycetes 1. Rod Rhizopus sp.

Opće osobine: micelij raste vrlo brzo, tvoreći bijele odvojene kolonije. Zračni je micelij

pahuljast. Micelij je neseptiran, a iz njega se stvaraju sporangiospore koje završavaju s crnim

sporangijem. Veliki broj hifa (rizoida) prodire u supstrat (npr. kruh).

Nacrtajte. 2. Rod Mucor sp.

Opće osobine: kolonije nalikuju onima iz roda Rhizopus. Micelij je neseptiran i stvara

pojedinačne sporangiospore koje na kraju nose kugličastu mješinicu – sporangiji. Sporangij

izrasta na kolumeli kruškolikog oblika. Predstavnici ovog roda ne stvaraju rizoide. Spore su

jajolikog oblika. Nacrtajte.

26

Razred: Ascomycetes

1. Rod Aspergillus sp.

Opće osobine: kolonije su bijele boje koje tijekom starenja poprimaju zelenkasto-plavu, crnu

ili smeđu boju. Hife su septirane iz kojih izrastaju dugački konidiofori. Spore (konidiospore)

se stvaraju u lancima na krajevima sterigma koje izrastaju iz kugličastog kraja konidiofora. Nacrtajte, 2. Rod Penicillium sp.

Opće osobine: kolonije su u pravilu zelenkasto ili plavkasto-zelene boje. Micelij je septiran i iz

njega izrastaju konidiofori. Konidiospore se stvaraju u lancima na krajevima sterigmi koje

izrastaju iz metula konidiofora. Nacrtajte

27

Razred: Deuteromycetes (Fungi imperfecti)

1. Rod Alternaria sp.

Opće osobine: kolonije su sivkasto-zelene ili crne sa sivim krajevima. Zračni micelij ne raste

gusto, a boja je sivkasta do bijela. Micelij je septiran. Višestanične su spore (konidije)

kruškolike i stvaraju se na pojedinačnim konidioforima koji izrastaju iz micelija. Nacrtajte. 2. Rod Fusarium sp.

Opće osobine: kolonije su bijele i pahuljaste. Micelij je septiran. Spore su višestanične

(konidije) jajolikog ili srpolikog oblika, a stvaraju se na konidioforima koji izrastaju iz micelija. Nacrtajte.

28

11. Određivanje osjetljivosti mikroorganizama prema antimikrobnim lijekovima

Antibiogram je istraživanje osjetljivosti izdvojene i identificirane bakterije prema

antibakterijskim lijekovima. Stupanj osjetljivosti bakterija prema antibakterijskom lijeku

može se odrediti uz pomoć dvije metode: dilucijske i difuzijske. Postupkom dilucije utvrđuje

se minimalna inhibitorna koncentracija (MIK) antibakterijskog lijeka za istraživanu bakteriju.

Izvodi se tako da se u nizu epruveta s tekućom hranjivom podlogom razrjeđuje

antibakterijski lijek. U svaku epruvetu se ucijepi stalan broj bakterijskih stanica. Nakon

inkubacije (18-24 h) pri 37 °C očitava se zamućenje koje je nastalo razmnožavanjem

bakterija. Epruveta u kojoj je najveće razrjeđenje antibakterijskog lijeka a u kojoj nema

zamućenja označava se kao MIK – tj. najmanja količina lijeka koja je dovoljna da se inhibira

razmnožavanje bakterija.

Postupkom difuzije istražuje se osjetljivost bakterija na nekoliko antibakterijskih

lijekova istodobno. Suspenzija bakterijskog soja kojemu se određuje osjetljivost nacjepljuje

se na površinu krute hranjive podloge. Na hranjivu se podlogu potom postavljaju diskovi ili

tablete. Diskovi su izrađeni od papira i sadrže određenu količinu antibakterijskog lijeka.

Razmak između diskova mora biti najmanje 3 cm. Antibakterijski lijek iz diska difundira u

hranjivu podlogu radijalno u svim smjerovima, a koncentracija se smanjuje s udaljenošću od

diska. Nakon inkubacije (18-24 h na 35-37 °C) utvrđuje se porast ispitivane bakterije. Rast

bakterija oko diska ovisiti će o njegovoj osjetljivosti na lijek. Ako je bakterija osjetljiva

prestati će rasti na većoj udaljenosti od diska jer i mala koncentracija antibakterijskog lijeka

inhibira njezin rast. Na ovaj način se stvaraju područja (zone) u kojem nema vidljivog rasta

tzv. područje (zone) inhibicije rasta bakterija. Na temelju veličine tj. promjera područja

inhibicije (u mm) određuju se tri kategorije osjetljivosti: 1. kategorija: osjetljiv (obilježava se s a +++ ili brojkom 3) 2. kategorija. umjereno osjetljiv (obilježava se sa ++ ili brojkom 2) 3. kategorija: otporan (obilježava se s brojkom 0). Prema rezultatima antibiograma odabire se optimalan antibakterijski lijek.

Zadatak 1.

Metodom difuzije utvrdite koji je antibakterijski lijek najučinkovitiji za pojedine ispitivane

bakterije.

Materijal: špiritusna lampa, diskovi od filtar-papira s antibioticima, pinceta, boca s

alkoholom, Petrijeve zdjelice s hranjivom podlogom u kojima su suspendirane odabrane

kulture bakterija.

29

Postupak

1. Na površinu donjeg, vanjskog dijela Petrijevih zdjelica napišite u odabranim, pravilnim

razmacima kratice istraživanih antibiotika.

2. Sterilizirajte metalnu pincetu.

3. Sterilnom pincetom uzmite disk na kojem se nalazi istraživani antibiotik, a potom ga

unesite u Petrijevu zdjelicu i položite na površinu čvrste hranjive podloge na udaljenosti

oko 1 cm od unutarnjeg ruba Petrijeve zdjelice te potom lagano pritisnite pincetom na

označeno mjesto da čvrsto prione na hranjivu podlogu.

4. Inkubirajte pri 37 oC tijekom 24 do 48 sati.

30

12. Mikrobiološka analiza vode za piće

Zdravstveno ispravna voda za ljudsku potrošnju smatra se voda koja ne sadrži

mikroorganizme, parazite i njihove razvojne oblike u broju koji predstavlja opasnost za

zdravlje ljudi, ne sadrži štetne tvari u koncentracijama koje same ili zajedno s drugim tvarima

predstavljaju opasnost za zdravlje ljudi. Patogene bakterije prisutne su u okolišu u niskim

koncentracijama pa je njihova detekcija teška. Stoga se koriste tzv. indikatorske bakterije za

detekciju vjerojatne prisutnosti patogenih bakterija. Koliformne bakterije predstavljaju

indikatorske bakterije za vrednovanje higijenske kvalitete vode. Koliformne bakterije

uključuju rodove (Escherichia coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter i dr.) iz porodice

Enterobacteriaceae, to au Gram-negativne, nesporogene, štapićaste, aerobne ili

fakultativno-anaerobne bakterije koje fermentiraju šećer laktozu. Ukupne koliformne

bakterije razgrađuju laktozu na 35 ±0,5 °C/48 h dok fekalne koliformne bakterije razgrađuju

laktozu na 44,5 ±0,2 °C/24 h, što znači da imaju sposobnost termotolerancije. Primarno su

nepatogene i normalno obitavaju u donjem intestinalnom traktu (debelom crijevu) čovjeka i

toplokrvnih životinja, gdje su odgovorne za pravilnu probavu hrane. Izlučuju se fekalijama te

dospijevaju u otpadne vode, a preko njih u prirodne vode recipijente otpadnih voda.

Zadatak 1.

Analiza materijala s prethodne vježbe.


Ukoliko je došlo do mikrobiocidnog djelovanja antibiotika, oko mjesta gdje su postavljeni

diskovi filtar-papira s istraživanim antibioticima pojavit će se prozirne zone, tj. na tim

mjestima na hranjivoj podlozi neće biti prisutan porast kolonija istraživane bakterijske

kulture. Prema veličini (izmjerenom promjeru) nastale zone inhibicije odredite kategoriju

osjetljivosti bakterija prema antibioticima.

Zadatak 2.

Dokažite ukupne i fekalne koliformne bakterije i Escherichia coli (MacConkey bujon i Endo

agar) i ukupni broj aerobnih mezofilnih bakterija (Plate count agar) u uzorku vode

Materijal: sterilna epruveta s fiziološkom otopinom, prazna sterilna Petrijeva zdjelica,

epruveta s agarom za ukupan broj bakterija, epruveta s MacConkey bujonom i Durhamovom

cjevčicom, petrijevka sa Endo-agarom, sterilna pipeta od 1 ml, savijeni stakleni štapić,

špiritusna lampa.

31

Postupak

1. Promućkajte uzorak vode i odpipetirajte 0,5 ml i prenesite u praznu sterilnu Petrijevu

zdjelicu i prelijte otopljeni agar za određivanje ukupnog broja bakterija. Inkubirajte pri

22 °C 48 - 72 h i 37 °C 24 - 48 sati.

2. U epruvete s MacConkey bujonom prenesite 1 ml uzorka vode. Epruvete inkubirajte 48 h

pri 37°C i 24 h pri 44 °C.

3. Na površinu Endo-agara prenesite 0,1 ml uzorka vode.

4. Savijeni stakleni štapić sterilizirajte i razmažite uzorak po cijeloj površini agara. Uronite

štapić u alkohol i ponovno ga sterilizirajte.

5. Petri-ploču inkubirajte 48 h pri 37 °C.

32

13. Obrada rezultata i praktičan rad

Zadatak 1.

Analiza materijala s prethodne vježbe.


U Petrijevoj zdjelici s poraslim aerobnim mezofilnim bakterijama odredite CFU. U epruvetu s

MacConkey bujonom odredite promjenu boje indikatora odnosno je li došlo do nakupljanja

plina u Durhamovoj cjevčici. U Petrijevoj zdjelici s Endo-agarom utvrdite da li je došlo do

porasta specifičnih kolonija E.coli. Usporedite rezultate s važećim Pravilnikom.

Zadatak 2.

Praktičan rad: prepoznavanje nativnih i obojanih mikroskopskih preparat mikroorganizama -

- bakterija, kvasaca i plijesni.

33

Literatura

Duraković, S. 1996. Opća mikrobiologija. Prehrambeno tehnološki inženjering. Zagreb

Duraković, S.; Duraković, L. 1998. Priručnik za rad u mikrobiološkom laboratoriju, I. dio knjiga

prva. Durieux. Zagreb.

Duraković, S.; Duraković, L. 1998. Priručnik za rad u mikrobiološkom laboratoriju, I. dio knjiga

druga. Durieux. Zagreb.

Duraković, S. 1996. Primjenjena mikrobiologija. Prehrambeno tehnološki inženjering.

Zagreb.

Duraković, S.; Redžepović, S. 2002. Uvod u opću mikrobiologiju. Kugler. Zagreb.

Harley, J.P.; Prescott, L.M. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw-Hill

Publishing Companies.

Jarak, M.; Govedarica, M. 2003. Mikrobiologija. Univerzitet u Novom Sadu. Poljoprivredni

fakultet.

Jarak, M.; Đurić, S. 2006. Praktikum iz mikrobiologije. Poljoprivredni fakultet. Novi Sad.

Volner, Z. 2003. Opća medicinska mikrobiologija s epidemiologijom i imunologijom. Školska

knjiga. Zagreb.

praktikum iz opće mikrobiologije

Documents